ES2255349B1 - PROCEDURE AND DEVICE FOR THE IDENTIFICATION AND SEQUENTIAL CHARACTERIZATION OF DISCRETE UNITS IN SUSPENSION IN A CAPILLARY JET IN LAMINAR FLOW REGIME, THROUGH AN OPTICAL OR ELECTROMAGNETIC SENSOR. - Google Patents
PROCEDURE AND DEVICE FOR THE IDENTIFICATION AND SEQUENTIAL CHARACTERIZATION OF DISCRETE UNITS IN SUSPENSION IN A CAPILLARY JET IN LAMINAR FLOW REGIME, THROUGH AN OPTICAL OR ELECTROMAGNETIC SENSOR. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento y dispositivo para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético. Es objeto de la presente invención un procedimiento para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, que incluye las siguientes etapas: - impulsión mediante una sobrepresión de hasta 200 atm a través de un orificio, simultánea y concéntricamente, de un líquido L portador de las unidades discretas, conjuntamente con otro fluido F inmiscible con él, que lo envuelve dando lugar a un chorro. - ajuste del caudal del chorro a un valor comprendido entre una y trescientas veces el cuadrado de la tensión superficial correspondiente a la entrefase del líquido L y el fluido envolvente F, dividida por la raíz cuadrada del producto de la densidad del líquido L yla potencia tercera del incremento de presión p; - ajuste del diámetro y el caudal del chorro a los requerimientos de frecuencia de paso y umbral de detección del sensor; - registro por el sensor del paso de las unidades discretas y caracterización en sucesión de cada una de ellas.Procedure and device for the identification and sequential characterization of discrete units in suspension in a capillary jet in laminar flow regime, by means of an optical or electromagnetic sensor. The object of the present invention is a process for the identification and sequential characterization of discrete units in suspension in a capillary jet in a laminar flow regime, by means of an optical or electromagnetic sensor, which includes the following steps: - impulsion by an overpressure of up to 200 atm through a hole, simultaneously and concentrically, of a liquid L carrying the discrete units, together with another fluid F immiscible with it, which envelops it giving rise to a jet. - adjustment of the flow of the jet to a value between one and three hundred times the square of the surface tension corresponding to the interphase of the liquid L and the enveloping fluid F, divided by the square root of the product of the density of the liquid L and the third power of the increase in pressure p; - adjustment of the diameter and the flow of the jet to the requirements of the frequency of passage and threshold of detection of the sensor; - registration by the sensor of the passage of discrete units and characterization in succession of each of them.
Description
Procedimiento y dispositivo para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético.Procedure and device for sequential identification and characterization of discrete units in suspension in a capillary stream in laminar flow regime, by means of an optical or electromagnetic sensor.
Es objeto de la presente invención un procedimiento para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, que incluye las siguientes etapas:The object of the present invention is a procedure for sequential identification and characterization of discrete units in suspension in a capillary jet in regime laminar flow, by means of an optical or electromagnetic sensor, which includes the following stages:
- \bullet?
- impulsión mediante una sobrepresión de hasta 200 atm a través de un orificio, simultánea y concéntricamente, de un líquido L portador de las unidades discretas, conjuntamente con otro fluido F inmiscible con él, que lo envuelve dando lugar a un chorro.drive through a overpressure of up to 200 atm through a hole, simultaneously and concentrically, of a liquid L carrying the units discrete, together with another F fluid immiscible with it, which Wraps it, giving rise to a jet.
- \bullet?
- ajuste del caudal del chorro a un valor comprendido entre una y trescientas veces el cuadrado de la tensión superficial correspondiente a la entrefase del líquido L y el fluido envolvente F, dividida por la raíz cuadrada del producto de la densidad del líquido L y la potencia tercera del incremento de presión \Deltap;jet flow setting a a value between one and three hundred times the square of the surface tension corresponding to the interphase of the liquid L and the envelope fluid F, divided by the square root of product of the density of the liquid L and the third power of the pressure increase Δp;
- \bullet?
- ajuste del diámetro y el caudal del chorro a los requerimientos de frecuencia de paso y umbral de detección del sensor;diameter and flow adjustment of the jet to the requirements of step frequency and threshold of sensor detection;
- \bullet?
- registro por el sensor del paso de las unidades discretas y caracterización en sucesión de cada una de ellas.registration by step sensor of discrete units and succession characterization of each of them.
Es asimismo objeto de la presente invención un procedimiento para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, según lo anterior, caracterizado porque el fluido envolvente F es un gas.An object of the present invention is also a procedure for sequential identification and characterization of discrete units in suspension in a hair jet in laminar flow rate, by means of an optical sensor or electromagnetic, according to the above, characterized in that the fluid envelope F is a gas.
Además, se define en esta invención un procedimiento para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, según lo anterior, caracterizado porque la viscosidad del líquido L se ajusta haciendo que éste sea producto de la mezcla de al menos dos líquidos miscibles de viscosidad diferente y compatibles con las unidades discretas en suspensión, de tal forma que la longitud del chorro capilar sea superior a 300 micrómetros, preferentemente superior a 1 milímetro, medida a partir del orificio hasta el punto donde el chorro capilar se disgrega en gotas.Furthermore, in this invention a procedure for sequential identification and characterization of discrete units in suspension in a capillary jet in regime laminar flow, by means of an optical or electromagnetic sensor, according to the above, characterized in that the viscosity of the liquid L is adjusted by making this product of the mixture of at least two miscible liquids of different viscosity and compatible with the discrete units in suspension, such that the length of the capillary jet is greater than 300 micrometers, preferably greater than 1 millimeter, measured from the hole to the point where the hair jet disintegrates in drops.
Tal procedimiento se puede aplicar a la identificación y caracterización secuencial de diversos tipos de unidades discretas: células, virus, microcristales, partículas inertes, partículas-sonda con afinidad por sustancias a analizar, microcápsulas mono- o multivesiculares.Such a procedure can be applied to the identification and sequential characterization of various types of discrete units: cells, viruses, microcrystals, particles inert, probe-particles with affinity for substances to be analyzed, mono- or multivesicular microcapsules.
Por otra parte, el procedimiento puede incluir una etapa de separación de las unidades discretas.On the other hand, the procedure may include a stage of separation of discrete units.
Asimismo es objeto de la invención un dispositivo para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en uno o más chorros capilares en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, caracterizado porque incluye:Likewise, an object of the invention is device for sequential identification and characterization of discrete units suspended in one or more capillary jets in laminar flow rate, by means of an optical sensor or electromagnetic, characterized in that it includes:
- \bullet?
- una fuente del líquido L portador de las unidades discretas;a source of liquid L carrier of discrete units;
- \bullet?
- una fuente del fluido F envolvente;a source of the fluid F envelope
- \bullet?
- una barrera impermeable, que separa a las dos fuentes citadas del ambiente exterior, y de la que emergen uno o más chorros de líquido portador L rodeados concéntricamente por el fluido envolvente F a través de uno o más orificios correspondientemente practicados en dicha barrera;a waterproof barrier, which separates the two sources cited from the outside environment, and from which one or more jets of carrier liquid L emerge surrounded concentrically by the envelope fluid F through one or more holes correspondingly practiced in said barrier;
- \bullet?
- un elemento que asegura una sobrepresión de hasta 200 atm de las fuentes con respecto al ambiente exterior y permite que todos los caudales emergentes del o de los orificios se encuentren en el rango descrito en la reivindicación 1;an element that ensures a overpressure of up to 200 atm from sources with respect to outside environment and allows all emerging flows of the o of the holes are in the range described in the claim 1;
- \bullet?
- un sensor, situado ante el tramo estable del o los chorros concéntricos, que registra las unidades discretas en tránsito secuencial.a sensor, located in front of the section stable of the concentric jets, which registers the units discrete in sequential transit.
Opcionalmente, el fluido envolvente F puede ser un gas.Optionally, the envelope fluid F can be a gas
El dispositivo se puede aplicar a la identificación y caracterización secuencial de diversos tipos de unidades discretas: células, virus, microcristales, partículas inertes, partículas-sonda con afinidad por sustancias a analizar, microcápsulas mono- o multivesiculares.The device can be applied to the identification and sequential characterization of various types of discrete units: cells, viruses, microcrystals, particles inert, probe-particles with affinity for substances to be analyzed, mono- or multivesicular microcapsules.
Asimismo, puede incluir elementos para efectuar la separación de dichas unidades discretas del chorro capilar.It can also include elements to make the separation of said discrete units from the hair jet.
La citometría de flujo (CMF) es una tecnología destinada a medir muy diversos parámetros celulares, tales como antígenos de superficie, citoplasmáticos y nucleares, ácidos nucleicos, actividad enzimática, flujo de calcio, potencial de membrana y pH. Se caracteriza esta tecnología, desarrollada en los últimos 35 años, por su capacidad para la medición de un gran número de células, en forma individual, durante periodos muy corto de tiempo. Entre sus ventajas se encuentran su exactitud, precisión, rapidez y capacidad para procesar un gran número de muestras en corto tiempo. La CMF permite un análisis multiparamétrico, extensivo a un gran número de células y a múltiples procesos funcionales; es fácil conseguir una buena integración de respuestas y mecanismos, así como una adecuada resolución de la heterogeneidad celular y una selección fenotípica de subpoblaciones. Sin embargo, el equipo, su mantenimiento y reactivos son todavía costosos.Flow cytometry (CMF) is a technology intended to measure very diverse cellular parameters, such as surface, cytoplasmic and nuclear antigens, acids nucleic, enzymatic activity, calcium flow, potential membrane and pH. This technology is characterized, developed in the last 35 years, for its ability to measure a large number of cells, individually, for very short periods of time. Among its advantages are its accuracy, precision, speed and ability to process a large number of Samples in short time. The CMF allows an analysis multiparameter, extensive to a large number of cells and to multiple functional processes; it's easy to get a good integration of responses and mechanisms, as well as adequate resolution of cellular heterogeneity and a phenotypic selection of subpopulations. However, the equipment, its maintenance and Reagents are still expensive.
En CMF, las células o partículas objeto de medición se desplazan arrastradas por un flujo o torrente líquido laminar, siendo los rangos actuales de medición de 100-25.000 células por segundo en sangre periférica u otros líquidos corporales. Cada célula pasa por un punto donde el chorro recibe el impacto de un láser, que emite luz de una longitud de onda adecuada; las características propias de cada célula determinan un patrón específico de dispersión y de intensidad en la radiación emitida. Dicha radiación es captada y depurada por un sistema óptico, que concentra y transforma la señal convirtiéndola en pulsos de voltaje. Éstos son codificados e interpretados por un ordenador. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy versátilmente, siendo de gran fiabilidad y exactitud. La citometría de flujo supera con mucho la capacidad de otras metodologías tradicionales y permite orientar el diagnóstico, clasificación y prognosis de numerosas enfermedades.In CMF, the cells or particles subject to measurement move dragged by a flow or liquid stream laminar, being the current measuring ranges of 100-25,000 cells per second in peripheral blood or other body fluids. Each cell goes through a point where the jet receives the impact of a laser, which emits light from a adequate wavelength; the characteristics of each cell determine a specific pattern of dispersion and of intensity in emitted radiation. Said radiation is captured and purified by an optical system, which concentrates and transforms the signal turning it into voltage pulses. These are coded and Interpreted by a computer. The data obtained in this way they can be handled very versatile, being very reliable and accuracy. Flow cytometry far exceeds the capacity of other traditional methodologies and allows to guide the diagnosis, classification and prognosis of numerous diseases.
Las células pueden llevar acopladas moléculas fluorescentes (labelling, tagging o marcado molecular), que, una vez excitadas por el láser, emiten una respuesta fluorescente en una longitud de onda mayor, lo que facilita la identificación de subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares. Cuando las células van desfilando en hilera por la zona de medida, donde la luz de láser intersecta el chorro, cada célula etiquetada produce un breve destello fluorescente, cuya intensidad es directamente proporcional al número de copias marcadas presentes en la célula. Los marcadores (fluorescent dyes) se conjugan con los antígenos presentes en la superficie de la célula, actuando como señales de clasificación. Actualmente existen diferentes protocolos que permiten unir anticuerpos a compuestos fluorescentes. Entre los fluorocromos utilizados destacan el isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), diclortriazinilaminofluoresceina (DTAF), Rojo Texas, bimane y otros. Son deseables ciertas propiedades biológicas en los marcadores fluorescentes, tales como su reactividad con grupos químicos, su unión no covalente a estructuras, su interacción con iones o radicales, su susceptibilidad a reacciones enzimáticas y su permeabilidad y retención a través de la membrana celular.The cells can carry coupled fluorescent molecules ( labelling, tagging or molecular labeling), which, once excited by the laser, emit a fluorescent response in a longer wavelength, which facilitates the identification of specific subgroups within large cell populations . When the cells parade in a row through the measurement zone, where the laser light intersects the jet, each labeled cell produces a brief fluorescent flash, the intensity of which is directly proportional to the number of marked copies present in the cell. The markers ( fluorescent dyes ) are conjugated with the antigens present on the surface of the cell, acting as classification signals. Currently there are different protocols that allow to bind antibodies to fluorescent compounds. Among the fluorochromes used, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrodamine isothiocyanate (TRITC), dichlortriazinylaminofluorescein (DTAF), Texas Red, bimane and others stand out. Certain biological properties in fluorescent markers are desirable, such as their reactivity with chemical groups, their non-covalent binding to structures, their interaction with ions or radicals, their susceptibility to enzymatic reactions and their permeability and retention across the cell membrane.
Un aspecto singular de la citometría de flujo es que mide la fluorescencia asociada individualmente a cada célula o partícula. En cambio, las mediciones espectrofotométricas se realizan en masa, valorándose la absorción o la transmisión de luz en porcentajes para el conjunto de la muestra. En la CMF, por el contrario, cada célula es interrogada individualmente por el láser. Para conseguirlo, y éste es uno de los aspectos centrales de la presente invención, es preciso asegurar una trayectoria predecible y secuencial de las células, que son enfocadas hidrodinámicamente para forzar su movimiento en fila dentro del eje de un chorro líquido.A unique aspect of flow cytometry is which measures the fluorescence individually associated with each cell or particle. Instead, spectrophotometric measurements are performed in bulk, valuing absorption or light transmission in percentages for the whole sample. In the CMF, for the On the contrary, each cell is interrogated individually by the laser. To achieve this, and this is one of the central aspects of the In the present invention, it is necessary to ensure a predictable trajectory and sequential cells, which are hydrodynamically focused to force its movement in a row inside the axis of a jet liquid.
Seguidamente, es tarea de unos tubos fotomultiplicadores (photo multiplier tubes, PMTs) y unos detectores de estado sólido el recoger las emisiones fotónicas de cada célula y convertirlas en diferencias de potencial analógicas. Las señales analógicas son luego digitalizadas mediante convertidores (analog to digital converters, ADCs) y almacenadas para su análisis posterior.Next, it is the task of some tubes photomultipliers (photo multiplier tubes, PMTs) and ones solid state detectors collecting photonic emissions from each cell and convert them into analog potential differences. The analog signals are then digitized by converters (analog to digital converters, ADCs) and stored for later analysis.
La citometría de flujo (CMF) permite la medición de numerosos parámetros de interés, tanto a nivel molecular, por fluorescencia (proteínas extracelulares, secuencias de ADN o ARN libres, complejos inmunes circulantes), como a nivel subcelular (viriones individuales, liposomas, cromosomas, orgánulos o núcleos aislados), a nivel celular (bacterias, hongos unicelulares, células humanas y animales, protoplastos vegetales) o a nivel supracelular (hibridomas y fusiones celulares, esferoides, organismos pluricelulares). También se pueden analizar parámetros intracelulares (componentes intracelulares, funciones intracelulares o entorno intracelular) y parámetros extracelulares (interacción con otras células, diferenciación celular).Flow cytometry (CMF) allows measurement of numerous parameters of interest, both at the molecular level, by fluorescence (extracellular proteins, DNA or RNA sequences free, circulating immune complexes), as at the subcellular level (individual virions, liposomes, chromosomes, organelles or nuclei isolated), at the cellular level (bacteria, unicellular fungi, cells human and animal, plant protoplasts) or supracellular level (hybridomas and cell fusions, spheroids, organisms multicellular). You can also analyze parameters intracellular (intracellular components, intracellular functions or intracellular environment) and extracellular parameters (interaction with other cells, cell differentiation).
Un aspecto importante de muchos sistemas de CMF es su capacidad para discriminar. En efecto, la citometría de flujo ha emergido como una herramienta poderosa en la diferenciación de subpoblaciones celulares. Para ello, el chorro portador de células es sometido a oscilación por medio de un cristal de cuarzo piezoeléctrico. La perturbación así inducida causa la rotura del chorro en microgotas, cuya frecuencia de generación es tan alta que cada gota tiene a lo sumo una sola célula. Si la célula en cuestión satisface los criterios exigidos, la gota portadora recibe un pulso de carga eléctrica. Seguidamente, se hace discurrir las gotas por un campo eléctrico que produce la deflexión del flujo y la separación de las subpoblaciones. Tales procesos de separación son actualmente comunes en el campo de la hematología experimental. Véase, por ejemplo, la descripción en Flow Cytometry and Sorting, second edition, M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, Editors. Wiley-Liss, New York, 1991.An important aspect of many CMF systems It is your ability to discriminate. In effect, flow cytometry has emerged as a powerful tool in the differentiation of cellular subpopulations. To do this, the cell carrier jet is subjected to oscillation by means of a quartz crystal piezoelectric. The disturbance thus induced causes the rupture of the jet in microdrops, whose generation frequency is so high that each drop has at most a single cell. If the cell in question satisfies the required criteria, the carrier drop receives a electric charge pulse Next, the drops through an electric field that produces the deflection of the flow and the Subpopulation separation. Such separation processes are currently common in the field of experimental hematology. See, for example, the description in Flow Cytometry and Sorting, second edition, M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, Editors. Wiley-Liss, New York, 1991.
Además de medir señales procedentes de los destellos fluorescentes de las células, los sistemas CMF permiten indicar otros aspectos de las células transeuntes, en particular el tamaño celular y la densidad. La luz láser incidental es dispersada de forma diferente dependiendo del tamaño relativo de la célula y de la presencia de orgánulos interiores. El tamaño y la densidad son parámetros esenciales en hematología para diferenciar tipos de células en la sangre.In addition to measuring signals from fluorescent flashes of cells, CMF systems allow indicate other aspects of transient cells, particularly the cell size and density. The incidental laser light is dispersed differently depending on the relative size of the cell and the presence of inner organelles. The size and the density are essential parameters in hematology to differentiate types of cells in the blood.
Los componentes habituales de un sistema de CMF son:The usual components of a CMF system They are:
- \bullet?
- Inyección de la muestra y cámara de flujoSample and chamber injection flow
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- Emisión de fluorescencia y bancada ópticaFluorescence emission and optical bench
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- Amplificación de las señales de fluorescenciaSignal amplification of fluorescence
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- Eliminación de señales no deseadas mediante un discriminadorSignal elimination no desired through a discriminator
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- Cuantificación de las señales: Convertidor analógico-digitalSignal quantification: Analog-to-digital converter
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- Clasificación de las señales: Histograma de frecuenciasClassification of the signals: Histogram of frequencies
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- Presentación de datos: gráficos de puntos y proyeccionesData presentation: graphics of points and projections
En cuanto al campo de aplicaciones de la CMF, pueden citarse numerosos ámbitos. En la práctica clínica general, los sistemas CMF permiten el diagnóstico o el pronóstico basados en análisis celulares, la evaluación y monitorización del tratamiento, o el análisis de la lesión y muerte celular. Son amplias las aplicaciones diagnósticas de la citometría de flujo, tanto para caracterización de las células normales como para identificación y detección de células anormales. En terapéutica, se aplica para la selección de células en la terapia celular (análisis de progenitores en el transplante autólogo, pruebas cruzadas en transplantes heterólogos, detección y cuantificación de leucocitos residuales en hemopreparados), análisis de la acción terapéutica a nivel celular (cambios en parámetros estructurales o funcionales), análisis de la acción terapéutica a nivel del paciente (detección de recidivas y enfermedad mínima residual, establecimiento de patrones pronósticos de éxito terapéutico) o detección y análisis de resistencia a la terapia (análisis de la captación y retención de fármacos, análisis del metabolismo de fármacos).Regarding the field of applications of the CMF, numerous fields can be cited. In general clinical practice, CMF systems allow diagnosis or prognosis based in cellular analysis, evaluation and monitoring of treatment, or analysis of cell injury and death. They are wide diagnostic applications of flow cytometry, both for characterization of normal cells and for identification and detection of abnormal cells. In therapeutics, it Applies for cell selection in cell therapy (analysis of parents in autologous transplantation, cross-testing in heterologous transplants, detection and quantification of leukocytes residuals in hemopreparations), analysis of the therapeutic action at cellular level (changes in structural or functional parameters), analysis of therapeutic action at patient level (detection of relapses and minimal residual disease, establishment of prognostic patterns of therapeutic success) or detection and analysis of resistance to therapy (analysis of uptake and retention of drugs, drug metabolism analysis).
Son también abundantes las aplicaciones de la citometría de flujo en el análisis de la lesión y muerte celular: detección de lesión celular subletal (cambios en parámetros estructurales o funcionales), determinación de efectos citotóxicos globales (control de calidad de las preparaciones celulares), caracterización de los mecanismos de muerte celular (identificación y análisis de células apoptóticas, identificación de células necróticas). En inmuno-hematologia se ha aplicado la CMF al análisis de antígenos (inmunofenotipo de superficie, detección de antígenos intracelulares o de antígenos circulantes), al analisis de anticuerpos (circulantes o unidos a células), al análisis de la función celular (proliferación, bioquímica, muerte celular). Véase por ejemplo en O'Connor, J.E., Guasch, R.M., Carretero, F. (1994) "Flow Cytometry: Technical Bases and Analytical Applications", en "Diagnostic Applications of Cytofluorimetric Methods Using Monoclonal Antibodies", European School of Transfusion Medicine, Milano, pp. 3-14; también puede consultarse en Sansonetty F., O'Connor, J.E. (1998) "Breve introduiçâo á Citometria de Fluxo-Uma das alternativas para "fazer" Citologia e Citopatologia Analítica". Micron 1: 14-20.The applications of the Flow cytometry in the analysis of cell injury and death: sublethal cell injury detection (changes in parameters structural or functional), determination of cytotoxic effects global (quality control of cell preparations), characterization of cell death mechanisms (identification and analysis of apoptotic cells, identification of necrotic cells). In immuno-hematology it has CMF applied to antigen analysis (immunophenotype of surface, detection of intracellular antigens or antigens circulating), to the analysis of antibodies (circulating or linked to cells), to the analysis of cell function (proliferation, biochemistry, cell death). See for example in O'Connor, J.E., Guasch, R.M., Carretero, F. (1994) "Flow Cytometry: Technical Bases and Analytical Applications ", in" Diagnostic Applications of Cytofluorimetric Methods Using Monoclonal Antibodies ", European School of Transfusion Medicine, Milano, pp. 3-14; It can also be found at Sansonetty F., O'Connor, J.E. (1998) "Brief introduction to Cytometry of Fluxo-Uma das alternatives for "fazer" Cytology and Analytical Cytopathology. "Micron 1: 14-20.
Un campo en el que la CMF comienza a resultar relevante es en el de la identficación y cuantificación de ácidos nucleicos, tanto para fines de diagnóstico (identificación de secuencias génicas asociadas a organismos patógenos o a alteraciones genéticas del paciente) como a la cuantificación de cambios en los patrones de expresión génica. Véase en Wedemeyer N, Potter T (2001) "Flow cytometry: an "old" tool for novel applications in medical genetics". Clin Genet 60: 1-8.A field in which the CMF begins to result relevant is in the identification and quantification of acids nucleic, both for diagnostic purposes (identification of gene sequences associated with pathogenic organisms or genetic alterations of the patient) as to the quantification of changes in gene expression patterns. See in Wedemeyer N, Potter T (2001) "Flow cytometry: an" old "tool for novel applications in medical genetics ". Clin Genet 60: 1-8.
Finalmente, se citan numerosas aplicaciones de la CMF en el campo ambiental, tales como el análisis de poblaciones unicelulares en su entorno (identificación y taxonomía, estimación de biomasa), la detección de contaminaciones, la detección de toxicidad in situ (marcadores de exposición, marcadores de efecto bioquímico, uso de microorganismos naturales o de laboratorio como indicadores de toxicidad, análisis genómico en células procedentes de organismos superiores).Finally, numerous applications of CMF in the environmental field are cited, such as the analysis of unicellular populations in their environment (identification and taxonomy, biomass estimation), the detection of contamination, the detection of toxicity in situ (exposure markers, biochemical effect markers, use of natural or laboratory microorganisms as toxicity indicators, genomic analysis in cells from higher organisms).
En cuanto a las tendencias actuales, el sector de los citómetros de flujo está experimentando un acelerado cambio, tendente a reducir su tamaño y consumo energético. Se alcanzan prestaciones de hasta 100000 células por segundo, con identificaciones particularizadas que afectan a hasta una célula entre 10 millones. Asimismo es factible medir la dispersión de luz en dos o tres ángulos, la fluorescencia en 12 o más regiones espectrales.As for current trends, the sector of the flow cytometers is experiencing an accelerated change, tending to reduce its size and energy consumption. Are reached benefits of up to 100,000 cells per second, with particularized identifications that affect up to one cell between 10 million It is also feasible to measure the light scattering in two or three angles, fluorescence in 12 or more regions Spectral
El objetivo del sistema fluido en CMF es el transportar una corriente hasta el haz de láser asegurando su exposición óptima y secuencial a la fuente lumínica. Para ello es preciso que sólo una célula o partícula transite a través del haz en cada momento. Esto se logra inyectando la muestra en una corriente de fluido envolvente dentro de la cámara de flujo. La muestra fluye como un núcleo coaxial con el fluido envolvente, manteniéndose guiada gracias a un principio hidrodinámico conocido como enfoque.The objective of the fluid system in CMF is the transport a current to the laser beam ensuring its Optimal and sequential exposure to the light source. To do this it is it is necessary that only one cell or particle transits through the beam in every moment This is achieved by injecting the sample into a stream of enveloping fluid inside the flow chamber. The sample flows as a coaxial core with the enveloping fluid, staying guided by a hydrodynamic principle known as focus.
La llamada tecnología Flow Focusing o FF (Gañán-Calvo 1998, Physical Review Letters 80, 285), aplicando una geometría especial, utiliza la vía neumática para generar microchorros de líquido que posteriormente, pasado el orificio de salida, se rompen en gotas de tamaño muy pequeño y sustancialmente homogéneo. Esta última tecnología también es capaz de generar micro-chorros de líquido mediante otro líquido en lugar de gas, o bien puede generar micro-chorros de gas en el seno de un líquido (el mismo líquido u otro diferente usado como forzador, es decir, con el mismo papel desempeñado por el gas en el procedimiento neumático), con lo cual se generan microburbujas de tamaño homogéneo.The so-called Flow Focusing or FF technology (Gañán-Calvo 1998, Physical Review Letters 80, 285), applying a special geometry, uses the pneumatic path to generate liquid micro cubes that subsequently, after the exit orifice, are broken into drops of size Very small and substantially homogeneous. The latter technology is also capable of generating micro-jets of liquid by another liquid instead of gas, or it can generate micro-jets of gas within a liquid (the same liquid or a different one used as a forger, that is, with the same role played by the gas in the pneumatic process), with which microbubbles of homogeneous size are generated.
La presente invención pretende aplicar las ventajas de un diseño sencillo y robusto propias de la tecnología FF a la identificación en CMF.The present invention aims to apply the advantages of a simple and robust technology design FF to identification in CMF.
La presente invención hace referencia a un procedimiento y dispositivo asociado para la identificación y caracterización, así como a la posible separación, de unidades discretas (células eucarióticas, bacterias, virus, partículas portadoras de información biológica o genética, microcristales, partículas inertes, partículas- sonda con afinidad por sustancias a analizar, microcápsulas mono- o multivesiculares). Las citadas unidades se encuentran en suspensión en un líquido L que se hace circular en chorro laminar y estable mediante su extrusión concéntrica a través de un orificio, conjuntamente con otro fluido envolvente F, siendo F preferentemente un gas. El chorro compuesto resultante consta de un núcleo líquido en el que viajan en suspensión las unidades discretas objeto de interés, rodeado de la corriente constituida por el fluido envolvente F. Un sensor en correspondencia con el chorro compuesto se encarga de la identificación y caracterización secuencial de las unidades discretas.The present invention refers to a procedure and associated device for identification and characterization, as well as the possible separation, of units discrete (eukaryotic cells, bacteria, viruses, particles carriers of biological or genetic information, microcrystals, inert particles, particles-probe with affinity for substances a analyze, mono- or multivesicular microcapsules). Those cited units are suspended in a liquid L that is made circular in laminar jet and stable by extrusion concentric through a hole, together with another fluid envelope F, F being preferably a gas. The compound jet resulting consists of a liquid core in which they travel in suspension of discrete units of interest, surrounded by the current consisting of the surrounding fluid F. A sensor in correspondence with the composite jet takes care of the identification and sequential characterization of the units discreet
El procedimiento propuesto se basa en la formación de un chorro que presenta un tramo laminar y estable, apto para la circulación secuencial de las unidades discretas objeto de análisis a alta velocidad; las condiciones para la formación del chorro se regulan mediante un rango de caudales dictado por variables fluidomecánicas del líquido portador y el fluido envolvente, preferentemente un gas.The proposed procedure is based on the formation of a jet presenting a laminar and stable section, suitable for sequential circulation of discrete units object of high speed analysis; the conditions for jet formation are regulated by a range of flow rates dictated by fluidomechanical variables of the carrier liquid and the envelope fluid, preferably a gas.
En citometría son conocidos los procedimientos analíticos basados en el barrido óptico de un chorro líquido portador de células a analizar; sin embargo, los procedimientos convencionales se enfrentan a problemas de atascamiento en las boquillas y canalículos a través de los cuales se hace circular la suspensión celular y presentan escasa flexibilidad en cuanto al tamaño de las células o partículas a analizar, así como en cuanto al régimen de flujo. Se han propuesto alternativas basadas en la utilización de otro líquido auxiliar, que rodea durante la formación del chorro al líquido portador a fin de incrementar la estabilidad del flujo, evitar el taponamiento y aumentar las variables de control. Sin embargo, la presencia de este líquido auxiliar, que se mezcla con el portador, puede causar interferencias o contaminaciones, obliga a un mantenimiento costoso, y el volumen de residuo generado es grande.In cytometry the procedures are known analytical based on the optical scanning of a liquid jet carrier of cells to be analyzed; however, the procedures Conventionals face problems of binding in the nozzles and canalicules through which the cell suspension and have little flexibility in terms of size of cells or particles to be analyzed, as well as in terms of to the flow regime. Alternatives based on the use of another auxiliary liquid, which surrounds during formation of the jet to the carrier liquid in order to increase the flow stability, avoid clogging and increase control variables However, the presence of this liquid auxiliary, which is mixed with the carrier, can cause interference or contamination, forces an expensive maintenance, and the volume of waste generated is large.
Aspectos esenciales de la invención propuesta en las reivindicaciones siguientes son: (1) el carácter inmiscible de los dos fluidos utilizados, que evita interferencias o la migración de las partículas entre el líquido portador y el fluido envolvente; (2) la posibilidad de adaptar, sin modificar el dispositivo, el diámetro y régimen de flujo en el chorro a los requerimientos de circulación y de identificación de las unidades discretas; (3) la posibilidad de utilizar un gas, en particular aire, como fluido envolvente, con el consiguiente ahorro en componentes, eliminación de gran parte del volumen de residuos y simplificación en el procedimiento; (4) la simplicidad funcional resultante, que permite multiplicar en un mismo dispositivo el número de chorros y de haces sensores, multiplicándose así sustancialmente la productividad del sistema, con un volumen de residuo limitado.Essential aspects of the invention proposed in The following claims are: (1) the immiscible character of the two fluids used, which prevents interference or the particle migration between carrier liquid and fluid envelope (2) the possibility of adapting, without modifying the device, the diameter and flow rate in the jet at unit circulation and identification requirements discrete; (3) the possibility of using a gas, in particular air, as a surrounding fluid, with the consequent savings in components, disposal of much of the volume of waste and simplification in the procedure; (4) functional simplicity resulting, which allows multiplying on the same device the number of jets and sensor beams, thus multiplying substantially the productivity of the system, with a volume of limited residue
La figura 1 muestra un dispositivo adaptado al procedimiento descrito para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético, mostrándose los siguientes aspectos de la invención:Figure 1 shows a device adapted to the procedure described for identification and characterization sequential discrete units suspended in a jet capillary in laminar flow regime, by means of an optical sensor or electromagnetic, showing the following aspects of the invention:
- (1)(one)
- fuente de alimentación del líquido portador de las unidades discretas L;liquid power supply carrier of discrete units L;
- (2)(2)
- boquilla de eyección del líquido portador L;liquid ejection nozzle carrier L;
- (3)(3)
- cámara a presión del fluido envolvente F;enclosure fluid pressure chamber F;
- (4)(4)
- orificio de salida del líquido portador L y del fluido envolvente F;liquid outlet carrier L and envelope fluid F;
- (5)(5)
- barrera impermeable que separa las fuentes de alimentación de ambos fluidos del ambiente exterior;waterproof barrier that separates power supplies of both ambient fluids Exterior;
- (6)(6)
- emisor;transmitter;
- (7)(7)
- sensor óptico o electromagnético.optical sensor or electromagnetic.
El líquido L forma un chorro en el que viajan las unidades discretas objeto de identificación y caracterización secuencial, siendo enfocado hidrodinámicamente por un fluido envolvente F.The liquid L forms a jet in which they travel the discrete units object of identification and characterization sequential, being hydrodynamically focused by a fluid envelope F.
La invención descrita en el presente documento contempla un procedimiento y su correspondiente dispositivo para la identificación y caracterización secuencial de unidades discretas en suspensión en un chorro capilar en régimen de flujo laminar, mediante un sensor óptico o electromagnético. La invención incluye dos fluidos inmiscibles: uno, necesariamente un líquido, tiene por misión transportar las unidades discretas objeto de estudio en una corriente organizada como chorro esbelto, de un diámetro característico superior o del orden del de las unidades discretas. El otro fluido es el enfocante (F): puede ser un gas, pero ello no es obligatorio. Ambos fluidos proceden de sendas fuentes independientes. Su movimiento se produce por impulsión debida a una sobrepresión de hasta 200 atm con respecto al ambiente exterior. Bajo dicha impulsión, ambos fluidos salen al exterior a través de uno o más orificios (4), con flujo simultáneo y concéntrico. Cada orificio está practicado en una barrera impermeable (5), que separa a las dos fuentes citadas del ambiente exterior. A través del orificio emerge un chorro de líquido portador L rodeado concéntricamente por el fluido envolvente F. Durante el flujo de salida de ambos fluidos, el fluido envolvente o enfocante rodea al chorro de líquido portador, moldeando bajo su simple acción aerodinámica a dicho líquido portador y asegurando su enfoque, es decir, la concentración del flujo del líquido portador en un chorro de diámetro reducido. Para ello es preciso ajustar el caudal del chorro portador a un valor comprendido entre una y trescientas veces el cuadrado de la tensión superficial correspondiente a la entrefase del líquido L y el fluido envolvente F, dividida por la raíz cuadrada del producto de la densidad del líquido L y la potencia tercera del incremento de presión \Deltap.The invention described herein contemplates a procedure and its corresponding device for sequential identification and characterization of discrete units in suspension in a capillary stream in laminar flow regime, by means of an optical or electromagnetic sensor. The invention includes two immiscible fluids: one, necessarily a liquid, has for mission transport the discrete units under study in a stream organized as a slender stream, with a diameter superior characteristic or of the order of discrete units. The other fluid is the focusing one (F): it can be a gas, but it doesn't It is mandatory. Both fluids come from both sources independent. Its movement is produced by impulse due to a overpressure of up to 200 atm with respect to the outside environment. Under said drive, both fluids go outside through one or more holes (4), with simultaneous and concentric flow. Every hole is practiced in a waterproof barrier (5), which separates to the two sources cited from the outside environment. Through hole emerges a stream of carrier liquid L surrounded concentrically by the enveloping fluid F. During the flow of outflow of both fluids, the enveloping or focusing fluid surrounds the jet of carrier liquid, molded under its simple action aerodynamics to said carrier liquid and ensuring its focus, is that is, the concentration of the flow of the carrier liquid in a reduced diameter jet. This requires adjusting the flow rate. of the carrier jet at a value between one and three hundred times the square of the surface tension corresponding to the interphase of the liquid L and the enveloping fluid F, divided by the square root of the product of the density of the liquid L and the third power of the pressure increase Δp.
A fin de satisfacer los requerimientos de frecuencia de paso y umbral de detección del sensor es preciso también ajustar el diámetro y caudal (ligado a la frecuencia de paso de unidades discretas) del chorro. Sólo así es posible el registro por el sensor del paso de las unidades discretas y la caracterización en sucesión de cada una de ellas.In order to meet the requirements of step frequency and sensor detection threshold is accurate also adjust the diameter and flow rate (linked to the frequency of passing discrete units) of the jet. Only then is the registration by the sensor of the passage of discrete units and the characterization in succession of each of them.
El fluido envolvente F puede ser (preferentemente) un gas, aunque este requisito no es obligatorio. Sin embargo, elegir un gas reporta grandes ventajas de economía y reduce el riesgo de contaminación del chorro portador por mezclado o arrastre con un líquido envolvente. Ha de observarse que el patrón de flujo FF evita totalmente el contacto del chorro portador con el orificio de salida (4).The envelope fluid F can be (preferably) a gas, although this requirement is not mandatory. However, choosing a gas reports great economic advantages and reduces the risk of contamination of the carrier jet by mixing or Drag with a liquid envelope. It should be noted that the pattern FF flow totally prevents contact of the carrier jet with the exit hole (4).
En cuanto a la longitud del chorro portador, éste es un parámetro importante a fin de asegurar espacio suficiente para la zona de medida (intercepción por un haz láser u otro agente de medición). Es posible ajustar la viscosidad del líquido L haciendo que éste sea producto de la mezcla de al menos dos líquidos miscibles de viscosidad diferente y compatibles con las unidades discretas en suspensión, de tal forma que la longitud del chorro capilar sea superior a 300 micrómetros, preferentemente superior a 1 milímetro, medida a partir del orificio (4) hasta el punto donde el chorro capilar se disgrega en gotas.As for the length of the carrier jet, This is an important parameter in order to ensure space sufficient for the measurement zone (interception by a laser beam or other measuring agent). It is possible to adjust the viscosity of the L liquid making it a product of the mixture of at least two miscible liquids of different viscosity and compatible with the discrete units in suspension, such that the length of the capillary jet is greater than 300 micrometers, preferably greater than 1 millimeter, measured from the hole (4) to the point where the hair jet disintegrates in drops.
Las unidades discretas portadas por el chorro pueden ser diversas: células, virus, microcristales, partículas inertes, partículas-sonda con afinidad por sustancias a analizar o microcápsulas mono- o multivesiculares.The discrete units carried by the jet They can be diverse: cells, viruses, microcrystals, particles inert, probe-particles with affinity for substances to be analyzed or microcapsules mono- or multivesicular.
El procedimiento puede incluir una etapa de separación de las unidades discretas mediante las técnicas habituales de desagregación de subpoblaciones (suministro de un pulso eléctrico a las unidades discretas marcadas positivamente, seguida de separación en un campo eléctrico).The procedure may include a stage of separation of discrete units by techniques usual sub-population disaggregation (supply of a Electric pulse to positively marked discrete units, followed by separation in an electric field).
Un aspecto principal de la invención es el guiado aerodinámico que el fluido enfocante ejerce sobre el líquido portador. Dicho efecto enfocante se produce sin necesidad de ningún campo eléctrico; y la emisión de un chorro fino o filamento de líquido portador se produce por razones meramente hidrodinámicas, como consta documentadamente en numerosas publicaciones ilustradoras del principio flow-focusing.A main aspect of the invention is the aerodynamic guidance that the focusing fluid exerts on the carrier liquid. Said focusing effect occurs without the need of any electric field; and the emission of a fine stream or filament of carrier liquid occurs for purely hydrodynamic reasons, as documented in numerous publications illustrating the flow-focusing principle.
El objetivo que se persigue es la definición de un sistema fluídico, aplicado a CMF, que asegure las siguientes cualidades:The objective pursued is the definition of a fluidic system, applied to CMF, that ensures the following qualities:
- \circ\ circ
- Escaso caudal de líquido portador y de fluido enfocante;Low flow of carrier liquid and focusing fluid;
- \circ\ circ
- Robustez de materiales y de manejo;Robustness of materials and driving;
- \circ\ circ
- Facilidad de uso;Easy to use;
- \circ\ circ
- Alta controlabilidad del diámetro y longitud del chorro portador;High diameter controllability and length of the carrier jet;
- \circ\ circ
- Reducción del riesgo de contaminación del fluido portador;Risk reduction of carrier fluid contamination;
- \circ\ circ
- Evitación del atasco del orificio de salida (4) (clogging).Avoidance of the exit hole jam (4) ( clogging ).
Claims (19)
- 1)one)
- impulsión mediante una sobrepresión \Deltap de hasta 200 atm a través de un orificio (4), simultánea y concéntricamente, de un líquido L portador de las unidades discretas, conjuntamente con otro fluido F inmiscible con él, que lo envuelve dando lugar a un chorro;drive by overpressure Δ of up to 200 atm through a hole (4), simultaneously and concentrically, of a liquid L carrying the units discrete, together with another F fluid immiscible with it, which it wraps it into a jet;
- 2)2)
- ajuste del caudal del chorro a un valor comprendido entre una y trescientas veces el cuadrado de la tensión superficial correspondiente a la entrefase del líquido L y el fluido envolvente F, dividida por la raíz cuadrada del producto de la densidad del líquido L y la potencia tercera del incremento de presión \Deltap;jet flow setting to a value between one and three hundred times the square of the tension surface corresponding to the interphase of the liquid L and the envelope fluid F, divided by the square root of the product of the density of the liquid L and the third power of the increase of pressure Δp;
- 3)3)
- ajuste del diámetro y el caudal del chorro a los requerimientos de frecuencia de paso y umbral de detección del sensor;adjustment of the diameter and flow rate of jet to the requirements of step frequency and threshold of sensor detection;
- 4)4)
- registro por el sensor del paso de las unidades discretas y caracterización en sucesión de cada una de ellas.registration by the sensor of the passage of discrete units and succession characterization of each of they.
tes.7. Procedure for the identification and sequential characterization of discrete units in suspension in a capillary jet in laminar flow regime, by means of an optical or electromagnetic sensor, according to claims 1 to 3, characterized in that the discrete units are inert particles.
tes.
- 1)one)
- una fuente (1) del líquido L portador de las unidades discretas;a source (1) of the liquid L carrying the units discrete;
- 2)2)
- una fuente del fluido F envolvente;a source of envelope fluid F;
- 3)3)
- una barrera impermeable (5), que separa a las dos fuentes citadas del ambiente exterior, y de la que emergen uno o más chorros de líquido portador L rodeados concéntricamente por el fluido envolvente F a través de uno o más orificios (4) correspondientemente practicados en dicha barrera;a waterproof barrier (5), which separates the two sources cited from the outside environment, and from which one or more jets of liquid emerge carrier L concentrically surrounded by the envelope fluid F a through one or more holes (4) correspondingly practiced in said barrier;
- 4)4)
- un elemento que asegura una sobrepresión \Deltap de hasta 200 atm de las fuentes con respecto al ambiente exterior y permite que todos los caudales emergentes del o de los orificios (4) se encuentren en el rango descrito en la reivindicación 1;a element that ensures an overpressure Δp of up to 200 atm of the sources with respect to the outside environment and allows all the emerging flows of the hole (4) are in the range described in claim 1;
- 5)5)
- un sensor (7), situado ante el tramo estable del o los chorros concéntricos, que registra las unidades discretas en tránsito secuencial.a sensor (7), located before the stable section of the jet (s) concentric, which records discrete units in transit sequential.
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AU2002318269A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-03-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Gas-focusing flow cytometer cell and flow cytometer detection system with waveguide optics |
-
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