ES2149776T5 - Modulacion, inducida por un morfogeno, de la respuesta inflamatoria. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODO Y A COMPOSICIONES PARA MITIGAR LOS EFECTOS DESTRUCTIVOS EN LOS TEJIDOS ASOCIADOS A LA RESPUESTA INFLAMATORIA A UN DAÑO EN UN TEJIDO DE UN MAMIFERO. LOS METODO Y COMPOSICIONES CONSISTEN EN LA ADMINISTRACION DE UNA CONCENTRACION TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UN MORFOGENO O DE UN AGENTE ESTIMULADOR DE MORFOGENES QUE MITIGUE LA DESTRUCCION DE LOS TEJIDOS MEDIADA POR UNA CELULA INMUNE.

Description

Modulación, inducida por un morfógeno, de la respuesta inflamatoria.

Campo de la invención

La presente invención encuentra en general utilidad en un método para modular la respuesta inflamatoria inducida en un mamífero después de una lesión en un tejido. Por ejemplo, esta invención encuentra utilidad en un método para aliviar la destrucción de tejido mediada por inmunocitos y asociada con la respuesta inflamatoria.

Fundamentos de la invención

La respuesta inflamatoria del cuerpo a una lesión en un tejido puede causar seria destrucción del tejido, dando lugar a la pérdida de función del tejido. El daño en las células como resultado de los efectos de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, por destrucción del tejido mediada por inmunocitos, ha sido implicado como la causa de una reducción o una pérdida de la función del tejido en enfermedades de las articulaciones (por ejemplo, artritis reumatoide y osteoartritis) y de varios órganos, entre ellos los riñones, el páncreas, la piel, los pulmones y el corazón. Por ejemplo, según se cree, la nefritis glomerular, la diabetes, las enfermedades inflamatorias del intestino, las enfermedades vasculares como la aterosclerosis y la vasculitis, y las enfermedades de la piel como la psoriasis y la dermatitis, pueden ser el resultado en gran parte de una reacción inflamatoria aguda no deseada y de fibrosis. Cierto número de estas enfermedades, entre ellas la artritis, la psoriasis y las enfermedades inflamatorias del intestino, son consideradas enfermedades inflamatorias crónicas. El tejido dañado suele ser reemplazado también por tejido fibrótico, por ejemplo tejido cicatrizante, el cual reduce aun más la función del tejido. Se cree que el rechazo de un injerto u órgano trasplantado también es causado principalmente por la acción del sistema de respuesta inmunitaria/inflamatoria del cuerpo.

Tras una lesión o agresión inicial en un tejido, suele producirse la destrucción del tejido mediada por los inmunocitos. El daño secundario, causado por la respuesta inflamatoria, suele ser la causa de un daño importante en el tejido. Entre los factores sospechosos de mediar en estos efectos dañinos están los asociados con la modulación de la respuesta inflamatoria del cuerpo que se produce después de una lesión en el tejido, por ejemplo citoquinas como la interleuquina 1 (IL 1) y el factor de necrosis humoral (TNF), y los radicales libres derivados del oxígeno como los aniones de superóxido. Estos agentes humorales son producidos por leucocitos neutrófilos adherentes o por células endoteliales y han sido identificados en zonas isquémicas después de una reperfusión. Además, las concentraciones de TNF aumentan en seres humanos después de un infarto de miocardio.

Hay una gama de enfermedades pulmonares que se caracterizan por inflamación de las vías respiratorias, entre ellas la bronquitis crónica, el enfisema, la fibrosis pulmonar idiopática y el asma. Otro tipo de trastornos inflamatorios relacionados con los pulmones, es el de las enfermedades inflamatorias caracterizadas por una respuesta inflamatoria aguda diseminada y generalizada, como el síndrome disneico del adulto. Otra disfunción asociada con la respuesta inflamatoria es la generada en respuesta a una lesión causada por hiperoxia, por ejemplo, por una exposición prolongada a concentraciones letalmente elevadas de oxígeno (95-100% O_{2}). Del mismo modo, un riego sanguíneo reducido en un tejido (y, por consiguiente, un nivel reducido o una falta completa de oxígeno en el tejido), como se describe más abajo, puede inducir también una lesión primaria en el tejido que estimule la respuesta inflamatoria.

Es bien conocido que las células mamíferas privadas de oxígeno sufren daño. De hecho, la interrupción de riego sanguíneo, ya sea parcial (hipoxia) o completa (isquemia) y las consiguientes respuestas inflamatorias tal vez sean la causa más importante de necrosis coagulativa o muerte celular en enfermedades humanas. Las complicaciones de la aterosclerosis, por ejemplo, son generalmente el resultado de una lesión celular isquémica en cerebro, corazón, intestino delgado, riñones y extremidades inferiores. Las células altamente diferenciadas, como las células del túbulo convoluto proximal del riñón, los miocitos cardíacos, y las neuronas del sistema nervioso central, dependen todas de la respiración aerobia para producir ATP, la energía necesaria para llevar a cabo sus respectivas funciones especializadas. Cuando la isquemia limita el aporte de oxígeno y se agota el ATP, las células afectadas pueden sufrir una lesión irreversible. Las respuestas inflamatorias consecuentes a esta lesión inicial producen una agresión adicional al tejido afectado. Ejemplos de esta hipoxia o isquemia son la pérdida parcial o total del riego sanguíneo en el cuerpo por completo, en un órgano dentro del cuerpo, o en una región dentro de un órgano, tal como ocurre en un paro cardíaco, una embolia pulmonar, la oclusión de una arteria renal, la oclusión coronaria o una embolia cerebral oclusiva.

Se cree que el daño en el tejido asociado con una lesión por isquemia y reperfusión se compone del daño celular inicial inducido por la privación de oxígeno en las células y la posterior restablecimiento del riego en ellas, así como del daño causado por la respuesta del cuerpo a este daño inicial. Se cree que una lesión por reperfusión puede ser la causa de una disfunción en el endotelio de la vasculatura así como de una lesión en el tejido circundante. En la fibrosis pulmonar idiopática, por ejemplo, se acumula tejido cicatrizante en la pared del tejido pulmonar, inhibiendo la elasticidad del tejido. Se cree que el daño en el tejido asociado con una lesión hiperóxica sigue un mecanismo similar, donde el daño inicial es mediado primordialmente por la presencia de metabolitos tóxicos de oxígeno seguida por una respuesta inflamatoria a dicha lesión inicial.

Del mismo modo, los tejidos y órganos para trasplantes también están expuestos a los efectos de destrucción de los tejidos asociados con la respuesta inflamatoria del cuerpo del receptor después del trasplante. Actualmente se cree que la respuesta destructiva inicial es debida en gran parte a la lesión por reperfusión en el órgano trasplantado después de que éste haya sido trasplantado al receptor del órgano.

Por consiguiente, el éxito de un trasplante de órgano o tejido depende en gran parte de la conservación de la actividad del tejido (por ejemplo, la viabilidad del tejido u órgano) en el momento de la extirpación del órgano, durante el almacenamiento del órgano extirpado, y en el momento del trasplante. Hasta la fecha, la conservación de órganos como los pulmones, el páncreas, el corazón y el hígado sigue siendo un obstáculo importante para el éxito del trasplante de estos órganos. La Patente de los EE.UU. Nº 4.952.409 describe un liposoma que contiene una superóxido-dismutasa para inhibir la lesión causada por reperfusión. La Patente de los EE.UU. Nº 5.002.965 describe el uso de gincólidos, antagonistas conocidos del factor de activación plaquetaria, para inhibir la lesión causada por reperfusión. Según se describe, estos dos tipos de factores actúan principalmente inhibiendo la liberación y/o inhibiendo el efecto dañino de los radicales libres de oxígeno. También han sido expedidas cierto número de patentes sobre el uso de inmunosupresores para inhibir el rechazo de injertos. Una lista representativa incluye las Patentes de los EE.UU. Nº 5.104.858, 5.008.246, y 5.068.323. Un grave problema con muchos inmunosupresores es su bajo índice terapéutico, lo cual requiere la administración de altas dosis que pueden ir acompañadas de importantes efectos secundarios tóxicos.

La artritis reumatoide y la osteoartritis son enfermedades prevalentes caracterizadas por una inflamación crónica de la membrana sinovial que cubre la articulación afectada. Una grave consecuencia de la enfermedad inflamatoria crónica de las articulaciones (por ejemplo, artritis reumatoide) y de la artritis degenerativa (por ejemplo, osteoartritis) es la pérdida de función en las articulaciones afectadas. Esta pérdida de función es debida principalmente a la destrucción de los principales componentes estructurales de la articulación, cartílago y hueso, y a la subsiguiente pérdida de la correcta anatomía de la articulación. Como consecuencia de la enfermedad crónica, se produce una destrucción de la articulación que puede conducir a un daño permanente e irreversible en la articulación y a la pérdida de función. Los métodos actuales de tratamiento para casos severos de artritis reumatoide típicamente incluyen la extirpación de la membrana sinovial, por ejemplo una sinovectomía. La sinovectomía quirúrgica tiene muchas limitaciones, entre ellas el riesgo de la intervención quirúrgica en sí, y el hecho de que el cirujano no suele poder extirpar por completo la membrana enferma. Por lo general, el tejido enfermo que queda se regenera, causando los mismos síntomas que la cirugía trató de aliviar.

La psoriasis es una enfermedad crónica, recurrente, caracterizada por escamas y de etiología desconocida, que se manifiesta como una inflamación crónica de la piel. Las erupciones eritematosas, a menudo en pápulas o placas, y usualmente manifestándose con unas escamas de color blanco plateado, pueden manifestarse en cualquier parte de la piel, pero suelen aparecer en cuero cabelludo, codos, rodillas y zona lumbar de la espalda. Le enfermedad ocurre normalmente en adultos, pero los niños también pueden verse afectados. Los pacientes que sufren de psoriasis tienen una incidencia mucho mas alta de artritis (artritis psoriática), y una exfoliación generalizada y hasta la muerte pueden amenazar a los individuos afectados.

Los métodos actuales de tratamiento incluyen la aplicación tópica o intralesional de corticosteroides, la administración tópica de agentes queratolíticos, y el uso de brea y luz UV en las áreas afectadas. No existe una terapia ideal, y es poco frecuente que el paciente no sea tratado con varias alternativas durante el curso de recaída y remisión de la enfermedad. Aunque un tratamiento sistemático puede inducir una resolución rápida de las lesiones de psoriasis, la supresión a menudo requiere un aumento progresivo de dosis, a veces con efectos secundarios tóxicos, y una terapia de disminución puede ocasionar fenómenos de rebote con la extensión de las lesiones, posiblemente hasta exfoliación.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) incluye una clase de trastornos clínicos de la mucosa gastrointestinal caracterizados por una inflamación crónica y una ulceración severa de la mucosa. Los dos trastornos principales en esta clasificación son la colitis ulcerosa y la enteritis regional (enfermedad de Crohn). Al igual que la mucositis oral, los trastornos clasificados bajo EII están asociados con una severa ulceración mucosal (la cual frecuentemente penetra en la pared del intestino y forma estrechamientos y fístulas), una severa inflamación mucosal y submucosal y edema, y fibrosis (por ejemplo, una formación de tejido cicratizante que interfiere con la función protectora del ácido de la pared gastrointestinal). Otros tipos de EII incluyen la ileítis regional y la proctitis. Clínicamente, los pacientes con EII fulminante pueden enfermar de gravedad con diarrea masiva, pérdida de sangre, deshidratación, pérdida de peso y fiebre. El pronóstico de la enfermedad no es favorable y frecuentemente se requiere una resección del tejido enfermo.

Esta invención encuentra su aplicación en un método para proteger el tejido mamífero, particularmente el tejido humano, del daño asociado con la respuesta inflamatoria que sigue a una lesión en el tejido. La reacción inflamatoria puede darse en respuesta a una lesión o agresión inicial en el tejido. La lesión original puede tener una causa química, mecánica, biológica, o immunológica. Otra aplicación se encuentra en métodos y composiciones para proteger el tejido contra los efectos de destrucción asociados con enfermedades inflamatorias crónicas, entre ellas artritis (por ejemplo, artritis reumatoide u osteoartritis), artritis psoriática, psoriasis y dermatitis, enfermedad inflamatoria intestinal y otras enfermedades autoinmunitarias. Otra aplicación más se encuentra en métodos y composiciones para intensificar la viabilidad de tejidos y órganos mamíferos para trasplantes, como la protección de órganos trasplantados contra la destrucción de tejido mediada por los inmunocitos, como el daño en tejidos asociado con lesiones de isquemia y reperfusión. Este daño en el tejido puede ocurrir durante la extirpación y el transporte del tejido u órgano donado, así como tras el restablecimiento del riego sanguíneo en el receptor después del trasplante del órgano o tejido.

La invención encuentra también una aplicación en un método para aliviar el daño en el tejido asociado con lesiones por isquemia y reperfusión en un mamífero después de una privación de oxígeno en un tejido en el mamífero. Otras aplicaciones incluyen proporcionar un método para aliviar el daño en el tejido asociado con una lesión por isquemia y reperfusión en un ser humano que ha padecido hipoxia o isquemia después de un paro cardíaco, embolia pulmonar, oclusión de arteria renal, oclusión coronaria o embolia cerebral oclusiva. Otra aplicación más es proporcionar un método para aliviar el daño en el tejido asociado con lesiones relacionadas con hiperoxia, mas específicamente, por ejemplo, concentraciones letalmente elevadas de oxígeno.

Otra aplicación adicional de esta invención es el proporcionar un método para modular las respuestas inflamatorias en general, particularmente las inducidas en un ser humano después de un daño en un tejido.

Estos y otros objetos y características de la invención se harán aparentes a través de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones que siguen a continuación.

Kurvilla et al. (1991) 88 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2918-2921, Lefer et al. (1990), 249 Science 61-64; Shepard et al., EP 0.269.408; Nathan et al., W090/00900; y Bentz et al., la Patente de los EE.UU. 4.971.952 describen estudios que analizan si TGF-\beta puede mitigar tipos específicos de daños por isquemia y reperfusión o inflamatorios en células o tejidos de mamíferos. El TGF-\beta no es un miembro de la clase de proteínas definidas aquí como morfógenos.

Oppermann et al., WO91/05802; Kuberasampath et al., WO89/09787; Oppermann et al., WO89/09788 y Oppermann et al., WO92/07073 muestran que OP-1 y las proteínas relacionadas pueden utilizarse en la estimulación de la regeneración específica de tejido en el cartílago y tejido óseo de mamíferos. En particular, estas referencias muestran que OP-1, cuando se adsorbe en una matriz de soporte adecuada, induce la cascada de desarrollo de los eventos moleculares y celulares que culminan en la morfogénesis ósea endocondrial. Las preparaciones de OP-1 biológicamente activa muestran que, como mucho, es moderadamente soluble en disoluciones compatibles fisiológicamente. Dispositivos de matrices cargadas con OP-1 se divulgan de este modo muy útiles para inducir la morfogénesis local de hueso y/o cartílago.

Cohen et al., W092/15323 muestra que OP-1 induce la morfogénesis específica de tejido en diversos tejidos del cuerpo de mamíferos, y este morfógeno puede utilizarse en la sustitución o reparación de tejidos dañados.

Compendio de la invención

El presente invento está definido en las reivindicaciones. Encuentra utilidad en un método para aliviar los efectos de destrucción hística asociados con la activación de las respuestas inflamatorias después de una lesión en el tejido. El método comprende la etapa de aportar al tejido afectado una concentración terapéuticamente efectiva de una proteína morfogénica ("morfógeno", como se define en este documento) tras una lesión hística o con antelación a la lesión hística, y suficiente para inhibir o reducir considerablemente los efectos de destrucción hística de la respuesta inflamatoria.

También se describen en este documento como composiciones y métodos de tratamiento terapéutico que comprenden la etapa de administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína morfogénica ("morfógeno"), como se define en este documento, tras una lesión hística o con antelación a dicha lesión hística, durante un tiempo y a una concentración suficientes para inhibir los efectos de destrucción hística asociados con la respuesta inflamatoria del cuerpo, incluyéndose la reparación del tejido dañado y/o la inhibición de daño adicional.

Como se indica en este documento, la expresión "lesión por isquemia y reperfusión" se refiere al daño inicial asociado con la privación de oxígeno en una célula y el daño subsiguiente asociado con la respuesta inflamatoria cuando se restablece el suministro de oxígeno a la célula. Como se indica en este documento, la expresión "lesión inducida por hiperoxia" se refiere al daño en el tejido asociado con una exposición prolongada a dosis letalmente elevadas de oxígeno, por ejemplo, superiores al 95% de O_{2}, incluyéndose el daño hístico asociado con la respuesta inflamatoria a la dosis tóxicamente elevada de oxígeno. Por consiguiente, como se emplea en este documento, la expresión "concentraciones tóxicas de oxígeno" se refiere al daño hístico asociado con la lesión inducida tanto por concentraciones letalmente bajas de oxígeno (incluyéndose la falta completa de oxígeno), como por concentraciones letalmente altas de oxígeno. La expresión "mitigar" significa proteger contra, reducir y/o eliminar la destrucción hística no deseada, particularmente la destrucción hística mediada por las células del sistema inmunitario. La destrucción del tejido puede ser la respuesta a una lesión hística inicial, que puede tener un origen mecánico, químico o inmunológico. La expresión "intensificar la viabilidad de" tejidos u órganos vivos, como se utiliza en este documento, significa proteger contra, reducir y/o eliminar la pérdida o disminución de función del órgano o tejido como resultado de la muerte hística, particularmente la muerte hística mediada por células del sistema inmunitario. Los tejidos vivos "trasplantados" abarcan tanto los trasplantes de tejidos (por ejemplo, en el caso de trasplantes de médula ósea) como los injertos de tejido. Finalmente, un "agente inhibidor de los radicales libres de oxígeno" significa una molécula capaz de inhibir la liberación de radicales libres de oxígeno y/o inhibir sus efectos dañinos en los tejidos.

Se describen en este documento métodos y composiciones para mitigar la lesión por isquemia y reperfusión en tejido de mamíferos como resultado de una privación y posterior reperfusión de oxígeno en el tejido. También se describe un método para mitigar los efectos de destrucción de tejido asociados con hiperoxia. También se describen en este documento métodos y composiciones para mantener la viabilidad de tejidos y órganos, particularmente tejidos y órganos vivos que van a ser trasplantados, incluyendo protegerlos contra la lesión por isquemia y reperfusión, junto con métodos para proteger tejidos y órganos contra los efectos de destrucción hística producidos por enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis, psoriasis, dermatitis, incluyendo la dermatitis de contacto, IBD y otras enfermedades inflamatorias crónicas del tracto gastrointestinal, así como también los efectos de destrucción del tejido asociados con otras enfermedades autoinmunitarias conocidas, tal como diabetes, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), y otras enfermedades autoinmunitarias neurodegenerativas.

El morfógeno puede ser administrado al tejido dañado después de la lesión inicial en el tejido. El morfógeno puede administrarse directamente al tejido, p.ej. por inyección en el lugar de tejido dañado o por administración tópica, o puede administrarse indirectamente, p.ej., sistémicamente vía oral o parenteral.

El morfógeno puede también administrarse al tejido con riesgo de daño debido a la destrucción hística mediada por células del sistema inmunitario. Ejemplos de tales tejidos incluyen los injertos de tejidos y trasplantes de órganos y tejidos, así como también cualquier tejido u órgano que vaya a someterse a un procedimiento quirúrgico u otro procedimiento clínico que probablemente va a inhibir el flujo de sangre al tejido o en otros casos va a inducir una respuesta inflamatoria. Aquí el morfógeno se administra al paciente preferiblemente antes de la inducción de la lesión, p.ej., como un profiláctico, para proporcionar un efecto citoprotector para el tejido en riesgo.

Cuando el tejido en riesgo consiste en un tejido u órgano que va a ser trasplantado, el tejido u órgano que se va a trasplantar se expone preferiblemente al morfógeno antes del trasplante. Lo más preferiblemente, se expone el tejido u órgano al morfógeno antes de su extirpación del donante, proporcionando al donante una composición consistente en un morfógeno. Alternativamente, o además, una vez extirpado del donante, el órgano o tejido se coloca en una disolución conservante que contenga un morfógeno. Además, también es preferible proporcionar al receptor del trasplante un morfógeno justo momentos antes de o simultáneamente con el trasplante. En todos los casos, el morfógeno puede administrarse directamente al tejido en riesgo, ya sea por inyección o administración tópica al tejido, o puede proporcionarse sistémicamente, ya sea por vía oral o parenteral.

Los morfógenos descritos en esté documento están previstos que sean de gran utilidad para intensificar la viabilidad de cualquier órgano o tejido vivo que vaya a trasplantarse. Los morfógenos pueden utilizarse para un beneficio particular en los trasplantes de pulmón, corazón, hígado, riñón o páncreas, así como también en el trasplante y/o injerto de médula ósea, piel, mucosa gastrointestinal, y otros tejidos vivos.

Cuando el paciente padece una enfermedad inflamatoria crónica, tal como diabetes, artritis, psoriasis, IBD, y otras similares, el morfógeno preferiblemente se administra a intervalos regulares como un profiláctico, para prevenir y/o inhibir el daño hístico normalmente asociado con la enfermedad durante los periodos de empeoramiento. Como anteriormente, el morfógeno puede administrarse directamente al tejido en riesgo, por ejemplo mediante la administración de una inyección o por vía tópica, o indirectamente, sistémicamente, pe., administración oral o parenteral.

Entre los morfógenos útiles en este invento están las proteínas originalmente identificadas como proteínas osteogénicas, tales como la OP-1, OP-2 y proteínas CBMP2, así como también las proteínas con una secuencia aminoacídica afín tales como DDP (de Drosophila), Vgl (de Xenopus), Vgr-1 (de ratón, véase el documento U.S. 5.011.691 en Oppermann et al.), GDF-1 (de ratón, véase Lee (1991) PNAS 88: 4250-4254), todas ellas presentadas en la Tabla II y Secuencias con números de identificación 5-14), y la proteína 60 A recientemente identificada (de Drosophila, Sec. Con NID Nº 24, véase Wharton et al. (1991) PNAS 88: 9214-9218.) Los miembros de esta familia, los cuales incluyen miembros de la superfamilia de proteínas TGF-\beta, comparten una gran homología de las secuencias de aminoácidos en sus regiones C-terminales. Las proteínas se traducen como precursores, teniendo una secuencia señal peptídica en la región N-terminal, normalmente de menos de 30 restos aproximadamente, seguida por un dominio "pro" que es cortado para dar la secuencia de la proteína madura. El péptido señal se corta rápidamente en el proceso de traducción, en el lugar de corte que puede predecirse en una secuencia dada utilizando el método de Von Heijne [(1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4691]. La Tabla 1, debajo, describe los diversos morfógenos identificados hasta la fecha, incluyendo su nomenclatura tal como se ha utilizado en este documento, sus referencias de NID (No. de identificación) de Sec., y fuentes de publicación para las secuencias de aminoácidos de toda la proteína no incluidas en la Lista de Sec.

TABLA I

"OP-1"

Se refiere genéricamente al grupo de proteínas morfogénicamente activas expresadas a partir de una parte o de toda la secuencia de DNA que codifica la proteína OP-1, incluyendo las variantes de especie y alélicas, p.ej., OP-1 humana ("hOP-1", Sec con NID Nº 5, secuencia de aminoácidos de la proteína madura), u OP-1 de ratón ("mOP-1", Sec. con NID Nº 6, secuencia de aminoácidos de la proteína madura.). El esqueleto conservado de siete cisteínas está definido por los restos 38 a 139 de la Sec. con NID. Nos. 5 y 6. Las secuencias de cDNA y los aminoácidos que codifican toda la proteína se proporcionan en la Sec. con Nid. Nos. 16 y 17 (hOP1) y en la Sec. con Nid. Nos. 18 y 19 (mPO1). Las proteínas maduras están definidas por los restos 293-431 (hOP1) y 292-430 (mOP1). Las regiones "pro" de las proteínas, que se cortan para dar las proteínas maduras, morfogénicamente activas, están definidas esencialmente por los restos 30-292 (hOP1) y los restos 30-291 (mOP1).

"OP-2"

Se refiere genéricamente al grupo de proteínas activas expresadas a partir de una parte o de toda la secuencia de DNA que codifica la proteína OP-2, incluyendo las variantes de especie y alélicas, p.ej., OP-2 humana ("hOP-2", Sec con NID Nº 7, secuencia de aminoácidos de la proteína madura), o OP-2 de ratón ("mOP-2", Sec. con NID Nº 8, secuencia de aminoácidos de la proteína madura.). El esqueleto de siete cisteínas conservado está definido por los restos 38 a 139 de la Sec. con NID. Nos. 7 y 8. Las secuencias de DNAc y los aminoácidos que codifican toda la proteína se proporcionan en la Sec. con Nid. Nos. 20 y 21 (hOP2) y en la Sec. con Nid. Nos. 22 y 23 (mPO2). Las proteínas maduras se definen esencialmente por los restos 264-402 (hOP2) y 261-399 (mOP2). Las regiones "pro" de las proteínas, que se cortan para dar las proteínas maduras, morfogénicamente activas, están definidas esencialmente por los restos 18-263 (hOP2) y los restos 18-260 (mOP2). (Existe también otro sitio de corte 21 restos curso arriba para ambas proteínas OP-2.)

"CBMP2"

Se refiere genéricamente al grupo de proteínas morfogénicamente activas expresadas a partir de una secuencia de DNA que codifica las proteínas CBMP2, incluyendo las variantes de especie y alélicas, p.ej., CBMP2A humana ("CBMP2A(fx)", Sec con NID Nº 9), o el DNA de la CBMPB2 humana ("CBMP2B(fx)" Sec. con NID Nº 10). La secuencia de aminoácidos que codifican toda la proteína, referida en la literatura como BMP2A y BMP2B o BMP2 y BMP4, aparece en Wozney, et al. (1988) Science 242: 1528-1534. El dominio pro para BMP2 (BMP2A) incluye probablemente los restos 25-248 ó 25-282; la proteína madura, los restos 249-396 ó 283-396. El dominio pro para BMP4 (BMP2B) incluye probablemente los restos 25-256 ó 25-292; la proteína madura, los restos 257-408 ó 293-408.

"DPP(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen DPP de Drosophila y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID. No.11). La secuencia aminoacídica de toda la proteína aparece en Padgett, et al (1987) Nature 325: 81-84. El dominio pro se extiende desde el sitio de corte del péptido señal hasta el resto 456; la proteína madura probablemente está definida por los restos 457-588.

"Vgl(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen Vgl de Xenopus y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID. No.12). La secuencia aminoacídica de toda la proteína aparece en Weeks (1987) Cell 51: 861-867. El dominio pro probablemente se extiende desde la sitio de corte del péptido señal hasta el resto 246; la proteína madura está definida por los restos 247-360.

"Vgr-1(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen Vgr-1 de murino y definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID. No.13). La secuencia aminoacídica de toda la proteína aparece en Lyons, et al, (1989) PNAS 86: 4554-4558. El dominio pro se extiende desde la sitio de corte del péptido señal hasta el resto 299; la proteína madura probablemente está definida por los restos 300-438.

"GDF-1(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen GDF-1 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID. No.14). El DNAc y la secuencia aminoacídica de toda la proteína se proporciona en la Sec. con NID. No. 32. El dominio pro probablemente se extiende desde la sitio de corte del péptido señal hasta el resto 214; la proteína madura probablemente está definida por los restos 215-372.

"60A"

Se refiere genéricamente al grupo de proteínas morfogénicamente activas expresadas a partir de una parte o de toda la secuencia de DNA (a partir del gen 60A de Drosophila) que codifica la proteínas 60A (véase la Sec. con NID. No. 24 en donde se proporciona el DNAc y la secuencia aminoacídica que codifica toda la proteína).

"60A(fx)"

se refiere a las secuencias de proteína que definen el esqueleto de siete cisteínas conservadas (restos 354 hasta 455 de la Sec. con NID Nº 24.) El dominio pro probablemente se extiende desde la sitio de corte del péptido señal hasta el resto 324; la proteína madura probablemente está definida por los restos 325-455.

"BMP3(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen BMP3 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID. No.26). La secuencia aminoacídica de toda la proteína aparece en Wozney et al. (1988) Science 242: 1528-1534. El dominio pro se extiende desde la sitio de corte del péptido señal hasta el resto 290; la proteína madura está definida por los restos 291-472.

"BMP5(fx)"

Se refiere a las secuencias de proteínas codificadas por el gen BMP5 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID nº 27). La secuencia de aminoácidos de la proteína completa aparece en Celeste, et al. (1991) PNAS 87: 9843-9847. El dominio pro puede abarcar desde el sitio de corte del péptido señal hasta el resto 316; la proteína madura probablemente está definida por los restos 317-454.

"BMP6 (fx)"

Se refiere a las secuencias de proteína codificadas por el gen BMP6 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Sec. con NID nº 28). La secuencia de aminoácidos de la proteína completa aparece en Celeste, et al. (1990) PNAS 87: 9843-5847. El dominio pro puede abarcar desde el punto de segmentación péptida de la señal hasta el resto 374; la proteína madura puede incluir los restos 375-513.

Las proteínas OP-2 poseen un resto de cisteína adicional en esta región (p.ej., véase el resto 41 de las sec. con los NID nº 7 y 8) aparte del esqueleto de cisteína conservado que tienen en común con las otras proteínas de esta familia. La proteína GDF-1 posee una inserción de cuatro aminoácidos dentro del esqueleto conservado (restos 44-47 de la sec. con NID nº 14) pero esta inserción probablemente no interfiere en la relación de las cisteínas en la estructura plegada. Además, a las proteínas CBMP2 les falta un resto de aminoácido dentro del esqueleto de cisteína.

Los morfógenos están inactivos en su forma reducida, pero resultan activos cuando son homodímeros oxidados y cuando están oxidados junto con otros morfógenos (p.ej., cuando son heterodímeros). Así pues, tal como aquí se define, un morfógeno es una proteína dímera constituida por un par de cadenas polipeptídicas, donde cada cadena polipeptídica comprende al menos por el esqueleto de seis cisteínas del extremo C-terminal definidas por los restos 43-139 de la sec. con NID nº 5, incluyendo disposiciones funcionalmente equivalentes de estas cisteínas (p.ej., inserciones o supresiones de aminoácidos que alteran la disposición lineal de las cisteínas en la secuencia pero no su relación en la estructura plegada), de modo que cuando las cadenas polipeptídicas están plegadas, la especie de proteína dímera que comprende el par de cadenas polipeptídicas tiene la estructura tridimensional adecuada, incluyendo los enlaces disulfuro intracatenarios o intercatenarios apropiados, de forma que la proteína sea capaz de actuar como un morfógeno tal como aquí se define. De forma específica, los morfógenos por lo general son capaces de desarrollar todas las funciones biológicas siguientes en un ambiente morfogénicamente permisivo: estimular la proliferación de células progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferación de células diferenciadas; y apoyar el crecimiento y mantenimiento de las células diferenciadas, lo que incluye la "rediferenciación" de las células transformadas. Además, también se espera que estos morfógenos sean capaces de inducir la rediferenciación de las células involucradas bajo las condiciones ambientales adecuadas.

Los morfógenos descritos en esta memoria pueden constar de una de las dos especies de secuencias genéricas de aminoácidos: Secuencia Genérica 1 (Sec. con NID Nº 1) o Secuencia Genérica 2 (Sec. con NID Nº 2); donde cada Xaa indica uno de los 20 isómeros L de \alpha-aminoácidos que aparecen de forma natural, o un derivado de los mismos. La Secuencia Genérica 1 consta del esqueleto conservado de seis cisteínas y la Secuencia Genérica 2 comprende el esqueleto conservado de seis cisteínas más la cisteína adicional identificada en OP-2 (véase el resto 36 Sec. con NID Nº 2). Estas secuencias pueden constar además de la siguiente secuencia adicional en su extremo N-terminal:

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa} (Seq. ID No. 15)

Las secuencias de aminoácidos dentro de las secuencias genéricas precedentes son: Secuencia Genérica 3 (Sec. con NID Nº 3), Secuencia Genérica 4 (Sec. con NID Nº 4) Secuencia Genérica 5 (Sec. con NID Nº 30) y Secuencia Genérica 6 (Sec. con NID Nº 31), listadas más adelante. Estas Secuencias Genéricas incluyen las homologías compartidas por los distintos miembros preferidos de esta familia de morfógenos identificados en la Tabla II, así como la variación de secuencias de aminoácidos entre ellas. En concreto, las Secuencias Genéricas 3 y 4 son secuencias de aminoácidos compuestas de las siguientes proteínas presentadas en la Tabla II e identificadas en las Sec. con NID Nº 5-14: OP-1 humana (hOP-1, Sec. con NID Nº 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Sec. con NID Nº 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Sec. con NID Nº 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Sec. con NID Nº 9), CBMP2B (Sec. con NID Nº 10), DPP (de Drosophila, Sec. con NID Nº 11), Vgl (de Xenopus, Sec. con NID Nº 12), Vgr-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 13), y GDF-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 14). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos compartida por las secuencias de la Tabla II como los restos alternativos de las posiciones variables dentro de la secuencia. Nótese que estas secuencias genéricas permiten una cisteína adicional en la posición 41 ó 46 en las Secuencias Genéricas 3 ó 4 respectivamente, proporcionando un esqueleto de cisteína adecuado donde puedan formarse enlaces disulfuro inter- o intra-moleculares, y que contienen determinados aminoácidos fundamentales que influyen en la estructura terciaria de las proteínas.

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(Secuencia pasa a página siguiente)

Secuencia Genérica 3

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1

donde cada Xaa se selecciona de forma independiente a partir de un grupo de uno o más aminoácidos específicos definidos como sigue: "Res." significa "resto" y Xaa en res. 4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res. 6 = (Arg, Gln, Ser o Lys); Xaa en res. 7 = (Asp, o Glu); Xaa en res. 8 = (Leu o Val); Xaa en res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en res. 12 = (asp., Arg o Asn); Xaa en res. 14 = (Ile o Val); Xaa en res. 15 = (Ile o Val); Xaa en res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res. 20 = Tyr o Phe); Xaa en res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu o Gln); Xaa en res. 23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res 26 = (Glu, His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res. 28 = (Glu, Lys, Asp o Gln); Xaa en res. 30 = (Ala, Ser, Pro o Gln); Xaa en res. 31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res. 33 = (Leu o Val); Xaa en res. 34 = (Asn, Asp, Ala o Thr); Xaa en res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res. 37 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res 38 = (Asn o Ser); Xaa en res 39 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en res. 40 = Thr, Leu o Ser); Xaa en res. 44 = (Ile o Val); Xaa en res. 45 = Val o Leu); Xaa en res. 46 = (Gln o Arg); Xaa en res 47 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res. 49 = (Val o Met); Xaa en res. 50 = (His o Asn); Xaa en res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala o Val); Xaa en res. 53 = (Asn, Lys, Ala o Glu); Xaa en res. 54 = (Pro o Ser); Xaa en res. 55 = (Glu, Asp, Asn, o Gly); Xaa en res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala); Xaa en res. 57 = (Val, Ala o Ile); Xaa en res. 58 = (Pro o Asp); Xaa en res. 59 = (Lys o Leu); Xaa en res. 60 = (Pro o Ala); Xaa en res. 63 = (Ala o Val); Xaa en res. 65 = (Thr o Ala); Xaa en res. 66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res. 67 = (Leu, Met o Val); Xaa en res. 68 = (Asn, Ser o Asp); Xaa en res. 69 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res. 75 = (Phe, Tyr, o Leu); Xaa en res. 76 = (Asp o Asn); Xaa en res. 77 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res. 78 = (Ser, Gln, Asn o Tyr); Xaa en res. 79 = (Ser, Asn, Asp o Glu); Xaa en res. 80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res. 82 = (Ile o Val); Xaa en res. 84 = (Lys o Arg); Xaa en res. 85 = (Lys, Asn, Gln o His); Xaa en res. 86 (Tyr o His); Xaa en res. 87 = (Arg, Gln o Glu); Xaa en res. 88 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res. 90 = (Cal, Thr o Ala); Xaa en res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res. 93 = Ala, Gly o Glu); y Xaa en res. 97 = (His o Arg).

Secuencia Genérica 4

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2

donde cada Xaa se selecciona de forma independiente a partir de un grupo de uno o más aminoácidos específicos definidos como sigue: "Res." significa "resto" y Xaa en res. 2 = (Lys o Arg); Xaa en res. 3 = (Lys o Arg); Xaa en res. 4 = (His o Arg); Xaa en res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg o Pro); Xaa en res. 9 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res. 11 = (Arg, Gln, Ser o Lys); Xaa en res. 12 = (Asp, o Glu); Xaa en res. 13 = (Leu o Val); Xaa en res. 16 = (Gln, Leu, Asp, His o Asn); Xaa en res. 17 = (Asp, Arg o Asn); Xaa en res. 19 = (Ile o Val); Xaa en res. 20 = (Ile o Val); Xaa en res. 23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res. 25 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu o Gln); Xaa en res. 28 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res 31 = (Glu, His, Tyr, Asp o Gln); Xaa en res. 33 = (Glu, Lys, Asp o Gln); Xaa en res. 35 = (Ala, Ser, Pro o Gln); Xaa en res. 36 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res. 38 = (Leu o Val); Xaa en res. 39 = (Asn, Asp, Ala o Thr); Xaa en res. 40 = (Ser, Asp, Glu, Leu o Ala); Xaa en res. 41 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res. 42 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res. 43 = (Asn o Ser); Xaa en res 44 = (Ala, Ser o Gly); Xaa en res. 45 = Thr, Leu o Ser); Xaa en res. 49 = (Ile o Val); Xaa en res. 50 = Val o Leu); Xaa en res. 51 = (Gln o Arg); Xaa en res 52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res. 54 = (Val o Met); Xaa en res. 55 = (His o Asn); Xaa en res. 56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res. 57 = (Ile, Met, Asn, Ala o Val); Xaa en res. 58 = (Asn, Lys, Ala o Glu); Xaa en res. 59 = (Pro o Ser); Xaa en res. 60 = (Glu, Asp, Asn, o Gly); Xaa en res. 61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser o Ala); Xaa en res. 62 = (Val, Ala o Ile); Xaa en res. 63 = (Pro o Asp); Xaa en res. 64 = (Lys o Leu); Xaa en res. 65 = (Pro o Ala); Xaa en res. 68 = (Ala o Val); Xaa en res. 70 = (Thr o Ala); Xaa en res. 71 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res. 72 = (Leu, Met o Val); Xaa en res. 73 = (Asn, Ser o Asp); Xaa en res. 74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res. 80 = (Phe, Tyr, o Leu); Xaa en res. 81 = (Asp o Asn); Xaa en res. 82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res. 83 = (Ser, Gln, Asn o Tyr); Xaa en res. 84 = (Ser, Asn, Asp o Glu); Xaa en res. 85 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res. 87 = (Ile o Val); Xaa en res. 89 = (Lys o Arg); Xaa en res. 90 = (Lys, Asn, Gln o His); Xaa en res. 91 (Tyr o His); Xaa en res. 92 = (Arg, Gln o Glu); Xaa en res. 93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res. 95 = (Cal, Thr o Ala); Xaa en res. 97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res. 98 = Ala, Gly o Glu); y Xaa en res. 102 = (His o Arg).

De forma similar, la Secuencia Genérica 5 (Sec. con NID Nº 30) y la Secuencia Genérica 6 (Sec. con NID Nº 31) incluyen las homologías compartidas por todos los miembros de la familia de proteínas morfogénicas identificadas en la Tabla II. En concreto, las Secuencias Genéricas 5 y 6 son secuencias de aminoácidos compuestas de OP-1 humana (hOP-1, Sec. con NID Nº 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Sec. con NID Nº 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Sec. con NID Nº 7, 8 y 20-22, CBMP2A (Sec. con NID Nº 9), CBMP2B (Sec. con NID Nº 10), DPP (de Drosophila, Sec. con NID Nº 11), Vgl (de Xenopus, Sec. con NID Nº 12), Vgr-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 13), y GDF-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 14), BMP3 humana (Sec. con NID Nº 26), BMP5 humana (Sec. con NID Nº 27), BMP6 humana (Sec. con NID Nº 28) y 60A (de Drosophila, Sec. con NID Nº 24-25). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácidos compartida por estas secuencias en el dominio del extremo C-terminal, definido por los esqueletos de seis y siete cisteínas (Secuencias Genéricas 5 y 6 respectivamente) como los restos alternativos de las posiciones variables dentro de la secuencia. Como para las Secuencias Genéricas 3 y 4, las Secuencias Genéricas 5 y 6 permiten una cisteína adicional en la posición 41 (Secuencia Genérica 5) o en la posición 46 (Secuencia Genérica 6), proporcionando un esqueleto de cisteína adecuado donde puedan formarse enlaces disulfuro inter o intramoleculares, y que contiene determinados aminoácidos fundamentales que influyen en la estructura terciaria de las proteínas.

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(Secuencia pasa a página siguiente)

Secuencia Genérica 5

3

donde cada Xaa se selecciona de forma independiente a partir de un grupo de uno o más aminoácidos específicos definidos como sigue: "Res." significa "resto" y Xaa en res. 2 = (Tyr o Lys); Xaa en res. 3 = (Val o Ile); Xaa en res. 4 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res. 6 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res. 7 = (Asp, Glu o Lys); Xaa en res. 8 = (Leu, Val o Ile); Xaa en res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res. 12 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res. 14 = (Ile o Val); Xaa en res. 15 = (Ile o Val); Xaa en res. 16 = (Ala o Ser); Xaa en res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res. 19 = (Gly o Ser); Xaa en res. 20 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res. 23 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res 26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o Ser); Xaa en res. 28 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res. 30 = (Ala, Ser, Pro, Gln o Asn); Xaa en res. 31 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res. 33 = (Leu, Val o Met); Xaa en res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res. 37 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res 38 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res 39 = (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res. 40 = Thr, Leu o Ser); Xaa en res. 44 = (Ile, Val o Thr); Xaa en res. 45 = Val, Leu o Ile); Xaa en res. 46 = (Gln o Arg); Xaa en res. 47 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res. 48 = (Leu o Ile); Xaa en res. 49 = (Val o Met); Xaa en res. 50 = (His, Asn o Arg); Xaa en res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val o Leu); Xaa en res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res. 54 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res. 55 = (Glu, Asp, Asn Gly, Val o Lys); Xaa en res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro o His); Xaa en res. 57 = (Val, Ala o Ile); Xaa en res. 58 = (Pro o Asp); Xaa en res. 59 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res. 60 = (Pro o Ala); Xaa en res. 63 = (Ala o Val); Xaa en res. 65 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res. 66 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res. 67 = (Leu, Met o Val); Xaa en res. 68 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res. 69 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res. 70 = (Ile, Thr, Val o Leu); Xaa en rest. 71 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en rest. 72 = (Val, Met o Ile); Xaa en rest. 74 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 75 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res. 76 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en res. 77 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res. 78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res. 79 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res. 80 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res. 82 = (Ile, Val o Asn); Xaa en res. 84 = (Lys o Arg); Xaa en res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en res. 86 (Tyr o His); Xaa en res. 87 = (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en res. 88 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res. 90 = (Cal, Thr, Ala o Ile); Xaa en res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res. 93 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res. 95 = (Gly o Ala) y Xaa en res. 97 = (His o Arg).

Secuencia Genérica 6

4

donde cada Xaa se selecciona de forma independiente a partir de un grupo de uno o más aminoácidos específicos definidos como sigue: "Res." significa "resto" y Xaa en res 2 = (Lys, Arg, Ala o Gln); Xaa en res. 3 = (Lys, Arg o Met); Xaa en res. 4 = (His, Arg o Gln); Xaa en res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr o Tyr); res. 7 = (Tyr o Lys); Xaa en res. 8 = (Val o Ile); Xaa en res. 9 = (Ser, Asp o Glu); Xaa en res. 11 = (Arg, Gln, Ser, Lys o Ala); Xaa en res. 12 = (Asp, Glu o Lys); Xaa en res. 13 = (Leu, Val o Ile); Xaa en res. 16 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn o Ser); Xaa en res. 17 = (Asp, Arg, Asn o Glu); Xaa en res. 19 = (Ile o Val); Xaa en res. 20 = (Ile o Val); Xaa en res. 21 = (Ala o Ser); Xaa en res. 23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro o Arg); Xaa en res. 24 = (Gly o Ser); Xaa en res. 25 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu o Gly); Xaa en res. 28 = (Tyr, Asn o Phe); Xaa en res 31 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln o Ser); Xaa en res. 33 = (Glu, Lys, Asp, Gln o Ala); Xaa en res. 35 = (Ala, Ser, Pro, Gln o Asn); Xaa en res. 36 = (Phe, Leu o Tyr); Xaa en res. 38 = (Leu, Val o Met); Xaa en res. 39 = (Asn, Asp, Ala, Thr o Pro); Xaa en res. 40 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala o Lys); Xaa en res. 41 = (Tyr, Cys, His, Ser o Ile); Xaa en res. 42 = (Met, Phe, Gly o Leu); Xaa en res 43 = (Asn, Ser o Lys); Xaa en res 44 = (Ala, Ser, Gly o Pro); Xaa en res. 45 = Thr, Leu o Ser); Xaa en res. 49 = (Ile, Val o Thr); Xaa en res. 50 = Val, Leu o Ile); Xaa en res. 51 = (Gln o Arg); Xaa en res. 52 = (Thr, Ala o Ser); Xaa en res. 53 = (Leu o Ile); Xaa en res. 54 = (Val o Met); Xaa en res. 55 = (His, Asn o Arg); Xaa en res. 56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala o Val); Xaa en res. 57 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val o Leu); Xaa en res. 58 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly o Phe); Xaa en res. 59 = (Pro, Ser o Val); Xaa en res. 60 = (Glu, Asp, Asn Gly, Val o Lys); Xaa en res. 61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro o His); Xaa en res. 62 = (Val, Ala o Ile); Xaa en res. 63 = (Pro o Asp); Xaa en res. 64 = (Lys, Leu o Glu); Xaa en res. 65 = (Pro o Ala); Xaa en res. 66 = (Ala o Val); Xaa en res. 70 = (Thr, Ala o Glu); Xaa en res. 71 = (Gln, Lys, Arg o Glu); Xaa en res. 72 = (Leu, Met o Val); Xaa en res. 73 = (Asn, Ser, Asp o Gly); Xaa en res. 74 = (Ala, Pro o Ser); Xaa en res. 75 = (Ile, Thr, Val o Leu); Xaa en rest. 76 = (Ser, Ala o Pro); Xaa en rest. 77 = (Val, Met o Ile); Xaa en rest. 79 = (Tyr o Phe); Xaa en res. 80 = (Phe, Tyr, Leu o His); Xaa en res. 81 = (Asp, Asn o Leu); Xaa en res. 82 = (Asp, Glu, Asn o Ser); Xaa en res. 83 = (Ser, Gln, Asn, Tyr o Asp); Xaa en res. 84 = (Ser, Asn, Asp, Glu o Lys); Xaa en res. 85 = (Asn, Thr o Lys); Xaa en res. 87 = (Ile, Val o Asn); Xaa en res. 89 = (Lys o Arg); Xaa en res. 90 = (Lys, Asn, Gln, His o Val); Xaa en res. 91 (Tyr o His); Xaa en res. 92 = (Arg, Gln, Glu o Pro); Xaa en res. 93 = (Asn, Glu o Asp); Xaa en res. 95 = (Cal, Thr, Ala o Ile); Xaa en res. 97 = (Arg, Lys, Val, Asp o Glu); Xaa en res. 98 = (Ala, Gly, Glu o Ser); Xaa en res. 100 = (Gly o Ala) y Xaa en res. 102 = (His o Arg).

Las secuencias de particular utilidad como morfógenos en este invento incluyen los dominios del extremo C-terminal, p.ej., los restos de aminoácidos 96-102 del extremo C-terminal de Vgl, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, CBMP-2A, CBMP-2B, GDF-1 (véase la Tabla II más adelante y las Sec. con NID Nº 5-14), así como las proteínas que abarcan los dominios del extremo C-terminal de 60A, BMP3, BMP5 y BMP6 (véanse las Sec. con NID Nº 24-28), todos los cuales incluyen al menos el esqueleto conservado de seis o siete cisteínas. Además, las construcciones biosintéticas diseñadas a partir de secuencias genéricas, tales como COP-1, 3-5, 7, 16, descritas en la Patente de EE.UU. Nº 5.011.691, resultan también útiles. En otro aspecto preferible del invento, los morfógenos útiles incluyen proteínas activas constituidas por especies de cadenas polipeptídicas que tengan la secuencia genérica de aminoácidos aquí denominada "OPX", la cual incluye las homologías entre las distintas especies identificadas de OP1 y OP2 (Sec. con NID Nº 29).

Los morfógenos descritos en la presente memoria incluyen proteínas constituidas por cualquiera de las cadenas polipeptídicas descritas anteriormente, ya hayan sido aisladas a partir de fuentes naturales o producidas mediante DNA recombinante u otras técnicas sintéticas, e incluyen variantes alélicas y de especies de estas proteínas, mutantes naturales o biosintéticos de las mismas, y diversas construcciones truncadas y de fusión. Es de esperar que los mutantes con supresiones o adiciones también sean activos, entre ellos aquellos que puedan alterar el esqueleto conservado de cisteína del extremo C-terminal, siempre que la alteración no interrumpa funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura plegada. Por consiguiente, dichas formas activas se consideran el equivalente de las construcciones específicamente descritas que aquí se explican.

Las proteínas pueden incluir formas que tengan distintos modelos de glicosilación, distintos extremos N-terminales, una familia de proteínas relacionadas con las anteriores que tengan regiones de homología en la secuencia de aminoácidos, y formas activas truncadas o mutadas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas mediante la expresión de DNA recombinante en las células anfitrionas.

Las proteínas morfogénicas pueden expresarse a partir de cDNA intacto o truncado o a partir de DNA sintéticos en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, y ser purificadas, escindidas, replegadas y dimerizadas para formar composiciones morfogénicamente activas. Las células anfitrionas preferidas actualmente son células de E. coli o mamíferos, tales como células CHO, COS, o BSC.

De este modo, a la vista de esta descripción, los ingenieros genéticos especializados pueden aislar genes a partir de bancos de cDNA o genómicos de diversas especies diferentes que codifiquen las secuencias adecuadas de aminoácidos, o construir cadenas de DNA a partir de oligonucleótidos, para después expresarlas en diversos tipos de células anfitrionas, entre ellas las procariotas y eucariotas, a fin de producir grandes cantidades de proteínas activas capaces de proteger a los tejidos y órganos de la destrucción hística mediada por células, incluyendo la inhibición substancial de dicho daño y/o la regeneración del tejido dañado en una gran variedad de mamíferos, entre ellos los seres humanos.

Lo precedente y otros objetos, funciones y ventajas del presente invento quedarán mejor ilustrados con la descripción detallada que se ofrece a continuación.

Breve descripción de las ilustraciones

Fig 1 muestra los efectos cardioprotectores del morfógeno (hOP1) en un modelo de rata con isquemia miocárdica y reperfusión, como lo evidencia la menor pérdida de creatina-quinasa miocárdica en ratas tratadas con hOP1;

Fig 2 muestra los efectos de 20 \mug de morfógeno (hOP1) administrado 24 horas antes del aislamiento de corazón de rata sobre la vasorrelajación dependiente del endotelio a la acetilcolina tras una lesión inducida por isquemia y reperfusión;

Fig 3 muestra el efecto del morfógeno (hOP1) sobre la adherencia de neutrófilos al endotelio de la arteria mesentérica estimulada con LTB4 en ratas con neutrófilos activados;

Fig 4 (A y B) son representaciones esquemáticas de la inhibición por morfógenos de la multinuclearización fagocítica mononuclear precoz in vivo;

Fig 5 ilustra el efecto de un morfógeno (p.ej., OP-1) y un control de placebo sobre la formación de una lesión mucosítica; e

Fig 6 (A-D) ilustra los efectos de un morfógeno (p.ej., OP-1, Fig. 6A y 6C) y TGF-\beta (Fig. 6B y 6D) sobre la producción de colágeno (6A y 6B) y ácido hialurónico (6C y 6D) en cultivos primarios de fibroblastos.

Descripción detallada del invento

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que los morfógenos aquí descritos son agentes eficaces para aliviar los efectos de destrucción hística asociados a la respuesta inflamatoria del cuerpo ante la lesión hística. En concreto, tal como aquí se divulga, los morfógenos son capaces de aliviar los efectos de necrosis hística asociados a las respuestas inflamatorias subsiguientes que se producen tras la lesión inicial de un tejido.

Cuando se produce una lesión de tejido, causada por bacterias, traumatismo, substancias químicas, calor o por cualquier otro fenómeno, se estimula la respuesta inflamatoria del cuerpo. En respuesta a las señales emitidas por las células dañadas (p.ej., las citoquinas), se induce la extravascularización de las células efectoras inmunitarias. Bajo circunstancias normales, estas células efectoras inmunitarias invasoras matan al agente infeccioso y/o a las células infectadas o dañadas (mediante la liberación de substancias asesinas tales como los superóxidos, las perforinas, y otros agentes antimicrobianos almacenados en gránulos), eliminan los tejidos y organismos muertos (mediante fagocitosis), liberan distintos modificadores de la respuesta biológica que promueven la curación rápida y el cubrimiento de la herida (lo que a menudo da lugar a la formación de tejido fibrótico cicatrizado), y después, cuando el área está bien curada, salen del punto de la agresión inicial. Una vez que el punto se considera normal, cesa la liberación local de citoquinas inflamatorias, y la manifestación de moléculas de adhesión en el endotelio del vaso vuelve a los niveles basales. En algunos casos, sin embargo, el celo de estas señales y sistemas celulares interactivos, que están diseñados para capturar y retener agentes infecciosos que se multiplican a gran velocidad, actúa en detrimento del cuerpo, matando tejido adicional circundante que está sano. Esta innecesaria muerte adicional de tejido compromete aún más la función del órgano y en ocasiones da lugar a la muerte del individuo. Además, el tejido cicatrizado resultante que se forma a menudo puede interferir en la función normal del tejido, como ocurre por ejemplo en el caso de la fibrosis pulmonar idiopática, IBD y cirrosis de órganos.

El endotelio vascular constituye la primera barrera entre las células efectoras inmunitarias circulantes y los tejidos extravasculares. La extravasación de estas células circulantes exige que éstas se fijen a las células endoteliales vasculares, crucen la membrana base, y se introduzcan en los tejidos agredidos, p.ej., por fagocitosis o por degradación de la matriz extracelular mediada por proteasa. Sin limitarse a una teoría en particular, se cree que los morfógenos de este invento pueden modular en parte la respuesta inflamatoria modulando la conexión de las células efectoras inmunitarias al lado luminal del endotelio de los vasos sanguíneos en los puntos de daño hístico o cerca de los mismos y/o de lesiones inflamatorias. Dado que el método reduce o impide la conexión de células efectoras inmunitarias en estos puntos, también impide la liberación subsiguiente de agentes destructores de tejidos por parte de estas mismas células efectoras inmunitarias en los puntos de daño hístico o en lesiones inflamatorias. Puesto que la conexión de las células efectoras inmunitarias al endotelio debe preceder a su extravascularización, el método también impide la entrada inicial o continuada de estas células en los puntos extravasculares de destrucción hística o en lesiones inflamatorias en curso. Por lo tanto, el invento no sólo encuentra utilidad en un método para reducir o prevenir la destrucción celular mediada por células inmunitarias en los puntos extravaculares de destrucción hística reciente, sino que también encuentra utilidad en un método para prevenir o reducir la entrada continua de células efectoras inmunitarias en puntos extravasculares de cascadas inflamatorias en curso. Como podrán apreciar los especialistas en este campo, también pueden contemplarse los morfógenos de este invento en mecanismos que interrumpen la interacción funcional de las células efectoras inmunitarias con endotelio donde las moléculas de adhesión son inducidas por medios que no sean la respuesta ante una lesión hística.

Una fuente de lesión hística está inducida por la exposición de la célula a concentraciones tóxicas de oxígeno, tal como la lesión hística por isquemia y reperfusión (privación de oxígeno), y tras una lesión de hiperoxia (concentraciones letalmente elevadas de oxígeno). Por consiguiente, el presente invento encuentra utilidad en un método para aliviar el daño hístico inducido por lesiones tras isquemia y reperfusión o lesiones inducidas por hiperoxia, que comprenden el paso de administrar al individuo lesionado una cantidad terapéutica de un morfógeno antes, durante o después del daño en el tejido afectado. Cuando puedan inducirse deliberadamente concentraciones tóxicas de oxígeno, como en un procedimiento quirúrgico o clínico, es preferible administrar el morfógeno antes de la inducción.

Además, los morfógenos aquí descritos, en contraste con los factores de crecimiento fibrogénico tales como TGF-\beta, estimulan la morfogénesis hística y no estimulan la fibrosis ni la formación de tejido cicatrizado (véase el Ejemplo 9 más adelante). Por consiguiente, además de inhibir los efectos de destrucción hística asociados a la respuesta inflamatoria, los morfógenos mejoran aún más la viabilidad de los tejidos y/u órganos dañado estimulando la regeneración del tejido dañado y previniendo la fibrogénesis.

Los morfógenos aquí descritos pueden además inhibir la proliferación de células epiteliales (véase el Ejemplo 10 más adelante). Esta actividad de los morfógenos también puede resultar particularmente útil en el tratamiento de la psoriasis y de otras enfermedades inflamatorias que implican poblaciones de células epiteliales.

A continuación se ofrecen descripciones detalladas de morfógenos adecuados que resultan útiles en el invento, así como métodos para su administración y aplicación, y numerosos ejemplos no limitantes que 1) ilustran la idoneidad de los morfógenos aquí descritos como agentes terapéuticos que protegen a los tejidos de los efectos de destrucción hística asociados con la respuesta inflamatoria del cuerpo; y 2) proporcionan ensayos con los que someter a prueba los morfógenos candidatos para comprobar su eficacia.

I. Morfógenos útiles

Tal como aquí se define, una proteína es morfogénica si es capaz de inducir la cascada evolutiva de eventos celulares y moleculares que culminan en la formación de tejido nuevo específico para el órgano y consta como mínimo del esqueleto conservado de seis cisteínas del extremo C-terminal o de su equivalente funcional (véase más arriba). De forma específica, los morfógenos por lo general son capaces de realizar todas las funciones biológicas siguientes en un ambiente morfogénicamente permisivo: estimular la proliferación de células progenitoras; estimular la diferenciación de células progenitoras; estimular la proliferación de células diferenciadas; y apoyar el crecimiento y mantenimiento de las células diferenciadas, lo que incluye la "rediferenciación" de las células transformadas. Los detalles sobre el modo en que se identificaron por primera vez los morfógenos útiles en el invento, así como la descripción sobre la forma de elaborarlos, usarlos y someterlos a prueba para comprobar su actividad morfogénica están publicados en el documento USSN 667.274, presentado el 11 de marzo de 1991, y en el documento USSN 752.764, presentado el 30 de agosto de 1991. Tal como allí se describe, los morfógenos pueden purificarse a partir de material procedente de fuentes naturales o de material producido de forma recombinante a partir de células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, utilizando las secuencias genéticas allí publicadas. Por otra parte, pueden identificarse las secuencias morfogénicas nuevas siguiendo los procedimientos allí publicados.

Las proteínas de particular utilidad son las que constan de las secuencias derivadas de forma natural que se presentan en la Tabla II. Otras secuencias útiles son las construcciones biosintéticas, tales como los que se publican en la Patente de EE.UU. 5.011.691 (p.ej., COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, Y COP-16).

Los morfógenos útiles en el invento también pueden describirse por cualquiera de las 6 secuencias genéricas aquí descritas (Secuencias Genéricas 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Las Secuencias Genéricas 1 y 2 también pueden incluir en su extremo N-terminal la secuencia

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa} (Seq. ID No. 15)

La Tabla II, presentada a continuación, compara las secuencias de aminoácidos de las regiones activas de proteínas nativas que se han identificado como morfógenos, entre ellas OP-1 humana (hOP-1, Sec. con NID Nº 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Sec. con NID Nº 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Sec. con NID Nº 7, 8 y 20-23), CBMP2A (Sec. con NID Nº 9), CBMP2B (Sec. con NID Nº 10), BMP3 (Sec. con NID Nº 26), DPP (de Drosophila, Sec. con NID Nº 11), Vgl (de Xenopus, Sec. con NID Nº 12), Vgr-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 13), GDF-1 (de ratón, Sec. con NID Nº 14, 32 y 33), proteína 60A (de Drosophila, Sec. con NID Nº 24 y 25), BMP5 (Sec. con NID Nº 27) y BMP6 (Sec. con NID Nº 28). Esencialmente, las secuencias están alineadas según el método de Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol., 48: 443-453) y calculadas con el programa Align (DNAstar, Inc). En la tabla, tres puntos indican que el aminoácido en esa posición es el mismo que el aminoácido en hOP-1. Tres guiones indican la ausencia de aminoácidos en esa posición, y se incluyen con objeto de ilustrar las homologías. Por ejemplo, falta el resto de aminoácido 60 de CBMP-2A Y CBMP-2B. Por descontado, las dos secuencias de aminoácidos de esta región incluyen Asn-Ser (restos 58, 59), y CBMP-2A incluye Lys e Ile, mientras que CBMP-2B contiene Ser e Ile.

TABLA II

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

\text{**} Entre los restos 56 y 57 de BMP3 se encuentra un resto de valina; entre restos 43 y 44 de GDF-1 está la secuencia de aminoácidos Gli-Gli-Pro-Pro.

Actualmente, las secuencias de proteínas más preferidas que son útiles como morfógenos en esta invención incluyen la secuencia de aminoácidos que define el esqueleto conservado de 6 cisteínas de hOP-1 (p.ej., restos 43-139 de la Seq. Con NID Nº 5). Además, las secuencias más preferidas incluyen tanto variantes alélicas como variantes de especies de las proteínas OP-1 y OP-2, entre ellas la proteína 60 A de Drosophila. En consecuencia, en otro aspecto preferido, la invención incluye morfógenos que contienen especies de cadenas polipeptídicas con la secuencia genérica de aminoácidos referida aquí como "OPX", y que define el esqueleto de siete cisteínas, y toma en cuenta las identidades entre las varias proteínas OP1 y OP2 identificadas en ratones y en seres humanos. OPX es presentada en la Seq. Con NID Nº 29. Como se describe, cada Xaa en una posición dada es seleccionada independientemente de los restos que ocurren en la posición correspondiente en la secuencia del extremo C-terminal de la proteína OP1 y OP2 de ratón o humana (véase Seq. NID Nº 5-8 y/o Seq. NID Nº 16-23).

II. Formulaciones y métodos para administrar agentes terapéuticos

Los morfógenos pueden ser suministrados a un individuo por cualquier método adecuado, prefiriéndose la administración directa (por ejemplo, localmente por medio de una inyección o administración tópica a un lugar en el tejido) o sistémica (por ejemplo por ruta perenteral u oral). En casos donde el morfógeno es suministrado por ruta parenteral, tal como por ruta intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, bucal, rectal, vaginal, intranasal, o por medio de un aereosol, se prefiere que el morfógeno sea parte de una solución acuosa. La solución es fisiológicamente aceptable de manera que además de ser vehículo para la entrega del morfógeno deseado al paciente, la solución no afecta de manera adversa al balance de electrólitos o de volumen del paciente. El medio acuoso para el morfógeno puede por lo tanto estar constituido de solución fisiológica salina normal (9,85% NaCl, 0,15 M), pH 7-7,4. La solución acuosa que contiene el morfógeno puede hacerse, por ejemplo, disolviendo la proteína en acetonitrilo que contiene 50% de etanol y 0,1% de ácido trifluoroacético (ATF) o 0,1% HCl, o disolventes equivalentes. Después, se añade por ejemplo un volumen de la solución a diez volúmenes de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que puede incluir de 0,1-0,2% de seroalbúmina humana (SAH). La solución que resulta es agitada extensivamente por medio de vórtice. Si se desea, se puede aumentar la solubilidad de un morfógeno dado uniéndolo a una molécula adecuada. Por ejemplo, la asociación de un dímero maduro con el dominio pro de un morfógeno mantiene el morfógeno soluble en un tampón fisiológico. De hecho, se cree que la proteína endógena es transportada en esta forma. Otra molécula capaz de aumentar la solubilidad y que es particularmente útil para la administración oral es la caseína. Por ejemplo, la adición de caseína al 0,2% aumenta la solubilidad de la forma madura activa de OP-1 en un 80%. Otros componentes que se encuentran en la leche y otras proteínas del suero también pueden ser útiles.

Soluciones útiles para la administración parenteral pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en este campo farmacéutico, descritos por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed), Mack Pub. 1990. Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y compuestos similares. Las formulaciones para la administración directa, en particular, pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener el morfógeno en el locus (lugar) deseado. Los polímeros biológicamente compatibles, preferiblemente reabsorbibles, entre ellos, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, fosfato de tricalcio, polibutirato, polímeros de lactida y glicolida, y copolímeros de lactida/glicolida, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del morfógeno in vivo. Otros sistemas de entrega parenteral que son potencialmente útiles para estos morfógenos incluyen partículas de copolímeros de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión que se implantan, y liposomas. Las formulaciones para la administración por inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril-éter, glicocolato o desoxicolato, o soluciones en aceite para administrarse en forma de gotas nasales o como un gel para ser aplicado de forma intranasal. Las formulaciones para administración parenteral también pueden incluir glicocolato para administración bucal, metoxisilicilato para administración rectal, o ácido cítrico para administración vaginal.

Los supositorios para administración rectal también pueden ser preparados mezclando el morfógeno o agente estimulante del morfógeno con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a la temperatura del cuerpo.

Las formulaciones para administración tópica en la superficie de la piel pueden ser preparadas dispersando el morfógeno o agente estimulante del morfógeno con un vehículo dermatológico aceptable tal como una loción, crema, ungüento, o jabón. De utilidad particular son los vehículos capaces de formar una película o una capa fina sobre la piel para localizar la aplicación e inhibir su retirada. Para la administración tópica a superficies internas de los tejidos, el morfógeno puede ser dispersado en un medio adhesivo líquido para tejidos u otras sustancias que se sabe aumentan la adsorción a una superficie de tejido. Por ejemplo, las soluciones de hidroxipropilcelulosa o de fibrinógeno/trombina pueden ser usadas para esto con ventaja. Alternativamente, pueden ser usadas soluciones que forman una capa sobre los tejidos, tales como formulaciones que contengan pectina.

Alternativamente, los morfógenos descritos aquí, pueden ser administrados oralmente. La administración oral de proteínas como fármacos no se practica generalmente, ya que la mayoría de las proteínas son fácilmente degradadas por las enzimas digestivas y por los ácidos en los sistemas digestivos mamíferos antes de que puedan ser absorbidas en la sangre. Sin embargo, los morfógenos aquí descritos son típicamente estables en ácidos y resistentes a la degradación por proteasas (véase por ejemplo, la Patente de los EE.UU. nº 4.968.590). Además, por lo menos un morfógeno, OP-1, ha sido identificado en extractos de glándulas mamarias, calostro, y leche de 57 días. Además, OP-1 purificada de un extracto de la glándula mamaria es morfogénicamente activa. Específicamente, esta proteína induce formación de huesos endocondriales en mamíferos cuando se implanta subcutáneamente en asociación con un material matriz adecuado y puede ser medido usando un ensayo óseo normal in vivo., tal como el divulgado en la Patente de los EE.UU. nº 4.968.590. Además, el morfógeno también se detecta en la sangre. Finalmente, la forma soluble del morfógeno, p.ej. el morfógeno maduro asociado con el dominio pro es morfogénicamente activo. Estos resultados indican que la administración oral y parenteral son métodos viables para administrar el morfógeno a un individuo. Además, mientras que las formas maduras de algunos morfógenos aquí descritos son poco solubles, la forma del morfógeno que se encuentra en la leche (y en extractos de la glándula mamaria y calostro) es rápidamente soluble, posiblemente debido a la asociación de la forma madura, morfogénicamente activa con parte o con todo el dominio pro de la secuencia intacta, y/o por asociación con uno o más componentes de leche. Consecuentemente, los compuestos que aquí se proporcionan, pueden ser asociados con moléculas capaces de aumentar su solubilidad in vitro e in vivo.

En los casos donde el morfógeno o agente estimulante del morfógeno constituyen parte de una solución para conservar un tejido u órgano, cualquier solución de conservación disponible comercialmente puede ser usada con ventaja. Por ejemplo, soluciones útiles que se conocen en este campo incluyen la solución de Collins, solución de Wisconsin, solución de Belzer, solución de Eurocollins, y solución de Ringer lactada. Generalmente, una solución para conservación de órganos posee usualmente una o más de las siguientes propiedades: (a) una presión osmótica sustancialmente igual a la del interior de una célula mamífera (las soluciones son típicamente hiperosmolares, y tienen iones de K+ y/o Mg++ presentes en cantidades suficientes para producir una presión osmótica ligeramente más alta que la que hay dentro de una célula mamífera); (b) la solución es típicamente capaz de mantener niveles sustancialmente normales de ATP en las células; y (c) la solución usualmente permite un mantenimiento óptimo del metabolismo de la glucosa en las células. Las soluciones para conservación de órganos pueden también contener anticoagulantes, fuentes de energía tales como glucosa, fructosa y otros azúcares, metabolitos, agentes quelantes de metales pesados, glicerol y otros materiales de alta viscosidad para aumentar la supervivencia en temperaturas bajas, agentes inhibidores de radicales libres de oxígeno, y un indicador de pH. Una descripción en detalle de las soluciones para conservación y componentes útiles puede encontrarse, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. nº 5.002.965.

Los compuestos que se proporcionan aquí también pueden asociarse con moléculas capaces de guiar el morfógeno o agente estimulante del morfógeno a un tejido deseado. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra proteína de enlace que interactúa específicamente con una molécula en la superficie de la célula del tejido deseado. Las moléculas guiadoras útiles pueden ser diseñadas, por ejemplo, usando la tecnología del sitio de unión a la cadena individual, divulgada por ejemplo en la Patente de los EE.UU. nº 5.091.513.

Como se describió anteriormente, los morfógenos proporcionados aquí comparten una homología significativa en la secuencia de los dominios activos del extremo C-terminal. En contraste, las secuencias típicamente divergen significativamente en las secuencias que definen al dominio pro. Por lo tanto, se cree que el dominio pro es específico a cada morfógeno. Como se describió anteriormente, se sabe también que los varios morfógenos identificados hasta hoy en día son expresados diferencialmente en distintos tejidos. Por lo tanto, sin limitarse a una teoría específica, es probable que bajo las condiciones naturales del cuerpo, morfógenos selectos actúan típicamente en un tejido dado. Por lo tanto, parte o todos los dominios pro que han sido identificados y asociados con la forma activa del morfógeno en solución, pueden actuar como moléculas guiadoras para los morfógenos descritos aquí. Por ejemplo, los dominios pro pueden interactuar específicamente con una o más moléculas en el tejido específico para dirigir el morfógeno asociado con ese dominio pro a dicho tejido. Por lo tanto, otra molécula guiadora útil para guiar al morfógeno a un tejido de interés es parte o todo el dominio pro de un morfógeno. Por ejemplo, puede usarse parte o todo el dominio pro de GDF-1 para guiar un morfógeno al tejido nervioso. Alternativamente, puede usarse parte o todo el dominio pro de OP-1 o CBMP2 para guiar un morfógeno a tejido óseo, siendo ambas unas proteínas que se encuentran asociadas de modo natural con el tejido óseo.

Los morfógenos descritos aquí son útiles para proporcionar efectos neuroprotectores que alivien los daños en las rutas neurales asociados con la respuesta inmunitaria/inflamatoria del cuerpo a una lesión inicial de los tejidos nerviosos. Como se usa aquí, "una ruta neural" se refiere a un circuito de nervios para el paso de señales eléctricas desde una fuente hasta un sitio específico en una célula, e incluye tanto el sistema nervioso central (CNS) como el sistema nervioso periférico (PNS). La ruta incluye las neuronas a través de las cuales es transportado el impulso eléctrico, abarcando grupos de neuronas interconectadas, las fibras nerviosas formadas por ramas de axones neurales, y las células gliales que rodean y están asociadas con las neuronas. Puede ocurrir una respuesta inflamatoria a una lesión del tejido nervioso después de un trauma en el tejido nervioso, causado por ejemplo por una disfunción autoinmunitaria (incluyendo autoanticuerpos), lesión neoplásica, infección, trauma químico o mecánico, u otra enfermedad. Un ejemplo de enfermedad inflamatoria relacionada con los nervios es la esclerosis múltiple. También puede producirse daño en la ruta neural a consecuencia de una reducción o interrupción, p.ej., oclusión, del abastecimiento de sangre a los nervios, como ocurre en un derrame embólico (p.ej., isquemia o lesión inducida por hipoxia), o por otro trauma en el nervio o material vecino. Además, parte del daño asociado con cierto número de tumores primarios del cerebro también parece ser de tipo inmunitario. La aplicación del morfógeno directamente a las células que van a ser tratadas, o el suministro del morfógeno sistémicamente al mamífero, por ejemplo, por ruta intravenosa o indirectamente por administración oral, puede ser usada para aliviar y/o inhibir la respuesta de tipo inmunitario a una lesión neural. Alternativamente, también puede usarse la administración de un agente capaz de estimular la expresión y/o secreción del morfógeno in vivo, preferiblemente en el sitio de la lesión. En casos donde va a ser inducida una lesión, tal como durante cirugía u otros tratamientos clínicos agresivos, puede suministrarse el morfógeno o agente antes de inducir la lesión para proporcionar un efecto neuroprotector al tejido nervioso en riesgo.

En casos donde se propone usar el morfógeno como un agente terapéutico para aliviar daños a los tejidos asociados con una condición inmunitaria/inflamatoria del CNS, se debe considerar un problema adicional: superar la llamada "barrera hematoencefálica", la estructura de pared de capilares del cerebro que hace de pantalla eficaz para todas excepto algunas categorías seleccionadas de moléculas presentes en la sangre impidiendo que pasen al cerebro. La barrera hematoencefálica puede ser esquivada efectivamente por la infusión directa del morfógeno o agente estimulante del morfógeno en el cerebro. Alternativamente, el morfógeno o agente estimulante del morfógeno puede ser modificado para intensificar su transporte a través de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, ciertas formas truncadas del morfógeno o de un agente estimulante del morfógeno pueden tener más éxito. Alternativamente, el morfógeno o agente estimulante del morfógeno puede ser modificado para hacerlo más lipofílico, o puede conjugarse a otra molécula que sea transportada de forma natural a través de la barrera, usando métodos normales conocidos por las personas expertas en este campo, como por ejemplo los descritos en Pardridge, Endocrine Reviews 7:314-330 (1985) y la Patente de los EE.UU. nº 4.801.575.

Finalmente los morfógenos proporcionados aquí pueden ser administrados en solitario o en combinación con otras moléculas que se sabe son beneficiosas en las composiciones y métodos de tratamiento descritos aquí, incluyendo pero no limitándose a anticoagulantes, agentes que inhiben radicales libres de oxígeno, ácido salicílico, vitamina D y otros agentes antiinflamatorios. Los tratamientos para la psoriasis pueden incluir también el tratamiento con luz ultravioleta, óxido de zinc y retinoides.

Los compuestos proporcionados aquí pueden ser formulamos en preparaciones farmacéuticas mezclándolos con excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables y no tóxicos. Como se indicó anteriormente, tales composiciones pueden ser preparadas para administración parenteral, particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, particularmente en la forma de tabletas o cápsulas; o intranasal, particularmente en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones pueden ser formuladas para administración parenteral u oral a seres humanos y otros mamíferos en cantidades terapéuticamente efectivas, p.ej., cantidades que proveen las concentraciones adecuadas por un tiempo suficiente para aliviar los efectos de destrucción del tejido asociados con respuestas antiinflamatorios, incluyendo protección del tejido anticipándose al daño en el tejido.

Como será apreciado por aquellas personas familiarizadas con este campo, la concentración de los compuestos descritos en una composición terapéutica variará dependiendo de un cierto número de factores, incluyendo la dosis de la droga que va a ser administrada, las características químicas (p.ej., hidrofobia) de los compuestos empleados, y la ruta de administración. La dosis preferida de la droga que se va a administrar es probable que dependa de variables tales como el tipo y grado de progresión de daño en el tejido, el estado general de salud del paciente particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación de los excipientes para el compuesto, y su ruta de administración. En términos generales, los compuestos de esta invención pueden ser suministrados en una solución acuosa en tampón fisiológico que contenga alrededor del 0,001% al 10% peso/volumen del compuesto para administración parenteral. Los intervalos de dosis típicos van de alrededor de 10 ng/kg a alrededor de 1 g/kg de peso corporal por día; un intervalo de dosis preferido es de alrededor de 0,1 \mug/kg a 100 mg/kg de peso corporal por día. Óptimamente, la dosis del morfógeno suministrada está entre 0,1 y 100 \mug de proteína por kilogramo de peso del paciente. No se han observado lesiones patológicas obvias inducidas por el morfógeno cuando el morfógeno maduro (p.ej., OP-1, 20 \mug) es administrado diariamente durante 21 días a ratas con crecimiento normal. Además, 10 \mug del morfógeno en inyecciones sistémicas (p.ej., OP-1) inyectadas diariamente durante 10 días a ratones normales recién nacidos no producen ninguna anormalidad grotesca.

En la administración de morfógenos sistémicamente, se prefiere usar una dosis de carga de volumen grande al principio del tratamiento. El tratamiento es continuado luego con una dosis de mantenimiento. La administración posterior puede ser determinada vigilando a intervalos los niveles del morfógeno en la sangre.

Cuando se induce deliberadamente una lesión en tejido, como ocurre por ejemplo, en un procedimiento quirúrgico, se prefiere suministrar el morfógeno justo antes o al mismo tiempo que la inducción del trauma. Preferiblemente, el morfógeno se administra profilácticamente en ambientes quirúrgicos.

Alternativamente, una cantidad efectiva de un agente capaz de estimular los niveles endógenos de un morfógeno puede ser administrada por cualquiera de las rutas descritas anteriormente. Por ejemplo, un agente capaz de estimular la producción del morfógeno y/o su secreción de las células en los tejidos afectados y/o tejidos transplantados puede ser suministrado a un mamífero p.ej., por administración directa del agente al tejido que será tratado. Un método para identificar y analizar los agentes capaces de modular los niveles de morfógenos endógenos en un tejido dado es descrito en forma general en el Ejemplo 15 aquí, y en detalle en el documento pendiente USSN 752.859, presentado el 30 de agosto de 1991. Dicho en pocas palabras, pueden ser identificados y analizados compuestos que son candidatos incubando el compuesto in vitro con un tejido o células en prueba, durante un tiempo suficiente para permitir que el compuesto efectúe la producción, es decir la expresión y/o la secreción del morfógeno producido por las células de ese tejido.

Para los propósitos de la invención presente, los morfógenos descritos anteriormente, efectivos en el alivio de daños en tejidos asociados con lesiones por isquemia y reperfusión son administrados antes o durante la restauración del oxígeno (p.ej., restauración del riego sanguíneo, reperfusión). En casos donde el tratamiento es para una lesión ya existente, el agente terapéutico es preferiblemente administrado como una infusión intravenosa suministrada agudamente después de que ocurre una condición de hipoxia o isquemia. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser administrado por infusión intravenosa inmediatamente después de un infarto cerebral, un infarto de miocardio, asfixia, o una parada cardiorrespiratoria. En casos donde la lesión de isquemia o hipoxia es deliberada y/o inevitablemente inducida como parte de, por ejemplo, un procedimiento quirúrgico, donde el riego sanguíneo a un órgano o sistema de órganos es deliberada y/o temporalmente interrumpido, p.ej., enterectomia de la carótida, derivación aortocoronaria, injertos, trasplantes de órganos, terapia fibrinolítica, etc., el agente terapéutico se suministra preferiblemente justo antes o al mismo tiempo que ocurre la reducción de oxígeno en el tejido. Preferiblemente, el morfógeno se administra profilácticamente en un ambiente quirúrgico.

De igual manera, en casos donde lesiones inducidas por hiperoxia hayan ocurrido previamente, el morfógeno es administrado una vez hecho el diagnóstico. En casos donde la lesión por hiperoxia puede ser inducida, por ejemplo, durante el tratamiento de recién nacidos prematuros, o pacientes que sufren de enfermedades pulmonares tales como enfisema, el agente terapéutico es administrado preferiblemente antes de la administración de oxígeno p.ej., profilácticamente.

III. Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de tejidos que expresan morfógenos

La determinación de la distribución de los morfógenos en los tejidos puede ser usada para identificar distintos morfógenos expresados en un tejido particular, así como para identificar nuevos morfógenos relacionados. La distribución en los tejidos también puede ser usada para identificar tejidos útiles que producen morfógenos y que puedan ser usados en la selección e identificación de agentes candidatos que estimulan a los morfógenos. Los morfógenos (o sus transcriptos de mRNA) son fácilmente identificados en distintos tejidos usando metodologías normales y modificaciones mínimas en tejidos donde la expresión pueda ser baja. Por ejemplo, la distribución de una proteína puede ser determinada usando el análisis normal de transferencia Western o técnicas de inmunofluorescencia, y anticuerpos específicos al morfógeno o morfógenos de interés. De forma similar la distribución de transcriptos del morfógeno pueden ser determinados usando protocolos normales de hibridación Northern y sondas específicas para los transcriptos.

Cualquier sonda capaz de hibridarse específicamente con un transcripto y de distinguir el transcripto de interés de otros transcriptos relacionados, puede ser usada. Debido a que los morfógenos descritos aquí comparten una alta homología en las secuencia de sus dominios activos del extremo C-terminal, la mejor manera de determinar la distribución en los tejidos de un transcripto específico de un morfógeno puede ser utilizar una sonda específica para la región pro de la proteína inmadura y/o la región N-terminal de la proteína madura. Otra secuencia útil es el extremo 3' de la región que no codifica y que se encuentra a ambos lados y sigue inmediatamente al codón de terminación. Estas partes de la secuencia varían sustancialmente entre los morfógenos de esta invención, y por consiguiente, son específicas para cada proteína. Por ejemplo, una secuencia de sonda específica para Vgr-1 y que es particularmente útil es el fragmento de PvuII-SacI, un fragmento de 265 pares de bases que codifica tanto una parte de la región pro no traducida así como la región N-terminal de la secuencia madura (véase Lyons et al. (1989) PNAS 86:4554-4558 para una descripción de la secuencia del cDNA). De forma similar, unas secuencias de sonda específicas para mOP-1 particularmente útiles son el fragmento BstXI-BglI, una secuencia de 0,68 Kb que cubre aproximadamente dos tercios de la región pro de mOP-1; un fragmento StuI-StuI, una secuencia de 0,2 Kb inmediatamente precedente al dominio de cisteína-7 en dirección opuesta a la expresión; y el fragmento Ear1-Pst1, un fragmento de 0,3 Kb que contiene una parte de la secuencia 3' no traducida (Véase Secuencia Con NID Nº 18, donde la región pro es definida esencialmente por los restos 30-291). Enfoques similares pueden ser usados, por ejemplo, con hOP-1 (secuencia Con NID Nº 16) o OP-2 humana o de ratón (Secuencia NID Nº 20 y 22).

Usando estas secuencias específicas para morfógenos, que pueden ser sintéticamente construidas u obtenidas a partir de secuencias clonadas, los transcriptos de morfógenos pueden ser identificados en tejidos mamíferos usando metodologías normales bien conocidas por los expertos en este campo. Dicho en pocas palabras, se prepara RNA total a partir de varios tejidos murinos adultos (p.ej., hígado, riñón, testículos, corazón, cerebro, timo, y estómago) usando una metodología normal tal como el método de Chomczyaski et al. (1987) Anal Biochem 162:156-159) y descrito a continuación. Se prepara poli A+ RNA usando cromatografía con celulosa-oligo (dT) (p.ej., tipo 7 de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). Poli A+RNA (generalmente 15 \mug) de cada tejido es fraccionado en un gel de 1% agarosa/formaldehído y transferido a una membrana Nytran (Schleicher & Schuell). Después de transferir, la membrana se hornea a 80ºC y el RNA es fuertemente enlazado a la membrana usando luz ultravioleta (generalmente 30 segundos a 1 mW/cm^{2}). Antes de la hibridación, la sonda adecuada es desnaturalizada por calor. La hibridación es llevada a cabo en un cilindro de lucita que rota en un aparato con botella cilíndrica a una velocidad de aproximadamente 1 rev/min por aproximadamente 15 horas a 37ºC usando una mezcla de hibridación de 40% de formamida, 5 x Denhardts, 5 x SSPE y 0,1% SDS. Siguiendo la hibridación, las cuentas no específicas se separan de las membranas lavándolas en 0,1% SSPE, 0,1% SDS a 50ºC.

Ejemplos demostrando la distribución en los tejidos de varios morfógenos, entre ellos Vgr-1, OP-1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, GDF-1, y OP-2, en tejidos en desarrollo y adultos son divulgados en el documento USSN 752.764 pendiente y en Ozkaynak et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179:116-123, y en Oskaynak et al. (1992) (JBC, en prensa). Utilizando la metodología general de sondas descrita aquí, las hibridaciones con transferencia Northern usando sondas específicas de estos morfógenos para indagar en tejidos de cerebro, bazo, pulmón, corazón, hígado, y riñón, han indicado que los tejidos relacionados con los riñones parecen ser la principal fuente de expresión para OP-1, siendo los tejidos del cerebro, corazón, y pulmón fuentes secundarias. Usando esta metodología de sondas específicas, también fue identificado el RNA_{m} de OP-1 en las glándulas salivares, específicamente en las glándulas parótidas de ratas. El tejido pulmonar parece ser la principal fuente de expresión para Vgr-1, BMP5, BMP4 y BMP3. También han sido observados niveles más bajos de Vgr-1 en tejidos de los riñones y del corazón, mientras que el hígado parece ser una fuente de expresión secundaria para BMP5 y el bazo parece ser una fuente de expresión secundaria para BMP4. GDF-1 parece ser expresada principalmente en tejidos del cerebro. Hasta ahora, OP-2 parece ser expresada principalmente en tejidos embriónicos jóvenes. Específicamente, las transferencias Northern de embriones murinos y de animales de 6 días de vida desde el nacimiento demuestran una expresión abundante de OP-2 en embriones de 8 días. La expresión es reducida significativamente en embriones de 17 días y no es detectada en animales después de nacer.

Ejemplo 2 Morfógenos activos en fluidos corporales

La expresión de OP-1 ha sido identificada en saliva (específicamente la glándula parótida de la rata, véase Ejemplo 1), suero sanguíneo humano, y en varias formas de leche, incluyendo extractos de la glándula mamaria, calostro, y leche bovina de 57 días. Además, y como se describe en el texto de USSN 923.780, la proteína extraída de los fluidos corporales es morfogénicamente activa. El descubrimiento de que el morfógeno está presente de modo natural en leche y saliva, junto con la observación conocida de que la forma activa, madura de OP-1 es estable en medio ácido y resistente a proteasas, indican que la administración oral es una ruta útil para la administración terapéutica del morfógeno a un mamífero. La administración oral es el modo típicamente preferido de entrega en terapias prolongadas o profilácticas. Además, la identificación de morfógenos en todas las formas de leche, incluyendo calostro, sugiere que la proteína puede jugar un papel significativo en el desarrollo de los tejidos, incluyendo el desarrollo del esqueleto, en los jóvenes.

2.1 Detección de morfógenos en la leche

Se purificó parcialmente OP-1 a partir de un extracto de glándulas mamarias de ratas y calostro bovino y leche de 57 días haciendo pasar estos fluidos por una serie de columnas cromatográficas, (por ej. intercambio de cationes, afinidad y fase inversa). En cada etapa se recogió el eluyente en fracciones que se ensayaron para detectar la presencia de OP-1 con inmuno-transferencia normal, las fracciones inmunorreactivas se combinaron luego y se purificaron aún más. El producto final, parcialmente purificado, se examinó para detectar la presencia de OP-1 con la técnica de transferencia Western, utilizando antisueros específicos para OP-1, y se analizó para detectar actividad in vivo e in vitro.

Las OP-1 purificadas de las diferentes fuentes de leche se caracterizaron mediante las técnicas de transferencia Western usando anticuerpos generados contra OP-1 y BMP2. Los anticuerpos se prepararon siguiendo los protocolos inmunológicos normales ampliamente conocidos en este campo, y como se describe en términos generales en el Ejemplo 15, más abajo, utilizando como inmunógenos OP-1 y BMP2 producidas por E. coli de longitud completa. En todos los casos, OP-1 purificada reaccionó solamente con el anticuerpo anti-OP-1 y no con el anticuerpo anti-BMP2.

La actividad morfogénica de OP-1 purificada a partir de extracto de glándula mamaria fue evaluada in vivo esencialmente siguiendo el ensayo del modelo de rata descrito en la patente de EE.UU. No. 4.968.590. En breves palabras, se preparó una muestra a partir de cada fracción inmunorreactiva frente a OP-1 del producto final de OP-1 derivado del extracto de glándula mamaria liofilizando una porción (33%) de la fracción y volviendo a suspender la proteína en 220 \mul de 50% de acetonitrilo/0,1% de TFA. Después de agitar con vórtice, se añadieron 25 mg de matriz de colágeno. Las muestras fueron liofilizadas durante la noche, e implantadas en ratas Long Evans (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, 29 a 35 días de vida). Cada fracción se implantó por duplicado. Para obtener más detalles sobre el procedimiento de implantación se puede ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.968.590. Al cabo de 12 días, se retiraron los implantes y se evaluaron para detectar la formación de nueva formación ósea mediante observación histológica, tal como se describe en la Patente de EE.UU. No. 4.968.590. En todos los casos, las fracciones inmunorreactivas fueron ostogénicamente activas.

2.2 Detección de morfógeno en suero

Es posible detectar un morfógeno en suero usando anticuerpos específicos para el morfógeno. El ensayo se puede realizar utilizando cualquier ensayo inmunológico normal, como transferencia Western (inmuno-transferencia) y otras similares. Preferiblemente, la determinación se realiza utilizando una columna de afinidad a la que se ha fijado un anticuerpo específico para el morfógeno y a través de la cual se vierte luego el suero de muestra, para extraer selectivamente el morfógeno de interés. Luego se eluye el morfógeno. Es posible determinar empíricamente un tampón de elución apropiado determinando las condiciones adecuadas de fijación y elución primero con un control (por ej. morfógeno purificado, producido de manera recombinante). Luego se ensayan las fracciones para determinar la presencia del morfógeno con la técnica normal de inmuno-transferencia, y los resultados se confirman por secuenciación
N-terminal. Preferiblemente, la columna de afinidad se prepara usando anticuerpos monoclonales. Las concentraciones de morfógeno en suero u otras muestras fluidas se puede determinar a continuación utilizando técnicas normales de cuantificación de proteínas, incluyendo absorbancia espectrofotométrica, o por cuantificación del anticuerpo
conjugado.

A continuación, se presenta un protocolo de muestra para identificar OP-1 en el suero. Siguiendo esta metodología general se pueden detectar otros morfógenos en los fluidos corporales, incluyendo el suero. La identificación del morfógeno en el suero indica además que la administración sistémica es una manera adecuada de proporcionar concentraciones terapéuticas de un morfógeno a una persona, y que es muy posible que los morfógenos se comporten de manera sistémica como factores similares a los endocrinos. Por último, usando este protocolo, se pueden detectar fluctuaciones en los niveles del morfógeno endógeno, y estos niveles alterados se pueden utilizar como un indicador de disfuncionalidad hística. Alternativamente, las fluctuaciones en los niveles del morfógeno pueden determinarse vigilando los niveles de transcripción del morfógeno, ya sea por el método normal de análisis de transferencia northern, como se describió en el Ejemplo 1, o por hibridación in situ, usando una sonda marcada capaz de hibridarse específicamente al mRNA del morfógeno, y los protocolos normales de hibridación a RNA descritos claramente en el artículo y descritos en términos generales en el Ejemplo 1.

Se detectó OP-1 en el suero humano usando el siguiente ensayo. Un anticuerpo monoclonal producido frente a OP-1 recombinante de mamíferos, usando técnicas inmunológicas normales, bien descritas claramente en la bibliografía y descritas en términos generales en el Ejemplo 15, fue inmovilizado haciendo pasar el anticuerpo sobre un gel activado con agarosa (por ej. Affi-Gel®, de Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y utilizado para purificar OP-1 a partir del suero. Luego se hizo pasar el suero humano sobre la columna y se eluyó con K-tiocianato 3 M. Luego, las fracciones de K-tiocianato se dializaron en urea 6 M, PO_{4} 20 mM, pH 7,0, se aplicaron a una columna C8 HPLC, y se eluyeron con un gradiente de 25-50% acetonitrilo/0,1% TFA durante 20 minutos. Homopolímeros de OP-1 maduros y producidos de manera recombinante eluyen entre 20 y 22 minutos. Luego se recolectaron las fracciones, que se analizaron para detectar la presencia de OP-1 siguiendo la técnica normal de inmuno-transferencia usando un anticuerpo específico para OP-1 como en el Ejemplo 2.A.

Los niveles de morfógeno administrado o endógeno pueden vigilarse en las terapias aquí descritas comparando la cantidad de morfógeno presente en una muestra de fluidos corporales con un valor predeterminado de referencia, por ejemplo, para evaluar la eficiencia de un protocolo terapéutico, y similar. Además, las fluctuaciones en los niveles de anticuerpos frente al morfógeno endógeno pueden ser detectadas con este método, con mayor probabilidad en suero, utilizando un anticuerpo u otra proteína fijadora capaz de interactuar específicamente con el anticuerpo frente al morfógeno endógeno. Por ejemplo, se pueden usar las fluctuaciones detectadas en los niveles de anticuerpo frente a morfógeno endógeno, como indicadores de un cambio en el estado del tejido. Por ejemplo, cuando un tejido dañado se regenera y la función del tejido u órgano regresa a la "normalidad" y, si no se detecta daño hístico adicional, pueden ser necesarias dosis menores de morfógeno y se puede medir un nivel más elevado de anticuerpo frente al morfógeno circulante.

Ejemplo 3 Efecto del morfógeno después del comienzo del proceso isquémico

El efecto cardioprotector de los morfógenos después de una lesión por isquemia y reperfusión en un mamífero se puede evaluar fácilmente con un modelo de rata. En este ejemplo, se administra el morfógeno (por ej. OP-1) inmediatamente antes del comienzo del proceso isquémico en ratas con infartos de miocardio inducidos experimentalmente, esencialmente siguiendo el método de Lefer, et al. (1990) Science 249:61-64 y (1992) J. Mol. Cell. Cardiol. 24: 385-393. En pocas palabras, se evalúa la pérdida de función del tejido del miocardio después de una isquemia y reperfusión midiendo la pérdida e la actividad de creatina-quinasa miocárdica (CK) y la pérdida de función de vasorrelajación dependiente del endotelio (ver Ejemplo 4, más abajo).

En un primer grupo de ratas anestesiadas con éter, se ocluyó con una ligadura de seda la arteria coronaria izquierda en relación proximal a la primera rama principal a fin de inducir un infarto de miocardio (IM). La ligadura se retiró 10 minutos después de la oclusión para permitir la reperfusión coronaria. De aquí en adelante, se hará referencia a este primer grupo como el grupo con "infarto de miocardio" (IM). Un Segundo grupo de ratas recibió el mismo procedimiento con la excepción de que no se ocluyó la arteria coronaria, y por consiguiente, no se produjo un infarto del miocardio. De aquí en adelante, se hará referencia a este segundo grupo como el grupo con "infarto de miocardio falso" (IM FALSA).

El primer grupo de ratas, el grupo de ratas IM, fue subdividido otra vez en tres sub-grupos. Se inyectaron 2 \mug de morfógeno (OP-1) por vía intravenosa en el primer sub-grupo de ratas IM 10 minutos después de la ligadura, inmediatamente antes de la reperfusión; en el segundo grupo de ratas IM, se inyectaron 20 \mug de OP-1 por vía intravenosa 10 minutos después de la ligadura, inmediatamente antes de la reperfusión; y en el tercer sub-grupo de ratas IM (control) se inyectó solamente un vehículo, por ej. 0,9% de NaCl, igual que para las ratas tratadas con OP-1.

Al cabo de veinticuatro horas, se extirparon los corazones de todas las ratas y se determinaron los niveles de creatina-quinasa (CK) del ventrículo izquierdo (la región infartada) y del septo interventricular (la región no isquémica de control) siguiendo métodos normales. Al comparar las diferencias en actividad de CK en ambas regiones, se utilizó la pérdida de la cantidad de actividad CK de la región infartada como un índice de lesión celular cardíaca en la región infartada.

Como se muestra en la Figura 1, los datos indican que los morfógenos (por ej., OP-1) pueden ofrecer un efecto cardioprotector importante cuando se administran a un tejido isquémico. En la figura, se hace un gráfico de la pérdida de CK como la diferencia en actividad CK específica entre el septo interventricular y el ventrículo izquierdo.

La pérdida de actividad CK por el subgrupo de ratas IM que recibió 2 \mug de OP-1 inmediatamente antes de la reperfusión demostró cierto nivel de protección si se lo compara con las ratas IM de control que recibieron inyecciones de vehículo a solas, cuando los niveles de ambos sub-grupos se miden contra y se comparan con los niveles obtenidos para el control de IM FALSA. Una importante cardioprotección se observó en el sub-grupo que recibió 20 \mug de OP-1 inmediatamente antes de la reperfusión si se lo compara con las ratas IM de control que recibieron inyecciones de vehículo a solas, cuando los niveles de ambos sub-grupos se miden contra y se comparan con los niveles obtenidos para el control de IM FALSA.

Estos datos indican que OP-1 ofrece una importante protección cardíaca cuando se administra después de una isquemia y antes de la reperfusión.

También se puede realizar una variación de este ejemplo administrando morfógeno al animal antes de la inducción de la isquemia. Los experimentos se pueden realizar en ratas normales o con el sistema inmunitario comprometido a fin de evaluar los efectos cardioprotectores del morfógeno administrado antes de la isquemia.

Ejemplo 4 Vasodilatación de tejido cardíaco con infarto de miocardio tratado con morfógeno

Ciertos vasodilatadores como acetilcolina (Ach) y el difosfato de adenosina (ADP, un mediador inmunitario) ejercen una actividad de vasodilatación solamente en presencia de endotelio intacto, que se estimula para liberar una sustancia denominada factor relajante derivado del endotelio (EDRF). Si el endotelio se lesiona de modo que no se libere el EDRF, no ocurre vasodilatación en respuesta a estos agentes dependientes del endotelio. En cambio, varios otros vasodilatadores incluyendo nitroglicerina (NTG) y nitroprusiato, son dilatadores independientes del endotelio, dado que dilatan directamente los vasos sanguíneos.

El presente ejemplo demuestra la capacidad de OP-1 para prevenir la pérdida de actividad de relajación dependiente del cardioendotelio (EDR) en la microvasculatura coronaria tras la reperfusión del miocardio isquémico, y su capacidad para reducir la lesión del miocardio 24 horas después del tratamiento del morfógeno. En síntesis, 2 a 24 horas después del tratamiento de morfógeno se induce la lesión por isquemia y reperfusión en corazones aislados de ratas, los corazones en los que se ha hecho la reperfusión están vasodilatados con ACh o NTG. Si no se ha realizado un tratamiento con morfógeno, el tejido lesionado debe inhibir la vasodilatación inducida por ACh, pero no la vasodilatación inducida con NTG. Se anticipa que el tratamiento de morfógeno mejore la vasodilatación inducida por ACh en los corazones con reperfusión.

Por consiguiente, 48 ratas adultas Sprague-Dawley (250 a 330 g) se dividieron en ocho grupos de 6 ratas cada uno. Doce ratas fueron sometidas a infartos de miocardio falsos (IM FALSA), como se describió en el Ejemplo 3. Los corazones de las 36 ratas restantes fueron aislados de la siguiente manera: un conjunto de doce ratas fue inyectado por vía intravenosa con 20 \mug de OP-1 24 horas antes del aislamiento del corazón; otro grupo de ratas fue inyectado por vía intravenosa con 20 \mug de OP-1 2 horas antes del aislamiento del corazón; el grupo final fue inyectado solamente con el vehículo (por ej. NaCl al O,9%). Luego se anestesiaron las ratas con pentobarbital de sodio (35 mg/kg, intraperitoneal); sus corazones fueron aislados y perfundidos por el método de Langerdoff a un flujo constante (15 ml/min) con una solución oxigenada de Krebs-Henseleit (Aoki et al.(1988) J. Pharmacol. 95-35).

Cada grupo de ratas fue luego dividido en dos subgrupos de seis ratas cada uno. Veinte minutos antes de la reperfusión, se midió la respuesta vasodilatadora coronaria induciendo la constricción con 0,05 \mumol U-44619 (9,11-metanoepoxi-postaglandina H_{2}) seguido de un agente vasodilatador 3 minutos después: sub-grupo uno - 15 nmol ACh; sub-grupo dos - 15 nmol NTG y se midió el aumento del nivel de presión de perfusión coronaria (PPC) como un indicación de vasodilatación. Cuando los niveles de PPC regresaron a los valores normales, los corazones fueron sometidos a isquemia reduciendo la infusión coronaria a 15% del flujo de control durante 30 minutos, reestableciendo luego el flujo normal, es decir, reperfusión, por 20 minutos adicionales.

Luego se volvió a medir la respuesta vasodilatadora por constricción y administración de un agente vasodilatador como se describió anteriormente.

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Fig. 2. Antes del evento isquémico, tanto ACh como NTG produjeron resultados vasorrelajantes normales en todos los eventos. Los corazones que recibieron OP-1 24 horas antes de la isquemia demostraron una respuesta de aproximadamente 70% al ACh, en tanto que los corazones que recibieron OP-1 dos horas antes de la isquemia demostraron una respuesta de 55% al ACh. El grupo que recibió el vehículo a solas demostró una respuesta de 40% al ACh. Por último, el grupo de control que no fue sometido a la isquemia demostró una respuesta ACh de aproximadamente 95%. Esto demuestra que los vasodilatadores dependientes del endotelio ejercen una respuesta vasodilatadora reducida tras isquemia y reperfusión en el corazón de la rata. Aún más, OP-1 conservó considerablemente la dilatación dependiente del endotelio cuando se administró 24 horas antes de la inducción de la isquemia del miocardio. No ocurrió ningún defecto en la vasodilatación como respuesta al vasodilatador directo (NTG); las actividades vasodilatadoras inducidas por NTG fueron 95% de la inicial en los corazones expuestos a isquemia y 100% de la inicial en los corazones sin isquemia.

Ejemplo 5 Efecto del morfógeno sobre la adherencia de neutrófilos

El papel de la adherencia de neutrófilos en la disfuncionalidad del endotelio y los efectos cardioprotectores de los morfógenos en la modulación de esta actividad pueden evaluarse usando un ensayo normal de adherencia de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) como la descrita por Lefer et al. (1992) J. Mol. Cell. Cardiol. 24: 385-393. En pocas palabras, se aislaron segmentos de la arteria mesentérica superior de ratas que habían sido tratadas con el morfógeno (OP-1, 20 \mug) o con NaCl al 0,9%, 24 horas antes del aislamiento de la arteria. Los segmentos se limpiaron, cortaron en anillos transversales de 1 a 2 mm de largo, y estos fueron posteriormente abiertos e incubados en una solución de K-H a 37ºC, pH 7,4. Los neutrófilos fueron preparados y marcados de manera fluorescente usando procedimientos normales (por ej., los leucocitos se aislaron en ratas esencialmente siguiendo el procedimiento de Pertroft et al. (1968) Exp. Cell. Res. 50: 355-368, se lavaron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), se purificaron por centrifugación en gradiente; y se marcaron por el método de Yuan et al. (1990) Microvasc. Res 40: 218-229.

Luego se agregaron neutrófilos marcados a los baños con los anillos abiertos y se activaron con leucotrieno B4 (LTB4) 100 nM. Los anillos fueron incubados por 20 minutos y el número de neutrófilos adheridos a la superficie endotelial fue determinado de manera visual con microscopía fluorescente.

Como se muestra en la Figura 3, los PMN no estimulados (es decir, los PMN solos) añadidos a los baños no se adhirieron considerablemente al endotelio vascular. En los anillos que se obtuvieron de ratas inyectadas con NaCl al 0,9%, la activación de los neutrófilos con LTB_{4} (100 nM) aumentó significativamente el número de PMN que se adhirieron al endotelio (P<0,001). OP-1 (20 \mug administrados 24 horas antes) inhibieron considerablemente la adherencia de los PMN activados con LTB_{4} (P<0,01 del control).

Ejemplo 6 Modelos in-vivo para la protección frente a isquemia y reperfusión en los tejidos de los pulmones, nervios y riñones

Otros tejidos gravemente afectados por la lesión debida a isquemia y reperfusión incluyen el tejido neural, el tejido renal y el tejido pulmonar. El efecto de los morfógenos sobre la paliación de la lesión por isquemia y reperfusión en estos tejidos se pueden evaluar usando metodologías y modelos conocidos por las personas con experiencia en este tema y que se describen más abajo. Igualmente, se proporciona también una metodología para evaluar los efectos protectores del tejido de un morfógeno sobre tejidos lesionados del pulmón luego de una lesión producida por hiperoxia.

Por ejemplo, el modelo de ataque embólico del conejo ofrece un método útil para evaluar el efecto de los morfógenos sobre las lesiones hísticas tras isquemia y reperfusión cerebral. El protocolo que se presenta a continuación es esencialmente el de Phillips et al. (1989) Annals of Neurology 25: 281-285. En pocas palabras, conejos blancos de Nueva Inglaterra (2 a 3 kg) son anestesiados y colocados en un respirador. Luego se cateteriza selectivamente la circulación intracraneal usando la técnica de Seldinger. Se realiza luego una angiografía cerebral basal, utilizando una unidad de sustracción digital. La arteria carótida interna distal o sus ramas es luego selectivamente embolizada con 0,085 ml de trombos autólogos de 18 horas de existencia. La oclusión arterial se documenta con angiografías repetidas inmediatamente después de la embolización. Después de un lapso de tiempo suficiente como para inducir infartos cerebrales (15 minutos o 90 minutos), se induce reperfusión administrando un bolo de un agente de reperfusión como el análogo de TPA conocido como Fb-FB-CF (por ej., 0,8 mg/kg durante 2 minutos).

El efecto del morfógeno en los infartos cerebrales se puede evaluar mediante la administración de diversas concentraciones de morfógenos, por ej. OP-1, en diferentes momentos antes o después de la embolización y/o la reperfusión. Los conejos se sacrifican de 3 a 14 días después de la embolización y se preparan sus cerebros para el examen neuropatológico, fijándolos por inmersión en formalina tamponada neutra al 10% durante por lo menos 2 semanas. Luego se cortan los cerebros en un plano coronal a intervalos de 2 a 3 mm, se numeran y se envían para el procesamiento histológico normal en parafina, y se determina visualmente el grado de necrosis del tejido neural.

Los efectos protectores renales de los morfógenos sobre la lesión por isquemia y reperfusión se pueden determinar usando el modelo de ratón presentado por Oueliette et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 766-771. Resumiendo, se induce quirúrgicamente isquemia renal en ratones machos suizos criados exógenamente y de 35 a 45 días de vida, realizando una nefroctomía derecha normal y ocluyendo la arteria que llega al riñón izquierdo durante 10 a 30 minutos con una pinza de microaneurisma. Entonces se puede administrar el morfógeno de manera parenteral, en diversos momentos antes o después de la oclusión y/o reperfusión. Luego se pueden evaluar los efectos del morfógeno mediante una estimación biológica y una estimación histológica usando técnicas normales bien conocidas en este campo.

Los efectos protectores del tejido manifestados por el morfógeno sobre tejidos expuestos a concentraciones de oxígeno letales por elevadas pueden determinarse mediante el siguiente procedimiento. Ratas adultas (275 a 300 g) reciben primero el morfógeno (por ej. HOP1) o solamente el vehículo, y luego son expuestas a oxígeno al 96 a 98% como se describe en Rinaldo et al. (1983) Am. Rev. Respir. Dis. 130:1065 para inducir hiperoxia. Los animales se guardan en jaulas de plástico (38 cm x 48 cm x 21 cm). Una jaula que contiene 4 a 5 animales se coloca en una cámara de plexiglas estanca al agua, de 75 litros. Se mantiene una atmósfera de 96 a 98% de oxígeno mediante la entrega de gas de O_{2} (O_{2} líquido). Se ajusta el flujo de gas en la cámara para mantener por lo menos 10 intercambios de aire/hora, una temperatura de 22 \pm1ºC, niveles mínimos de condensación en la jaula, y una concentración de dióxido de carbono de < 0,5% medida con un analizador de gas médico espectrofotométrico de masas.

Al cabo de 72 horas, todos los supervivientes son observados en aire ambiente durante 1,5 horas y durante períodos más largos de tiempo para evaluar el grado de dificultad respiratoria y cianosis inducida por la agresión inicial y el daño inmunitario posterior mediado por las células. Al final de la prueba, se anota la cantidad de supervivientes y se compara el grupo tratado con el control no tratado mediante la prueba de proporciones de chi-cuadrados. Se seleccionan al azar varios de los animales supervivientes de cada grupo para el procesamiento histológico del tejido pulmonar.

El tejido pulmonar para procesamiento histológico se fija con una infusión de formalina al 10% tamponada a través de una cánula traqueal a una presión constante de 20 cm de H_{2}O. Después de la fijación durante 24 a 48 horas, se cortan secciones de cada lóbulo y posteriormente se tiñen con hematoxilina y eosina. Luego, se examinan portaobjetos codificados, preferiblemente a doble ciegas para detectar indicios de cambios patológicos, como edema, celularidad intersticial y respuesta inflamatoria.

Ejemplo 7 Inhibición por morfógenos de la respuesta inflamatoria celular y humoral

Los morfógenos aquí descritos inhiben la multinucleación de células fagocíticas mononucleares bajo condiciones en las que estas células serían activadas normalmente, por ej., en respuesta a una lesión hística o la presencia de una sustancia extraña. Por ejemplo, si no hay morfógeno, un material de sustrato implantado (por ej., implantado subcutáneamente) compuesto de, por ejemplo, hueso mineralizado, una cerámica tal como óxido de titanio o cualquier otro sustrato que provoque una formación de células gigantes multinucleadas, queda rápidamente rodeado por células gigantes multinucleadas, por ej., fagocitos activados estimulados para que respondan y destruyan el objeto extraño. Sin embargo, en presencia de morfógeno, las células reclutadas permanecen en su forma precursora mononuclear y el material máximo no se altera. La Figura 4 ilustra este efecto de los morfógenos, en una representación gráfica de los resultados histológicos de un sustrato de óxido de titanio implantado subcutáneamente. En la figura, "mg" significa células gigantescas mononucleadas y "ob" significa osteoblastos. El sustrato representado en la Figura 4B fue implantado junto con el morfógeno (OP-1) y son evidentes osteoblastos recién formados alrededor del sustrato. En cambio, el sustrato representado en la Fig. 4A fue implantado sin morfógeno y es evidente la formación de gran cantidad de células gigantes multinucleadas alrededor del sustrato. Por lo tanto, el efecto del morfógeno inhibiendo la pérdida excesiva de masa ósea en un mamífero también puede incluir la inhibición de la activación de estas células.

Además, los morfógenos aquí descritos igualmente suprimen la producción de anticuerpos estimulada en respuesta a un antígeno extraño en un mamífero. Específicamente, cuando se implantó matriz de colágeno de hueso bovino a solas en un sitio óseo en una rata, se estimuló en la rata una respuesta normal de anticuerpos al colágeno según se pudo determinar mediante los experimentos normales ELISA de anti-colágeno bovino realizados en muestras de sangre extraídas a intervalos de cuatro semanas tras la implantación (por ej., entre 12 a 20 semanas). Las valoraciones de anticuerpos anti-colágeno del suero, medidas con ELISA esencialmente siguiendo el procedimiento descrito por Nagler-Anderson et al. (1986) PNAS 83: 7443-7446, aumentaron consistentemente durante todo el experimento. Sin embargo, cuando se implantó la matriz junto con un morfógeno (por ej., OP-1, dispersado en la matriz y adsorbido al mismo, esencialmente como se describe en la Patente EE.UU. No. 4.968.590) la producción de anticuerpos anti-colágeno bovino fue suprimida considerablemente. Esta capacidad del morfógeno de suprimir la respuesta humoral es una prueba adicional de la utilidad del morfógeno para aliviar el daño hístico asociado con las enfermedades auto-inmunitarias, incluyendo enfermedades originadas por los propios anticuerpos, tales como la artritis reumatoide.

Ejemplo 8 Protección de la mucosa del tracto intestinal, mediante morfógenos, contra ulceraciones e inflamaciones

La mucositis oral es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal en la que se producen ulceraciones de la mucosa de la boca a consecuencia de, por ejemplo, radioterapia o quimioterapia. Aunque normalmente no se trata de una enfermedad típicamente crónica, los efectos de destrucción de tejidos que se producen en la mucositis oral son similares a los que ocurren en enfermedades inflamatorias crónicas tales como la IBD (enfermedad inflamatoria del intestino). El ejemplo que se describe a continuación demuestra la eficacia con la que los morfógenos protegen a la mucosa oral de la mucositis oral en hámsters, incluyendo tanto la inhibición de las ulceraciones inflamatorias como el aumento de la regeneración de los tejidos ulcerados. Para obtener información detallada sobre el protocolo empleado, véase Sonis, et al., (1990) Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 69: 437-443. En base a estos datos, los morfógenos descritos en este documento deberían mostrarse eficaces en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo: IBD, artritis, psoriasis y artritis psoriásica, esclerosis múltiple, y similares.

Un conjunto de hámsters sirios dorados (de 6 a 8 semanas de edad, procedentes de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) se dividió en 3 grupos de ensayo: el Grupo 1 era un grupo de control tratado solamente con solución salina (es decir, placebo); los otros dos grupos se trataron con una dosis baja de morfógenos (100 ng), y con una dosis alta de morfógenos (1 \mug) (Grupos 2 y 3, respectivamente). Las dosis de morfógenos se proporcionaron en una solución de etanol al 30%. Cada grupo contenía 12 animales.

Comenzando el día 0 y siguiendo hasta el día 5, los Grupos 2 y 3 recibieron dos aplicaciones diarias de morfógeno. El día 3, se inició en todos los grupos la inducción de la mucositis. Los días 3 y 5, se inyectó 5-fluorouracilo (60 mg/kg) por vía intraperitoneal. El día 7, y usando una aguja calibrada del 18, se irritó superficialmente la mucosa de la bolsa bucal derecha de los animales. En los animales no tratados, en el día 10 se había inducido una mucositis ulcerativa severa en al menos un 80% de los animales.

En cada administración del vehículo de control (placebo) o del morfógeno, la administración se realizaba secando primero ligeramente la mucosa de la bolsa del carrillo, y luego aplicando uniformemente el vehículo o el morfógeno sobre la superficie de la mucosa. Para mantener el morfógeno en contacto con la mucosa se utilizó un recubrimiento basado en hidroxipropilcelulosa. Este recubrimiento proporcionaba al menos 4 horas de tiempo de contacto.

El día 12, se sacrificaron dos animales de cada grupo para realizar estudios histológicos. Se disecaron la mucosa de la bolsa bucal derecha y el tejido conjuntivo subyacente, fijándolos luego en formalina al 10% aplicando procedimientos de disección e histológicos normales. Los especímenes se montaron sobre parafina y se prepararon para su examen histológico. A continuación, estos cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina y fueron examinados, a ciegas, por tres patólogos orales con experiencia en el estudio de cortes histológicos procedentes de hámsters, siendo puntuados, también a ciegas, con arreglo a un panel de mucositis normal. Se evaluaron el grado de atrofia, la infiltración celular, la desintegración del tejido conjuntivo, el grado de ulceración y la epitelización.

Durante 21 días, se determinó diariamente la puntuación media de la mucositis mostrada por cada grupo experimental, mediante fotografías y examen visual de la bolsa del carrillo derecho de la boca. Las diferencias existentes entre los grupos se determinaron utilizando un ensayo de "t" normal, por ej. el ensayo de la "t" de Student. Además, se contrastaron los datos procedentes de los tres grupos comparando el número de animales que mostraban mucositis severa, usando el análisis estadístico de Chi-cuadrados. Asimismo, se determinó el significado estadístico de las diferencias existentes entre los pesos medios diarios.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 5, que representa gráficamente el efecto del morfógeno (a dosis altas: cuadrados; a dosis bajas: rombos) y del placebo: círculos) sobre las puntuaciones medias de mucositis. Tanto las dosis bajas como altas de morfógeno inhiben significativamente la formación de lesiones, de forma proporcional a la dosis. Además, los resultados de los exámenes histológicos mostraron niveles significativamente menores de atrofia hística, restos celulares, y células efectoras inmunitarias, incluyendo menores cantidades de macrófagos y neutrófilos activados, en los animales tratados con morfógeno, frente a los animales control no tratados.

Ejemplo 9 Efecto de los morfógenos sobre la fibrogénesis y la formación de tejido cicatricial

Los morfógenos descritos en este documento inducen la morfogénesis de tejido en los tejidos dañados o perdidos. La capacidad que estas proteínas tienen para volver a generar tejido nuevo aumenta el efecto antiinflamatorio de las mismas. A continuación se describen una serie de experimentos in vitro que demuestran la capacidad que los morfógenos tienen para inducir la migración y la acumulación de células mesenquimales. Además, los experimentos demuestran que los morfógenos, a diferencia del TGF-\beta, no estimulan la fibrogénesis ni la formación de tejido cicatricial. En concreto, los morfógenos no estimulan la producción de colágeno, de ácido hialurónico (AH) ni de metaloproteinasas en los fibroblastos primarios, elementos todos ellos necesarios para la fibrogénesis o la formación de tejido cicatricial. Por contra, el TGF-\beta, un conocido inductor de fibrosis, pero no de la morfogénesis de tejido, sí que estimula la producción de estos marcadores de la fibrosis.

Se midió la quimiotaxis y la migración de las células progenitoras mesenquimales en cámaras de Boyden modificadas, esencialmente tal y como describe Fava. R.A. et al, (1991), en J. Exp. Med. 173: 1121-1132, utilizando filtros policarbonatados con orificios de 2, 3 y 8 micras a fin de cuantificar la migración de las células progenitoras de neutrófilos, monocitos y fibroblastos. La quimiotaxis se midió en una variedad de concentraciones de morfógeno, a saber: OP-1 10^{-20}M a 10^{-12}M. En el caso de las células progenitoras de neutrófilos y monocitos, concentraciones de 10^{-18} a 10^{-17}M de OP-1 indujeron, de forma sistemática, un máximo de migración, mientras que, en el caso de las células progenitoras de los fibroblastos, la migración máxima se constató a concentraciones de 10^{-14}M a 10^{-13}M de OP-1. En todos los casos, la actividad quimiotáctica pudo inhibirse con anticuerpos anti-OP-1. Con el TGF-\beta, se midieron y observaron actividades de migración similares.

El efecto del morfógeno sobre la fibrogénesis se determinó evaluando la producción de ácido hialurónico (AH), colágeno, colagenasa, e inhibidor hístico de las metaloproteinasas (ITMP), por parte de los fibroblastos.

A partir de explantes de prepucios de niños, se obtuvieron fibroblastos humanos que se mantuvieron en cultivos monocapa empleando procedimientos de cultivo normales. (Véase, por ejemplo, (1976) J. Exp. Med. 144: 1188-1203). Para describirlo sucintamente, se cultivaron fibroblastos en un medio de mantenimiento compuesto de MEM de Eagle, y complementado con aminoácidos no esenciales, ácido ascórbico (50 \mug/ml), tampones NaHCO_{3} y HEPES (pH 7,2), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), anfotericina B (1 \mug/ml), y SFC (suero fetal de ternera) al 9% inactivado por el calor. Los fibroblastos usados como células diana con las que medir la quimiotaxis se mantuvieron en placas de Petri de vidrio de 150 mm de diámetro. Los fibroblastos usados en los experimentos para medir la síntesis de colágeno, ácido hialurónico, colagenasa e inhibidor hístico de las metaloproteinasas (TIMP) se cultivaron en placas de Petri de plástico, para cultivo de tejidos, de 100 mm de diámetro.

Los efectos del morfógeno sobre la producción de ácido hialurónico, colágeno, colagenasa e ITMP por parte de los fibroblastos se determinaron mediante ensayos normales. (Véase, por ejemplo, Posttethwaite et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 629-636, Posttethwaithe (1988) J. Cell Biol. 106: 311-318, y Clark et al (1985) Arch. Bio-chem. Biophys. 241: 36-44). En estos ensayos, se transfirieron fibroblastos a placas de cultivo de tejidos con 24 pozos, con una densidad de 8 x 10^{4} células por pozo. Estos fibroblastos se cultivaron de forma confluente, durante 72 horas, en un medio de mantenimiento que contenía SFC al 9%, y posteriormente se cultivaron en medio de cultivo libre de suero durante 24 horas. A continuación, se retiró el medio de cultivo de todos los pozos, agregándoles diversas concentraciones de OP-1 (en forma soluble o madura, producido mediante recombinación) o de TGF-\beta-1 (R&D Systems, Minneapolis) en 50 \mul de PBS, a fin de triplicar los pozos que contenían las monocapas de fibroblastos confluentes. En los experimentos en los que se midió la producción de colagenasa y de TIMP, se agregó a cada pozo un medio de mantenimiento (450 \mul) que contenía FCS al 5%, extrayéndose el sobrenadante del cultivo de cada pozo 48 horas más tarde y almacenándose éste a -70ºC hasta el momento del ensayo. En los experimentos en los que se evaluó la producción de HA, se agregó a cada pozo un medio de mantenimiento (450 \mul) que contenía FCS al 2,5%, cultivando durante 48 horas. En los experimentos en los que se midió la producción de colágenos por parte de los fibroblastos, se agregó a cada pozo un medio de mantenimiento (450 \mul) libre de suero y de aminoácidos no esenciales, cultivando durante 72 horas. La producción de HA por parte de los fibroblastos se midió marcando los glicosaminoglicanos (GAG) sintetizados de nuevo con [^{3}H]-acetato durante las últimas 24 horas de cultivo y cuantificando la radiactividad liberada tras su incubación con hialuronidasa procedente de Streptomyces hyaluronicus (ICN Biochemical, Cleveland, Ohio), que degrada el ácido hialurónico de forma específica. La producción de colágeno total por parte de los fibroblastos se midió realizando un análisis de las proteínas sensibles a la colagenasa, que refleja la incorporación de [^{3}H]-prolina durante las últimas 24 horas de cultivo, en los colágenos sintetizados de nuevo. Los niveles de colagenasa y de la proteína TIMP en los sobrenadantes de los cultivos de fibroblastos se midieron mediante ELISAs específicos.

Como se aprecia en la Fig. 6, la OP-1 no estimula una producción significativa de colágeno ni de HA, en comparación con el TGF-\beta. En la figura, el panel A muestra el efecto de la OP-1 sobre la producción de colágeno, el panel B muestra el efecto del TGF-\beta sobre la producción de colágeno, y los paneles C y D muestran los efectos de la OP-1 (panel C) y del TGF-\beta (panel D) sobre la producción de HA. Los resultados del morfógeno fueron idénticos ya se emplease la forma soluble o madura de la OP-1. Por contra, la forma latente del TGF-\beta (es decir, la forma del TGF-\beta que tiende a asociarse formando dominios pro de TGF-\beta) no se mostró activa.

Ejemplo 10 Inhibición, por parte de los morfógenos, de la proliferación de células epiteliales

Este ejemplo demuestra la capacidad que tienen los morfógenos para inhibir la proliferación de células epiteliales in vitro, como se determinó por la captación de ^{3}H-timidina utilizando células de cultivo de una línea celular de epitelio pulmonar de visón (ATCC Nº CCL 64), y procedimientos normales de cultivo de células de mamíferos. Para describirlo sucintamente, se cultivaron las células en confluencia, en el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) complementado con SBF (suero fetal bovino) al 10%, 200 unidades/ml de penicilina, y 200 \mug/ml de estreptomicina; este medio de cultivo, junto con las células, se utilizó para sembrar una placa de cultivo celular de 48 pozos, a una densidad celular de 200.000 células por pozo. Una vez alcanzada la confluencia en este cultivo, se reemplazó el medio con 0,5 ml de EMEM complementado con FBS al 1% y penicilina/estreptomicina, incubándolo a 37ºC durante 24 horas. A continuación, se agregaron a los pozos muestras de ensayo de morfógeno en EMEM complementado con FBS al 5%, y se incubaron las células durante otras 18 horas. Tras esta incubación, se agregó 1,0 \muCi de ^{3}H-timidina en 10 \mul a cada pozo, y se incubaron las células a 37ºC durante 4 horas. A continuación, se extrajo el medio y se lavaron las células una vez con solución salina tamponada con fosfato, helada, y se precipitó el DNA agregando 0,5 ml de TCA al 10% a cada pozo, e incubando a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se lavaron las células tres veces con agua destilada helada, y se lisaron éstas con 0,5 ml de NaOH 0,4 M; el lisado de cada pozo se transfirió a un vial de centelleo, y se midió la radioactividad mediante un contador de centelleo (Smith-Kline Beckman).

Los resultados se presentan en la Tabla III, más adelante. El efecto antiproliferativo de los diversos morfógenos ensayados se expresó en forma de recuentos de ^{3}H-timidina (x 1000) integrada en el DNA, y se compararon éstos con las células no tratadas (control negativo) y con el TGF-\beta (1 ng), un factor de acción local del que se sabe que inhibe la proliferación de células epiteliales. COP-5 y COP-7 son productos de biosíntesis que anteriormente ya han demostrado tener actividad osteogénica, capaces de inducir la cascada completa que lleva a la formación de hueso endocondrial en un experimento normal con hueso de rata (véase la Patente de los EE.UU. Nº 5.011.691). Los morfógenos inhiben de forma significativa la proliferación de células epiteliales. Experimentos similares, llevados a cabo con los morfógenos COP-16, bOP (proteína osteogénica de hueso purificada, una proteína dimérica compuesta de CBMP2 y OP-1), y OP-1 recombinante, también inhiben la proliferación celular. bOP y COP-16 también inducen la formación de hueso endocondrial (véase las Patentes de los EE.UU. Nº 4.968.590 y Nº 5.011.691).

TABLA III

	Captación de timidina (x 1000)
control	50,048, 53,692
COP-7-1 (10 ng)	11,874
COP-7-2 (3 ng)	11,136
COP-5-1 (66 ng)	16,094
COP-5-2 (164 ng)	14,43
TGF-\beta (1 ng)	1,86, 1,478

Ejemplo 11 Tratamiento con morfógenos de una enfermedad inflamatoria sistémica

El siguiente ejemplo proporciona un modelo de artritis en ratas, inducida mediante un adyuvante, que demuestra la eficacia de los morfógenos en el tratamiento de la artritis y de otras enfermedades inflamatorias sistémicas. La artritis, inducida mediante adyuvante, en ratas, induce una enfermedad inflamatoria sistémica en la que el hueso y el cartílago sufren cambios similares a los observados en la artritis reumatoide, solo que en un plazo de tiempo mucho menor (véase, por ejemplo, Pearson (1964) Arth. Rheum. 7: 80). Para obtener una descripción detallada del protocolo empleado, véase Walz, et al., (1971) J. Pharmac. Exp. Ther. 178: 223-231.

Para describirlo sucintamente, se distribuyen, de forma aleatoria, ratas Sprague-Dawley hembras (en este caso, de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts), formando tres grupos: control, morfógeno a dosis bajas
(1-10 \mug/kg de peso corporal y día), y morfógeno a dosis altas (10-20 \mug/kg de peso corporal y día), llamados Grupos 1, 2 y 3, respectivamente.

Se induce la artritis mediante un adyuvante en los tres grupos, inyectando 0,05 ml de una suspensión de Mycobacterium butyricum al 1,5% (bacteria muerta) en aceite mineral en la superficie subplantar de la garra delantera derecha. En el día 18 posterior a la inyección de este adyuvante, se determinan los volúmenes de las extremidades de ambas extremidades posteriores. En ausencia de tratamiento mediante morfógenos, en este momento ya se ha inducido una afección artrítica sistémica en las ratas a las que se les ha inyectado el adyuvante, como indica la hinchazón significativa de las extremidades posteriores no inyectadas (<2,3 ml de volumen, medido por desplazamiento del mercurio). Posteriormente, se realizan determinaciones del edema de la garra y puntuaciones de las radiografías de la extremidad posterior no inyectada. Empezando en el día 1, a las ratas de los Grupos 2 y 3 se les administra por vía oral una dosis diaria de morfógeno. Los volúmenes de las extremidades se determinan en los días 29 y 50 posteriores a la inyección del adyuvante; asimismo, se determina el tamaño del edema midiendo la diferencia de volumen en comparación con el día 18. En el día 50, se realizan radiografías de la extremidad posterior no inyectada de cada rata, y se evalúan las lesiones sufridas en las articulaciones empleando una escala arbitraria del 1 al 10 (1 = sin lesiones; 10 = lesiones máximas). Usando un ensayo de la "t" normal, se analizan las diferencias existentes entre el grupo de control y los grupos tratados con morfógeno (edema en el día 29, edema en el día 50 y puntuaciones de las radiografías en el día 50). Las ratas tratadas con morfógenos muestran lesiones uniformemente menores en las articulaciones (es decir, menores edema y puntuaciones de las radiografías), en comparación con las ratas de control, no tratadas.

Como otro ejemplo alternativo, a las ratas de los Grupos 2 y 3 se les administra una dosis diaria de morfógenos, empezando en el día 18 y hasta el día 50, a fin de demostrar la eficacia de los morfógenos en el tratamiento de los animales artríticos.

Ejemplo 12 Inhibición mediante morfógenos de los edemas localizados

El siguiente ejemplo demuestra la eficacia de los morfógenos en la inhibición de una respuesta inflamatoria localizada, en un modelo normal del edema en ratas. Se distribuyen ratas experimentales (aquí, ratas Long-Evans procedentes de Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts), formando tres grupos: Grupo 1, un control negativo, a las que sólo se administra un vehículo; Grupo 2, un control positivo, a las que se administra un agente antiinflamatorio bien conocido y caracterizado (en concreto, la indometacina); y Grupo 3, a las que se administra un morfógeno.

Los Grupos 2 y 3 pueden subdividirse en subgrupos con los que probar dosis bajas, medias y altas (por ejemplo, Grupo 2: 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg y 9,0 mg/kg de indometacina; Grupo 3: 0,1-5 \mug, 5-20 \mug, y 20-50 \mug de morfógeno). 60 minutos después de administrar la indometacina o el morfógeno a las ratas de los Grupos 2 ó 3 (por ejemplo, mediante inyección en la vena caudal, o a través de una sonda oral), se induce la inflamación en todas las ratas mediante una inyección subplantar de una solución de carragenina al 1% (50 \mul) en la garra posterior derecha. Tres horas después de la administración de carragenina, se mide el grosor de la garra como indicación de un edema (es decir, hinchazón) y de una respuesta inflamatoria inducida por la solución de carragenina inyectada.

Tres horas después de la inyección de carragenina, se evidencia una hinchazón significativa en las ratas no tratadas con el morfógeno. Tras la eutanasia, también se mide la inflamación mediante procedimientos histológicos normales: en concreto, se secciona la garra posterior derecha de cada animal a la altura de la articulación del tobillo, se pesa ésta, y luego se fija el tejido de la almohadilla plantar en una solución tamponada neutra de formalina al 10%, preparándose muestras, teñidas con hematoxilina y eosina, para su examen visual.

Las ratas tratadas con morfógeno muestran una inducción del edema, consecutiva a la inyección de carragenina, notablemente inferior a la mostrada por las ratas no tratadas.

Ejemplo 13 Tratamiento con morfógenos de la encefalomielitis alérgica

El siguiente ejemplo demuestra la eficacia de los morfógenos en el tratamiento de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en una rata. La EAE es un modelo animal bien caracterizado que puede servir como referencia para la esclerosis múltiple, una enfermedad autoinmunitaria. Para obtener una descripción detallada del protocolo empleado, véase Kuruvilla, et al., (1991) PNAS 88: 2918-2921.

Para describirlo sucintamente, la EAE se induce en las ratas (p.ej., ratas Long-Evans, Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) inyectando un homogenato de tejido del SNC (por ejemplo, médula espinal) en adyuvante de Freund completo (CFA) en los días -44, -30 y 0 (último día de la inmunización), por vía subcutánea en tres puntos del dorso del animal. Se administra morfógeno diariamente mediante una inyección intraperitoneal, empezando en el día -31. Preferiblemente, se evalúa una serie de intervalos de dosificación del morfógeno (baja, media y alta, como en el Ejemplo 12 descrito anteriormente). A las ratas control sólo se les administra el vehículo que acompaña al morfógeno (por ejemplo, NaCl al 0,9%, o solución salina tamponada). Se examina diariamente a las ratas en busca de signos de la enfermedad, puntuándolas en una escala de severidad ascendiente del 0 al 4.

En ausencia del tratamiento con el morfógeno, en los días +7 al +10 se evidencian disfunciones neurológicas significativas (concretamente, debilidad en las extremidades anteriores y posteriores que va progresando hasta una parálisis total de las extremidades posteriores). A fin de evaluar el grado de necrosis de los tejidos, se realizan análisis hematológicos, de los perfiles químicos séricos y análisis histológicos, y se lleva a cabo histología, empleando procedimientos normales. El tratamiento con morfógenos inhibe significativamente la disfunción neurológica normalmente evidente en los animales afectados de EAE. Además, los marcadores histopatológicos normalmente asociados con la EAE están ausentes en los animales tratados con morfógeno.

Ejemplo 14 Tratamiento con morfógenos de la artritis inducida por colágeno

El siguiente ejemplo demuestra la eficacia de los morfógenos en la inhibición de la respuesta inflamatoria en la artritis inducida por colágeno (CIA) en una rata. La CIA es un modelo animal bien caracterizado que puede servir como referencia para la artritis reumatoide, una enfermedad autoinmunitaria. El protocolo hecho público es esencialmente el publicado en Kuruvilla et al., (1991) PNAS 88: 2918-2921. Para describirlo sucintamente, la CIA se induce en las ratas (p.ej., ratas Long-Evans, Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) mediante la múltiple inyección intradérmica de colágeno bovino Tipo II (en dosis de 100 \mug) en CFA (0,2 ml), en el día 1. Se distribuyen los animales en dos grupos: Grupo 1, animales control, a los que sólo se les administra el vehículo, y el Grupo 2, animales tratados con morfógeno, que, preferiblemente, se subdivide en intervalos de dosificación baja, media y alta, como en el Ejemplo 13, descrito anteriormente. El morfógeno se administra diariamente (mediante una inyección en la vena caudal), comenzando en diferentes días posteriores a la inyección del colágeno, en concreto, comenzando en los días 7, 14, 28, 35 y 42. A lo largo de todo el experimento, se evalúa visualmente a los animales y se vigilan el grosor de las garras y el peso corporal. Se sacrifica a los animales en el día 60 y se preparan, para su evaluación histológica tal y como se ha descrito en los Ejemplos 12 y 13, las articulaciones proximales y distales de las extremidades, así como la oreja, la cola y la médula espinal. Como variación del experimento, puede administrarse el morfógeno durante períodos prescritos, por ejemplo, en períodos de cinco días, comenzando en diferentes días posteriores a la inyección del colágeno (por ejemplo, en los días 0-4, 7-11, 14-18, 28-32).

En ausencia del tratamiento con el morfógeno, normalmente se induce una afección artrítica a los 30 días de la inyección del colágeno. En los animales tratados con el morfógeno, la CIA queda suprimida y los cambios histopatológicos que evidencian normalmente los animales control con CIA inducida (concretamente, acumulaciones de células inflamatorias mononucleares activadas y tejido conjuntivo fibroso) están ausentes. Además, y en coherencia con los resultados obtenidos en el Ejemplo 7 descrito anteriormente, los títulos séricos de anticuerpos anti-colágeno también quedan significativamente suprimidos en los animales tratados con el morfógeno.

Ejemplo 15 Ensayo de detección de compuestos candidatos que alteran los niveles de morfógenos endógenos

Mediante el siguiente ensayo de detección pueden encontrarse compuestos candidatos que pueden administrarse para alterar el nivel de un morfógeno determinado; en este ensayo, el nivel de producción de morfógeno por parte de un tipo de célula que produce niveles medibles de dicho morfógeno se determina tanto incubando como sin incubar la célula en un cultivo en el que también está presente el compuesto, a fin de evaluar los efectos que el compuesto tiene sobre la célula. Esto se puede lograr detectando el morfógeno a nivel de proteína o de RNA. Puede obtenerse también una descripción más detallada en USSN 752.861.

15.1 El crecimiento del cultivo celular

Los cultivos celulares de riñón, cápsulas suprarrenales, vejiga urinaria, cerebro u otros órganos se pueden preparar como se describe ampliamente en la bibliografía. Por ejemplo se puede hacer una explantación de riñones de roedores (ratón o rata) neonatos, recién nacidos, jóvenes o adultos y usarse en cultivos de órganos como tejidos completos o parciales (de 1 a 4 mm). Los cultivos de tejidos primarios y líneas celulares establecidas derivadas también de riñón, cápsulas suprarrenales, vejiga urinaria, cerebro, mama u otros tejidos pueden establecerse en placas de pozos múltiples (de 6 ó 24 pozos) de acuerdo a las técnicas convencionales de cultivo celular y se cultivan en ausencia o presencia de suero durante un período de tiempo (de 1 a 7 días). Las células se pueden cultivar por ejemplo en el medio de Dulbecco modificado por Eagle (Gibco, Long Island, NY) que contiene suero (por ejemplo el suero fetal de ternero del 1% al 10% de Gibco) o en un medio sin suero, según se desee o en un medio definido (que contenga p.ej. insulina, transferrina, glucosa, albúmina u otros factores de crecimiento).

Las muestras para analizar el nivel de producción de morfógeno incluyen sobrenadantes de cultivos o lisados de células recolectados periódicamente y evaluados en cuanto a la producción de OP-1 por análisis de inmunotransferencia (Sambrook et al, eds, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) o una porción del propio cultivo celular, recolectada periódicamente y usada para preparar poliA + RNA para los análisis de RNA. Para vigilar la síntesis OP-1 de novo, (de nueva procedencia) algunos cultivos se etiquetan de acuerdo a los procedimientos convencionales con una mezcla de ^{35}S-metionina/^{35}S-cisteina durante 6 a 24 horas y luego se evalúan para la síntesis OP-1 por métodos convencionales de inmunoprecipitación.

15.2 Determinación del nivel de proteína morfogénica

Para cuantificar la producción de una proteína morfogénica por un tipo de célula, se puede realizar un inmunoensayo para detectar el morfógeno usando un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para esa proteína. Por ejemplo, se puede detectar OP-1 usando un anticuerpo policlonal específico para OP-1 en un ensayo ELISA como se describe a continuación:

Se añade 1 \mug/100 \mul de IgG policlonal de conejo de afinidad purificada específica para OP-1 a cada pozo de una placa de 96 pozos y se incuba a 37ºC durante una hora. Los pozos se lavan cuatro veces con 0,167 de tampón de borato de sodio con NaCl 0,15 M (BSB), pH 8,2, conteniendo 0,1% de Tween 20®. Para minimizar la unión no específica, los pozos se bloquean llenándolos completamente con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en BSB e incubándola durante 1 hora a 37ºC. Los pozos se lavan entonces cuatro veces con BSB conteniendo 0,1% de Tween 20®. Una alícuota de 100 \mul de una dilución apropiada de cada una de estas muestras de ensayo del sobrenadante del cultivo celular se añade a cada célula en triplicado y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación se añaden 100 \mul de suero anti-OP-1 biotinilado de conejo (una solución madre de aproximadamente 1 mg/ml diluida 1:400 en BSB conteniendo 1% de BSA antes de usarse) a cada pozo y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Los pozos se lavan entonces cuatro veces con BSB conteniendo 0,1% de Tween 20®. Se añaden a cada pozo 100 \mul de estrepavidina alcalina (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama; diluida 1:2000 en BSB conteniendo 0,1% de Tween 20® antes de usarse) y se incuban a 37ºC durante 30 minutos. Las placas se lavan cuatro veces con solución salina tamponada con Tris 0,5 M (TBS), pH 7,2, se añaden 50 \mul de substrato (Sistema de amplificación ELISA, Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) a cada pozo y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. Entonces se añaden 50 \mul de amplificador (del mismo juego del sistema amplificador) y se incuban durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene con la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 0,3 M. Se anota el OD a 490 nm de la solución en cada pozo. Para cuantificar OP-1 en un medio de cultivo, se realiza la curva normal OP-1 en paralelo con las muestras de las pruebas.

El anticuerpo policlonal puede preparase como sigue: A cada conejo se le administra inmunización primaria de 100 \mug/500 \mul de un monómero OP-1 producido por E. coli (aminoácidos 328-431 en identificación de secuencia No. 5) en SDS al 0,1% mezclado con 500 \mul de adyuvante de Freund completo. El antígeno se inyecta subcutáneamente en diferentes sitios en la espalda y los costados del animal. Al conejo se le da un refuerzo de la misma manera después de un mes usando el adyuvante Freund incompleto. Siete días después se toman muestras de sangre de la vena de la oreja. Se administran dos refuerzos adicionales y se toman muestras de sangre a intervalos de un mes hasta que se detecta el anticuerpo contra OP-1 en el suero utilizando un ensayo ELISA. Luego se refuerza al conejo cada mes con 100 \mug de antígeno y se obtiene sangre (15 ml cada vez) los días siete y diez después del refuerzo.

Para un morfógeno determinado se pueden preparar anticuerpos monoclonales específicos de la manera siguiente. A un ratón se le administran dos inyecciones de un monómero de OP-1 producido por E. coli. La primera inyección se aplica subcutáneamente y contiene 100 \mug de OP-1 en adyuvante de Freund completo. La segunda inyección se aplica intraperitonealmente y contiene 50 \mug de OP-1 en adyuvante Freund incompleto. El ratón luego recibe un total de 230 \mug de OP-1 (aminoácidos 307-431 en identificación de secuencia No. 5) en cuatro inyecciones intraperitoneales aplicadas en varias ocasiones en un período de ocho meses. Una semana antes de la fusión, ambos ratones se refuerzan intraperitonealmente con 100 \mug de OP-1 (307-431) y 30 \mug de péptido N-terminal (Ser_{293}-Asn_{309}-Cys) conjugado a través de la adición de cisteína a la albúmina sérica de bovino con el agente reticulante SMCC. Este refuerzo se repitió cinco días (IP), cuatro días (IP), tres días (IP) y un día (IV), antes de la fusión. Las células esplénicas del ratón entonces se fusionan a las células del mieloma (por ejemplo 653) a razón de 1:1 usando PEG 1500 (Boehringer Mannheim) y la fusión de las células se coloca en la placa y se seleccionan los anticuerpos específicos OP-1 usando como antígeno OP-1 (307-431). La fusión celular y la selección monoclonal entonces estarán de acuerdo a los procedimientos normales bien descritos en los libros de texto ampliamente usados.

\newpage

El invento puede realizarse en otras formas específicas y las presentes realizaciones consecuentemente deberán considerarse en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas, estando indicado el alcance del invento en las reivindicaciones anejas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTES: KUBERASAMPATH, THANGAVEL

\hskip3,5cm

PANG, ROY H.L.

\hskip3,5cm

OPPERMANN, HERMANN

\hskip3,5cm

RUEGER, DAVID C.

\hskip3,5cm

COHEN, CHARLES M.

\hskip3,5cm

OZKAYNAK, ENGIN

\hskip3,5cm

SMART, JOHN

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: MODULACIÓN INDUCIDA POR MORFÓGENOS DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CREATIVE BIOMOLECULES

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 35 SOUTH STREET

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: HOPKINTON

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: disco flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA DE APLICACIÓN: Patent in Release 1.0, Versión 1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE UNA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 667,274

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 DE MARZO DE 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE UNA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 753.059

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE UNA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 752.764

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO.1

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia genérica 1

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Cada Xaa indica uno de los 20 isómeros L naturales de los \alpha-aminoácidos o un derivado de ellos.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 1:

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia genérica 2

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Cada Xaa indica uno de los 20 isómeros L naturales de los \alpha-aminoácidos o un derivado de ellos.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 2:

21

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia genérica 3

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en donde cada Xaa es seleccionado independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos como se define en la memoria descriptiva.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 3:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Sequencia genérica 4

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en donde cada Xaa es seleccionado independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos como se define en la memoria descriptiva.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 4:

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: hOP-1 (forma madura)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 5:

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: mOP-1 (forma madura)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 6:

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: hOP-2 (forma madura)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 7:

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: mOP-2 (forma madura)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 8:

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CBMP-2A (fx)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 9:

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CBMP-2B (fx)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 10:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: DPP (fx)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 11:

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Vgl (fx)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 12:

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Vgr-1 (fx)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 13:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: cerebral

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

/producto: "GDF-1 (fx)"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 14:

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.822 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hipocampo

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 49..1341

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nombre normal es "hOP1"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 16:

34

36

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 431 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "OPI-PP"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 17:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.873 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Muridae

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: embrionario

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 104..1393

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota: "MOP1 (cDNA)"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 18:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 430 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "mOP1-PP"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 19:

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.723 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hipocampo

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 490..1696

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota "hOP2 (cDNA)"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 20:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 402 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "hOP2-PP"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 21:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.926 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Muridae

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: embrionario

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 93..1.289

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota "mOP2 cDNA"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 22:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

53

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 399 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto "mOP2-PP"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.368 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1368

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: nombre normal "60A"

\vskip0.666000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

AUTORES: WHARTON, KRISTIA.; THOMSEN, GERALD H., GELBERT, WILLIAM M.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TÍTULO: DROSOPHILA, 60A GENE...

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

REVISTA: PROC. NAT'L ACAD. SCI. USA

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 88

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

RESTOS RELEVANTES EN LA INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 3, DE 1 A 1.368

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

PÁGINAS 9214-9218

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

FECHA: OCTUBRE DE 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 24:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 455 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 25:

59

60

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..102

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota "BMP 3"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..104

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota "BMP 3"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 26:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..102

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "BMP5"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 27:

62

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: HOMO SAPIENS

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..102

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "BMP6"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 28:

63

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..102

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: etiqueta OPX

Nota: "En donde Xaa en cada posición se selecciona independientemente de los restos que ocurren en la posición correspondiente en la secuencia C terminal de OP1 u OP2 de ratón o humano (ver info. de secuencias Nos. 5, 6, 7 y 8 ó 16, 18, 20 y 22)".

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 29:

64

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: secuencia genérica 5

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en donde cada Xaa es seleccionado independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos como se define en la memoria descriptiva.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 30:

65

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA Nº 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: secuencia genérica 6

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en donde cada Xaa es seleccionado independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos específicos como se define en la memoria descriptiva.

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 31:

66

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.238 pares de bases, 372 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácidos nucleicos, aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: cerebral

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto: "GDF – 1"

\hskip5,9cm

/nota: "GDF-1 cDNA"

\vskip0.666000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

AUTORES: Lee, Se-Jin

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TÍTULO: Expresión de Crecimiento/Factor 1 de Diferenciación

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

REVISTA: Proc. Nat'l Acad. Sci.

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

VOLÚMEN: 88

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

RESTOS RELEVANTES: 1 al 1238

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

PÁGINAS 4,250-4,254

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

FECHA: MAYO DE 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 32:

67

68

69

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENAS: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTI SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: humano

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: cerebral

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función

\hskip5,9cm

/producto: GDF-1

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO. 33:

70

71

Claims (23)

1. El uso de un morfógeno seleccionado del grupo que consiste en OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16; o un morfógeno que comprende una proteína dímera, que induce morfogénesis específica de tejido en un mamífero (por ejemplo, el ser humano) y comprende un par de polipéptidos plegados, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden

(a)

la secuencia del dominio con siete cisteínas de la OP-1 humana, OP-1 de ratón, OP-2 humana, OP-2 de ratón o 60A; o

(b)

una secuencia de aminoácidos seleccionada de la identificación de secuencia Nos. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 26, 27, 28 ó 29 (CBMP2A(fx), CBMP2B(fx), DPP(fx), Vgl(fx), Vgr-1(fx), GDF-1(fx), BMP3, BMP5, BMP6 u OPX); o

(c)

una secuencia de aminoácidos de los restos 38 a 139 de la identificación de secuencia Nº 5, 6, 7 u 8, o los restos 354 a 455 de la identificación de secuencia Nº 24,

para la fabricación de un medicamento para:

(a)

modular una respuesta inflamatoria; o

(b)

aliviar los efectos de destrucción de tejido asociados con la respuesta inflamatoria a la lesión hística.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, para modular una respuesta inflamatoria en tejidos de mamíferos, en el que la modulación de dicha respuesta inflamatoria comprende:

(a)

alivio de fibrosis o de formación de tejido de cicatrización; y/o

(b)

inhibición de adherencia de las células efectoras inmunitarias al endotelio vascular; y/o

(c)

alivio de inflamación intersticial; y/o

(d)

alivio de edema o eritema; y/o

(e)

alivio de necrosis del tejido inflamatorio.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la respuesta inflamatoria está asociada con lesión hística (pudiendo tener la lesión una causa, por ejemplo, química, mecánica, biológica o inmunitaria).

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento se administra: (a) para la profilaxis o el tratamiento de la lesión de dicho tejido; y/o (b) en una cantidad eficaz para inhibir la fibrogénesis o estimular la regeneración específica de tejido de dicho tejido lesionado o dañado; y/o (c) para inhibir la pérdida o la reducción de la funcionalidad de dicho tejido; y/o (d) de modo oral, parenteral o tópico; y/o (e) disperso en adhesivo líquido para tejidos; y/o (f) en aerosol.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que la lesión de dicho tejido incluye:

(a)

lesión por isquemia y reperfusión; o

(b)

lesión hiperóxica.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5(a), en el que dicha lesión por isquemia y reperfusión está:

(a)

asociada con paro cardíaco, oclusión pulmonar, oclusión arterial (por ejemplo, de la arteria renal), oclusión coronaria o apoplejía oclusiva; o

(b)

asociada con cirugía o la reducción o interrupción del flujo sanguíneo en un órgano durante un procedimiento clínico (por ejemplo, enterectomía de carótida, derivación de arteria coronaria, un procedimiento de injerto de tejido, un trasplante de órgano o una terapia fibronolítica); o

(c)

asociada con infarto cerebral, infarto de miocardio, asfixia o parada cardiorrespiratoria.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5(b), en el que la lesión hiperóxica está asociada con el tratamiento de:

(a)

un nacimiento prematuro; o

(b)

enfisema; o

(c)

asfixia.

8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tejido es pulmonar, cardíaco, hepático, neural, pancreático, sinovial, cutáneo o renal, por ejemplo, en el que:

(a)

el tejido es tejido renal y el mamífero padece nefritis glomerular, aterosclerosis o diabetes, o

(b)

el tejido es tejido cardíaco y el mamífero padece aterosclerosis o enfermedad vascular, o

(c)

el tejido es tejido pancreático y el mamífero padece diabetes, o

(d)

el tejido es tejido sinovial y el mamífero padece artritis,

(e)

el tejido es tejido cutáneo y el mamífero padece dermatitis o psoriasis,

(f)

el tejido es tejido pulmonar y el mamífero padece bronquitis, enfisema, fibrosis pulmonar idiopática, asma, asfixia o síndrome de disnea en el adulto.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que la lesión del tejido incluye:

(a)

una respuesta inflamatoria mediada por las células del sistema inmunitario; o

(b)

una enfermedad inflamatoria (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria crónica); o

(c)

una respuesta inmunitaria anómala; o

(d)

edema o eritema.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9(a), 9(c) o 9(d), en el que la lesión de tejido incluye:

(a)

una respuesta inflamatoria aguda generalizada; o

(b)

inflamación de las vías respiratorias.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 9(b), en el que la enfermedad inflamatoria incluye:

(a)

una enfermedad autoinmunitaria; o

(b)

artritis, psoriasis, dermatitis, enfermedad inflamatoria del intestino o diabetes.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que:

(a)

en la reivindicación 10(a) la respuesta inflamatoria aguda está asociada con asfixia o síndrome de disnea en el adulto; o

(b)

en la reivindicación 10(b) la inflamación de las vías respiratorias está asociada con bronquitis crónica, enfisema, fibrosis pulmonar idiopática o asma.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que:

(a)

en la reivindicación 11(a) la enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, esclerosis múltiple o esclerosis lateral amiotrófica); o

(b)

en la reivindicación 11(b) la artritis es reumatoide, degenerativa o psoriásica.

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que la modulación de la respuesta inflamatoria se efectúa por administración del medicamento antes o después de la lesión, por ejemplo antes o después de la reducción o interrupción del flujo sanguíneo o después de la reanudación del flujo sanguíneo, cuando la lesión es una lesión por isquemia y reperfusión.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 6(b), en el que dicha intervención clínica es un procedimiento de injerto de tejido (por ejemplo, piel, médula ósea o tejido de la mucosa gastrointestinal) o de trasplante de un órgano (por ejemplo; pulmón, corazón, riñón, hígado o páncreas).

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la modulación de la respuesta inflamatoria es afectada por la administración del medicamento:

(a)

en el momento o después de la extirpación del órgano o tejido de un donante hospedante; o

(b)

durante el almacenaje o transporte del órgano o tejido previo al implante en el receptor hospedante; o

(c)

en el momento o después del implante en el receptor hospedante.

17. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho medicamento comprende el morfógeno disperso en un vehículo acuoso fisiológicamente aceptable, apropiado para la administración parenteral a un mamífero.

18. Una composición farmacéutica para uso en el alivio de la lesión asociada con la exposición del tejido de mamíferos a concentraciones tóxicas de oxígeno, que comprende un morfógeno disperso en un vehículo acuoso fisiológicamente aceptable a una concentración eficaz para aliviar extravasación de células efectoras inmunitarias, inflamación intersticial, edema, necrosis o fibrogénesis en tejidos de mamíferos en riesgo de padecer o que padecen dicha lesión, seleccionándose dicho morfógeno del grupo que consiste en OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16; o comprendiendo dicho morfógeno una proteína dímera que induce la morfogénesis específica de tejido en mamíferos, comprendiendo dicha proteína dímera un par de polipéptidos plegados, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden el dominio de siete cisteínas de la región C-terminal de la OP-1 humana (restos 38-139 de identificación de secuencia No. 5), comprendiendo dicha composición además un anticoagulante o un agente inhibidor con un radical libre de oxígeno.

19. Una solución conservante para mantener la viabilidad ex vivo de células o tejido de mamíferos o un órgano de mamíferos, que comprende una formulación fluida que tiene una presión osmótica sustancialmente equivalente a la presión osmótica de las células vivas de mamíferos y un morfógeno disperso en dicho fluido a una concentración eficaz para aliviar la extravasación de células efectoras inmunitarias, inflamación intersticial, edema, necrosis o fibrogénesis en dichas células, tejido u órgano, seleccionándose dicho morfógeno del grupo que consiste en OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16; o comprendiendo dicho morfógeno una proteína dímera que induce morfogénesis específica de tejido en un mamífero, comprendiendo dicha proteína dímera un par de polipéptidos plegados, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden el dominio de siete cisteínas de la región C-terminal de la OP-1 humana (restos 38- 139 de identificación de secuencia No. 5).

20. Una solución, de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende además un azúcar, un anticoagulante o un agente inhibidor de radicales libres de oxígeno; o formulada además para mantener sustancialmente normales los niveles de ATP en dichas células, tejido u órgano.

21. La composición de la reivindicación 18 o la solución de la reivindicación 19 ó 20, en la que el morfógeno es como se define en la reivindicación 1.

22. Un método ex vivo para proteger un tejido vivo de mamíferos u órgano trasplantado de mamíferos contra una lesión asociada con la respuesta inflamatoria de células activas efectoras inmunitarias, que comprende la etapa de proporcionar a dicho tejido u órgano un morfógeno seleccionado del grupo que consiste en OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16; o comprendiendo dicho morfógeno una proteína dímera que induce morfogénesis específica de tejido en un mamífero, comprendiendo dicha proteína dímera un par de polipéptidos plegados, cuyas secuencias de aminoácidos comprenden el dominio de siete cisteínas de la región C-terminal de la OP-1 humana (restos 38-139 de identificación de secuencia No. 5).

23. El método de reivindicación 22, en el que:

(a)

el tejido u órgano es como se define en la reivindicación 15; y/o

(b)

el morfógeno es como se define en la reivindicación 1;

(c)

el morfógeno es proporcionado en la forma de una solución como se define en la reivindicación 19 ó 20.