ES2373130T3

ES2373130T3 - Anticuerpo antagonista contra la proteína tirosina quinasa sal-s1.

Info

Publication number: ES2373130T3
Application number: ES08021130T
Authority: ES
Inventors: Brian D. Bennett; David Goeddel; James M. Lee; William Matthews; Siao Ping Tsai; William I. Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-04-04
Filing date: 1995-04-04
Publication date: 2012-01-31
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: EP0804572A1; ATE527357T1; EP2067790A2; DK0804572T3; US5635177A; EP2067790B1; HK1131791A1; DK2067790T3; ATE489402T1; PT2067790E; CA2185656A1; WO1995027061A1; DE69536123D1; CA2185656C; EP0804572B1; ES2355952T3; JPH09511644A; JP2005218452A; PT804572E; EP2067790A3

Abstract

Anticuerpo agonista que se une al dominio extracelular del dominio quinasa de un receptor proteína tirosina quinasa (pTK) SAL-S1 y lo activa.

Description

Anticuerpo antagonista contra la proteína tirosina quinasa sal-s1

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos agonistas que son capaces de activar el dominio tirosina quinasa del receptor pTK SAL-S1.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR

[0002] La transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasa son enzimas que catalizan este proceso. Además, muchas actúan como receptores de factores de crecimiento. El subgrupo c-kit de receptores de tirosina quinasa catalizan la fosforilación de sustratos exógenos, así como residuos de tirosina en sus propias cadenas de polipéptidos (Ullrich et al., Cell 61:203 [1990]). Los miembros del subgrupo c-kit incluyen FLT/FLK (Kinasa de hígado fetal), FGF (Receptor del Factor de Crecimiento de Fibroblastos) y NGF (Receptor del Factor de Crecimiento Nervioso).

[0003] La subfamilia EPH de tirosina quinasa, Eph, Elk, Eck, Eek, Hek, Hek2, Sek, Ehk-1, Ehk-2, Cek-4 to -10, Tyro 1, 4, 5 y 6, parece ser la subfamilia más grande de tirosinas quinasas transmembrana (Hirai et al., Science 238:1717-1720 [1987]; Letwin et al., Oncogene 3:621-678 [1988]; Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 13:7071-7079 [1993]; Lindberg et al., Mol. cell. Biol. 10:6316-6324 [1990]; Bohme et al., Oncogene 8:2857-2862 [1993]; y Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:1611-1615 [1992]; Pasquale et al. Cell Regulation 2:523-534 [1991]; Sajjadi et al., New Biol. 3:769-778 [1991] ; Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:1611-1615 [1992]; Lhotak et al., Mol. Cell. Bio. 11:2496-2502 [1991]; Gilardi-Hebenstreit et al., Oncogene 7:2499-2506 [1992]; Lai et al., Neuron 6:691-704 [1991]; Sajjadi et al., Oncogene 8:1807-1813 [1993]; and Maisonpierre et al., Oncogene 8:3277-3288 [1993]).

[0004] WO 93/15201 se refiere a genes de proteína tirosina quinasa presentes en células megacariocíticas y linfocíticas humanas, las proteínas codificadas por estos genes, los anticuerpos específicos para las proteínas codificadas, las secuencias de ácido nucleico ARN que se hibridan a los genes y los métodos de uso para los mismos.

[0005] Ashman et al. J. Cell Physiol. 158: 545-554 (1994) describe la localización de epítopos y estudios funcionales con tres anticuerpos monoclonales para el receptor tirosina quinasa c-kit.

[0006] Sarup et al., Growth Regul. 1:72-82 describe la caracterización de un anticuerpo monoclonal anti-p185HER2 que estimula la función del receptor e inhibe el crecimiento de células tumorales.

[0007] Las pTK adicionales y anticuerpos agonistas a las mismas son necesarias para estudiar adicionalmente el crecimiento y diferenciación de las células, para su uso como agentes terapéuticos y para fines de diagnóstico.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0008] Los genes aislados tal como se describen en la presente invención son referidos, colectivamente, como “genes de proteína tirosina quinasa” o “genes de pTK”. Las secuencias de ácidos nucleicos de algunos de estos genes, aislados tal como se describe aquí, muestran una homología significativa con proteínas tirosina quinasas identificadas previamente que contienen dominios extracelulares, que actúan como receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, pTKs del subgrupo c-kit). Se ha observado que algunos de los genes de pTK están presentes tanto en células megacariocíticas como células linfocíticas.

[0009] En particular, se han identificado catorce genes de pTK. Se identificaron dos genes de pTK, referidos como SAL-S1 y SAL-D4, en células megacariocíticas. SAL-D4 está relacionado con la familia CSK de pTK intracelulares y SAL-S1 está relacionado con la familia de receptores FGF de pTK. Se identificaron cinco genes de pTK, referidos como LpTK, en células linfocíticas y se ha observado que están presentes también en megacariocitos. Se identificó un gen de pTK, referido como HpTK5, en células de hematoma humano. Se hallaron seis genes de pTK, referidos como genes de bpTK, en tejido de cerebro humano.

[0010] Los genes de pTK se identificaron en general utilizando dos grupos de cebadores de oligonucleótidos degenerados: un primer grupo que amplifica todos los segmentos de ADN de pTK (SEC ID NOS: 1-2), y un segundo grupo que amplifica secuencias altamente conservadas presentes en el dominio catalítico del subgrupo c-kit de pTKs (SEC ID NOS: 3-4). Los genes de pTK identificados de esta manera se describen a continuación.

[0011] SAL-S1 se expresa en varias líneas de células megacariocíticas, pero no en líneas de células eritroides. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos de parte de SAL-S1, revelando una secuencia que contenía 160 pares de bases (SEC ID NO: 5). Este fragmento de ADN aislado codificaba una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 6) que mostraba una homología de secuencia significativa con proteínas tirosina quinasas conocidas de la familia FLT/FLK. La secuencia de aminoácidos deducida de SAL-S1 (SEC ID NO: 32) contiene 1298 residuos.

[0012] SAL-D4, también expresado en células megacariocíticas, es un fragmento de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos de 147 pares de bases. (SEC ID NO: 7). Este fragmento de ADN aislado codificaba una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 8) que mostraba una homología de secuencia significativa con proteínas tirosina quinasas conocidas de la familia de pTK intracelulares CSK.

[0013] Las LpTKs, incluyendo LpTK 2, LpTK 3, LpTK 4, LpTK 13 y LpTK 25, se expresan en células linfocíticas, así como células megacariocíticas. Se obtuvo la secuencia de nucleótidos (151 pares de bases) del gen de LpTK 3 (SEC ID NO: 11). Las secuencia de nucleótidos de los genes de LpTK 2, LpTK 4, y LpTK 13 contenían 149 pares de bases (SEC ID NO: 9), 137 pares de bases (SEC ID NO: 13), y 211 pares de bases (SEC ID NO: 15) respectivamente. La LpTK 25 tiene una secuencia de nucleótidos de 3120 b.p. (SEC ID NO: 22). Se ha obtenido una secuencia de genes de longitud completa para LpTK 2 (SEC ID NO: 19) que contiene 7607 b.p. La secuenciación adicional de LpTK 4 reveló una secuencia de 404 b.p. (SEC ID NO: 21).

[0014] El gen de HpTK5, expresado en células de hematoma humano, presenta una secuencia de nucleótidos de 3969 b.p. (SEC ID NO: 23).

[0015] Las secuencias de nucleótidos de las bpTKs, incluyendo bpTK 1, bpTK 2, bpTK 3, bpTK 4, bpTK 5 y bpTK 7, se expresan en tejido de cerebro humano y codifican proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOS: 25-29 y 34, respectivamente.

[0016] De este modo, se puede aislar el ADN de una línea de células megacariocíticas humanas, que se hibrida al ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que es altamente conservada en el dominio catalítico de proteínas tirosina quinasas del subgrupo c-kit.

[0017] Se describen aquí las proteínas codificadas por los genes de pTK identificadas tal como se describen aquí que muestran una homología de secuencia significativa con los miembros del subgrupo c-kit de pTKs, así como las proteínas codificadas por HpTK5 y las bpTKs. Se describen aquí homólogos o equivalentes de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK (es decir, proteínas que tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares, pero no idénticas, a las de SAL-S1, SAL-D4, las LpTKs, HpTK5 y las bpTKs, que muestran actividad tirosina quinasa). Se describen aquí péptidos (fragmentos de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK) que mantienen la actividad tirosina quinasa, aunque son menos que las secuencias completas de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK5 y bpTK también son posibles; y usos para las secuencias de ácidos nucleicos de SAL-S1, SAL-D4, las LpTK, HpTK y las bpTK y equivalentes de SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK y bpTK.

[0018] Se describen aquí las secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con ADN o ARN que codifican las proteínas descritas aquí que muestran una homología de secuencia significativa con FLT/FLK, el receptor de FGF o la familia de receptores NGF de proteínas tirosina quinasas contenidas en el subgrupo c-kit. Dichas secuencias de ácido nucleico son útiles como sondas para identificar genes de pTK en otros vertebrados, particularmente mamíferos, y en otros tipos de células. También se pueden utilizar como oligonucleótidos anti-sentido para inhibir la actividad de proteína tirosina quinasa, tanto in vitro como in vivo.

[0019] Las tirosina quinasas SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK y bpTK se pueden utilizar como proteínas diana conjuntamente con el desarrollo de fármacos y agentes terapéuticos para modular el crecimiento y diferenciación celular y otras funciones metabólicas. Las proteínas SAL-S1, SAL-D4, LpTK, HpTK o bpTK se pueden utilizar como agonistas o antagonistas a otras tirosina quinasas. Las pTKs también pueden jugar un papel decisivo en la modulación de interacciones de adhesión a megacariocitos y/o plaquetas.

[0020] Además, las tirosina quinasas SAL-51, SAL-D4, LpTK, HpTK y bpTK se pueden utilizar en ensayos de screening para detector factores de crecimiento y/o diferenciación celular. Utilizando técnicas de laboratorio estándar, se pueden identificar los ligandos de las pTK. En particular, la presente invención proporciona proteínas de fusión quiméricas bpTK7-inmunoglobulina que son útiles para aislar ligandos para las pTK descritas en la presente invención. Las proteínas quiméricas también son útiles para ensayos de diagnóstico diseñados para detectar estos ligandos presentes de forma endógena, en las células, así como de forma exógena, en fluidos extracelulares. También se pueden diseñar ensayos, utilizando proteínas quiméricas, como herramientas de diagnóstico para detectar estos ligandos en fluidos corporales, tales como sangre y orina.

[0021] Un aspecto de la presente invención da a conocer un anticuerpo agonista que se une al dominio extracelular del dominio quinasa de un receptor proteína tirosina quinasa (pTK) SAL-S1 y lo activa.

[0022] La presente invención también se refiere a un anticuerpo monoclonal tal como se establece en la reivindicación 2. Además, la presente invención se refiere a un método para activar una pTK tal como se establece en la reivindicación 4.

[0023] Un método para detectar una pTK puede implicar poner en contacto una fuente sospechosa de contener la pTK con un anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable que reacciona de forma inmunológica con la pTK y determinar si el anticuerpo se une a la fuente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0024] Las figuras 1A y 1B representan la secuencia de nucleótidos de SAL-S1 (SEC ID NO: 5) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 6). Las figuras 2A y 2B representan la secuencia de nucleótidos de SAL-D4 (SEC ID NO: 7) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 8). La figura 3A representa la secuencia de nucleótidos de LpTK 2 (SEC ID NO: 9) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 10). La figura 3B representa la secuencia de nucleótidos de LpTK 3 (SEC ID NO: 11) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 12). La figura 3C representa la secuencia de nucleótidos de LpTK 4 (SEC ID NO: 13) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 14). La figura 3D representa la secuencia de nucleótidos de LpTK 13 (SEC ID NO: 15) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 16). Las figuras 4A-4I representan la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 17) de SAL-S1 y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 18). Las figuras 5A-5K representan la secuencia de nucleótidos de longitud completa (SEC ID NO: 19) de LpTK2 y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 20). La figura 6 representa la secuencia de nucleótidos parcial (SEC ID NO: 21) para LpTK4. Las figuras 7A-7C representan la secuencia de nucleótidos de longitud completa (SEC ID NO: 22) para LpTK25. Las figuras 8A-8I representan la secuencia de nucleótidos de longitud completa (SEC ID NO: 23) y la secuencia de aminoácidos deducida de HpTK5 (SEC ID NO: 24). La figura 9 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 25) de bpTK1. La figura 10 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 26) de bpTK2. La figura 11 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 27) de bpTK3. La figura 12 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 28) de bpTK4. La figura 13 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 29) de bpTK5. La figura 14 representa la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 30) de bpTK7. Las figuras 15A-15F representan la secuencia de nucleótidos de longitud completa de SAL-S1 (SEC ID NO: 31) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 32). Las figuras 16A-16H representan la secuencia de nucleótidos de longitud completa de bpTK7 (SEC ID NO: 34) y su secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 34).

[0025] Se han identificado nuevos genes de proteínas tirosina quinasa, se han determinado sus secuencias de ácido nucleicos y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas deducidas. Los genes aislados tal como se describen en la presente invención son referidos, colectivamente, como “genes de proteínas tirosina quinasa” o “genes de pTK”.

[0026] Para facilitar el aislamiento e identificación de estas pTKs nuevas, se utilizaron dos grupos de sondas de ADN, tal como se describe en el ejemplo 1. El primer grupo consistía en general de dos secuencias de oligonucleótidos degeneradas, pTK 1 (SEC ID NO: 1) y pTK 2 (SEC ID NO: 2) (Matthews, Cell 65:1143 [1991]; y Wilks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1603 [1989)). Estas secuencias se utilizaron como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los segmentos de ADN de tirosina quinasa (Mullis, et al., Cold Spring Harbor Symp. Advan. Biol. 51:263 [1986]).

[0027] El segundo grupo consistía en general de dos secuencias de oligonucleótidos, pTK 3 (SEC ID NO: 3) y pTKKW (SEC ID NO: 4) diseñadas para amplificar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica las regiones altamente conservadas de los dominios catalíticos de la familia c-kit de proteínas tirosina quinasas. Estas secuencias se utilizaron como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una segunda ronda de amplificación de ADN. Utilizando este procedimiento de amplificación de dos etapas, se identificaron fragmentos de ADN que se hibridaban a estos cebadores de pTK, se aislaron y posteriormente se secuenciaron.

[0028] En particular, se han identificado catorce genes de pTK. Se identificaron dos genes de pTK, referidos como SAL-S1 y SAL-D4, en varias líneas de células megacariocíticas, incluyendo CMK 11-5, DAMI, UT-7 y UT-7 desarrolladas en eritropoyetina, pero no en las líneas de células eritroides HEL, células HEL estimuladas con PMA, o K562. Se identificaron cinco genes de pTK, referidos como LpTKs, en células linfocíticas, así como en células megacariocíticas. Se identificó un gen de pTK, referido como HpTK5, en células de hematoma humano, y se identificaron seis genes, referidos como bpTKs, en tejido de cerebro humano.

[0029] La SAL-S1 (SEC ID NOS: 6, 18 y 32) codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NOS: 5, 17 y 31 muestra una homología significativa con la familia FLT/FLK de pTKs. SAL-S1 tiene un péptido señal (es decir, residuos de aminoácidos 1 a 24 de la figura 15); dominios extracelulares (es decir, residuos de aminoácidos 25 a 775 de la figura 15); dominio transmembrana (es decir, residuos de aminoácidos 776 a 800 de la figura 15) y un dominio citoplasmático de tirosina quinasa (es decir, residuos de aminoácidos 801 a 1298 de la figura 15). La SAL-D4 (SEC ID NO: 8) codificada por SEC ID NO: 7 se refiere a la familia CSK de pTKs intracelulares. Las LpTKs, LpTK 2 (SEC ID NOS: 10 y 20) codificadas por SEC ID NOS: 9 y 19; LpTK 3 (SEC ID NO: 12) codificada por SEC ID NO: 11; LpTK4 (SEC ID NO: 14) codificada por SEC ID NOS: 13 y 21; LpTK13 (SEC ID NO: 16) codificada por SEC ID NO: 15; y LpTK25 codificada por SEC ID NO: 22, también muestran una homología de secuencia con proteínas tirosina quinasas conocidas.

[0030] La HpTK5 (SEC ID NO: 24) codificada por SEC ID NO: 23 y las bpTKs 1, 2, 3, 4, 5 y 7 (SEC ID NOS: 25-29 y 34 respectivamente), muestran de manera similar una homología de secuencia con proteínas tirosina quinasas conocidas. La BpTK7 codifica un receptor de pTK con un péptido señal (es decir, residuos de aminoácidos 1-19 de la figura 16); dominio extracelular (es decir, residuos de aminoácidos 20-547 de la figura 16); y dominio transmembrana (es decir, residuos de aminoácidos 548-570 de la figura 16). La secuencia restante comprende el dominio tirosina quinasa intracelular.

[0031] De este modo, tal como se ha descrito anteriormente, se han aislado y secuenciado moléculas de ADN que se hibridan con ADN que codifica las secuencias de aminoácidos presentes en el dominio catalítico de una proteína tirosina quinasa del subgrupo c-kit de proteínas quinasas. Se ha observado que estas secuencias de ADN aisladas, referidas colectivamente como “géneros de pTR”, (y sus secuencias de aminoácidos deducidas) muestran una homología de secuencia significativa con miembros conocidos de familias pTK.

[0032] Una vez aislados, estos fragmentos de ADN se pueden amplificar utilizando técnicas estándar conocidas, tales como PCR. Estos fragmentos amplificados se pueden clonar a continuación en vectores de clonación apropiados y determinar sus secuencias de ADN.

[0033] Estas secuencias de ADN se pueden escindir de los vectores de clonación, marcarse con un nucleótido radiomarcado, tal como 32P, y utilizarse para cribar las bibliotecas de ADNc apropiadas para obtener el clon de ADNc de longitud completa.

[0034] Los genes de pTK, tal como se han descrito anteriormente, se han aislado de la fuente en que están de forma natural, por ejemplo, células megacariocíticas y linfocíticas. También se consideran aquí genes de pTK producidos utilizando técnicas de ingeniería genética, tales como tecnología recombinante, así como genes de pTK que se sintetizan químicamente.

[0035] Las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes de pTK incluyen secuencias de aminoácidos que codifican péptidos que muestran una homología significativa con el dominio catalítico de proteínas tirosina quinasa del subgrupo c-kit de tirosina quinasas. Estas proteínas, codificadas por los genes de pTK, pueden incluir secuencias en las que residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos por residuos en la secuencia, que dan lugar a un cambio silencioso, que es un cambio no detectado fenotípicamente. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como equivalente funcional, dando lugar a una sustitución silenciosa.

[0036] Además, la estructura de la proteína se puede modificar mediante deleciones, adiciones, inversión, inserciones o sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia que no perjudican sustancialmente a las propiedades funcionales deseadas de tirosina quinasa del péptido.

[0037] Las pTK modificadas, con actividad tirosina quinasa, se pueden producir utilizando técnicas de ADN recombinante, tales como escisión de un vector que contiene un ADNc que codifica dicha proteína, o mediante la síntesis del ADN que codifica la proteína deseada mecánica y/o químicamente utilizando técnicas conocidas.

[0038] Una estrategia alternativa para producir pTK es utilizar la síntesis de péptidos para producir un péptido o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, dependiendo de la longitud de pTK deseada. Los péptidos o equivalentes modificados de los mismos se pueden sintetizar directamente mediante química de fase sólida o líquida estándar para la síntesis de péptidos.

[0039] Preferiblemente, las pTK se producirán mediante la inserción de ADN que codifica las proteínas en un sistema vector/huésped apropiado donde se expresará. Las secuencias de ADN se pueden obtener de fuentes en las que tienen lugar de forma natural, se pueden sintetizar químicamente o se pueden producir utilizando tecnología recombinante estándar.

[0040] Se describe aquí un vector de expresión que comprende un gen de pTK, que codifica una proteína que muestra actividad de receptor tirosina quinasa.

[0041] Los genes de pTK se pueden utilizar para un conjunto de fines de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de los genes de pTK se pueden utilizar como sondas para identificar otras proteínas tirosina quinasas presentes en otros tipos de células, incluyendo tipos de células eucariotas y procariotas.

[0042] Las secuencias de ácido nucleico también se pueden utilizar para diseñar fármacos que inhiben directamente la actividad quinasa de proteínas tirosina quinasa o para diseñar péptidos que se unen al dominio catalítico de tirosina quinasas, inhibiendo de este modo su actividad. Estas secuencias también se pueden utilizar para diseñar nucleótidos anti-sentido que también pueden inhibir o destruir actividad tirosina quinasa. Dicha inhibición de actividad tirosina quinasa sería deseable en estados patológicos donde la proliferación celular disminuida sería beneficiosa, tales como leucemias u otros cánceres.

[0043] Las secuencias de ácidos nucleicos también se pueden utilizar para diseñar fármacos, péptidos o nucleótidos antisentido como antes, pero con efectos potenciadores, En lugar de inhibidores, sobre tirosina quinasas. Dicha actividad aumentada de tirosina quinasa daría lugar a un incremento de la fosforilación de sustratos (exógenos, así como residuos de tirosina endógenos). Serían deseables efectos potenciados en estados en los que una mayor proliferación celular seria beneficiosa, tales como anemias, trastornos del sangrado y durante procedimientos quirúrgicos.

[0044] Los genes de pTK también se pueden utilizar para obtener fragmentos solubles de receptores tirosina quinasa, capaces de unirse a sus ligandos respectivos. Los genes de pTK que codifican fragmentos solubles de tirosina quinasa se pueden producir utilizando técnicas de ADN recombinante o sintéticamente. En cualquier caso, el ADN obtenido codifica un fragmento de pTK soluble que carece de una parte sustancial de la región transmembrana hidrofóbica para permitir la solubilización del fragmento.

[0045] Estos fragmentos de proteínas pTK se pueden introducir exógenamente para actuar como competidores con las pTK endógenas unidas a membrana por sus respectivos ligandos, inhibiendo así la actividad de tirosina quinasa. Alternativamente, se puede introducir un fragmento de proteína pTK soluble modificado que se une al ligando pero no activa la actividad quinasa.

[0046] Estos fragmentos solubles de proteínas pTK también se pueden utilizar en ensayos de unión para detectar ligandos, tales como factores de crecimiento y diferenciación. Una vez se han identificado estos ligandos, se pueden alterar o modificar para inhibir o potenciar la actividad quinasa. Por ejemplo, los ligandos se pueden modificar o unir a sustancias que son tóxicas para la célula, tal como ricina, destruyendo así la célula diana. La sustancia puede ser una sustancia superactivante que, después de la unión a la pTK, puede incrementar sustancialmente la actividad quinasa, o activar otros factores de crecimiento.

[0047] Los genes de pTK también serían útiles para desarrollar herramientas de diagnóstico para ensayos de cribado in vitro para ligandos, tales como factores de crecimiento o factores de diferenciación que inhiben o potencian la actividad quinasa. Las proteínas codificadas por los genes de pTK también se pueden utilizar en dichos ensayos, o como inmunógenos, para producir anticuerpos monoclonales o policlonales a utilizar en dichos ensayos.

[0048] Se puede construir una quimera que comprende una fusión del dominio extracelular de la pTK (donde la pTK es un receptor) y un dominio constante de inmunoglobulina que se puede utilizar para ensayar los ligandos para el receptor y se puede utilizar para la producción de anticuerpos contra el dominio extracelular del receptor.

[0049] La expresión “dominio extracelular” o “ECD” cuando se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier secuencia de polipéptido que comparte una función de unión a ligando del dominio extracelular del receptor natural de pTKs descrito aquí. La función de unión a ligando del dominio extracelular se refiere a la capacidad del polipéptido de unirse a por lo menos un ligando de pTK. Por consiguiente, no es necesario incluir el dominio extracelular completo, ya que se encuentra que normalmente segmentos más pequeños son adecuados para unirse al ligando. El dominio extracelular truncado es en general soluble. El término ECD comprende secuencias de polipéptido en las que la secuencia transmembrana hidrofóbica (y, opcionalmente los aminoácidos 1-20 C-terminales y/o N-terminales con respecto al dominio transmembrana) de la pTK madura ha sido eliminada. De este modo, el polipéptido que contiene el dominio extracelular soluble puede comprender el dominio extracelular y el dominio citoplasmático de la pTK. Alternativamente, el polipéptido comprende sólo el dominio extracelular de la pTK. Los dominio extracelular y transmembrana de la pTK se pueden determinar fácilmente por el experto en la materia mediante la alineación de la pTK de interés con secuencias de aminoácidos de pTK conocidas para los que se han trazado estos dominios. Alternativamente, el dominio transmembrana hidrofóbico se puede trazar fácilmente en base a la representación de la hidrofobicidad de la secuencia. El dominio extracelular es N-terminal con respecto al dominio transmembrana.

[0050] El término “inmunoglobulina” se refiere en general a polipéptidos que comprende una cande aligera o pesada normalmente ambas unidas a disulfuro en la configuración “Y” nativa, aunque otras uniones entre ellos, incluyendo tetrámeros o agregados de los mismos, se encuentra en el alcance de la invención.

[0051] Las inmunoglobulinas (Ig) y ciertas variantes de las mismas son conocidas y muchas se han preparado en cultivo celular recombinante. Por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos 4,745,055; EP 256,654; Faulkner et al., Nature 398:286 [1982]; EP 120,694; EP 125,023; Morrison, J. Immun. 123:793 [1979]; Köhler et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 77:2197 [1980] ; Raso et al., Cancer Res . 41:2073 [1981]; Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 [1984]; Morrison, Science 229:1202 [1985]; Morrison et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:6851 [1984]; EP 255,694; EP 266,663; y WO 88/03559. También se conocen cadenas de inmunoglobulina recombinadas. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4,444,878; WO 88/03565; y EP 68,763 y las referencias citadas en las mismas. La parte de inmunoglobulina en la quimera se puede obtener de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente IgG1 o IgG3. Más preferiblemente, la parte inmunoglobulina es la parte Fc de IgG-y.

[0052] Los términos “quimera que comprende una fusión de un dominio extracelular de una pTK con una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina” o “quimera pTK-inmunoglobulina” se refieren a un polipéptido que comprende un dominio extracelular que codifica una secuencia de aminoácido de una pTK conjugada a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. Esta definición incluye quimeras en formas monoméricas, homomultiméricas o heteromultiméricas, y particularmente homodiméricas o heterodiméricas o tetraméricas.

[0053] Aquí se describe la fusión del extremo C-terminal del dominio extracelular de una pTK, al N-terminal de la parte C-terminal de un anticuerpo (en particular, el dominio Fc) que contiene las funciones efectoras de inmunoglobulina G1. La región constante de cadena pesada completa se puede fusionar al dominio extracelular. Una secuencia que empieza en la región bisagra justo en dirección 5’ del sitio de división por papaína (que define la Fv de IgG químicamente; el residuo 216, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada el 114 (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, [1987]), o sitios análogos de otras inmunoglobulinas) se puede fusionar con la ECD de la pTK.

[0054] El dominio extracelular de pTK se puede fusionar a la región bisagra y la bisagra CH2 y CH3 o CH1, dominio CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG3. El sitio preciso en que la fusión se realiza no es crítico, y el sitio óptimo se puede determinar mediante experimentación de rutina. Una ventaja principal de las quimeras es que se secretan en el medio de cultivo de huéspedes recombinantes, aunque el grado de secreción podría ser diferente para varios sistemas de expresión.

[0055] En general, las quimeras se construyen de una manera similar a los anticuerpos quiméricos en los que un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio variable de otra especie. Véase, por ejemplo, EP 0 125 023; EP 173,494; Munro, Nature 312: [13 Diciembre 1984]; Neuberger et al., Nature 312: [13 Diciembre 1984]; Sharon et al., Nature 309: [24 May 1984]; Morrison et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 [1984]; Morrison et al. Science 229:1202-1207 [1985]; Boulianne et al., Nature 312:643-646 [13 Diciembre 1984]; Capon et al., Nature 337, 525-531 [1989]; Traunecker et al., Nature 339, 68-70 [1989].

[0056] Para preparar los polipéptidos quiméricos pTK-IgG, se divide el ADN que incluye una región que codifica la secuencia de pTK deseada mediante una enzima de restricción en el extremo 3’ o próximo al mismo del ADN que codifica el dominio o dominios de tipo inmunoglobulina en un punto o próximo al ADN que codifica el extremo Nterminal de la pTK madura (donde se contempla el uso de una secuencia líder diferente) o en la región codificante Nterminal para pTK o próxima a la misma (donde se utiliza la secuencia señal nativa). Este fragmento de ADN se inserta fácilmente a continuación de forma próxima al ADN que codifica una región constante de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina y, si es necesario, la construcción resultante se ajusta mediante mutagénesis por deleción. Preferiblemente, la Ig es una inmunoglobulina humana cuando la variante está destinada a terapia in vivo para humanos. El ADN que codifica las regiones constantes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina es conocido o fácilmente disponible a partir de bibliotecas de ADNc o se sintetiza. Véase, por ejemplo, Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 [1980]; Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 [1980]; Dolby et al., P.N.A.S. USA, 22:6027-6031 [1980]; Rice et al., P.N.A.S. USA 79:7862-7865 [1982]; Falkner et al., Nature 298:286-288 [1982]; y Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239.256 [1984].

[0057] Las proteínas quiméricas descritas aquí son útiles como agentes de diagnóstico para aislar o cribar ligandos para la pTK de interés utilizando las técnicas de Lyman et al., Cell 75:1157-1167 [1993], por ejemplo. Además, las proteínas quiméricas son útiles para fines de diagnóstico para estudiar la interacción de varios ligandos con el dominio extracelular de las diversas pTK (véase, por ejemplo, Bennett et al., J. Biol, Chem. 266(34):23060-23067 [1991]). Las proteínas quiméricas son útiles además para la producción de anticuerpos contra el dominio extracelular de la pTK (véase los ejemplos 3 y 5 de la presente invención). Las proteínas quiméricas también presentan una utilidad terapéutica adicional siempre que proporcionen una forma soluble del dominio extracelular de la pTK que generalmente presenta una mayor vida media en plasma (en comparación con el dominio extracelular solo) y, por lo tanto, se puede formular en un portador farmacéuticamente aceptable y se administra a un paciente. Las proteínas quiméricas se cree que son útiles como agentes terapéuticos para la eliminación del exceso de ligando de pTK sistémico o localizado en un tejido que se ha administrado a un paciente. La eliminación del ligando en exceso es particularmente de forma deseable cuando el ligando puede ser tóxico para el paciente. La proteína quimérica actúa uniéndose al ligando en competición con la pTK endógena en el paciente. De forma similar, se contempla que la proteína quimérica se puede administrar a un paciente de manera simultánea, o posteriormente a la administración del ligando en forma de una composición de liberación prolongada. La proteína quimérica actúa como proteína de unión soluble para el ligando, extendiendo de este modo la vida media del ligando.

[0058] El término “anticuerpo” se utiliza en la presente invención en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, que reaccionan inmunológicamente con una pTK.

[0059] En la realización preferida de la invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales producidos utilizando técnicas que son conocidas en el sector. Por ejemplo, se puede utilizar la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 [1976], y también descrita por Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 [1981]. Las técnicas de Cote et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos [Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 [1985] y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 [1991]).

[0060] El término “anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo (tal como se ha definido anteriormente en la presente invención) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen habitualmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se pueden sintetizar mediante un cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas.

[0061] Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como, Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen mínimos residuos de aminoácidos derivados de una inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, la región armazón Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituye por los correspondientes residuos de FR no humana. Además, un anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR o secuencias del armazón importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente y optimizar la acción del anticuerpo.

[0062] Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos híbridos (quiméricos) y recombinantes producidos por el corte y empalme (“splicing”) de un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-pTK con un dominio constante (por ejemplo, anticuerpos “humanizados”), sólo uno de los cuales dirigido contra una pTK, o cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de especies de origen o designación de clase o subclase de inmunoglobulina, siempre que sean capaces de unirse a la pTK de interés [Véase, por ejemplo, Cabilly, et al., Patente de Estados Unidos No. 4,816,567; y Mage & Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York [1987]).

[0063] Para anticuerpos “quméricos” y “humanizados”, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4,816,567; WO 91/09968; EP452,508; y WO 91/16927.

[0064] De este modo, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular.

[0065] En la realización más preferida de la invención, los anticuerpos son anticuerpos agonistas. Por “anticuerpo agonista” se entiende un anticuerpo que es un anticuerpo agonista. Por “anticuerpo agonista” se entiende un anticuerpo que es capaz de unirse a una pTK particular y activarla. Por ejemplo, el agonista se puede unir al dominio extracelular de la pTK y causar de este modo la dimerización de la pTK, dando lugar a la transfosforilación y activación del dominio quinasa catalítico intracelular. Consecuentemente, esto puede dar lugar a la estimulación del crecimiento y/o diferenciación de células que expresan el receptor in vitro y/o in vivo. Los anticuerpos agonistas de la presente invención son preferiblemente contra epítopos en el dominio extracelular de la pTK, y preferiblemente, presentan las mismas características biológicas que el anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma depositada en la American TIPO Culture Collection No. de Acceso. ATCC HB 11,583. Por "características biológicas" se entiende las actividades in vitro y/o in vivo del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, capacidad de activar el dominio quinasa de una pTK particular, capacidad de estimular el crecimiento y/o diferenciación celular de células que expresan la pTK, y características de unión del anticuerpo, etc. Por consiguiente, el anticuerpo se une preferiblemente a sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal anti-HpTK5 descrito específicamente en la presente invención. Más preferiblemente, el anticuerpo tendrá sustancialmente la misma afinidad de unión a antígeno o superior del anticuerpo monoclonal anti-HpTK5 descrito en la presente invención.

Para determinar si un anticuerpo monoclonal presenta la misma especificidad que el anticuerpo anti-HpTK5 descrito específicamente (es decir, el anticuerpo que tiene el depósito ATCC No. HB 11,583), se puede utilizar, por ejemplo, un ensayo de unión ELISA competitivo.

[0066] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales útiles en el método de la invención se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión que, a continuación, se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes.

[0067] Los anticuerpos agonistas descritos en la presente invención son útiles para ensayos de diagnóstico in vitro para activar el receptor de pTK de interés. Esto es útil a efectos de estudiar el papel del receptor en el crecimiento y/o diferenciación celular.

[0068] Los anticuerpos agonistas de pTK presentan una utilidad terapéutica adicional en un método para aumentar el crecimiento y/o diferenciación celular que comprende administrar a un paciente humano con necesidad de dicho tratamiento una cantidad fisiológicamente eficaz de un anticuerpo agonista de pTK exógeno. Los anticuerpos agonistas para la pTK SAL-S1 pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos con el sangrado y anemias, ya que se observó que esta pTK se expresaba en células megacariocíticas. Los anticuerpos agonistas de bpTK se pueden utilizar de forma similar para aumentar la diferenciación y/o proliferación de células de cerebro en enfermedades neurodegenerativas (tales como la enfermedad de Alzheimer) en base a la expresión de estos receptores en tejido cerebral. Finalmente, los anticuerpos agonistas de HpTK5 se pueden utilizar para aumentar la proliferación de células hematopoyéticas primitivas en pacientes que han experimentado quimioterapia o terapia por radiación o transplante de médula ósea.

[0069] Un compuesto terapéutico “exógeno” se define en la presente invención para significar un compuesto terapéutico que es exógeno para el paciente mamífero, u homólogo a un compuesto que se encuentra en el paciente mamífero, pero producido fuera del paciente mamífero.

[0070] Los anticuerpos de la presente invención también son adecuados para detector una pTK mediante el contacto de una fuente sospechosa de contener la pTK con un anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable y determinar si el anticuerpo se une a la fuente. Existen muchos marcadores diferentes y métodos de marcaje conocidos en la técnica. Entre los marcadores adecuados se incluyen, por ejemplo, enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y bioluminiscentes, isótopos paramagnéticos. La pTK puede estar presente en muestras biológicas, tales como fluidos biológicos o tejidos. Para fines analíticos o de diagnóstico, los anticuerpos se administran en una cantidad suficiente para permitir la detección de un sitio en una pTK para el que el anticuerpo monoclonal es específico. La concentración del anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable debe ser suficiente para proporcionar una señal detectable por encima de la línea base cuando se une a un epítopo de pTK.

[0071] Los anticuerpos agonistas de pTL descritos en la presente invención se pueden administrar a un mamífero, preferiblemente un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo aquellas que se pueden administrar a un humano de forma intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.

[0072] Dichas formas de dosificación comprenden portadores farmacéuticamente aceptables que son intrínsecamente no tóxicos y no terapéuticos. Entre los ejemplos de dichos portadores se incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de aceites grasos vegetales, agua, sales, o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de disodio, hidrogeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa y polietilenglicol. Los portadores para formas tópicas o de base gel de anticuerpo incluyen polisacáridos, tales como carboximetilcelulosa de sodio o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, se utilizan de forma adecuada formas de depósito. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, vendajes adhesivos, formas de inhalación, pulverizadores nasales y comprimidos sublinguales. El anticuerpo se formulará habitualmente en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

[0073] Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar y formular en formas de dosificación mediante métodos conocidos en la técnica; por ejemplo, véase, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15a Edición 1975.

[0074] Una cantidad eficaz del anticuerpo agonista de pTK a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta titular la dosis y modificar la ruta de administración según se desee para obtener el efecto

5 terapéutico óptimo. Una dosis diaria habitual podría variar desde aproximadamente 1 !g/kg hasta 1000 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Habitualmente, el médico administrará la molécula hasta alcanzar una dosis que consigue el efecto deseado. El proceso de esta terapia se controla fácilmente mediante ensayos convencionales.

[0075] Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,01 mg a 100 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 0,010 a 20 mg/kg del anticuerpo agonista podría ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, mediante, por ejemplo una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se repite hasta

15 que tenga lugar una supresión deseada de síntomas de la enfermedad o se consigue la mejora deseada en la enfermedad del paciente. Sin embargo, también pueden ser útiles otras pautas de dosificación.

[0076] Los siguientes ejemplos no pretenden ser limitantes en ningún caso.

EJEMPLO 1

IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE GENES DE pTK

[0077] Para facilitar el aislamiento e identificación de estos genes de pTK nuevos, se utilizaron en general dos 25 grupos de sondas de ADN (véase la Tabla 1).

[0078] El primer grupo consistía en dos secuencias de oligonucleótidos degenerados, pTK1 (SEC ID NO: 1) y pTK 2 (SEC ID NO: 2). Estas secuencias se utilizaron como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando técnicas PCR estándar, para amplificar segmentos de ADN de tirosina quinasa.

[0079] El segundo grupo consistía en dos secuencias de oligonucleótidos, pTK 3 (SEC ID NO: 3) y pTKKW (SEC ID NO: 4) seleccionadas de las regiones altamente conservadas de los dominios catalíticos del subgrupo c-kit de proteínas tirosina quinasa. Estas secuencias también se utilizaron como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa en una segunda ronda de amplificación del ADN. Utilizando este procedimiento de amplificación de dos

35 etapas, se identificaron, aislaron y posteriormente se secuenciaron fragmentos de ADN que se hibridaban a estos cebadores de pTK utilizando técnicas de laboratorio conocidas.

TABLA 1

Primera ronda de amplificación

Nombre de la sonda Secuencia pTK1 5’-CGGATCCACAGNGACCT-3’ pTK2 5’-GGAATTCCAAAGGACCAGACGTC-3’

Segunda ronda de amplificación pTK3 (específica de la familia kit) 5’-CGGATCCATCCACAGAGATGT-3’ pTKKW (específica de la familia kit) 5’-GGAATTCCTTCAGGAGCCATCCACTT-3’

45 EJEMPLO 2

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE HpTK5

A. Amplificación de ADN y clonación de HpTK5

[0080] Las células mononucleares de médula ósea humana de densidad ligera, obtenidas de voluntarios normales utilizando protocolos aprobados por el Deaconess Hospital Institutional Review Board y con el consentimiento por escrito de los voluntarios, se separaron mediante anticuerpo anti-CD34 (AMAC, Westbrook, ME) y esferas inmunomagnéticas (Dynal, Oslo, Noruega). El análisis citométrico de flujo que utiliza anticuerpos anti-CD34 55 conjugados a FITC (AMAC) confirmó una positividad CD34 de células aisladas del �95%. La línea celular de hematoma, Hep3B, se cultivó en medio alfa (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con penicilina (100U/mL), estreptomicina (100 !g/mL) y suero bovino fetal al 10% (Gibco) a 37°C en un incubador de CO2 al 5%. El ARN total extraído de células mononucleares de médula ósea CD34+ o células Hep3B se transcribió de forma inversa con cebadores aleatorios y la transcriptasa inversa (RT) del virus de leucemia murina de Moloney siguiendo las condiciones del fabricante (Gibco-BRL) en una reacción de 20 !l. La PCR se realizó en el producto de reacción de

RT en una reacción de 100 !l que contenía KCl 50 mM, Tris- HCl 10 mM (pH 8,4), NaCl 1,5 mM, gelatina 20 !g/ml, dNTPs 0,2 mM, 2,5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer/Cetus) y 50 pmol de cada uno de los cebadores degenerados específicos de pTK [pTK1 5’TCGGATCCACA/CGNGAC/TC/TTGGC 3’ (SEC ID NO. 35), pTK1B 5’TCGGATCCAC/TC/AGNGAC/TC/TTNGCNGC 3’ (SEC ID NO. 36), pTK2 5’CTCGAATTCCA/GA/TAA/GC/GT/ACCAG/CACA/GTC 3’ (SEC ID NO. 37), pTK2B 5’CTCGAATTCCA/GA/TAT/CC/GT/ACCAT/AACA/GTC 3’(SEC ID NO. 38)] derivados de regiones de consenso entre pTK conocidas tal como se ha descrito por otros (Hanks et al., Science, 241:42-52 [1988]; Wilks, Proc. Nat. Acad. Sci.. USA 86:1603-1607 [1989]; y Matthews et al., Cell 65:1143-1152 [1991]). El ciclo PCR fue de 1,5 min a 95°C, 2 min a 37°C y 3 min a 63°C repetido 35 veces. El producto de reacción se separó electroforéticamente en un gel de agarosa de punto de fusión al 2%, se purificó en una columna Elutip-D (Schleicher & Schuell) digerida con EcoR1 y BamH1, y se subclonó en pUC19.

[0081] Se secuenciaron los recombinantes mediante el método didesoxi de Sanger y se evaluaron mediante el programa de análisis de secuencia de ácidos nucleicos FASTA. Se marcó radioactivamente un clon denominado HpTK5 (214 pb) mediante cebado aleatorio y se utilizó para cribar una biblioteca de ADN de lambda gt10 de Hep3B cebado con oligo dT. El ADN aislado 17 placas de fagos positivos y se subclonaron insertos en el sitio EcoRI de pBluescript (Stratagene La Jolla, CA). El inserto mayor, un ADNc de 3969 pb, se sonicó hasta un tamaño promedio de 800-2000 pb y se clonó en el sitio SmaI de M13. Se secuenciaron clones solapantes utilizando el Método de Ciclo de Cebador de Colorante Taq (CABI) en la Catalyst 800 Molecular Biology Lab Station (ABI). A continuación, las reacciones de secuenciación se analizaron en el Secuenciador de ADN Automatizado ABI 373A.

[0082] Se aisló y secuenció un ADNc único de 3969 pb de longitud completa (figuras 8A-8F). El clon de longitud completa, denominado quinasa transmembrana de hepatoma (HTK) o HpTK5, incluía un marco de lectura abierto que se extendía del nucleótido 90 al 350 previsto para codificar una proteína de 987 aminoácidos de 108.270 Dalton. El codón de iniciación potencial está precedido por un codón de parada en el marco que empieza en la base 78. Antes del marco de lectura abierto se encuentra una región 5’ no traducida que es rica en GC como es característico para muchos factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento (Kozak, J. Cell Biol. 115:887-903 [1991]).

[0083] La secuencia de proteína prevista incluye una región transmembrana (aminoácidos 538-563) que divide la HpTK5 en dominios extracelulares (ECD) e intracelulares (ICD). El ECD de 538 aminoácidos incluye un péptido señal de 15 aminoácidos y una caja rica en cisteína que contiene 20 residuos de Cys. Además, existen dos repeticiones de fibronectina tipo III que abarcan los aminoácidos 321 a 425 y 435 a 526. La Asn en las posiciones 208, 340 y 341 son posibles sitios para la N-glicosilación.

[0084] El dominio intracelular potencial (ICD) contiene una región consenso quinasa de la posición 613 a 881. Esta región quinasa incluye un consenso potencial de unión a ATP (Gly-X-Gly-X-X-Gly) en el subdominio I en las posiciones 622-627. Una Lys en la posición 647 (subdominio II) corresponde a una Lys invariante entre tirosina quinasas que se cree que son críticas para la reacción de fosfotransferencia. Las regiones distintivas indicativas de especificidad de sustrato sugieren que la HpTK5 es una tirosina en lugar de una serina/treonina quinasa. Éstas incluyen la secuencia en las posiciones 740-745 en el subdominio VI y la secuencia en las posiciones 783-790 en el subdominio VIII. Los residuos de tirosina en las posiciones 601, 619 y 741 son posibles sustratos para actividad tirosina quinasa.

[0085] La secuencia de aminoácidos prevista de HpTK5 que se parece más a la de la subfamilia definida originalmente por EPH. El patrón de expresión de la subfamilia de EPH sugiere un papel en la diferenciación y desarrollo. En particular, la aparición de elementos neurales corresponde con la expresión de ciertos genes relacionados con EPH. Los receptores de la familia de EPH, Hek2 y Elk, son las pTK más estrechamente relacionadas con HpTK5. Comparten una identidad del 79,3 y 76,5% en el ICD, respectivamente, y una identidad del 45 y 42% en el CD, respectivamente.

B. Mapeo (localización) cromosómico de HpTK5

[0086] Se utilizaron ADN híbridos de células somáticas de un panel de 25 líneas de células humanas-hámster (Bios, New Haven, CN) para la localización cromosómica por PCR. Se eligieron dos grupos de cebadores de la región 3’ no traducida de HpTK5. Se realizó la PCR con 250 ng de ADN y 50 pmol de cada uno de los cebadores 5’ y 3’, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, gelatina 20 !g/ml, dNTP 0,2 mM y 2,5 unidades de Taq polimerasa en un volumen final de 100 !l. Los ciclos de 94°C durante 30 s, 60°C durante 30 s y 72°C durante 30 s se repitieron 30 veces. Se sometió a electroforesis una parte de cada muestra (15 !l) a través de un gel de agarosa al 1,5%, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó a una sonda de ADNc de HpTK5 de longitud completa marcada con 32P antes de una autorradiografía de 5 horas. Se anotaron los positivos y se compararon con un resumen de la matriz de material cromosómico humano presente en cada uno de los ADN híbridos de células somáticas.

[0087] La región 3’ no traducida contiene de forma característica algunas, si están presentes, secuencias intermedias y presenta un grado elevado de diversidad entre los miembros de de familias de genes haciéndola preferida en este tipo de análisis. Ambos grupos de cebadores produjeron resultados que eran concordantes con sólo el cromosoma 7 humano. El cromosoma 7 humano también incluye los genes para el receptor de EGF, el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), HGF, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la interleuquina-6. Las anormalidades cariotípicas que implican este cromosoma son habituales entre las leucemias humanas, particularmente en leucemias mieloides agresivas que aparecen después de la radiación, quimioterapia con agente alquilante o una enfermedad mielodisplásica existente (Baer et al., Curr, Opin. Oncol. 4,:24-32 [1992]).

C. Transferencia Northern de HpTK5

[0088] Se sometió a electroforesis un ARN seleccionado de Poli-A a través de una agarosa al 1,2%, gel de formaldehído 2,2 M y se transfirió a un filtro de nylon. Se hibridaron filtros preparados u obtenidos comercialmente en formamida al 50% a 42oC a HpTK5 marcada con 32P, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o inserciones de ADNc de actina y se lavaron bajo condiciones astringentes (lavado final: 0,1 x SSC, SDS al 0,2% SDS a 65°C). SSC es NaCl 0,15 M/Na3·citrato 0,015M, pH 7,6. Las transferencias Northern de ARN de tejido fetal o adulto humano se obtuvieron de Clontech (Palo Alto, CA) y contenían 2 !g/carril de ARN seleccionado de poly A.

[0089] El análisis por transferencia Northern de tejidos fetales humanos reveló un único transcrito de 4Kb en el corazón, pulmón, hígado y riñón, con una señal menor detectable en el cerebro. En tejido humano adulto, no se detectó señal en cerebro, mientras que la placenta presentaba una señal particularmente intensa seguida del riñón, hígado, pulmón y páncreas. El músculo esquelético y el corazón presentaban una intensidad de señal inferior.

[0090] También se analizó la expresión de HpTK5 en líneas celulares de tumor humano mediante análisis de transferencia Northern realizado tal como se ha descrito anteriormente. Las líneas celulares derivadas de hígado, mama (MCF 7), (Colo 205), pulmón (NCI 69), melanocito (HM-1) o cuello del útero (HeLa) presentaban una señal detectable de tamaño apropiado. El mensaje estaba presente en líneas celulares seleccionadas de origen hematopoyético. K562 (una célula mieloide primitiva con multipotencial), THP-1 (una célula monocitoide), U937 (una línea celular mielomonocítica), Hep3B (una línea celular de hepatocarcinoma humano), y CMK (de origen megacariocítico) fueron todas positivas para el mensaje de HpTK5, pero linfoide (H9, Jurkat, JH-1, Raji, Ramos) u otras células mieloides seleccionadas (KG-1 o KMT2) no presentaban un transcrito detectable mediante análisis Northern.

[0091] La expresión diferencial del transcrito de HpTK5 en cerebro fetal frente a cerebro adulto sugiere que la HPTK5 puede compartir, con otros miembros de la subfamilia de EPH, un papel en sucesos relacionados con el desarrollo neural. Sin embargo, a diferencia de algunos miembros de la subfamilia de EPH que se expresan exclusivamente en neuronas (Maisonpierre et al., supra), la HpTK5 se expresa ampliamente en otros tejidos. En particular, la HpTK5 se expresa en células hematopoyéticas que incluyen células progenitoras hematopoyéticas CD34+. La presencia del mensaje de HpTK5 en células hematopoyéticas tempranas y líneas celulares de linaje mieloide, pero no en líneas celulares derivadas de células linfoides, sugiere que la HpTK5 puede presentar una expresión limitada al linaje.

EJEMPLO 3

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA HPTK5

[0092] Se construyó un gen de fusión de Fc de IgG1 humana y el dominio extracelular (ECD) de HpTK5 y se produjo una proteína de fusión tal como se ha descrito previamente (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 [1991]). Se generaron anticuerpos policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda contra la proteína de fusión; se emulsionaron 4 !g en 100 !l de PBS con 100 !l de adyuvante de Freund (adyuvante completo para la inyección primaria y adyuvante incompleto para todos los refuerzos). Para la inmunización primaria y el primer refuerzo, se inyectó la proteína directamente en los nódulos linfáticos poplíteos (Sigel et al., Methods Enzymol. 93:3-12 [1983]). Para los refuerzos posteriores, la proteína se inyectó en sitios subcutáneos e intramusculares. Se inyectaron 1,3 !g proteína/kg de peso corporal cada 3 semanas con sangrados tomados 1 y 2 semanas después de cada refuerzo. La especificidad de HpTK5 del suero de conejo inmunizado se valoró mediante análisis citométrico de flujo de células NIH3T3 transfectadas con HpTK5 de longitud completa o vector solo utilizando una dilución 1:200 de suero preinmune o suero de Fc de IgG anti-HpTK5. Se observaron desplazamientos significativos en los picos en varios clones que expresaban HpTK5 en comparación con los controles transfectantes de suero preinmune o vector solo.

EJEMPLO 4

UTILIDAD Y ACTIVIDAD AGONISTA DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA HPTK5

A. Construcción de la fusión FLAG-HpTK5

[0093] Se ligaron oligonucleótidos solapantes que codifican un péptido de 12 aminoácidos que tiene la secuencia MDYKDDDDKKLAM (SEC ID NO: 39) que incluye el sitio de reconocimiento de anticuerpo de 4 aminoácidos "FLAG" (IBI, New Haven, CT) un sitio de restricción 5’-EcoRV y un sitio de restricción 3’-NcoI (5’-CCGGATATCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGCTTGCCATGGAGCTC; SEC ID NO: 40), en el sitio NcoI (base 88) de HpTK5 en el vector Bluescript digerido con EcoRV (Stratagene, La Jolla, CA).

B. Transcripción y traducción in vitro

[0094] La transcripción se realiza en 2 pmol de PTK5 linealizado o plásmido que contenía FLAG-HpTK5 a 37°C durante 1 hora en un volumen de 50 !l que contenía ditiotreitol 10 mM, 2,5 !g de albúmina de suero bovino, 0,25 mM de cada dNTP, recubrimiento m7GRNA 0,5 M (New England Biolabs, Beverly, MA), 2,5 unidades de RNasin (Promega, Madison, WI), 3 unidades T3 ARN polimerasa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se añadió 1 !g de DNAasa (New England Biolabs, Beverly MA) durante 15 min a 37°C antes de la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol. La traducción se realizó utilizando el kit de de lisado de reticulocitos de conejo Promega según las instrucciones de fabricante con o sin el marcaje con 35S-metionina (350 !Ci). Se añadió tampón de muestra que contenía SDS y beta-mercaptoetanol 2-ME) antes de la ebullición y SDS-PAGE al 10%.

C. Expresión de HpTK5 en células NIH3T3

[0095] Se subclonaron un fragmento de ADNc Clal - Xbal de 4038 pb que contenía 23 pb de secuencia enlazadora, 37 pb de polienlazador pBluescript (Stratagene La Jolla, CA) y el ADNc de HpTK5 de 3969 pb completo en el vector de pRIS (Genentech, Inc.) bajo el control del promotor LTR del virus de sarcoma de Rous. Las células NIH3T3 mantenidas en un Medio de Eagle Modificado por Dulbecoo con glucosa elevada (DMEM) suplementado con FCS al 10% se cotransfectaron con pRIs-HpTK5 y pNeo (un vector basado en Sv40 que contenía el marcador de resistencia a neomicina) mediante el método de fosfato de calcio descrito por Gorman et al., en DNA Prot. Engineer. Tech. 2:310 [1990]. Las colonias de resistencia a neomicina se seleccionaron 48 horas después de la transfección con Geneticina (Gibco/BRL) a 400 !g/ml. Catorce días después se aislaron las colonias resistentes individuales, se expandieron y analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de HpTK5 utilizando antisuero policlonal de conejo.

D. Inmunoprecipitación

[0096] Se utilizaron células (Hep3B, control NIH3T3 o NIH33T3 transfectadas con HpTK5) o proteína traducida in vitro (HpTK5 o FLAGHpTK5) para la inmunoprecipitación con suero (pre-inmune o anti-HpTK5-IgG Fc) o anticuerpo monoclonal (específico de FLAG, M2, o control de isotipo) (IBI, Rochester, NY). Las células subconfluentes se marcaron con 200 !Ci/ml de 35S-metionina durante 18 horas y se lisaron en tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, azida sódica 0,025, N-40 al 1%, SDS al 0,1%, glicerol al 10%, desoxicolato sódico al 0,5%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, apronitina 10 !g/ml, leupeptina 10 !g/ml y vanadato de sodio 50 !M) durante 30 min en hielo. El lisado celular se centrifugó (12,000 X g) durante 10 min a 4°C. El sobrenadante del lisado celular o mezcla de traducción in vitro se preaclaró con 0,05 volumen de suero de conejo normal y se adsorbió con 0,05 volumen de proteína A Sefarosa CL4B de Staphylococcus aureus. Después de la centrifugación, el suero preinmune o inmune (dilución 1:100), o anticuerpo monoclonal, se añadieron y agitaron durante la noche a 4°C antes de añadir 100 !l de proteína A Sefarosa CL4B y la solución se agitó a 4°C durante 2 h adicionales. Se lavaron los inmunoprecipitados, se suspendieron en un tampón de carga de SDS/PAGE (glicerol al 10%, 2-ME al 5%, SDS al 2,3% y Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8), se calentaron hasta 95°C durante 5 min y se analizaron mediante SDS-PAGE al 7,5%.

E. Fraccionamiento celular

[0097] El fraccionamiento celular de células Hep3B se realizó para confirmar la localización en la membrana de HpTK5 prevista mediante su secuencia de aminoácidos. Las células Hep-3B (1x107) se marcaron durante toda la noche con 200 !Ci/ml de 35S-metionina en un medio alfa MEM que contenía FCS dializado al 10%. Las células se lavaron dos veces con PBS frío, se extrajeron en 1 ml de tampón frío (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, EGTA 5 mM, sacarosa 0,25 M, leupeptina al 0,01%, PMSF 4 mM, 2-ME 10 mM) y se alteraron mediante sonicación durante 40 segundos. Se centrifugaron los homogenatos completos a 12.000 X g durante 15 min, se aislaron los residuos nucleares y el sobrenadante decantado se centrifugó a 140.000 X g durante 40 min a 4°C para obtener residuos de membranas. El sobrenadante resultante se utilizó como la fracción citosólica (C). Las fracciones nucleares (N) y de membrana (M) se lavaron y disolvieron en tampón que contenía NP-40 al 0,5% antes de la inmunoprecipitación. Las fracciones c, N o M se inmunoprecipitaron con un suero anti-HpTK5 o pre-inmune (control), se sometieron a SDS-PAGE al 12% y se autorradiografiaron. La HpTK5 se segregó predominantemente con la fracción de membrana, aunque el material inmunoprecipitado era evidente en un grado menor en el citosol.

F. Ensayo de proteína quinasa

[0098] Se lavaron los inmunoprecipitados una vez con tampón quinasa (Hepes 25 mM pH 7,4, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM, MnCl 10 mM) y se resuspendió en 40 !l de tampón quinasa que contenía ATP no marcado o 10 !Ci de 32P-ATP (3000 Ci/mM). Después de una incubación de 10 minutos a 30°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 40 !l

de 2 X tampón de muestra y la ebullición de las muestras durante 3 min antes de la electroforesis en gel SDS-PAGE al 8,0%. El gel secado se cubrió con 4 láminas de papel de aluminio para bloquear la autorradiografía de proteína marcada con 35S y el gel se colocó bajo una película durante 5 horas durante la noche.

G. Transferencia Western y ensayo de fosfotirosina

[0099] Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 !m (Bio-Rad) o una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,45 !m (Millipore) en un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), glicina 192 mM y metanol al 20% a 100 mA durante 2 horas. Los filtros se lavaron en TBS (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM) , se bloquearon durante la noche mediante la incubación en TBST (TBS con Tween-20 al 0,05%) más BSA al 5%. Los filtros se lavaron cuatro veces durante 5 minutos cada uno en TBST y se incubaron durante 2 horas con anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 de UBI (dilución 1:1000 en TBST). Los filtros se lavaron cuatro veces durante 5 minutos cada uno en TBST y se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (Promega) a una dilución 1:7500 en TBST. Después de lavarse cuatro veces, se reveló la transferencia durante 30-60 min en tampón AP (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) más sustratos BCIP, NBT.

H. Ensayo de fosforilación inducido por anticuerpo

[0100] Se analizó el anticuerpo de conejo para HptK5-Fc de IgG por su capacidad de inducir la fosforilación de HpTK5 en células NIH3T3 transfectadas con HpTK5. Las células se emplacaron a una densidad de 5 x 105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y, después de 24 horas, se privaron de suero durante 1 hora antes de la adición de suero pre-inmune o inmune a una dilución de 1:50 durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron en PBS y se lisaron en 2X tampón de muestra o tampón de lisis NP-40 tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, los lisados crudos o lisados de células inmunoprecipitadas se separaron a través de un gradiente de SDS-PAGE al 4-12% y se analizaron mediante inmunotransferencia anti-fosfotirosina tal como se ha descrito anteriormente. Las células que expresaban HpTK5 se expusieron a antisuero y se separaron mediante SDS-PAGE con sin inmunoprecipitación. El gel electrotransferido se inmunotransfirió con anticuerpo antifosfotirosina. Se observó una mayor fosforilación de tirosina de HpTK5 después de la exposición a antisuero policlonal mostrando un efecto de tipo agonista de la unión a anticuerpo. La interacción de HpTK5 con un anticuerpo dirigido contra su ECD induce la fosforilación. Esto apoya además que el HpTK5 pueda servir como receptor para un ligando que desencadena la activación de quinasa. Los detalles del mecanismo de señalización de HpTK5 se pueden explorar adicionalmente utilizando antisuero como ligando sustituto.

I. Conclusiones

[0101] Se expresó una proteína de fusión HpTK5-Fc de IgG, se purificó y utilizó para generar anti-suero de conejo que inmunoprecipitó una proteína de 120 kD de células Hep3B. La especificidad del antisuero se confirmó mediante inmunoprecipitación de ARN de HpTK5 traducido in vitro y células NIH3T3 transfectadas con HpTK5. Para determinar la capacidad funcional de HpTK5, se inmunoprecipitó la HpTK5 traducida in vitro, se expuso a condiciones de quinasa y se inmunotransfirieron utilizando un anticuerpo monoclonal específico de fosfotirosina. Los datos obtenidos indicaron que la HpTK5 se fosforila en tirosina. Sin embargo, la presencia de otras bandas que aparecían sistemáticamente en la inmunoprecipitación marcada con 32P sugirió que la proteína HpTK5 estaba únicamente parcialmente purificada y, por lo tanto, no se podía concluir que la HpTK5 era enzimáticamente activa. Para superar este problema, se generó una construcción de fusión en la que se añadió un epítopo de 8 aminoácidos (FLAP) al extremo N-terminal de HpTK5. La fusión FLAG-HpTK5 se tradujo in vivo y se inmunoprecipitó con un anticuerpo monoclonal específico de FLAG dando lugar a una única proteína de tamaño adecuado ( 120kD). Cuando se sometió a las condiciones de quinasa en presencia de 32P-ATP, la proteína de fusión HpTK5-FLAG se marcó en la tirosina confirmando la autofosforilación de tirosina la autofosforilación de tirosina y, de este modo, la función quinasa de HpTK5.

EJEMPLO 5

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA HPTK5

[0102] Se produjeron anticuerpos monoclonales anti-HpTK5 mediante la hiperinmunización intraperitoneal de ratones BALB/c con la proteína de fusión Fc de IgG1 Humana-dominio extracelular (ECD) de HpTK5 (producida utilizando las técnicas descritas anteriormente) en adyuvante RIBI (RIBI ImmunoChem Research, Hamilton, MT) y la fusión de esplenocitos con la línea celular de mieloma de ratón X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123:15481550 [1979]). Se purificaron los anticuerpos del fluido ascítico utilizando proteína A Sefarosa (Repligen Corp., Cambridge, MA) y se establecieron procedimientos de cromatografía de afinidad (Goding, J.W., J. Immunol. Methods 20:241-253 [1978]).

[0103] Se cribaron anticuerpos monoclonales por su capacidad de unirse al antígeno de HpTK5. Comenzando en el día 15 después de la fusión, se recogieron los sobrenadantes del cultivo de las placas de fusión y se analizó su capacidad de "capturar" específicamente HpTK5-IgG. En este ensayo ELISA, se recubrió la IgG anti-ratón de cabra en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron los sobrenadantes de cultivo (100 μl) a los pocillos y se unieron las IgG de ratón presentes mediante los anticuerpos IgG anti-ratón de cabra. Se lavaron las placas y se añadió HpTK5-IgG o CD4-IgG (100 μl a 6 nM). Se detectó inmunoadhesina "capturada" utilizando un conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-hu de cabra (específico de Fc) y sustrato de ortofenilen diamina. Se determinó la cuantificación de catálisis de sustrato mediante la densidad óptica a 490 nm.

[0104] A continuación, se cribaron los anticuerpos agonistas para utilizar las técnicas descritas en el Ejemplo 6 siguiente. Se identificaron dos anticuerpos monoclonales agonistas, uno de los cuales fue depositado con la ATCC.

EJEMPLO 6

ACTIVIDAD AGONISTA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA HPTK5

[0105] Se evaluaron los anticuerpos monoclonales producidos utilizando las técnicas descritas en el Ejemplo 5 por su capacidad de inducir la fosforilación de HpTK5 en células NIH3T3 transfectadas con HpK5. Se pusieron en placas las células a una densidad de 5 x 105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y, después de 24 horas, se les privó de suero durante 1 hora antes de añadir suero pre-inmune o anticuerpo monoclonal anti-HpTK5 (se utilizaron medios de hibridoma acondicionados sin diluir) durante 30 minutos. A continuación, se lavaron las células en PBS y se lisaron en 2X de tampón de muestra o tampón de lisis NP-40 tal y como se ha descrito anteriormente. A continuación, se separaron los lisados crudos o los lisados de células inmunoprecipitadas mediante gradiente de SDS-PAGE al 4-12% y se analizaron mediante inmunotransferencia de antifosfotirosina tal y como se ha descrito anteriormente. Se expusieron células que expresaban HpTK5 al anticuerpo monoclonal y se separaron mediante SDS-PAGE con o sin inmunoprecipitación. El gel electrotransferido se inmunotransfirió con anticuerpo antifosfotirosina. Se observó una mayor fosforilación de tirosina de HpTK5 después de la exposición a anticuerpos monoclonales mostrando un efecto de tipo agonista de la unión a anticuerpo. Por consiguiente, la interacción de HpTK5 con un anticuerpo monoclonal dirigido contra su ECD es capaz de inducir la fosforilación del dominio quinasa del mismo.

EJEMPLO 7

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES PARA SAL-S1

[0106] Se construyó un gen de la fusión dominio extracelular (ECD) de SAL-S1-Fc de IgG1 humana y se produjo la proteína de fusión tal como se ha descrito previamente en Bennett et al., J. Biol. Chem. 266:23060-23067 [1991]. Brevemente, los cebadores de PCR otk 1.41.1 (SEC ID NO: 43) y otk 1.41.2 (SEC ID NO: 44) se utilizaron en la técnica de PCR utilizando el plásmido pRK5.tk1-1.1 (SEC ID NO: 45) que contenía el ácido nucleico de SAL-S1 como plantilla para crear un fragmento de ADN que, cuando se digiere con SalI/BstEII, generó un fragmento SalI/BstEII de 155 pb. Este fragmento de 155 pb se combinó con un fragmento SalI/HindIII de 6839 pb aislado de pRKS.tk1-1.1 y un fragmento BstEII/HindIII de 719 pb aislado de pBSSK-CH2-CH3 (Bennett et al., supra). Estos fragmentos se ligaron para crear un plásmido pRK5.tk1.igl.1 (7713 pb de tamaño) que, cuando se transfectaron en células 293, se utilizaron para producir una proteína de fusión del dominio extracelular (ECD) de SAL-S1-Fc de IgG humana. La proteína de fusión se preparó y purificó tal como se ha descrito en Bennett et al., supra. Se generaron anticuerpos policlonales en conejos blancos hembra de Nueva Zelanda contra la proteína de fusión. Brevemente, se emulsionaron 12,5 !g de proteína de fusión en 0,625 ml de PBS con 0,625 ml de adyuvante de Freund (adyuvante completo para la inyección primaria y adyuvante incompleto para todos los refuerzos). La inyección primaria y todos los refuerzos fueron intramusculares en dos sitios y subcutáneos en múltiples sitios. Los refuerzos se realizaron en intervalos de 3 semanas con sangrados tomados 1 y 2 semanas después de cada refuerzo. La especificidad de SAL-S1 del suero de conejo inmunizado se valoró mediante análisis citométrico de flujo de 293 (ATCC CRL 1593) y COS7 (ATCC CRL 1651) transfectadas con Sal-S1 de longitud completa o vector solo (ver a continuación) utilizando una dilución 1:200 de suero pre-inmune o suero anti-SAL-S1-Fc de IgG. Se observaron desplazamientos significativos de los picos en varios clones que expresan SAL-S1 en comparación con el suero preinmune o controles transfectantes de vector solo.

EJEMPLO 8

UTILIDAD Y ACTIVIDAD AGONISTA DE ANTICUERPOS POLICLONALES SAL-S1

A. Inmunoprecipitación

[0107] Se utilizaron células de control 293 y COS7 además de las células 293 y COS7 transfectadas con SAL-S1 para inmunoprecipitación con suero pre-inmune o anticuerpo policlonal anti-SAL-S1-Fc de IgG. Se transfectaron las células COS7 y 293 utilizando un procedimiento de CaPO4 tal y como describe Gorman, C. DNA Cloning, Glover D. Ed., IRL Press, Oxford, vol2: 143-190 (1985). Para la expresión transitoria, se transfectaron células 293 tal y como describe Gearing et al. EMBO 8: 3667-3676 (1989). Se marcaron células subconfluentes con 200μCi/ml de 35Smetionina durante 18 horas y se lisaron en tampón de lisis (NaCl 150 mM, HEPES 50mM, pH 7,5, EGTA 1 mM, azida de Na 0,025, Triton-X 100 al 1%, MgCl2 1,5mM, Glicerol al 10%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] 1 mM, aprotinina 10 μg/ml, leupeptina 10 μg/ml y vanadato de Na 50 μM) durante 10 min en hielo. Se centrifugó el lisato celular (12.000 X g) durante 10 min a 4°C. Después de la centrifugación, se añadió anticuerpo preinmune o policlonal al sobrenadante y se giró durante 4 horas a 4ºC antes de añadir 100 μl de proteína-A Sefarosa CL4B y la solución se agitó a 4ºC durante 2 horas adicionales. Se lavaron los inmunoprecipitados, se suspendieron en tampón de carga SDS/PAGE (glicerol al 10%, 2-ME al 5%, SDS al 2,3% y Tris-HCl 62,5mM pH 6,8), se calentaron hasta 95ºC durante 5 min y se analizaron mediante SDS-PAGE al 7,5%.

B. Transferencia western y ensayo de fosfotirosina

[0108] Se transfirieron electroforéticamente las proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm (Bio-Rad) o una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,45 μm (Millipore) en un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), glicina 192 mM y metanol al 20% a 100 mA durante 2 h. Se lavaron los filtros en TBS (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM), se bloquearon mediante incubación en TBST (TBS con Tween-20 al 0,05%) más BSA al 5% durante toda la noche. Se lavaron los filtros cuatro veces durante 5 min cada uno en TBST y se incubaron durante 2 h con anticuerpo 4G10 anti-fosfotirosina de UBI (dilución 1:1000 en TBST). Se lavaron los filtros cuatro veces durante 5 min cada uno en TBST y se incubaron durante 1 h con fosfatasa alcalina marcada con anticuerpo secundario antiratón (Promega) en una dilución 1:5000 en TBST. Después de lavar cuatro veces, se reveló la transferencia durante 30-60 min en tampón AP (Tris-HCl 100mM, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM) más sustratos BCIP, NBT.

C. Ensayo de fosforilación inducida por anticuerpo

[0109] Se evaluaron los antisueros de conejo para SAL-S1-Fc de IgG por su capacidad de inducir la fosforilación de SAL-S1 en células 293 transfectadas con SAL-S1. Se pusieron en placas las células a una densidad de 5 x 105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y, después de 24 horas, se les privó de suero durante 12 horas antes de añadir suero pre-inmune o suero inmune en una dilución 1:5 durante 30 minutos. A continuación se lavaron las células en PBS y se lisaron en tampón de muestra o tampón de lisis Triton-X tal y como se describe anteriormente. A continuación, se separaron lisatos crudos o lisatos de células inmunoprecipitadas mediante gradiente de SDS-PAGE al 8% o al 4-12% y se analizaron mediante inmunotransferencia de antifosfotirosina tal y como se describe anteriormente. Se expusieron células que expresaban SAL-S1 a antisueros y se separaron mediante SDS-PAGE con o sin inmunoprecipitación. El gel electrotransferido se inmunotransfirió con anticuerpo anti-fosfotirosina. Se observó una mayor fosforilación de tirosina de SAL-S1 después de la exposición a antisuero policlonal mostrando un efecto de tipo agonista de la unión a anticuerpo. La interacción de SAL-S1 con un anticuerpo dirigido contra su ECD induce la fosforilación

EJEMPLO 9

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA SAL-S1

[0110] Se produjeron anticuerpos monoclonales anti-SAL-S1 mediante la hiperinmunización de ratones BALB/c en la base de la pata con la proteína de fusión Fc de IgG1 humana-dominio extracelular de SAL-S1 en adyuvante de RIBI (RIBI Immunochem Research, Hamilton, MT) y la fusión de linfocitos de nódulos linfáticos con la línea celular de mieloma de ratón X63-Ag8U1.

[0111] Empezando en el día 10 después de la fusión, se recogieron los sobrenadantes cultivados de las placas de fusión y se ensayó su capacidad de unirse a SAL-S1. En este ensayo ELISA, se recubrió IgG1 SAL-S1 en placas de microtiulación de 96 pocillos. Se añadieron los sobrenadantes cultivados (100 μl) a los pocillos y se unieron los anticuerpos de ratón presentes a IgG1 SAL-S1. Se lavaron las placas y se detectó IgG de ratón utilizando un conjugado de peroxidasa de rábano picante con IgG de cabra anti-ratón (Fc específico sin reactividad cruzada contra Fc de IgG humano) y sustrato de ortofenilen diamina. Se determinó la cuantificación de catálisis de sustrato mediante densidad óptica a 490 nm.

[0112] A continuación, se evaluaron los sobrenadantes cultivados que fueron positivos en ELISA por su capacidad de unirse específicamente a 293 transfectadas con receptor de SAL-S1 y se analizaron mediante citometría de flujo. A continuación, se cribaron los anticuerpos agonistas para utilizar las técnicas descritas en el Ejemplo 10 siguiente. Se identificaron seis anticuerpos monoclonales agonistas.

EJEMPLO 10

ACTIVIDAD AGONISTA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA SAL-S1

[0113] Se evaluaron los anticuerpos monoclonales por su capacidad de inducir la fosforilación de SAL-S1 en células 293 transfectadas con SAL-S1. Las células se recogieron de la placa de cultivo tisular mediante tampón de ensayo y se lavaron 2 veces con el mismo tampón. Se añadieron 1x105 células a una placa de base U de 96 pocillos que se centrifugó y se extrajo el tampón de ensayo. Se añadieron 150 !l de sobrenadantes de cultivo a cada pocillo seguido de incubación a 37°C durante 30 minutos, la placa se centrifugó y se extrajeron los sobrenadantes de cultivo. Se añadieron 100 !l de solución de fijación, las células se fijaron durante 30 minutos a -20°C, las células se lavaron con tampón dos veces y se tiñeron con conjugado anti-fosfotirosina con FITC durante 60 minutos a 4°C. Las células se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan Becton Dickinson, milplitas, CA). Los seis anticuerpos monoclonales anti-SAL-S1 eran capaces de inducir la fosforilación de SAL-S1 en células 293 transfectadas con SAL-S1

Depósito de materiales

[0114] Los siguientes materiales se han depositado con la American TIPO Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Hibridoma ATCC Dep. No. Data del depósito Anti-HpTK5 HB 11.583 15 de marzo de 1994

[0115] Este depósito se realizó según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha del depósito. El organismo estará disponible mediante la ATCC según los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al uso público tras la concesión de la respectiva patente estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie a la persona autorizada por el Comisionado de Estados Unidos de Patentes y Marcas de acuerdo con la norma 35 USC § 122 y las normas del Comisionado según lo acordado (incluyendo 37 CFR § 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

[0116] El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente remplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

[0117] La memoria escrita anterior se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la invención. La presente invención no se limita en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente invención y cualquier cultivo que sea funcionalmente equivalente están dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, las diversas modificaciones además de las mostradas y descritas en la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior.

LISTADO DE SECUENCIAS [0118]

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc. Bennett, Brian D. Goeddel, David Lee, James M. Matthews, William Tsai, Siao Ping Wood, William I.

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS AGONISTAS DE PROTEÍNA TIROSINA QUINASA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 45

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: Genentech, Inc.

(B): CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

(C): CIUDAD: South San Francisco

(D): ESTADO: California

(E): PAÍS: USA

(F): CP: 94080

(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: disquete de 5.25 pulgadas, 360 Kb

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: patin (Genentech)

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE SOLICITUD:

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/222616

(B): FECHA DE SOLICITUD: 04-APR-1994

(viii) INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE:

(A): NOMBRE: Wendy M. Lee

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 00,000

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 821P3PCT

(ix) INFORMACIÓN DE COMUNICACIÓN:

(A): TELÉFONO: 415/225-1994

(B): TELEFAX: 415/952-9881

(C): TELEX: 910/371-7168

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1: CGGATCCACA GNGACCT 17

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2: GGAATTCCAA AGGACCAGAC GTC 23

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3: CGGATCCATC CACAGAGATG T 21

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 26 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4: GGAATTCCTT CAGGAGCCAT CCACTT 26

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 160 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 53 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 147 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 49 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 47 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:11:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 151 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 50 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:13:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 137 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:14:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 45 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:15:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 211 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:16:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 70 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:17:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 6827 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17: 10

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:18:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 348 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:19:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 7607 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:19:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:20:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 505 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:20:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:21:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 404 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:21:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:22:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3120 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:22:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:23:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3969 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:23:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1276 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:24:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:25:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 59 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:25:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:26:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 54 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:26:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:27:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 54 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:27:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:28:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:28:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:29:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:29:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:30:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:30:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:31:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 4425 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:31:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:32:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 4425 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:32:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:33:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1298 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:33:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:34:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3348 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:34:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:35: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3348 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:35:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:36:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1104 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:36:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:37:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:37: TCGGATCCAC ACGNGACTCT TGGC 24

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:38:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 28 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:38: TCGGATCCAC TCAGNGACTC TTNGCNGC 28

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:39:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:39: CTCGAATTCC AGATAAGCGT ACCAGCACAG TC 32

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:40:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:40: CTCGAATTCC AGATATCCGT ACCATAACAG TC 32

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:41:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:41:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:42:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 54 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:42:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:43: AGGCTGCTGG AGGAAAAGTC TG 22

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:44: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:44: GGAGGGTGAC CTCCATGCTG CCCTTATCCT CG 32

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:45:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 9108 bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:45: 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo agonista que se une al dominio extracelular del dominio quinasa de un receptor proteína tirosina

quinasa (pTK) SAL-S1 y lo activa. 5
2.

Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.
3.

Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 y un portador

farmacéuticamente aceptable. 10
4. Método in vitro para activar el dominio quinasa de un receptor proteína tirosina quinasa (pTK) SAL-S1, comprendiendo el método poner en contacto pTK con un anticuerpo agonista que se une al dominio extracelular del receptor pTK.

15 5. Anticuerpo agonista según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o la composición farmacéutica según la reivindicación 3, para utilizar como medicamento.