ES2242314T3 - Subtisilina proteasa mutada. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN UNAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR MUTACION DE LOS GENES DE UNA SERIE DE PROTEASAS DE SUBTILISINA Y EXPRESANDO LOS GENES MUTADOS EN HUESPEDES ADECUADOS. LAS ENZIMAS MUESTRAN UN RENDIMIENTO MEJORADO PARA EL LAVADO EN COMPARACION CON SUS ENZIMAS MATRICES DEL TIPO SILVESTRE. LAS ENZIMAS SON MUY ADECUADAS PARA SU USO EN COMPOSICIONES DETERGENTES.

Description

Subtisilina proteasa mutada.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para preparar nuevas enzimas mutantes o variantes de enzimas útiles para formular composiciones de detergentes, que muestran un rendimiento de lavado mejorado.

Estado de la técnica

En la industria de los detergentes se han utilizado enzimas desde hace más de 20 años en las formulaciones de lavado. Entre las enzimas empleadas en dichas composiciones se encuentran las proteasas, las lipasas, las amilasas, las celulasas, así como otras enzimas o mezclas de las mismas. Las proteasas son las más importantes comercialmente.

Aunque se han utilizado las proteasas en la industria de los detergentes desde hace más de 20 años, todavía no se sabe exactamente qué características físicas o químicas son las responsables del buen rendimiento en el lavado o de la capacidad de una proteasa.

Las proteasas que se emplean hoy en día fueron halladas aislando las proteasas de su entorno natural y probándolas en las composiciones de detergentes.

Proteasas de Bacillus

Las enzimas que interrumpen los enlaces de la amida en los substratos de la proteína se clasifican como proteasas o peptidasas (intercambiables) (véase Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3). Las bacterias de la especie Bacillus segregan dos especies extracelulares de proteasa, una neutra, o metaloproteinasa, y una proteasa alcalina que es funcionalmente una serina endopeptidasa, a la que se hace referencia como subtilisina. Se ha relacionado la secreción de estas proteasas con el ciclo de crecimiento bacteriano, con una mayor expresión de la proteasa durante la fase estacionaria, cuando también se produce la esporulación. Joliffe et al. (1980, J. Bacteria) 141:1199 1208) ha sugerido que las proteasas de Bacillus funcionan en la renovación de la membrana celular.

Subtilisina

Una serina proteasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces péptidos y en la que hay un residuo esencial de serina en el centro activo (White, Handler and Smith, 1973 "Principies of Biochemistry", Quinta Edición, McGraw-Hill Book Company, NY, págs. 271-272).

Las serina proteasas bacterianas tienen un peso molecular en la gama de 20.000 a 45.000. Son inhibidas por el diisopropilfluorofosfato, pero a diferencia de las metaloproteasas son resistentes al ácido etileno diamino tetraacético (EDTA) (aunque los iones de calcio las estabilizan a altas temperaturas). Éstas hidrolizan los ésteres terminales simples y tienen una actividad similar a la quimiotripsina eucariótica, que también es una serina proteasa. Un término menos amplio, la proteasa alcalina, que abarca un subgrupo, refleja el pH alto óptimo de algunas serina proteasas, desde un pH 9.0 a 11.0 (para revisión, véase Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41:711-753).

En relación con la presente invención, una subtilisina es una serina proteasa producida por bacterias u hongos gram-positivos. Se ha identificado una amplia variedad de subtilisinas y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de varias subtilisinas. Éstas incluyen al menos seis subtilisinas de las cepas de Bacillus, es decir, la subtilisina 168, la subtilisina BPN', la subtilisina Carlsberg, la subtilisina DY, la subtilisina amylosacchariticus y la mesentericopeptidasa (Kurihara et al., 1972, J.Biol.Chem. 247:5629-5631; Wells et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:7911-7925; Stahl and Ferrari, 1984, J.Bacteriol. 159:811-819, Jacobs et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13:8913-8926; Nedkov et al., 1985,
Biol. Chem. Hoppe Seyler 366:421 430, Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196:228 232), una subtilisina de un actino-
micetalo, la termitasa de Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS Lett. 1983: 195-200), y una subtili-
sina micótica, la proteinasa K de Tritirachium album (Jany and Mayer, 1985, Biol.Chem. Hoppe Seyler 366:584 492).

Las subtilisinas están bien caracterizadas físicamente y químicamente. Junto con un conocimiento de la estructura primaria (secuencia de aminoácidos) de estas enzimas, se han determinado más de 50 estructuras de la subtilisina por rayos-X de alta resolución que trazan la unión del substrato, el estado de transición, los productos, como mínimo tres inhibidores de la proteasa diferentes y definen las consecuencias estructurales de una variación natural (Kraut, 1977, Ann.Rev.Biochem. 46:331-358).

En el contexto de la presente invención, una variante de la subtilisina o una subtilisina proteasa mutada significa una subtilisina que ha sido producida por un organismo que está expresando un gen mutante derivado de un microorganismo padre que poseía un gen original o padre y que produjo una enzima madre correspondiente, dicho gen padre ha sido mutado con el objetivo de producir el gen mutante a partir del cual se produce dicha subtilisina proteasa mutada cuando se expresa en el huésped adecuado.

Tanto las mutaciones aleatorias como las dirigidas del gen de la subtilisina han surgido del conocimiento de la propiedades físicas y químicas de la enzima y de la información aportada en relación a la actividad catalítica de la subtilisina, a la especificidad del substrato, a la estructura terciaria, etc. (Wells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U.. 84; 1219-1223; Wells et al., 1986, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317:415-423: Hwang and Warshel, 1987, Biochem. 26:2669-2673; Rao et al., 1987, Nature 328:551 554).

En especial, la mutagénesis dirigida de los genes de la subtilisina ha atraído mucha atención y se describen varias mutaciones en las solicitudes de patente y patentes siguientes:

Publicación de EP nº 130756 (GENENTECH) (correspondiente a la patente de Estados Unidos nº 4,760,025
(GENENCOR)) en relación a mutaciones específicas o generadas aleatoriamente en las "carbonil hidrolasas" y el cribaje subsiguiente de las enzimas mutadas para conseguir propiedades diferentes, como la proporción k_{cat}/K_{m}, el perfil de actividad del pH y la estabilidad de la oxidación. Además de revelar que la mutación dirigida es posible y que la mutación de la subtilisina BPN' en determinadas posiciones específicas, como ^{-1}Tyr, ^{32}Asp, ^{155}Asn, ^{104}Tyr, ^{222}Met, ^{166}Gly, ^{64}His, ^{169}Gly, ^{189}Phe, ^{33}Ser, ^{221}Ser, ^{217}Tyr, ^{156}Glu o ^{152}Ala, provee enzimas que poseen propiedades alteradas, esta solicitud no contribuye a resolver el problema de decidir dónde se deben introducir las mutaciones para obtener enzimas con las propiedades deseadas.

La publicación de EP nº 214435 (HENKEL) en relación a la clonación y la expresión de la subtilisina Carlsberg y dos mutantes de la misma. En esta solicitud no se establece ninguna razón para que se lleve a cabo la mutación de ^{158}Asp en ^{158}Ser y de ^{161}Ser en ^{161}Asp.

En la publicación de patente internacional nº WO 87/04461 (AMGEN) se propone reducir el número de secuencias Asn-Gly presentes en la enzima madre con el objetivo de obtener enzimas mutadas que tengan mejor pH y termoestabilidades. En la solicitud se insiste en eliminar, mutar, o modificar los residuos ^{109}Asn y ^{218}Asn en la subtilisina BPN'.

La publicación de patente internacional nº WO 87/05050 (GENEX) expone la mutación aleatoria y el cribaje subsiguiente de un gran número de mutantes de la subtilisina BPN' para conseguir propiedades mejoradas. En la solicitud se describen las mutaciones en las posiciones ^{218}Asn, ^{131}Gly, ^{254}Thr, ^{166}Gly, ^{116}Ala, ^{188}Ser, ^{126}Leu y ^{53}Ser.

En la solicitud de EP nº 87303761 (GENENTECH) se describe cómo se pueden aplicar las consideraciones de homología tanto en el nivel estructural primario como en el terciario para identificar residuos aminoácidos equivalentes tanto si se conservan como si no. Esta información, junto con los conocimientos de los inventores sobre la estructura terciaria de la subtilisina BPN', lleva a los inventores a seleccionar varias posiciones susceptibles de mutar con la esperanza de obtener mutantes con propiedades alteradas. Las posiciones se identifican como sigue: ^{124}Met, ^{222}Met, ^{104}Tyr, ^{152}Ala, ^{156}Glu, ^{166}Gly, ^{169}Gly, ^{189}Phe, ^{217}Tyr. También las posiciones ^{155}Asn, ^{21}Tyr, ^{22}Thr, ^{24}Ser, ^{32}Asp, ^{33}Ser, ^{36}Asp, ^{46}Gly, ^{48}Ala, ^{49}Ser, ^{50}Met, ^{77}Asn, ^{87}Ser, ^{94}Lys, ^{95}Val, ^{96}Leu, ^{107}Ile, ^{110}Gly, ^{170}Lys ^{171}Tyr, ^{172}Pro, ^{197}Asp, ^{199}Met, ^{204}Ser, ^{213}Lys y ^{221}Ser, se espera que estas posiciones influyan en las diferentes propiedades de la enzima. Asimismo, se pone como ejemplo varias mutaciones para reforzar estas sugerencias. Junto con las mutaciones simples en estas posiciones, los inventores también llevaron a cabo varias mutaciones múltiples. Además los inventores califican como interesantes ^{215}Gly, ^{67}His, ^{126}Leu, ^{135}Leu y los residuos aminoácidos dentro de los segmentos 97-103, 126-129, 213-215, y 152-172, pero no se presentan ejemplos de las mutaciones en ninguna de estas posi-
ciones.

La publicación de EP nº 260105 (GENENCOR) describe las modificaciones de determinadas propiedades en enzimas que contienen una tríada catalítica mediante la selección de un residuo aminoácido dentro de aproximadamente 15 A de la tríada catalítica y susbtituye el residuo aminoácido por otro residuo. Se dice que, concretamente, las enzimas del tipo de la subtilisina descritas en la presente descripción pertenecen a la clase de enzimas que contienen una tríada catalítica. Las posiciones de las subtilisinas 222 y 217 vienen indicadas como las posiciones preferidas para la sustitución.

La publicación de patente internacional nº WO 88/06624 (GIST-BROCADES NV) presenta las secuencias de ADN y de aminoácidos de una proteasa subtilisina llamada PB92 homóloga casi en un 100% en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la Subtilisina 309

La publicación de patente internacional nº WO 88/07578 (GENENTECH) reivindica enzimas mutadas derivadas de una enzima precursora mediante la sustitución o la modificación de, al menos, un grupo catalítico de un residuo aminoácido. Los inventores afirman que haciendo esto se obtiene una enzima mutada que resulta reactiva con substratos que contienen el grupo catalítico modificado o sustituido (catálisis asistida de substrato).

La teoría general se basa en la subtilisina de B. amyloliquefaciens (BPN'), en la que se han descrito modificaciones en las posiciones ^{64}His que fue modificada en ^{64}Ala sola o combinada con una mutación "coadyuvante" de Ser-24-Cys. También se sugieren modificaciones en los residuos aminoácidos ^{32}Asp, y ^{221}Ser y una mutación "coadyuvante" de Ala-48-Glu.

La publicación de patente internacional nº WO 88/08028 (GENEX) presenta la ingeniería genética en torno a emplazamientos de unión del ion metálico para la estabilización de proteínas. Esta publicación también utiliza la Subtilisina BPN' como ejemplo y señala los siguientes residuos aminoácidos como candidatos a ser sustituidos ^{172}Pro (P172D, P172E), ^{131}Gly (G131D), ^{76}Asn (N76D; N76D+P172D(E), ^{78}Ser (S78D). Además, se hacen sugerencias sobre los mutantes combinados N76D+S78D+G131 D+P172D(E); N76D+G131 D; S78D+G131 D; S78D+P172D(E) Y S78D+G131 D+P172D(E).

La publicación de patente internacional nº WO 88/08033 (AMGEN) presenta varios análogos de la subtilisina que tienen un sitio de unión del calcio modificado y sustituye bien Asn o Gly en cualquier secuencia de Asn-Gly presente en la molécula obteniendo así enzimas que cuentan con una mejor estabilidad térmica y del pH. Se ha descrito uno de los sitios de unión de calcio que incluye los residuos aminoácidos ^{41}Asp, ^{75}Leu, ^{76}Asn, ^{77}Asn, ^{78}Ser, ^{79}Ile, ^{80}Gly, ^{81}Val, ^{208}Thr y ^{214}Tyr; otros sitios de unión de calcio potenciales se sugieren en ^{140}Asp y ^{172}Pro; ^{14}Pro y ^{271}Gln; y ^{172}Pro y 1^{195}Glu o ^{197}Asp. También se sugiere la mutación de las posiciones ^{109}Asn y ^{218}Asn. Los mutantes producidos son N109S, N109S+N218S, N76D+N109S+N218S, N76D+N77D+N 109S+N218S, N76D+I79E+N 109S+N218S.

La publicación de patente internacional nº WO 88/08164 (GENEX) describe un método para identificar residuos en una proteína que puede sustituirse por una cisteína para permitir la formación de enlaces de disulfuro potencialmente estabilizantes. El método se basa en el conocimiento detallado de tres estructuras dimensionales de la proteína y emplea un ordenador para seleccionar las posiciones. En relación con las subtilisina proteasas, se utilizó la Subtilisina BPN' como sistema modelo. Al emplear el método en la Subtilisina BPN' se obtuvo la propuesta de 11 candidatos para introducir enlaces de disulfuro (1:T22C+S87C, 2:V26C+L235C, 3:G47C+P57C, 4:M50C+N109C, 5:E156C+T164C, 6:V165C+K170C, 7:V165C+S191C, 8:Q206C+A216C, 9:A230C+V270C, 10:1234C+A274C, 11:H238C+W241C). De éstos se produjeron 4 (1, 2, 4, y 8) de los cuales 2 no conllevaron ningún efecto estabilizador (2 y 4). Se produjeron más mutantes al combinar dos de estos mutantes entre sí y uno con otra mutación, a saber, T22C+S87C+N218S y T22C+S87C+Q206C+A216C. También se produjeron varios mutantes que no tuvieron éxito, a saber, Al C+S78C, S24C+S87C, K27C+S89C, A85C+A232C, 1122C+V147C, S249C+A273C y T253C+A273C.

Asimismo, Tomás, Russell y Fersht, Nature 318, 375-376(1985) han demostrado que el cambio de ^{99}Asp a ^{99}Ser en la subtilisina BPN' modifica la dependencia de pH de la enzima.

En un artículo posterior J. Mol. Biol. (1987)193, 803-813, los mismos autores también abordan el tema de la sustitución de ^{156}Ser en lugar de ^{156}Glu.

Ambas mutaciones se encuentran dentro de una distancia de aproximadamente 15 \ring{A} del ^{64}His activo.

En Nature 328, 496-500(1987) Russel y Fersht comentan los resultados de sus experimentos y presentan reglas para cambiar los perfiles de actividad de pH mutando una enzima para obtener modificaciones en la carga superficial.

Punto isoelectrico (pl_{o})

El punto isoeléctrico, pl_{o}, se define como el valor de pH en el que el complejo molecular de la enzima (con metales u otros iones asociados opcionalmente) es neutro, es decir, que la suma de cargas electroestáticas (carga electroestática de la red =NEC) en el complejo es igual a cero. En esta suma, por supuesto, debe tenerse en cuenta la naturaleza positiva o negativa de las cargas electroestáticas individuales.

El punto isoeléctrico se calcula convenientemente empleando cantidades de equilibrio que utilizan valores de pK para los diferentes residuos cargados en la enzima en cuestión y a continuación encuentran por iteración el valor de pH en el que la NEC de la molécula de la enzima es igual a cero.

Un problema que se presenta en este cálculo es que los valores de pK para los residuos cargados dependen de su entorno y, consecuentemente, están sujetos a variación. Sin embargo, se pueden obtener muy buenos resultados al asignar determinados valores de pK aproximados a los residuos cargados independientemente del valor real. También resulta posible hacer los cálculos más sofisticados, teniendo en cuenta en parte el entorno.

El pl_{o} también puede determinarse experimentalmente mediante la focalización isoeléctrica o mediante la titración de una solución que contenga la enzima. Además, los diferentes valores de pK para los residuos cargados pueden determinarse experimentalmente mediante titración.

Aplicaciones industriales de las subtilisinas

Las proteasas como las subtilisinas han resultado ser de mucha utilidad en la industria, particularmente en las composiciones de detergentes, debido a que son útiles para eliminar las manchas proteínicas.

Actualmente las siguientes proteasas resultan conocidas y muchas de éstas se comercializan en grandes cantidades en muchos países del mundo.

La Subtilisina BPN' o Novo, comercializada por, p. ej., SIGMA, St. Louis, E.E.U.U.

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La subtilisina Carlsberg, comercializada por Novo-Nordisk A/S (Dinamarca) como ALCALASE® y por IBIS (Holanda) como MAXATASE®;

La subtilisina de Bacillus lentus, comercializada por NOVO INDUSTRI A/S (Dinamarca) como SAVINASE®;

Enzimas que se asemejan mucho a SAVINASE® como MAXACAL.®, comercializada por IBIS, y OPTICLEAN® comercializada por MILES KALI CHEMIE (FRG);

La subtilisina de Bacillus lentus, comercializada por Novo-Nordisk A/S (Dinamarca) como ESPERASE®;

KAZUSASE® comercializada por SHOWA DENKO (Japón)

Sin embargo, para que dichas enzimas resulten eficaces no sólo deben mostrar actividad bajo condiciones de lavado, sino que también deben ser compatibles con otros componentes del detergente durante la producción y almacenamiento de dicho detergente.

Por ejemplo, las subtilisinas se pueden utilizar en combinación con otras enzimas que sean activas frente a otros substratos y la subtilisina seleccionada debe poseer estabilidad ante tales enzimas; asimismo, la subtilisina seleccionada preferentemente no catalizará la degradación de las otras enzimas. Además, la subtilisina elegida deberá ser resistente a la acción de otros componentes en la composición de detergentes, como los blanqueadores, los agentes oxidantes, etc. Concretamente una enzima que se va a emplear en la composición de un detergente debería ser estable con respecto al poder de los agentes oxidantes, las propiedades de enlace del calcio y las condiciones de pH establecidas por los componentes no enzimáticos del detergente durante el almacenamiento y en la solución de lavado durante el lavado.

A menudo se hace referencia a la capacidad de una enzima para catalizar la degradación de varios substratos que se dan de forma natural en los objetos que hay que limpiar durante, p. ej., el lavado, como su capacidad de lavado, su lavabilidad, su detergencia o rendimiento de lavado. En toda esta solicitud el término rendimiento de lavado se usará de manera que englobe esta propiedad.

Se ha descubierto que las subtilisinas que se dan de forma natural poseen propiedades que son altamente variables en relación con su poder o capacidad de lavado cuando se dan variaciones en los parámetros como el pH. Varias de las proteasas utilizadas en los detergentes comercializados descritas arriba tienen, de hecho, un mejor rendimiento que los que se comercializaban hace aproximadamente 20 años, pero para llegar a su rendimiento óptimo cada enzima tiene unas condiciones específicas propias en lo que concierne a la composición y a las condiciones de lavado, p. ej., el pH, la temperatura, la fuerza iónica (=I), el sistema activo (agentes de superficie, surfactantes, blanqueador, etc.), los adyuvantes, etc.

Como consecuencia se descubre que una enzima que posee propiedades deseables con un pH bajo y con un I bajo puede resultar menos interesante bajo condiciones más alcalinas y un I alto, o una enzima que presenta propiedades adecuadas con un pH alto y un I alto puede resultar menos interesante con unas condiciones de pH bajo, I
bajo.

El descubrimiento y desarrollo de las técnicas de ADN recombinante tiene una vasta influencia sobre el campo de la química de las proteínas.

Se ha pronosticado que estas técnicas permitirán diseñar péptidos y proteínas, como las enzimas y las hormonas, según las condiciones deseadas, permitiendo así la producción de compuestos que presenten las propiedades desea-
das.

Hoy en día resulta posible construir enzimas que tengan las secuencias de aminoácidos deseadas y, como se ha indicado anteriormente, gran parte de las investigaciones se ha consagrado a las subtilisinas diseñadas con propiedades alteradas. Entre las propuestas, la técnica de producción y cribaje de un gran número de enzimas mutadas tal y como se describe en la publicación europea nº 130756 (GENENTECH) (Patente Estadounidense nº 4,760,025 (GENENCOR)) y en la publicación de patente internacional nº WO 87/05050 (GENEX) corresponde al método clásico de aislamiento de enzimas originales y cribaje según sus propiedades, pero resulta más eficaz con el conocimiento de la presencia de un gran número de enzimas mutantes diferentes.

Puesto que una enzima subtilisina normalmente comprende 275 residuos aminoácidos, y cada uno puede ser 1 de 20 aminoácidos posibles que se dan naturalmente, un inconveniente muy serio en el procedimiento sería el número tan grande de mutaciones generadas que han de ser sometidas a un cribaje preliminar antes de seguir probando los mutantes seleccionados que muestren características interesantes en el primer cribaje, puesto que no se ofrece ninguna orientación a la hora de determinar qué residuos aminoácidos cambiar para obtener la enzima deseada con propiedades mejoradas para el empleo en cuestión, como es, en este caso, la formulación de composiciones de detergentes que presenten un rendimiento de lavado mejorado bajo condiciones específicas de la solución de lava-
do.

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Por lo tanto, un procedimiento como el que se perfila en estas solicitudes de patentes sólo será ligeramente mejor que los procedimientos de mutación aleatorios tradicionales que se conocen desde hace años.

El resto de técnicas conocidas se refieren al hecho de cambiar propiedades específicas, como el nivel de transesterificación y de hidrólisis (publicación de EP nº 260105 (GENENCOR), el perfil de la actividad de pH (Tomás, Russell, and Fersht, supra) y la especificidad del substrato (publicación de patente internacional nº WO 88/07578
(GENENTECH). Ninguna de estas publicaciones hace referencia al cambio en el rendimiento de lavado de las
enzimas.

Otra técnica que ha evolucionado consiste en emplear la información detallada sobre las tres estructuras dimensionales de las proteínas para analizar las consecuencias potenciales de la sustitución de ciertos aminoácidos. Este enfoque se ha utilizado y se describe en EP 260105 (GENENCOR), WO 88/07578 (GENENTECH), WO 88/08028 (GENEX), WO 88/08033 (AMGEN) y WO 88/08164 (GENEX).

Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente, aún no se ha identificado ninguna relación entre las propiedades bien definidas de una enzima como las que se mencionan arriba y el rendimiento de lavado de una enzima.

En la solicitud de patente internacional inédita nº PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) se propone emplear el concepto de comparación de homología para determinar qué posiciones de los aminoácidos deberían ser seleccionadas para la mutación y qué aminoácidos deberían ser sustituidos en estas posiciones para obtener el cambio deseado en el rendimiento de lavado.

Utilizando un procedimiento como éste la tarea del cribaje se ve reducida drásticamente, puesto que el número de mutantes generados es mucho más pequeño, pero con este procedimiento sólo se prevé que se puedan obtener las enzimas que presentan las propiedades útiles combinadas de la enzima madre y la enzima utilizada en la compara-
ción.

El problema parece radicar en que, a pesar de que se ha dirigido gran parte de las investigaciones a revelar el mecanismo de la actividad enzimática, aún se sabe poco sobre los factores que afectan a la estructura y la combinación de los residuos aminoácidos que determina las propiedades de las enzimas con respecto a su rendimiento de
lavado.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de seguir mejorando y confeccionando enzimas para sistemas de lavado, así como un mejor entendimiento del mecanismo de acción de la proteasa en el uso práctico de las composiciones utilizadas en la limpieza o en los detergentes. Un entendimiento como éste podría tener como resultado reglas que puedan aplicarse a la hora de seleccionar las mutaciones que, con un grado razonable de certeza, den como resultado una enzima que presente un rendimiento de lavado mejorado bajo condiciones específicas en una solución de
lavado.

Resumen de la invención

Otras investigaciones sobre estos problemas han demostrado sorprendentemente que uno de los factores fundamentales en el empleo de enzimas subtilisina en las composiciones de detergentes es la adsorción de la enzima al substrato, es decir, el material que ha de ser eliminado de los textiles, superficies duras u otros materiales que haya que limpiar.

En consecuencia, la presente invención se refiere a mutaciones del gen de subtilisina dando como resultado propiedades cambiadas de la enzima subtilisina mutante expresada por este gen mutado, por lo que dicha enzima subtilisina mutante muestra un comportamiento mejorado en las composiciones de detergentes. Las mutaciones se generan en los ácidos nucléicos específicos en el gen padre de subtilisina responsable de la expresión de los aminoácidos específicos en posiciones específicas de la enzima subtilisina.

La presente invención también hace referencia a métodos de selección de las posiciones y los aminoácidos que deben mutar y, de ese modo, los ácidos nucleicos que se deben cambiar mutatis mutandis en el gen de la subtilisina en cuestión.

Según la invención, se proporciona un método para preparar una subtilisina proteasa mutante según está dispuesto en las reivindicaciones anexas.

La invención trata en parte, pero sin intención de limitarse a ello, las mutaciones de los genes de subtilisina 309 y de subtilisina Carlsberg y derivados de las enzimas subtilisina 309 mutante y Carlsberg, que presentan un rendimiento de lavado mejorado en las diferentes composiciones de detergentes, dando como resultado soluciones de lavado con diferentes valores de pH.

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Abreviaturas Aminoácidos

A = Ala = Alanina

V = Val = Valina

L = Leu = Leucina

I = Ile = Isoleucina

P = Pro = Prolina

F = Phe = Fenilalanina

W = Trp = Triptófano

M = Met = Metionina

G = Gly = Glicina

S= Ser = Serina

T = Thr = Treonina

C = Cys = Cisteína

Y = Tyr = Tirosina

N = Asn = Asparagina

Q = Gln = Glutamina

D = Asp = Ácido Aspártico

E = Glu = Ácido Glutámico

K = Lys = Lisina

R = Arg = Arginina

H = His = Histidina

Bases de ácidos nucleicos

A = Adenina

G = Guanina

C = Citosina

T = Timina (sólo en ADN)

U = Uracilo (sólo en ARN)

Mutaciones

Al describir los diferentes mutantes producidos o contemplados según la invención, se adaptaron las siguientes nomenclaturas para facilitar la referencia:

Aminoácido(s) sustituido(s) en la(s) posición(es) original(es) del (de los) aminoácido(s)

Según esto, la sustitución del ácido glutámico por glicina en la posición 195 se designa con:

Gly 195 Glu o G195E

una deleción de la glicina en la misma posición es:

Gly 195 * o G195*

y la inserción de un residuo aminoácido adicional como la lisina es:

Gly 195 GlyLys o G195GK

En aquellos casos en los que aparece indicada una deleción en la tabla 1 o en los que aparece presente en una subtilisina no indicada en la tabla 1, la inserción en dicha posición se indica con:

*36 Asp o *36D

para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36

Las mutaciones múltiples se separan mediante el símbolo de adición, es decir:

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu o R170Y+G195E

que representan las mutaciones en las posiciones 170 y 195 sustituyendo la tirosina y el ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente.

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TABLA 1 Comparación de la secuencia de aminoácidos de varias proteasas

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a =

subtilisina BNP' (Wells et al, 1983, supra)

b =

subtilisina amylosacchariticus (Kurihara et al, 1972, supra)

c =

subtilisina 168 (Stahl and Ferrari, 1984, supra)

d =

subtilisina mesentericopeptidasa (Svendsen et al, 1986, supra)

e =

subtilisina DY (Nedkov et al, 1985, supra)

f =

subtilisina Carlsberg (Smith et al, 1968, supra)

g =

subtilisina Carlsberg (Jacobs et al, 1985, supra)

h =

subtilisina 309 (solicitud de patente internacional nº PCT/ DK 88/ 00002)

i =

subtilisina 147 (solicitud de patente internacional nº PTC/ DK 88/ 00002)

j =

termitasa (Meloun et al, 1985, supra)

k =

proteinasa K (Betzel et al, 1988, Eur. J. Biochem. 178: 155 ff), y Gunkel et al, 1989, Eur. J. Biochem. 179: 185 ff)

l =

aqualisina (Kwon et al, 1988, Eur. J. Biochem. 173: 491 ff)

m =

proteasa PB92 de Bacillus (publicación de patente europea nº 0 283 075)

n =

proteasa TW7 (Tritirachium album) (solicitud de patente internacional nº PCT/ US88/ 01040)

o =

proteasa TW3 (Tritirachium album) (solicitud de patente internacional nº PCT/ US88/ 01040

* =

deleción asignada

1

TABLA I (continuación)

2

TABLA I (continuación)

3

TABLA I (continuación)

4

TABLA I (continuación)

5

TABLA I (continuación)

6

Descripción detallada de la invención

Arriba se establece que la invención introduce subtilisinas mutadas en las que se ha cambiado la secuencia de aminoácidos mediante la mutación del gen de la enzima subtilisina, que se desea modificar, en los codones responsables de la expresión de los aminoácidos localizados en o cerca de la superficie de la enzima resultante.

En el contexto de esta invención, una subtilisina se define como una serina proteasa producida por hongos o bacterias gram-positivas. En un sentido menos amplio, aplicable a muchas formas de realización de la invención, una subtilisina también es una serina proteasa de bacterias gram-positivas. Según otra definición, una subtilisina es una serina proteasa en la que el orden relativo de los residuos aminoácidos en la tríada catalítica es Asp-His-Ser (posiciones 32, 64 y 221). En un sentido todavía más específico, muchas de las formas de realización de la invención se refieren a serina proteasas de bacterias gram-positivas que se pueden trasladar a una homología substancialmente no ambigua en su estructura primaria, con las subtilisinas que aparecen en la tabla 1 anterior.

Empleando el sistema de numeración que se deriva de la secuencia de aminoácidos de subtilisina BPN' que se muestra en la Tabla 1 anterior junto con la secuencia de aminoácidos de otras subtilisinas conocidas, resulta posible indicar la posición de un residuo aminoácido en una enzima subtilisina de forma no ambigua. A las posiciones anteriores al residuo aminoácido númerol en la subtilisina BPN' se les asigna un número negativo, como por ejemplo -6 para el N-terminal Y en la termitasa, o 0, como por ejemplo para el N-terminal A en la proteinasa K. Se numeran los residuos aminoácidos que son inserciones en relación con la subtilisina BPN' mediante la adición de letras en orden alfabético al número de la subtilisina BPN' precedente, como por ejemplo 12a, 12b, 12c, 12d, 12e para la "inserción" S-T-S-P-G en la proteinasa K entre ^{12}Ser y ^{13}Thr.

Utilizando el sistema de numeración establecido arriba las posiciones de interés son:

1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

Punto isoeléctrico (pl_{o})

Si partimos del hecho de que el substrato bajo condiciones de lavado tiene una carga electroestática opuesta a la de la enzima, cabría esperar que la adsorción y, por lo tanto, el rendimiento de lavado de la enzima al substrato mejoraría mediante el aumento de la carga electroestática de la red, NEC, de la enzima.

Sin embargo, se halló sorprendentemente que la disminución de la NEC de la enzima bajo tales circunstancias podría dar como resultado un rendimiento de lavado de la enzima mejorado.

Lo que es lo mismo, se descubrió que al cambiar el punto isoeléctrico, pl_{o}, de la enzima en una dirección para acercarse a un pH más bajo, también variaba el pH del rendimiento de lavado óptimo de la enzima hasta alcanzar un valor inferior, lo que significa que para poder diseñar una enzima para una solución de lavado con un pH bajo, en la que la enzima debe ser activa, se puede obtener una mejora en el rendimiento de lavado de una enzima subtilisina conocida mediante la mutación del gen de forma que la enzima subtilisina conocida obtuviera una enzima mutante que contara con un pl_{o} más bajo.

Este hallazgo condujo a experimentos que demostraban que lo contrario también era posible. Esto significa que también se puede diseñar una enzima subtilisina conocida para su utilización en detergentes con un pH alto variando su plo de forma que adquiera valores más altos, cambiando así el pH óptimo del rendimiento de lavado de la enzima hasta alcanzar mayores valores de pH.

La presente invención se refiere a un método para preparar subtilisina proteasas mutadas, en las que se ha cambiado la carga electroestática de la red en comparación con la proteasa madre con el mismo pH, y en las cuales hay, con respecto a dicha proteasa madre, residuo(s) aminoácido(s) con menos o más carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con más o menos carga negativa, o residuo(s) aminoácido(s) con más o menos carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con menos o más carga negativa, entre los residuos aminoácidos en la posición 252, y en los que dicha subtilisina proteasa mutada tiene un pH isoeléctrico (pl_{o}) menor o mayor, respectivamente, que el de dicha proteasa madre.

En otra forma de realización la invención se refiere subtilisina proteasas mutadas, en las que se ha modificado la carga electroestática de la red en comparación con la proteasa madre con el mismo pH, y en las que hay, con respecto a dicha proteasa madre, residuo(s) aminoácido(s) con menos o más carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con más o menos carga negativa, o residuo(s) aminoácido(s) con más o menos carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con menos o más carga negativa, entre los residuos aminoácidos en la posición 252, y al menos una mutación adicional que afecta a un residuo aminoácido que ocupa una posición elegida entre el grupo de posiciones:

1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275

y en los que dicha subtilisina proteasa tiene un pH isoeléctrico (pl_{o}) menor o mayor, respectivamente, que el de dicha proteasa madre.

En estos aspectos, la invención, en pocas palabras, hace referencia a las proteasas mutantes en las que el pl_{o} de la proteasa mutante es más bajo que el pl_{o} de la proteasa madre y en las que el pH para conseguir un rendimiento de lavado óptimo es también más bajo que el pH óptimo de la proteasa madre; o proteasas en las que el pl_{o} de la proteasa mutante es más alto que el pl_{o} de la proteasa madre y en las que el pH para conseguir un rendimiento de lavado óptimo es también más alto que el pH óptimo de la proteasa madre.

Por lo general se cree que (Tomás, Russell, and Fersht, arriba) los cambios en la carga electroestática de superficie próxima al centro activo de la enzima pueden influir en las propiedades cinéticas, pero ahora se ha descubierto sorprendentemente que los cambios en las propiedades cinéticas de una enzima también pueden producirse modificando las cargas de superficie alejadas del centro activo.

En consecuencia, la invención comprende métodos para producir enzimas subtilisina mutantes, donde se ha cambiado uno o más residuos de aminoácidos en una distancia superior a 15\ring{A} de la tríada catalítica de dicho enzima en comparación con la secuencia de aminoácidos de su enzima madre, y de tal manera que proporcione una proteasa mutante que tiene un punto isoeléctrico (=pl_{o}) variado en la misma dirección que se desee variar el pH para conseguir un rendimiento de lavado óptimo de la enzima, este pH óptimo debería ser el más próximo posible al pH de la solución de lavado, en la que se vaya a usar dicha proteasa mutante.

Según la invención, se sigue prefiriendo que la enzima subtilisina mutante represente una mutación de una enzima madre seleccionada a partir de subtilisina BPN', subtilisina amylosacchariticus, subtilisina 168, subtilisina mesentericopeptidasa, subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, subtilisina 147, termitasa, proteasa PB92 de Bacillus y proteinasa K, preferiblemente subtilisina 309, subtilisina 147, subtilisina Carlsberg, aqualisina, proteasa PB92de Bacillus, Proteasa TW7 o Proteasa TW3.

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Las subtilisina proteasas mutadas usadas en los ejemplos, como referencia, incluyen una o más de las mutaciones:

S001) G195E

S002) G195D

S003) R170Y

S004) R170Y+G195E

S005) K251E

S006) H120D

S008) H120D+G195E

S009) T71D

S010) T71D+G195E

S011) R170Y+K251 E

S012) R170Y+G195E+K251E

S013) T71 D+R170Y+K251E

S014) T71 D+R170i+G195E+K251E

S015) K235L

S016) H120D+K235L

S017) H 120D+G195E+K235L

S234) Q206D

S235) *36D+N76D

S242) *36Q+N76D+H120D+G195E+K235L

C001) D14K

C002) D120K

C003) D140K

C004) D14K+D120K

C005) K27D

C006) K27D+D120K

C008) D172K

C009) D14K+D120K+D140K

C010) D14K+D120K+D140K+D172K

C013) N97D

C014) S98D

C015) T213D

C017) S156E

C018) N97D+S98D

C019) N97D+T213D

C022) S98D+T213D

C028) N218D

C100) V51D

C101) E54T

C102) E54Y

Las observaciones anteriores acerca del pl_{o} pueden ser también utilizadas en un método para determinar o seleccionar la(s) posición(es) y el(los) aminoácid(os) que debe(n) ser sustituido(s) para el(los) aminoácido(s) en una enzima madre, por lo que la selección se realiza de tal modo que la carga calculada de la red electroestática (=NEC) en una enzima mutante resultante haya sido cambiada en comparación con la NEC de la enzima madre elegida calculada con el mismo valor de pH.

Otra forma de expresión de este principio establecido por la invención es que la(s) posición(es) y el(los) aminoáci-
do(s) que se debe(n) sustituir para conseguir el(los) aminoácido(s) en dicha enzima madre se selecciona(n) mediante un método por el cual el número total de cargas o el contenido total de la carga (=TCC) y/o la NEC de una enzima mutante resultante se cambia de modo que se obtenga una proteasa mutante que tenga un punto isoeléctrico (=pl_{o}) variado en la dirección deseada para modificar el pH para conseguir un rendimiento de lavado óptimo de la enzima, este pH óptimo debe ser lo más próximo posible al pH de la solución de lavado, en la que se va a emplear dicha proteasa mutante.

Como se ha indicado anteriormente, el pl_{o} de una macromolécula como, por ejemplo, una enzima se calcula como el pH cuando la NEC de la molécula es igual a cero. El procedimiento está ejemplificado en los ejemplos que siguen, pero los principios se describen con más detalle aquí.

Los valores de pK se asignan a cada residuo aminoácido potencialmente cargado. A continuación la proporción de incidencia de un residuo aminoácido en un pH dado en forma cargada o no cargada (cargada/no cargada, C/U(i)) se calcula tanto para la carga negativa como para la positiva, empleando las fórmulas Ia y Ib:

(Ia)C/U(i) = exp(In_{10}(pH-pK_{i}))(carga negativa)

(Ib)C/U(i) = exp(In_{10}(pK_{i} -pH))(carga positiva)

respectivamente.

A partir de las fórmulas Ia y Ib se observa que con un mismo pH para pK_{i}, C/U(i) es igual a 1.

A continuación la carga relativa, Q_{r}(i) o la aportación de carga asignada a cada residuo cargado se calcula mediante las fórmulas IIa y IIb:

(IIa)Q_{r}(i) = C/U(i)/(1+C/U(i))(carga negativa)

(IIb)Q_{r}(i) = -C/U(i)/(1+C/U(i))(carga positiva)

El valor del pH en el que la suma de todas las aportaciones de carga de los residuos cargados es igual a cero se halla mediante la iteración o a través de la interpolación en una tabla de suma de cargas de pH lo suficientemente densa.

Composiciones de detergentes que incluyen enzimas mutantes

La presente invención también comprende el empleo de las enzimas mutantes de la invención en composiciones para la limpieza y de detergentes y dichas composiciones incluyen las enzimas subtilisina mutantes.

Dichas composiciones comprenden, junto a cualquiera de una o más de las enzimas subtilisina mutantes de acuerdo con cualquiera de los aspectos precedentes de la invención, cualquiera de los componentes usuales solos o en combinación incluidos en dichas composiciones que son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Entre estos componentes se encuentran adyuvantes, como los adyuvantes de fosfato o de zeolita, surfactantes, como los surfactantes aniónicos, catiónicos o no iónicos, polímeros, como los polímeros acrílicos o equivalentes, agentes decolorantes, como los precursores o activadores decolorantes que contienen perborato o amino, estructurantes, como los estructurantes de silicato, alcali o ácido para ajustar el pH, humectantes y/o sales inorgánicas neutras.

Las composiciones de detergentes pueden estar formuladas de la manera siguiente:

a) Una composición de detergente formulada como un detergente en polvo que contiene un adyuvante de fosfato, un surfactante aniónico, surfactante no iónico, un polímero acrílico o equivalente, un precursor decolorante de perborato, un activador decolorante que contiene amino, un silicato u otro estructurante, alcali para conseguir el pH deseado para su empleo y sal inorgánica neutra.

b) Una composición de detergente formulada como un detergente en polvo que contiene un adyuvante de zeolita, partículas atenuantes actantes aniónicas, un surfactante no iónico, un polímero acrílico o equivalente, un precursor decolorante de perborato, un activador decolorante que contiene aminos, silicato u otro estructurante, para conseguir el pH deseado para su empleo y sal inorgánica neutra.

c) Una composición de detergente formulada como un detergente líquido acuoso que incluye un surfactante aniónico, un surfactante no fónico, un humectante, ácido orgánico, alcali cáustico, con un pH ajustado a un valor entre 9 y 10.

d) Una composición de detergente formulada como un detergente líquido no acuoso que incluye un surfactante no iónico líquido que consiste esencialmente en alcohol primario alcoxilado lineal, triacetina, trifosfato de sodio, alcali cáustico, precursor decolorante de monohidrato de perborato y activador decolorante de amina terciaria, con un pH ajustado a un valor entre aproximadamente 9 y 10.

e) Una composición de detergente formulada como un detergente en polvo en forma granulada que tiene una densidad aparente de al menos 550 g/l, p. ej., al menos 600 g/l, que contiene surfactantes aniónicos y no iónicos, p. ej., surfactante aniónico y una mezcla de surfactantes no iónicos con grados de alcoxilación respectivos de aproximadamente 7 y aproximadamente 3, sal inorgánica neutra baja o sustancialmente cero, adyuvante de fosfato, precursor decolorante de perborato, activador decolorante de amina terciaria, silicato de sodio y auxiliares y humedad.

f) Una composición de detergente formulada como un detergente en polvo en forma granulada que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l, que contiene surfactante aniónico y una mezcla de surfactantes no fónicos con sus grados de alcoxilación respectivos de aproximadamente 7 y aproximadamente 3, sal inorgánica neutra baja o sustancialmente cero, adyuvante de zeolita, precursor decolorante de perborato, activador decolorante de amina terciaria, silicato de sodio y auxiliares y humedad.

g) Una composición de detergente formulada como un detergente en polvo que contiene surfactante aniónico, surfactante no iónico, polímero acrílico, jabón de ácido graso, carbonato sódico, sulfato sódico, partículas de arcilla con o sin aminas, precursor decolorante de perborato, activador decolorante de amina terciaria, silicato de sodio y auxiliares y humedad.

h) Una composición de detergente formulada como una pastilla de detergente (jabón) que contiene jabón basado en una mezcla de cristalizadores saponificados de sebo y aceite de coco, neutralizado con ácido ortofosfórico, mezclado con proteasa, también mezclado con formato de sodio, borax, propilenoglicol y sulfato sódico y a continuación se introduce lentamente en una cadena de producción de jabón.

j) Una composición enzimática detergente formulada para dar como resultado un pH de la solución de lavado de 9 o inferior cuando se emplea en una proporción correspondiente a la de un surfactante de 0,4-0,8 g/l.

k) Una composición enzimática detergente formulada para dar como resultado un pH de la solución de lavado de 8.5 o mayor cuando se emplea en una proporción correspondiente a la de un surfactante de 0,4-0,8 g/l.

l) Una composición enzimática detergente formulada para dar como resultado una fuerza fónica de la solución de lavado de 0,03 o inferior, p. ej., 0,02 o inferior, cuando se emplea en una proporción correspondiente a la de un surfactante de 0,4-0,8 g/l.

m) Una composición enzimática detergente formulada para dar como resultado una fuerza iónica de la solución de lavado de 0,01 o mayor, p. ej., 0,02 o mayor, cuando se emplea en una proporción correspondiente a la de un surfactante de 0,4-0,8 g/l.

Composiciones de detergentes que incluyen enzimas mutantes en combinación con lipasas

Sorprendentemente se ha descubierto que una disminución en el punto isoeléctrico, pl y, por lo tanto, en la carga de red de una proteasa del tipo subtilisina bajo unas condiciones de lavado, puede dar como resultado no sólo un rendimiento de lavado mejorado de la enzima sino también una compatibilidad mejorada con la lipasa.

También se ha descubierto sorprendentemente que la compatibilidad de la proteasa con la lipasa no sólo se ve influida por el pl sino también por las posiciones en las que se sitúan las cargas con respecto al centro activo de la proteasa: la introducción de una carga negativa o la eliminación de una carga positiva más cercana al centro activo da como resultado una mayor mejora de la compatibilidad de la proteasa con la lipasa.

Los mutantes de enzimas producidos según el método de la invención pueden ser usados en composiciones enzimáticas detergentes, que comprenden lipasa y que también comprenden la subtilisina proteasa mutada, donde se modifica la carga molecular electroestática de red de la proteasa mutada mediante la inserción, eliminación o sustitución de los residuos aminoácidos en comparación con la proteasa madre, y donde, en dicha proteasa, hay, con respecto a dicha proteasa madre, residuo(s) aminoácido(s) con menos carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con más carga negativa, por lo que dicha subtilisina proteasa tiene un pH isoeléctrico (pl_{o}) más bajo que el de dicha proteasa madre.

Una clase preferida de lipasas para este empleo tiene su origen en bacterias gram-negativas e incluye, p. ej., enzimas lipasa de los grupos definidos en la EP 0 205 208 y 0 206 390 (ambas de Unilever), que contienen lipasas inmunológicamente relacionadas con aquellas de cepas de Ps. fluorescens, P. gladioli y Chromobacter.

Las formas de realización preferidas de la enzima subtilisina proteasa mutante su uso junto con la lipasa como se ha mencionado anteriormente poseen una o más mutaciones en el centro de un residuo aminoácido situado dentro del intervalo de aproximadamente 15A-20A del centro activo, especialmente, por ejemplo, en las posiciones 170, 120, o 195.

Se puede añadir la lipasa de manera útil en forma de una composición granulada, (o en forma de una solución o una emulsión), de enzima lipolítica con el material de soporte (p. ej., como en la EP 258068 (Novo Nordisk A/S) y la Savinase® y la Lipolase® (productos de Novo Nordisk A/S).

Se puede escoger la cantidad añadida de lipasa dentro de unos límites amplios, por ejemplo, de 50 a 30.000 LU/g por gramo del sistema surfactante o de la composición de detergente, p. ej., a menudo como mínimo 100 LU/g, de forma muy útil como mínimo 500 LU/g, a veces preferiblemente más de 1000, por encima de 2000 LU/g o más de 4000 LU/g o más, muy a menudo dentro del margen de 50-4000 LU/g y posiblemente dentro del margen de 200-1000 LU/g. En esta descripción las unidades de lipasa se definen como en la EP 258068.

Se puede escoger la enzima lipolítica de entre un amplia gama de lipasas: concretamente las lipasas descritas, por ejemplo, en las siguientes descripciones de patente, EP 214761 (Novo Nordisk A/S), EP 0 258 068 y, en especial, las lipasas que muestran una reacción cruzada inmunológica con los antisueros establecidos en contra de la lipasa de Thermomyces lanuginosus ATCC 22070, EP 0 205 208 y EP 0 206 390 y especialmente las lipasas que muestran una reacción cruzada inmunológica con antisueros establecidos en contra de la lipasa de Chromobacter viscosum var lipolvticum NRRL B 3673, o en contra de la lipasa de Alcaligenes PL 679, ATCC 31371 y FERM-P 3783, también las lipasas descritas en las descripciones WO 87/00859 (Gist-Brocades) y EP 0 204 284 (Sapporo Breweries). Resultan especialmente adecuados, por ejemplo, los siguientes preparados con lipasa comercialmente disponibles: Novo Lipolase®, lipasas Amano CE, P, B, AP, M AP, AML, y CES, y lipasas Meito MY 30, De y PL, también Esterase® MM, Lipozym®, SP225, SP285, lipasa Saiken, lipasa Enzeco, lipasa Toyo Jozo y lipasa Diosynth (marcas comerciales).

Se puede conseguir la ingeniería genética de las enzimas mediante la extracción del gen de lipasa apropiado, p. ej., el gen para la lipasa de Thermomyces lanuginosus o de un mutante derivado de éste y mediante la introducción y la expresión del gen o de un derivado del mismo en un organismo productor adecuado como un Aspergillus. Se pueden aplicar y adaptar las técnicas descritas en WO 88/02775 (Novo Nordisk A/S), EP 0 243 338 (Labofina), EP 0 268 452 (Genencor) y notablemente en la EP 0 305 216 (Novo Nordisk A/S) o en la EP 0 283 075 (Gist-Brocades).

Se aplican consideraciones similares mutatis mutandis en el caso de otras enzimas, que también pueden estar presentes. Sin limitación: por ejemplo, se puede utilizar la amilasa cuando se encuentre en una cantidad de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 MU (unidades de maltosa) por gramo de composición de detergente, (o 0,014-1,4, p. ej., 0,07-0,7, KNU/g (unidades Novo). Por ejemplo, se puede utilizar la celulasa cuando se encuentre en una cantidad de entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 35 unidades CEVU por gramo de composición de detergente.

Las composiciones de detergentes pueden incluir, además, los siguientes ingredientes de detergentes usuales en las cantidades usuales. Éstos pueden estar predefinidos o sin predefinir y pueden ser del tipo cero-P (es decir, que no comprendan ningún tipo de adyuvantes que contengan fósforo). Así, la composición puede contener en total, por ejemplo, de 1-50%, p.ej., como mínimo aproximadamente un 5% y a menudo hasta aproximadamente de un 35-40% por peso, de uno o más adyuvantes orgánicos y/o inorgánicos. Entre los ejemplos típicos de este tipo de adyuvantes se encuentran los mencionados arriba y, en un sentido más amplio, son orto, piro y tripolifosfatos de metal alcalino, carbonatos de metal alcalino, bien solos o junto con calcita, citratos de metal alcalino, nitriltriacetatos de metal alcalino, carboximetiloxisuccinatos, zeolitas, poliacetalcarboxilatos, etc.

Lo que es más, las composiciones de detergentes pueden contener de un 1-35% de agente decolorante o precursor de la decoloración o un sistema que incluya un agente y/o precursor decolorante con un activador del mismo. Otros ingredientes opcionales son supresores de espuma, inhibidores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de la suciedad, agentes secuestrantes, agentes de antiredeposición de suciedad, perfumes, tintes, estabilizantes para las enzimas etc.

Se pueden utilizar las composiciones para lavar materiales textiles, especialmente, aunque sin limitarse a, tejidos a base de algodón y poliéster y mezclas derivadas de éstos. Resultan especialmente adecuados, por ejemplo, los procesos de lavado realizados a temperaturas de entre aproximadamente 60-65 grados C o menos, p. ej., de aproximadamente 30 grados C a 35 grados C o menos. Podría resultar muy conveniente emplear las composiciones dentro de un margen que resulte suficiente para proporcionar aproximadamente, p. ej., 0,4-0,8 g/l de surfactante en la solución de lavado, aunque, por supuesto, resulta posible emplear concentraciones mayores o menores si se desea. Por ejemplo, se puede afirmar sin limitación que un nivel de empleo de entre aproximadamente 3 g/l y aproximadamente 6 g/l de la composición de detergente resulta adecuado para el uso en caso de que las formulaciones sean iguales a las de los Ejemplos.

Método para producir mutaciones en los genes de subtilisina

Son muy conocidos en la técnica muchos de los métodos utilizados para introducir mutaciones en los genes. Tras un breve comentario sobre la clonación de genes de subtilisina, se tratarán métodos para generar mutaciones tanto en lugares aleatorios como en lugares específicos, dentro del gen de subtilisina.

Clonación de un gen de subtilisina

El gen que codifica la subtilisina es susceptible de ser clonado a partir de cualquier bacteria u hongo gram-positivos mediante diferentes métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, se debe construir una biblioteca genómica y/o una biblioteca de ADNc de ADN utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la subtilisina que va a ser estudiada. A continuación, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la subtilisina, se pueden sintetizar y utilizar las sondas de oligonucleótidos homólogos y marcados para identificar los clones que codifican la subtilisina a partir de una biblioteca genómica de ADN bacteriano o de una biblioteca de ADNc micótico. Alternativamente, se puede utilizar una sonda de oligonucleótidos marcados que contenga secuencias homólogas a la subtilisina de otra cepa de bacterias u hongos como sonda para identificar los clones que codifican la subsitilina usando unas condiciones de hibridación y de lavado de una estringencia inferior.

Otro método para identificar clones que producen subtilisina podría consistir en la inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como puede ser un plásmido, la transformación de las bacterias de proteasas negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante y a continuación el recubrimiento de las bacterias transformadas en un agar que contenga un substrato de subtilisina, como la leche desnatada. Estas bacterias que contienen un plásmido portador de la subtilisina producirán colonias rodeadas por un halo de agar claro, debido a la digestión de la leche desnatada por la subtilisina excretada.

Generación de mutaciones aleatorias en el gen de subtilisina

Una vez clonado el gen de subtilisina en el vector adecuado, como puede ser un plásmido, se pueden aplicar diferentes métodos para introducir mutaciones aleatorias en el gen.

Un método podría ser incorporar el gen clonado de subtilisina como parte de un vector recuperable en la cepa mutágena de Eschericia coli.

Otro método puede comprender la generación de una forma monocatenaria del gen de subtilisina y, a continuación, templar el fragmento de ADN que contiene el gen de subtilisina con otro fragmento de ADN de manera que una porción del gen de la subtilisina siga siendo monocatenario. Esta región monocatenaria diferenciada podría entonces estar expuesta a cualquiera de los diferentes agentes mutagenizantes, entre los que se encuentran, pero sin limitarse, sodio bisulfito, hidroxilamina, ácido nitroso, ácido fórmico o hidralacina. Shortle y Nathans (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U., 75: 2170-2174) describen un ejemplo específico de este método para generar mutaciones aleatorias. Según el método de Shortle y Nathans, el plásmido portador del gen de subtilisina podría ser cortado por una enzima de restricción que partiría el gen. Este corte se ensancharía hasta formar un hueco empleando la acción de la exonucleasa de la ADN polimerasa I. El hueco monocatenario resultante podría entonces ser mutagenizado utilizando cualquiera de los agentes mutagenizantes mencionados anteriormente.

Alternativamente, se podría clonar el gen de subtilisina de una especie de Bacillus, incluyendo el promotor natural y otras secuencias de control, en un vector plásmido que contenga replicones tanto de E. coli como de B. subtilis, un marcador fenotípico seleccionable y el origen M13 de la replicación para la producción de ADN de plásmido monocatenario tras la superinfección con el fago ayudante IR1. El ADN del plásmido monocatenario que contiene el gen clonado de subtilisina se aísla y se templa con un fragmento de ADN que contiene secuencias del vector pero no la región de codificación de subtilisina, lo que da como resultado una molécula dúplex discontinua. Se introducen mutaciones en el gen de subtilisina bien con sodio bisulfito, con ácido nitroso o con ácido fórmico o bien por replicación en una cepa mutágena de E. coli como se describe arriba. Puesto que el sodio bisulfito reacciona exclusivamente con citosina en un ADN monocatenario, las mutaciones creadas con este mutágeno se ven restringidas sólo a las regiones de codificación. El tiempo de reacción y la concentración de bisulfito varían en los diferentes experimentos de manera que se crea una media de una a cinco mutaciones por gen de subtilisina. La incubación de 10 mg de ADN dúplex interrumpido en 4 M de Na-bisulfito, con un pH de 6.0, durante 9 minutos a 37 grados C en un volumen de reacción de 400 ml, produce una desaminación de aproximadamente un 1% de citosinas en la zona monocatenaria. La región de codificación de la subtilisina madura contiene aproximadamente 200 citosinas, dependiendo de la cadena de ADN. Afortunadamente, el tiempo de reacción varía desde aproximadamente 4 minutos (para producir una frecuencia de mutación aproximadamente de una de 200) hasta cerca de 20 minutos (aproximadamente 5 de 200).

Tras la mutagénesis se trata las moléculas discontinuas in vitro con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) para producir moléculas completamente bicatenarias y fijar las mutaciones. El E. coli competente se transforma a continuación con el ADN mutagenizado para producir una biblioteca ampliada de subtilisinas mutantes. Las bibliotecas de mutantes ampliadas también pueden ser producidas desarrollando el ADN plásmido en una cepa Mut D de E. coli lo que aumenta el margen de mutaciones debido a la tendencia al error de la ADN polimerasa.

También se puede utilizar el ácido nitroso y el ácido fórmico de los mutágenos para producir bibliotecas de mutantes. Ya que estos productos químicos no son tan específicos para el ADN monocatenario como el sodio bisulfito, las reacciones de la mutagénesis se llevan a cabo según el procedimiento que sigue a continuación. Se clona la porción codificada del gen de subtilisina en el fago M13 mediante los métodos estándar y mediante el ADN del fago monocatenario preparado. El ADN monocatenario reacciona a continuación con 1 M de ácido nitroso con un pH de 4,3 durante 15-60 minutos a 23 grados C o con 2,4 M de ácido fórmico durante 1-5 minutos a 23 grados C. Estas variaciones en los tiempos de reacción producen una frecuencia de mutación que oscila entre 1 de 1000 hasta 5 de 1000. Tras la mutagénesis, se templa un cebador universal al ADN M13 y se sintetiza el ADN dúplex empleando el ADN monocatenario mutagenizado a modo de plantilla de forma que la porción codificada del gen de subtilisina sea completamente bicatenaria. En este punto la región de codificación puede ser extraída del vector M13 mediante enzimas de restricción y puede unirse a un vector de expresión no mutagenizado de modo que las mutaciones sólo se den en el fragmento restrictivo. (Myers et al., Science 229:242 257 (1985)).

Generación de mutaciones dirigidas en el gen de subtilisina

Una vez que se ha clonado el gen de subtilisina y se han identificado los lugares deseables para que se lleve a cabo la mutación, se pueden introducir dichas mutaciones empleando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias nucleótidas que flanquean los lugares deseados para que se lleve a cabo la mutación; se insertan los nucleótidos mutantes durante la síntesis del oligonucleótido. En un método preferido, el hueco monocatenario del ADN, que conecta el gen de subtilisina, se crea en un vector portador del gen de subtilisina. A continuación, se templa el nucleótido sintético, que hace de soporte de la mutación deseada, a una porción homóloga de ADN monocatenario. El hueco restante se rellena entonces con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y se une la construcción empleando la ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:646 639). Según Morinaga et al., se elimina un fragmento del interior del gen utilizando una endonucleasa restrictiva. El vector/gen, que ahora contiene el hueco, se desnaturaliza y se hibrida junto con un vector/gen que, en lugar de contener el hueco, ha sido partido con otra endonucleasa restrictiva en un lugar externo al área implicada en el hueco. Una región monocatenaria del gen queda entonces disponible para que se lleve a cabo la hibridación con oligonucleótidos mutados, el hueco restante se rellena con el fragmento Klenow de ADN polimerasa I, se unen las inserciones con ADN ligasa T4 y, tras un ciclo de replicación, se produce un plásmido bicatenario portador de la mutación deseada. El método de Morinaga evita la manipulación adicional de los nuevos lugares de restricción de la construcción y, por lo tanto, facilita la generación de mutaciones en lugares múltiples. Según la patente estadounidense Nº 4,760,025, de Estell et al., publicada el 26 de Julio de 1988, se pueden introducir oligonucleótidos portadores de mutaciones múltiples realizando alteraciones menores en el cassette. Sin embargo, se puede introducir una variedad aún mayor de mutaciones en cualquier momento mediante el método de Morinaga debido a que se pueden introducir una multitud de oligonucleótidos de longitudes diferentes.

Expresión de los mutantes de subtilisina

Según la invención, un gen de subtilisina mutado producido mediante los métodos descritos anteriormente o mediante cualquiera de los métodos alternativos conocidos en la materia puede expresarse en forma de enzima, empleando un vector de expresión. El vector de expresión generalmente se engloba bajo la definición de un vector de donación, puesto que el vector de expresión normalmente incluye los componentes de un vector de donación típico, a saber, un elemento que permite una replicación autónoma del vector en un microorganismo independiente del genoma del microorganismo y uno o más marcadores fenotípicos con objetivos de selección. Un vector de expresión incluye secuencias de control que codifican un promotor, un operador, un lugar de unión del ribosoma, una señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores. Para permitir la secreción de la proteína expresada, se pueden insertar los nucleótidos que codifican una "secuencia señal" antes de la secuencia de codificación del gen. Para conseguir la expresión bajo la dirección de las secuencias de control, el gen blanco que tendrá que ser tratado según se establece en la invención es vinculado operativamente a las secuencias de control en el marco de lectura apropiado. Las secuencias promotoras que pueden ser incorporadas a los vectores plásmidos y que pueden soportar la transcripción del gen mutante de la subtilisina, incluyen, aunque no sin limitarse a ellos, el promotor procariótico 13-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 75:3727-3731) y el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 80:21-25). Se pueden encontrar más referencias en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94.

Según una forma de realización, se transforma B. subtilis con un vector de expresión que lleva el ADN mutado. Si la expresión debe tener lugar en un microorganismo de secreción como B. subtilis, una secuencia señal puede seguir a la señal de iniciación de la traducción y preceder a la secuencia de ADN que interesa. La secuencia señal actúa para transportar el producto de expresión a la membrana celular donde se separa del producto tras la secreción. El término "secuencias de control" tal como se ha definido anteriormente pretende incluir una secuencia señal, cuando esté presente.

Ejemplos La mutación puntual del gen de subtilisina genera mutantes con características químicas útiles

Varios ejemplos emplean mutantes que no son ejemplos de la invención aunque sí la ilustran.

Materiales y métodos Cepas de bacterias

B. subtilis 309 y 147 son variedades de Bacillus lentus, depositadas en el NCIB y a las que se ha concedido los números de registro NCIB 10147 y NCIB 10309 y están descritas en la patente estadounidense Nº 3,723,250, publicada el 27 de marzo de1973.

B. subtilis DN 497 aparece descrita en la publicación estadounidense Nº 039,298 publicada el 17 de abril de 1987, correspondiente a la publicación de EP Nº 242 220, y que es un aro^{+} transformante de RUB 200 con ADN cromosómico de SL 438, una cepa de esporulación y carente de proteasa obtenida por el Dr. Kim Hardy de Biogen.

E. coli MC 1000 r^{-m}+ (Casadaban, M.J. and Cohen, S.N. (1980), J. Mol. Biol. 138:179-207), fue transformada en r^{-m}+ mediante métodos convencionales y también aparece descrita en la publicación estadounidense Nº 039,298.

B. subtilis DB105 aparece descrita en: Kawamura, F., Doi, R.H. (1984), Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracelular alkaline and neutral proteases, J.Bacteriol. 160 (2), 442-444.

Plásmidos

pSX50 (descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense Nº 039,298) es un derivado de plásmido pDN 1050 que incluye el promotor-operador P_{1} O_{1}, el gen xyn B de B. pumilus y el gen xyl R de B. subtilis.

pSX62 (descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense Nº 039,298, supra) es un derivado de pSX52 (ibid), que comprende un gen de fusión entre el gen de proquimosina de ternera y el gen xyn B de B. pumilus insertado en el pSX50 (supra). Se generó pSX62 al insertar el terminador rrn B de E. coli en pSX52 detrás del gen de proquimosina.

pSX65 (descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense Nº 039,298, supra) es un derivado del plásmido pDN 1050, que incluye el promotor-operador P_{2}O_{2}, el gen xyn B de B. pumilus, y el gen xyl R de B. subtilis.

pSX88 (descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S)) es un derivado de pSX50 que incluye el gen de subtilisina 309.

pSX92 se produjo clonando la subtilisina 309 en plásmido pSX62 (supra) seccionado en Cla 1 y Hind III, y Cla 1 rellenado antes de la inserción de los fragmentos Dral-Nhel y Nhel-Hind III del gen clonado de subtilisina 309.

pSX93, mostrado en la figura 3, es el pUC13 (Vieira and Messing, 1982, Gene 19::259 268) que incluye un fragmento de 0,7kb de Xbal-Hind III del gen de subtilisina 309 que incluye el terminador insertado en una secuencia poliligadora.

pSX119 (descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/DK 88/00002 (Novo INDUSTRI A/S)) es un pUC13 que alberga un fragmento de EcoRI-Xbal del gen de subtilisina 309 insertado en el poliligador.

pSX120 es un plásmido en el que el fragmento de HpaI-HindIII junto con el gen de subtilisina 309 a partir de pSX88 se inserta dentro de EcoRV-HindIII en pDN 1681, de manera que se expresa el gen de la proteasa mediante los promotores amy M y amy Q. pDN 1681 se obtiene a partir de pDN 1380 (Diderichsen, B. and Christiansen, L.: 1988, FEMS Microbiology Letters 56: 53-60) con un fragmento de Clal de 2,85 bp insertado de B. amyloliquefaciens que lleva el gen amy Q con el promotor (Takkinen et al.: 1983, J. Biol. Chem. 258: 1007ff.)

pUC13 aparece descrito en: Vieira, J. and Messing, J.: 1982, Gene 19: 259-268.

pUC19 aparece descrito en: Yanisch-Perron, C. and Vieira, J. Messing, J., 1985, Gene 33:103-119.

pUB110 aparece descrito en: Lacey,R.W., Chopra,J. (1974), Genetic studies of a multiresistant strain of
Staphvlococcus aureus, J. Med.Microbiol. 7, 285-297, y en: Zyprian,E., Matzura,H. (1986), Characterization of
signais promoting gene expression on the Staphvlococcus aureus plasmid pUB110 and developement of a Gram-positive expression vector system, DNA 5 (3), 219-225.

Genes

Los genes para las diversas subtilisinas se obtuvieron tal y como aparece en la bibliografía mencionada arriba. Concretamente, los genes para las enzimas subtilisina 309 y 147 se obtuvieron como se describe en la solicitud inédita de patente internacional nº PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S).

Construcción del gen de subtilisina carlsberg

Se diseñó un gen sintético basado en la secuencia de codificación de la proteasa de subtilisina Carlsberg madura y en su terminador de transcripción (Jacobs, M. Eliasson,M., Uhlen,M., Flock,J.-I. (1985), Cloning, sequencing and expression of Subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic Acids Res. 13 (24), 8913-8926), ligadas a las secuencias de codificación pre y pro de la proteasa de subtilisina BPN' (Wells, J.A., Ferrari, E., Henner, D.J., Estell, D.A., Chen, E.Y. (1983), Cloning, sequencing and secretion of Bacillus ámvloliquefaciens subtilisin in
Bacillus subtilis, Nucleic Acids Res. 11 (22), 7911-7925). Se subdividió el gen en siete fragmentos con una longitud que oscilaba entre 127 y 313 pares de bases, cada fragmento se construyó a partir de oligos sintetizados químicamente con de 16 a 77 nucleótidos. La superposición entre los oligos de ambas cadenas se optimizó con el objetivo de facilitar un templado de una sola fase para cada fragmento (Mullenbach, G.T., Tabrizi, Un., Blacher, R.W., Steimer,K.S. (1986), Chemical synthesys and expression in Yeast of a gene coding connective tissue activating peptide III, J.Biol. Chem. 261 (2), 719-722). Se ensambló y se clonó cada fragmento en un vector de clonación y secuenciación de E. coli. Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de estos fragmentos clonados para confirmar que la secuencia de cada fragmento era correcta. Después, se ensamblaron y clonaron todos los fragmentos en el vector pUB110 (Lacey,R.W., Chopra,J. (1974), Genetic studies of a multiresistant strain of Staphvlococcus aureus, J. Med.Microbiol. 7, 285-297) y se trasladaron a B. subtilis DB105 (Kawamura,F., Doi, R.H. (1984), Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracelular alkaline and neutral proteases, J.Bacteriol. 160 (2), 442 444). Se inició la transcripción del gen mediante el promotor HpaII del vector plásmido pUB110 (Zyprian,E., Matzura,H. (1986), Chracterization of
signais promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and development of a Gram-positive expression vector system, DNA 5 (3), 219-225). En el proceso de construcción del gen resultó que el fragmento más largo (#5; 313 pares de bases de longitud) necesitaba más fragmentación (fragmentos #8 y #9) para evitar problemas con el ensamblaje de este fragmento más bien largo.

La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia nucleótida difiere de la secuencia de subtilisina Carlsberg publicada anteriormente en las posiciones 129, 157, 161 y 212 (Smith,E.L., DeLange,R.J., Evans,W.H., Landon,W., Markland,F.S. (1968), Subtilisin Carlsberg V. The complete sequence: comparison with subtilisin BPN'; evolutionary relationships., J.Biol.Chem. 243 (9), 2184-2191). No se ha podido confirmar la quinta alteración a la que hace referencia Jacobs et al. (1985) en el clon del gen Carlsberg descrito en la presente solicitud.

Cálculo del punto isoeléctrico pl_{o}

El cálculo del punto isoeléctrico de la enzima subtilisina 309 de tipo salvaje (S000) aparece ejemplificado más abajo con el objetivo de demostrar el procedimiento utilizado. El mismo procedimiento también se puede aplicar, naturalmente, al cálculo de cualquier enzima, tanto si se trata de una enzima mutante como si no.

Se asignaron valores de pK a cada residuo aminoácido potencialmente cargado (Tyr, Asp, Glu, Cys, Arg, Su, Lys, N-terminal, C-terminal, Cae^{2+}). En este caso se tuvo en cuenta el ambiente por lo que se emplean valores de pK diferentes en el mismo residuo aminoácido dependiendo de sus vecinos. Los valores asignados aparecen indicados en la Tabla II.

A continuación, se calculó el índice de incidencia de un residuo aminoácido con un determinado pH en forma cargada o sin cargar (cargada/sin cargar, C/U(i)) tanto para la carga negativa como para la positiva, empleando las fórmulas Ia y Ib, respectivamente. En la Tabla II esta proporción sólo viene indicada para un pH igual a pl_{o}.

Posteriormente se calculó la carga relativa, Q_{r} (i) o aportación de carga situada en cada residuo cargado mediante las fórmulas IIa y IIb:

Se halló por iteración el valor de pH en el que la suma de todas las aportaciones de carga de los residuos cargados es igual a cero.

TABLA II

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Como se ha indicado anteriormente y en la Tabla II el valor de pK asignado a cada aminoácido era diferente teniendo en cuenta las variaciones locales en el entorno. Esto sólo tiene como resultado una precisión realzada del cálculo, pero la experiencia ha demostrado que los valores de pK constantes estimados son de ayuda a la hora de mostrar la dirección en la que se moverá el pl_{o} para una enzima mutante dada en comparación con el pl_{o} de la enzima madre. Esto aparece indicado en la Tabla III, donde se indican los valores de pl_{o} para los valores de pK estimados.

Con el objetivo de comparar las diversas enzimas y las enzimas mutantes se han llevado a cabo las pruebas de lavado descritas con detalle más abajo. En la Tabla III que aparece abajo se han tabulado los resultados de estas pruebas que emplean la enzima madre y las enzimas mutantes de subtilisina 309 (designada S000, etc.) y subtilisina Carlsberg (designada 0000, etc.) con el objetivo de demostrar la correlación entre el pl_{o} y el rendimiento de lavado con diferentes valores de pH de la solución de lavado utilizada. En las pruebas de lavado se utilizó una composición de detergente líquida de baja salinidad con un pH de 8.3 según el ejemplo del detergente D7 y un detergente en polvo de salinidad normal con un pH de 10.2 según el ejemplo del detergente D2.

En la Tabla III se indican los resultados como resultados relativos en comparación con las enzimas de tipo salvaje (S000 y C000, respectivamente). También se indican los pl_{o} calculados y observados para las enzimas.

TABLA III

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A partir de la tabla III se puede observar que al variar el pl_{o} hasta alcanzar valores más bajos (series-S) se proporciona una mejora en el rendimiento de lavado con un pH bajo (pH=8.3), mientras que una variación ascendente en el pl_{o} (serie-C) proporciona una mejora en el rendimiento de lavado con un pH alto (pH=10.2).

Se ha averiguado que el concepto de punto isoeléctrico resulta muy útil a la hora de seleccionar las posiciones de los aminoácidos en la enzima madre que se deben cambiar.

Por lo general se ha descubierto que las mutaciones deberían de llevarse a cabo en codones que correspondan a los aminoácidos situados en o cerca de la superficie de la molécula de la enzima manteniendo así en la medida de posible, la estructura interna de la enzima madre.

Depuración de subtilsinas

El procedimiento hace referencia a una depuración típica de una fermentación a escala de 10 litros de la enzima Subtilisina 147, la enzima Subtilisina 309 o mutantes derivados de éstas.

Se centrifugaron aproximadamente 8 litros de caldo de fermentación a 5000 rpm durante 35 minutos en vasos para análisis de 1 litro. Se ajustaron los sobrenadantes a un pH de 6.5 empleando un 10% de ácido acético y se filtraron con placas de filtro de Seitz Supra S100.

Se concentraron las filtraciones hasta aproximadamente 400 ml empleando una unidad Amicon CH2A UF equipada con un cartucho Amicon SIY10 UF. Se centrifugó y se filtró el concentrado UF antes de que tuviera lugar la absorción a temperatura ambiente sobre una columna de afinidad de bacitracina con un pH de 7. Se eluyó la proteasa de la columna de bacitracina a temperatura ambiente utilizando un 25% de 2-propanol y 1 M de cloruro sódico en la solución tampón con un 0,01 de ácido dimetilglutárico, 0,1 M de ácido bórico y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a un pH de 7.

Se combinaron las fracciones con actividad de proteasa de la fase de depuración de Bacitracina y se aplicaron a una columna Sephadex G25 de 750 ml (5 cm de dia.) equilibrada con un tampón con un contenido de 0,01 de ácido dimetilglutárico, 0,2 M de ácido bórico y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a un pH de 6.5.

Se combinaron las fracciones con actividad proteolítica de la columna de Sephadex G25 y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico de CM Sefarosa CL 6B de 150 ml (5 cm dia.) equilibrada con un tampón con un contenido de 0,01 M de ácido dimetilglutárico, 0,2 M de ácido bórico y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a un pH de 6.5.

Se eluyó la proteasa empleando un gradiente lineal de 0-0,1 M de cloruro sódico en 2 litros del mismo tampón (0-0,2 M de cloruro sódico en caso de sub 147).

En una última fase de depuración, se combinó la proteasa con un contenido de fracciones de la columna de CM sefarosa y se concentró en una célula de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana GR81 PP (de Danish Sugar Factories Inc.).

La Subtilisina 309 y los mutantes

Gly 195 Glu (G195E (SO01):

Arg 170 Tyr (R170Y (S003):

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu (R17OY+G195E (S004):

Lys 251 Glu (K251E (S005):

His 120 Asp (H120D (S006):

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 251 Glu (R170Y+G195E+K251E (S012):

Lys 235 Leu (K235L (S015):

His 120 Asp + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D+G195E+K235L (S017)):

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D+R170Y+G195E+K235L (S019) :

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu + Lys 251 Glu (H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E (S020):

fueron depurados mediante este procedimiento.

Depuración de las subtilisina proteasas carlsberg (mutantes)

Los medios de fermentación se aplicaron sea directamente sobre una columna de afinidad de bacitracina (5 cm diam * 15 cm; equilibrada con un tampón de 10 mM de Tris/HCl con un pH de 7.9; nivel de flujo aproximado de 500 ml/h) sea concentrados hasta 500 ml mediante un dializador Nephross Andante H.F. (Organon Technika) empleando una contrapresión de 10-12 p.s.i. y agua desmineralizada en el circuito externo. En el último caso, la proteasa se precipita a partir del concentrado añadiendo 600 g/l de sulfato de amonio. Se recoge el precipitado mediante centrifugado y se disuelve en aproximadamente 500 ml de agua desmineralizada. Se extrae el sulfato de amonio de la solución de proteasa utilizando el mismo dializador que se describe arriba. El volumen final fue aproximadamente de 300 ml, mientras que se ajustó el pH a un pH de 6.0. Se eluyó la proteasa de las columnas de bacitracina (mencionadas arriba) empleando un tampón Tris de 10 mM (pH 7.9) que contenía 2,7 M de NaCl e isopropanol al 18%.

Después de la diálisis del material de la proteasa depurada con bacitracinas o proteasa concentrada se realizó otra depuración mediante la aplicación sobre una columna de intercambio iónico de CM-Trisacryl (5 cm. diam * 15 cm; equilibrada con 0,03M de fosfato de sodio con un pH de 6.0) utilizando un nivel de flujo de 200 ml/h. Se eluyó la proteasa de la columna con un gradiente lineal de entre 0 y 0,3 M de NaCI (2 * 500 ml) en el tampón de fosfato. Se agruparon las fracciones que contenían actividad de proteasa y se almacenaron a 20 grados C en presencia de sales tampón tras la liofilización.

Síntesis de oligonucleótidos

Se sintetizaron todos los cebadores desapareados en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems 380 y se depuraron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

Ensayo sobre la actividad proteolítica

La actividad proteolítica de las enzimas mutantes fue evaluada con el objetivo de determinar hasta qué punto se retuvo la actividad catalítica de la enzima. Se llevaron a cabo las determinaciones mediante el método de dimetil caseína (DMC) descrito en la Publicación de NOVO AF 220-gb (o en posteriores ediciones), disponible en Novo-Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca.

Ensayos sobre el rendimiento de lavado

A:

Se produjeron telas de prueba (2,2 cm x 2,2 cm), aproximadamente de 0,1 g) pasando telas de algodón (100% algodón, DS 71) desencoladas a través del recipiente en un Mathis Washing and Drying Unit de tipo TH (Werner Mathis AG, Zurich, Suiza) que contenía manchas de hierba.

Finalmente se secó la tela en una corriente de aire fuerte a temperatura ambiente, se almacenó a temperatura ambiente durante 3 semanas y, posteriormente, se mantuvo a -18ºC antes de usarla.

Todas las pruebas se llevaron a cabo en un sistema de minilavado modelo. En este sistema se lavaron 6 telas de prueba en un vaso de precipitados de 150 ml que contenía 60 ml de solución detergente. Los vasos de precipitados se manturvieron en un baño de agua con el termostato a 30ºC con agitación magnética.

Como detergente se utilizó el siguiente detergente líquido estándar:

AE, Berol 160	15%
LAS, Nasa 1169/P	10%
Ácido graso de coco	9%
Ácido oleico	1%
Trietanolamina	9%
Glicerol	10,5%
Etanol	1,5%
TrixNaxCitratx2H_{2}O	8%
CaCl_{2}x2H_{2}O	0,1%
NaOH	1%
Agua a partir de LAS	23,3%
Agua a partir de Glicerol	1,5%
Agua añadida	34,9%

Los porcentajes que se facilitan son los porcentajes de contenido activo.

Se ajustó el pH con 1 N de NaOH a 8.14. El agua empleada era de aprox. 6 grados dH (dureza alemana).

Las pruebas se llevaron a cabo con concentraciones enzimáticas de: 0, 1.0 mg de proteína enzimática/l y 10,0 mg de proteína enzimática/l y se llevaron a cabo dos tandas independientes de pruebas para cada uno de los mutantes. Los resultados mostrados a continuación son promedios de estas pruebas.

Los lavados duraron 60 minutos y tras el lavado se pusieron a remojo las telas en un cubo con agua corriente del grifo durante 25 minutos.

A continuación, se secaron las telas al aire durante la noche (protegidas de la luz solar) y la remisión, R, se determinó en un fotómetro ELREPHO 2000 de Datacolor S.A., Dietkikon, Suiza a 460 nm.

Como medida del rendimiento de lavado se utilizó la remisión diferencial, delta R, de forma que resultaba igual a la remisión después del lavado con la enzima añadida menos la remisión tras el lavado sin enzima añadida.

B:

Se sometió a prueba el rendimiento de lavado de varios mutantes en comparación con telas de algodón manchadas de hierba según el método descrito anteriormente.

Se utilizaron 2,0 g/l de un detergente líquido comercializado en los Estados Unidos.

Se disolvió el detergente en un tampón de 0,005 M de etanolamina en agua con intercambio iónico. Se ajustó el pH a un pH de 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0 respectivamente con NaOH/HCl.

Se mantuvo la temperatura a 30ºC de forma isotérmica durante 10 minutos.

Cada uno de los mutantes fue dosificado a 0,25 mg de proteína enzimática/l.

C:

Las pruebas de lavado en las que se emplean las composiciones de detergentes que se muestran en los ejemplos de detergentes que aparecen a continuación se llevaron a cabo en una mini lavadora utilizando telas de prueba a base de algodón que contenían pigmentos, grasa y proteína (caseína). Las condiciones fueron:

a) 2 g/l de detergente D3 en agua a 6º fH (dureza francesa) con un pH de 8.3, o

b) 5 g/l de detergente D2 en agua a 15º fH con un pH de 10.2.

Después del enjuague y del secado se calculó la reflexión a 460 nm.

Se calculó el factor de mejora a partir de una curva de respuesta a la dosis y se hizo referencia a la cantidad de enzima necesaria para obtener un valor delta R dado en comparación con la enzima de tipo salvaje en cuestión (S000 y C000), lo que significa que un factor de mejora de 2 indica que sólo se necesita la mitad de la cantidad enzimática para obtener el mismo valor delta R.

Los resultados de estas pruebas se muestran en la tabla III anterior.

D:

Las pruebas experimentales sobre la estabilidad de la lipasa se realizaron, por ejemplo, empleando los materiales siguientes:

Se incubó 1 LU/ml de lipasa de Pseudomonas cepacia en solución de lavado de cada uno de los dos tipos, O y W (descritos abajo). Se tomaron alícuotas a intervalos y fueron evaluadas para calcular la actividad lipasa. Se realizaron incubaciones paralelas sin proteasas o con proteasas de diferentes tipos como se establece abajo, para comprobar el efecto de la proteasa en la retención de la actividad lipasa. Se evaluaron las proteasas de tipo salvaje a 20 GU/ml, las proteasas mutadas fueron evaluadas a 0,5 microgramos/ml.

Composiciones de detergentes que comprenden variantes de enzimas

Detergente D1

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención que contiene un adyuvante de fosfato para que contenga: aproximadamente un 16% de detergente total activo, aproximadamente un 9% de detergente aniónico, aproximadamente un 6% de detergente no fónico, aproximadamente un 20% de adyuvante que contenga fosfato, aproximadamente un 3,5% de polímero acrílico o equivalente, (alternativamente hasta aproximadamente un 2%), aproximadamente entre un 6-18% de precursor decolorante de perborato, alternativamente cerca de entre un 15-20%, aproximadamente un 2% de activador decolorante que contenga amino, aproximadamente un 3,5% de silicato u otro estructurante, alternativamente hasta cerca de un 8%, enzimas de aproximadamente 8 unidades de glicina/mg de actividad, con alcali para conseguir el pH que se desea para su uso y sal inorgánica neutra y enzimas (cerca de un 0,5% por cada enzima).

El detergente aniónico es una mezcla de sulfonato de dodecil benceno sódico, alternativamente alquil-benceno-sulfonato de sodio lineal, al 6%, y sulfato de alquilo primario al 3%. El detergente no fónico es un etoxilato de un alcohol primario de aproximadamente C13-C15 con 7 residuos de etoxilato por mol. El adyuvante de fosfato es tripolifosfato de sodio. El polímero es ácido poliacrílico, alternativamente un copolímero acrílico/maléico. El precursor decolorante de perborato es tetrahidrato o monohidrato de tetraborato sódico. El activador es tetra-acetil-etileno-diamina. El estructurante es silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio.

Las enzimas comprenden proteasas según el Mutante SO01, alternativamente la proteasa S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226, S223, S224, o S225.

Detergente D1a

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención que contiene un adyuvante de fosfato para que contenga: aproximadamente un 15% de detergente total activo, aproximadamente un 7% de detergente aniónico, aproximadamente un 6% de detergente no iónico, aproximadamente un 25% de adyuvante que contenga fosfato, aproximadamente un 0,5% de polímero acrílico o equivalente, aproximadamente un 10% de precursor decolorante de perborato, aproximadamente un 2% de activador decolorante que contenga amino, aproximadamente un 6% de silicato u otro estructurante, enzima proteasa con un grado de aproximadamente 8 unidades de glicina/mg, con alcali para conseguir el pH que se desea para su uso y sal inorgánica neutra así como enzimas (aproximadamente un 0,5% por cada enzima).

El detergente aniónico es alquil-benceno-sulfonato de sodio lineal. El detergente no fónico es un etoxilato de un alcohol primario de aproximadamente C13-C15 con 7 residuos de etoxilato por mol o una mezcla de éste con el etoxilato de alcohol correspondiente a la extensión de 3 residuos por mol. El constructor de fosfato es tripolifosfato de sodio. El precursor decolorante de perborato o perácido es tetrahidrato de tetraborato sódico. El activador es tetra-acetil-etileno-diamina. El estructurante es silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio. Las enzimas comprenden la proteasa según el mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, 0001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, o S226.

Detergente D2

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención que contiene un adyuvante de zeolita para que contenga: aproximadamente un 16% de detergente total activo, aproximadamente un 9% de detergente aniónico, aproximadamente un 6% de detergente no iónico, aproximadamente un 20% de adyuvante que contenga zeolita, aproximadamente un 3,5% de polímero acrílico o equivalente, aproximadamente un 6-18% de precursor decolorante de perborato, aproximadamente un 2% de activador decolorante que contenga amino, aproximadamente un 3,5% de silicato u otro estructurante, alternativamente hasta cerca de un 2,5%, de enzimas de aproximadamente 8 (alternativamente cerca de 15) unidades de glicina/mg de calidad, con alcali para conseguir el pH que se desea para su uso y sal inorgánica neutra así como enzimas (aproximadamente 0,5% por cada enzima).

El detergente aniónico es una mezcla de sulfonato dodecil-benceno de sodio, alternativamente alquil-benceno-sulfonato de sodio lineal, al 6% y sulfato de alquilo primario al 3%. El detergente no fónico es un etoxilato de alcohol primario de aproximadamente C13-C15 con 7 residuos de etoxilato por mol. El adyuvante de zeolita es zeolita del tipo A. El polímero es ácido poliacrílico. El precursor decolorante de perborato es tetrahidrato o monohidrato de tetraborato sódico. El activador es tetraacetil-etilenodiamina. El estructurante es silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio. Las enzimas comprenden la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, 0001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, o S226.

Detergente D2a

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención que contiene un adyuvante de zeolita para que contenga: aproximadamente un 14% de detergente total activo, aproximadamente un 7% de detergente aniónico, aproximadamente un 7% de detergente no iónico, aproximadamente un 25% de constructor que contenga zeolita, aproximadamente un 3% de polímero acrílico o equivalente, aproximadamente un 10% de precursor decolorante de perborato o de perácido, aproximadamente un 2% de activador decolorante que contenga amino, aproximadamente un 0,5% de silicato u otro estructurante, enzimas con un grado de cerca de 6 unidades de glicina/mg, con alcali para conseguir el pH que se desea para su uso y sal inorgánica neutra así como enzimas (aproximadamente un 0,5% por cada enzima).

El detergente aniónico es alquil-benceno-sulfonato de sodio lineal, el detergente no fónico es una mezcla de etoxilatos de alcohol primario de aproximadamente C13-C15 con 7 y 3 residuos de etoxilato respectivamente por mol. El adyuvante de la zeolita es zeolita del tipo A. El polímero es un copolímero acrílico/maléico. El precursor decolorante de perborato es monohidrato de tetraborato sódico. El activador es tetra-acetil-etileno-diamina. El estructurante es silicato de sodio. La sal inorgánica neutra es sulfato de sodio. Las enzimas comprenden proteasas según el mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, o S226.

Detergente D3

Se formula un detergente líquido acuoso según una forma de realización de la invención para que contenga: un 16% de ácido dodecilbenceno sulfónico, etoxilato de alcohol lineal C12-C15 condensado con 7 mol/mol de óxido de etileno al 7%, un 2% de monoetanolamina, un 6,5% de ácido cítrico, un 6% de sodio xilensulfonato, aproximadamente un 4,1% de hidróxido sódico, un 0,5% de proteasa, auxiliares y agua hasta el 100%. El pH se ajusta a un valor entre 9 y 10. La enzima es una proteasa según el Mutante S020, alternativamente S019, S012, S004, S001, S003, S005, S015, S017, S021, S022, S025, S035, S201, S223, S226 o S235.

Detergente D4

Se formula un detergente líquido no acuoso según una forma de realización de la invención empleando un 38,5% de etoxilato de alcohol primario lineal C13-C15 alcoxilado con 4,9 mol/mol de óxido de etileno y 2,7 mol/mol de óxido de propileno, un 5% de triacetina, un 30% de trifosfato de sodio, un 4% de carbonato de sodio, un 15,5% de monohidrato de perborato de sodio que contenga una proporción menor de oxoborato, un 4% de TAED, un 0,25% de EDTA del cual un 0,1% es ácido fosfónico, un 0,6% de Aerosil, un 1% de SCMC y un 0,6% de proteasa. El pH se ajusta a un valor entre 9 y 10, p. ej., de aproximadamente 9.8. La enzima comprende la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S021, S035, S201, S225, S226, o S235.

Detergente D5

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención en forma granulada que cuenta con una densidad aparente de al menos 600 g/l, con un contenido de aproximadamente un 20% en peso de surfactante del cual aproximadamente un 10% es dodecilbenceno sulfonato de sodio y el resto es una mezcla de Synperonic A7 y Synperonic A3 (aproximadamente de entre un 5,5% y un 4,5%) y sal inorgánica neutra cero (p. ej., sulfato de sodio), más un 33% aproximadamente de adyuvante de fosfato, aproximadamente un 16% de tetrahidrato de perborato de sodio, aproximadamente un 4,5% de activador de TAED, aproximadamente un 6% de silicato de sodio, y auxiliares que incluyen aproximadamente un 2% de carbonato de sodio y un contenido de humedad de aproximadamente un 10%. También se incluyen las enzimas (aproximadamente un 0,5% por cada enzima). La enzima incluye la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D6

De formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención en forma granulada que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l, alternativamente de aproximadamente 550 g/l, con un contenido de aproximadamente un 20%, alternativamente hasta cerca de un 16% en peso de surfactantes de los cuales aproximadamente un 9%, alternativamente cerca de un 7%, es dodecilbenceno sulfonato de sodio, alternativamente alquil benceno sulfonato de sodio lineal, y el resto es una mezcla de Synperonic A7 y Synperonic A3 (o etoxilatos similares) (respectivamente aproximadamente entre un 5% y un 6%, alternativamente cerca de un 4% y un 7%), y sal inorgánica neutra cero (p. ej., sulfato de sodio), más un 30% aproximadamente de adyuvante de zeolita, alternativamente cerca de un 25%, tetrahidrato de perborato de sodio, alternativamente monohidrato, aproximadamente un 14% o un 15%, aproximadamente un 3,6% de activador de TAED, y auxiliares que incluyen aproximadamente un 9% de carbonato de sodio, o hasta un 15%, aproximadamente un 0,7% de Dequest® 2047 y un contenido de humedad de cerca de un 10%. También se incluyen las enzimas (cerca del 0,5% por cada enzima, o cerca del 0,2% de lipasas y cerca del 0,7% de proteasas). La enzima incluye la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D6a

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención en forma granulada que tiene una densidad aparente de al menos 600 g/l, que contiene aproximadamente un 15% en peso de surfactantes de los cuales aproximadamente un 7% es alquil benceno sulfonato de sodio lineal, un 2% de sulfato de alcohol primario, y el resto Synperonic A7 o etoxilatos similares y sal inorgánica neutra cero (p. ej., sulfato de sodio), más un 22% aproximadamente de adyuvante de zeolita, aproximadamente un 15% de tetrahidrato de perborato sódico, aproximadamente un 7% de activador de TAED y auxiliares que incluyen aproximadamente un 15% de carbonato de sodio, aproximadamente un 0,7% de Dequest® 2047 y un contenido de aproximadamente un 10% de humedad. Las enzimas (aproximadamente un 1,2%) incluyen la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223,S224, S225, S226, o S235.

Detergente D7

Se formula un detergente en polvo según una forma de realización de la invención para que contenga: un 6% de ácido dodecilbencenosulfónico, un 5% de óxido de etileno con 7 mol/mol de etoxilato de alcohol lineal condensado C12-C15, un 3% de jabón de ácido graso, un 3% del polímero CP5 Sokolan®, un 22% de zeolita A, un 10% de carbonato de sodio, un 17% de sulfato de sodio, un 8% de partículas de arcilla, un 13% de tetrahidrato de perborato de sodio, un 2% de tetraacetil-etilenodiamina, un 0,5% de proteasa, auxiliares y agua hasta el 100%. El pH se ajusta a un valor entre 9 y 10. La enzima proteasa comprende la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D8

Se formula un detergente (jabón) en pastilla según una forma de realización de la invención de la manera siguiente: jabón basado en un 82% de sebo saponificado, un 18% de aceite de coco, un 0,15% de ácido ortofosfórico neutralizado, mezclado con proteasa (aproximadamente 8 GU/mg de la composición de la pastilla) y mezclado con formato de sodio al 2%, un 2% de borax, un 2% de propilenoglicol y un 1% de sulfato de sodio, todo esto se pasa lentamente por una cadena de producción de jabón. La enzima proteasa comprende la proteasa según el Mutante S001, alternativamente S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D9

Los detergentes líquidos estructurados pueden, por ejemplo, contener además de una proteasa como la que se describe aquí, un 2-15% de surfactante no iónico, un 5-40% de surfactante total, incluyendo el surfactante no iónico y, opcionalmente, el aniónico, un 5-35% de un adyuvante que contenga o que no contenga fosfato, un 0,2-0,8% de espesante polimérico, p. ej., un polímero acrílico reticulado con peso molecular de aproximadamente 10^{6}, al menos un 10% de silicato de sodio, p. ej., como el vidrio soluble neutro, alcali (p. ej., alcali que contenga potasio) para ajustar el pH deseado, preferiblemente dentro del margen de 9-10 o superior, p. ej., un pH por encima de 11, con un catión de sodio proporcionado: un anión de silicato (como el sílice libre) (en peso) inferior a 0,7:1 y una viscosidad de 0,3-30 Pas (a 20 grados C y 20s-1).

Los ejemplos apropiados contienen aproximadamente un 5% de alcohol C13-15 de surfactante no iónico alcoxilado con aproximadamente 5 grupos EO por mol y con cerca de 2,7 grupos PO por mol, un 15-23% de vidrio soluble neutro con una proporción de peso de 3,5 entre el óxido de sílice y de sodio, un 13-19% de KOH, un 8-23% de STTP, un
0-11% de carbonato de sodio, un 0,5% de Carbopol® 941.

La proteasa se puede incorporar, por ejemplo, en un 0,5% de proteasa según el Mutante S001, alternativamente S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D10

Se formula un detergente líquido acuoso, estructurado, viscoso y adecuado para hacer la colada como se muestra a continuación (% en peso):

\vskip1.000000\baselineskip

Acido cítrico	2,5
Borax (10aq)	4
NaOH	2
Glicerol	5
Aquil-benceno-sulfonato lineal C14-C15 o sulfato de alcohol primario C14-C15	6,5
Synperonic A3 no fónico C12-C15 3EO	1,2
Synperonic A7 no iónico C12-C15 7EO	3,6
Zeolita	20
Proteasa	0,5
Amilasa (Teramyl® 300LDX)	0,2
Auxiliares y agua	hasta 100%

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede ajustar el pH a un valor entre 9 y 10. La enzima es una proteasa según el Mutante S020. En otras versiones alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de entre S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S035, S201, S223, S224, S225, S226, o S235.

\newpage

Detergente D11

Se formula un detergente líquido acuoso, isotrópico y adecuado para su empleo en la colada como se muestra a continuación (% en peso):

Acido cítrico	2
Acido bórico	1
NaOH	3
KOH	4,5
Glicerol	10
Etanol	6,5
Surfactante no fónico (grupos de C12-alcohol 6,5 EO etoxilato o sulfato de alcohol
primario sódico	10
Acido oleico	16
Jabón de aceite de coco (C12)	11
Proteasa	0,5
Auxiliares y agua	hasta 100%

Se puede ajustar el pH a un valor entre 9 y 10. La enzima es una proteasa según el Mutante S020. En otras versiones alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de entre S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D12

Se formula un detergente líquido acuoso para que contenga:

Alquil-benceno-sulfonato de sodio	14,5
Jabón sódico C18	2
Detergente no fónico (C12-15 6EO)	9
Acido graso (ácido oleico)	4,5
Alquenil succinato de sodio	11
Propanodiol	1,5
Etanol	3,6
Citrato sódico	3,2
Agente complejante, p. ej., Dequest 2060	0,7
Proteasa	0,5
Amilasa	0,1
Cloruro de sodio	0,5
Auxiliares y agua	hasta 100%

Se puede ajustar el pH a un valor entre 9 y 10. La enzima es una proteasa según el Mutante S020. En otras versiones alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de entre S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D13

Se formula un detergente líquido acuoso para que contenga:

alquil-benceno-sulfonato de sodio	8
detergente no fónico 6.5EO	10
dietilamida oléica	10
Ácido graso (C12/C18 75:25)	18
Citrato de sodio	1
Trietanolamina	5
Propanol	7
Etanol	5

(Continuación)

Dequest 2060	0,5
Proteasa	0,5
Amilasa	0,1
Auxiliares y agua	hasta 100%

\vskip1.000000\baselineskip

Se puede ajustar el pH a un valor entre 9 y 10. La enzima es una proteasa según el mutante S020. En otras versiones alternativas de este detergente, la enzima se selecciona de entre S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226, o S235.

Detergente D14

Se formula un detergente líquido no acuoso para que contenga (% en peso):

Detergente líquido no iónico (C12/C18 75:25)	41%
Triacetina	5
Ácido alquilbencenosulfónico lineal	6
Estabilizador del óxido de magnesio	1
Adyuvante/Base del carbonato de sodio	18
Adyuvante del carbonato de calcio	8
Activador decolorante TAED	3,5
Precursor decolorante de monohidrato de perborato	10,5
Sílice parcialmente hidrofóbico	2
Proteasa	0,4
Auxiliares de Lipasa (Lipolase®) o adicional	3
surfactante líquido no fónico (sin agua)	hasta 100%

\vskip1.000000\baselineskip

Para formular esta composición, se añade primero el surfactante no iónico líquido y la triacetina, seguidos del óxido de magnesio y, a continuación, el resto de ingredientes excepto la enzima. Se muele la mezcla en un molinillo coloidal y se enfría y, finalmente, se agrega la(s) enzima(s) y cualquier otro auxiliar termosensible.

La enzima es una proteasa según el Mutante S020. En otras versiones alternativas de este detergente, la enzima se selecciona entre S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226, o S235.

También se puede utilizar cualquier otra formulación de detergente de las descritas y ejemplificadas en la EP 0 342 177 junto con los mutantes utilizados en el Detergente D3.

Resultados Generación de mutaciones puntuales del gen de subtilisina 309

Las mutaciones puntuales se llevaron a cabo según el método de Morinaga et al. (Biotechnology, supra). Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para introducir las mutaciones:

\vskip1.000000\baselineskip

a) Gly 195 Glu (G195E (S001):

Un cebador desapareado 27-mer, Nor-237, que también genera un nuevo lugar de restricción SacI:

100

\newpage

b) Arg 170 Tyr (R170Y (S003):

Un cebador desapareado 25-mer, Nor 577, que destruye un lugar HaeIII:

101

\vskip1.000000\baselineskip

c) His 120 Asp (H120D (S006)):

Un cebador desapareado 32-mer, Nor 735, que destruye un lugar SphI:

102

\vskip1.000000\baselineskip

d) Lys 251 Glu (K251 E (S005):

Un cebador desapareado 32-mer, Nor 736, que genera un lugar XhoI:

103

\vskip1.000000\baselineskip

e) Lys 235 Leu (K235L (S015):

Un cebador desapareado 24-mer, Nor77-856, que genera un lugar PStI:

104

\vskip1.000000\baselineskip

f) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu (R170Y;G195E (S004)):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-577 y Nor-237 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

g) Gly 195 Glu; Lys 251 Glu (G195E;K251E (S018)):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-237 y Nor-736 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

h) Arq 170 Tyr; Lys 251 Glu (R170Y;K251E (S011)):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-577 y Nor-736 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

i) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 251 Glu (R170Y;G195E;K251 E (S012)):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-577, Nor-237 y Nor-736 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

j) Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (G195E;K235L):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-237 y Nor-856 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

k) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (R170Y;G195E;K235L):

Se levó a cabo una combinación de Nor-577, Nor-237 y Nor-856 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

l) His 120 Asp; Lys 235 Leu (H120D;K235L (S016):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-735 y Nor-856 en analogía con lo anterior.

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m) His 120 Asp; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D;G195E;K235L (S017):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-735, Nor-237 y Nor-856 en analogía con lo anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

n) His 120 Asp; Arq 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D;R17OY;G195E;K235L (S019)):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-735, Nor-577, Nor-237 y Nor-856 en analogía con lo anterior.

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o) His 120 Asp; Arq 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; Lys 251 Glu (H120D;R170Y;G195E;K235L;K251 E (S020):

Se llevó a cabo una combinación de Nor-735, Nor-577, Nor-237, Nor-856 y Nor-736 en analogía con lo anterior.

Se llevó a cabo una mutagénesis dúplex interrumpida empleando los plásmidos pSX93, pSX119, y pSX120 como plantillas. Se muestra el pSX93 en la figura 3 y es un pUC13 (Vieira, J. and Messing, J.: 1982, Gene 19: 259-268) que alberga un fragmento de HindIII-XbaI de 0,7 kb del gen de subtilisina 309 que incluye el terminador insertado en el poliligador.

Para la introducción de mutaciones en la parte del terminal-N de la enzima, se utilizó el plásmido pSX119. El pSX119 es pUC13 que alberga un fragmento de EcoRI-XbaI del gen de subtilisina 309 insertado en el poliligador. Las plantillas pSX 93 y pSX119 cubren, así, por completo el gen de subtilisina 309.

El plásmido pSX120 es un plásmido en el que el fragmento HpaI-HindIII con el gen de subtilisina 309 a partir de pSX88 se inserta dentro de EcoRV-HindIII en pDN 1681, de modo que el gen de proteasa viene expresado por los promotores amy M y amy Q. El pDN 1681 se obtiene a partir de pDN 1380 (Diderichsen, B. and Christiansen, L.: 1988, FEMS Microbiology Letters 56: 53-60) con un fragmento ClaI de 2,85 bp insertado a partir de B. amyloliquefaciens portador del gen amy Q junto con el promotor (Takkinen et al.: 1983, J. Biol. Chem. 258: 1007ff.). La construcción de pSX120 aparece resumida en la figura 1, donde se muestra que el pDN1681 se corta junto con EcoRV y HindIII y el pSX88 con HindIII y HpaI y a continuación la ligadura da como resultado un pSX120 regulado por los promotores amy M y amy Q.

Se crearon otros cuatro plásmidos pSX170, pSX172, pSX173 y pSX186 para conseguir la mutagénesis dúplex discontinua del gen de subtilisina 309:

- pSX170: SphI-KpnI, 700 bp a partir de pSX120 insertado en pUC 19 SphI-KpnI, a partir del residuo aminoácido 170 en subtilisina 309 madura hasta el terminador.

- pSX172: EcoRI-SphI, 1360 bp a partir de pSX120 insertado en pUC 19 EcoRI-SphI, desde el promotor hasta el residuo aminoácido 170 en subtilisina 309 madura. pSX173: como pSX170, pero con G195E.

- pSX186: PvuII-EcoRI, 415 bp a partir de pSX120 insertado en pUC 19 HincI-EcoRI, desde el residuo aminoácido 15 hasta el residuo aminoácido 206 en subtilisina 309 madura.

La Figura 2 muestra un mapa de restricciones un tanto detallado de pSX120 en el que se indica los fragmentos que se emplearon para la construcción de los plásmidos pSX170, pSX172, pSX173 y pSX186.

La mutación a) se llevó a cabo cortando pSX93 con XbaI y ClaI como se indica en la Figura 3 y se describe en la sección "Generación de mutaciones dirigidas en el gen de subtilisina" y en la solicitud de patente internacional nº PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S).

Las mutaciones b), d) y e) se llevaron a cabo correspondientemente al cortar el pSX170 mediante SphI y KpnI.

Las mutaciones f) y g) se llevaron a cabo como en los supuestos anteriores, pero con el pSX173 en vez de con el pSX170.

La mutación c) se llevó a cabo de manera correspondiente cortando el pSX186 mediante PstI y EcoRI.

Las mutaciones h) a o) se construyeron combinando fragmentos de ADN con las mutaciones de b) a g) simples o dobles utilizando los lugares de restricción NheI, XbaI, ClaI, AvaII y KpnI dependiendo de lo que resulte apropiado.

Se produjeron otros mutantes empleando métodos similares o métodos generales que se conocen a partir de la bibliografía.

Mutantes de subtilisina Carlsberg

A partir de determinados ejemplos de mutaciones en subtilisina Carlsberg mencionados en esta descripción se introdujeron los siguientes cambios en la secuencia de nucleótidos del gen:

Asp 14 Lys (D14K (C001)) (GAT > AAG)

Asp 120 Lys (D120K (C002)) (GAT > AAA)

Asp 140 Lys (D140K (C003)) (GAC > AAA)

Asp 14 Lys + Asp 120 Lys (D14K+D120K (C004))

Lys 27 Asp (K27D (C005)) (AAA > GAT)

Lys 27 Asp + Asp 120 Lys (K27D+D120K (C006))

Asp 172 Lys (D172K (C008)) (GAC > AAA)

Asp 14 Lys + Asp 120 Lys + Asp 140 Lys + Asp 172 Lys (D14K + D120K + D140K + D172K (C010))

Val 51 Asp (V51 D (C100))

Glu 54 Thr (E54T (C101)) (GGG > ACA)

Glu 54 Tyr (E54Y (C102)) (GGG > TAT)

Estos cambios se introdujeron modificando los oligos correspondientes en los fragmentos implicados. La corrección de las nuevas secuencias se confirmó después de que los oligos originales fueran reemplazados por estas nuevas secuencias y se ensamblaran en los nuevos fragmentos de ADN. Finalmente, se volvieron a ensamblar los fragmentos con el nuevo gen de subtilisina Carlsberg.

Expresión de subtilisinas mutantes

Tras la confirmación de que la secuencia de mutación es correcta, los fragmentos de ADN mutado se insertaron en los plásmidos pSX92 o pSX120, que se emplearon para producir los mutantes.

El plásmido pSX92 se muestra en la Figura 4 y se produjo mediante la clonación del gen de Sub 309 en el plásmido pSX62 cortado en ClaI, relleno con el fragmento Klenow de ADN polimerasa I y cortado con HindIII antes de la inserción de los fragmentos Dra-NheI y NheI-HindIII del gen clonado de Sub 309.

Para expresar los mutantes, los fragmentos mutados (XbaI-ClaI, XbaI-HindIII o EcoRI-XbaI) fueron escindidos del plásmido de mutaciones apropiado pSX93, pSX119, pSX170, pSX172, pSX173, y pSX186, respectivamente, y fueron insertados en pSX92 o en pSX120 para obtener plásmidos capaces de expresar los diferentes mutantes.

El pSX92 o pSX120 mutado se utilizó entonces para transformar DN497 de B. subtilis.

Las células transformadas se distribuyeron entonces sobre placas de agar LB con 10 mM de fosfato, un pH de 7,6 mg/ml de cloranfenicol y un 0,2% de xilosa para inducir el promotor xyn en el plásmido. Las placas también contenían un 1% de leche desnatada de manera que la proteasa que produce los transformantes pudiera ser detectada por el halo claro en el que se haya degradado la leche desnatada.

Tras el crecimiento adecuado, se recuperaron y se depuraron las enzimas mutadas.

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Fermentación de las especies de subtilisina carlsberg

Con el objetivo de producir una enzima proteasa sobre la base de los microorganismos que llevan genes mutantes para BPN' como se describe arriba, se utilizó de manera general una fermentedora Chemoferm del tipo Rushton con una turbina de ocho cuchillas planas y un volumen de trabajo de 8 litros. La configuración de la fermentadora se preparó conforme a las reglamentaciones sobre la seguridad para VMT y que consistían en:

a) Un controlador de presión (tipo 4-3122, Bell & Howell) que corta el suministro de aire por encima de 0,1 bar de sobrepresión. Esto se hace para impedir que se atasquen los filtros de aire.

b) Un colector de espuma en la salida de gas compuesto por un recipiente de succión de 20 l que tiene una capa anti espuma en el fondo.

c) Una envoltura de agua de enfriamiento sin juntas herméticas para evitar la contaminación del agua de enfriamiento o del drenaje del agua del grifo.

d) Se utiliza un filtro contra la evacuación absoluta (Gelman acro 50, 0,45 micra).

e) Muestreo a través de un dispositivo de bombeo del muestreo con un volumen interno pequeño.

Controles

Se controlaron las corrientes de gases utilizando medidores de flujo-masa (Brooks, tipo 5852, gama de 0-10 l).

Se controló el pH empleando un transmisor Hartmann & Braun y un controlador Philips (Witromat). Se utilizó NaOH (3M) concentrado como neutralizador.

Se analizaron los gases evacuados usando un Unor 4 N (CO2) y un Oxygor 7 N (O2) de Maihak, Westinghouse. Se determinó la presión de oxígeno en el medio empleando una sonda de oxígeno esterilizable polarográfica industrial (tipo Ingold 322756702).

Se controló la temperatura del medio mediante un sensor PT100 y un controlador de temperatura Honeywell (clase 84). La formación de espuma se mantuvo en un nivel aceptable empleando un electrodo de contacto, mientras un conmutador de nivel activaba una bomba de dosificación antiespuma.

Todos los controles externos se pusieron bajo el control de un microordenador de Hewlett Packard (HP220).

Condiciones del cultivo

Se prepararon los inoculos incubando un cultivo de frasco de agitación a 30ºC durante 16 h a 250 rpm en un agitador giratorio (fermentación LH, tipo MKx). Se utilizaron 300 ml de inoculo para acondicionar 8 L de medio en las condiciones de fermentación reales (pH de 7.0, 30ºC, flujo de aire de 3,5 l/min, agitador a 1000-1500 rpm). Se mantuvo la concentración de oxígeno disuelto al 25% por encima de la saturación del aire. El agente antiespuma empleado fue un material basado en aceite de silicona (Rhodorsil R426, Rhone Poulenc).

Producción de la subtilisina proteasa

Se produjeron las proteasas (mutantes) empleando la cepa DB105 de B. subtilis que contenía el gen mutante tal y como se describe en el apartado de construcción del gen. El medio de cultivo consiste en: 8 g/l de NH4Cl; 4 g/l de KH2PO4; 4 g/l de K2HPO4; 2 g/l de NaCl; 1 g/l de MgSO4.2H20; 10 g/l de extracto de levadura; 40 g/l de sacarosa; un pH de 7.0 y esterilizado durante 45 minutos a 120ºC. Tras la esterilización se añadieron 25 mg/l de triptófano; 20 mg/l de neomicina. Se detuvieron las fermentaciones tras 20-30 horas. Los medios se despejaron de células mediante el centrifugado.

Actividad proteolítica de subtilisinas mutantes

Se comprobó la actividad proteolítica de varios mutantes frente a la caseína como substrato proteínico, según el método DMC supra. En la tabla IV se presentan los resultados.

TABLA IV

Actividad proteolítica de las subtilisinas mutantes
Mutante	Actividad relativa
Ninguno (S000)	100
S001	95
S003	90
S004	85
S005	105
S006	100
S012	80
S017	90
S019	70
S020	75
S024	70

Rendimiento de lavado de las subtilisinas mutantes

A:

Se probó el rendimiento de lavado de varios mutantes en Detergente estándar líquido con un pH de 8.14 en un sistema modelo contra manchas de hierba según los métodos detallados arriba. En la tabla V se presentan los resultados.

TABLA V

10

A partir de la tabla se puede observar que todos los mutantes sometidos a prueba mostraban un rendimiento de lavado mejorado o igual en comparación con la enzima madre de tipo salvaje. El rendimiento de lavado de los mutantes S019 y S020 es mejorado de modo que 1,0 mg/l de estas enzimas, en términos generales, sean capaces de sustituir 10,0 mg/l de la enzima madre de tipo salvaje, indicando con ello una mejora substancial en el rendimiento de lavado de las enzimas mutantes de la invención.

B:

En la tabla VI se muestran los resultados de las pruebas de algunas variantes de las enzimas de la invención en el detergente líquido modificado comercializado en los Estados Unidos con valores de pH diferentes en un sistema modelo.

TABLA VI

11

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Los resultados muestran claramente que si se modifica el pl de una enzima donde se desea que varíe el pH óptimo para el rendimiento de lavado de la enzima de manera que éste se aproxime al pH de la solución de lavado se mejora el rendimiento de lavado de la enzima.

D:

Se comprobó el rendimiento de lavado de varios mutantes en tela de algodón con manchas de hierba según el método descrito en el Ensayo A.

Se utilizaron 2,0 g/l de un detergente líquido (detergente D3). Se disolvió el detergente en agua con intercambio iónico. Se ajustó el pH a 9.1 con NaOH/HCl.

La temperatura se mantuvo a 20ºC de forma isotérmica durante 10 minutos.

Se dosificaron los mutantes a 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; y 10,0 mg de proteína enzimática/l cada uno.

Se determinó la estabilidad de los mutantes examinados midiendo la temperatura de desnaturalización (capacidad máxima de calor excesivo) por calorimetría de análisis diferencial, DSC. El nivel de calentamiento fue de 0,5ºC/min.

Se comprobó la estabilidad en una solución que contenía aproximadamente 2 mg/ml del mutante en un 91% de detergente líquido estándar, cuya composición se describe en el Ensayo A. Se obtuvo la solución mezclando 100 ml de solución enzimática (aproximadamente 20 mg de enzima/ml en un tampón de 0,01 M de ácido dimetilglutárico, 0,002 M de CaCl_{2}, 0,2 M de H_{3}BO_{3} y 0 0,1 M de NaCl con un pH de 6.5) con 1000 ml de detergente líquido estándar.

Dentro del grupo de mutantes de Subtilisina 309, los resultados de estabilidad obtenidos mediante DSC resultan coherentes con los resultados de estabilidad obtenidos mediante las pruebas de estabilidad de almacenamiento tradicionales.

Resultados

El rendimiento de lavado de los diferentes mutantes en el detergente líquido se presenta en la tabla VII. Los resultados se muestran como factores de mejora con respecto a la enzima madre de tipo salvaje. El factor de mejora aparece definido como en el Ensayo C.

En la tabla VII también se muestra la temperatura de desnaturalización en detergente estándar líquido por DSC y la diferencia entre la temperatura de desnaturalización de la enzima madre de tipo salvaje y la del mutante en cuestión.

TABLA VII

13

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A partir de la tabla VII se puede observar que todos los mutantes evaluados muestran un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la enzima madre de tipo salvaje. El mejor rendimiento de lavado se consigue mediante los mutantes que tienen un pl_{o} igual o ligeramente inferior al pH de la solución de lavado.

La temperatura de desnaturalización obtenida mediante DSC muestra que la estabilidad de los mutantes individuales S 021 (*36D) y S 201 (N76D) aumenta en 4,0ºC y 4,2ºC respectivamente con respecto a la enzima madre de tipo salvaje.

Junto con las mutaciones que se incorporan a uno o más de los mutantes catalogados en la tabla VII, se ha demostrado que las mutaciones R170Y y K251 E desestabilizan el mutante con respecto a la enzima madre de tipo salvaje, mientras que las mutaciones H120D, G195E y K235L son insensibles con respecto a la estabilidad.

Se puede observar a partir de la tabla VII que los mutantes que contienen una mutación desestabilizante se desestabilizan, incluso en aquellos casos en los que se incluye una mutación estabilizadora.

Los efectos estabilizantes de *36D y N76D son aditivos. Esto se observa en los mutantes S 025 y S 035. S 025 contiene tres mutaciones que se mantienen insensibles ante la estabilidad y ante la mutación estabilizadora *36D. La temperatura de desnaturalización para el S 025 aumenta en 3,9ºC con respecto a la enzima madre de tipo salvaje, que resulta igual al aumento calculado en los mutantes individuales *36D, S 021. S 035 contiene la misma mutación N76D. La temperatura de desnaturalización para S 035 aumenta en 7,3ºC con respecto a la enzima madre de tipo salvaje, que, dentro del error experimental, resulta igual a la suma del aumento calculado en los mutantes individuales *36D, S 021 y N76D, S 201.

E:

Se evaluó el rendimiento de lavado de los tres mutantes en tela de algodón con manchas de hierba según el método descrito en el Ensayo A.

Se utilizaron 2,0 g/l de detergente líquido D3. Se disolvió el detergente en agua con intercambio iónico. Se ajustó el pH a 9.1 con NaOH/HCl.

Se mantuvo la temperatura a 30ºC de forma isotérmica durante 10 minutos. Se dosificaron los mutantes a 1,0 y 10,0 mg de proteína enzimática/l cada uno.

Resultados

Se evaluó el rendimiento de lavado de los tres mutantes en un detergente líquido comercializado en Estados Unidos contra las manchas de hierba. Los resultados se muestran en la tabla VIII.

TABLA VIII

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A partir de la tabla VIII se puede observar que todos los mutantes muestran un rendimiento de lavado mejorado con respecto a la enzima madre de tipo salvaje. También se puede observar que el mejor rendimiento se consigue con el mutante que tiene un pl_{o} más cercano al pH de la solución de lavado.

F:

Se evaluó el rendimiento de lavado de dos mutantes en tela de algodón con manchas de hierba según las condiciones descritas en el Ejemplo E.

Resultados

Se evaluó el rendimiento de lavado de los dos mutantes en detergente D3 con respecto a tela de algodón con manchas de hierba. Los resultados se muestran en la tabla IX.

TABLA IX

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A partir de la Tabla IX se puede observar que todos los mutantes muestran un rendimiento de lavado mejorado con respecto a la enzima madre de tipo salvaje. También se puede observar que el mejor rendimiento se consigue con el mutante que tiene un pl_{o} más cercano al pH de la solución de lavado.

G:

Se evaluó el rendimiento de lavado de varios mutantes en tela de algodón con manchas de hierba según el método descrito en el Ensayo A.

Se utilizaron 2,0 g/l de detergente D3.

El detergente se disolvió en un tampón (0,0025 M de ácido bórico y 0,001 M de fosfato de hidrógeno disodio preparado en agua con intercambio iónico). Se ajustó el pH a 7.0, 8.0, 9.0, y 10,0 respectivamente con NaOH/HCl. Se mantuvo la temperatura a 30ºC de forma isotérmica durante 10 minutos.

Se dosificaron los mutantes a 0,2 mg de proteína enzimática/l cada uno.

Resultados

En la tabla X se muestra el rendimiento de lavado de algunas de las variantes de las enzimas de la invención con diferentes valores de pH en un sistema modelo.

TABLA X

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Los resultados de la tabla X muestran claramente que variando el pl de una proteasa de forma que se acerque al pH de la solución de lavado mejora el rendimiento de lavado de la proteasa.

Los resultados también muestran que todas las variantes evaluadas tienen un rendimiento mejorado en comparación con la enzima madre de tipo salvaje con un pH por debajo de 10.0.

H:

Se evaluó el rendimiento de lavado de varios mutantes en tela de algodón con manchas de hierba según el método descrito en el Ensayo A.

Se emplearon 2,0 g/l del detergente líquido D3. Se disolvió el detergente en 0,005 M de glicina preparada en agua con intercambio fónico). Se ajustó el pH a 10.0, 10.25, 10.50, 10.75, 11.0, 11.5, y 12.0, respectivamente, con NaOH. Se mantuvo la temperatura a 30ºC de forma isotérmica durante 10 minutos.

Se dosificaron los mutantes a 0,2 mg de proteína enzimática/l cada uno.

Resultados

En la tabla XI se muestra el rendimiento de lavado de algunas variantes de la enzima de la invención con diferentes valores de pH en un sistema modelo. En este caso, se investigaron las variantes con un pl ligeramente más elevado que el de la enzima madre de tipo salvaje. Se investigó el intervalo de pH de un pH de 10.0 a 12.0 más detalladamente que en ejemplos anteriores.

TABLA XI

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Los datos de la Tabla XI muestran que con valores de pH altos se puede conseguir un rendimiento máximo con valores de pH un poco por encima del pl calculado. Además, aumentando el pl de la proteasa se tiende a aumentar el pH del rendimiento máximo. Los efectos no son tan pronunciados como se observa con valores de pH bajos (ensayos B y G).

I:

Con el objetivo de visualizar la correlación entre el punto isoeléctrico de la proteasa y el pH en el que la proteasa tiene su rendimiento máximo, se utilizan los resultados de los ejemplos B, G y H para encontrar el pH en el que cada una de las variantes sometidas a investigación (y la enzima madre de tipo salvaje) tienen su rendimiento máximo. En la figura 5 se muestra este pH_{max} como función del pl_{o} calculado.

Teniendo en cuenta que se investiga el intervalo de pH en etapas con un valor de pH de 1.0, la correlación resulta obvia.

En lo que se refiere a la combinación entre los mutantes de la invención con la lipasa, los resultados experimentales condujeron a las siguientes conclusiones prácticas:

La lipasa se mantuvo estable durante una hora en solución de lavado de tipo O a 37ºC. La presencia de Savinase® condujo a una desactivación rápida. La Kazusase® condujo a una inactivación substancialmente inferior de la lipasa durante el período de prueba.

Se observó que la proteinasa K era menos agresiva para la lipasa que la Savinase®, pero más que la Kazusase®. Sin embargo, la subtilisina BPN' no inactivó la lipasa en absoluto bajo estas condiciones.

Las proteasas preferidas para su uso, p. ej., junto con la lipasa en composiciones para el lavado representadas por el tipo O son los mutantes S001, S003, S004, S012, S019, S020, S021, S025, S035, y S235.

La solución de lavado del tipo O era una solución de 5 g/l a 37ºC derivada de la formulación detergente siguiente (% en peso):

Surfactante aniónico	6
Surfactante no fónico	5
Ácido graso	2,8
Polímero acrílico	3
Zeolita	22
Carbonato	10
Sulfato	17,5
Arcilla	8
Amina terciaria	2
Monohidrato de perborato	13
Auxiliares y agua	hasta 100.

El tipo W de la solución de lavado era una solución de 2 g/l de un detergente líquido con la composición siguiente (% en peso):

Surfactante aniónico	16
Surfactante no fónico	7
Hidrótropo	6
Ácido cítrico	6,5
NaOH	4,1
Monoetanolamina	2
Auxiliares y agua	hasta 100.

Claims (6)

1. Una subtilisina proteasa mutada en la que la carga electroestática de la red ha sido modificada en comparación con la proteasa madre con el mismo pH, de manera que, en dicha proteasa hay, con respecto a dicha proteasa madre, residuo(s) aminoácido(s) con menos o más carga positiva y/o residuo(s) aminoácido(s) con más o menos carga negativa, en el que la proteasa madre está seleccionada entre subtilisina BPN', subtilisina amylosacchariticus, subtilisina 168, subtilisina mesentericopeptidasa, subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, subtilisina 147, termitasa, aqualisina, proteasa PB92 de Bacillus y proteinasa K, Proteasa TW7 o Proteasa TW3 caracterizada por el hecho de que se lleva a cabo una mutación en una posición correspondiente a la posición 252 en la subtilisina BPN' por sustitución, de manera que dicha subtilisina proteasa mutada tiene un punto isoeléctrico (pl_{o}) más bajo o más alto que el de dicha proteasa madre y el pl_{o} de la subtilisina proteasa mutada es más cercano al pH de la solución de lavado formado por la composición de detergente que el pl_{o} de la proteasa madre, de tal manera que la subtilisina proteasa mutada muestre un rendimiento de lavado mejorado con respecto a la proteasa madre en dicha solución de lavado.

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la proteasa tiene al menos una mutación adicional que afecta al residuo aminoácido que ocupa una posición elegida entre el grupo de posiciones:

1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275

donde dicha subtilisina proteasa mutada tiene un punto isoeléctrico (pl_{o}) más bajo o más alto que el de dicha proteasa madre y el pl_{o} de la subtilisina proteasa mutada es más cercano al pH de la solución de lavado formada por la composición de detergente que el pl_{o} de la proteasa madre, de tal manera que la subtilisina proteasa muestre un rendimiento de lavado mejorado con respecto a la proteasa madre en la dicha solución de lavado.

3. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la subtilisina madre es la subtilisina 309.

4. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la subtilisina madre es la subtilisina 147.

5. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la subtilisina madre es la subtilisina Carlsberg.

6. El método según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la subtilisina madre es la proteasa PB92 de Bacillus.