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EP0781339A2 - Verfahren zur herstellung von polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinante bakterienstämme zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur herstellung von polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinante bakterienstämme zur durchführung des verfahrens

Info

Publication number
EP0781339A2
EP0781339A2 EP95931149A EP95931149A EP0781339A2 EP 0781339 A2 EP0781339 A2 EP 0781339A2 EP 95931149 A EP95931149 A EP 95931149A EP 95931149 A EP95931149 A EP 95931149A EP 0781339 A2 EP0781339 A2 EP 0781339A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
mol
polyhydroxy fatty
approx
hydroxyhexanoic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95931149A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Steinbüchel
Matthias Liebergesell
Henry Valentin
Andreas Pries
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Buck Chemisch Technische Werke GmbH and Co
Buck Werke GmbH and Co
Monsanto Co
Original Assignee
Buck Chemisch Technische Werke GmbH and Co
Buck Werke GmbH and Co
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Buck Chemisch Technische Werke GmbH and Co, Buck Werke GmbH and Co, Monsanto Co filed Critical Buck Chemisch Technische Werke GmbH and Co
Publication of EP0781339A2 publication Critical patent/EP0781339A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/01—Saturated compounds having only one carboxyl group and containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C59/10—Polyhydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of polyhydroxy acids according to claim 1, a recombinant bacterial strain according to claim 19, a polyhydroxy fatty acid according to claim 23 and a DNA fragment according to claim 33.
  • a major disadvantage of organic synthetic plastics is that many of these plastics have enormous biological half-lives or cannot be disposed of in landfills or in waste incineration plants in a harmless manner, but rather aggressive gases are frequently generated, as is the case, for example of polyvinyl chloride, which releases hydrogen chloride gas during combustion.
  • a first step towards success on environmentally compatible materials was achieved with the synthetic plastics, for example with the paraffin-like polymers polyethylene, polypropylene, since these essentially only release CO 2 and water during combustion.
  • renewable raw materials such as plants that contain a lot of polysaccharide, such as potatoes, maize, wheat, beans, peas or the like, to obtain the polysaccharides that occur naturally in these plants and to use them to produce polymers that can be used in plastics technology to produce which are biodegradable.
  • hydroxy fatty acids were used as building blocks of naturally occurring polyhydroxy fatty acids (PHF) wrote.
  • the hydroxyl group of this PHF is usually in the 3 'position.
  • the aliphatic side chains are either saturated or mono- or di-unsaturated. They are thus unbranched or branched and they can be substituted with functional groups such as halogen atoms, preferably bromine, iodine, chlorine, cyano groups, ester groups, carboxyl groups or also with cyclically aliphatic and even aromatic groups.
  • the hydroxyl group is also in the 4 'or 5' position.
  • poly (3-hydroxybutyric acid) has been detected in eukaryotes as the only PHF.
  • This polyester comes in yeasts such as Saccharomyces cere visiae, various plants, for example cauliflower, various organs from animals, for example liver, and also in humans, for example in blood plasma, before [Reusch, RN 1992, Biological complexes of polyhydroxybutyrate, FEMS Microbiol. Rev. 103: 119-130].
  • the proportion of poly (3-hydroxybutyric acid) in eukaryotes is at most 0.1% by weight. Inclusions in the form of grana, as they occur in prokaryotes, are not known in eukaryotes.
  • the eukaryotic PHF are usually not in free form, but the polyester is either bound to other proteins or as a complex spanning the cytoplasmic membrane together with calcium ions and polyphosphate molecules.
  • the biosynthesis of PHF in bacteria can be divided into three phases:
  • phase I the carbon source offered to the bacteria in the medium is first absorbed into the bacterial cell.
  • Either special uptake transport systems have to exist for the corresponding carbon source or the cells are cultivated under conditions which create a certain artificial permeability of the cytoplasmic membrane for the carbon source.
  • Some non-ionic carbon sources for example fatty acids in non-dissociated form, can also get into the cells by passive diffusion.
  • phase II the absorbed carbon source is converted into a suitable substrate for the enzyme that is able to produce PHF.
  • This enzyme is commonly referred to as polyhydroxy fatty acid synthase.
  • Phase III involves the linking of monomeric precursors to the polyester. This reaction is catalyzed by the enzyme PHF synthase, which is the key enzyme in PHF biosynthesis. These enzymes are bound to the PHF-Grana and they are there on the surface. Due to the very low specificity of most of the PHF synthases investigated to date, which occur in different species, the biosynthesis of a large number of different PHFs is possible. So far, only the coenzyme A thioesters of hydroxy fatty acids have been detected as monomeric biosynthetically active precursors. As shown above, PHF synthase is the key enzyme in PHF synthesis.
  • Type I is represented by the PHF synthase from the bacterium Alcaligenes eutrophus, which has been most closely examined with regard to the PHF metabolism and has a molecular weight of approximately 63,940 and catalyzes the synthesis of PHF from short-length hydroxy fatty acids.
  • Type II is represented by the Pseudomonas oleovarans PHF synthase.
  • the size of this enzyme is similar to that of Type I PHF synthases (molecular mass 62400), but it differs considerably in terms of substrate specificity from Type I PHF synthases. Only 3-hydroxy fatty acids of medium chain length can be incorporated into PHF. In contrast, 4- and 5-hydroxyfatty acids and 3-hydroxybutyric acid are not incorporated into the biosynthesized polyesters. However, the specificity of the enzyme is still so wide that approx. 50 different 3-hydroxy fatty acids can be processed as substrates.
  • Type III is represented by Chromatium vinosum PHF synthase. In terms of substrate specificity, this enzyme is similar to Type I PHF synthases. However, it has a significantly lower molecular mass (approx. 39730) and requires a second protein in order to be catalytically active.
  • PHF poly(2-hydroxybutyric acid)
  • poly (3HB) poly (3HB)
  • copolyester poly (3-hydroxybutyric acid-co-3-hydroxyvalerianic acid) poly (3HB-co-3HV)
  • these polymers can be prepared using conventional injection molding processes , Extrusion blow molding and injection blow molding processes as well as by fiber spinning techniques.
  • the first stage is used to grow the bacterial cells to high densities and takes about 48 hours and only glucose is offered as a substrate.
  • the cells have grown into a phosphate limitation and, after a further 40 to 50 hours of cultivation, cell densities of more than 100 g of dry cell mass per liter with a PHF with glucose and with propionic acid as a precursor for the building block 3-hydroxyvaleric acid. Share of more than 70 wt .-% reached.
  • the cells are then removed using an enzyme cocktail consisting essentially of lysozyme, proteases and other hydrolyti see enzymes is treated, which releases the PHF grana.
  • the granas sediment on the bottom of the reactor and are collected, washed, dried, melted, extruded and granulated from there.
  • This PHF is currently produced with a production volume of approx. 300 tons per year.
  • poly (3HB) and poly (3HB-co-3HV) have good properties and can be processed using the methods commonly used in plastics technology, their production is still relatively expensive on the one hand and on the other hand only contains them two monomeric subunits, so that the overall properties of the resulting polymer can only be controlled by means of these two parts, and thus a fine control with regard to flexibility, processability in plastics technology systems, resistance to certain solvents etc. cannot be controlled in fine steps .
  • 3-hydroxyvaleric acid gives a PHF good flexibility and processability
  • the building block 4-hydroxyvaleric acid which can also occur in the PHF synthesized by bacteria, gives the resulting biopolymer a significantly higher degree of flexibility confers than is the case with 3-hydroxyvaleric acid alone.
  • the above object is achieved by the features of patent claim 1.
  • the object is achieved according to the features of patent claim 19.
  • the above object is achieved by the features of patent claim 23.
  • the DNA fragment according to claim 33 also achieves the above object.
  • it is possible for the first time to produce polyesters containing 4HV, starting from levulinic acid.
  • the chemical structure of levulinic acid is shown in the following formula:
  • levulinic acid is a 4-oxopentanoic acid that is easily soluble in water, alcohol and ether.
  • the PHF-free mutants GPpl04 from Pseudomonas putida (Huismann, GW, Wonink, E., Meima, R., Kazemier, W., Trpstra, P. and Witholt, B. (1991) J .Biol.Chem.
  • strains have the special property that they contain essentially exactly those DNA fragments which contain and express the genes phaE and phaC; because the gene products phaE and phaC together are able to develop a PHF synthase activity.
  • nucleotide sequences which carry the phaE and p ⁇ aC genes can additionally have common control regions, for example promoters, S / D sequences, or the like.
  • the inventors of the present invention found that the recombinant bacterial strains which contain and express at least one fragment of the Thiocapsa pfenigii PHF synthase gene are also capable of 5-hydroxyhexanoic acid, its salts, esters and lactones into a copolyester biosynthesized by these bacteria.
  • 5-Hydroxyhexanoic acid was prepared starting from 4-acetoacetic acid, which was quantitatively reduced with NaBH4.
  • 5-Hydroxyhexanoic acid (5HHx) as a building block was detected by gas chromatography after methanolysis both in lyophilized cells and in isolated and purified polyester.
  • the isolated and purified polyester was subjected to 13 C-NMR and ⁇ H-NMR analysis and the incorporation of 5 HHx was thereby confirmed.
  • analysis of the polyester accumulated by the bacterial cells showed a polyester content of over 40% by weight of the dry cell mass, a typical polymer containing: Approx. 71 mol% 3-hydroxybutyric acid, approx. 4 mol% 3-hydroxyhexanoic acid, approx. 23 mol% 5-hydroxyhexanoic acid and approx. 2 mol%. 3-hydroxyoctanoic acid.
  • 4-Hydroxyheptanoic acid was prepared by saponifying ⁇ -heptalactone with NaOH.
  • the analysis of the polymer accumulated by the recombinant cells showed a polyester content of approximately 40% by weight of the dry cell mass.
  • a typical polymer contained approx. 43 mol% 3-hydroxybutyric acid, approx. 16 mol% 3-hydroxyvaleric acid, approx. 27 mol% 3-hydroxyhexanoic acid, approx. 5 mol% 3-hydroxyheptanoic acid, approx. 6 mol%. 4-hydroxyheptanoic acid and approx. 6 mol% 3-hydroxyoctanoic acid.
  • 4-Hydroxyoctanoic acid is prepared by saponifying ⁇ -lactone with NaOH.
  • the bacterial cells accumulated the synthesized copolyester to a content of approximately 20% by weight of the dry cell mass.
  • the new copolyesters produced by means of the process according to the invention likewise had thermoplastic properties and could be processed without problems using the techniques customary in plastics technology.
  • thermoplastic copolymers which had a high degree of biocompatibility, which makes these materials appear to be applicable for use in medical technology - for example as implants - or as sutures or the like.
  • the duration of the cultivation of the microorganisms used for the purposes of the present invention depends on the culture conditions, which are mainly dependent on the temperature, the oxygen content of the medium (aerobic conditions) and the medium itself, amount of the carbon source, the mineral salts, the trace elements and / or the pH value.
  • the amount of substrate used depends on the particular microorganism. However, concentrations in the range of approx. 0.1% (w / v) to 10% (w / v) can correspond to 100g / l, in particular 0.2 (w / v) to 5% (w / v).
  • the cell harvest can generally take place during the log phase up to the stationary phase, preferably it should take place in the stationary phase.
  • the bacterial cells can either be obtained from the medium in their entirety after a single culture (batch or fed-batch process) or can be obtained continuously via a continuous culture, for example by conventional centrifugation or filtration processes.
  • the harvested cells can, if appropriate after washing, for example with a buffer, preferably with a phosphate buffer, particularly preferably with a sodium phosphate buffer in the neutral range of about pH 7.0, be frozen, lyophilized or treated by spray drying.
  • a buffer preferably with a phosphate buffer, particularly preferably with a sodium phosphate buffer in the neutral range of about pH 7.0, be frozen, lyophilized or treated by spray drying.
  • polyesters according to the invention can be obtained by known methods, preferably the solution or the extraction is carried out with organic solvents, in particular by halogenated, preferably chlorinated hydrocarbons, particularly preferably by chloroform or methylene chloride.
  • the copolyesters obtained according to the invention are easy to process as thermoplastics and can be used in a variety of ways.
  • thermoplastics for example in surgery for objects for wound closure, for example as suture material or staples or the like, as a fastening element for bones, for example fixation pins, plates, screws, dowels, as separating, filling or covering material, for example in the form of tissue, fleece, Cotton wool.
  • the polyesters according to the invention can be used in pharmaceutical galenics, for example as auxiliaries, carrier materials, release systems for pharmaceuticals or for the encapsulation and / or microencapsulation of substances and active ingredients.
  • biodegradable packaging materials such as foils, bottles, ampoules, cans, bags, boxes, boxes or the like, is possible using the present invention.
  • the advantage of preculturing the recombinant bacteria according to claim 2 in a complex medium is that a strong increase in the biomass is initially achieved in this way, in order then to biochemically stimulate the bacteria for the biosynthesis of the desired PHF.
  • An additional, growth-promoting carbon source according to claim 3 to add to the nutrient medium for the bacterial culture has the advantage that on the one hand, different subunits can be installed, and on the other hand, that the bacteria sometimes grow considerably faster and at the same time a larger amount of biosynthesize the desired PHF.
  • the measures of claim 4 have the advantage that the method of the present invention can be carried out using the methods customary in industrial biotechnology.
  • the measures of claim 5 have the advantage that an economic relationship between polyester yield and dry bacterial cell mass can be obtained, so that the yield obtained is economically worthwhile.
  • the lower limit for profitability can be in the order of approximately 30% by weight of polyester, based on the dry cell mass of the bacterial cell.
  • the measures of claim 6 have the advantage that in the case of copolyesters with at least two subunits, the chemical, biochemical and physical properties of the polyester can be adjusted in fine steps by varying the different subunits if the appropriate substrates are offered to the bacteria.
  • Allowing the recombinant bacteria to grow up with cell densities of up to 100 g dry cell mass per liter of bacterial nutrient medium according to claim 7 has the advantage that relatively small volumes contain a considerable biomass and thus significantly increase productivity with appropriate dimensioning of large-scale plants than lower cell densities.
  • the measures of claim 10 have the advantage that the entire process can be better controlled in the direction of higher yields by gradually increasing the concentration of the substrate carbon source.
  • the measures of claims 11, 12 and 13 reflect advantageous process conditions for the biotechnological production of PHF according to the present invention.
  • the measures of claims 14 and 15 have the advantages that all methods common in biotechnology for breaking down bacteria can be used to obtain the biotechnologically produced PHF. Since these are generally heavier than the surrounding nutrient medium and the cell debris, the PHF can easily be separated and obtained by accelerated sedimentation, for example by centrifugation.
  • the measures of claim 16 have the advantage that the PHF is precipitated by introducing a PHF product dissolved by means of an organic solvent into water or a lower alcohol, preferably ethanol, and a cleaning step is thereby achieved which is a recrystallization process in organic chemistry for cleaning up the desired product.
  • an enzyme cocktail according to claims 17 and 18 has the advantage that specifically the bacterial cell wall and the membrane are destroyed enzymatically, so that the grana, which contain the PHF, fall out of the cytoplasm and sediment to the bottom of the reactor.
  • proteolytic and lytic enzymes for example lysozyme or lipases
  • the entire biotechnological approach essentially consists of macromolecules - namely the desired synthesized polyester - and a large number of smaller molecules which are formed by enzymatic cleavage of the nucleic acids, proteins, glycoproteins, polysaccharides and lipids contained in the cells, as well as the cell wall and cell membrane, and which can thus be easily separated from one another, oh ne that the isolated PHF contain significant impurities from other bacterial compounds.
  • detergents are particularly advantageous here, since proteins and nucleic acids in particular are thereby still solubilized and they are then broken down by the other enzymes, as if they were suspended in the aqueous solutions as colloid particles.
  • care must be taken that detergents in which the enzymes used are still or even more actively are used.
  • Such a mild detergent is, for example, octylglucoside.
  • it is known, for example, of the V8 protease from Staphylococcus aureus that it still exhibits a strong proteolytic activity in 1 to 2% sodium dodecyl sulfate.
  • Claims 19 to 21 relate to novel recombinant bacterial strains according to the invention which contain and express the genes phaC and phaE from Thiocapsa pfennigii which are relevant for PHF synthesis.
  • the Ba / ⁇ HI fragment B28 contained in the newly constructed bacterial strains according to the invention was obtained after Ba / ⁇ HI digestion of the EcoRI fragment E156 and essentially comprises the two genes phaC and phaE.
  • the bacterial strains according to the invention provide particularly high yields of PHF.
  • Claim 23 relates to a PHF as can be obtained by a process according to one of Claims 1 to 18, in particular the following PHF or polyester or copolyester could be prepared according to Claim 24 by the process according to the invention: (A) 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid, and 4-hydroxyvaleric acid;
  • Claims 25 to 32 indicate preferred quantitative compositions of the PHF, as obtained with the method according to the invention. All PHF obtained can be processed as thermoplastic and are extremely flexible.
  • Claims 33 and 34 relate to a DNA fragment which carries the genes phaC and phaE from Thiocapsa pfennigii. The phaC gene encodes the phaC protein and the phaE gene encodes the phaE protein.
  • FIG. 1 shows the DNA sequence of a DNA fragment according to the invention from Thiocapsa pfennigii and the amino acid sequence of the phaC and phaE proteins.
  • the 2.8 kb DNA fragment shown in FIG. 1 is obtained by BamHI digestion of a 15.6 kb EcoRI fragment from Thiocapsa pfennigii. 1 shows the assignment of the amino acid sequences of the phaC and phaE proteins (in the IUPAC one letter code) to their corresponding genes phaC (DNA sequence section 1322 to 2392) and phaE (DNA sequence section 180 to 1280).
  • example 1 shows the assignment of the amino acid sequences of the phaC and phaE proteins (in the IUPAC one letter code) to their corresponding genes phaC (DNA sequence section 1322 to 2392) and phaE (DNA sequence section 180 to 1280).
  • Example 2 The procedure was as given in Example 1, except that instead of Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014 :: E156) the strain Alcali ⁇ enes eutrophus PHB ⁇ 4 (pHP1014 :: E156) was used, and that instead of neutralized octane acid 0.3% neutralized gluconic acid was offered as a carbon source in addition to levulinic acid.
  • polyesters had the analytical data shown below, where "A" represents the 13 C-NMR spectrum and "B" the 1 H-NMR spectrum.
  • the signal assignment results from the numbering given in the structural formula of poly (3HB-CO-3HV-CO-4HV) shown. The gas chromatogram after methanolysis of this polyester is then shown.
  • Example 2 The procedure was as described in Example 2, except that the volume of the inoculum from the preculture was only 3 ml and that was inoculated with 50 ml of the above-mentioned mineral salt medium in a 500 ml Erlenmeyer flask as the main culture. The flasks were then shaken aerobically for 72 hours before cell harvesting.
  • the analysis of the polymer accumulated by the cells showed a polyester content of approx. 25 percent by weight of the dry cell mass.
  • the polymer consisted of approximately 61 mol% 3-hydroxybutyric acid, approximately 32 mol% 3-hydroxyvaleric acid and approximately 7 mol% 4-hydroxyvaleric acid.
  • the analysis of the polymer accumulated by the cells showed a polyester content of approx. 37 percent by weight of the cell dry matter.
  • the polymer consisted of approx. 37 mol% 3-hydroxybutyric acid, approx. 50 mol% 3-hydroxyvaleric acid and approx. 13 mol% 4-hydroxyvaleric acid.
  • 5HHx as a building block was detected by gas chromatography after methanolysis both in lyophilized cells and on isolated and cleaned polyester.
  • the isolated and purified polyester was also subjected to 13 C-NMR and 1 H-NMR analysis, and the incorporation of 5 HHx was confirmed thereby.
  • 5-Hydrohexanoic acid was prepared starting from 4-acetoacetic acid, which was reduced quantitatively with NaBH 4 .
  • the analysis of the polymer accumulated by the cells showed a polyester content of approx. 36 percent by weight of the dry cell mass.
  • the polymer consisted of approx. 71 mol% 3-hydroxybutyric acid, approx. 4 mol% 3-hydroxyhexanoic acid and approx. 23 mol% 5-hydroxyhexanoic acid and approx. 2 mol% 3-hydroxyoctanoic acid (also a minimal amount of 4-hydroxyoctanoic acid).
  • polyesters had the analytical data shown below, where "A” represents the 13 C-NMR spectrum and "B" the 1 H-NMR spectrum.
  • the signal assignment is based on the numbering that is shown in the structural formula of poly (3HB-co-3HHx- co-5HHx-3HO).
  • the GC analysis after methanolysis is then shown.
  • 4-Hydroxyheptanoic acid was prepared by saponifying ⁇ -heptalactone with NaOH.
  • the polymer consisted of 43 mol% 3-hydroxybutyric acid, 16 mol% 3-hydroxyvaleric acid, 27 mol% 3-hydroxyhexanoic acid, 5 mol% 3-hydroxyheptanoic acid, 6 mol% 4-hydroxyheptanoic acid and 3-hydroxyoctanoic acid.
  • the analysis of the polymer accumulated by the cells showed a polyester content of approx. 18 percent by weight of the dry cell mass.
  • the polymer consisted of approx. 75 mol% of approx. 3-hydroxybutyric acid, approx. 22 mol% of 3-hydroxyhexanoic acid, approx. 1.5 mol% of 3-hydroxyoctanoic acid and approx. 3 mol% of 4-hydroxy-octanoic acid.
  • P. putida GPp104 PHF accumulated to a maximum of approx. 50% of the dry cell mass, which consists of 3-hydroxybutyric acid (approx. 70 to 90 mol%), 3-hydroxyvaleric acid (approx. 1 to 5 mol%), 3-hydroxyhexanoic acid (approx. 10 to 20 mol%), 3-hydroxyoctanoic acid (approx. 1 to 5 mol%) and 4-hydroxyoctanoic acid (approx. 0.5 to 4 mol%).
  • Example 2 The procedure was as described in Example 1, except that the volume of the inoculum from the preculture was only 3 ml, and that was inoculated with 50 ml of the mineral salt medium mentioned above in a 500 ml Erlenmeyer flask as the main culture. The flasks were then shaken aerobically for 72 hours before cell harvesting.
  • a copolyester of the formula poly (3HB-co-3HHx-co-4HHx) could be produced, the analytical data of which are reproduced below.
  • the polyesters had the analytical data shown below, where "A” represents the 13 C-NMR spectrum and "B” the * H-NMR spectrum.
  • the signal assignment results from the numbering given in the structural formula of poly (3HB-co-3HHx-co-4HHx) shown.
  • the gas chromatogram after methanolysis is then shown.
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • 3HHx 3-hydroxyhexanoic acid
  • 4HHx 4-hydroxyhexanoic acid.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinante Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens. Darüber hinaus werden neue Polyhydroxyfettsäuren sowie neue Substrate zur Herstellung konventioneller und neuer Polyhydroxyfettsäuren beschrieben. Ferner betrifft die Erfindung auch ein DNA-Fragment, welches für einen PhaE und einen PhaC-Bestandteil der Polyhydroxyfettsäuresynthase aus Thiocapsa pfennigii codiert sowie die entsprechende Polyhydroxyfettsäuresynthase.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinante Bakterienstänαne zur Durchführung des
Verfahrens
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxysäuren gemäß Anspruch 1, einen rekombinanten Bakterienstamm gemäß Anspruch 19, eine Polyhydroxyfettsäure gemäß Anspruch 23 sowie ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 33.
Im Zeitalter des wachsenden Umweltbewußtseins finden sich in Industrie und Wissenschaft vermehrt Ansätze zur Herstellung von biologisch abbaubaren Polymeren. Dabei sollen diese neuartigen umweltverträglichen Polymere im wesentlichen dieselben Eigenschaften aufweisen wie diejenigen Polymere, welche seit Jahrzehnten durch organisch-chemische Synthese hergestellt werden.
Dabei soll insbesondere die Verarbeitbarkeit der neuartigen, biologisch abbaubaren Polymere der Verarbeitung üblicher Kunststoffe mit gleichen Methoden, wie beispielsweise Extrudieren, Spritzgießen, Spritzpressen, Schäumen usw., gegeben sein.
Ein großer Nachteil der organisch-synthetischen Kunststoffe ist es jedoch, daß viele dieser Kunststoffe enorme biologisehe Halbwertszeiten aufweisen bzw. sich auf Mülldeponien bzw. in Müllverbrennungsanlagen nicht auf unschädliche Art und Weise entsorgen lassen, sondern es entstehen vielmehr häufig aggressive Gase, wie beispielsweise im Falle des Polyvinylchlorids, welches bei der Verbrennung Chlorwasserstoffgas freisetzt. Ein erster Schritt in Richtung Erfolg auf umweltverträgliche Materialien wurde mittels der synthetischen Kunststoffe, beispielsweise durch die paraffinartigen Polymere Polyethylen, Polypropylen erzielt, da diese bei Verbrennung im wesentlichen nur CO2 und Wasser freisetzen.
Darüber hinaus wurden auch viele Anstrengungen unternommen, mittels sogenannter nachwachsender Rohstoffe, wie beispielsweise stark polysaccharidhaltigen Pflanzen, wie Kartoffeln, Mais, Weizen, Bohnen, Erbsen oder dergleichen, an die in diesen Pflanzen natürlich vorkommenden Polysaccharide zu gelangen und aus ihnen für die Kunststofftechnik verwertbare Polymere herzustellen, welche biologisch abbaubar sind.
Bei derartigen Polymermaterialien aus nachwachsenden Rohstoffen ist man jedoch im wesentlichen auf die natürliche Beschaffenheit der in diesen höheren Pflanzen vorkommenden Polymere angewiesen und als Modifikation auf genetischer Ebene bieten sich nur relativ komplexe Verfahren sowohl der klassischen Züchtung als auch der modernen Gentechnik an.
Einen wesentlich weiteren Schritt in Richtung auf natürlich vorkommende Polymere, welche den Kunststoffthermoplasten recht ähnlich sind, brachte die Entdeckung der Poly(3- Hydroxybuttersäure) durch Lemoigne 1926 [Lemoigne, M. (1926) Prσduits de deshydration et de Polymerisation de l'acide ß-oxybutyric, Bull. Soc. Chim. Biol. (Paris) 8:770- 782]. Die Entdeckung von Lemoigne kann als wegweisend betrachtet werden für die Weiterentwicklung von modernen Polyhydroxyfettsäuren, welche auch Polyhydroxyalkanoate genannt werden und chemisch lineare Ester von Hydroxyfettsäuren darstellen - und damit schlußendlich Polyester sind. In den 80er Jahren und insbesondere in den letzten fünf Jahren wurden weitere Hydroxyfettsäuren als Bausteine von in der Natur vorkommenden Polyhydroxyfettsäuren (PHF) be schrieben. Dabei befindet sich die Hydroxylgruppe dieser PHF meist in 3' Stellung. Die aliphatischen Seitenketten sind entweder gesättigt oder einfach bzw. zweifach ungesättigt. Sie sind somit unverzweigt oder verzweigt und sie können mit funktioneilen Gruppen, wie beispielsweise Halogenatomen, vorzugsweise Brom, Jod, Chlor, Cyanogruppen, Estergruppen, Carboxylgruppen oder auch mit zyklisch aliphatischen und sogar auch aromatischen Gruppen substituiert sein. Bei einigen Hydroxyfettsäuren befindet sich die Hydroxylgruppe auch in 4'- oder in 5'-Stellung.
Polyhydroxyfettsäuren wurden bisher sowohl in Gram-positiven als auch in Gram-negativen, in aeroben und anaeroben, in heterotrophen und autotrophen, in Eubakterien und Archaebakterien sowie in anoxygenen und oxygenen photosynthetischen und somit in nahezu allen wichtigen Bakteriengruppen nachgewiesen. Die Befähigung zur Synthese von derartigen Polyestern stellt somit anscheinend keine besonders anspruchsvolle oder seltene biochemische Stoffwechselleistung dar. Meist setzt die Biosynthese der PHF dann ein, wenn eine verwertbare Kohlenstoffquelle bei gleichzeitigem Mangel einer anderen Nährstoffkomponente im Überschuß vorliegt. Dabei kann Stickstoff-, Phosphor-, Schwefel-, Eisen¬, Kalium-, Magnesium- oder Sauerstoffmangel die PHF-Synthese in Bakterien auslösen [Anderson, A.J. und Dawes, E.A. (1990) Occurence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiol. Rev. 54: 450-472; Steinbüchel, A. (1991) Polyhydroxyalkanoic acids: In: D.Byrom (Hrsgb) Biomaterials, Macmillan Press, New York, Seiten 123-213]. In den meisten Bakterien werden PHF in Form von Einschlüssen bzw. Grana im Cytoplasma abgelagert, wobei der Anteil an der Zelltrockenmasse bis zu 95 Gew.-% betragen kann. In Eukaryonten wurde als einzige PHF bisher lediglich Poly( 3-Hydroxybuttersäure) nachgewiesen. Dieser Polyester kommt in Hefen, wie beispielsweise Saccharomyces cere visiae, verschiedenen Pflanzen, beispielsweise Blumenkohl, verschiedenen Organen aus Tieren, beispielsweise Leber, sowie auch im Menschen, beispielsweise im Blutplasma, vor [Reusch, R.N. 1992, Biological complexes of polyhydroxy- butyrate, FEMS Microbiol . Rev. 103: 119-130]. Im Unterschied zu Prokaryonten liegt der Anteil von Poly( 3-Hydroxy- buttersäure) bei Eukaryonten jedoch bei maximal 0,1 Gew.-%. Einschlüsse in Form von Grana, wie sie bei den Prokaryonten vorkommen, sind bei den Eukaryonten nicht bekannt. In der Regel liegen die eukaryontischen PHF auch meist nicht in freier Form vor, sondern der Polyester liegt entweder gebunden an andere Proteine oder als ein die Cytoplasmamembran durchspannender Komplex zusammen mit Calciumionen und Polyphosphatmolekülen vor.
Somit ist für industrielle biotechnologische Zwecke lediglich eine Produktion von PHF in Bakterien von Interesse.
Die Biosynthese von PHF in Bakterien kann in drei Phasen unterteilt werden:
In Phase I wird die den Bakterien im Medium angebotene Kohlenstoffquelle zunächst in die Bakterienzelle aufgenommen. Entweder müssen für die entsprechende Kohlenstoffquelle spezielle Aufnahmetransportsysteme existieren oder die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine gewisse künstliche Permeabilität der Cytoplasmamembran für die Kohlenstoffquelle erzeugen. Einige nicht-ionische Kohlenstoffquellen, beispielsweise Fettsäuren in nicht-dissoziierter Form, können auch durch passive Diffusion in die Zellen gelangen.
In Phase II wird die aufgenommene Kohlenstoffquelle in ein geeignetes Substrat für dasjenige Enzym, welches in der Lage ist, PHF herzustellen, umgewandelt. Dieses Enzym wird im allgemeinen als Polyhydroxyfettsäuresynthase bezeichnet. Hier sind zahlreiche mehr oder weniger komplexe Reaktions folgen, die sowohl anabolische als auch katabolische Enzyme der Reaktionswege einschließen können, denkbar und auch bereits nachgewiesen worden. Phase III umfaßt die Verknüpfung von monomeren Vorstufen zum Polyester. Diese Reaktion wird durch das Enzym PHF- Synthase katalysiert, welche das Schlüsselenzym der PHF- Biosynthese darstellt. Diese Enzyme sind an die PHF-Grana gebunden und sie befinden sich dort an der Oberfläche. Bedingt durch die sehr geringe Spezifität der meisten bisher darauf untersuchten PHF-Synthasen, die in unterschiedlichen Spezies vorkommen, ist die Biosynthese einer Vielzahl verschiedener PHF möglich. Als monomere biosynthetisch aktive Vorstufen wurden bisher ausschließlich die Coenzym A-Thioester von Hydroxyfettsäuren nachgewiesen. Wie oben gezeigt wurde, ist die PHF-Synthase das Schlüsselenzym der PHF-Synthese.
Nachdem das Strukturgen der PHF-Synthase aus Alcaligenes eutrophus unabhängig voneinander in drei verschiedenen Laboratorien kloniert und sequenziert worden war, wurden die Strukturgene für das Schlüsselenzym aus ca. 20 verschiedenen Bakterien kloniert [Slater, S.C., Voige, H. und Dennis, D.E. (1988) Cloning and expressing escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-β-hydroxybutyrate biosynthetic pathway, J. Bacteriol. 170: 4431-4436; Schubert, P, Steinbüchel, A. und Schlegel, H.G. (1988) Cloning of the Alcaligenes eutrophus gene for synthesis of poly-β- hydroxybutyric acid and synthesis of PHB in Escherichia coli, J. Bacteriol. 170: 5837-5847; Peoples, O.P. und Sinslkey, A.J. (1989) Poly-β-hydroxybutyrate biosynthesis and Alcaligenes eutrophus H16. Identification and characterization of the PHB polymerase gene (phbC ) , J. Biol. Chem. 264: 15298-15303].
Derzeit wurden von mindestens 12 Polyhydroxyfettsäure- synthasegenen (PHF-Synthasegenen) die Nukleotidsequenzen ermittelt. Aufgrund der hiervon abgeleiteten Primärstrukturen für die Enzyme und aufgrund physiologischer Daten können nunmehr drei verschiedene Typen von PHF-Synthasen unterschieden werden. Typ I wird durch die PHF-Synthase aus dem bezüglich des PHF-Stoffwechsels am genauesten untersuchten Bakterium Alcaligenes eutrophus repräsentiert, welche ein Molekulargewicht von ca. 63 940 besitzt und die Synthese von PHF aus Hydroxyfettsäuren mit kurzer Kettenlänge katalysiert. Neben 3-Hydroxypropionsäure, 3-Hydroxy- buttersäure und 3-Hydroxyvaleriansäure werden auch 4- Hydroxybuttersäure, 4-Hydroxyvaleriansäure und 5-Hydroxy- valeriansäure in einen Copolyester aus verschiedenen Hydroxyfettsäureuntereinheiten eingebaut. Typ II wird von der PHF-Synthase aus Pseudomonas oleovarans repräsentiert. Dieses Enzym weist eine ähnliche Größe wie die Typ I PHF-Synthasen auf (Molekularmasse 62400), es unterscheidet sich jedoch erheblich bezüglich der Substratspezifität von den Typ I PHF-Synthasen. Es vermag nur 3-Hydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlänge in PHF einzubauen. 4- und 5-Hydroxyfettsäuren und 3-Hydroxybuttersäure werden dagegen nicht in die biosynthetisierten Polyester eingebaut. Die Spezifität des Enzyms ist jedoch noch so breit, daß ca. 50 verschiedene 3-Hydroxyfettsäuren als Substrate verarbeitet werden können.
Typ III wird von der PHF-Synthase aus Chromatium vinosum repräsentiert. Dieses Enzym ähnelt von der Substratspezifi- tät her den Typ I PHF-Synthasen. Es weist jedoch eine deut- lieh niedrigere Molekularmasse auf (ca. 39730) und benötigt ein zweites Protein, um katalytisch aktiv zu sein.
Soweit man bisher PHF aus Bakterien isoliert hat, weisen diese äußerst interessante Eigenschaften auf: Sie sind thermoplastisch verformbar, wasserunlöslich, biologisch abbaubar, nicht-toxisch und optisch aktiv, soweit es sich nicht um Homopolyester von ω-Fettsäuren handelt. Für Poly(3-Hydroxybuttersäure) wurde ferner gezeigt, daß es biokompatibel ist und daß es piezoelektrische Eigenschaften aufweist. Für Poly( 3-Hydroxybuttersäure)[Poly(3HB)] sowie für den Copolyester Poly( 3-Hydroxybuttersäure-co-3-hydroxyvalerian- säure)[Poly(3HB-co-3HV)] wurde gezeigt, daß diese Polymere mit konventionellen Spritzgußverfahren, Extrusionsblas- und Spritzblasverfahren sowie durch Faserspinntechniken verar- beitet werden können.
Zur großtechnischen Produktionsreife avancierten bislang lediglich zwei Polyhydroxyfettsäuren, nämlich der Homopoly- ester Poly(3HB) sowie der Copolyester Poly ( 3HB-co-3HV). Das Copolymer wird unter dem Handelsnamen "Biσpol" vermarktet.
Die Herstellung dieser Biopolymere ist in der EP-A 69 497 offenbart. Die Polymerproduktion wird als zweistufiger Fed- Batch-Prozeß in einem 35 m-3 Air-Liftreaktor sowie in Rühr- kesselreaktoren mit Arbeitsvolumina von bis zu 200 m3 mit einer Doppelmutante von Alcaligenes eutrophus als Produktionsorganismus und mit Glucose und Propionsäure als Koh- lenstoffquellen unter Phosphatlimitation durchgeführt [Byrom, D. (1990) Industrial production of copolymer from Alcaligenes eutrophus. In: Dawes, E.A. (Hrsg) Novel bio- gradable microbial polymers, Seiten 113-117, Kluwer Academic Publishers, Doordrecht]. Die erste Stufe dient der Anzucht der Bakterienzellen zu hohen Dichten und dauert ca. 48 Stunden und es wird lediglich Glucose als Substrat ange- boten. In der zweiten Stufe sind die Zellen in eine Phos- phatlimitierung hineingewachsen und mit Glucose sowie mit Propionsäure als Vorstufe für den Baustein 3-Hydroxyvale- riansäure werden nach weiteren 40 bis 50 Stunden Kultivierung Zelldichten von mehr als 100 g Zelltrockenmasse pro Liter mit einem PHF-Anteil von mehr als 70 Gew.-% erreicht. Die Zellen werden dann mittels eines Enzymcocktails, der im wesentlichen aus Lysozym, Proteasen und anderen hydrolyti sehen Enzymen besteht, behandelt, wodurch die PHF Grana freigesetzt werden. Die Grana sedimentieren auf dem Boden des Reaktors und werden von dort gesammelt, gewaschen, getrocknet, geschmolzen, extrudiert und granuliert.
Diese PHF wird derzeit mit ca. 300 Jahres-Tonnen Produktionsmenge produziert. Obwohl diese mikrobiell hergestellten Biopolymere Poly(3HB) und Poly( 3HB-co-3HV) gute Eigenschaften haben und mit den in der Kunststofftechnologie üb- liehen Methoden verarbeitet werden können, ist deren Produktion zum einen jedoch noch relativ teuer und zum anderen enthält es lediglich zwei monomere Untereinheiten, so daß die Gesamteigenschaften des entstehenden Polymers nur durch diese beiden Anteile gesteuert werden können und so- mit eine Feinsteuerung in bezug auf Flexibilität, Verar- beitbarkeit in kunststofftechnologischen Anlagen, Widerstandsfähigkeit gegenüber bestimmten Lösungsmitteln usw. nicht in feinen Schritten gesteuert werden kann. Obwohl 3-Hydroxyvaleriansäure einer PHF eine gute Flexibilität bzw. Verarbeitbarkeit verleiht, hat sich herausgestellt, daß beispielsweise der Baustein 4-Hydroxyvalerian- säure, welcher zusätzlich in den von Bakterien synthetisierten PHF vorkommen kann, dem entstehenden Biopolymer ei- nen deutlich höheren Grad an Flexibilität verleiht als dies durch 3-Hydroxyvaleriansäure allein der Fall ist.
Im Stand der Technik wurde 4-Hydroxyvaleriansäure (4HV) als neuer Baustein in bakteriellem PHF nachgewiesen. Verschie- dene Bakterien waren in der Lage, Polyester mit diesem neuen Baustein zu synthetisieren. Es handelte sich dabei meist um Copolyester, die neben 4HV noch 3-Hydroxybutter- säure und 3-Hydroxyvaleriansäure als Baustein enthielten. Allerdings konnten diese Terpolyester bisher jedoch nur ausgehend von teuren toxischen SpezialChemikalien, die die Bakterien als Vorstufensubstrate bzw. als Kohlenstoffquelle für die PHF-Biosynthese angeboten wurden, hergestellt werden.
Insbesondere beschreiben Valentin, H.E, Schönebaum, A. und Steinbuehel, A. (1992), Appl .Microbiol .Biotechnol .36 : 507- 514 "Identification of 4-hydroxyvaleric acid as a constituent of biosynthetic polyhydroxyalcanoic acids from bacteria" die Herstellung eines Terpolyesters, welcher aus 3- Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure und 4-Hydroxy- valeriansäure als Untereinheiten besteht, wobei beispielsweise einem Alcaliαenes-Stamm 4-Hydroxyvaleriansäure oder 4-Valerolacton als einzige Kohlenstoffquelle in einem Batch-, Fed-Batch- oder Zweischritt-Batch-Verfahren angeboten wurden.
Um die in diesem Stand der Technik verwendeten Mikroorganismen zu einem Einbau von 4-Hydroxyvaleriansäure zu bewegen, verlangt der Stand der Technik jedoch die recht teure und toxische 4-Hydroxyvaleriansäure selbst bzw. deren Lactone.
Ausgehend von diesem Stand der Technik war es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, PHF mit verbesserten Eigenschaften sowie mit billigeren und ungiftigen Ausgangssub- stanzen zur Verfügung zu stellen.
Verfahrenstechnisch wird die obige Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Bezüglich eines rekombinanten Bakterienstammes wird die Aufgabe gemäß den Merkmalen des Patentanspruchs 19 gelöst. Bezüglich einer Polyhydroxyfettsäure wird die obige Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 23 gelöst. Darüber hinaus löst das DNA-Fragment gemäß Patentanspruch 33 ebenfalls die obige Aufgabe. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 ist es erstmals möglich, 4HV-enthaltende Polyester, ausgehend von Lävulinsäure herzustellen. Die chemische Struktur der Lävulinsäure ist in folgender Formel wiedergegeben:
Lävulinsäure ist chemisch gesehen eine 4-Oxopentansäure, die in Wasser, Alkohol und Ether leicht löslich ist.
Es handelt sich um eine relativ preiswerte Substanz, da sie aus Hexosen pflanzlichen Ursprungs - also nachwachsenden Rohstoffen - beispielsweise durch Kochen mit Salzsäure hergestellt werden kann. Ferner fällt sie auch als Abfallpro- dukt bei der Holzverarbeitung in großer Menge an und kann somit großtechnisch weiterverarbeitet werden. Als Produktionsorganismen werden gemäß der vorliegenden Erfindung die PHF-freien Mutanten GPpl04 von Pseudomonas putida (Huismann, G.W., Wonink, E., Meima, R., Kazemier, W., T rpstra, P. und Witholt, B. (1991) J.Biol.Chem. 266: 2191- 2198) und PHB~4 von Alcaligenes eutrophus H16 (Schlegel, H.G., Lafferty, R. und Krauss, I. (1970) Arch. Microbiol .71: 283-294) herangezogen, in welche das Plasmid pHP1014::E156, welches unter anderem das Strukturgen der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthält und exprimiert, zuvor konjugativ übertragen worden waren (Liebergesell, M., Mayer, F. und Steinbuehel, A. (1993) Appl.Microbiol .Biotechnol. 40: 292-300; Valentin, H.E., Lee, E.Y., Choi, C.Y. und Steinbuehel, A. (1994) Appl .Microbiol .Biotechnol .40: 710-716). Darüber hinaus werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren die neuen Organismen Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014::B28+), welcher von BUCK-Werke GmbH & Co., Geislinger Str. 21, 73337 Bad Überkingen, Deutschland, bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig unter Nr. 9417 (Pseudomonas putida SK 6691 - DSM 9417) am 05.09.1994 nach dem Budapester Übereinkommen hinterlegt wurde, sowie Alcaligenes eutrophus PHB-4 (pHP1014::B28+), welcher bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweig unter Nr. 9418 (Alcaligenes eutrophus SK 6891 - DSM 9418) am 05.09.1994 nach dem Budapester Übereinkommen hinterlegt wurde, verwendet.
Diese Stämme haben die besondere Eigenschaft, daß sie im wesentlichen genau diejenigen DNA-Fragmente enthalten, die die Gene phaE und phaC enthalten und exprimieren; denn die Genprodukte phaE und phaC sind zusammen in der Lage eine PHF-Synthase-Aktivität zu entfalten.
Selbstverständlich ist es dem Fachmann wohl bekannt daß Nukleotidsequenzen, die phaE- und pΛaC-Gene tragen zusätzlich noch gängige Kontrollregionen, beipielsweise Promotoren, S/D-Sequenzen, oder dergleichen, aufweisen können.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, neue 4HV-haltige Copolyester herzustellen, welche ebenfalls thermoplastische Eigenschaften haben und welche sich deutlich flexibler verhalten, als die Copolyester des Standes der Technik. Aufgrund des verwendeten billigen Ausgangsmateriales Lävulinsäure konnten die Polyester auch deutlich billiger hergestellt werden als dies bislang mit den biotechnologischen Verfahren des Standes der Technik möglich war. Selbstverständlich kann statt Lävulinsäure auch ein Lävulinsäuresalz bzw. ein Lävulinsäurelacton bzw. weitere Derivate, beispielsweise Halogenderivate als Substrat für die Produktionsorganismen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Erfin- düng herausgefunden, daß die rekombinanten Bakterienstämme, welche wenigstens ein Fragment des Gens der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfenigii enthalten und exprimieren, auch in der Lage sind, 5-Hydroxyhexansäure, deren Salze, Ester und Lactone in einen von diesen Bakterien biosynthetisierten Copolyester einzubauen. Die Herstellung von 5-Hydroxyhexan- säure erfolgte ausgehend von 4-Acetylessigsäure, welche quantitativ mit NaBH4 reduziert wurde. Der Nachweis von 5- Hydroxyhexansäure (5HHx) als Baustein erfolgte gaschromato- graphisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch im isolierten und gereinigten Polyester. Der isolierte und gereinigte Polyester wurde einer 13C-NMR- und ^H-NMR-Analyse unterzogen und der Einbau von 5 HHx wurde hierdurch bestätigt. Beispielsweise ergab die Analyse des von den Bakterienzellen akkumulierten Polyesters einen Polyestergehalt von über 40 Gew.-% der Zelltrockenmasse, wobei ein typisches Polymer enthielt: Ca. 71 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 4 mol% 3-Hydroxy- hexansäure, ca. 23 mol% 5-Hydroxyhexansäure und ca. 2 mol%. 3-Hydroxyoctansäure.
Es wurden auch zahlreiche Wildtypstämme im Hinblick auf ih- re Fähigkeit, PHF-Polyester mit 5 HHx als einer Untereinheit, ausgehend von 5-Hydroxyhexansäure als Kohlenstoff- quelle, biosynthetisieren zu können, geprüft. Hierzu war jedoch keiner der geprüften Stämme in der Lage. Wird den für die vorliegende Erfindung verwendeten rekombinanten Bakterienstämme eine 4-Hydroxyheptansäure (4HHp) als Kohlenstoffquelle angeboten, so findet man diesen neuen Baustein ebenfalls in dem von den Bakterien synthetisierten Copolyester als Untereinheit vor.
Die Herstellung von 4-Hydroxyheptansäure erfolgte durch Verseifen von γ-Heptalacton mit NaOH .
Beispielsweise ergab die Analyse des von den rekombinanten Zellen akkumulierten Polymers einen Polyestergehalt von ca. 40 Gew.-% der Zelltrockenmasse. Ein typisches Polymer enthielt ca. 43 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 16 mol% 3- Hydroxyvaleriansäure, ca. 27 mol% 3-Hydroxyhexansäure, ca. 5 mol% 3-Hydroxyheptansäure, ca. 6 mol%. 4- Hydroxyheptansäure und ca. 6 mol% 3-Hydroxyoctansäure. Es wurden zahlreiche Wildtypstämme im Hinblick auf deren Fähigkeit, Copolyester mit 4HHp als einem Baustein, ausgehend von 4-Hydroxyheptansäure als Kohlenstoffquelle biosynthetisieren zu können, geprüft, jedoch war hierzu keine der geprüften Wildtypstämme in der Lage.
Auch hier erfolgte der Nachweis von 4HHp gaschromatogra- phisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch am isolierten und gereinigten Polyester. Die Erfinder haben ebenfalls herausgefunden, daß ein rekombinanter Stamm, der das Gen der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthält, beispielsweise eine PHF-freie Mutante GPpl04 von Pseudomonas putida einen neuen Copolyester synthetisieren kann, der den Baustein 4-Hydroxyoctansäure (4HO) enthält.
Der Nachweis von 4H0 erfolgte gaschromatographisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch am isolierten und gereinigten Polyester.
Die Herstellung von 4-Hydroxyoctansäure erfolgt durch Verseifen von γ-Lacton mit NaOH. Typischerweise akkumulierten die Bakterienzellen den synthetisierten Copolyester bis zu einem Gehalt von ca. 20 Gew.-% der Zelltrockenmasse. Das Polymer enthielt bei- spielsweise:
Ca. 75 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 22 mol% 3-Hydroxy- hexansäure, ca. 1,5 mol% 4-Hydroxyoctansäure und ca. 3 mσl% 3-Hydroxyoctansäure.
Auch diesbezüglich wurden zahlreiche Wildtypstämme im Hinblick auf ihre Fähigkeit Copolyester mit 4H0 als einer Untereinheit, ausgehend von 4-Hydroxyoctansäure als Kohlenstoffquelle zu biosynthetisieren, geprüft, wozu jedoch kei- ner der geprüften Wildstämme in der Lage war.
Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten neuen Copolyester wiesen ebenfalls thermoplastische Eigenschaften auf und ließen sich einwandfrei mit den in der Kunststofftechnologie üblichen Techniken verarbeiten.
Es handelte sich um wasserunlösliche thermoplastische Copolymere, die einen hohen Biokompabilitätsgrad aufwiesen, was diese Materialien zur Anwendung in der Medizintechnik - etwa als Implantate - oder als Nahtmaterial oder dergleichen anwendbar erscheinen läßt.
Grundßätzlich richtet sich die Dauer der Kultivierung der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen nach den Kulturbedingungen, die sich in der Hauptsache nach der Temperatur, dem Sauerstoffgehalt des Mediums (aerobe Bedingungen) und nach dem Medium selbst, Menge der Kohlenstoffquelle, der Mineralsalze, der Spurenelemente und/oder dem pH-Wert richten. Die Menge der jeweils eingesetzten Substrate richtet sich nach dem jeweiligen Mikroorganismus. Es kann jedoch von Konzentrationen im Bereich von ca. 0,1% (Gew/Vol) bis 10% (Gew/Vol) entspre- chend 100g/l, insbesondere 0,2 (Gew/Vol) bis 5% (Gew/Vol) ausgegangen werden.
Die Zellernte kann allgemein während der log-Phase bis in die stationäre Phase erfolgen, vorzugsweise sollte sie in der stationären Phase erfolgen. Die Bakterienzellen können entweder nach einmaliger Kultur in ihrer Gesamtheit aus dem Medium gewonnen (Batch- oder Fed-Batch-Verfahren) oder laufend über eine kontinuierliche Kultur erhalten werden, beispielsweise durch übliche Zentrifugations- oder Filtrationsverfahren.
Die geernteten Zellen können, gegebenenfalls nach Waschen, beispielsweise mit einem Puffer, bevorzugt mit einem Phosphatpuffer, besonders bevorzugt mit einem Natriumphosphatpuffer im neutralen Bereich von ca. pH 7,0, gefroren, lyophilisiert oder durch Sprühtrocknung behandelt werden.
Die Gewinnung der erfindungsgemäßen Polyester kann nach bekannten Methoden erfolgen, vorzugsweise wird die Lösung oder die Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, insbesondere durch halogenierte, vorzugsweise chlorierte Kohlenwasserstoffe, besonders bevorzugt durch Chloroform oder Methylenchlorid, durchgeführt.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Copolyester sind als Thermoplaste leicht zu verarbeiten und vielseitig verwendbar. Beispielsweise in der Chirurgie für Gegenstände zum Wundverschluß, z.B. als Nahtmaterial oder Klammern oder der- gleichen, als Befestigungselement für Knochen, beispielsweise Fixationsstifte, Platten, Schrauben, Dübel, als Trenn-, Füll- oder Abdeckmaterial, beispielsweise in Form von Gewebe, Vlies, Watte. Ebenso können die erfindungsgemäßen Polyester in der pharmazeutischen Galenik, z.B. als Hilfsstoffe, Trägermaterial, Freigabesystem für Arzneimittel oder zur Verkapselung und/oder Mikroverkapselung von Substanzen und Wirkstoffen verwendet werden. Darüber hinaus ist die Herstellung biologisch abbaubarer Verpackungsmittel, wie Folien, Flaschen, Ampullen, Dosen, Beutel, Schachteln, Kisten oder dergleichen, mittels der vorliegenden Erfindung möglich.
Die rekombinanten Bakterien gemäß Anspruch 2 in einem Komplexmedium vorzukultivieren, hat den Vorteil, daß hierdurch zunächst eine starke Vermehrung der Biomasse erreicht wird, um die Bakterien dann biochemisch zur Biosynthese der gewünschten PHF zu stimulieren.
Eine zusätzliche, das Wachstum fördernde Kohlenstoffquelle gemäß Anspruch 3 zu dem Nährmedium für die Bakterienkultur zuzusetzen, hat den Vorteil, daß hierdurch zum einen verschiedene Untereinheiten eingebaut werden können, und zum anderen, daß die Bakterien zum Teil erheblich schneller wachsen und gleichzeitig eine größere Menge der gewünschten PHF biosynthetisieren.
Die Maßnahmen des Anspruchs 4 haben den Vorteil, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit den in der großtechnischen Biotechnologie üblichen Verfahren durchgeführt werden kann.
Die Maßnahmen des Anspruchs 5 haben den Vorteil, daß ein wirtschaftliches Verhältnis zwischen Polyesterausbeute und Bakterienzelltrockenmasse erhalten werden kann, so daß sich die erhaltene Ausbeute wirtschaftlich betrachtet lohnt.
Wirtschaftliche Kalkulationen haben ergeben, daß die Untergrenze für eine Rentabilität in der Größenordnung von ca. 30 Gew.-% Polyester, bezogen auf die Bakterienzelltrockenmasse, liegen kann.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es jedoch möglich, Werte deutlich über 40% PHF, bezogen auf die Bakterienzeil- trockenmasse, zu erzielen. Dabei kann die Ausbeute selbstverständlich durch geeignete Veränderung biochemischer und/oder biophysikalischer Parameter zur Steuerung des biotechnologischen Verfahrens, beispielsweise pH-Einstellung, Druck- und/oder Temperatureinstellung, schrittweises Zugeben der Substrate und/oder der Substratgemische, Zelldichten, Nährmedienzusammensetzungen usw, noch erheblich gesteigert werden.
Die Maßnahmen des Anspruchs 6 haben den Vorteil, daß bei Copolyestern mit wenigstens zwei Untereinheiten die chemischen, biochemischen und physikalischen Eigenschaften des Polyesters durch Variation der verschiedenen Untereinheiten in feinen Schritten eingestellt werden kann, wenn man den Bakterien die entsprechenden Substrate anbietet.
Die rekombinanten Bakterien mit Zelldichten von bis zu 100 g Zelltrockenmasse pro Liter Bakteriennährmedium gemäß Anspruch 7 hochwachsen zu lassen, hat den Vorteil, daß relativ kleine Volumina eine beachtliche Biomasse enthalten und somit die Produktivität bei entsprechender Dimensionierung der großtechnischen Anlagen deutlich erhöhen als geringere Zelldichten.
Die Substrat-Kohlenstoffquelle gemäß Anspruch 8 und 9 im Überschuß anzubieten, hat den Vorteil, daß dieses Substrat dann aufgrund des Konzentrationsgradienten bevorzugt von den Bakterien aufgenommen wird und zur Produktion des Polyesters eingesetzt wird.
Die Maßnahmen des Anspruchs 10 weisen den Vorteil auf, daß durch schrittweises Erhöhen der Konzentration der Substrat- Kohlenstoffquelle der gesamte Prozeß besser in Richtung höherer Ausbeuten gesteuert werden kann. Die Maßnahmen der Ansprüche 11, 12 und 13 geben vorteilhafte Prozeßbedingungen für die biotechnologische Herstellung von PHF gemäß der vorliegenden Erfindung wieder. Die Maßnahmen der Ansprüche 14 und 15 weisen die Vorteile auf, daß sämtliche in der Biotechnologie üblichen Methoden zum Aufbrechen von Bakterien verwendet werden können, um die biotechnisch produzierten PHF zu gewinnen. Da diese in der Regel schwerer sind als das sie umgebende Nährmedium und der Zelldebris, können die PHF leicht durch beschleunigte Sedimentation, beispielsweise durch Zentrifu- gation, abgetrennt und gewonnen werden. Die Maßnahmen des Anspruchs 16 haben den Vorteil, daß durch Einbringen einer mittels eines organischen Lösungsmittel gelösten PHF-Produktes in Wasser oder einen niederen Alkohol, bevorzugt Ethanol, die PHF ausgefällt werden, und hierdurch ein Reinigungsschritt erreicht wird, welcher in der organischen Chemie einem Umkristallisationsprozeß zum Aufreinigen des gewünschten Produktes gleichkommt.
Einen Enzymcocktail gemäß Anspruch 17 und 18 zu verwenden, weist den Vorteil auf, daß hier spezifisch die Bakterien- zellwand und die Membran enzymatisch zerstört werden, so daß die Grana, welche die PHF enthalten, aus dem Cytoplasma herausfallen und zum Boden des Reaktors sedimentieren. Da hierbei in der Regel auch besonders bevorzugt proteoly- tische und lytische Enzyme, beispielsweise Lysozym oder auch Lipasen, eingesetzt werden, besteht der gesamte biotechnologische Ansatz im wesentlichen aus Makromolekülen - nämlich dem gewünschten synthetisierten Polyester - sowie aus einer Vielzahl von kleineren Molekülen, welche durch enzymatische Spaltung der in den Zellen, sowie Zellwand und Zellmembran enthaltenen Nukleinsäuren, Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide und Lipide entstehen, und welche somit leicht voneinander getrennt werden können, oh ne daß die isolierte PHF wesentliche Verunreinigungen aus anderen bakteriellen Verbindungen enthalten.
Der Einsatz von Detergenzien ist hierbei besonders vorteilhaft, da insbesondere Proteine und Nukleinsäuren hierdurch noch solubilisiert werden und sie dann quasi als Kolloidteilchen schwebend in den wäßrigen Lösungen von den anderen Enzymen abgebaut werden. Hierbei muß selbstverständlich darauf geachtet werden, daß Detergenzien verwendet werden, in welchen die verwendeten Enzyme noch oder erst recht aktiv sind. Ein solches mildes Detergenz ist beispielsweise Octylglucosid. Andererseits ist es beispielsweise von der V8-Protease aus Staphylococcus aureus bekannt, daß sie in 1 bis 2% Natriumdodecylsulfat noch eine starke proteolytische Aktivität entfaltet.
Die Ansprüche 19 bis 21 betreffen neue erfindungsgemäße rekombinante Bakterienstämme, welche die für die PHF- Synthese relevanten Gene phaC und phaE aus Thiocapsa pfennigii enthalten und exprimieren.
Das in den neu konstruierten erfindungsgemäßen Bakterienstämmen enthaltene Ba/πHI-Fragment B28 wurde nach Ba/πHI-Verdauung des EcoRI-Fragmentes E156 erhalten und umfaßt im wesentlichen die beiden Gene phaC und phaE .
Die erfindungsgemäßen Bakterienstämme nach Anspruch 19 liefern besonders hohe Ausbeuten an PHF.
Anspruch 23 betrifft eine PHF, wie sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 erhältlich ist, insbesondere konnten gemäß Anspruch 24 die folgenden PHF bzw. Polyester bzw. Copolyester nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden: (A) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, und 4-Hydroxyvaleriansäure;
(B) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure,
4-Hydroxyvaleriansäure, 3-Hydroxyhexansäure und 3-Hydroxyoctansäure;
(C) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure,
5-Hydroxyhexansäure und 3-Hydroxyoctansäure;
(D) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure,
3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyheptansäure,
4-Hydroxyheptansäure und 3-Hydroxyoctansäure; (E) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure,
3-Hydroxyoctansäure und 4-Hydroxyoctansäure;
( F ) 3-Hydroxybuttersäure , 3-Hydrσxyhexansäure ,
5-Hydroxyhexansäure;
( G) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure,
3-Hydroxyheptansäure und 4-Hydroxyheptansäure ;
(H) 3-Hydroxybuttersäure , 3-Hydroxyvaleriansäure ,
3-Hydroxyhexansäure , 3-Hydroxyoctansäure , und
4-Hydroxyoctansäure ;
( I ) 3-Hydroxybuttersäure , 3-Hydroxyhexansäure ,
4-Hydroxyhexansäure ;
(J) 3-Hydroxybuttersäure, 5-Hydroxyhexansäure.
Die Ansprüche 25 bis 32 geben bevorzugte quantitative Zusammensetzungen der PHF, wie sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, an. Sämtliche erhaltenen PHF sind als Thermoplast verarbeitbar und weisen eine hohe Flexibilität auf. Die Ansprüche 33 und 34 betreffen ein DNA-Fragment, welches die Gene phaC und phaE aus Thiocapsa pfennigii trägt. Das Gen phaC codiert für das phaC-Protein,und das Gen phaE codiert für das phaE-Protein.
Beide Proteine zusammen weisen PHF-Synthase-Aktivität auf.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Beispielen sowie anhand der Zeichnung. Es zeigt:
Fig. 1 die DNA-Sequenz eines erfindungsgemäßen DNA- Fragmentes aus Thiocapsa pfennigii sowie die Aminosäuresequenz der Proteine phaC und phaE.
Das in Figur 1 gezeigte 2,8kb DNA-Fragment wird erhalten durch BamHI Verdauung eines 15,6 kb EcoRI-Fragmentes aus Thiocapsa pfennigii. Darüber hinaus zeigt die Fig. 1 die Zuordnung der Aminosäuresequenzen der phaC- und phaE- Proteine (im IUPAC one letter code) zu deren entsprechenden Genen phaC (DNA-Sequenzabschnitt 1322 bis 2392) und phaE (DNA-Sequenzabschnitt 180 bis 1280). Beispiel 1
Mit 500 ml einer stationären Vorkultur des Stammes Pseudomonas putida GPp104 (pHP1014 :E156 ) in einem Komplexmedium, bestehend aus "beef extract" (3g) und Pepton (5g), gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser werden 8 1 Mineralsalzmedium (Schlegel, H.G., Kaltwasser, H. und Gottschalk, G. 1961 Arch. Microbiol.38: 209-222) der Zusammensetzung
gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser, welches 10 ml einer Spurenelementlösung enthielt, der Zusammensetzung
gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser, supplementiert mit 0,2 % (Gew/Vol) neutralisierter Octansäure auf pH 7 eingestellt in einem belüfteten Rührkessel beimpft. Nach 12 und nach 24 Stunden Kultivierung bei 30°C wurden jeweils 0,5% (Gew/Vol) neutralisierte Lävulinsäure hinzugegeben. Nach insgesamt 48 h Kultivierung erfolgte die Zellernte. Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von 15 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 11 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 59 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure, ca. 15 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure, ca. 10 mol% 3-Hydroxyhexansäure und ca. 5 mol% 3-Hydroxyoctansäure.
Beispiel 2
Es wurde wie unter Beispiel 1 angegeben verfahren, außer daß anstelle von Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014::E156) der Stamm Alcaliαenes eutrophus PHB~4 (pHP1014::E156) verwendet wurde, und daß anstelle von neutralisierter Octan säure 0,3% neutralisierte Gluconsäure als Kohlenstoffquelle neben Lävulinsäure angeboten wurde.
Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von 31 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 55 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 36 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure und ca. 9 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure. Die Polyester wiesen beispielsweise die im folgenden gezeigten analytischen Daten auf, wobei "A" das 13C-NMR- Spektrum und "B" das 1H-NMR-Spekturm wiedergibt. Die Signalzuordnung ergibt sich aufgrund der Numerierung, die in der gezeigten Strukturformel von Poly( 3HB-CO-3HV-CO-4HV) angegeben ist. Anschließend ist das Gaschromatogramm nach Methanolyse dieses Polyesters gezeigt.
Gaschromatogramm der gereinigten PHF aus A. eutrophus
Beispiel 3
Es wurde wie unter Beispiel 2 angegeben verfahren, außer daß nach 36 Stunden eine dritte Portion von 0,5 % (Gew/Vol) Lävulinsäure zugegeben wurde und für weitere 24 Stunden kultiviert wurde.
Die Analyse des von den Zellen akkumulierte Polymers ergab einen Polyestergehalt von 35 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 43 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 45 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure und ca. 12 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure. Beispiel 4
Es wurde wie unter Beispiel 2 angegeben verfahren, außer daß das Volumen des Inokulums aus der Vorkultur lediglich 3 ml betrug und das mit 50 ml des oben genannten Mineralsalzmediums in einem 500 ml Erlenmeyerkolben als Hauptkultur beimpft wurden. Die Kolben wurden anschließend 72 Stunden aerob geschüttelt, bevor die Zellernte erfolgte.
Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von ca. 25 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 61 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 32 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure und ca. 7 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure. Beispiel 5
Zellen von Alcaligenes eutrophus PHB- (pHP1014::E156) aus 50 ml einer 15 Stunden alten aeroben Vorkultur in dem in Beispiel 1 genannten Komplexmediums wurden durch Zentrifu- gation geerntet, mit steriler, 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen und in 50 ml eines modifizierten Mineralmediums (wie in Beispiel 1 beschrieben, aber ohne NH4C1) überführt, welches 1% (Gew/Vol) Lävulinsäure enthielt und 72 Stunden aerob geschüttelt.
Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von ca. 37 Gewichtsprozent der Zeil trockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 37 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 50 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure und ca. 13 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure. Beispiel 6
Mit 500 ml einer stationären Vorkultur des Stammes Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014::E156 ) in einem Komplexmedium, bestehend aus "beef extract" (3g) und Pepton (5g), gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser werden 8 1 Mineralsalzmedium (Schlegel et al., 1961) der Zusammensetzung
gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser, welches 10 ml einer Spurenelementlösung enthielt, der Zusammensetzung
gelöst in einem Liter deionisiertem Wasser, supplementiert mit 0,3 % (Gew/Vol) neutralisierter Octansäure plus 0,1%
(Gew/Vol) neutralisierter Vorstufensubstrat und auf pH 7 eingestellt, beimpft. Nach 12 und 36 Stunden wurden jeweils 0,5% Vorstufensubstrat nachgefüttert, und nach weiteren 36 Stunden wurde geerntet. Der Fermenter wurde bei der Kultivierung mit 500 Upm gerührt und mit einer Rate von 800 ml Luft pro Minute belüftet.
1. Einbau von 5-Hydroxyhexansäure
Es wurde gefunden, daß ein rekombinanter Stamm der PHF- freien Mutante GgP104 von Pseudomonas putida, der das Gen der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthält und expri- miert, einen Copolyester synthetisieren kann, der den neuen Baustein 5-Hydroxyhexansäure enthält.
Der Nachweis von 5HHx als Baustein erfolgte gaschromato- graphisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch am isolierten und gereinigten Polyester. Der isolierte und gereinigte Polyester wurde auch einer 13C-NMR und 1H-NMR Analyse unterzogen, und der Einbau von 5 HHx wurde hierdurch bestätigt.
Die Herstellung von 5-Hydrohexansäure erfolgte ausgehend von 4-Acetylessigsäure, welche quantitativ mit NaBH4 reduziert wurde. Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von ca. 36 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 71 mol% 3-Hydroxybuttersäure, ca. 4 mol% 3-Hydroxyhexansäure und ca. 23 mol% 5-Hydroxyhexansäure und ca. 2 mol% 3-Hydroxyoctansäure (daneben noch eine minimale Menge 4-Hydroxyoctansäure).
Die Polyester wiesen beispielsweise die im folgenden gezeigten analytischen Daten auf, wobei "A" das 13C-NMR- Spektrum und "B" das 1H-NMR-Spekturm wiedergibt. Die Signalzuordnung ergibt sich aufgrund der Numerierung, die in der gezeigten Strukturformel von Poly( 3HB-co-3HHx- co-5HHx-3HO) angegeben ist. Anschließend ist die GC-Analyse nach Methanolyse gezeigt.
Es ist jedoch auch möglich, eine Poly( 3HB-co-5HHx)-PHF zu erhalten, deren spektroskopische und GC-Daten im folgenden gezeigt sind. Die Polyester wiesen beispielsweise die im folgenden gezeigten analytischen Daten auf, wobei "A" das 13C-NMR-Spektrum und "B" das 1H-NMR-Spekturm wiedergibt. Die Signalzuordnung ergibt sich aufgrund der Numerierung, die in der gezeigten Strukturformel von Poly( 3HB-co-5HHx) angegeben ist.
Strukturformel von Poly(3-Hydroxybuttersäure-co-5-Hydroxyhexansäure) [Poly(3HB-co-5HHx)].
2. Einbau von 4-Hydroxyheptansäure
Es wurde gefunden, daß ein rekombinanter Stamm der PHF- freien Mutante GPp104 von Pseudomonas putida, der das Gen der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthielt und ex- primierte, einen Copolyester synthetisieren kann, der den neuen Baustein 4-Hydroxyheptansäure (4HHp) enthält. Der Nachweis von 4HHp erfolgte gaschromatographisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch am isolierten und gereinigten Polyester.
Die Herstellung von 4-Hydroxyheptansäure erfolgte durch Verseifen von γ-Heptalacton mit NaOH.
Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von 39 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus 43 mol% 3-Hydroxybuttersäure, 16 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure, 27 mol% 3- Hydroxyhexansäure, 5 mol% 3-Hydroxyheptansäure, 6 mol% 4- Hydroxyheptansäure und 3-Hydroxyoctansäure.
Einbau von 4-Hydroxyoctansäure
Es wurde gefunden, daß ein rekombinanter Stamm der PHF- freien Mutante GPpl04 von Pseudomonas putida. der das Gen der PHF-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthielt und ex- primierte, einen Copolyester synthetisieren kann, der den neuen Baustein 4-Hydroxyoctansäure (4HO) enthält.
Der Nachweis von 4HO erfolgte gaschromatographisch nach Methanolyse sowohl in lyophilisierten Zellen als auch am isolierten und gereinigten Polyester. Wegen des geringen Anteils an 4HO waren NMR-spektroskopische Untersuchungen nicht möglich. Die Herstellung von 4-Hydroxyoctansäure erfolgte durch Verseifen von γ-Octalacton mit NaOH (Abb. 4).
Die Analyse des von den Zellen akkumulierten Polymers ergab einen Polyestergehalt von ca. 18 Gewichtsprozent der Zelltrockenmasse. Das Polymer bestand aus ca. 75 mol% ca. 3- Hydroxybuttersäure, ca. 22 mol% 3-Hydroxyhexansäure, ca. 1,5 mol% 3-Hydroxyoctansäure und ca. 3 mol% 4-Hydroxy- octansäure.
Beispiel 7
Um die neuen Polyester in kleinerem Maßstab, z.B. für analytische und Testzwecke zu erhalten oder um Stämme auf deren Fähigkeit hin diese neuen Polyester biosynthetisieren zu können, zu prüfen, wurde in der Regel wie folgt vorgegangen:
Zellen von Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014::E156) aus 50 ml einer 15 Stunden alten aeroben Vorkultur in dem in Beispiel 1 genannten Komplexmediums wurden durch Zentrifugation geerntet, mit steriler, 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen und in 50 ml eines modifizierten Mineralmediums (wie in Beispiel 1 beschrieben, aber ohne NH4Cl) überführt und 72 Stunden aerob geschüttelt.
Mit 5-Hydroxyhexansäure, welche in Portionen (0,25 plus 0,25 plus 0,5%) insgesamt einer Konzentration von 1% zugesetzt wurde, akkumulierte P. putida GPpl04 (pHP1014::E156)PHF bis zu einem Anteil von maximal ca. 40% von der Zelltrockenmasse, welche sich aus ca. 3-Hydroxybuttersäure (ca. 50 bis 80 mol%), 3-Hydroxyhexansäure (ca. 3 bis 10 mol%) und 5-Hydroxyhexansäure (ca. 10 bis 30 mol%) zusammensetzte.
Mit 4-Hydroxyheptansäure, welches in Portionen (0,25 plus 0,25 plus 0,5%) insgesamt in einer Konzentration von 1% zu gesetzt wurde, akkumulierte P. putida GPp104 (pHP1014::E156)PHF bis zu einem Anteil von maximal ca. 40% von der Zelltrockenmasse, welche sich aus ca. 3-Hydroxy- buttersäure (ca. 30 bis 80 mol%), 3-Hydroxyvaleriansäure (ca. 5 bis 20 mol%) und 3-Hydroxyheptansäure (ca. 1 bis 5 mol%) und 4-Hydroxyheptansäure (ca. 3 bis 10 mol%) zusammensetzte.
Mit 4-Hydroxyoctanat, welches viermal mit einer Konzentration von 0,2% nachgefüttert wurde, akkumulierte P. putida GPp104 (pHP1014::E156 )PHF bis zu einem Anteil von maximal ca. 50% von der Zelltrockenmasse, welches sich aus 3-Hydroxybuttersäure (ca. 70 bis 90 mol%), 3-Hydroxy- valeriansäure (ca. 1 bis 5 mol%), 3-Hydroxyhexansäure (ca. 10 bis 20 mol%), 3-Hydroxyoctansäure (ca. 1 bis 5 mol%) und 4-Hydroxyoctansäure (ca. 0,5 bis 4 mol%) zusammensetzte.
Beispiel 8 Um die neuen Polyester im kleineren Maßstab für analytische und/oder Testzwecke zu erhalten oder um Stämme auf deren Fähigkeit hin diese neuen Polyester biosynthetisieren zu können, zu prüfen, wurde alternativ auch wie folgt vorgegangen:
Es wurde wie unter Beispiel 1 angegeben verfahren, außer daß das Volumen des Inokulums aus der Vorkultur lediglich 3 ml betrug, und das mit 50 ml des oben genannten Mineralsalzmediums in einem 500 ml Erlenmeyerkolben als Haupt- kultur beimpft wurde. Die Kolben wurden anschließend 72 Stunden aerob geschüttelt, bevor die Zellernte erfolgte.
Die Ergebnisse der Speicherung (PHF-Anteil an der Zelltrockenmasse und Zusammensetzung des Polymers) waren und variierten in dem unter Beispiel 7 jeweils beschriebenen Rahmen. Beispiel 9
Analog zu den Beispielen 1 bis 7 wurden die neuen Bakterienstämme Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014::B28+), DSM Nr. 9417 sowie Alcaligenes eutrophus PHB-4 (pHP1014::B28+), DSM Nr. 9418, als Produktionsorganismen verwendet.
Im Beispielfalle ließ sich ein Copolyester der Formel Poly( 3HB-co-3HHx-co-4HHx) herstellen, dessen analytische Daten im folgenden wiedergegeben sind. Die Polyester wiesen beispielsweise die im folgenden gezeigten analytischen Daten auf, wobei "A" das 13C-NMR-Spektrum und "B" das *H- NMR-Spekturm wiedergibt. Die Signalzuordnung ergibt sich aufgrund der Numerierung, die in der gezeigten Strukturformel von Poly( 3HB-co-3HHx-co-4HHx) angegeben ist. Anschließend ist das Gaschromatogramm nach Methanolyse gezeigt.
Strukturformel von Poly(3-Hydroxyburtersäure-fo-3-Hydroxyhexansäure-co- 4-Hydroxyhexansäure)[Poly(3HB-co-3HHx-co-4HHx)].
Chemische Verschiebungen der 13C-NMR-Signale von Poly(3HB-co-3HHx-co- 4HHx).
3HB, 3-Hydroxybuttersäure; 3HHx, 3-Hydroxyhexansäure : 4HHx, 4-Hydroxyhexansäure .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren mit wenigstens einer Untereinheit mittels rekombinanter Bakterien, welche wenigstens ein Fragment des Gens der Polyhydroxyfettsäure-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthalten und exprimieren, und welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014 : :E156), Alcaliαenes eutrophus PHB"4 (pHP1014 : :E156), Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014 : :B28+) [DSM# 9417] und Alcaliαenes eutrophus PHB-4 (pHP1014 : :B28+) [DSM# 9418], wobei die Bakterien in einem mineralischen Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert werden, wobei man den Bakterien wenigstens eine Substrat-Kohlenstoffquelle anbietet, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Lävulinsäure, Salze der Lävulinsäure, Ester der Lävulinsäure, Lävulinsäurelactone, substituierte Lävulinsäure bzw. deren Derivate; 5-Hydroxyhexansäure, deren Salze, Ester und Lactone; 4-Hydroxyheptansäure, deren Salze, Ester und Lactone; 4-Hydroxyoctansäure, deren Salze, Ester und Lactone; deren halogenierte Derivate; sowie deren Mischungen; man die Bakterien eine bestimmte Zeit mit der Kohlenstoffquelle inkubiert; und man die von den Bakterien biosynthetisierten Polyhydroxyfettsäurepolymere isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien in einem Komplexmedium vorkultiviert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur noch wenigstens eine zusätzliche, das Wachstum fördernde Kohlenstof fquelle zusetzt, wobei die Kohlenstoffquelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Citronensäure, Octansäure, Gluconsäure; deren Salze, Ester und Lactone; Hexosen, insbesondere Glucose, Fructose; sowie deren Mischungen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren als BatchVerfahren, Fed-Batch-Verfahren, Zweischrittverfahren oder Continous-Flow-Verfahren durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure in einer Konzentration von ca. 15 bis 70 Gew.-%, insbesondere ca. 15 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise ca. 40 Gew.-%, bezogen auf die Bakterienzelltrockenmasse erhalten wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäuren als
Copolyester mit wenigstens zwei, vorzugsweise drei Untereinheiten, erhalten werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten Bakterien mit
Zelldichten von bis zu 100 g Zelltrockenmasse pro Liter Bakteriennährmedium kultiviert werden,
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrat-Kohlenstoffquelle im Überschuß anbietet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrat-Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von ca. 0,1 bis 5 Gew.-% einsetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man schrittweise die Konzentration der Substrat-Kohlenstoffquelle im Kulturmedium erhöht, gegebenenfalls unter Vorkultivierung in Gegenwart einer zusätzlichen, nicht als Substrat dienenden Kohlenstoffquelle.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man nach ca. 12 h und 24 h Kultivierung bei ca. 27°C bis 35°C, vorzugsweise bei ca. 30°C, jeweils ca. 0,5% (Gewicht/Volumen) neutralisierte SubstratKohlenstoffquelle zugibt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ca. 24 h bis 96 h, insbesondere ca. 36 h bis 72 h, vorzugsweise ca. 48 h bis 72 h, kultiviert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten Bakterien unter Mangelbedingungen, vorzugsweise Stickstoff-, Magnesium- oder Phosphat-Mangelbedingungen kultiviert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die geernteten rekombinanten Bakterien durch physikalische und/oder chemische und/oder biochemische Verfahren aufgebrochen werden, um die biotechnisch produzierten Polyhydroxyfettsäuren zu gewinnen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die geernteten rekombinanten Bakterien lyophilisiert werden, und dann mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder Methylenchlorid, extrahiert werden, um die rekombinanten Bakterien aufzubrechen, und um die Polyhydroxyfettsäuren zu gewinnen
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das extrahierte Polyhydroxyfettsäure-Produkt durch Einbringen in ein hydrophiles Lösungsmittel, insbesondere Wasser oder einen niederen Alkohol, vorzugsweise Ethanol, ausgefällt wird, und durch Entfernen des hydrophilen Lösungsmittels im wesentlichen rein erhalten wird.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die geernteten rekombinanten Bakterien mittels Detergentien und/oder eines lytischen Enzymcocktails aufgebrochen werden, wodurch die Polyhydroxyfettsäure-haltigen Bakterienzellgrana zum Boden des Bioreaktors sedimentieren und von dort gesammelt werden, um weiterverarbeitet zu werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der lytische Enzymcocktail Enzyme enthält, welehe ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus:
Lysozym; Proteasen; anderen hydrolytischen Enzymen; sowie deren Mischungen.
19. Rekombinanter Bakterienstamm zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren, insbesondere zur Durchfüh rung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Bakterienstamm ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Pseudomonas putida GPpl04 (pHP1014 : :B28+) [DSM# 9417] und Alcaligenes eutrophus PHB"4
(pHP1014: :B28+) [DSM# 9418].
20. Bakterienstamm nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er ein minimal kleines DNA-Fragment mit dem Gen der Polyhydroxyfettsäure-Synthase aus Thiocapsa pfennigii enthält und exprimiert.
21. Bakterienstamm nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß er in der Lage ist, wenigstens eine Substrat-Kohlenstoffquelle zu einer Polyhy- droxyfettsäure mit wenigstens einer Untereinheit umzusetzen und intrazellulär zu speichern, wobei die Substrat-Kohlenstoffquelle ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Lävulinsäure, Salze der Lävulinsäure, Ester der Lävulinsäure, Lävulinsäurelactone, substituierte Lävulinsäure bzw. deren Derivate; 5-Hydroxyhexansäure, deren Salze, Ester und Lactone; 4-Hydroxyheptansäure, deren Salze, Ester und Lactone; 4-Hydroxyoctansäure, deren Salze, Ester und Lactone; deren halogenierte Derivate; sowie deren Mischungen.
22. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine thermoplastische Polyhydroxyfettsäure in Form eines Copolymers mit wenigstens drei Untereinheiten biosynthetisiert.
23. Polyhydroxyfettsäure, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18.
24. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie Untereinheitengruppen enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
(A) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, und 4-Hydroxyvaleriansäure;
(B) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxyvaleriansäure, 3-Hydroxyhexansäure und 3-Hydroxyoctansäure;
(C) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure,
5-Hydroxyhexansäure und 3-Hydroxyoctansäure;
(D) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyheptansäure,
4-Hydroxyheptansäure und 3-Hydroxyoctansäure;
(E) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure,
3-Hydroxyoctansäure und 4-Hydroxyoctansäure;
(F) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure, und 5-Hydroxyhexansäure;
(G) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, 3-Hydroxyheptansäure und 4-Hydroxyheptansäure;
(H) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyvaleriansäure, 3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure, und 4-Hydroxyoctansäure;
(I) 3-Hydroxybuttersäure, 3-Hydroxyhexansäure,
4-Hydroxyhexansäure; sowie
(J) 3-Hydroxybuttersäure und 5-Hydroxyhexansäure.
25. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (A) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 35 mol% bis 65 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 30 mol% bis 50 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure; und ca. 5 mol% bis 20 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure.
26. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (B) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 10 mol% bis 15 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 40 mol% bis 60 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure;
ca. 10 mol% bis 20 mol% 4-Hydroxyvaleriansäure;
ca. 5 mol% bis 15 mol% 3-Hydroxyhexansäure und
ca. 2 mol% bis 10 mol% 3-Hydroxyoctansäure.
27. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (C) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 60 mol% bis 80 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 2 mol% bis 10 mol% 3-Hydroxyhexansäure,
ca. 15 mol% bis 30 mol% 5-Hydroxyhexansäure; und ca. 1 mol% bis 5 mol% 3-Hydroxyoctansäure.
28. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (D) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 30 mol% bis 50 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 10 mol% bis 30 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure, ca. 15 mol% bis 35 mol% 3-Hydroxyhexansäure;
ca . 1 mol% bis 10 mol% 3-Hydroxyheptansäure,
ca. 1 mol% bis 10 mol% 4-Hydroxyheptansäure; und ca. 1 mol% bis 10 mσl% 3-Hydroxyoctansäure.
29. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (E) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 65 mol% bis 85 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 15 mol% bis 30 mol% 3-Hydroxyhexansäure;
ca. 1 mol% bis 5 mol% 3-Hydroxyoctansäure; und ca . 0,5 mol% bis 5 mol% 4-Hydroxyoctansäure.
30. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (F) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 50 mol% bis 80 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 3 mol% bis 10 mol% 3-Hydroxyhexansäure;
ca. 10 mol% bis 30 mol% 5-Hydroxyhexansäure.
31. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (G) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 30 mol% bis 80 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 5 mol% bis 20 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure;
ca. 1 mol% bis 5 mol% 3-Hydroxyheptansäure;und ca. 3 mol% bis 10 mol% 4-Hydroxyheptansäure .
32. Polyhydroxyfettsäure nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyfettsäure mit der Untergruppeneinheit (H) folgende quantitative Zusammensetzung aufweist: ca. 70 mol% bis 90 mol% 3-Hydroxybuttersäure;
ca. 1 mol% bis 5 mol% 3-Hydroxyvaleriansäure;
ca. 10 mol% bis 20 mol% 3-Hydroxyhexansäure;
ca. 1 mol% bis 5 mol% 3-Hydroxyoctansäure; und ca. 0,5 mol% bis 4 mol% 4-Hydroxyoctansäure.
33. DNA-Fragment, welches für einen pha E und eine pha C Bestandteil der Polyhydroxyfettsäure-Synthase aus Thiocapsa pfennigii codiert. dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens die Nukleotidsequenz der Sequenzabschnitte 180 bis 1280 (phaE) und 1322 bis 2392 (phaC) der folgenden DNA-Sequenz (SEQ ID NO 1) aufweist:
wobei Nukleotidsequenzen umfaßt sind, die für identische Proteinsequenzen codieren.
34. DNA-Fragment nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Ba/nHI-Verdau eines 15,6 kbp EcoRI -DNA- Fragmentes aus Thiocapsa pfennigii erhältlich ist.
35. DNA-Fragment nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es die vollständige Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 33 umfaßt.
36. Polyhydroxyfettsäure-Synthase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Proteinbestandteile phaE und phaC aufweist, welche die folgende Aminosäuresequenz aufweisen:
sowie abgewandelte Aminosäuresequenzen der phaE und phaC Proteine, welche wenigstens annähernd dieselbe Polyhydroxyfettsäure-Synthaseaktivität ergeben.
EP95931149A 1994-09-16 1995-09-15 Verfahren zur herstellung von polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinante bakterienstämme zur durchführung des verfahrens Withdrawn EP0781339A2 (de)

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DE (1) DE4433134A1 (de)
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000189170A (ja) * 1998-05-08 2000-07-11 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法
EP2159287A3 (de) * 2000-02-11 2014-02-12 Metabolix, Inc. Intein enthaltende Multigen-Expressionskonstrukte
DE60141594D1 (de) * 2000-11-17 2010-04-29 Metabolix Inc Herstellung von polyhydroxyalkanoaten mittlerer kettenlänge aus fettsäure-biosynthesewegen
JP4255383B2 (ja) * 2002-01-16 2009-04-15 ユニバーシティ オブ ハワイ 有機系廃棄物からの生分解性の熱可塑性プラスチック材料の生産
US8735113B2 (en) 2003-10-15 2014-05-27 Newlight Technologies, Llc Methods and systems for production of polyhydroxyalkanoate
US7745197B1 (en) 2003-10-15 2010-06-29 Newlight Technologies, Llc Process for the utilization of ruminant animal methane emissions
US7579176B2 (en) 2003-10-15 2009-08-25 Newlight Technologies, Llc Method for the production of polyhydroxyalkanoic acid
US8071342B2 (en) * 2003-10-15 2011-12-06 Newlight Technologies, Llc Process for the treatment of methane emissions
CA2600882C (en) 2005-03-16 2013-02-26 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
TWI488964B (zh) 2007-03-16 2015-06-21 Genomatica Inc 用於１，４丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
JP5912529B2 (ja) 2008-09-10 2016-04-27 ゲノマチカ， インク． １，４−ブタンジオールの生成のための微生物体
US9096861B2 (en) * 2009-03-05 2015-08-04 Metabolix, Inc. Stable, fertile, high polyhydroxyalkanoate producing plants and methods of producing them
US20100229256A1 (en) * 2009-03-05 2010-09-09 Metabolix, Inc. Propagation of transgenic plants
US8597918B2 (en) * 2009-06-04 2013-12-03 Genomatica, Inc. Process of separating components of a fermentation broth
CN113528417A (zh) 2009-06-04 2021-10-22 基因组股份公司 生产1,4-丁二醇的微生物和相关方法
US20120165500A1 (en) 2009-08-27 2012-06-28 Newlight Technologies, Llc Process for the production of polyhydroxyalkanoates
US9181559B2 (en) 2009-09-15 2015-11-10 Metabolix, Inc. Generation of high polyhydroxybutyrate producing oilseeds
CA2777459A1 (en) * 2009-10-13 2011-04-21 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
US8048661B2 (en) * 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) * 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US9040267B2 (en) 2011-03-08 2015-05-26 Newlight Technologies, Llc Polyhydroxyalkanoate production method
US12060597B2 (en) 2011-12-02 2024-08-13 Newlight Technologies, Inc. Polyhydroxyalkanoate production methods and systems for same
US8986977B2 (en) * 2011-12-30 2015-03-24 Alliance For Sustainable Energy, Llc Disruption of cell walls for enhanced lipid recovery
US20200347417A1 (en) 2012-03-29 2020-11-05 Newlight Technologies, Inc Polyhydroxyalkanoate production methods and materials and microorganisms used in same
US9085784B1 (en) 2012-03-29 2015-07-21 Newlight Technologies, Llc Polyhydroxyalkanoate production methods and materials and microorganisms used in same
CN111705028A (zh) 2012-06-04 2020-09-25 基因组股份公司 制造4-羟基丁酸酯、1，4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
EP3221460A1 (de) 2014-11-20 2017-09-27 Full Cycle Bioplastics Inc. Herstellung von polyhydroxyalkanoatcopolymeren aus organischen abfallprodukten
MX2021002172A (es) * 2018-08-24 2021-07-16 Moharram Ventures Inc Composicion polimerica biodegradable y metodo para producir la misma.

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8513310D0 (en) * 1985-05-28 1985-07-03 Ici Plc Copolymer production
US5229279A (en) * 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
AT393134B (de) * 1989-12-27 1991-08-26 Danubia Petrochemie Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren
US5512456A (en) * 1990-05-25 1996-04-30 James Madison University Method for the improved production and recovery of poly-β-hydroxybutyrate from transformed Escherichia coli
EP0475785A3 (en) * 1990-09-14 1993-04-14 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Process for preparation of copolymer
JP2777757B2 (ja) * 1991-09-17 1998-07-23 鐘淵化学工業株式会社 共重合体およびその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9608566A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996008566A2 (de) 1996-03-21
US20010031489A1 (en) 2001-10-18
US6011144A (en) 2000-01-04
WO1996008566A3 (de) 1996-05-17
CA2203264A1 (en) 1996-03-21
US6770464B2 (en) 2004-08-03
DE4433134A1 (de) 1996-03-21

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