ES2159529T5 - Anticuerpos monoclonales humanos anti-tnf alfa. - Google Patents

Abstract

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS (MABS) QUE SE UNEN A TNFALFA HUMANO. SE DESCRIBEN ANTICUERPOS E ISOTIPOS IGG Y IGM. EL REFERIDO ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO SE CONOCE COMO B5 ( F78 HUMANO EN EL FORMATO ELISA CON UNA LEY COMPARABLE A LA TRINEUTRALIZACION DE ALTA AFINIDAD DE MABS DE RATON. TAMBIEN ENLAZA AL TNFALFA CELULAR SUPERFICIAL Y PREVIENE LA SECRECION DE TNFALFA POR LAS LINEAS CELULARES HUMANAS MONOCITICAS.

Description

ANTECEDENTE DE LA INVENCION Campo: La divulgación se refiere de manera general a anticuerpos monoclonales y, específica-mente, a la materia objeto de las reivindicaciones. Técnica anterior: El TNFα es una citocina pluripotente y pleiotrópica. Principalmente, se produce por macrófagos activados; no obstante, su síntesis y secreción se ha observado igualmente usando granulocitos, células B tonsilas, líneas de células B, células asesinas naturales, líneas de células T, aislados de células B malignas crónicas primarias, y células T de sangre periférica.

Igualmente, el TNFα puede expresarse sobre superficies de células, aparentemente en dos formas. Una de ellas, es una proteína de transmembrana tipo 2 integral de 26 kd de peso molecular sobre monocitos, células T y algunas otras células. La otra forma, es el producto de 17 kd secretado que está unido a su receptor.

Entre las muchas actividades del TNFα secretado se encuentran el factor de crecimiento timocito, el factor de crecimiento y maduración de células B, la producción in vivo de necrosis hemorrágica, pérdida de peso, colapso cardiovascular y fallo de órganos múltiple. Naturalmente, estas últimas actividades son la fuente del interés clínico en el TNFα.

Durante el choque séptico, así como en enfermedades inflamatorias, la síntesis y secreción del TNFα, IL-1, IL-6 y IL-8 han sido documentadas. En consecuencia, los sistemas inmunes de algunos individuos están expuestos crónicamente a estas citocinas. Realmente, se han informado de anticuerpos de baja afinidad por el TNFα (A. Fomsgaard y otros, "Autoanticuerpos del factor α de necrosis de tumor en humanos sanos y pacientes con enfermedades inflamatorias e infecciones bacterianas gram-negativas", Scand. J. Immunol., vol. 30, págs. 21923, (1989); y K. Bendtzen y otros, "Auto-anticuerpos del IL-1α y del TNFα en individuos normales y trastornos infecciosos e inmunoinflamatorios", Prog. Leukocyte. Biol., vol. 10B, págs. 447-52, (1990)). No obstante, estos auto-anticuerpos anti-TNFα pueden no ser específicos (H.-G. Leusch y otros, "Fracaso en demostrar auto-anticuerpos específicos del TNFα en sueros humanos mediante ELISA y transferencia Western", J. Immunol. Meth., vol. 139, págs. 145-47, (1991)).

Una característica particular del suero humano, así como de los sueros procedentes de otros animales, es su contenido de anticuerpos naturales, denominados polireactivos. Usualmente, estos son anticuerpos IgM que se unen a varios autoantígenos con baja afinidad (A.

B. Hartman y otros, "Los auto-anticuerpos reactivos de órganos procedentes de ratones Balb/c adultos no inmunizados son polireactivos y expresan el uso del gen Vh no influido", Molec. Immunol., vol. 26, págs. 359-70, (1989); y P. Casali y otros, "Linfocitos B CD5+, anticuerpos polireactivos y el repertorio de células B humanas", Immunol. Today, vol. 10, págs. 364-8, (1989)). En consecuencia, podría esperarse que la reactividad de tipo auto-anticuerpo al TNFα fuera de baja actividad y probablemente de reactividad cruzada con otros diversos antígenos.

Se ha informado de algunos anticuerpos neutralizantes de alta afinidad para el IL1α en sueros normales (N. Mae y otros, "Identificación de auto-anticuerpos anti-IL-1α de alta afinidad en suero humano normal como una substancia interfiriente en un ensayo inmunoenzimático sensible para el IL-1α", Lymphokine Cytokine and Research, vol. 10, (No. 1), págs. 61-68, (1991)) o de pacientes (H. Suzuki y otros, "Demostración de auto-anticuerpos neutralizantes contra IL-1α en sueros procedentes de pacientes con artritis reumatoide", J. Immunol., vol. 145, págs. 2140-6, (1990)).

A pesar de estas consideraciones, los autores de la presente invención no tienen conocimiento de la descripción de ningún anticuerpo humano monoclonal que se una específicamente al TNFα, incluso aunque se ha pensado que dichos anticuerpos pueden tener un valor clínico significativo. De acuerdo con ello, persiste la necesidad de disponer de anticuerpos monoclonales monoespecíficos para el TNFα.

RESUMEN DE LA INVENCION

Los inventores las presentes han fabricado anticuerpos humanos monoclonales que se unen tanto al TNFα humano como de ratón. Los anticuerpos se unen al TNFα humano recombinante (rhTNFα) con un título comparable a tres mAbs de ratón neutralizantes de alta afinidad, cuando se ensayan mediante ELISA. Los anticuerpos más completamente caracterizados son los del isotipo IgM, aunque también se han preparado anticuerpos del isotipo IgG. Mediante ensayos de unión de competencia, el anticuerpo parece unirse a epítopos sobre el rhTNFα distintos de los unidos mediante los mAbs de ratón neutralizantes hasta ahora descritos. Los análisis de especificidad indican que el auto-anticuerpo IgM humano se une tanto al TNFα recombinante humano como de ratón, pero no a otros antígenos comúnmente reconocidos por auto-anticuerpos IgM naturales polireactivos. El alto nivel de identidad de aminoácidos entre las moléculas del TNFα humano y de ratón, sugiere que el anticuerpo es monoespecífico para un epítopo dado compartido por estas dos formas del TNFα.

Igualmente, el anticuerpo B5 se une al TNFα de superficie de células (csTNFα) sobre células T humanas, células B, monocitos, una diversidad de líneas de células de linaje linfoide y monocito de origen humano, así como astrocitomas, un carcinoma de pulmón, y un melanoma. Igualmente, el anticuerpo se une a linfocito de chimpancé y a la línea de células de linfoma T de ratón de csTNFα. La unión del anticuerpo a cdTNFα es específica, puesto que puede ser inhibida por el TNFα pero no por el TNFß, un mAb anti-TNFα de ratón neutralizante, ni tampoco mediante una forma recombinante del dominio extracelular del receptor del TNF p55 (TNFR). El auto-anticuerpo B5 puede inhibir la secreción del TNFα inducida por LPS mediante

células de la línea de células tipo monocito humano THP-1.

Se han descrito en la literatura varios anticuerpos TNFα anti-humano de ratón monoclonales. No obstante, ninguno de ellos, se unen igualmente al TNFα de ratón.

La especificidad, la naturaleza auto-anticuerpo, la unión al TNFα de superficie de célula y la capacidad para inhibir la secreción del TNFα hacen del B5 un nuevo mAb.

A continuación, se describe la caracterización de los anticuerpos y su forma de obtenerlos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Las Figuras 1A y 1B muestran, en formato de gráfica, una comparación de la unión en formato ELISA en fase sólida al rhTNFα de los anticuerpos monoclonales B5 (humano) y A10G10 (múrido). Las placas ELISA se recubrieron con diversas concentraciones de TNF y, a continuación, se dejaron unirse dosis valoradas de mAb. Se muestran las curvas de unión para cada anticuerpo para las diversas concentraciones de recubrimiento del TNF.

Las Figuras 2A y 2B muestran, en formato de gráfica, la carencia de competencia por la unión al TNFα entre mAbs de ratón y mAb B5. La Figura 2A muestra la unión de tres mAbs anti-TNF de ratón y la unión de mAb anti-rFVIII C7F7 de control a rhTNFα en fase sólida. La Figura 2B muestra la carencia de inhibición de unión de B5 al TNF unido en placa cuando los monoclonales de ratón se dejaron primeramente unir a placas de TNF y posteriormente se agregó el anticuerpo B5.

La Figura 3 muestra, en formato de gráfica, la unión de mAbs IgM anti-TNF humano a rhTNFα capturado y presentado como un complejo mediante la combiinación de los mAbs de ratón unidos en placa a Al10G10, B6 y A6. Las placas ELISA se pre-recubrieron con los tres mAbs de ratón y, a continuación, se incubaron con rhTNFα. Las placas se lavaron y, a continuación, se dejaron unir 20 ug/ml de los mAbs IgM humanos indicados. Las barras rellenas muestran la unión de los mAbs IgM humanos a los tres mAbs de ratón que han sido incubados con el TNF, las barras rayadas muestran la unión de los mAbs IgM cuando los mAbs de ratón unidos no han sido expuestos al TNF.

Las Figuras 4A-4F muestran, en forma de gráfica múltiple, los resultados de un análisis de la especificidad de la unión de varios anticuerpos monoclonales. Las placas se prerecubrieron o bien con TNFα humano recombinante (�), linfotoxina humana recombinante (�), insulina humana (�), tiroglobulina porcina (�), BSA (�), ssDNA (�), dsDNA (4) o bien con fragmentos Fc de IgG humano (Δ). En el panel A se muestra el mAb de ratón A10G10. Los mAbs IgM humanos B5, 7T1, H5, 1A6B5F y F2.2.34 se muestran en los paneles B, C, D, E y F, respectivamente. La unión del anticuerpo se comprobó mediante ELISA.

La Figura 5 muestra, en forma de gráfica, la unión de B5 al TNFα de ratón recombinante. Las placas de plástico se pre-recubrieron con un anticuerpo de TNFα anti-ratón de hamster monoclonal neutralizante a una concentración de 8 ug/ml (cuadrados), 4 ug/ml (triángulos) y 2 ug/ml (círculos). A continuación, se agregó TNFα de ratón recombinante a una concentración de 2 ug/ml (símbolos rellenos), o bien no se agregó (símbolos en blanco). A continuación, el mAb humano B5 se dejó unirse a las concentraciones indicadas. A continuación, la unión se comprobó mediante ELISA usando anticuerpo IgM anti-humano.

La Figura 6 muestra, en formato de gráfica, una comparación de la unión de mAb B5 (triángulos) y mAb A10G10 (círculos) a rhTNFα soluble. Los anticuerpos se unieron a las placas de plástico pre-recubiertas con anticuerpo anti-humano o anti-ratón. A continuación, se incubó TNF biotinilado con los anticuerpos. La unión de TNFα soluble se detectó madiante conjugados de enzima-avidina.

La Figura 7 muestra, en forma de gráfica, que el mAb B5 capturado se une al TNFα soluble y se manifiesta débilmente al mAb A10G10. El mAb B5 anti-TNFα o 6F11 (IgM anti-LPS humano) como control, se dejaron unir a las placas pre-recubiertas con IgM antihumano. A continuación, el TNFα humano se dejó unir a los mAbs humanos acomplejados. Se agregó mAb A10G10 y su unión al TNF acomplejado con mAb B5 se detectó mediante anticuerpo IgM anti-ratón ligado a enzima.

La Figura 8 muestra, en formato de fotografía de tansferencias Western, la unión de varios anticuerpos IgM humanos al TNFα de ratón y la unión del mAb B5 humano al TNFα humano. El TNFα de ratón recombinante (bandas A-G) y rhuTNFα (bandas H e I), se trataron por electroforésis bajo condiciones reductoras y se transfirieron a nitrocelulosa. El TNFα de ratón se tranfirió con los siguientes anticuerpos monoclonales: 7T1 (banda A), B5 (banda B), 1A6B5F (banda C), 6F11 (banda D), H5 (banda E), A8 (banda F) y sin anticuerpo primario (banda G). El TNFα humano se trató por electroforésis en las bandas H e I. A continuación, la banda H se transfirió con mAb B5 y la banda I con mAb 6F11. A continuación, las bandas A-F, H e I se expusieron a IgM anti-humano biotinilado. La banda F se expuso a IgG anti-humano biotinilado, puesto que A8 es un anticuerpo IgG. A continuación, todas las bandas se expusieron al reactivo de revelado de peroxidasa de rábano picante acoplado con avidina. Los estándares de pesos moleculares, comprendidos dentro del intervalo de pesos moleculares desde 211 kd hasta 15,4 kd, se ensayaron en paralelo, indicándose sus posiciones en dicha figura.

La Figura 9 muestra, en forma de gráfica, la neutralización de rhTNFα mediante mAb de ratón A10G10 y la carencia de neutralización por mAbs humanos. Las células WEHI 164 se incubaron con una dosis citotóxica de rhTNFα en presencia de concentraciones valoradas de mAb. A continuación, se comprobó la viabilidad.

Las Figuras 10A-10H muestran, en formato de histogramas, los perfiles de tinción fluorescente de dos líneas de células teñidas con mAbs anti-TNFα IgM humanos. Las células 8B9 (Figuras 10A, 10C, 10E, 10G) y las células THP-1 (Figuras 10B, 10D, 10F, 10H) se tiñeron sin anticuerpos (Figuras 10A, 10B), con IgM anti-humano FL-F(ab)'2 (Figuras 10C, 10D), IgM B5 anti-TNFα+FL-anti-IgM (Figuras 10E, 10F) y 6F11 anti-LPS+FL-anti-IgM (Figuras 10G, 10H). Los números del canal de intensidad de fluorescencia, en unidades arbitrarias se representaron frente a las células por canal sobre la ordenada. Para cada muestra, se acumularon 5000 células. Se muestran los porcentajes de células que caen dentro de los marcadores indicados, puntuados como fluorescencia positiva.

Las Figuras 11A-11B muestran, en formato de gráfica, la detección de la expresión de la superficie de células del TNFα sobre células THP-1 y U937 con el mAb B5 anti-TNFα, y el incremento de expresión con LPS y PMA. Las células THP-1 (Figura 11A) y U937 (Figura 11B) se incubaron durante 3 horas con medio (círculos en blanco), LPS (círculos rellenos) o LPS+PMA (triángulos rellenos).

Las Figuras 12A-12D muestran, en formato de gráfica, el desplazamiento en la intensidad de tinción cuando el mAb B5 anti-TNFα se une a células que han sido teñidas con anticuerpo F1-anti-IgM. Se muestran los esplenocitos positivos CD19. Estos se tiñeron con antiCD19 conjugado con ficoeritrina y únicamente las células positivas se analizaron posteriormente para determinar la tinción del anticuerpo conjugado con fluoresceína. La Figura 12A muestra esplenocitos C19+ no teñidos con FL-anti-IgM. La Figura 12B muestra la tinción de estas células con B5-FL-anti-IgM, la Figura 12C muestra la tinción con FL-anti-hIgM únicamente, y la Figura 12D muestra la tinción con 6F11 anti-LPS IgM+FL-anti-IgM de control. Se muestran los porcentajes de células dentro de los marcadores indicados, indicándose el porcentaje de células teñidas positivamente con el anticuerpo conjugado con fluoresceína. Igualmente, se muestran los números de canal medios para las poblaciones positivas. Estos números reflejan la intensidad de la tinción, medida en unidades arbitrarias, para las poblaciones positivas a la fluorescencia.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Materiales y Procedimientos Reactivos: El rhTNFα fue proporcionado por Bayer A.G., Wuppertal, Alemania. Los rmTNFα y rhLT se adquirieron a Genzyme. Los fragmentos Fc de IgG humano se adquirieron a Chemicon. La insulina se adquirió a Novo Nordisk Labs y todos los otros antígenos restantes usados en los ensayos ELISA se adquirieron a Sigma. La cepa Staph. aureus Cowan se adquirió a Calbiochem (San Diego, CA). El conjugado dextrano-IgD anti-humano se obtuvo de una fuente privada. El ácido forbol mirístico, el IgG1 de ratón, la enterotoxina estafilocócica B (SEB) y la fitohemaglutinina (PHA) se adquirieron a Sigma. El LPS de E. coli se obtuvo de una fuente privada. Los diferentes sueros bovinos fetales se adquirieron a Hyclone.

Las líneas de células mencionadas en la Tabla 2 se adquirieron todas ellas a la American Type Culture Collection (ATCC), excepto en el caso de la línea de células B humana transformada de EBV 8B9, la cual se obtuvo de la Genetic Systems Corporation.

El TNF se biotiniló usando técnicas estándar; en resumen, se agregó éster Nhidroxisuccinimidilo de biotina a TNF disuelto en NaHCO3 50 mM, pH 8,5 durante 15 minutos, se interrumpió con NH4Cl y, a continuación, se dializó para separar la biotina sin reaccionar.

El mAb IgG1 anti-TNFα A10G10 de ratón se generó en colaboración con la Chiron Corporation y tiene el número de desginación ATCC HB 9736, identificado como la línea de células de hibridoma 2-2-3E3.

El mAb IgG2 de ratón A6 y B6 se generó a partir de ratones hiperinmunizados en el propio laboratorio de los autores de la presente invención. Todos estos tres mAbs de ratón neutralizan la toxicidad del TNF y han sido descritos por Galloway y otros, en el artículo "Los anticuerpos anti-factor de necrosis de tumor (TNF) monoclonales protegen las células humanas y de ratón de la citotoxicidad del TNF", J. Immunol. Meth., vol. 140, págs. 37-43, (1991), el cual se incorpora aquí como referencia. Estos mAbs se purificaron mediante cromatografía de afinidad.

Los mAbs IgM polireactivos 1A6B5F y F2.2.34 se produjeron y caracterizaron por Kasaian y otros, en "Identificación y análisis de la nueva subunidad del linfocito B CD5-de superficie humano productora de anticuerpos naturales", J. Immunol., vol. 148, págs. 2690-702, (1992). El mAb IgM humano 7T1 se produjo y fue proporcionado en ascitis por una fuente privada.

La línea linfoblastoide de la célula B transformada de EBV 6F11-64 (6F11) que tiene el número de designación de ATCC CRL 1869, produce un anticuerpo IgM específico de LPS de Pseudomonas tipo 2 anti-Fisher humano y se adquirió a Genetic Systems Corporation. El anticuerpo monoclonal procedente de esta línea de células se produjo en el propio laboratorio de los autores de la presente invención. Sirve como un mAb de control apareado a un isotipo para los mAbs anti-rhTNFα de ratón.

El IgG anti-ratón de cabra y el IgG anti-humano de cabra biotinilado se adquirieron a Jackons Labs. El IgG anti-ratón de cabra biotinilado y el IgM anti-humano de ratón biotinilado se adquirieron a Zymed. La HRP acoplada con avidina y la fosfatasa alcalina acoplada con avidina se adquirieron a Zymed.

Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19 conjugados con ficoeritrina se adquirieron a Dakopatts. La anti-LeuM3 conjugada con ficoeritrina se adquirió a Becton Dickinson. Los anticuerpos IgM anti-humano F(ab)'2 conjugado con fluoresceína (FL), IgG anti-humano FLF(ab)'2 e IgG anti-ratón FL-F(ab)'2 se adquirieron a Cappel.

Ensayos ELISA: Los anticuerpos de captura o antígenos (anticuerpos anti-inmunoglobulina) se usaron para recubrir placas de plástico en tampón de carbonato/bicarbonato, o PBS conteniendo 20 ug/ml de BSA, durante una noche a 4ºC ó 3 horas a 37ºC. Las incubaciones secundarias se realizaron durante una noche a 4ºC o a temperatura ambiente durante un período de 2 horas o menos. Los anticuerpos secundarios se biotinilaron y sus uniones se revelaron usando HRP acoplado con avidina y fosfatasa alcalina acoplada con avidina.

REALIZACIONES ESPECIFICAS Producción de hibridoma: Se produjeron mAbs IgM humanos mediante fusión con el mieloma no secretante P3X63Ag8.653 de ratón. Las células mononucleares de sangre periférica procedentes de un donante positivo al CMV se separaron mediante centrifugación sobre Ficoll, se trataron con éster metílico de L-leucil leucina, se incubaron in vitro con antígeno y, a continuación, se transformaron con EBV. Los transformantes se distribuyeron a concentraciones limitantes y las células que produjeron la unión del anticuerpo al TNF se fusionaron y, a continuación, se subclonaron. El hibridoma B5 se subclonó un mínimo de 5 veces y se depositó en el ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, el 24 de Marzo de 1993, como depósito CRL 11306. Los hibridomas F448-1D1-A8 y F80-1B9-F12 se depositaron el 11 de Mayo de 1993 como HB 11343 y HB 11344. Los mAbs H5 y 7T1 se produjeron mediante fusión de células tonsilares humanas inmunizadas in vitro. Los anticuerpos IgM humanos monoclonales se purificaron por afinidad mediante técnicas estándar para uso en experimentos posteriores.

Ensayo de citotoxicidad: Con el fin de comprobar la capacidad de neutralización del TNF de diversos mAbs, se usó el ensayo descrito por Galloway y otros (citado anteriormente) con las modificaciones menores siguientes. En resumen, se incubaron 20 pg/ml de TNF durante una noche con 60.000 células WEHI 164 y el mAb de ensayo. A continuación, las células viables se detectaron mediante tinción con violeta cristal y lectura de la densidad óptica a 570 nm.

Transferencia Western: El huTNFα recombinante (100 ug/ml más 100 ug/ml de BSA) y el mTNFα recombinante (5 ug/ml con 100 ug/ml de BSA) se trataron por electroforésis en presencia de ßmercaptoetanol y SDS sobre geles de poliacrilamida al 12%. A continuación, las proteínas se electro-transfirieron a nitrocelulosa, la cual, a continuación, se bloqueó con BSA. Los mAbs de ensayo se dejaron unir y, a continuación, fueron detectados con reactivos de antiinmunoglobulina biotinilados. Acto seguido, se agregó estreptavidina-HRP seguido del substrato.

Análisis por fluorescencia: Se tiñeron un millón de células con concentraciones óptimas de anticuerpo primario, usualmente a una concentración de 2,5-40 ug/ml a 4ºC durante 1/2 hora en PBS conteniendo FBS al 1% y azida sódica al 0,02%. Se agregaron las concentraciones óptimas de anticuerpos secundarios fluorescentes, después de dos lavados de células, durante un tiempo similar y en un tampón similar. Después del lavado, las células se fijaron con solución de paraformaldehído al 2%. A continuación, se analizó la fluorescencia sobre un FACSCAN (nombre del instrumento).

Inhibición de la estimulación por LPS de la secreción del TNFα: Se incubaron un millón de células THP-1/ml durante 4 horas con 1 ug/ml de LPS de E. coli en presencia o ausencia de 40 ug/ml de anticuerpos IgM humanos. Los sobrenadantes se recolectaron, se centrifugaron, se filtraron y se ensayaron para determinar la citotoxicidad del TNFα en el ensayo con WEHI 164 mencionado anteriormente. Los sobrenadantes se valoraron y la viabilidad se representó frente a la dilución del sobrenadante. Estas curvas se compararon a una curva estándar usando rhuTNFα para determinar las concentraciones reales del TNFα producido por las células.

Resultados

El anticuerpo IgM humano monoclonal B5 se une al TNF humano recombinante (rhTNFα) en fase sólida. En el propio laboratorio de los autores de la presente invención, se han establecido varios hibridomas que secretan anticuerpos anti-rhTNFα monoclonales. Se realizó un análisis de título de punto final comparando un panel de 6 mAbs IgM humanos y 3 mAbs IgG humanos para tres mAbs de ratón neutralizantes de alta afinidad, A10G10, A6 y B6. Las placas ELISA se recubrieron con 2 ug/ml de rhTNFα. Se agregaron los mAbs indicados en concentraciones valoradas y la unión se comprobó espectrofométricamente. Se muestran las concentración de mAb mínimas que proporcionan una unión con rhTNFα detectable. Los B5 y F12 (F801B9-F12) fueron dos de los mejores mAbs IgM humanos de acuerdo con este criterio, que muestran títulos de punto final dentro del intervalo de los subnanogramos/ml. La Tabla 1 presenta los datos que figuran a continuación.

Tabla 1

Comparación de la unión de rhTNFα en formato ELISA de fase sólida por varios anticuerpos humanos monoclonales

mAb

Título de punto final (ng/ml) Clase Ig

A1-G10

0,6 IgG de ratón

A6

0,15 IgG de ratón

B6

0,08 IgG de ratón

F78-1A10-A1

0,3 IgM humano

F78-1A10-B5

0,6 IgM humano

F80-1B9-B12

0,15 IgM humano

F81-4E3-D6

9,8 IgM humano

F83-1D6-B6

625,0 IgM humano

D83-1D6-F6

1250,0 IgM humano

F83-1A7-G7

0,76 IgM humano

F83-1G12-C1

1,5 IgM humano

F83-4D3-D8

0,38 IgM humano

F83-8D5-F10

0,76 IgM humano

F84-6G9-D6

1563,0 IgM humano

Es preciso indicar que los intervalos y títulos de punto final fueron similares para los mAbs IgM anti-TNFα y los mAbs IgG anti-TNFα.

5 La Figura 1 presenta una comparación más amplia de los mAbs humano B5 y de ratón A10G10. La unión de ambos mAbs dependió de la concentración, independientemente de la concentración del recubrimiento del TNF. El mAb B5 se une ligeramente mejor que el A10G10 con altas concentraciones de recubrimiento del TNF. No obstante, cuando se redujo la concentración de recubrimiento del TNF, la unión del B5 disminuyó más rápidamente que la del A10G10.

10 Esto está de acuerdo con el B5 que tiene una menor afinidad que el A10g10 por el rhTNFα. Estos datos muestran que el mAb B5 se une a rhTNFα en fase sólida. El mAb B5 se une a un epítopo diferente sobre el rhTNFα que a los unidos por tres mAbs anti-TNF de ratón. Los experimentos de unión de competencia han mostrado que el A10G10 y el B6 reconocen epítopos similares sobre rhTNFα, en tanto que el A6 reconoce un

15 epítopo diferente (datos no mostrados). Con el fin de examinar la especificidad de la unión del epítopo de B5, se realizaron experimentos de unión de competencia usando los mAbs de ratón y B5.

Los mAbs de ratón se agregaron a diferentes concentraciones a placas ELISA previamente recubiertas con el TNFα. A continuación, se agregó una concentración óptima de mAb B5 y la unión se detectó posteriormente con IgM anti-humano biotinilado. Si los mAbs de ratón reconocen el mismo epítopo que el mAb B5, estos suelen inhibir la unión del mAb B5 de una manera que depende de la concentración.

Tal como se muestra en la Figura 2A, la unión de los mAbs de ratón al rhTNFα unido a la placa, depende de la concentración. La Figura 2B muestra que ninguno de los mAbs de ratón interfieren con la unión del rhTNFα para una cantidad fijada de mAb B5, incluso a concentraciones de los mAbs de ratón significativamente en exceso con respecto a los requeridos para la unión máxima a la placa. Estos datos sugieren que el B5 reconoce un epítopo sobre el rhNTFα diferente de los reconocidos por A10G10, A6 y B6.

Para apoyar este descubrimiento, se agregó rhTNFα a placas ELISA previamente recubiertas con la combinación de mAbs A10G10, B6 más A6. A continuación, se agregó mAb B5 al ensayo en donde pudo o bien unirse al rhTNFα acomplejado, o bien capturado, por los mAbs de ratón.

La Figura 3 muestra que el B5 y todos los otros mAbs IgM humanos, excepto el 7T1, se unen al rhTNFα acomplejado a mAbs de ratón. La unión de los mAbs humanos no se observó en ausencia del rhTNFα, lo cual demuestra la especificidad por algún epítopo del rhTNFα. El fallo del mAb 7T1 para unirse al TNF acomplejado puede ser debido simplemente a una baja afinidad. Estos resultados apoyan la conclusión de que los mAbs IgM humanos B5, F12, B6 y D6 y los tres mAbs de ratón reconocen diferentes epítopos sobre el rhTNFα.

El mAb B5 no es polireactivo. Puesto que el mAb B5 es un IgM humano que se une al TNFα humano, y por ello, tiene las propiedades que le definen como un auto-anticuerpo, fue importante determinar la calidad de este mAb y comprobar su polireactividad. Para ello, se escogió un panel de antígenos humanos y no humanos usados típicamente para definir la polireactividad. Se comparó la unión de estos antígenos por mAb B5, A10G10, dos mAbs IgM humanos polireactivos de control 1A6B5F y F2.2.34 y otros dos mAbs IgM anti-TNF humanos. Los resultados se normalizaron para cada anticuerpo con el fin de permitir una comparación directa.

La Figura 4 presenta los datos procedentes de cuatro experimentos similares. El mAb de ratón A10G10 se une específicamente al rhTNFα y a ninguno de los otros antígenos restantes. Por el contrario, el mAb polireactivo 1A6B5F se une virtualmente a la totalidad de los antígenos ensayados. Esto mismo fue cierto para el otro mAb polireactivo F2.2.34, aunque la unión a BSA y TNF fue mucho más fuerte que la observada con los otros antígenos. El mAb B5 mostró especificidad por el rhTNFα. No se observó unión del mAb B5 a linfotoxina humana recombinante (rhTNFα) ni a ninguno de los otros antígenos ensayados. Estos datos proporcionan la evidencia de que el mAb B5 no es polireactivo.

Por el contrario, los mAbs IgM humanos 7T1 y H5 se unen a fragmentos Fc humanos, lo cual indica una naturaleza de factor reumatoide. Estos dos anticuerpos se unen igualmente a la insulina y el 7T1 se une también a BSA. Los mAbs polireactivos de control parecen definir dos clases de polireactividad; una de ellas de especificidad muy amplia y la otra más restringida en los antígenos reconocidos. Los mAbs 7T1 y H5 pertenecen a la clase más restringida de mAbs polireactivos. El mAb anti-TNF F12 se une al TNFα humano, pero solamente marginalmente a otros antígenos.

El mAb B5 se une al TNFα de ratón recombinante. Durante el transcurso del análisis de la especificidad del mAb B5, los presentes autores observaron que se une igualmente al TNFα de ratón. Con el fin de demostrar esto, en primer lugar se capturó TNFα de ratón con un anticuerpo monoclonal de hamster neutralizante y, a continuación, se dejó unirse el B5 a este complejo. La Figura 5 muestra los resultados de este tipo de experimento. La unión de B5 dependió tanto de la concentración del B5 presente, como de la concentración de anticuerpo de hamster usado para recubrir las placas. No se observó unión cuando no se agregó TNFα de ratón, lo cual indica la especificidad de la unión del B5 en este sistema. Otros experimentos no mostrados revelaron la unión al TNFα de ratón por el mAb F12.

El mAb B5 se une al rhTNFα soluble con una afinidad baja pero detectable. A continuación, los presentes autores han comprobado la capacidad de los mAbs para unirse al rhTNFα soluble. Las placas ELISA se recubrieron con IgM anti-humano y, a continuación, se agregó B5. A continuación, se determinó la capacidad del mAb B5 unido para capturar el rhTNFα biotinilado.

La Figura 6 compara las capacidades de A10G10 y B5 para unirse al TNFα soluble bajo estas condiciones. Aunque ambos mAbs se unen al rhTNFα soluble, se requiere una concentración aproximadamente 300 veces mayor de mAb B5 para una unión equivalente a la del A10G10. Además, la unión del TNFα soluble a B5 inmovilizado no se saturó con las concentraciones de B5 ensayado. Estos resultados están de acuerdo con una baja afinidad de unión del rhTNFα por el mAb B5. Realmente, los intentos para medir la constante de unión del mAb B5 revelaron una afinidad demasiado baja como para ser calculada mediante procedimientos convencionales (datos no mostrados).

La unión del rhTNFα soluble por B5 se demostró, igualmente, mediante el recubrimiento de placas con anti-IgM, captura del B5 y, a continuación, adición de rhTNFα soluble no modificado. A continuación, se agregó A10G10 y su unión a esta forma acomplejada con B5 de rhTNFα se detectó con IgG anti-ratón biotinilado. La Figura 7 compara las capacidades de B5 y un IgM humano de control, el 6F11, para capturar y exponer el rhTNFα soluble al A10G10. Aunque se ha observado algo de unión no específica con el mAb de control, el mAb B5 se une aproximadamente cuatro a ocho veces más que el rhTNFα en este experimento. Estos datos están de acuerdo con una baja constante de unión de B5 y agregan además un soporte al concepto de que el mAb B5 y el mab A10g10 reconocen epítopos diferentes sobre el rhTNFα.

El mAb B5 reconoce al rhTNFα en transferencias Western. La Figura 8 muestra los resultados de un experimento usando transferencia Western para demostrar la unión de B5 al TNFα desnaturalizado. Las imágenes se han ampliado para una mayor claridad. En las bandas A-G, se examinó la unión a TNFα de ratón y en las bandas H e I se examinó la unión a TNFα humano. El anticuerpo 6F11 no se unió a ninguna especies TNFα, lo cual proporciona un control de especificidad. Todos los mAbs IgM humanos, 7T1, H5, 1A6B5F y B5, se unen al TNFα de ratón. Además, el anticuerpo B5 se une también al TNFα humano, bajo estas condiciones. Estos resultados sugieren que el B5 puede reconocer un epítopo lineal del rhTNFα.

El mAb B5 no neutraliza la citotoxicidad del rhTNFα. La línea de células WEHI 164 sensible al TNF, se usó para comprobar la capacidad del mAb B5 para neutralizar la citotoxicidad del TNFα. La Figura 9 muestra que el A10G10 neutraliza claramente el rhTNFα de una manera que depende de la dosis, tal como ha sido previamente demostrado por Galloway y otros (citado anteriormente). No obstante, a ninguna concentración de B5 se observó nada de neutralización del rhNTFα. Lo mismo es cierto para los otros tres mAbs IgM humanos anti-TNFα, los B6, F12 y 7T1 que se ensayaron. Estos datos agregan un soporte adicional a la idea de que el B5 y el A10G10 unen diferentes epítopos del TNF y están de acuerdo con la capacidad del mAb B5 para unirse débilmente al rhTNFα soluble.

El mAb B5 anti-rTNFα se une a la superficie de varias líneas de células diferentes. Puesto que el mAb B5 se une específicamente al rTNFα, se escogieron varias líneas de células para ensayar los casos en que el mAb se unía a sus superficies. La Figura 10 muestra los resultados de un experimento típico usando dos líneas de células. La línea de células 8B9 linfoblastoide B humana transformada por EBV y la línea de células THP-1 de monocitos humana se tiñeron o bien con los mAbs B5 anti-TNFα o bien con LPS anti-pseudomonas 6F11 y, a continuación, fragmentos F(ab)'2 IgM anti-humanos fluorescentes.

Las células 8B9 se tiñeron bien con el mAb B5, en tanto que no se observó una unión significativa a la superficie de células con el mAb 6F11 de control. Igualmente, se observó la tinción de B5 con células THP-1. No obstante, en esta población se tiñeron pocas células y la tinción observada fue algo más obscura que la observada para las células 8B9. No obstante, casi 1/3 de las células de la población de THP-1 expresaron el TNFα de superficie de célula (csTNFα), tal como se detectó con el mAb B5. No está claro de si este nivel de tinción refleja algún tipo de regulación de expresión de csTNFα, o bien si es debido a variación clonal dentro de la línea de células.

5 La dependencia de la concentración de la unión de B5 a las superfices de las células, se examinó más detenidamente con las líneas de células del monocito THP-1 y del histiocito U937. Estas células se tiñeron con cantidades valoradas de anticuerpo B5 después de incubación o bien sin estímulo, o bien con LPS o bien con LPS+PMA durante 3 horas. En la Figura 11 se muestran los resultados. En todos los casos, la unión de B5 a las células dependió

10 de la dosis. Como aspecto interesante, se observó una mayor unión para ambas líneas de células cuando se pre-incubaron con LPS o LPS+PMA. Esto resultó especialmente cierto para la línea de células U937. Este incremento está de acuerdo con la capacidad conocida de estos agentes para inducir la secreción del TNF mediante líneas de células de monocitos. Mediante la estimulación, la unión de B5 a las células fue obvia, incluso a varios cientos de nanogramos/ml

15 de anticuerpo. La Tabla 2 muestra los resultados de dos experimentos, en los cuales se vigiló la unión del mAb B5 anti-TNFα. Las células se tiñeron con los anticuerpos primarios indicados y el anticuerpo secundario IgM anti-humano (µ-específico) marcado con fluoresceína. Se muestran los porcentajes de células que se tiñeron positivamente tal como se determinó mediante un

20 instrumento FACSCAN.

Tabla 2

Unión del mAb IgM humano B5 específico del TNFα a diversas líneas de células

Exp.

Línea Fenotipo % células teñidas positivamente anticuerpo primario

ninguno

B5 6F11

1

8B9-EBV 1A2-EBV hplbl EBVcpbl-EBV tonsil-EBV linfoblasto B humano linfoblasto B humano linfoblasto B humano Llinfoblasto B de chimpancé linfoblasto B humano 1,1 2,3 2,0 6,6 4,6 86,9 64,7 96,2 76,1 91,2 4,7 2,7 2,3 6,2 4,9

Jurkat

linfoma T humano 0,7 17,9 1,2

LBRM33

infoma T humano 3,1 72,7 3,8

DU4475

carcinoma de mama de ratón 10,2 52,4 9,89

SW1088

astrocitoma humano 11,2 15,3 10,9

U118MG

glioblastoma humano 6,2 7,3 6,2

U373

glioblastoma/astrocitoma humano 4,9 69,6 3,5

2

U937 Linfoma histiocístico humano 0,9 63,1 1,5

THP-1

Monocito humano 1,7 25,2 2,0

1A2-EBV

Linfoblasto B humano 2,2 98,4 2,9

8B9-EBV

Linfoblasto B humano 4,7 98,8 5,4

A375

Mieloma humano 1,7 8,5 2,5

Se ensayaron una diversidad de líneas de células, incluyendo las de origen linfocito B y T humano, carcinoma de pecho, astrocitoma, glioblastoma, monocito, histiocito, melanoma y monoblasto. Igualmente, se ensayó un linfoma de célula T de ratón. De las 15 líneas

5 ensayadas, únicamente el carcinoma de pecho U118MG no mostró unión mediante B5. Las otras mostraron un intervalo en los porcentajes de células dentro de cada población que expresaron csTNFα desde un valor bajo de aproximadamente el 8% para el melanoma A375 hasta por encima del 90% para células B transformadas de EBV. La clase apareada de mAb anti-LPS 6F11 se mostró incapaz de teñir ninguna de estas líneas de células. Esto y la línea de células negativa

10 indica que la tinción observada de B5 fue específica y no el resultado de una afinidad general para todas las células.

Carencia de unión de mAb anti-TNFα de ratón neutralizante a csTNFα

Los experimentos ELISA han mostrado la especificidad por el TNF del mAb B5 y 15 demostrado su unión a un epítopo sobre TNFα diferente del unido mediante el mAb de ratón neutralizante A10G10. A continuación, los presentes autores han examinado si el epítopo

reconocido por el mAb A10G10 ha sido expresado o no sobre la superficie de células a las cuales se une el B5. La Tabla 3 presenta los datos procedentes de cinco experimentos dirigidos a este tejido usando las líneas de células U937 y THP-1. Las células se tiñeron con los anticuerpos

5 primarios indicados y los anticuerpos secundarios IgG anti-ratón (γ-específico) o IgM anti-humano (µ-específico) marcados con fluoresceína. El asterisco (*) indica que se usaron los fragmentos F(ab)'2 del mAb A10G10. Se muestran los porcentajes de células teñidas positivamente tal como se determinó sobre un instrumento FACSCAN. No determinado, se indica mediante nd.

10 Tabla 3

Unión de mAbs anti-TNFα B5 humano y carencia de unión de A10G10 de ratón a TNF de superfice de célula sobre líneas de células monocito e histiocito no estimulados

Exp.

Línea celular % de células teñidas positivamente Anticuerpo primario

Ninguno

A10G10 mIgG1 ninguno B5 6F11

1 2 3 4 5

U937 THP-1 U937 THP-1 U937 THP-1 U937 THP-1 U937 0,3 0,9 0,8 3,1 1,6 2,4 2,8 4,7 1,5 0,4 2,6 2,4 2,7 1,9 3,1 2,9 6,0* 9,9* Nd Nd nd Nd Nd 1,6 2,8 6,7 2,3 2,9 2,3 2,7 2,7 1,6 1,7 2,2 4,6 1,2 15,1 24,8 99,1 34,7 35,7 17,7 20,2 56,3 61,4 2,7 2,8 2,8 3,4 1,8 3,4 2,7 Nd nd

En los cinco experimentos el mAb B5 se unió a cada línea de células. Por otra parte, el mAb A10G10 no se unió, en un grado significativo, en cuatro de los experimentos. En uno de los

15 cinco experimentos, se observó una pequeña cantidad de unión por el A10G10 a las células U937. Considerados en conjunto, estos datos sugieren que el TNFα está sobre la superficie de estas líneas de células, pero el epítopo reconocido por el A10G10 está únicamente raramente disponible para la unión por mAbs en ausencia de estimulación exógena.

Inducción por LPS de la expresión del TNFα de superfice de célula

El LPS es un agente comúnmente usado para inducir la secreción del TNFα por monocitos humanos. Los presentes autores han incubado células THP-1 y U937 con LPS para examinar si puede o no incrementarse la expresión de csTNFα. La Tabla 4 muestra los resulta

5 dos de tres experimentos. La estimulación se llevó a cabo mediante una incubación durante 3 ó 4 horas con 100 ng/ml de LPS. Las células se tiñeron con los anticuerpos primarios indicados y los anticuerpos secundarios IgG anti-ratón (γ-específico) o IgM anti-humano (µ-específico) marcados con fluoresceína. El asterisco (*) indica que se usaron los fragmentos F(ab)'2 del mAb A10G10. Se muestran los porcentajes de células teñidas positivamente tal como se determinó sobre un

10 instrumento FACSCAN. No determinado, se indica mediante nd.

Tabla 4

Análisis de la expresión de superficie de célula del TNFα después de inducción con lipopolisacárido

Exp.

Línea celular % de células teñidas positivamente Anticuerpo primario

LPS

Nnguno A10G10 mIgG1 ninguno B5 6F11

1

THP-1 - 3,1 2,7 Nd 2,7 34,7 3,4

+

6,9 16,5 Nd 3,7 43,8 3,6

U937

- 1,6 1,9 Nd 1,6 35,7 1,8

+

3,9 12,7 Nd 1,9 43,5 2,6

2

THP-1 - 2,4 3,1 1,6 1,7 17,7 3,4

+

3,1 8,3 2,2 3,0 29,6 3,2

U937

- 2,8 2,9 2,8 2,2 20,2 2,7

+

3,6 11,8 2,4 2,4 28,4 3,2

3

THP-1 - 4,7 6,0* 6,7 4,6 56,3 Nd

+

8,1 4,9* 5,4 5,0 65,9 Nd

U937

- 1,5 9,9* 2,3 1,2 61,4 Nd

+

1,0 13,1* 3,7 0,7 49,3 nd

En todos los tres experimentos, el LPS incrementó la cantidad de unión de B5 a las células THP-1. Esto fue cierto sólamente para las células A10G10 en dos de los tres experimentos. Por el contrario, en las células no inducidas, la estimulación mediante LPS condujo a la capacidad para ser teñidas por el mAb A10G10 tanto para la línea THP-1 como para la U937. No

5 obstante, los porcentajes de células en cualquier línea que expresa epítopos de TNFα reconocidos por A10G10 fueron pequeños, en comparación con los porcentajes observados con el mAb B5. Estos datos sugieren que el csTNFα puede incrementarse por incubación con LPS y que este incremento está relacionado con la adquisición de epítopos de TNFα reconocidos por anticuerpos neutralizantes.

10

Influencia de factores diferentes del LPS sobre la expresión de csTNFα

Durante el transcurso de los experimentos de los presentes autores, algunas de las líneas de células perdieron algo de expresión espontánea de csTNFα. Con el fin de examinar la influencia del suero bovino fetal (FBS) sobre la expresión de csTNFα, se cultivaron células

15 THP-1 durante cuatro días en lotes diferentes de sueros bovinos fetales y se analizaron para determinar la expresión del TNFα de célula de superficie. La Tabla 5 muestra los resultados típicos. Se muestran los porcentajes de células teñidas positivamente con los anticuerpos de tinción primarios indicados y los secundarios fluorescentes. Las concentraciones de endotoxina, en unidades de lisato de amebocito Limulus, para los lotes de FBS 1079, 1087, 2081 y 1026, son

20 0,125, 0,250, 0,060 y 0,750, respectivamente. Los análisis se llevaron a cabo con un instrumento FACSCAN Tabla 5

Influencia del suero bovino fetal sobre la expresión de la superficie de células del TNFα por células THP-1

1º Ab

2º Ab No. de lote FBS

1079

1087 2081 1026

% células teñidas positivamente

Ninguno Ninguno B5 6F11

Ninguno FL-anti-IgM FL-anti-IgM FL-anti-IgM 0,2 2,2 29,5 6,7 0,3 3,5 15,1 7,1 0,1 1,6 6,8 4,2 0,2 2,6 14,1 5,2

El lote de FBS tiene una gran influencia sobre la expresión del csTNFα por células THP-1. La diferencia en la expresión varía aproximadamente por un factor de cuatro, dependiendo de lote de FBS particular usado. La comparación de los niveles de endotoxina en estos diferentes lotes no reveló una correlación directa con los niveles del csTNFα. Estos datos sugieren que

5 otros factores diferentes del LPS pueden influir en la expresión del csTNFα.

Especificidad de la unión del mAb B5 al csTNFα La Tabla 6 presenta datos que confirman la especificidad de la unión del mAb B5 a las células THP-1. El mAb B5 se incubó a una concentración de 10 ug/ml con las concentracio

10 nes indicadas de inhibidores antes de la exposición a células THP-1 estimuladas con LPS. Su unión se detectó con anticuerpo IgM anti-humano F(ab)'2 conjugado con fluoresceína. En la tabla, LT es linfotoxina humana recombinante, ECD55 es el dominio de unión del TNFα extracelular recombinante del receptor p55 del TNF y A10G10 es el mAb IgG1 anti-TNFα de ratón neutralizan-te. Los análisis se llevaron a cabo con un instrumento FACSCAN.

15

Tabla 6

Especificidad de la unión del mAb anti-TNFα B5 a la superficie de células THP-1

Inhibidot

% células teñidas positivamente

ug/ml de inhibidor

0,0

0,03 0,30 3,0 30,0

TNFα LT Al10G10

44,1 44,1 44,1 43,2 39,8 39,6 35,9 40,0 40,09 22,2 40,0 44,4 15,8 29,7 41,9

La pre-incubación del mAb IgM B5 con TNFα inhibió su posterior unión de superficie de célula, de una manera dependiente de la dosis, mientras que la pre-incubación con linfotoxina no 20 lo hizo, excepto para un pequeño efecto a la concentración más alta. La carencia de inbición completa con las dosis altas del TNFα está de acuerdo con la baja afinidad previamente documentada de este mAb por el TNFα soluble. Como aspecto interesante, la pre-incubación del mAb B5 con A10G10 y la subsiguiente adición de ambos no disminuyó la unión de B5. Estos datos sugieren que el A10G10 neutralizante no compite por el mismo epítopo sobre el TNFα al cual se 25 une el mAb B5.

El B5 se une al csTNFα sobre células de bazo humano recientes

Las secciones anteriores establecen la unión de B5 al csTNFα sobre varias líneas

de células diferentes. Con el fin de determinar si el B5 se une o no a células no transformadas, se realizaron experimentos con esplenocitos humanos. Para analizar la expresión de la célula B del csTNFα por B5, los inventores usaron IgM B5 no conjugado, puesto que la fluoresceinación o biotinilación directa de este anticuerpo fue muy poco eficaz, o bien interfirió con su capacidad de unión al TNFα. Con el fin de detectar la unión de B5, se usaron fragmentos F(ab)'2 fluorescentes de anticuerpo IgM anti-humano. Puesto que las células B normales ya expresan sIgM como un receptor antígeno, no siempre fue posible detectar el csTNFα como un incremento en el porcentaje de células sIgM+. No obstante, los presentes autores pudieron detectar el csTNFα mediante la medición del incremento de la intensidad de tinción con el anti-IgM fluorescente cuando las células se incubaron con el mAb B5, en comparación con la incubación o bien con el mAb IgM 6F11 de control, o bien sin ningún anticuerpo.

La Figura 12 demuestra este desplazamiento en la intensidad de fluorescencia observado cuando el mAb B5 se une a células B. La Figura 12A muestra el histograma de fluorescencia de células teñidas con anticuerpo anti-IgM únicamente. La Figura 12B muestra un histograma de estas mismas células cuando reaccionaron primeramente con mAb B5 anti-TNFα y, posteriormente, se volvieron a teñir con anticuerpo anti-IgM fluorescente. La forma estadística más útil para medir este desplazamiento es el canal medio de la intensidad de fluorescencia, o simplemente el canal medio. En las tablas siguientes se presentan los números del canal medio cuando se examinaron células B.

La Tabla 7 presenta los datos procedentes de dos experimentos usando material de biopsia esplénico. La expresión del csTNFα sobre monocitos, células T y células B, se examinó mediante dos análisis de inmunofluorescencia de color, usando anti-LeuM3, anti-CD3 y anti-CD19 conjugados con ficoeritrina, respectivamente, conjuntamente con IgM anti-humano conjugado con fluoresceína. Los esplenocitos humanos recibidos un día después de la biopsia, se analizaron para determinar la expresión de la tinción de la superficie de la célula con los anticuerpos monoclonales indicados. Se controlaron linfocitos pequeños con el fin de determinar las propiedades de difusión transmitida y lateral y, a continuación, se analizaron. Las células T, las células B y los monocitos se tiñeron con anticuerpos anti-CD3, anti-CD19 y anti-LeuM3 conjugados con ficoeritrina, respectivamente. A continuación, se realizaron dos análisis de color sobre estas poblaciones usando IgM anti-humano F(ab)'2 marcado con fluoresceína y los mAbs IgM indicados. Los valores subrayados representan los que mostraron incrementos significativos en el porcentaje de células teñidas positivamente o mostraron más del doble de la intensidad de fluorescencia de la población de control apropiada. Los análisis se llevaron a cabo con un instrumento FACSCAN.

Tabla 7

Análisis de la expresión del TNFα de superficie de célula sobre esplenocitos humanos recientes

% Células teñidas positivamente (canal medio de intensidad de fluorecencia)

Células analizadas

1ºAb 2º Ab Ninguna anti-IgM Anti-IgM B5 Anti-IgM 7T1 Anti-IgM H5 Anti-IgM 6F11

Bazo #1:

linfocitos CD3+ LeuM3+

37,9 (86) 4,8 (21) 7,4 (125) 60,0 (246) 28,9 (19) 28,9 (76) 44,6 (94) 10,5 (29) 77,1 (106) 48,0 (95) 10,6 (22) 67,5 (124) 37,5 (88) 3,9 (24) 8,6 (84)

Bazo #2:

CD3+ CD19+ LeuM3+

8,8 (32) 57,5 (125) 7,7 (196) 88,3 (54) 97,5 (910) 49,8 (163) 25,5 (46) 71,2 (145) 66,8 (2272) 13,7 (47) 72,2 (138) 58,9 (1604) 7,1 (28) 55,7 (124) 9,1 (173)

En ambos experimentos, los monocitos constituyeron menos del 5% del total de las poblaciones de esplenocitos. De estos, una fracción significativa en ambos experimentos se tiñó

5 con el mAb B5 anti-TNFα. Por otra parte, estas células no se tiñeron con el mAb IgM humano 6F11 de control. Estos resultados sugieren que algunos monocitos esplénicos expresan el csTNFα.

Las células CD3+T mostraron una expresión variable del csTNFα. Aunque los porcentajes de células T positivas al csTNFα varía en estos experimentos, la tinción con el mAb

10 B5 fue mucho más débil que la observada para células B y monocitos. La intensidad de fluorescencia media para el csTNFα de célula T no alcanzó casi el doble de la observada para los controles de base. Estos resultados sugieren que una proporción variable de células T esplénicas expresan cantidades pequeñas de csTNFα. El análisis de la expresión de csTNFα en la célula B reveló una expresión

15 completamente fuerte de csTNFα. Tal como se observa en el bazo Z, el porcentaje de células B IgM+ se incrementó después de incubación con el mAb B5. Además, la intensidad de tinción de la población de células B enteras aproximadamente se triplicó. No se observó incremento en la tinción con el anticuerpo de control 6F11, lo cual indica la especificidad de la tinción del B5 sobre células B.

20 En estos análisis, se incluyeron los mAb 7T1 y H5 polireactivos. Además de la unión al TNFα, estos anticuerpos reaccionan con otros varios antígenos. Por ello, la especificidad de la unión de su superficie de célula es desconocida. Los presentes autores los han incluido, no solamente con fines comparativos puesto que ellos no se unen al TNF, sino además por que se encuentran disponibles pocos datos sobre la unión de mAbs polireactivos a células no fijadas. Estos anticuerpos parecen reaccionar con células T y con células B, pero reaccionan mucho mejor con superficies de monocitos. Además de unos incrementos significativos en los porcenta

5 jes de tinción de células B y T con estos anticuerpos, se tiñeron la mayoría de los monocitos en ambos experimentos. Estos datos sugieren que el mAb B5 anti-TNFα puede reaccionar con linfocitos esplénicos de linajes B y T, así como ser capaz de reconocer y unirse a monocitos esplénicos.

10 Unión de B5 a csTNFα sobre células de bazo humanas cultivadas Las células de bazo procedentes de un individuo examinadas en la Tabla 7 se cultivaron in vitro durante 3 días con diversos estímulos y, a continuación, se analizaron para determinar la unión al mAb B5. En la Tabla 8 se muestran los resultados. El cultivo de estas células dió como resultado la pérdida de monocitos, por lo cual, no se presentan los datos para

15 las células Leu-M3+. Las células se tiñeron para CD3 o CD19 con anticuerpos conjugados con ficoeritrina para dar lugar a dos análisis de color con IgM anti-humano F(ab)'2 y los mAbs IgM humanos indicados conjugados con fluoresceína. Todas las células se analizaron cuando no se incluyó activador en el cultivo, pero únicamente se analizaron las células activadas grandes procedentes de cultivos que incluyeron activadores. Los valores subrayados representan aquellos

20 que muestran incrementos significativos en el porcentaje de células teñidas positivamente o muestran más del doble de la intensidad de fluorescencia de la población de control apropiada. Los análisis se llevaron a cabo con un instrumento FACSCAN.

Tabla 8

Análisis de la expresión del TNFα de superficie de célula mediante linfocitos esplénicos humanos cultivados

% de células teñidas positivamente (canal de intensidad de fluorescencia medio)

Activador

Célula 1º AB 2º Ab -- -+ B5 + 7T1 + H5 + 6F11 +µ

Ninguno

CD3+ CD19+ 0,1(154) 1,0(22) 9,3(48) 85,1(54) 42,2(17) 99,4(294) 11,8(34) 91,8(56) 16,6(25) 96,1(96) 10,0(57) 86,8(52)

anti-δ-Dex más

IL-2 SEB SAC

CD19+ CD3+ CD19+ 4,0(76) 9,1(110) 3,4(42) 96,0(58) 24,4(102) 58,9(60) 100,0(272) 66,4(84) 100,0(452) 99,5(82) 44,8(82) 84,1(93) 99,9(224) 53,8(87) 94,3(183) 97,4(57) 26,1(106) 65,6(62

Las células cultivadas en medio fueron 55% de CD19+ (células B) y 22% de CD3+ (células T). De las células CD19+, el 85% sIgM+ con una intensidad de canal medio de 54. La tinción con mAb B5 incrementó esta intensidad hasta un canal medio de 294, casi seis veces

5 más. Este incremento no se observó con los mAbs IgM polireactivos o de control. Igualmente, se observaron los incrementos en los porcentajes de células CD3+ que se unieron al msb B5, aunque la intensidad de tinción fue baja. A pesar del hecho de que el anti-IgM solo reveló algo de tinción de célula T, la adición de 6F11 a estas células T no dió como resultado un incremento en la tinción de anti-IgM, lo cual muestra la especificidad de la tinción de B5 y sugiere que el mAb b5

10 no está unido a los receptores IgM expresados sobre células T activadas. Presumiblemente, estos receptores están anteriormente ocupados y cuentan para la tinción base observada con el anticuerpo secundario anti-IgM. La estimulación con el superantígeno Enterotoxina Estafilocócica B (SEB), que activa tanto las células T como B, dió como resultado que aproximadamente el 24% de las

15 células T se unieran al anticuerpo IgM anti-humano. Sin embargo, aproximadamente el 66% de las células T activadas con SEB se unieron al mAb B5 anti-TNFα. No se observó incremento en las células T sIgM+ con el mAb de control 6F11. Estos datos indican la inducción de la expresión del csTNFα cuando se activaron las células T. Las células B activadas tanto por anti-IgD-dextrano como por Staphylococcus

20 aureus Cowan Cepa I (SAC), ambos potentes mitógenos de la célula B, demostraron unión por mAb B5 anti-TNFα. La mayor intensidad de fluorescenia de tinción de B5 observada después de la inducción mediante SAC, sugiere un mayor nivel de superficie de célula B de expresión del TNFα que el observado sobre células B activadas mediante anti-IgD, o células B cultivadas en medio únicamente. Estos datos sugieren que ambas células T y células B humanas activadas

25 expresan epítopos del csTNFα reconocidos por el mAb B5.

Unión de mAb B5 a linfocitos de sangre periférica humanos y de chimpancé Con el fin de ampliar el descubrimiento de la expresión de linfocitos esplénicos humanos del csTNFα, se examinaron linfocitos de sangre periférica de origen humano y de

30 chimpancé. La Tabla 9 muestra los resultados obtenidos con sangre procedente de dos chimpancés y un humano. La sangre de chimpancé se recibió un día después de ser extraída, en tanto que la sangre humana fue reciente. El retraso en la recepción de la sangre parece dar

como resultado una pérdida de monocitos procedentes de la sangre de chimpancé. Las células mononucleares de sangre periférica se prepararon mediante separación sobre Ficoll y se tiñeron con anti-CD3, CD19 o LeuM3 derivado de PE. Para los chimpancés 171 y 203, menos de 2% y de 0,6% de las células fueron LeuM3+, respectivamente. Unos 20,2% de las células humanas 5 fueron LeuM3+. Las células T comprendieron el 62% y 54% de los linfocitos de chimpancé y el 68% de los linfocitos humanos. Los porcentajes de célula B fueron de 2,8 y 5,4 para los chimpancés y del 16,4% para el humano. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios IgM indicados y, a continuación, se tiñeron con el reactivo IgM anti-humano F(ab)'2 conjugado con fluoresceína. Los análisis se llevaron a cabo con un instrumento FACSCAN. Los valores subra

10 yados representan aquellos que muestran incrementos significativos en el porcentaje de células teñidas positivamente o muestran más del doble de la intensidad de fluorescencia de la población de control apropiada.

Tabla 9

15

Análisis de la expresión de célula T y célula B de sangre periférica de chimpancé y humana del TNFα de superficie de célula

% de células teñidas positivamente (canal de intensidad de fluorescencia medio)

Ab primario: anti-IgM:

-- -+ 6F11 + B5 + 7T1 + H5 +

Chimp 171

CD3+ CD19+

0,1(25) 0,4(10) 14,4 (40) 98,6(196) 14,8 (41) 98,4(196) 31,9 (23) 99,6(704) 18,2 (39) 98,9(230) 21,5 (28) 99,6(312)

Chimp 203

CD3+ CD19+

0,0(13) 0,6(13) 30,9 (26) 92,3 (70) 32,1 (27) 90,1 (79) 53,6 (27) 99,4(491) 31,2 (25) 95,1(101) 42,0 (24) 98,0(196)

Humano

CD3+ CD19+ LeuM3+

0,6(17) 1,3(37) 1,2(26) 1,7 (24) 83,5 (75) 5,6 (9) 3,3 (22) 84,6 (70) 4,2 (84) 17,1 (15) 99,4(316) 4,8(106) 2,8 (19) 91,5 (78) 35,3 (74) 4,5 (16) 96,1 (96) 30,4 (82)

Al contrario de los resultados previos con bazo humano, los monocitos humanos periféricos recientes no expresan el csTNFα tal como se observa mediante el mAb B5. No obstante, una fracción significativa de estas células se unió a los mAbs 7T1 y H5 polireactivos.

Las células T humanas recientes no expresan el IgM de superficie, en tanto que las células T de chimpancé extraídas un día antes sí lo hicieron. No obstante, las células T procedentes de ambas especies, expresaron cantidades modestas del csTNFα detectado por el mAb B5. Sin embargo, esta tinción de anti-TNFα fue muy bébil, y sugiere únicamente niveles bajos de csTNFα cuando se encontró presente. Las células T procedentes de ambas especies no fueron reconocidas por el 7T1 ni el H5 polireactivo.

Al contrario de las células T, las células B de sangre periférica procedentes tanto de chimpancés como de humano, mostraron altos niveles de csTNFα observados mediante mAb B5. Esta expresión fue mucho más intensa que la observada con las células T. Estos resultados sugieren que los monocitos de sangre periférica humana normal no expresan el csTNFα, en tanto que algunos linfocitos T y la mayoría de los linfocitos B procedentes de ambas especies expresan esta citocina de superficie de célula.

El mAb B5 anti-TNFα inhibe la secreción inducida por LPS del TNFα mediante células THP-1

Con el fin examinar si la unión del mAb B5 al csTNFα tiene o no alguna significación funcional, se estimuló la línea de células de monocito humana THP-1 con LPS en presencia de B5 u otros mAbs IgM humanos. Se ensayó la secreción del TNFα biológicamente activo midiendo la actividad citotóxica de los sobrenadantes sobre la línea de células WEHI 164 sensible al TNFα. En la Tabla 10 se muestran los resultados de dos de cuatro de dichos experimentos. Las células THP-1 se estimularon durante 4 horas con 100 ng/ml de LPS de E. coli en presencia de 40 ug/ml de los mAbs IgM humanos no neutralizantes del TNF indicados. A continuación, los sobrenadantes procedentes de estas incubaciones se ensayaron para determinar la citotoxicidad frente a la línea de células WEHI 164 sensible al TNFα. La totalidad de la citotoxicidad del sobrenadante dependió de la concentración y se neutralizó mediante mAb anti-TNFα A10G10, lo cual indica que la citotoxicidad fue debida al TNFα. Las concentraciones del TNFα secretado se determinaron mediante comparación con una curva estándar.

Tabla 10

Inhibición de la secreción del TNFα inducida por LPS mediante mAb B5

Exp.

mAb ug/ml pg/ml TNFα % inhibición

1

Ninguno 6F11 7T1 B5 " " " 0 40 40 40 20 10 5 1003 990 976 102 409 812 962 0 1 3 90 59 19 4

2

Ninguno 6F11 B5 B5 " " 0 40 40 20 10 5 2057 1992 143 783 1271 2276 0 3 93 62 38 -10

Las células HTP-1 estimuladas secretaron TNFα activo y la totalidad de esta actividad citotóxica se inhibió mediante la inclusión de A10G10 en el ensayo de citotoxicidad (datos no

5 mostrados). Los experimentos previos incluyendo el mAb B5 en el ensayo de citotoxicidad, han mostrado que el B5 no neutraliza al TNFα (Figura 9). La Tabla 10 muestra que el co-cultivo de las células THP-1 con mAb B5 inhibe la secreción del TNFα inducida por LPS. Estos datos sugieren que la interacción del mAb B5 con el csTNFα puede inhibir la secreción del TNF inducida por LPS.

10

EXPOSICION

Hasta donde alcanza el conocimiento de los presentes inventores, este es el primer informe de un auto-anticuerpo humano monoclonal específico para el TNFα humano y de ratón. No está claro si el origen del donante seropositivo al CMV del mAb B5 es o no significativo.

15 El anticuerpo es claramente diferente de los mAbs de ratón que los presentes inventores han generado para el TNFα, todos los cuales son neutralizantes, tal como ha sido mostrado previamente por Galloway y otros (citado anteriormente). Tres líneas de evidencia sugieren que el mAb B5 reconoce un epítopo diferente de los reconocidos por los mAbs de ratón descritos. En primer lugar, no existe competencia entre

los mAbs humano y de ratón por la unión a placas recubiertas con TNF. En segundo lugar, el TNF unido al mAb humano puede ser reconocido por los mAbs de ratón, y vice versa. Finalmente, el mAb B5 no neutraliza el rhTNFα en tanto que los mAbs de ratón si lo hacen. Se podría argüir que el TNFα es un trímero y, como tal, el TNFα unido a los mAbs de ratón neutralizantes sujetos a las placas pueden presentar aún un epítopo idéntico para ser reconocido por el mAb B5. La carencia de competencia entre los mAbs de ratón y del mAb B5 por el TNFα unido a la placa es un argumento fuerte frente esta posibilidad. Los datos de competencia, en combinación con la carencia de actividad neutralizante del mAb B5, apoyan la interpretación del reconocimiento del epítopo distinto por los mAbs de ratón y humano. Los efectos biológicos del TNFα, especialmente su capacidad para promover la secreción de Ig, puede excluir la generación de un auto-anticuerpo anti-TNFα neutralizante de alta afinidad mediante las técnicas usadas. Esta capacidad puede explicar, igualmente, las especificidades de los epítopos diferentes del mAb B5 y de los tres mAbs de ratón neutralizantes.

La base de la molécula del TNFα trímera en forma de campana, que contiene la terminación amino opuesta a la terminación carboxi, es la región de la molécula que se une a los receptores del TNF (M. J. Eck y otros, "La estructura del factor α de necrosis de tumor a una resolución de 2,6Å. Implicaciones para la unión del receptor", J. Biol. Chem., vol. 264, págs. 17595-605, (1989; y A. Corti y otros, "Regiones antígenas del factor alfa de necrosis de tumor y sus relaciones topográficas con los dominios estructural/funcional", Molec. Immunol., vol. 29, págs. 471-9, (1992)). Puesto que los mAbs de ratón usados en este informe neutralizan al TNFα, y se ha encontrado que bloquean la unión del TNFα a sus receptores, es verosimil que un epítopo en la base del trímero sea reconocido por estos anticuerpos. A partir de los datos presentados en este informe, se podría especular que el mAb B5 reconoce una región de la molécula del TNFα más próxima a la "parte superior" del trímero.

La débil unión del mAb B5 al TNFα soluble está de acuerdo con una baja constante de unión del mAb por el ligando. No obstante, la valencia de este mAb IgM puede pesar más que este defecto, de forma tal que el B5 puede unirse al TNFα en fase sólida tan bien como, o mejor que, los mAbs anti-TNFα de ratón neutralizantes de alta afinidad ensayados. Aparentemente, la unión multipunto permite al mAb B5 adherirse más fuertemente al TNFα cuando se encuentra disponible una densidad de antígeno suficiente.

Aunque el B5 parece unirse con baja afinidad, los presentes autores han mostrado que se une específicamente al TNFα y deja de unirse a cualquier otro de los antígenos ensayados. Esto contrasta con la unión observada de otros dos mAbs polireactivos de control. Por ello, el B5 parece ser monoespecífico y no es polireactivo. El B5 parece unirse específicamente a un epítopo, lo más probablemente un epítopo lineal, compartido por el TNFα de ratón y humano.

Estas propiedades clasifican al B5 como un auto-anticuerpo y le distinguen de otros mAbs anteriormente descritos.

El auto-anticuerpo B5 humano se une al TNFα de superficie sobre una amplia clase de líneas de células humanas y células linfoides. No es sorprendente que reconozca al TNFα de chimpancé, puesto que no existe diferencia en las secuencias de aminoácidos del TNFα procedente del chimpancé y humano. Igualmente, los presentes inventores han mostrado que el B5 reconoce el TNFα de ratón, el cual es un 80% aproximadamente idéntico al TNFα humano (D. Pennica y otros, "Clonación y expresión en Escherichia coli del cDNA para el factor de necrosis de tumor múrido", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 82, págs. 6060-4, (1985)). Por ello, no es sorprendente que el B5 reconozca al csTNFα de ratón.

Otros autores han descrito ciertamente la producción del TNF mediante células B humanas (M. Jäätelä, "Biología de la enfermedad. Actividades y mecanismos biológicos de la acción del factor-α de necrosis de tumor/catequina", Lab. Invest., vol. 64, págs. 724-42, (1991); y Smeland y otros, "La interleuquina 4 induce la producción selectiva de interleuquina 6 a partir de linfocitos B humanos naturales", J. Exp. Med., vol. 170, págs. 1463-68, (1989), células T (S.-S.J. Sung y otros, "Producción de factor de necrosis de tumor/catequina mediante líneas de células T humanas y linfocitos T de sangre periférica estimulada por miristato acetato de forbol y anticuerpo anti-CD3", J. Exp. Med., vol. 167, pág. 937, (1988), monocitos (Beutler y otros, "La biología del TNF-α/catequina: mediador primario de la respuesta del huésped", Ann. Rev. Immunol., vol. 7, págs. 625-55, (1989), líneas de células B (S.-S.J. Sung y otros, "Producción de factor de necrosis de tumor/catequina mediante líneas de células T humanas y linfocitos T de sangre periférica estimulada por miristato acetato de forbol y anticuerpo anti-CD3", J. Exp. Med., vol. 167, pág. 937, (1988); y G. J. Jochems y otros, "Heterogeneidad tanto en la producción de citocina como de la respuesta de un panel de líneas de células B transformadas del virus Epstein-Barr monoclonales", Hum. Antibod. Hybridomas, vol. 2, págs. 57-64, (1991), astrocitos (A. P. Lieberman y otros, "Producción del factor de necrosis de tumor y otras citocinas mediante astrocitos estimulados con lipopolisacárido o un virus neurotrópico", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 86, págs. 634852, (1989); y I. Y. Chung y otros, "Producción del factor alfa de necrosis de tumor mediante astrocitos: inducción mediante polisacárido, IFN-gamma y IL-1 beta", J. Immunol., vol. 144, págs. 2999-3007, (1990); y K. Selmaj y otros, "Identificación de linfotoxina y factor de necrosis de tumor en lesiones de escleroris múltiple", J. Clin. Invest., vol. 87, págs. 949-54, (1991), así como algunas líneas de células resistentes al TNF (B. Y. Rubin y otros, "Células no hematopoiéticas seleccionadas por su resistencia al factor de necrosis de tumor producen factor de necrosis de tumor", J. Exp. Med., vol. 164, págs. 1350-5, (1986)). Los presentes inventores han extendido estos descubrimientos para incluir al menos un carcinoma de pecho metastático, el DU4475, un melanoma, el A375, y el astracitoma/glioblastoma U373. Igualmente, los presentes autores han demostrado la expresión del csTNFα sobre células linfoides esplénicas humanas. Esto es algo sorprendente, puesto que la demostración previa del csTNFα por otros autores tiende a usar células activadas.

Aunque los presentes inventores han examinado linfocitos pequeños, tal como se determinó mediante las propiedades de difusión luminosa, es posible que muchas de estas células estuvieran parcialmente activadas o en una fase de diferenciación, en la cual pudieran expresar esta molécula de superficie de célula. Los pequeños porcentajes de linfocitos T y monocitos procedentes de sangre periférica humana que expresan el cdTNFα, están de acuerdo con el fenotipo de inactivación de estas células. En cualquier caso, la amplitud de la expresión del csTNFα sugiere que tiene un papel importante en la superficie de muchas células.

Otros autores han mostrado que el TNFα puede existir tanto en forma de una proteína de transmembrana integral, como en forma de una proteína madura unida a su receptor sobre las superficies de las células (B. Luettig y otros, "Evidencia de la existencia de dos formas de factor de necrosis de tumor de membrana: una proteína integral y una molécula unida a su receptor", J. Immunol., vol. 143, págs. 4034-38, (1989)). Algunas observaciones sugieren que el mAb B5 reconoce la proteína de transmembrana integral. La unión del B5 se incrementó cuando las células se activaron con LPS o PMA. Ambos agentes, pero especialmente PMA, regulan a la baja la expresión del receptor del TNF sobre una diversidad de tipos de células (A. H. Ding y otros, "Los macrófagos internalizan rápidamente sus receptores del factor de necrosis de tumor en respuesta a lipopolisacárido bacteriano", J. Biol. Chem., vol. 264, págs. 3924-9, (1989); y B. A. Aggarwal y otros, "Efecto de los ésteres de forbol sobre la regulación a la baja y la redistribución de los receptores de superficie de célula para el factor α de necrosis de tumor", J. Biol. Chem., vol. 262, págs. 16450-5, (1987)).

El B5 se une a líneas de células no estimuladas, en tanto que las líneas de células necesitan normalmente ser inducidas para secretar el TNF. Por ello, sería de esperar que las líneas de células no estimuladas mostraran poca cantidad de TNF unido al receptor. Los presentes autores han mostrado que la unión del B5 a superficies de células fue inhibida mediante preincubación con TNFα, pero no con mAb anti-TNFα A10G10. Esto demuestra la especificidad del anticuerpo B5.

El TNFß se une a los mismos receptores que el TNFα y, por ello, podría competir con algún receptor unido al TNFα sobre superficies de células. Los datos en la Tabla 6 con altas dosis de TNFß sugieren que esto se produjo, y fue detectado mediante una disminución en la tinción del B5. Por estas razones, es probable que el B5 reconozca la forma de transmembrana de 26 kd del TNFα y, posiblemente, el TNF unido al receptor.

Un resultado desconcertante de estos estudios, es que el mAb B5 se une al csTNFα en muchas situaciones, en las cuales, la unión del A10G10 está o bien ausente, o bien es menor que la observada con el B5. Está claro que estos dos anticuerpos distinguen epítopos no superpuestos. Puesto que el A10G10 neutraliza la citotoxicidad del TNFα y previene la unión del TNFα a su receptor, este mAb de ratón probablemente se une al TNFα cerca del dominio de unión del receptor.

Otros autores han mostrado que los mAbs que se unen a la terminación amino 15,

o a aminoácidos similares, bloquean la citotoxicidad del TNFα (S. H. Socher y otros, "Los anticuerpos contra los aminoácidos 1-15 del factor de necrosis de tumor bloquean su unión al receptor de superficie de célula", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, págs. 8829-33, (1987)). Por ello, es posible que el A10G10 se una a alguno de los aminoácidos N-terminales que están más próximos a la membrana sobre la forma de transmembrana del TNFα. Esta región puede no ser accesible al A10G10 para su unión, aunque la propia molécula TNF esté presente y pueda ser reconocida por el mAb B5.

Los experimentos de transferencia Western sugieren que el A10G10 no reconoce los monómeros del TNFα y, probablemente, reconoce un epítopo conformacional (datos no mostrados). Si la transmembrana del TNFα es fundamentalmente monómera, los epítopos reconocidos por el A10G10 puede que no se encuentran presentes. Los experimentos adicionales pueden ayudar a decidir entre estas y otras posibilidades.

Como aspecto interesante, los presentes inventores observaron la unión de la superficie de célula del A10G10 cuando las células se activaron con LPS. Esta indución provoca la secreción del trímero del TNFα biológicamente activo, el cual, a continuación, puede unirse a los receptores remanentes del TNF. Puesto que el TNFα trímero es multivalente, podría unirse a algunos receptores de una forma tal que permitiera que uno o incluso dos dominios de unión del receptor remanente permanecieran libres. Esta forma del csTNFα podría ser la que es reconocida por el A10G10. Realmente, otros autores han mostrado que la incubación de monocitos humanos fijados a paraformaldehído no activados con el TNFα, da como resultado la unión del TNFα a sus receptores y vuelve citotóxicos a estos monocitos. Además, esta citotoxicidad se anula mediante la neutralización de los anticuerpos anti-TNF (A. Nii y otros, "La incubación de monocitos de sangre humana con el factor alfa de necrosis de tumor conduce a la lisis células de tumor sensibles pero no resistentes al factor de necrosis de tumor", Lymphokine Res., vol. 9, págs. 113-24, (1990)).

Un modelo que explica muchos de los datos, es que los monómeros del TNFα de transmembrana son reconocidos por el mAb B5. Los presentes autores han mostrado el reconocimiento del monómero soluble por B5. Los monómeros del TNFα de superficie de célula

podrían mostrar una conformación total diferente de la del TNF trímero. Podrían además exponer los dominios de unión del receptor del TNF y, de esta forma, ser capaces de mediar en la citotoxicidad a través del contacto de la célula. Las células que expresan muchos monómeros, podrían, de esta forma, provocar la reticulación del receptor del TNF sobre células diana. Una 5 señal de activación podría provocar la polimerización de los monómeros del TNF en la membrana de la célula, dando lugar a un cambio conformacional, el cual, a su vez, podría exponer un sitio de escisión proteolítico que condujera a la liberación del TNFα trímero biológicamente activo, maduro. La liberación podría ser seguida de la interacción con los receptores del TNF y permitir la unión del A10G10, tal como se ha sugerido anteriormente. Aparentemente, el B5 se une a los 10 dominios del TNF distal de la membrana y, al hacerlo, puede interferir o bien con la polimerización del csTNFα, o con un cambio conformacional subsiguiente, o bien con ambos. Probablemente, el B5 no se une al sitio de escisión proteolítico, puesto que se une a la molécula trímera madura. Este modelo explicaría los resultados de tinción de la superficie de la célula, e igualmente explicaría la inhibición observada de la secreción del TNF después de activación con LPS de

15 las células THP-1. Es preciso señalar que este modelo permite un papel del dominio citoplásmico en la polimerización del csTNFα. Esto es únicamente un modelo de trabajo y, como tal, es indudablemente hipotético.

Claims (3)

1. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal humano

que se une al factor alfa de necrosis tumoral humano y que es capaz de inhibir la secreción del 5 factor alfa de necrosistumoral humano inducido por LPS por las células monocitos humanos.

2.

La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo del tipo IgM o IgG.

3.

La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es adecuado para administración intravenosa.

10 4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo se expresa por la línea celular depositada en la ATCC con la designación CRL 11306.