ES2340205T3 - Anticuerpos anti-egfr. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que inhibe la activación del EGFR y que se une a EGFR con una Kd de entre 0,01 pM y 10 pM, que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), seleccionándose dicha HCVR y dicha LCVR de: a)una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 50 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 67; b)una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 51 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 68; c)una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 55 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 72; y d)una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 73.
Description
Anticuerpos anti-EGFR.
La invención pertenece al campo de la medicina,
particularmente al campo de los anticuerpos monoclonales contra el
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Más
específicamente, la invención se refiere a anticuerpos
anti-EGFR humanizados de alta afinidad y al uso de
los anticuerpos para la terapia, la profilaxis o el diagnóstico de
diversos cánceres.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR) es un miembro de la familia tirosina quinasa de receptores
de superficie celular que se expresan ampliamente en tejidos
epiteliales, mesenquinatosos y neuronales y desempeñan papeles
fundamentales durante el desarrollo y la diferenciación. El EGFR,
también conocido como HER1 o
c-erbB-1, es una glicoproteína
transmembrana de 170 kDa constituida por un dominio de unión a
ligando extracelular, una región transmembrana y un dominio
intracelular con actividad tirosina quinasa (Ullrich y col., Human
Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant Expression of
the Amplified Gene in A-431 Epidermoid Carcinoma
Cells, Nature, Vol. 309, 418-25 (1986)). Los
ligandos de mamíferos que se unen a y activan el EGFR incluyen EGF,
factor de crecimiento transformante \alpha (TGF\alpha), factor
de crecimiento similar a EGF de unión a heparina, anfirregulina,
beta-celulina, epirregulina y epigen (Singh, A. y
Harris, R., 2005, Cellular Signaling 17:
1183-1193). La unión de los factores de crecimiento
EGF o factor de crecimiento transformante \alpha (TGF\alpha) al
receptor del factor de crecimiento epidérmico da como resultado la
dimerización del receptor, la autofosforilación y la inducción de
una cascada de tirosina quinasas que conducen en última instancia a
la síntesis de ADN y a la división celular.
El EGFR se activa de forma anormal en muchos
tumores epiteliales, incluyendo los del cáncer pulmonar no
microcítico, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cánceres de cabeza
y cuello y cáncer de próstata (Adams, G. y Weiner, L., 2005, Nature
Biotechnology, 23: 1147-1157). La activación anormal
del EGFR puede surgir de la sobreexpresión del receptor, la
amplificación génica, mutaciones activantes, la sobreexpresión de
ligandos del receptor y/o la pérdida de reguladores de la actividad
de EGFR (Baselga, J. y Arteaga, C., 2005, J. of Clin. Oncol. 23:
2445-2459). Una activación de EGFR anormalmente
elevada da como resultado la fosforilación de varios sustratos
intracelulares, que a su vez da origen a una señalización
mitogénica, así como a otras actividades inductoras de tumores. Por
consiguiente, el EGFR es una diana para estrategias terapéuticas
anticancerosas que pueden inhibir o reducir potencialmente la
expresión anormal del receptor.
Los agentes anticancerosos que se dirigen a EGFR
incluyen anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal
quimérico C225 (o cetuximab), que contiene la región variable murina
del mAb225 y una región constante de IgGl humana, está disponible
actualmente para el tratamiento del cáncer de colon resistente al
tratamiento con irinotecán en los Estados Unidos y en Europa
(Baselga, J. y Arteaga, C., 2005, J. of Clin. Oncol. 23:
2445-2459). Además, se han estudiado anticuerpos
monoclonales tanto humanos como humanizados contra EGFR. El
anticuerpo totalmente humano ABX-EGF (panitumumab)
tiene una afinidad por el EGFR aproximadamente 8 veces superior a
la del C225 (Yang, X-D y col., 2001, Crit. Rev.
Oncol./Hemat., 38: 17-23). La afinidad del
anticuerpo humanizado EMD72000 (matuzumab) por el EGFR es similar a
la del C225 (Vanhoefer, U. y col., 2004, J. Clin Oncol., 22:
175-184) y la afinidad del anticuerpo humanizado
h-R3 por el EGFR es menor que la del C225 (Crombet,
T. y col., 2004, J. Clin. Oncol., 22: 1646-1654). Se
han observado complicaciones en la clínica con dosis de cetuximab
superiores a 100 mg/m^{2}. Incluyen toxicidad cutánea, que da como
resultado eritema, dermatitis seborreica y erupción acneiforme
(Herbst, R. y Langer, C., 2002, Semin. Oncol. 29:
27-36).
El documento WO 98/50433 desvela anticuerpos
monoclonales totalmente humanos contra el receptor del factor de
crecimiento epidérmico humano (EGFR). Un anticuerpo, el E2.5, se une
con una afinidad de 16 pM e inhibe la interacción EGFR/EGFR.
El documento WO 96/40210 desvela versiones
quiméricas y humanizadas del anticuerpo
anti-receptor de EGF 225 y fragmentos del mismo
para el tratamiento de tumores. Sin embargo, este anticuerpo no
alcanza una afinidad de 0,1-10 pM.
Existe la necesidad terapéutica de un anticuerpo
anti-EGFR que se una al EGFR con una alta afinidad e
inhiba la activación anormal del EGFR en tumores epiteliales. Un
anticuerpo anti-EGFR de alta afinidad permitiría
que se administrasen dosis menores para eliminar los efectos
secundarios potenciales tales como la toxicidad cutánea. Además,
existe la necesidad de proporcionar un anticuerpo
anti-EGFR que mitigue cualquier respuesta inmune
potencial contra el anticuerpo, que podría inducirse por
dosificación múltiple. La presente invención satisface estas
necesidades y proporciona ventajas relacionadas.
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos
monoclonales específicos de EGFR humanizados y porciones de unión a
antígeno de los mismos, que inhiben la activación del EGFR. Los
anticuerpos de la invención se caracterizan por una alta afinidad
de unión a EGFR, donde un anticuerpo monoclonal
anti-EGFR tiene una afinidad de unión a EGFR (Kd)
de entre aproximadamente 0,01 pM y aproximadamente 10 pM.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a
antígeno del mismo, que inhibe la activación del EGFR y se une a
EGFR con una Kd de entre 0,01 pM y 10 pM, que comprende una región
variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena
ligera (LCVR), seleccionándose dicha HCVR y dicha LCVR de:
- a)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 50 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 67;
- b)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 51 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 68;
- c)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 55 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 72; y
- d)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 73.
Otra realización de la presente invención
incluye el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las realizaciones
anteriores, donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud
completa, un anticuerpo sustancialmente intacto, un fragmento Fab,
un fragmento F(ab')_{2} o un fragmento Fv de cadena
sencilla. Preferentemente, el anticuerpo, o porción de unión a
antígeno del mismo, de cualquiera de las realizaciones anteriores es
un anticuerpo humanizado.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica que
comprende un anticuerpo de acuerdo con la presente invención y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención incluye moléculas de ácido nucleico
aisladas que comprenden polinucleótidos que codifican los
anticuerpos descritos en este documento y vectores, preferentemente
vectores de expresión, que comprenden dichas moléculas de ácido
nucleico. La invención también incluye células huésped transfectadas
con vectores que contienen estos polinucleótidos que expresan los
anticuerpos descritos en el presente documento.
Por último, la invención incluye el uso de un
anticuerpo de acuerdo con la presente invención descrito en el
presente documento, para la fabricación de un medicamento para
tratar un cáncer mediado por EGFR en un sujeto que lo necesite.
La Fig. 1. muestra los resultados de un ELISA de
captura con los Fab 2.69, 4.15, 4.21, anticuerpo quimérico C225 y
anticuerpo humano AGX-EGF.
La Fig. 2. muestra los resultados de un ensayo
de proliferación de células A431 con los Fab 4.14, 4.15, 4.21, 4.4
y anticuerpo quimérico C225 (ch225).
La Fig. 3. muestra la inhibición de la
proliferación de células A431 por anticuerpos de longitud completa
4.15, anticuerpo murino 225 y anticuerpo quimérico C225.
La Fig. 4. muestra la cantidad de EGFR
fosforilado (p-Tyr EGFR) detectado en células A431
preincubadas con los anticuerpos 4.15, 4.21 o anticuerpo quimérico
C225.
La Fig. 5. muestra que la inhibición de la
proliferación de células A431 por anticuerpo 4.15 y anticuerpo
quimérico C225 se correlaciona con la inhibición de la fosforilación
de EGFR.
La Fig. 6. muestra los resultados de un ensayo
para determinar la inducción por anticuerpos de la apoptosis de
células A431 mediante anticuerpos de longitud completa 4.15,
anticuerpo quimérico C225 y anticuerpo humano
ABX-EGF.
La Fig. 7. muestra la inhibición de tumores A431
en un modelo de ratón por anticuerpos de longitud completa 2.69,
4.15, 4.21 y anticuerpo quimérico C225.
Como se usa en el presente documento, la
expresión "receptor del factor de crecimiento epidérmico" o
"EGFR" se refiere al receptor tirosina quinasa de superficie
celular maduro. La expresión "EGFR soluble" o "EGFR" se
refiere a una porción de EGFR que contiene el dominio extracelular
de unión a ligando del EGFR. Más específicamente, el sEGFR contiene
los aminoácidos 1-619 del EGFR maduro (Ullrich y
col., Human Epidermal Growth Factor cDNA Sequence and Aberrant
Expression of the Amplified Gene in A-431 Epidermoid
Carcinoma Cells, Nature, Vol. 309, 418-25
(1986)).
La expresión "cáncer mediado por EGFR" se
refiere a un cáncer caracterizado por tumores epiteliales en los
que el EGFR está anormalmente activado a niveles superiores a los
del tejido epitelial normal correspondiente. Estos niveles
superiores de actividad de EGFR promueven el desarrollo tumoral en
muchos de tipos de cáncer. Dichos cánceres incluyen, pero sin
limitación, cáncer pulmonar no microcícito, cáncer de mama, cáncer
colorrectal, cánceres de cabeza y cuello y cáncer de próstata. La
activación anormal del EGFR puede surgir de la sobreexpresión del
receptor, la amplificación génica, mutaciones activantes, la
sobreexpresión de ligandos del receptor y/o la pérdida de
reguladores de la actividad del EGFR.
El término "anticuerpo", como se usa en el
presente documento, pretende referirse a moléculas de
inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos
cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por
puentes disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región
variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como
HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región
constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1,
CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región
variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como
LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región
constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, el CL.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de
hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de
complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más
conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL
está compuesta por tres CDR y cuatro FR, organizadas del extremo
amino-terminal al carboxi-terminal
en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Generalmente, la asignación de aminoácidos a cada dominio es
conforme a convenciones bien conocidas (por ejemplo, Kabat,
"Sequences of Proteins of Immunological Interest", National
Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) o el esquema de
numeración de Chothia como se describe en
Al-Lazikani y col., J. Mol. Biol. 273:
927-948, 1997). Las CDR de la VH se denominan en el
presente documento HCDR1, HCDR2 y HCDR3. Las CDR de la VL se
denominan en el presente documento LCDR1, LCDR2 y
LCDR3.
LCDR3.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa y
lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa,
delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM,
IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y
pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región
"J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo
también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 3 o
más aminoácidos.
De acuerdo con lo anterior, los anticuerpos de
la presente invención son anticuerpos monoclonales. Sin embargo,
dichos anticuerpos son monoclonales solamente en el sentido de que
pueden obtenerse a partir de un clon de un solo tipo celular. Sin
embargo, esto no pretende limitarlos a un origen particular. Dichos
anticuerpos pueden producirse fácilmente en células que comúnmente
no producen anticuerpos, tales como células CHO, NS0 o COS. Además,
dichos anticuerpos pueden producirse en otros tipos de células,
especialmente células de mamífero e incluso vegetales, por
modificación por ingeniería genética de dichas células para que
expresen y ensamblen las cadenas polipeptídicas ligera y pesada que
forman el producto de anticuerpo. Además, dichas cadenas pueden
sintetizarse químicamente pero, puesto que serían específicas para
un determinante antigénico dado, aún constituirían anticuerpos
"monoclonales" dentro del ámbito en el que se usa ese término.
Por lo tanto, como se usa en el presente documento, la expresión
anticuerpo monoclonal pretende indicar más la especificidad y pureza
de las moléculas de anticuerpo que el simple mecanismo usado para
la producción de dichos anticuerpos.
La expresión "porción de unión a antígeno"
de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere
a esa porción de una molécula de anticuerpo, dentro de la región
variable, que es necesaria para unirse al antígeno de interés. La
porción de unión a antígeno contiene los restos aminoacídicos que
interaccionan con un antígeno y confieren al anticuerpo su
especificidad y afinidad por el antígeno. La función de unión a
antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de
un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de
unión incluidos en la expresión "porción de unión a antígeno"
de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento
monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un
fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende
dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región
bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y
CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de
un solo brazo de un anticuerpo, y (v) un fragmento dAb (Ward y col.,
(1989) Nature 341: 544-546), constituido por un
dominio VH. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y
VH, están codificados por genes separados, pueden unirse usando
procedimientos recombinantes por un engarce sintético que permita
producirlos como una sola cadena proteica en la que las regiones VL
y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas
como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo, Bird y col.
(1988) Science 242: 423-426: y Huston y col. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos
anticuerpos de cadena sencilla también pretenden incluirse en la
expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo.
También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena sencilla
tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes
biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una
sola cadena polipeptídica pero usando un engarce que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la
misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con
dominios complementarios de otra cadena y generando dos sitios de
unión a antígeno (véase por ejemplo, Holliger, P., y col. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak,
R. J., y col. (1994) Structure 2: 1121-1123).
La expresión "anticuerpo humanizado" se
refiere a un anticuerpo que está compuesto parcialmente o totalmente
por secuencias de aminoácidos obtenidas de una línea germinal de
anticuerpos humanos o una secuencia reorganizada y generada por
combinación de dichas secuencias con regiones determinantes de
complementariedad (CDR) no humanas. Las regiones flanqueantes de
las regiones variables se sustituyen por regiones flanqueantes
totalmente humanas o sustancialmente humanas. En un anticuerpo
humanizado para su uso terapéutico en seres humanos, la secuencia
flanqueante es preferentemente totalmente o sustancialmente de
origen humano (es decir, al menos un 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ó
99% de origen humano). Las CDR de un anticuerpo humanizado pueden
optimizarse a partir de las CDR de un anticuerpo no humano del que
proceden para generar las propiedades deseadas, por ejemplo,
especificidad, afinidad y capacidad. Las CDR optimizadas pueden
tener sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en
comparación con las CDR no humanas originales. Como se analiza en el
presente documento, el anticuerpo en el contexto de un anticuerpo
humanizado no se limita a un anticuerpo de longitud completa y
puede incluir porciones antigénicas del mismo, tales como fragmentos
y formas de cadena sencilla.
La expresión "anticuerpo humano", como se
usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos humanos
así como los que se preparan, expresan, generan o aíslan por medios
recombinantes. Los anticuerpos humanos generados por medios
recombinantes incluyen anticuerpos expresados usando un vector de
expresión recombinante transfectado en una célula huésped,
anticuerpos aislados a partir de una biblioteca combinatoria de
anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos aislados de un
animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de
inmunoglobulinas humanas (véase por ejemplo, Taylor, L. D., y col.
(1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295) o
anticuerpos preparados, expresados, generados o aislados por
cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias
génicas de inmunoglobulinas humanas con otras secuencias de ADN.
Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables
y constantes obtenidas de secuencias de inmunoglobulinas de la
línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos
anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in
vitro y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las
regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias
que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias de VH y
VL de la línea general humana, pueden no existir de forma natural en
el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in
vivo.
Las expresiones "propiedad biológica" o
"actividad biológica", en relación con un anticuerpo de la
presente invención, se usan indistintamente en el presente
documento e incluyen, pero sin limitación, la afinidad y la
especificidad de epítope/antígeno, la capacidad para neutralizar o
antagonizar una actividad del EGFR in vivo o in vitro
y la estabilidad del anticuerpo in vivo y las propiedades
inmunogénicas del anticuerpo. Otras propiedades biológicas
identificables de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, la
especificidad, la reactividad cruzada (es decir, con homólogos no
humanos del péptido diana, o con otras proteínas o tejidos,
generalmente) y la capacidad para conservar altos niveles de
expresión de proteína en células de mamífero. Las propiedades o
características mencionadas anteriormente pueden observarse o
medirse o evaluarse usando procedimientos reconocidos en la técnica
que incluyen, pero sin limitación, ELISA, ELISA competitivo,
análisis por resonancia de plasmón superficial, ensayos de
neutralización in vitro e in vivo, unión a receptor e
inmunohistoquímica con secciones tisulares de fuentes diferentes
incluyendo ser humano o cualquier otra fuente según sea
necesaria.
El término "inhibir", como se usa en el
presente documento con respecto a una actividad de un anticuerpo de
la invención, se refiere a la capacidad de antagonizar, prohibir,
impedir, limitar, ralentizar, alterar, eliminar, detener, reducir o
invertir sustancialmente, por ejemplo, la progresión o la gravedad
de lo que se está inhibiendo incluyendo, pero sin limitación, una
actividad o propiedad biológica, una enfermedad o una afección. La
inhibición o neutralización es preferentemente de al menos
aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%
o superior.
La expresión "capacidad para inhibir la
activación del EGFR" con respecto a un anticuerpo, como se usa en
el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo cuya
unión al EGFR da como resultado la inhibición de la activación del
EGFR humano y de la actividad biológica del EGFR humano que se
produce tras la activación del receptor. La medición de uno o más
indicadores de la actividad biológica del EGFR como se determina
usando un ensayo de proliferación celular, un ensayo de apoptosis,
un ensayo de unión a receptor, un ensayo de fosforilación de
receptor o un modelo tumoral en ratón (véanse los Ejemplos
6-10) puede evaluar la capacidad de un anticuerpo
para inhibir la activación del EGFR.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el
presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está
sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen
especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo
aislado que se une a EGFR está sustancialmente libre de anticuerpos
que se unen específicamente a otros antígenos). Un anticuerpo
aislado que se une específicamente al EGFR humano puede tener sin
embargo reactividad cruzada con otros antígenos, tales como
moléculas de EGFR de otras especies. Además, un anticuerpo aislado
puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o
productos químicos.
El término "k_{on}", como se usa en el
presente documento, pretende referirse a la constante de asociación
o de velocidad de asociación, o a la velocidad de reacción
específica, de la reacción directa o de formación de complejo,
medida en unidades: M^{-1}s^{-1}.
El término "k_{off}", como se usa en el
presente documento, pretende referirse a la constante de disociación
o de velocidad de disociación, o a la velocidad de reacción
específica, para la disociación de un anticuerpo del complejo de
antígeno/anticuerpo, medida en unidades: s^{-1}.
El término "Kd", como se usa en el presente
documento, pretende referirse a la constante de disociación de una
interacción de antígeno-anticuerpo particular. Se
calcula mediante la fórmula:
k_{off}/k_{on}
=
Kd
Los anticuerpos de la presente invención son
anticuerpos de alta afinidad que presentan generalmente valores de
k_{off} reducidos. Para los fines de la presente divulgación, la
expresión "alta afinidad" se refiere a una afinidad o Kd de
entre 1 x 10^{-11} M y aproximadamente 1 x 10^{-14} M, o se
refiere además a una afinidad o Kd no superior a 10, 9, 8, 7, 6, 5,
4, 3, 2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02 ó 0,01
pM.
La expresión "molécula de ácido nucleico",
como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de
ADN y moléculas de ARNm. Una molécula de ácido nucleico puede ser
monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN
bicatenario.
La expresión "molécula de ácido nucleico
aislada", como se usa en el presente documento en relación con
ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de
anticuerpos (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen al EGFR humano,
pretende referirse a una molécula de ácido nucleico en la que las
secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o porción de
anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que
codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen a
antígenos distintos del EGFR humano, pudiendo estas otras
secuencias flanquear de forma natural al ácido nucleico en el ADN
genómico humano. Por lo tanto, por ejemplo, un ácido nucleico
aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo
anti-EGFR humano no contiene otras secuencias que
codifican otras regiones VH que se unen a antígenos distintos del
EGFR humano.
El término "vector", como se usa en el
presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido
nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el que se ha
unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un
bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos
de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el
que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma
viral.
La expresión "célula huésped recombinante"
(o simplemente "célula huésped"), como se usa en el presente
documento, pretende referirse a una célula en la que se ha
introducido un vector de expresión recombinante.
Una ventaja principal de un anticuerpo
humanizado es que se minimizan las respuestas inmunes debidas a la
administración repetida en pacientes. Cuantas más secuencias humanas
se empleen en un anticuerpo humanizado, menor es el riesgo de
inmunogenicidad. Además, los anticuerpos humanizados inyectados
tienen generalmente una semivida más prolongada en la circulación
que los anticuerpos inyectados que no son humanos o que son
parcialmente no humanos.
Como se analiza en el presente documento, pueden
usarse regiones variables flanqueantes humanas y variantes de las
mismas en la presente invención. Sin embargo, independientemente de
la región flanqueante seleccionada, si el objetivo es reducir el
riesgo de inmunogenicidad, se minimizan el número de cambios
respecto a la región flanqueante humana seleccionada.
Los restos flanqueantes de la región variable de
la cadena pesada y ligera pueden proceder de las mismas secuencias
de anticuerpos humanos o de secuencias de anticuerpos humanos
diferentes. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las
secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser
secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. El anticuerpo
humanizado de la presente invención puede comprender o proceder de
una región flanqueante de cadena ligera de la línea germinal
humana. Asimismo, el anticuerpo humanizado de la presente invención
puede comprender o proceder de una región flanqueante de cadena
pesada de la línea germinal humana. El contexto de región
flanqueante de las CDR influye en su unión a antígeno de modo que
una variación entre regiones flanqueantes diferentes puede conducir
a cierta pérdida o a una pérdida significativa de la afinidad de
unión al antígeno. En realizaciones preferidas de la presente
invención, la región flanqueante de cadena ligera procede de la
secuencia VK de la línea germinal humana A26. En realizaciones
preferidas, la región flanqueante de cadena pesada de la línea
germinal humana se selecciona de VH2-26 y
VH4-59. Véase el documento WO 2005/005604 para una
descripción de secuencias de la línea germinal diferentes.
Las secuencias de aminoácidos de la región
constante de la cadena pesada humana preferidas de los anticuerpos
humanizados de la presente invención incluyen la región constante de
IgG1 o la región constante de IgG4, siendo ambas bien conocidas en
la técnica.
La presente invención incluye anticuerpos o
porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen a EGFR e
inhiben la unión al receptor de ligandos y su posterior activación.
Por lo tanto, las CDR y las regiones variables de las cadenas
pesada y ligera descritas en el presente documento se usan para
preparar anticuerpos de longitud completa, así como fragmentos
funcionales que mantengan la afinidad de unión de la proteína que
emplea las CDR para la unión a EGFR.
Se determinó la afinidad de unión de anticuerpos
usando un ensayo Sapidyne KINESA (véase el Ejemplo 7). El
anticuerpo quimérico C225 tiene una Kd de aproximadamente 380 pM
(picomolar). Los anticuerpos humanizados de la presente invención
tienen una kD de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 pM;
de aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 pM; de aproximadamente
0,1 y aproximadamente 1 pM; de aproximadamente 0,2 y aproximadamente
10 pM; de aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 pM; de
aproximadamente 0,6 y aproximadamente 10 pM; y de aproximadamente
0,6 y aproximadamente 1 pM. Preferentemente, los anticuerpos
humanizados de la presente invención tienen una Kd no superior a
10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,08, 0,06, 0,04,
0,02 ó 0,01 pM.
También se prefiere que los anticuerpos o
porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención
inhiban la activación del EGFR. Se utilizan varios ensayos para
ensayar la capacidad de los anticuerpos de la presente invención
para inhibir la activación del EGFR (véanse los Ejemplos
6-10).
Las Tablas 1 y 2 indican las secuencias de
aminoácidos (usando el código de aminoácidos de una letra
convencional) de las CDR empleadas en los anticuerpos de la
presente invención, que comprenden una o más CDR de cadena pesada y
ligera. Las CDR se presentan en la tabla en el contexto de clones de
anticuerpos individuales (fragmentos Fab). En las Tablas 1 y 2, las
localizaciones de las sustituciones de aminoácidos realizadas
respecto a las CDR de C225 correspondientes (es decir, las
localizaciones en las que las CDR difieren en aminoácidos) se
indican en negrita y subrayadas. Las Tablas 1 y 2 proporcionan CDR
de cadena pesada y ligera. Estas CDR se combinan con secuencias
flanqueantes de la línea germinal humana de la forma siguiente: se
combinan CDR de cadena ligera con la secuencia flanqueante de VL
A26. Las CDR para de Hu 2-26 a 2.II.10 en la Tabla 1
tienen una secuencia flanqueante de cadena pesada de VH
2-26, mientras que las CDR de Hu
4-49 a 4.23 en la Tabla 1 tienen una secuencia
flanqueante de cadena pesada de VH 4-59. Se muestran
a continuación en la Tabla 3 HCVR y LCVR ejemplares que muestran
las CDR en el contexto de las regiones flanqueantes.
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Se ha demostrado que cada uno de los Fab
enumerados en las Tablas 1 y 2 se une a EGFR, como se determinó por
un ensayo de transferencia de filtro de captura (Ejemplo 3) y un
ELISA de captura (Ejemplo 4). El ELISA de captura indicó además que
cada uno de estos Fab tiene una afinidad por el EGFR superior a la
del anticuerpo quimérico
C225.
C225.
La estructura que comprende una CDR de la
invención será generalmente una secuencia de cadena pesada o ligera
de anticuerpo o una porción sustancial de la misma, en la que la CDR
se localiza en una localización correspondiente a la CDR de una
HCVR y LCVR de origen natural (Kabat y col, Sequences of Proteins of
Immunological Interest, US Dept of HHS, 1991). Las tres regiones
CDR para cada cadena, ligera y pesada, se proporcionan en una región
flanqueante como una secuencia contigua representada por la fórmula
siguiente:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
Las FR1, FR2, FR3 y FR4 de la cadena pesada o la cadena ligera se
combinan para formar la región flanqueante completa cuando se
organizan como una secuencia contigua con las CDR en el orden
indicado. Preferentemente, las regiones flanqueantes de un
anticuerpo de la invención son humanas, humanizadas o
sustancialmente de origen humano.
Los anticuerpos de la presente invención
representados por Fab diferentes, cuyas CDR se enumeran en las
Tablas 1 y 2, difieren entre sí por cambios de secuencia en al
menos 1 CDR y hasta tantas como 5 CDR. Las diferencias en las CDR
entre los clones son indicativas de que las CDR para una posición
dada pueden sustituirse por otra de modo que un anticuerpo
sustituido resultante conserve probablemente la capacidad para
unirse a EGFR e inhibir su activación. En una realización de la
invención, un anticuerpo comprende una HCVR que comprende una CDRH1
que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por
las SEC ID Nº: 1-10 y 43, y/o una CDRH2 que
comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las
SEC ID Nº: 11-23 y 44, y/o una CDRH3 que comprende
una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº:
25-29 y 45. En otra realización, un anticuerpo
anti-EGFR de la invención comprende una LCVR que
comprende una CDRL1 que comprende una secuencia seleccionada del
grupo constituido por las SEC ID Nº: 30-34 y 46, y/o
una CDRL2 que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 35, y/o una
CDRL3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido
por las SEC ID Nº: 36-42 y 47. En una realización
preferida, un anticuerpo de la invención comprende una CDRH1 que
comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las
SEC ID Nº: 1-10 y 43, y/o una CDRH2 que comprende
una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº:
11-23 y 44, y/o una CDRH3 que comprende la
secuencia de las SEC ID Nº: 25-29 y 45, y comprende
además una LCVR que comprende una CDRL1 que comprende una secuencia
seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº:
30-34 y 46, y/o una CDRL2 que comprende la
secuencia de la SEC ID Nº: 35, y/o una CDRL3 que comprende una
secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº:
36-42 y 47.
En una realización preferida, un anticuerpo
anti-EGFR de la presente invención tiene una región
variable de cadena pesada que contiene las CDR de una combinación
de CDR numeradas en la Tabla 1, y una región variable de cadena
ligera que contiene las CDR de una combinación de CDR enumeradas en
la Tabla 2. Preferentemente, estas HCVR y LCVR contienen las
regiones flanqueantes descritas para las CDR en las Tablas 1 y 2.
Más preferentemente, un anticuerpo particular tiene una HCVR que
contiene las CDR de una de las combinaciones de CDR enumeradas en
la Tabla 1, y una LCVR que contiene las CDR de la combinación
correspondiente de CDR enumeradas en la Tabla 2, por ejemplo, un
anticuerpo que comprende una HCDR1 con la SEC ID Nº: 1, una HCDR2 la
SEC ID Nº: 11, una HCDR3 con la SEC ID Nº: 25, una LCDR1 con la SEC
ID Nº: 30, una LCDR2 con la SEC ID Nº: 35 y una LCDR3 con la SEC ID
Nº: 37. Preferentemente, estas HCVR y LCVR contienen las regiones
flanqueantes descritas para esas combinaciones particulares de CDR
enumeradas en las Tablas 1 y 2.
En otra realización preferida, un anticuerpo
anti-EGFR de la presente invención tiene una HCVR
seleccionada de uno de los Fab humanizados enumerados en la Tabla 3
y una LCVR seleccionada de uno de los Fab humanizados enumerados en
la Tabla 3. Más preferentemente, la HCVR y la LCVR son del mismo Fab
humanizado.
La Tabla 3 presenta las HCVR y LCVR preferidas
de los anticuerpos de la presente invención. Las regiones CDR están
en negrita. Estas HCVR y LCVR también presentan las regiones
flanqueantes preferidas de los anticuerpos de la presente
invención. Los anticuerpos 2.38 a 2.11.3 en la Tabla 3 tienen las
secuencias flanqueantes FRH1 (SEC ID Nº: 57), FRH2 (SEC ID Nº: 58),
FRH3 (SEC ID Nº: 59) y FRH4 (SEC ID Nº: 60), que son de la región
flanqueante de la línea germinal humana VH2-26.
Asimismo, ésta es la región flanqueante preferida para los
anticuerpos Hu2-26 a 2.II.10 en la Tabla 1. Los
anticuerpos 4.14 a 4.21 de la Tabla 3 tienen las regiones
flanqueantes FRH1 (SEC ID Nº: 61), FRH2 (SEC ID Nº: 62), FRH3 (SEC
ID Nº: 63) y FRH4 (SEC ID Nº: 64), que son de la región flanqueante
de la línea germinal humana VH4-59. Asimismo, ésta
es la región flanqueante preferida para los anticuerpos Hu
4-59 a 4.23 en la Tabla 1. Todos los anticuerpos de
la Tabla 3 tienen las regiones flanqueantes FRL1 (SEC ID Nº: 74),
FRL2 (SEC ID Nº: 75), FRL3 (SEC ID Nº: 76) y FRL4 (SEC ID Nº: 77) de
la región flanqueante de la línea germinal humana VK A26, que
también es la región flanqueante preferida para los anticuerpos
Hu-2-26 a 4.23 de la Tabla 2.
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De acuerdo con la invención descrita en el
presente documento, pueden generarse anticuerpos que tienen una
capacidad aumentada para inhibir la activación del EGFR por
combinación en una sola estructura polipeptídica de una o más
nuevas secuencias de CDR, como se describen en el presente
documento. De esta forma, pueden combinarse varias nuevas
secuencias de aminoácidos en un anticuerpo, en la misma CDR o en CDR
diferentes, para producir anticuerpos con niveles deseables de
actividad anti-EGFR. Dichos niveles deseables serán
a menudo el resultado de producir anticuerpos cuyos valores de Kd
sean preferentemente de 1 pM o menos. A modo de ejemplo no
limitante, dichas nuevas secuencias de CDR, como se presentan en
las Tablas 1 y 2, pueden emplearse y los anticuerpos resultantes
explorarse para determinar su capacidad para inhibir la activación
del EGFR, usando cualquiera de o varios de los ensayos que se
describen a continuación en los Ejemplos 6-10.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
examinarse para determinar varias propiedades beneficiosas que
contribuyen a la utilidad de un anticuerpo para una indicación
particular. En una realización, los anticuerpos de la presente
invención tendrán una afinidad por EGFR que es superior (es decir,
un número de Kd inferior) a la de anticuerpos conocidos en la
técnica tales como el anticuerpo quimérico C225, según se determina
por la Kd (por ejemplo, ensayos Biacore o Kinexa). Como se ha
descrito anteriormente, la Kd se mide por la relación de las
constantes k_{on} y k_{off}. Por ejemplo, una k_{on} de 3,1 x
10^{7} (M^{-1}s^{-1}) y una k_{off} de 0,9 x
10^{-4}(s^{-1}) se combinarían para dar una Kd de 2,9 x
10^{-12} M. Por lo tanto, la afinidad puede mejorarse aumentado
la k_{on} o disminuyendo la k_{off}.
Las mejoras en la afinidad de un anticuerpo
anti-EGFR bien puede corresponderse con una
capacidad aumentada de un anticuerpo para inhibir la activación del
EGFR. Los aspectos de la capacidad aumentada para inhibir la
activación del EGFR pueden examinarse por cualquiera de varios
ensayos in vitro o in vivo, como se describen en los
Ejemplos 6-10. Estos ensayos incluyen, pero sin
limitación, un ensayo de proliferación celular, un ensayo de
apoptosis, un ensayo de unión a receptor, un ensayo de fosforilación
de receptor o un modelo tumoral en ratón. Preferentemente, los
anticuerpos de la presente invención tendrán una capacidad mejorada
para inhibir la activación del EGFR, como se determina por
cualquiera de o varios de estos ensayos. Más preferentemente, los
anticuerpos de la presente invención tendrán una Kd no superior a 10
pM, más preferentemente no superior a 1 pM y aún más
preferentemente no superior a aproximadamente 0,2 pM, y tendrán una
capacidad aumentada para inhibir la activación del EGFR.
En otro aspecto, la presente invención también
se refiere a ADN recombinante que codifica los anticuerpos y
fragmentos de la invención. La secuencia de ADN recombinante que
codifica un anticuerpo o fragmento de la invención puede
determinarse fácilmente por un experto en la materia usando el
código genético. Puede prepararse un ácido nucleico que tenga la
secuencia determinada y expresarse en cualquiera de una amplia
diversidad de sistemas huésped usando procedimientos que son bien
conocidos en la técnica.
Preferentemente, el ADN codifica anticuerpos
que, cuando se expresan, comprenden de una a cinco de las CDR de
cadena ligera y pesada de las SEC ID Nº: 1, 11, 24, 30, 35, 36 y una
o más de las CDR de cadena ligera y pesada de las SEC ID Nº:
2-10, 12-23, 25-29,
31-34, 37-42, para un total de 6 CDR
(CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, donde la CDRL2 será la
SEC ID Nº: 35). Además, el ADN codifica preferentemente anticuerpos
que, cuando se expresan, comprenden estas CDR en combinación con las
regiones flanqueantes de cadena ligera y de cadena pesada
preferidas de la presente invención, como se representan en las
secuencias que se muestran en la Tabla 3.
El ADN que codifica los anticuerpos de la
presente invención incluirá típicamente además una secuencia
polinucleotídica de control de la expresión unida operativamente a
las secuencias codificantes de anticuerpos, incluyendo regiones
promotoras heterólogas o asociadas de forma natural.
Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán
sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o
transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse
secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha
incorporado el vector en la línea celular huésped apropiada, la
célula huésped se propaga en condiciones adecuadas para expresar
las secuencias de nucleótidos y, según se desee, puede seguirse de
la recogida y purificación de las cadenas ligeras, cadenas pesadas,
dímeros de cadena ligera/pesada o anticuerpos intactos, fragmentos
de unión u otras formas de inmunoglobulina.
Las secuencias de ácido nucleico de la presente
invención capaces de expresar en última instancia los anticuerpos
deseados pueden estar formadas por una diversidad de polinucleótidos
(genómico o ADNc, ARN, oligonucleótidos sintéticos, etc.) y
componentes (por ejemplo, regiones V, J, D y C) diferentes usando
cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. La unión
de secuencias genómicas y sintéticas apropiadas es un procedimiento
de producción común, pero también pueden utilizarse secuencias de
ADNc.
Pueden aislarse secuencias de ADN de la región
constante humana de acuerdo con procedimientos bien conocidos a
partir de una diversidad de células humanas, pero preferentemente a
partir de células B inmortalizadas. Pueden obtenerse células fuente
adecuadas para las secuencias polinucleotídicas y células huésped
para la expresión y secreción de inmunoglobulinas a partir de
varias fuentes bien conocidas en la técnica.
Como se describe en el presente documento,
además de los anticuerpos descritos específicamente en el presente
documento, pueden diseñarse y fabricarse fácilmente otros
anticuerpos modificados que tienen secuencias sustancialmente
similares o secuencias idénticas utilizando diversas técnicas de ADN
recombinante bien conocidas por los expertos en la materia. Por
ejemplo, las regiones flanqueantes pueden variar de las secuencias
nativas a nivel de la estructura primaria por varias sustituciones,
adiciones y deleciones terminales e intermedias de aminoácidos, y
similares. Además, pueden usarse una diversidad de regiones
flanqueantes humanas diferentes individualmente o en combinación
como base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente
invención. En general, pueden efectuarse fácilmente modificaciones
de los genes mediante una diversidad de técnicas bien conocidas
tales como mutagénesis dirigida.
Como alternativa, pueden producirse fragmentos
polipeptídicos que comprenden sólo una porción de la estructura
primaria del anticuerpo, poseyendo estos fragmentos una o más
actividades de inmunoglobulina (por ejemplo, actividad de fijación
del complemento). Estos fragmentos polipeptídicos pueden producirse
por escisión proteolítica de anticuerpos intactos por
procedimientos bien conocidos en la técnica, o por inserción de
codones de terminación en las localizaciones deseadas en vectores
usando mutagénesis dirigida, tal como después de la CH1 para
producir fragmentos Fab o después de la región bisagra para
producir fragmentos F(ab')_{2}. Pueden producirse
anticuerpos de cadena sencilla uniendo la VL y la VH con un engarce
de ADN.
Como se ha indicado anteriormente, los
polinucleótidos se expresarán en huéspedes después de que las
secuencias se hayan unido operativamente a (es decir, situado para
asegurar el funcionamiento de) una secuencia de control de la
expresión. Típicamente, estos vectores de expresión pueden
replicarse en los organismos huéspedes como episomas o como una
parte integrante del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los
vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por
ejemplo, tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para
permitir la detección de esas células transformadas con las
secuencias de ADN deseadas.
E. coli es un huésped procariota útil
particularmente para clonar los polinucleótidos de la presente
invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso
incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus, y otras
enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia y diversas
especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas
también pueden prepararse vectores de expresión, que típicamente
contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la
célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además,
puede estar presente cualquiera de varios promotores bien
conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema
promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de
beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda.
Típicamente, los promotores controlarán la expresión, opcionalmente
con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión
al ribosoma y similares para iniciar y terminar la transcripción y
la traducción.
También pueden usarse para la expresión otros
microbios tales como levaduras. Pichia pastoris es un huésped
preferido, teniendo los vectores adecuados secuencias de control de
la expresión, tales como promotores, incluyendo la
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, y un origen de la replicación, secuencias de
terminación y similares según se desee.
También puede usarse un cultivo celular de
tejido de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la
presente invención. Se prefieren células eucariotas ya que se han
desarrollado en la técnica varias líneas celulares huéspedes
adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen
las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células
HeLa, líneas celulares de mieloma, células B transformadas, líneas
celulares de riñón embrionario humano o hibridomas. Son líneas
celulares preferidas las líneas celulares CHO y de mieloma tales
como SP2/0 y NS0.
Los vectores de expresión para estas células
pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un
origen de replicación, un promotor, un potenciador y sitios de
información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión
al ribosoma, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de
poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción.
Son secuencias de control de la expresión preferidas promotores
procedentes de genes de inmunoglobulinas, SV40, adenovirus,
papilomavirus bovino, citomegalovirus y similares. Los sitios de
poliadenilación preferidos incluyen secuencias derivadas de SV40 y
hormona de crecimiento bovina.
Los vectores que contienen las secuencias
polinucleotídicas de interés (por ejemplo, las secuencias
codificantes de la cadena pesada y ligera y secuencias de control
de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped por
procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de
huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio
se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el
tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden
usarse para otros huéspedes celulares.
Una vez expresados, los anticuerpos pueden
purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales, incluyendo
precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de
intercambio iónico, de afinidad (por ejemplo, Proteína A), de fase
inversa, de interacción hidrófoba, electroforesis en gel y
similares. Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras que
tienen una pureza de al menos aproximadamente el 90 al 95%, y es más
preferida una pureza del 98 al 99% o más para usos farmacéuticos.
Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se
desee, los polipéptidos pueden usarse entonces terapéuticamente o
profilácticamente, como se indica en el presente documento.
Esta invención también se refiere a un
procedimiento de tratamiento de seres humanos que padecen un cáncer
mediado por EGFR, que comprende administrar una dosis eficaz de un
anticuerpo que se une a EGFR a un paciente que lo necesite. Los
anticuerpos de la presente invención se unen a EGFR e inhiben su
activación. Diversos cánceres mediados por EGFR incluyen, pero sin
limitación, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de mama, cáncer
colorrectal, cánceres de cabeza y cuello y cáncer de próstata.
Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno
de los mismos, de la presente invención pueden estar en forma de
una composición que comprende el anticuerpo de la invención
suspendido en un diluyente o excipiente farmacológicamente
aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse
por cualquier medio conocido en la técnica que consiga el propósito
deseado generalmente de tratar enfermedades autoinmunes,
preferentemente la esclerosis múltiple. La vía de administración
preferida es parenteral, definiéndose en el presente documento que
se refiere a los modos de administración que incluyen la inyección
e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,
intraesternal, subcutánea e intraarticular. La dosificación
administrada dependerá de la edad, salud y peso del destinatario,
de la clase de tratamiento concurrente, si existe, de la frecuencia
de tratamiento y de la naturaleza del efecto
deseado.
deseado.
Las composiciones dentro del alcance de la
invención incluyen todas las composiciones en las que está presente
un anticuerpo o porción de unión a antígeno en una cantidad que es
eficaz para conseguir el efecto médico deseado para tratar el
cáncer.
Las composiciones farmacéuticas para su
administración están diseñadas para que sean apropiadas para el modo
de administración seleccionado y se usan según sea apropiado
excipientes farmacéuticamente aceptables tales como tampones,
tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de
isotonicidad, agentes estabilizantes y similares. Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, última
edición, proporciona un compendio de técnicas de formulación como
las conocen en general los expertos en la materia.
La concentración del anticuerpo
anti-EGFR en formulaciones puede ser desde tan baja
como de aproximadamente el 0,1% hasta tanta como del 15 ó 20% en
peso y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de
líquido, viscosidades, estabilidad y etc., de acuerdo con el modo de
administración particular seleccionado. Las concentraciones
preferidas del anticuerpo anti-EGFR estarán
generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg/ml.
Preferentemente de 10 a aproximadamente 50 mg/ml.
La formulación puede esterilizarse por
filtración después de preparar la formulación o hacerse
microbiológicamente aceptable de otro modo. Puede añadirse un
conservante tal como m-cresol o fenol o una mezcla
de los mismos para prevenir la contaminación y el desarrollo
microbiano.
Una composición típica para infusión intravenosa
podría llegar a tener un volumen de hasta 250 ml de líquido, tal
como solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml o
más de concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos de la
invención pueden congelarse o liofilizarse para su almacenamiento y
reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes del uso. La
liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables
de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con
inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos de IgM tienden a
tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG).
Puede ser necesario ajustar las dosificaciones para compensar.
Aunque los procedimientos anteriores parecen ser
los más convenientes y los más apropiados para la administración de
proteínas tales como anticuerpos humanizados, mediante una
adaptación adecuada pueden emplearse otras técnicas para la
administración, tales como la administración transdérmica y la
administración oral, con tal de que se diseñe una formulación
apropiada. Además, puede ser deseable emplear formulaciones de
liberación controlada usando películas y matrices biodegradables, o
minibombas osmóticas, o sistemas de suministro basados en perlas de
dextrano, alginato o colágeno.
Los niveles de dosificación típicos pueden
optimizarse usando técnicas clínicas convencionales y dependerán
del modo de administración y del estado del paciente. Generalmente,
las dosis estarán en el intervalo de 10 \mug/kg/mes a 10
mg/kg/mes.
En otro aspecto, se contemplan los anticuerpos o
porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente
invención para su uso como medicamento para el tratamiento del
cáncer.
En otro aspecto más, se contempla un artículo de
fabricación tal como un recipiente, un envase, un material
envasado, un dispensador y similares.
La invención se ilustra mediante los ejemplos
siguientes, que no pretenden ser limitantes de ningún modo.
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Ejemplo
1
El EGFR humano está constituido por una sola
cadena polipeptídica y contiene regiones extracelular, transmembrana
e intracelular. Para proporcionar un antígeno soluble para su uso,
por ejemplo, en ensayos de unión, la región extracelular se clona y
se expresa de la forma siguiente.
Se diseñan cebadores basándose en la secuencia
del EGFR humano para aislar los primeros 643 aminoácidos de la
proteína precursora mediante RT-PCR. El cebador
"sentido" cadena arriba (Cebador 3053) añade un sitio
Kpn I para la clonación y altera la secuencia de Kozak y el
primer aminoácido de la secuencia señal para adaptarse a una
secuencia de Kozak consenso y mejorar la expresión eucariota. El
codón de inicio está subrayado en cada una de las secuencias que se
presentan a continuación.
Cebador 3053: TAA GGT ACC GCT CTT CGG GGA GCC
ACC ATC GGA CCC TCC GGG ACG [SEC ID Nº: 78]
Secuencia Nativa: GCT CTT CGG GGA GCA GCC
ATG CGA CCC TCC GGG ACG [SEC ID Nº: 79].
El cebador "antisentido" cadena abajo
(Cebador 3054) termina la proteína en I619 (basándose en la
numeración de aminoácidos de la proteína madura) y añade un engarce
(Gly)_{4}Ser [Gly Gly Gly Gly Ser; SEC ID Nº: 80] y un
marcador (His)_{6} [SEC ID Nº: 81). Se incluye un sitio
Xba I para la clonación.
Cebador 3054: ATG TCT AGA AAC TCA ATG GTG ATG
GTG ATG ATG CGA GCC ACC GCC ACC GAT CTT AGG CCC ATT CGT TGG ACA
[SEC ID Nº: 82]
La secuencia de aminoácidos del sEGFR maduro con
el engarce y el marcador (His)_{6} fusionados [SEC ID Nº:
6] se presenta en la Figura 2.
Se aísla ARNm de células de carcinoma epidérmico
A431 humanas (ATCC CRL-1555) usando un kit
Fast-Track (Invitrogen). La porción extracelular
del gen se amplifica usando RT-PCR de una etapa
SuperScript (GibcoBRL) con los cebadores 3053 y 3054, y se clona en
el vector de soporte pCRII (Invitrogen). El segmento génico marcado
se confirma por secuenciación de ADN y se inserta como un fragmento
Xba I/Kpn I en el vector de expresión pCDNA 3.1 (Invitrogen).
El ADN plasmídico se linealiza y se introduce
por electroporación en células CHO-K1. Los clones se
seleccionan por resistencia a Geneticina (GibcoBRL). Se ensayan
aproximadamente 100 sobrenadantes de colonias para determinar la
expresión de EGFR soluble (sEGFR) mediante transferencia de western
revelada con anticuerpo m225 (Ab-2) (Lab Vision
Corp.). Un clon que expresa apropiadamente se expande, se subclona
por dilución limitante y se adapta a medio sin suero (CHO SFII,
GibcoBRL).
El antígeno soluble se semipurifica a partir de
sobrenadantes de cultivos en matraces terminales por concentración
y unión a Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Valencia, CA).
En concreto, el sobrenadante de células terminales se recoge por
centrifugación para sedimentar las células y después el sobrenadante
se filtra para eliminar cualquier rastro de residuo celular y
posteriormente se mantiene a 0-4ºC durante las
etapas de purificación restantes. El sobrenadante se concentra
hasta un total de aproximadamente 100 ml usando el concentrador
Amicon con una membrana de límite de peso molecular (MWCO) de
30.000. El concentrado se dializa en Tampón A (Tampón A: Fosfato
Sódico 50 mM, pH 8,0, NaCI 300 mM, Imidazol 0,05 mM) durante una
noche. El tampón puede cambiarse una vez si se desea. Después de la
diálisis, aproximadamente 800 \mul de perlas
Ni-NTA se lavan 2-3 veces con Tampón
A y después se añaden al sobrenadante dializado en tubos cónicos de
50 ml y se hacen girar en una cámara fría durante 2 horas. Las
perlas se precipitan por centrifugación en tubos cónicos de 50 ml y
la mayor parte del sobrenadante se transfiere a otro recipiente
dejando una cantidad pequeña manejable de sobrenadante en los
tubos. Este sobrenadante se agita vorticialmente para resuspender
las perlas y las perlas se cargan en una columna comercial
adecuada. Se deja que el líquido pase a través de la columna y
después se añade el resto del sobrenadante a la columna. El
sobrenadante se recicla a través de la columna 2-3
veces. La columna se lava con aproximadamente 10 ml de Tampón A. La
columna se eluye con aproximadamente 3-4 ml de
Tampón A que contiene Imidazol 200 mM y se recogen fracciones de
250 \mul. Se comprueba la DO_{280} de las fracciones en un
lector de placas usando tampón de elución como blanco. Las
fracciones más concentradas se combinan y se dializan en PBS
durante una noche. Las fracciones dializadas combinadas pueden
congelarse a -70ºC después de la adición de 1/10 volumen de
glicerol, o las fracciones dializadas pueden biotinilarse (véase a
continuación).
El sEGFR se eluyó con Imidazol 500 mM y se
dializó en PBS como se ha descrito anteriormente. La fracción
proteica mixta que contenía el sEGFR se biotiniló usando
Sulfo-NHS-LC-Biotina
(Pierce 21335) y se dializó contra PBS para eliminar el reactivo no
incorporado. Las alícuotas de sEGFR biotinilado
(B-sEGFR) se almacenan en glicerol al 10% a
-80ºC.
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Ejemplo
2
Los Fab expresados de la presente invención
pueden aislarse a partir del periplasma bacteriano de la forma
siguiente. Se cultivan células XL-0 a 37ºC con
agitación a 250 rpm en medio 2X YT hasta que se alcanza una DO 600
nm de aproximadamente 0,9 a 1,2. Después, se añade IPTG a una
concentración final de 1 mM (a partir de una solución madre 1 M).
Para cada clon a analizar, se echan 15 ml de células en un tubo
cónico estéril. Las células se infectan con 10 \mul de una
solución madre de fago de alto título y se incuban a 37ºC durante
una hora con agitación. Las células se transfieren a 25ºC y se
cultivan durante una noche con agitación. Las células se sedimentan
en una centrífuga clínica de sobremesa a -2000 x g durante 25
minutos. Las células se resuspenden en 1 ml de
Tris-Cl 30 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM pipeteando hacia
arriba y hacia abajo, después se transfieren a un tubo eppendorf.
Las muestras se sedimentan durante 3 min a 8000 rpm en una
microcentrífuga. El sobrenadante se aspira y se desecha. El
sedimento se resuspende en Tris-Cl 50 mM, pH 8,0,
NaCl 150 mM, sacarosa 500 mM, después se agita vorticialmente y se
pone en hielo durante 30 min. El residuo celular se sedimenta
durante 10 min a 9000 rpm en una microcentrífuga a 4ºC. El
sobrenadante se aísla y se almacena a 4ºC.
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Ejemplo
3
Los Fab expresados en fagos que se unen a sEGFR
biotinilado se detectan a partir de una población diversa de Fab
por transferencias de filtro o de captura de Fab, de Fab expresados
en fagos que se unen a B-sEGFR, por ejemplo, a
partir de una población diversa de Fab expresados en fagos. En
resumen, se recubre un filtro con un reactivo de captura
(anticuerpo de cabra anti-cadena kappa humana),
después el filtro recubierto se pone en una placa con placas de
fago, de fago que está expresando Fab. El filtro se incuba con las
placas, después el filtro se incuba con sEGFR biotinilado y el
sEGFR biotinilado unido se detecta por unión de
Neutravidina-AP e incubación con el sustrato de
fosfatasa alcalina detectable.
En concreto, se recubre un filtro de
Nitrocelulosa (BA85, Schleicher and Schull) haciéndolo flotar en 5
ml de anticuerpo de cabra anti-kappa humana
(2060-01, Southern Biotech) a 10 \mug/ml en PBS
durante dos horas a temperatura ambiente. El filtro se sumerge
durante 15 min. El filtro se lava tres veces en PBS. El filtro se
bloquea en BSA al 1% en PBS durante 1 hora. El filtro se lava tres
veces en PBS. El filtro se seca al aire durante 10 min. El filtro
se extiende cuidadosamente sobre la placa de fago y se incuba
durante una noche a 22ºC. El filtro se retira levantándolo
cuidadosamente y se lava brevemente en PBS. El filtro se incuba con
antígeno biotinilado a una dilución 1/1000 en leche en polvo al 3%,
PBS; Tween 20 al 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente. El
filtro se lava al vacío con PBS, Tween 20 al 0,05% tres veces. El
filtro se incuba con Neutravidina-AP 1/1000 en PBS,
Tween 20 al 0,05%, durante 30 min a temperatura ambiente. El filtro
se lava al vacío con PBS, Tween 20 al 0,05% tres veces. El filtro
se revela en 10 ml de sustrato de AP (Nitro-azul de
tetrazolio,
5-Bromo-4-cloro-indolil
fosfato, Pierce, Rockford, IL). Las placas se seleccionan basándose
en la intensidad del color azul.
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Ejemplo
4
Se usa un ELISA de captura como un ensayo para
detectar Fab que se unen a sEGFR de la forma siguiente. Se recubre
una placa de fondo en U Costar con 50 \mul/pocillo de anticuerpo
de cabra anti-kappa humana (2060-01
Southern Biotech, Birmingham AL) a 10 \mug/ml en tampón carbonato
(carbonato sódico 0,015 M, bicarbonato sódico 0,035 M, pH 9,5)
durante una noche a 4ºC. Los pocillos se lavan 3 veces con
PBS-Tween 20 (0,05%). Los pocillos se bloquean con
50 \mul/pocillo de BSA al 1% en PBS-Tween durante
1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan 3 veces con
PBS-Tween. Se añaden 50 \mul/pocillo de Fab de
preparación de periplasma (véase el Ejemplo 2, diluido a 5
\mug/ml en PBS-Tween) con diluciones 1:5 hacia
abajo en la placa por duplicado. La placa se incuba a temperatura
ambiente durante 2 horas. La placa se lava 3 veces con
PBS-Tween. Se añaden 50 \mul/pocillo de sEGFR
biotinilado diluido 1/1000 en PBS-Tween y la placa
se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lava 3
veces con PBS-Tween. Se añaden 50 \mul/pocillo de
Neutravidina-Fosfatasa Alcalina
(Neutravidina-AP; Pierce, Rockford, III) diluida
1/1000 en PBS-Tween y se incuban durante 30 min a
temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con
PBS-Tween. Se añaden 150 \mul/pocillo de sustrato
pNPP (Sigma) y se incuban a 37ºC hasta que se desarrolla el color.
La placa se lee a DO 405.
Los resultados de los Fab ensayados para
determinar su unión a sEGFR por captura se muestran en la Fig.
1.
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Ejemplo
5
Puede ensayarse la unión de Fab a EGFR con
lisados de células de carcinoma A431 de la forma siguiente. Se
preparan lisados de células A-431 como se describe
en "Purification of an Active EGF Receptor Kinase with Monoclonal
Antireceptor Antibodies, Yarden y col, (1985) J. Biol. Chem., 260,
315-319". En resumen, monocapas confluentes de
células A-431 se lavan dos veces con PBS y una vez
con HNEG (tampón Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM,
glicerol al 10%). Las células se desprenden por raspado en 20 ml de
HNEG y se centrifugan a 600 x g durante 10 min. Se resuspenden
10^{7} células en 1 ml de tampón de solubilización (HEPES 50 mM
pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al
10%, EDTA 1 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, leupeptina 5 \mug/ml,
aprotinina al 1%) y después se homogeneizan en un homogeneizador de
vidrio-vidrio. El material insoluble se elimina por
centrifugación a 40.000 x g durante 30 min. El sobrenadante
transparente se retiró y se congeló a -80ºC.
Se recubre una placa de fondo en U Costar con 50
\mul/pocillo de lisado celular diluido 1/20 en HEPES 10 mM, pH
7,4, Triton X-100 al 0,1% y se seca en una campana
durante una noche. La placa se bloquea por adición de 100
\mul/pocillo de PBS, BSA al 0,5% y se incuba 1 hora a temperatura
ambiente. La placa se lava 3 veces con PBS, Tween al 0,05%. Se
añaden 50 \mul/pocillo de Fab, comenzando a 1-5
\mug/ml con diluciones 1/5 en PBS, Tween al 0,05%, y se incuban
durante 1 h a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con
PBS-Tween. Se añaden a los pocillos 100
\mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-kappa
humana-AP (2060-01, Southern Biotech
Birmingham, AL) a 1/2000 en PBS-Tween. La placa se
incuba 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con
PBS-Tween. Se añaden 150 \mul/pocillo de sustrato
pNPP (N-9389, Sigma, Saint Louis, MO) [Fuente/Nº
Cat.] (1 comprimido/3 ml de agua) y se incuban a 37ºC durante hasta
1 hora. La placa se lee a DO 504.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se usan ensayos de proliferación celular con
células de carcinoma epidérmico A431 para determinar la potencia
relativa de los Fab anti-EGFR. El ensayo se basa en
estudios previos (Sato y col, "Biological Effects in vitro
of Monoclonal Antibodies to Human Epidermal Growth Factor
Receptors", (1983), Mol. Biol. Med., 1, 511-529)
que demuestran una proliferación celular disminuida de células A431
en respuesta a anticuerpos anti-receptor de EGF.
Los ensayos de proliferación celular son de la forma siguiente. Se
mantienen células A431 en DMEM más FBS al 10%. El Día 1, las
células se ponen en PBS durante 20 minutos y se tratan con tripsina
durante 5 minutos antes de la siembra en placas. Las células se
siembran en placas a una densidad celular de 15.000 células por
pocillo en un formato de 384 pocillos en placas de cultivo celular
con tratamiento TC Greiner 384 usando un Multidrop 384. El volumen
medio final es de 50 \mul. Las placas de cultivo celular se cubren
con cinta Airpore (Qiagen, Valencia, CA). Se deja que las células
se adhieran durante una noche. El Día 2 se retira el medio de
cultivo celular y se sustituye con 50 \mul de DMEM sin rojo fenol
(sin FBS) ["pocillos de control"] o DMEM y preparación de
periplasma de Fab (véase el Ejemplo 2) ["pocillos de
tratamiento"] por duplicado a una concentración esperada de 2,5
\mug/ml. Dos pocillos de control se localizan adyacentes a cada
pocillo de tratamiento para un total de 192 pocillos de control. El
Día 3, se retira el medio y se sustituye con DMEM sin rojo fenol
que contiene reactivo de proliferación celular MTS (Promega,
Madison, WI; 1 ml/10 ml de medio). Se registra la absorbancia a 490
nm después de 15 y 30 minutos. El valor medio para todos los
tratamientos por duplicado se divide por la media de todos los
pocillos de
control.
control.
Los resultados de un ensayo representativo con
Fab se muestran en la Figura 2. Asimismo, los resultados de un
ensayo representativo con anticuerpos de longitud completa se
muestran en la Figura 3. Los datos mostrados en las Figuras 2 y 3,
respectivamente, están expresados como el porcentaje de señal
obtenido cuando las células se incuban en ausenta de Fab o
anticuerpo (= 100%). Debería señalarse que un porcentaje de
intensidad de señal no se correlaciona necesariamente a la
perfección con el número real de células.
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Ejemplo
7
Se determinan mediciones de la afinidad de unión
para anticuerpos monoclonales de longitud completa de la invención
usando un ensayo Sapidyne KINEXA. Se recubren previamente perlas de
Sepharose Fast-Flow activadas con NHS (GE
Healthcare) con antígeno (50 \mug de anticuerpo
anti-EGFR por ml de perlas) y se bloquean con BSA
10 mg/ml en Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Después, se
incuban 2 pM, 4 pM, 40 pM de un anticuerpo de la invención con
diversas concentraciones (por ejemplo, diluciones seriadas de 2,4 pM
a 10 nM) de sEGFR en tampón de procesamiento (PBS,
Tween-20 al 0,005% (v/v) y ovoalbúmina 1 mg/ml)
durante 10 horas a temperatura ambiente. Para determinar el
anticuerpo libre presente en equilibrio, cada muestra se pasa a
través de las perlas recubiertas con sEGFR. La cantidad de
anticuerpo unido a perlas se cuantifica después pasando una solución
de anticuerpo de cabra anti-Fc humano marcado con
fluorescencia (Cy5) (Jackson Immuno Research) diluido 1:4000 en
tampón de procesamiento sobre las perlas. La señal de fluorescencia
medida es proporcional a la concentración de anticuerpo libre en
equilibrio. Cada concentración de sEGFR se mide por duplicado. La
constante de disociación en equilibrio (K_{D}) se obtiene a
partir de una regresión no lineal de las curvas de competición
usando un modelo de unión homogéneo multicurva de un sitio
(programa informático KINEXA).
También se determina la constante de velocidad
de asociación (k_{on}) para la unión a sEGFR usando un ensayo
Sapidyne KINEXA. Dos pM de anticuerpo se mezclan con 20 pM de sEGFR
usando las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. A
diversos tiempos, las muestras se sondan para anticuerpo libre
usando las condiciones descritas anteriormente para la unión en
equilibrio y, después, la dependencia del tiempo resultante se
ajusta usando el programa informático KINEXA para determinar la
velocidad de disociación (k_{on}). La constante de velocidad de
disociación (k_{off}) se calcula usando la expresión k_{off} =
Kd x k_{on}. Las afinidades de anticuerpos monoclonales de
longitud completa se midieron usando el ensayo descrito y los
resultados obtenidos se enumeran a continuación en la Tabla 4.
Ejemplo
8
La capacidad de los anticuerpos de la presente
invención para inhibir la fosforilación del EGFR se ensaya de la
forma siguiente. Se cultivan células A431 hasta una confluencia de
\sim70% en placas de 6 pocillos y se privan de suero durante una
noche en DMEM con FBS al 0,5%. Las células se incubaron después con
diluciones de anticuerpos en presencia de EGF 100 nM (Upstate)
durante una hora. Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron
con 0,5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH
7,4, IGEPGAL CA-630 al 1%, desoxicolato sódico al
0,25%, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, vanadato sódico 1 mM (NaVO_{4}),
NaF 1 mM, ½ comprimido de cóctel de proteasas en 10 ml). Se eliminó
el material insoluble por ultracentrifugación a 10.000 rpm durante
30 min. Los lisados celulares se ajustaron por concentración de
proteína y se separaron cantidades equivalentes de cada extracto
mediante SDS-PAGE. Se determinó el EGFR fosforilado
por transferencia de Western revelada con un
anti-fosfo-EGFR (Upstate).
Los resultados de la fosforilación del EGFR en
presencia de los anticuerpos monoclonales C225, VH4.15 y VH4.21 se
muestran en la Figura 4. Como se muestra en la Figura 5, la
inhibición de la fosforilación se correlacionaba con la potencia
del anticuerpo en un ensayo basado en células en una comparación de
los anticuerpos monoclonales C224 y VH4.15.
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Ejemplo
9
La capacidad de anticuerpos
anti-EGFR para inhibir la activación del EGFR se
ensaya por inducción de la apoptosis de células A431 de la forma
siguiente. Se incuban células A431 a 20000 células/pocillo en placas
de 24 pocillos con 1,0 \mug/ml de anticuerpo durante 0, 3, 7, 24
ó 48 horas. La apoptosis se mide por ELISA para determinar la
fragmentación del ADN (Roche). La apoptosis basal de un anticuerpo
inespecífico se resta de la media.
Los resultados de la apoptosis de células A431
inducida por anti-EGFR por los anticuerpos
monoclonales de longitud completa C225, ABX-EGF y
VH4.15 se muestran en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La capacidad de anticuerpos
anti-EGFR para inhibir la activación del EGFR in
vivo se examinó con múltiples dosificaciones de anticuerpos en
un modelo de ratón que tenía tumores A431 establecidos. Este ensayo
de modelo tumoral en ratón se realiza de la forma siguiente. El Día
0, se obtienen células A431 cultivadas en crecimiento, se cuentan y
se resuspenden a una concentración de 5 x 10^{7}. Se inyecta a
ratones CB17-SCID (Taconic) macho de 7 semanas de
edad por vía subcutánea 10^{7} células (es decir, 200 \mul) en
el flanco izquierdo (EC). Una vez que los tumores miden \sim300
mm^{3} (típicamente a aproximadamente 21 días), a los animales se
les inyecta por vía intraperitoneal 0,5 mg de anticuerpo/ratón en un
volumen de aproximadamente 250-300 \mul dos veces
por semana (Martes/Viernes), recibiendo los animales de control 250
\mul de solución salina. Se administran un total de 5 inyecciones
de anticuerpo. Se mide el volumen tumoral tres veces por semana
durante un total de tres semanas, comenzando con la primera
administración de anticuerpo.
Los resultados de un tratamiento de tumores A431
en un modelo de ratón con anticuerpos anti-EGFR se
muestran en la Figura 7.
<110> ELI LILLY AND COMPANY
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS
ANTI-EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X-16761
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/735.363
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-11-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip0,8cm
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<210> 3
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\hskip0,8cm
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Claims (5)
1. Un anticuerpo, o una porción de unión a
antígeno del mismo, que inhibe la activación del EGFR y que se une
a EGFR con una Kd de entre 0,01 pM y 10 pM, que comprende
una región variable de cadena pesada (HCVR) y
una región variable de cadena ligera (LCVR), seleccionándose dicha
HCVR y dicha LCVR de:
- a)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 50 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 67;
- b)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 51 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 68;
- c)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 55 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 72; y
- d)
- una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 56 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº: 73.
2. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de
longitud completa, un anticuerpo sustancialmente intacto, un
fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2} o un fragmento Fv
de cadena sencilla.
3. Una composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso como un
medicamento.
5. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento
de un cáncer mediado por EGFR en un paciente que lo necesite.
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