EA013265B1 - Гликозилирование белков - Google Patents
Гликозилирование белков Download PDFInfo
- Publication number
- EA013265B1 EA013265B1 EA200702193A EA200702193A EA013265B1 EA 013265 B1 EA013265 B1 EA 013265B1 EA 200702193 A EA200702193 A EA 200702193A EA 200702193 A EA200702193 A EA 200702193A EA 013265 B1 EA013265 B1 EA 013265B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- group
- reagent
- specified
- carbohydrate
- Prior art date
Links
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 79
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 18
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims description 17
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 11
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical group [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SCGJGNWMYSYORS-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumylhex-5-ynoate Chemical compound OC(=O)C(N)CCC#C SCGJGNWMYSYORS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 4
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229910021589 Copper(I) bromide Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000001360 methionine group Chemical class N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- HYPMMIZBOPSABP-UHFFFAOYSA-N n,n-bis(2h-triazol-4-yl)-2h-triazol-4-amine Chemical compound N1N=NC(N(C=2N=NNC=2)C=2N=NNC=2)=C1 HYPMMIZBOPSABP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims 6
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims 2
- 125000006716 (C1-C6) heteroalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- FHBSGPWHCCIQPG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-methyl-oxo-sulfanylidene-$l^{6}-sulfane Chemical compound CS(S)(=O)=O FHBSGPWHCCIQPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 claims 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 8
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 8
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 6
- ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M bromocopper(1+) Chemical compound Br[Cu+] ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 1H-1,2,3-Triazole Chemical compound C=1C=NNN=1 QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018614 Uromodulin Human genes 0.000 description 3
- 108010027007 Uromodulin Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229930182478 glucoside Chemical class 0.000 description 3
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 3
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COHHCDMICDJRCQ-WWDSIBKISA-N 2-[[[(4s,4as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carbonyl]amino]methylamino]acetic acid Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)C3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(=O)NCNCC(O)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O COHHCDMICDJRCQ-WWDSIBKISA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008212 P-Selectin Human genes 0.000 description 2
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 2
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- NNWQLZWAZSJGLY-VKHMYHEASA-N (2s)-2-azaniumyl-4-azidobutanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCN=[N+]=[N-] NNWQLZWAZSJGLY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000000177 1,2,3-triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000001399 1,2,3-triazolyl group Chemical group N1N=NC(=C1)* 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- JFTHBDBUVHRREF-UHFFFAOYSA-N 2-acetamidopropanedioic acid Chemical compound CC(=O)NC(C(O)=O)C(O)=O JFTHBDBUVHRREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOSFCZBEJOXPGJ-UHFFFAOYSA-N 2-azidoethyl acetate Chemical compound CC(=O)OCCN=[N+]=[N-] FOSFCZBEJOXPGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 2-bromoethanol Chemical compound OCCBr LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100028672 C-type lectin domain family 4 member D Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000168486 Causus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N Formamidine Chemical compound NC=N PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000190687 Gobius Species 0.000 description 1
- 238000007167 Hofmann rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- 101000766905 Homo sapiens C-type lectin domain family 4 member D Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010059801 Lactase-Phlorizin Hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606155 Wakea Species 0.000 description 1
- UAOKXEHOENRFMP-KLHDSHLOSA-N [(2r,3r,4s,5s)-2,3,4,5-tetraacetyloxy-6-oxohexyl] acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)C=O UAOKXEHOENRFMP-KLHDSHLOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical group 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 150000004699 copper complex Chemical class 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical class C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical class C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- ZHOBJWVNWMQMLF-UHFFFAOYSA-N n,n-bis(prop-2-ynyl)prop-2-yn-1-amine Chemical compound C#CCN(CC#C)CC#C ZHOBJWVNWMQMLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N tert-butyl(dimethyl)silicon Chemical group C[Si](C)C(C)(C)C ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способам гликозилирования белка, в соответствии с которыми белок модифицируют для включения в него алкиновой и/или азидной групп. Настоящее изобретение также относится к белку, гликозилированному в соответствии с указанными способами.
Description
Настоящее изобретение также основано на сайт-специфичном введении метки, такой как алкиновая, азидная или тиоловая группа, в боковую цепь аминокислоты, в заданном положении аминокислотной последовательности белка (как было описано выше), после чего осуществляют реакции последовательного и ортогонального гликозилирования, которые являются специфичными для каждой соответствующей метки. Таким путем может быть достигнуто дифференциальное многосайтовое химическое гликозилирование белка.
Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к способу гликозилирования белка, где указанный способ включает стадии:
ί) модификации белка согласно способу первого аспекта настоящего изобретения; и ίί) взаимодействия модифицированного белка по пункту (ί) с
a) углеводным фрагментом, модифицированным для введения в него азидной группы; и/или
b) углеводным фрагментом, модифицированным для введения в него алкиновой группы в присутствии Οι.ι(Ι) катализатора.
Термин гликозилирование в контексте настоящего описания относится к общему способу присоединения гликозильной единицы к другому фрагменту посредством ковалентной связи.
В типичном случае, если белок модифицируют на стадии (ί) путем введения в него алкиновой группы, то реакцию на стадии (ίί) проводят с углеводным фрагментом согласно пункту (а) . Тогда как, если белок модифицируют на стадии (ί) путем введения в него азидной группы, реакцию на стадии (ίί) проводят с углеводным фрагментом согласно пункту (Ь).
Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, модификация белка (стадия ί) дополнительно включает стадию модификации белка, как определено здесь, для введения в него тиоловой группы, например, с помощью инсерции цистеинового остатка.
В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к способу гликозилирования белка, где указанный способ включает стадии:
ί) (а) модификации белка для включения в него алкиновой и/или азидной группы; и (Ь) до или после модификации согласно пункту (а), необязательной модификации белка для включения в него тиоловой группы; и ίί) последующей реакции белка, модифицированного согласно (ί), углеводным фрагментом (с) в присутствии СиД) катализатора, до или после реакции с тиол-селективным углеводным реагентом (ά),
c) с углеводным фрагментом, модифицированным путем введения в него азидной группы; и/или алкиновой группы; и
ά) с тиол-селективным углеводным реагентом.
Стадии (ί) (а) и (Ь) являются такими, как описаны в настоящем тексте. В том случае, когда белок подвергают модификации, с тем чтобы модифицированный белок содержал цистеиновый остаток, модификация белка, направленная на введение тиоловой группы, не является обязательной.
Альтернативно, может быть желательно включить одну или несколько тиоловых групп, в дополнение к уже имеющимся в белке.
Тиол-селективный углеводный реагент может включать любой реагент, который взаимодействует с
- 3 013265 тиоловой группой в белке, что позволяет ввести гликозильный остаток, присоединенный к белку через дисульфидную связь. Тиол-селективный углеводный реагент может включать, без ограничения, гликоалкантиосульфонатный реагент, например, гликометантиосульфонатный реагент (глико-МТС) (см. документ XVО 00/01712, содержание которого включено в настоящее описание полностью), гликоселенилсульфидные реагенты (см. документ νθ 2005/000862, содержание которого включено в настоящее описание полностью) и гликотиосульфонатные реагенты (см. документ νθ 2005/0008 62, содержание которого включено в настоящее описание полностью). Гликометантиосульфонатные реагенты представляют собой фрагмент формулы СН3-8О2-8-углевод.
Гликотиосульфонатные и гликоселенилсульфидные (8е8) реагенты описываются в основном формулой I, в соответствии с ν02005/000862 (где указанный документ включен в настоящее описание посредством ссылки). Конкретно, гликоселенилсульфидные (8е8) реагенты описываются формулой К-8-Хуглеводный фрагмент, где X обозначает 8е, и К обозначает необязательно замещенную С1-10 алкильную, фенильную, пиридильную или нафтильную группу. Гликотиосульфонатные реагенты описываются формулой К-8-Х-углеводный фрагмент, где X обозначает 8О2, и К обозначает необязательно замещенную фенильную, пиридильную или нафтильную группу. Такие реагенты обеспечивают сайт-селективное присоединение углевода к белку через дисульфидную связь.
Предпочтительно, подлежащие модификации углеводы включают моносахариды, дисахариды, трисахариды, тетрасахариды, олигосахариды и другие полисахариды, а также включают любой углеводный фрагмент, который присутствует в природных гликопротеинах или в биологических системах. В их число включаются гликозильные или гликозидные производные, например глюкозильные, глюкозидные, галактозильные или галактозидные производные. Гликозильные и гликозидные группы включают как α, так и β группы. Подходящие углеводные фрагменты включают глюкозу, галактозу, фукозу, ΟΙοΝΛο. Са1ΝΆε, сиаловую кислоту и маннозу, и полисахариды, включающие по меньшей мере один из остатков глюкозы, галактозы, фукозы, ΟΙεΝΑε, ΟαΙΝΑο, сиаловой кислоты и/или маннозы.
Углеводные фрагменты включают 01ο(Αο)4β-, Ο1ε(Βη)4β-, Са1(Ас)4в-, Ο1ε(Βη)4β-, С1с(Ас)4а(1,4)С1с (Αε)3α(1,4)61ε(Αε)4β-, β-СК, β-Са! α-Мап, а-Мап(Ас)4, Мап(1,6)Мапа-, Мап(1-6)Мап(1-3)Мапа-, (Ас)4 Мап(1-6)(Ас)4Мап(1-3)(Ас)2Мапа-, -Εί-β-Са1, -Εΐ-β^Κ, Е1-а-С1с, -Εΐ-α-Мап, -Εΐ-Ьас, -β^1ε(Αο)2, -βС1с(Ас)з, -Е1-а-С1с(Ас)2, -Е1-а-С1с(Ас)з, -Е1-а-С1с(Ас)4, -Εί-β-С1с(Αс)2, -Εί-β-С1с(Αс)з, -Εί-β-С1с(Αс)4, -Е1а-Мап(Ас)3, -Е1-а-Мап(Ас)4, -Εί-β-Са1(Αс)3, -Εί-β-Са1(Αс)4, -Е1-Ьас(Ас)5, -Е1-Ьас(Ас)6, -Е1-Ьас(Ас)7 и их эквиваленты без защитных групп.
Любые сахаридные единицы в составе углеводного фрагмента, получаемые из природных сахаров, могут иметь природную энантиомерную форму, которая может представлять собой либо Ό-форму (например, Ό-глюкозу или Ό-галактозу), либо Ь-форму (например, Ь-рамнозу или Ь-фукозу). Любые аномерные связи могут быть представлены α- или β-связями.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения углеводы, модифицируемые с целью включения в них азидной группы, представляют собой гликозилазиды.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения углеводы, модифицируемые с целью включения в них алкиновой группы, представляют собой алкинилгликозиды.
Предпочтительно, углеводные фрагменты, модифицированные азидной и/или алкиновой группой/ами (например, гликозилазид и/или алкинигликозид) не включают защитную группу, то есть они не защищены. Незащищенные азид- или алкинмодифицированные углеводные фрагменты могут быть получены путем присоединения азидной или алкиновой группы к защищенному сахару. Защитные группы, подходящие для экранирования -ОН групп в углеводном фрагменте, включают ацетат (Ас), бензил (Вп), силил (например, трет-бутилдиметилсилил (ТВЭМ81) и трет-бутилдифенилсилил (ТМЭР81)), ацетали, кетали и метоксиметил (МОМ). Позже защитную группу удаляют, до или после присоединения углеводного фрагмента к белку. В рамках такого способа проводят реакцию, определенную как реакция на стадии (й), с незащищенным гликозидом.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения Си(1) катализатор представляет собой СиВг или Си1. Предпочтительно, катализатором является СиВг. Си(1) катализатор может быть получен при использовании Си(11) соли (например, Си(П)8О4) в реакции, которая приводит к восстановлению до Си(1) при добавлении восстановителя (например, аскорбата, гидроксиламина, сульфита натрия или элементарной меди) ш §йи в реакционную смесь. Предпочтительно Си(1) катализатор получают путем непосредственного добавления Си(1)Вг к реакционной смеси. Предпочтительно получают Си(1)Вг с высокой степенью чистоты, например, с чистотой, равной по меньшей мере 99%, такой как 99,999%. Предпочтительно Си(1) (например, Си(1)Вг) получают в растворителе, в присутствии стабилизирующего лиганда, например, азотистого основания. Указанный лиганд стабилизирует Си(1) в реакционной смеси; в его отсутствие происходит быстрое окисление до Си(11), Предпочтительно, указанный лиганд представляет собой тристриазолиламинный лиганд (\νοπηη1ά апй Э^ек, 8йис1иге, 7, К155-К160 (1999)). Растворитель для данного катализатора имеет рН в диапазоне 7,2-8,2. Растворитель может представлять собой смешиваемый с водой растворитель (например, трет-ВиОН) или водный буфер, такой как фосфатный буфер. Предпочтительно растворителем является ацетонитрил.
- 4 013265
Реакция на стадии (ίί) представляет собой реакцию циклоприсоединения по типу [3+2] между алкиновой группой (на белке и/или на гликозиде) и азидной группой (на белке и/или на гликозиде) с образованием замещенных 1,2,3-триазолов (Ншдкеп, Ргос. Сйсш. 8ос. 356-369 (1961)), которые содержат связь между белком и одним или несколькими сахарами.
Другой аспект настоящего изобретения относится к белку, модифицированному по способу первого или второго аспекта настоящего изобретения.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к белку формулы (I), (II) или (III)
где а и Ь обозначают целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5): р и μ обозначают целые числа от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и где указанный белок соответствует приведенному в настоящем описании определению.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к гликозилированному белку, модифицированному по способу согласно второму аспекту настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к гликозилированному белку формулы (IV)
где ΐ обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения спейсер представляет собой замещенную или незамеченную С1-6алкильную группу. Предпочтительно спейсер отсутствует или представляет собой метил или этил.
В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения спейсер представляет собой гетероалкил, в котором гетероатом представлен О, N или 8, и алкил представлен метилом или этилом. Предпочтительно гетероалкильная группа имеет формулу СН2(Х)У, где X обозначает О, N или 8, и Υ обозначает 0 или 1. В типичном случае гетероатом непосредственно связан с углеводным фрагментом.
Заместитель представляет собой галоген или фрагмент, содержащий от 1 до 30 поливалентных атомов, выбранных из С, Ν, О, 8 и 81, а также моновалентных атомов, выбранных из Н и галогена. В одном классе рассматриваемых соединений заместитель, если он присутствует, например, выбран из галогена и фрагментов, содержащих 1, 2, 3, 4 или 5 поливалентных атомов, а также моновалентные атомы, выбранные из водорода и галогена. Поливалентные атомы могут быть, например, выбраны из С, Ν, О, 8, и В и могут, например, представлять собой С, Ν, 8 и О.
Термин замещенный, используемый в тексте настоящего описания применительно к фрагменту или группе, обозначает, что один или несколько атомов водорода в соответствующем фрагменте, в частности 1, 2 или 3 атома водорода, замещены, независимо друг от друга, соответствующим числом описанных заместителей.
Следует также понимать, что заместители находятся только в тех положениях, которые являются химически возможными, и специалист в данной области способен определить (экспериментально или теоретически), без дополнительных усилий, какое из конкретных замещений является возможным. На
- 5 013265 пример, аминогруппы или гидроксильные группы со свободным водородом могут быть нестабильными, если они связываются с атомами углерода ненасыщенными (например, олефиновыми) связями. Кроме того, следует также понимать, что приведенные в описании заместители сами могут быть замещены любым заместителем, и такое замещение также ограничивается определенными рамками возможности их осуществления, как это известно специалистам в данной области.
Замещенный алкил может представлять собой, например, алкил, определенный выше, который, в свою очередь, также замещен одним или несколькими заместителями, где указанные заместители, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из гидроксигруппы, этерифицированного гидроксила, галогена (например фтора), гидроксиалкила (например, 2-гидроксиэтила), галогеналкила (например, трифторметила или 2,2,2-трифторэтила), аминогруппы, замещенной аминогруппы (например, Νалкиламино, Ν,Ν-диалкиламино или Ν-алканоиламино), алкоксикарбонила, фенилалкоксикарбонила, амидино, гуанидино, гидроксигуанидино, формамидино, изотиоуреидо, уреидогруппы, меркаптогруппы, ацила, ацилокси, такого как, например, этерифицированная карбоксигруппа, карбоксигруппы, сульфогруппы, сульфамоила, карбамоила, цианогруппы, азогруппы, нитрогруппы и т. п.
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения гликозилированный белок имеет формулу (V)
где р и с.| обозначают целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5); и ΐ обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и где белок и углеводный фрагмент соответствуют приведенному в настоящем описании определению.
Белок или углеводный фрагмент могут быть присоединены к 1,2,3-триазолу в положении 1 или 2, как показано ниже в формулах (VI) и (VII). Таким образом, гикозилированный белок согласно настоящему изобретению может иметь формулу (VI) или (VII)
где белок, углеводный фрагмент, р, с.| и ΐ соответствуют приведенному в настоящем описании определению.
Предпочтительно р равно 2.
Предпочтительно с.| равно 0.
Настоящее изобретение также относится к гликозилированному белку формулы (VIII)
где и обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); спейсер и ΐ соответствуют приведенному в настоящем описании определению, и и Ζ представляют собой углеводные фрагменты, которые могут быть одинаковыми или разными.
Предпочтительно, гликозилированный белок имеет формулу (IX)
| ^^БелоГ^, | η | ||||
| Углеводный фрагмент Ζ | 1,2,3-триазол | , , I Углеводный I фрагментΙΛΙ I | |||
| и |
1 (IX) где спейсер, р, с.|. ΐ и и соответствуют приведенному в настоящем описании определению; и где г и 5 обозначает целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5).
Предпочтительно, гликозилированный белок имеет формулу (X) или (XI)
- 6 013265
где белок, углеводный фрагмент, спейсер, р, μ, г, к, ΐ и и соответствуют приведенному в настоящем описании определению.
Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению в типичном случае сохраняют присущую им функцию, а некоторые белки могут демонстрировать даже усиление данной функции, например повышенную ферментативную активность (относительно негликозилированного фермента) после гликозилирования в соответствии с настоящим изобретением. Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению могут также демонстрировать дополнительные связывающие способности по типу белок-белок с другими белками, например способность связываться с лектином. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению полезен с точки зрения возможности манипулировать белковыми функциями, например, с целью включения в белок дополнительной, не свойственной ему функциональной способности, такой как способность к связыванию по типу белок-белок с другими белками, например с лектинами.
Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению могут использоваться в медицине, например, при лечении или с целью профилактики заболевания или патологического состояния. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рассматриваемый в нем гликозилированный белок в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Белки согласно настоящему изобретению могут быть полезны, например, при лечении анемии или болезни Гоше.
В тексте всего описания и в формуле изобретения слова включает и содержит, а также различные вариации данных слов, например, включающий, следует трактовать как включающие, но не ограничивающиеся и их не следует понимать как исключающие какие-либо другие фрагменты, добавки, компоненты, целые числа или стадии.
В тексте всего описания изобретения и в формуле изобретения единственное число относится равным образом к множественному числу, если из контекста явно не следует иное. В частности, в случае использования неопределенного артикля следует понимать, что данная фраза относится также к множественному числу, если из контекста явно не следует иное.
Признаки, целые числа, характеристики, соединения, химические фрагменты или группы, описанные в сочетании с конкретным аспектом, вариантом или примером согласно настоящему изобретению, следует понимать как применимые к любому другому аспекту, варианту или примеру, описанному здесь, если указанные характеристики не являются несовместимыми с ними.
Ниже настоящее изобретение описывается со ссылкой на следующие не ограничивающие его примеры.
Примеры
Множественный сайт-направленный мутагенез
Получают ряд мутантов β-галактозидазы δκβΟ с использованием набора для множественного сайтнаправленного мутагенеза (Ошк-Сйапде МиШ 8йе-П1тес1еб Ми1адепекщ Кй), доступного от компании 8!та!адепе [каталожный номер 200514]. Плазмиду рЕТ28б, содержащую δκβΟ С344в, используют в качестве матрицы1. Соответствующие мутагенные праймеры получают при замене остатков Ме1 остатками 11е и проводят обычный синтез с использованием синтезатора 81дта-Сепокук в следующем формате:
- 7 013265
Таблица 81
| Мутация | Последовательность праймеров (все мутагенные праймеры являются З-фосфорилированными)) |
| №!1 | ТОАСССТбОТОТТССТАТТТСТОАТТОАААТСССЮ |
| Μ43Ι | СТТАСТААТСССОСТ<ЗСТАТеТТТТСТСОАТСА.ТОААСС |
| Μ73Ι | САТТТАОТСТАССТАТТГТТААТССТАТТГГТТСТОСАТТАТСОТСАААТОТС |
| Μ148Ι | ТАОАбОТААТООССААТСАТАОАтеТТТАОТАТАААОТАААОТССТС |
| Μ204Ι | ССААСААССТТАбОТТСАТГТАТТСТТОАСТАСТСАТССАС |
| М236Т | САОСТТОААТСАТСТТАТАТАТСССССТАССОСЗАААб |
| Μ275Ι | ССАТСТСТАССОСТТСТАТАТСТТТАТССОТТААСОО |
| Μ280Ι | САТСТАТТАТСАТПТСАССОАТСТСТАССОСГГСТАТАТС |
| Μ383Ι | СААТАССАТПТСАОТААССТАСАТАТАОАСАТОАТАТСТАТТССАО |
| Μ439Ι | ССТТГААСАОАССАААССТТАТАСАСААТССТОААОССС |
Таким способом могут быть введены мутанты с желательным количеством Ме! остатков (от 1 до
10). Другие мутации осуществляют по методике однократного сайт-направленного мутагенеза с использованием набора комплементарных прямых и обратных мутагенных праймеров:
Таблица 82
| Мутация | Последовательность праймеров (все мутагенные праймеры являются 5'-фосфорилированными) |
| 1439С | Прямой праймер: ОААТСЮОСТГСАОСАТТСТСТТССАСОТТТСОТСТОТГАААСОТС Обратный праймер ОАССТТТААСАОАССАААССТССААСАСААТССТОААССССАТТС |
Соответствующие мутантные белки могут быть экспрессированы с использованием описанного ниже протокола экспрессии.
Экспрессия белка с включенным аналогом Ме!
Экспрессию белков с включенным в их состав гомопропаргилглицином (Нрд) или азидогомоаланином (Айа) проводят по протоколу среднего смещения2. Ночную культуру ЕксйепсЫа сой В834 (ΌΕ3), ρΕΤ28ά 8§βΟ С3448 растят в среде с определенными молекулярными характеристиками (~16 ч), содержащей добавки канамицина (50 мкг/мл) и Ь-метионина (40 мкг/мл). Используют ночную культуру для инокуляции предварительно нагретой (до 37°С) культуральной среды (1,0 л, указанного выше состава) и клетки растят в течение 3 ч (до ОЭ600 ~1,2). Смещение среды осуществляют путем центрифугирования (6000 об/мин, 10 мин, 4°С), ресуспендирования в среде, не содержащей метионина (0,5 л), и переноса в предварительно нагретую (37°С) культуральную среду (1,0 л), содержащую неприродную аминокислоту (Ой-Нрд. в концентрации 80 мкг/мл, Ь-Айа, в концентрации 40 мкг/мл). Культуру встряхивают в течение 15 мин при 29°С и затем подвергают индукции путем добавления ΙΡΤΟ до концентрации 1,0 мМ. Экспрессию белка проводят при той же температуре, 29°С в течение 12 ч.
Полученную культуру центрифугируют (9000 об/мин, 15 мин, 4°С) и осадок клеток замораживают при -80°С. Белок очищают аффинной хроматографией с использованием никеля: клеточный осадок переносят в буфер для связывания (50 мл) и клетки разрушают озвучиванием (3x30 с, с амплитудой до 60%), после чего суспензию центрифугируют (20000 об/мин, 20 мин, 4°С). Супернатант фильтруют (0,8 мкм) и белок очищают на колонке для аффинной хроматографии с никелем, проводя элюцию возрастающими концентрациями имидазола. Элюцию сопровождают определением УФ поглощения при 280 нМ и соответствующие фракции объединяют. Объединенные фракции подвергают диализу (М^СО 1214 кДа) при 22°С в течение ночи против натрий-фосфатного буфера (50 мМ, рН 6,5, 4,01). Белковый раствор фильтруют (0,2 мкм) и хранят при температуре 4°С.
- 8 013265
Синтез реагентов
Ь-гомоазидоаланин синтезируют по реакции перегруппировки Хофманна, проводят диазоперенос и удаление защитной группы по стратегии, описанной в литературе.3
БЬ-гомопропаргилглицин получают из дизтилацетамидомалоната путем алкилирования гомопропаргилом, с последующими гидролизом и декарбоксилированием, как было описано ранее.2 1-Азидо-2-ацетимидо-2-дезокси-в-Б-гликопиранозид 1
защищенного ацетилом гликозилΝ-Ас-глюкозилазид синтезируют из соответствующим образом хлорида с проведением впоследствии реакции деацетилирования Земплена (Ζαηρίοη)1.
Хитобиозилазид 2
Хитобиозилазид получают по методике, описанной Макмилланом с соавт. (МастШап с1 а1)5. (2-Метантиосульфонатэтил)-а-Б-глюкопиранозид 7
Реагент а-глюкопиранозил-МТ8 получают из известного бромида путем удаления защитной группы и замещения метантиосульфонатом, по описанной в литературе методике6.
(2-Азидоэтил)-а-Б-маннопиранозид 3
Азидоэтил-а-маннопиранозид 3 синтезируют в соответствии с описанными в литературе процедурами из пентаацетата маннозы путем гликозилирования бромэтанолом с последующим замещением азидом6,7.
трис-Триазольный лиганд 11
Трис-триазольный лиганд 11 получают из азидоэтилацетата и трипропаргиламина, по описанной ранее методике8.
Этинил-С-галактозид 5
Этинил-в-С-галактозид получают по процедуре, используемой для получения известного Сглюкозида, описанной в работе Хи, Лнетапд; Еддег, Апйа; Всгпс1. Вгипо; УакеИа, Апбгеа; Не1у. СЫт. Ас!а; 79 (7), 1996, 2004-2022.
- 9 013265
Модель глико-ССНА реакций малых молекул
Диэтилгомопропаргилацетамидомалонат (55 мг, 0,20 ммоль), ΗΟ3,01οΝΑο-Ν3, 1 (101 мг, 0,41 ммоль), аскорбат натрия (202 мг, 10 ммоль) и лиганд трис-триазолеиламина 11 (6 мг, 0,012 ммоль) растворяют в смеси ΜΟΡ8 буфера (рН 7,5, 0,2 М; 4,0 мл) и трет-бутилового спирта (2,0 мл). К перемешиваемому раствору добавляют раствор сульфата меди(11) (0,1 М, 100 мкл, 0,01 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение 28 ч при комнатной температуре. Затем выпаривают растворитель при пониженном давлении и полученный остаток очищают флэш-хроматографией на колонке (силикагель, ΑεΟΕΐ до 15% МеОН в ΑεΟΕΐ). Полученный продукт имеет вид бесцветной пленки (83 мг, 79%) .
Метил-(8)-2-|И-ацетиламино]-4-{1-(2-дезокси-№ацетиламино-в-О-глюкопиранозил)[1,2,3]триазол-4ил}бутаноат
Бромид меди (10 мг, 0,070 ммоль) растворяют в ацетонитриле (1 мл) и добавляют лиганд (0,58 мл 0,12 М раствора в ацетонитриле). Указанный раствор (38 мкл, с 5% содержанием катализатора) добавляют к раствору алкинаминокислоты (15 мг, 0,08 ммоль) и сахара 2 (31 мг, 0,13 ммоль) в натрийфосфатном буфере (0,5 мл, 0,15 М, рН 8,2). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят анализ методом ТСХ, результаты которого указывают на исчезновение исходного алкинового материала. Далее смесь разбавляют этилацетатом и промывают водой (10 мл), после чего водный слой промывают ΑεΟΕΐ. Водный слой выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают колоночной хроматографией (силикагель 1:1, этилΑεΟΕΐ/ίΡτΟΗ до 4:4:2 Η2Ο/ίΡτΟΗ/ΑεΟΕΐ) с получением требуемого 1,2,3-триазола (26 мг, 74%) в виде бесцветного стеклоподобного твердого вещества.
Метил-(8)-2-[№ацетиламино]-4-{4-(в-О-галактопиранозил)[1,2,3]-триазол-1-ил}бутаноат
ЫНАс
СиВг, лиганд Водный буфер, рН8,2
Бромид меди (10 мг, 0,07 0 ммоль) растворяют в ацетонитриле (1 мл) и добавляют лиганд тристриа золиламин (0,58 мл, 0,12 М в ацетонитриле). Раствор (45 мкл, с 5% содержанием катализатора) добавляют к раствору аминокислоты (20 мг, 0,10 ммоль) и сахара 5 (28 мг, 0,13 ммоль) в натрий-фосфатном буфере (0,5 мл, 0,15 М, рН 8,2). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 ч. Далее реакционную смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток очищают колоночной хроматографией (силикагель 9:1, ΑεΟΕΐ/ΜεΟΗ до 4:4:2 Η2Ο/ίΡτΟΗ/ΑεΟΕΐ) с получением требуемого 1,2,3-триазола (37 мг, 97%) в виде белого твердого вещества.
Фиг. XX. Синтез О-пропаргил-8^а^асNΑс из О-пропаргил-№ацетилглюкозамина. Применяют очень
- 10 013265 простой ферментативный синтез 81аЬасМЛе с высоким выходом (по процедуре, описанной в литературе: Ва18сй, с1 а1.). Ни на одной стадии очистки, за исключением стадии флэш-хроматографии на колонке, не требуется получать какой-либо из продуктов.
2-Ацетамидо-2-дезокси-1 -пропаргил-в-Э-глюкопиранозид
2-Ацетамидо-2-дезокси-1-пропаргил-в-О-глюкопиранозид был описан ранее. Для целей настоящего изобретения его получают по описанной ниже схеме, в соответствии с методикой УаихсП1с5. Вогй: Оаи55С. Вгипо; Ра1ш1ст, 8ага: Веаи, 1сап-Маг1пс: Тсйайс'гоп Ьсй., 42(43) 2001, 7567-7570.
Л л
15%УЬ(ОВ)з , „ МаОМе
---АсО О^>^-МеОН ЫНАс
ЫНАс
АсО
ОАС -------*
ΝΗΑο
ДХМ. температура кипения
2-Ацетамидо-2-дезокси-4-О-в-'-галактопиранозил-1-пропаргил-О-глюкопиранозид
2-Ацетамидо-2-дезокси-1-пропаргил-З-Э-глюкопиранозид (15,0 мг, 0,058 ммоль) и динатриевую соль уридин-5'-дифосфогалактозы (59 мг, 0,092 ммоль) растворяют в 1,0 мл натрий-какодилатного буфера (0,1 М, 25 мМ МпС12, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, рН 7,41). Добавляют β-1,4галактозилтрансферазу (сс 2.4.1.22, 0,8 Ед) и щелочную фосфатазу (сс 3.1.3.1, 39 Ед) и смесь осторожно встряхивают при температуре 37°С в течение 21 ч, после чего проводят ТСХ (вода: изопропиловый спирт: этилацетат, 1:2:2), результаты которого указывают на полной потребление акцептирующего сахара (Вг 0,8). Реакционную смесь лиофилизируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией на колонке (вода: изопропиловый спирт: этилацетат, 2:5:6) с получением 23,7 мг (97% выход) белого аморф ного твердого вещества.
Пропаргил-(5-ацетимидо-3,5-дидезокси-'-глицеро-а-О-галакто-2-нонулопиранозилоновая кислота(2^3)-в-О-галактопиранозил-(1^4)-2-ацетимидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозид
2-Ацетамидо-2-дезокси-4-О-в-'-галактопиранозил-1-пропаргил-Э-глюкопиранозид (12 мг, 0,028 ммоль) и растворяют в 1,4 мл воды. Добавляют какодилат натрия (60 мг, 0,28 моль, до конечной концентрации: 0,2 М), тетрагидра.т хлорида марганца (8 мг, 0,041 ммоль, до конечной концентрации 29 мМ) и бычий сывороточный альбумин (2 мг). рН доводят до значения 7,1 перед добавлением натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-Ы-ацетилнейраминовой кислоты (19,8 мг, 1 эквивалент), а-2,3-(Ы)-сиалилтрансферазы, рекомбинантный вариант из 8ро'ор1ста 1гид1рсг'а, сс 2.4.99.6, 30 мЕд) и щелочную фосфатазу (сс 3.1.3.1, 30 Ед), после чего смесь осторожно встряхивают при температуре 37°С в течение 70 ч, и затем реакционную смесь лиофилизируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией на колонке (вода: изопропиловый спирт:этилацетат, 5:11:15) с получением 20,9 мг аморфного твердого вещества (выход 95%).
Тест ЕЬ18Л для оценки роли сульфотирозина в связывании Р-селектина
Проводят эксперименты с целью демонстрации того, что белки, гликозилированные согласно настоящему изобретению, обладают измененными биологическими свойствами по связыванию.
Тест ЕЬ18Л был модифицирован относительно описанной ранее в литературе процедуры тестирования. Модифицированные белки 8фС вносят в ячейки микротитрационного планшета в количестве 200 нг/ячейку (ЫиНС МахЦотр, 2 мкг/мл, 50 мМ карбонатный буфер, рН 9,6).
Добавляют дитиотреитол (5 мкл/ячейку, 50 мг/мл, в воде) для снижения имитирующего эффекта сульфатированного тирозина применительно к соответствующим линиям. Планшет инкубируют при температуре 4°С в течение 15 ч. Содержимое ячеек блокируют добавлением бычьего сывороточного альбумина (25 мг/мл, в буфере для анализа: 2 мМ СаС12, 10 мМ Трис, 150 мМ ЫаС1, рН 7,2, 200 мкл/ячейку) на 2 ч при температуре 37°С. Планшеты промывают промывочным буфером (буфер для анализа, содержащий 0,05% об./об. Твин 20, 3x400 мкл на ячейку) перед добавлением Р-селектина (от Са1Ьюсйсш, каталожный номер 561306, рекомбинантный вариант в СНО-клетках с усеченной последовательностью, без трансмембранного и цитоплазматического доменов, в двойном серийном разведении из 400 нг/ячейку до 1,6 нг/ячейку, для каждого различным образом модифицированного мутанта 8фС в 100 мкл промывочного буфера). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 3 ч.
После промывания дважды промывочным буфером ячейки инкубируют с анти-Р-селектиновым антителом (1дС1 подтип, Сйсшкоп, клон АК-6, 100 нг/ячейку, в 100 мкл буфера для анализа) в течение 1 ч при температуре 21°С (плюс 3 контрольных ячейки) и промывают промывочным буфером (3x300
- 11 013265 мкл/ячейку).
Каждую из ячеек инкубируют с анти-мышиным 1дС-специфичным конъюгатом с пероксидазой хрена (от 8фта. А 0168) в течение 1 ч при температуре 21°С. Ячейки промывают промывочным буфером (3x300 мкл). Наличие связывания визуализируют путем добавления раствора субстрата ТМВ (от 81дтаΑΐάποίι. Т0440. 100 мкл на ячейку) и инкубируют в темноте при температуре 22°С до тех пор. когда величина поглощения при 370 нм не установится в линейном диапазоне (примерно через 15 мин).
(8)-2-Амино-4-{4-(в-П-галактопиранозил)[1.2.3]триазол-1-ил}бутаноат
В рамках указанной выше методики проводят исследование по оптимизации процесса с использованием 1.5 экв. этинил-С-галактозида 5. относительно Айа.
а - по данным 'Н ЯМР (Ό2Θ. 500 МГц); величина подтвержденного выхода в результате очистки. при рН 8.2 составляет 84%.
Получение фрагмента Тамма-Хорсфолла (Татт-Нот81а11)
Аналоги (Н2Х-61п-А8р-Рйе-Айа/Нрд-11е-Тйг-А8р-11е-Су8-Ееи-Ееи-61и-С(О)ХН2) пептидного фрагмента Тамма-Хорсфолла (ТНр) (295-306; Н2П-61п-А8р-Рйе-А8п-11е-Тйг-А8р-8ег-Ееи-Ееи-61и-С(О)ХН2)12 были синтезированы в соответствии с методами Гтос-химии на амиде МВНА-полистироловой смолы К1пк [1% дивинилбензол. ХоуаЫосйет каталожный номер 01-64-0037] с использованием пептидного синтезатора. включающего устройство для микроволновой обработки. ЫЬейу-СЕМ.
Репрезентативная процедура проведения глико-циклоприсоединения Айа-содержащего белка азидопротеина
Этинил-в-С-галактозид (5 мг. 0.027 ммоль) 5 растворяют в натрий-фосфатном буфере (0.5 М. рН 8.2. 200 мкл). К указанному выше раствору добавляют раствор белка (0.2 мг в 300 мкл) и все хорошо перемешивают. Проводят предварительное смешивание свежеприготовленного раствора бромида меди(1) (99.999%) в ацетонитриле (33 мкл в концентрации 10 мг/мл) с ацетонитрильным раствором лиганда тристриазолиламина 11 (12.5 мкл в концентрации 120 мг/мл). К смеси добавляют раствор ранее образованного Си-комплекса (45 мкл) и реакционную смесь перемешивают на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь центрифугируют для удаления какого-либо осадка солей Си(11). супернатант обессоливают на колонке ΡΌ 10 и затем проводят элюцию деминерализованной водой (3.5 мл). Элюент концентрируют на мембранном концентраторе ущазрш (при отсечении величины пороговой молекулярной массы 10 кДа) и промывают 50 мМ раствором ЭДТА и затем деминерализованной водой (3x50 мкл). В итоге раствор концентрируют до 100 мкл и определяют характеристики продукта методами ЬС-М8. гель-электрофореза в 8Э8-РЛСЕ. СО. путем расщепления трипсином и при проведении анализа продуктов расщепления трипсином методами ЬС-М8/М8.
- 12 013265
Данные анализа методом ВЭЖХ/МС после расщепления трипсином для репрезентативного исходного материала 88вС-Су83448ег-Ме121Айа-Ме143-Айа-Ме173Айа-Ме1148Айа-Ме1204Айа-Ме1236АйаМе1275Ака-Ме1280Айа-Ме13 83Айа-Ме1439Айа
Таблица 83
| Расщепляемый фрагмент [остаток Ν’] | Время удерживания [мин] | Состояние зараженности (т/ζ) | |||
| + 1 | +2 | + 3 | +4 | ||
| Т2 16-41 | 24,1 | 1459,1 | 973,1 | ||
| ТЗ 42-70 | 24,7 | 1584,7 | 1056,8 | ||
| Т5-79-82 | 4,1 | 442,3 | |||
| Т16 147-158 | 32,2 | 930,5 | |||
| Т22 200-225 | 25,5 | 1406,7 | 938,1 | ||
| Т25 241-251 | 17,7 | 641, 8 | |||
| Т29 280-292 | 17,1 | 757,3 | |||
| Т45 427-445 | 26,8 | 1193,0 | 795,7 |
Данные анализа методом ВЭЖХ/МС после трипсинового расщепления региоселективно тригалактозилированного 88вС-Су83448ег-Ме121Айа-Ме143-Т-Са1-Ме173Айа-Ме1148Айа-Ме1204Айа-Ме1236АйаМе1275Айа-Т-Са1-Ме1280Айа-Т-Са1-Ме1383Айа-Ме1439Айа
Таблица 84
| Расщепляемый фрагмент [остаток №] | Время удерживания [мин] | Состояние заряженности (т/ζ) | |||
| + 1 | + 2 | +3 | +4 | ||
| Т2 16-41 | 24,4 | 1459,6 | 973,4 | ||
| ТЗ Са1 42-70 | 23,1 | 1120,1 | 840,3 | ||
| Т5 79-82 | 4,3 | 443,2 | |||
| Т22 200-225 | 25,6 | 1407,1 | 938,4 | ||
| Т25 241-251 | 18,1 | 1282, 7 | 641,8 | ||
| Т29Са12 280-292 | 6,9 | 945,4 | 630,6 | ||
| Т45 427-446 | 26,7 | 1193,5 | 796,0 |
Примечание: Нумерация остатков основана на фактически имеющихся аминокислотах и включает Ηίδ-метку. Нумерация, использованная в остальной части текста, основана на последовательности 8§βΟ дикого типа. Таким образом, например, трипсиновый фрагмент Т29 #280-292 соответствует участку 274286 (Κ)^[Т6а1]ΕАVΕ[Т6а1]ЛΕN^NΚ(Μ
Гликоциклоприсоединение Нрд-содержащего белка алкинилпротеина
Аналогичную процедуру используют для модификации Нрд-содержащих белков. В данном случае углевод, содержащий азид (НОзС1сNАсNз) 1, используют в данной реакции вместо алкинил-в-Сгликозида.
Двойная дифференциальная гликоконъюгация ТНр фрагмента
К раствору только что синтезированного пептида (пептида с включением Нрд или Айа, 0,5 мг) в водном фосфатном буфере (50 мМ, рН 8,2, 0,3 мл) добавляют раствор глюкозида МТ8-реагента 7 в воде (50 мкл, 33 мМ, 5 экв.). Реакционную смесь помещают на качалку на 1 ч и затем отбирают аликвоты для анализа по методу ЬСТ-М8 с использованием колонки Рйепотепех Сепши 5 мк С18 110А (скорость потока 1,0 мл/мин, градиент мобильной фазы: 0,05% муравьиной кислоты в Н2О до 0,05% муравьиной кислоты в МеСN в течение 20 мин).
Раствор комплексного медного катализатора получают при растворении бромида меди (5 мг, 99,999% чистоты) и трис-триазольного лиганда 11 (18 мг) в МеСN (0,5 мл). Этинилсахар 5 или азидосахар 1 (6 мг) растворяют в реакционной смеси, используемой для гликоконъюгации через дисульфидную связь до добавления комплексного соединения медиЦ) (15 мкл).
Завершение реакции между Айа-пептидом и этинилсахаром, определяемое по результатам анализа
- 13 013265
БС-М8, достигается через 1 ч при комнатной температуре. Через 1 ч к реакционной смеси, содержащей Нрд-пептид и азидосахар, добавляют в избыточном количестве раствор комплекса меди(1) (10 мкл). Еще через 1 ч проводят анализ БС-М8, который показывает полное превращение исходного материала в желательный конъюгированный продукт. Реакционные сайты маркированы на схеме кружками:
Точная масса 1433.7
Химическая формула СтоПизЬЬтОгвЗ?
Хим*неская формула^мНчооЫнОмЗ
Химическая формула:
Точная касса: 1859.6
Химическая формула:
Точная масса: 1654.7
- 14 013265
Комментарии по оптимизации условий гликоциклоприсоединения
Тристриазоловый лиганд 11 был описан ранее в литературе13 в качестве агента, используемого при стабилизации Си(1) в водной реакционной смеси. В его отсутствии происходит быстрое окисление до Си(11). В связи с низкой растворимостью СиВг в других растворителях, был выбран ацетонитрил.
Было показано, что слабо щелочная буферная система (рН 7,5 - рН 8,5) лучше всего подходит для реакции модификации. Многие ранее описанные в литературе примеры основаны на восстановлении ш δίΐιι соли Си(11) при добавлении к реакционной смеси восстановителя. Все попытки авторов использовать восстановление ш δίΐιι Си(11) в направлении каталитической модификации белка были безрезультатными. Качество спектральных характеристик соответствующих образцов было низким, и удаление свертки дает недостаточный сигнал для определения шумового коэффициента.
Ферментативная активность
Проводят кинетический анализ, который показывает, что мутантные белки и гликоконъюгаты сохраняют ферментативную активность (данные не приведены).
Исследования по связыванию с лектином
Были проведены эксперименты, которые показали, что гликоконъюгированные сахара влияют на биологическую доставку.
Лектин-связывающие свойства15 гликоконъюгированных 8§βΟ мутантов были охарактеризованы в рамках анализа их удерживающей способности на аффинных колонках с иммобилизованным лектином [6а1аЬ, каталожный номер ΡΝΑ, АтасЫк Нуродаеа: 051061, Соп А: 051041, ТпЦсит уц1дап8, К-\УСА1001]. Элюированные фракции визуализируют с использованием реагента Брэдфорда14 и определяют поглощение при длине волны 595 нм.
Таблица 87
- 15 013265
Мап δδβΟ демонстрирует явное связывание с лектином бобовых конканавалином А (Соп А), тогда как С1с-конъюгат (С1с δδβΟ) не демонстрирует выраженного связывания выше фонового значения. То же самое было показано для случая связывания в-СаГтриазол-конъюгированного δδβΟ с галактофильным лектином из арахиса, агглютинином (ΡΝΑ). Хитобиозный конъюгат (С1сХАс δδβΟ) и, в меньшей степени, С1сХАс конъюгаты, как было показано по результатам хроматографического анализа на спинаффинных колонках, также связываются с лектиновым агглютинином из зародышей пшеницы (\УСА). задерживая высвобождение неогликопептидов.
Отсутствие связывания глюкозных конъюгатов, в отличие от маннозных конъюгатов, можно объяснить меньшей аффинностью Соп А для глюкозы16. Относительное связывание моносахаридов с Соп А, как было показано, происходит в следующем порядке: МеаМап:Мап:МеаО1и:О1и, в соотношении 21:4:5:1. Из этого следует, что маннозные моносахариды связываются в 4 раза прочнее с Соп А, чем моносахариды глюкозы. Ароматический триазол также может вносить вклад в повышенное связывание маннозида, в сравнении с глюкозидом, осуществляемое через дисульфидную связь17.
Отсутствие связывания, выявляемое в некоторых конструкциях и не выявляемое в ряде других указанных выше конструкций, демонстрирует потребность в надежной процедуре получения гликопротеинов.
Доступность растворителей
В настоящий момент имеется лишь несколько исследований, относящихся к реакционной способности белков в химических реакциях, из числа тех, которые дают возможность провести интегрирован18 19-21 ную оценку доступности аминокислотных остатков .
Кристаллическую структуру δδβΟ получали в соответствии с методикой, описанной в работе 22. Доступность растворителя для мономера А в димерной форме δδβΟ определяют по методике №1ссе5523. Результаты оценки доступности мономера В дают практически идентичные значения. Значения, приведенные в виде относительной полной доступности боковой цепи, представляют особый интерес для данного исследования. Она является мерой доступности боковой цепи данной аминокислоты X относительно доступности той же самой боковой цепи в трипептиде А1а-Х-А1а. В этой связи можно ожидать, что доступность Ν-концевого остатка Ме11 при исследовании δδβΟ мутантов даст более высокие значения, чем расчетные значения для белка дикого типа (^Τ), поскольку экспрессированные мутанты содержат Ме41-О1у2, отделенный Н187-меткой от остальной части последовательности (остатки не пронумерованы).
Доступность растворителей проводят далее с использованием природной аминокислотной последовательности, а не на мутантах, например, содержащих включенный гомоазидоаланин и гомопропаргилглицин.
Расчеты проводят с использованием зондов разных размеров (1,0, 1,4 и 2,9 А), и было показано, что по мере повышения размера зонда становится доступным все меньшее число боковых цепей аминокислот.
На основании приведенных данных (см., приведенную ниже таблицу), следует ожидать, что метиониновые остатки в положениях 1, 43, 275 и 280 являются относительно доступными. То же самое можно ожидать в случае мутантов, которые являются их аналогами по метионину.
Таблица δ8
| Аминокислотный остаток | 1,0 А | 1,4 А | 2,8 А |
| МеС1 | 54,2 | 53,2 | 59,9 |
| Ме!21 | 9,8 | 1,9 | 0,0 |
| Ме!43 | 48,0 | 46,6 | 48,3 |
| МеЕ73 | 0,6 | 0,0 | 0,0 |
| Ме!148 | 3,6 | 0,0 | 0,0 |
| Ме!204 | 4,2 | 0,0 | 0,0 |
| Ме!236 | 17,3 | 11,2 | 2,1 |
| МеЬ275 | 62,8 | 64,0 | 69, 5 |
| Ме!280 | 37,5 | 35,1 | 26, 6 |
| Суз344 | 6,6 | 2,0 | 0,0 |
| МеЪ383 | 2,5 | 0,0 | 0, 0 |
| Ме!439 | 12,3 | 7,5 | 3,4 |
- 16 013265
Цилиндрическая форма Т1М
Наиболее распространенной третичной складчатой структурой, наблюдаемой при исследовании кристаллических структур белков, является Т1М цилиндр». Считается, что он присутствует в 10% всех белков24.
Гликопротеин Тамма-Хорсфолла (Татт-НогкГа11)(ТНр)
ТНр представляет собой наиболее широко представленную форму гликопротеина у млекопитающих12,25. Как известно и Ν-, и О-гликозилирование играют ключевую роль в биологической функции ТНр26. Известно, что семь из восьми возможных сайтов гликозилирования являются Νгликозилированными. В их число входит Акп-298 остаток27.
Гликозилирование эритропоэтина и гликозилцерамидазы
В случае эритропоэтина, соответствующими сайтами гликозилирования являются Акп24. Акп38 и Акп 83 для Ν-связанных углеводов. Данный белок содержит единственный сайт О-связанного гликозилированного в положении 8ег126. С использованием методики множественного сайт-направленного мутаганеза и включения метиониновых аналогов в сайты вновь введенных Ме! (природная последовательность Еро содержит только один метионин (М54)) данный белок может быть модифицирован.
Глюкозилцерамидаза (И-глюкоцереброзидаза), представляющая собой гликопротеин размером 60 кДа, который играет важную роль в развитии болезни Гоше, также может быть гликозилирована по данной методике.
Список цитированной литературы
1. Напсоск, 8. М., СогЬе!!, К., Рогбйат-8ке1!оп, А. Р., 6а!ейоике, ί. А. & Иау1к, В. 6. Иеуе1ортд рготксиоик д1усок1бакек Гог д1усок1бе куп!йек1к: Веыбиек \У433 апб Е432 ш 8и1Го1оЬик ко1Га!апсик Ье!ад1усок1баке аге 1трог!ап! д1исок1бе- апб да1ас!ок1бе-крес1йсйу бе!егттап!к. СйетВюСйет 6, 866-875 (2005).
2. уап Нек!, ί. С. М., Киск, К. Б. & Т1гге11, И. А. ЕГйаеп! тсогрогайоп оГ ипка!ига!еб те!йюшпе апа1одиек т!о рго!етк ш у1уо. I. Ат. Сйет. 8ос. 122, 1282-1288 (2000).
3. Апбги^к1ете^, В. & Во7к1е^1с7, И. Ап 1тргоуеб Ргерагайоп оГ №-!ег!-Ви!охусагЬопу1- апб N2Веп7у1оху-сагЬопу1-(8)-2,4-б1агшпоЬи!апо1с Ас1бк. 8уп!й: Соттип. 34,1049-1056 (2004).
4. 8хИаду ί, Ь. & буогдубеак, Ζ. 1пуекйда!юп оГ д1усоку1 а/|бек апб о!йег а/|бо кидагк: 8!егеосйетюа1 шПиепсек оп !йе опе-Ьопб 13С-1Н соирйпд сопк!ап!к. СагЬойубг. Век. 143,21-41 (1985).
5. МастШап, И., Иатек, А. М., ВаугйиЬег, М. & Рй!ксй, 8. Ь. 8ойб-Рйаке 8уп!йек1к оГ Тйюе!йегЫпкеб 61усорер!1бе М1тюк Гог Аррйсайоп !о 61усорго!ет 8ет1куп!йек1к. Огд. Бе!!. 4,1467-1470 (2002).
6. Иау1к, В. 6., Б1оуб, В. С & 1опек, ί. В. Соп!го11еб 8йе-8е1есйуе 61усоку1а!юп оГ Рго!етк Ьу а СотЬтеб 8йе-И1гес!еб Ми!адепек1к апб Сйетюа1 МобШсайоп Арргоасй. ί. Огд. Сйет. 63, 9614-9615 (1998).
7. Сйегпуак, А. Υ. е. а. 2-А/|бое1йу1 д1усок1бек: д1усок1бек ро!епйа11у икеГи1 Гог !йе ргерагайоп оГ пеод1усосоп)ида!ек. СагЬойубг. Век. 223, 303-309 (1992).
8. Райт1, С. ί. & Ζ^υ Ζ. А. Ииогодешс РгоЬе Гог !йе Соррег(1)-Са1а1ухеб А/|бе-А1купе Ыдайоп Веасйоп: Моби1а!юп оГ !йе Ниогексепсе Етккюп У1а 3(п,р*)-1(р,р*) 1пуегкюп. ί. Ат. Сйет. 8ос. 126 (2003).
9. Бочагу, Т., Ме1ба1, М., Не1тЬо1б!, А., Уаке11а, А. & Воск, К. №уе1 Туре оГ В1д1б С-Б1пкеб 61усоку1асе!у1епе - Рйепу1а1апте Вийбтд В1оскк Гог СотЬта!опа1 8уп!йек1к оГ С-йпкеб 61усорерйбек. ί. Огд. Сйет. 63, 9657-9668 (1998).
12. Рептса, И. е. а. 1бепййса!юп оГ Нитап Иготобийп ак !йе Татт-НогкГа11 Иппагу 61усорго!ет. 8с1епсе 236, 83-88 (1987).
13. Сйап, Т. В., НбдгаГ, В., 8йагр1екк, К. В. & Рокт, V. V. Ро1у1г1ахо1ек ак Соррег(1)-81аЫ1|/тд Б1дапбк т Са!а1ук1к. Огд. Бе!!. 6,2853-2855 (2004).
14. ВгабГогб, М. М. А гар1б апб кепкШуе те!йоб Гог !йе с.|иапШа1юп оГ тюгодгат с.|иап1Шек оГ рго!ет ιιΐΠίζίπβ !йе рппар1е оГ рго!ет-буе Ьтбтд. Апа1. Вюсйет. 72, 248-254 (1976).
15. Реагсе, О. М. Т. е! а1. 61усоу1гикек: сйетюа1 д1усоку1а!юп ге!агде!к абепоу1га1 депе !гапкГег. Апдете. Сйет. 1п!1 Еб. 44,1057-1061 (2005).
16. 8сйетата, Р. Р., Рип, К. И., Вйа!, В. 6. & 8игойа, А. Тйегтобупатюк оГ Мопокассйапбе Втбтд !о Сопсапауайп А, Реа (Р1кит кайуит) Бепй1, апб Бепй1 (Бепк сийпапк) Бесйп. ί. Вю1. Сйет. 268,7668-7677 (1993).
17. Рогек, В. И. & 6о1бк!ет, I. ί. Рго!ет-СагЬойубга!е 1п!егасйоп. Вюсйет. Рйагтасо1. 20, 2727-2739 (1971).
18. Бее, В. & Вюйагбк, Р. М. Тйе 1п!егрге!а!юп оГ Рго!ет 8!гис!игек: Екйтайоп оГ 8!айс АссеккМйу. ί. Мо1. Вю1. 55, 379-400 (1971).
19. 61оскег, М. О., Вогсйегк, С, Р1еб1ег, ^., 8искаи, И. & Р1ууЬу1ккГ М. Мо1еси1аг Сйагас!е^айоп оГ 8игГасе Торо1оду т Тегйагу 8!гис!игек Ьу Атто-Асу1а!юп апб Макк 8рес!готе!пс Рерйбе Марртд. Вюсоп). Сйет. 5, 583-590 (1994).
21. 8ап!гисек, Б, 8!гойа1т, М., Каб1с1к, V., Нупек, В. & Кобюек, М. Тугокте гекбиек тобШсайоп к!иб1еб Ьу МАБИ1-ТОР такк крес!готе!гу. Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 323, 1151 -1156 (2004).
22. Адийаг, С. Р. е! а1. Сгук!а1 к!гис!иге оГ !йе Ье!а-д1усок1баке Ггот !йе йуреййегторЫйс агсйеоп 8и1Го1оЬик ко1Га!апсик гекШепсе ак а кеу Гас!ог ш !йегток!аЬ11йу. ί. Мо1. Вю1 271, 789-802 (1997).
- 17 013265
24. РагЬег, 6. К. Ап а1рНа/Ье!а-Ьагге1 £и11 о£ еуойШопагу !гоиЫе. Сигг. Орш. 8!гис!. Вю1. 3, 409-412 (1993).
25. Татт, I. & Ногк£а11, Р. Ь. А тисорго!еш бепуеб £гот Нитап игше \\'1ис11 геас!к \νί11ι тПиеи/а, титрк, апб №\\'сак11е бекеаке упикек. I. Ехр. Меб. 95, 71-79 (1952).
26. Еак!оп, К. Ь., Ра!апкаг, М. 8., С1агк, 6. Р., Мотк, Н. К. & Бе11, А. Ргедпапсу-аккос1а!еб СНапдек ш (Не 61усоку1а!юп о£ Татт-Ногк£а11 61усорго!еш. I. Вю1. СНет. 275, 21928-21938 (2000).
27. уап Кооуеп, I. I. М., Уоккатр, А. Р., Катебшд, I. Р. & УБедепИаг!, Р. 6. 61усоку1а!юп кбек апб кйе-кресШс д1усоку1а!юп ш Нитап Татт-Ногк£а11 д1усорго!еш. 61усоЬю1оду 9, 21-30 (1999).
Claims (35)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ гликозилирования белка, включающий стадии:ί) модификации белка для включения алкиновой и/или азидной группы и ίί) взаимодействия модифицированного белка пункта (ί) с (a) углеводным фрагментом, модифицированным для включения азидной группы, и/или (b) углеводным фрагментом, модифицированным для включения алкиновой группы в присутствии Си(1) катализатора, где указанный Си(1) катализатор получают в растворителе в присутствии стабилизирующего лиганда.
- 2. Способ по п.1, где стабилизирующий лиганд представляет собой стабилизирующий аминный лиганд.
- 3. Способ по п.2, где указанный лиганд представляет собой тристриазолиламинный лиганд.
- 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный Си(1) катализатор выбирают из группы, состоящей из СиВг и Си1.
- 5. Способ по п.4, где указанный Си(1) катализатор представляет собой Си(1)Вг.
- 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная модификация белка включает замещение одной или нескольких аминокислот в белке одним или несколькими неприродными аналогами аминокислот.
- 7. Способ по п.6, где указанный неприродный аналог аминокислоты представляет собой аналог метионина.
- 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный аналог метионина представляет собой гомопропаргилглицин или азидогомоаланин.
- 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок включает более 10 аминокислот.
- 10. Способ по п.9, где указанный белок включает от 10 до 1000 аминокислот.
- 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок имеет молекулярную массу свыше 10 кДа.
- 12. Способ по п.10, где указанный белок имеет молекулярную массу от 10 до 100 кДа.
- 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок выбирают из группы, состоящей из гликопротеинов, белков крови, гормонов, ферментов, рецепторов, антител, интерлейкинов и интерферонов.
- 14. Способ по п.13, где указанный белок является гормоном.
- 15. Способ по п.14, где указанный гормон представляет собой эритропоэтин.
- 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная модификация белка (стадия ί) дополнительно включает стадию модификации белка для включения тиоловой группы.
- 17. Способ по п.16, где указанную тиоловую группу вводят путем инсерции цистеинового остатка в аминокислотную последовательность белка.
- 18. Способ по п.16 или 17, где способ включает взаимодействие модифицированного белка, модифицированного на стадии (ί) с тиолселективным углеводным реагентом.
- 19. Способ по п.18, где указанный тиолселективный углеводный реагент представляет собой реагент, который взаимодействует с тиоловой группой в белке для введения гликозильного остатка, связанного с белком через дисульфидную связь.
- 20. Способ по п.19, где указанный тиолселективный углеводный реагент представляет собой гликотиосульфонатный реагент.
- 21. Способ по п.20, где указанный гликотиосульфонатный реагент представляет собой гликометантиосульфонатный реагент.
- 22. Способ по любому из пп.16-19, где указанный тиолселективный реагент представляет собой гликоселенилсульфидный реагент.
- 23. Белок формулы (III)- 18 013265 где а и Ь представляют целые числа от 0 до 5; и р и с.| представляют целые числа от 1 до 5, и указанный белок включает по крайней мере 10 аминокислот.где ΐ обозначает целое число от 1 до 5; и спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С; и указанный белок включает по крайней мере 10 аминокислот.
- 25. Гликозилированный белок по п.24, где указанный спейсер выбирают из группы, состоящей из С1-6 алкильной группы и С1-6 гетероалкила.
- 26. Гликозилированный белок по п.25, где указанный спейсер выбирают из группы, состоящей из метила, этила и СН2(Х)У, где X обозначает О, N или 8 и у равен 0 или 1.
- 27. Гликозилированный белок по любому из пп.24-26, где указанный белок имеет формулу (V) где р и с.| обозначают целое число от 0 до 5 и ΐ обозначает целое число от 1 до 5.
- 28. Гликозилированный белок по п.27, где указанный белок имеет формулу (VI) (VI).
- 29. Гликозилированный белок по п.27, где указанный белок имеет формулу (VII) (νιΐ) где и и ΐ обозначают целые числа от 1 до 5; спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С; и и Ζ представляют собой углеводные фрагменты, которые могут быть одинаковыми или различными.где р, д, г и 5 обозначают целые числа от 0 до 5.- 19 013265
- 34. Белок по любому из пп.23-33, где указанный белок включает от 10 до 1000 аминокислот.
- 35. Белок по любому из пп.23-33, где указанный белок имеет молекулярную массу свыше 10 кДа.
- 36. Белок по п.35, где указанный белок имеет молекулярную массу от 10 до 100 кДа.
- 37. Белок по любому из пп.23-36, где указанный белок выбирают из группы, состоящей из гликопротеинов, белков крови, гормонов, ферментов, рецепторов, антител, интерлейкинов и интерферонов.
- 38. Белок по п.37, где указанный белок является гормоном.
- 39. Белок по п.38, где указанный гормон представляет собой эритропоэтин.
- 40. Применение белка по любому из пп.23-39 в качестве лекарственного средства.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0507123.8A GB0507123D0 (en) | 2005-04-08 | 2005-04-08 | Method |
| PCT/GB2006/001274 WO2006106348A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-04-06 | Protein glycosylation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200702193A1 EA200702193A1 (ru) | 2008-04-28 |
| EA013265B1 true EA013265B1 (ru) | 2010-04-30 |
Family
ID=34586902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200702193A EA013265B1 (ru) | 2005-04-08 | 2006-04-06 | Гликозилирование белков |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110059501A1 (ru) |
| EP (1) | EP1871784A2 (ru) |
| JP (1) | JP2008534665A (ru) |
| KR (1) | KR20080007575A (ru) |
| CN (1) | CN101198619A (ru) |
| AU (1) | AU2006232642A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0609088A2 (ru) |
| CA (1) | CA2603936A1 (ru) |
| EA (1) | EA013265B1 (ru) |
| GB (1) | GB0507123D0 (ru) |
| IL (1) | IL186500A0 (ru) |
| MX (1) | MX2007012544A (ru) |
| NZ (1) | NZ562996A (ru) |
| WO (1) | WO2006106348A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200709105B (ru) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101367219B1 (ko) | 2008-04-30 | 2014-03-14 | 지멘스 메디컬 솔루션즈 유에스에이, 인크. | 기질 기재 ｐｅｔ 조영제 |
| US8431551B2 (en) | 2010-01-12 | 2013-04-30 | Albert Duoibes | Nutritional composition made using isolated organic matter |
| WO2011094580A2 (en) * | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides |
| JP2013535198A (ja) | 2010-07-30 | 2013-09-12 | グリコド | 哺乳類のグリコシル化経路を有する酵母人工染色体 |
| JP2014509864A (ja) | 2011-03-23 | 2014-04-24 | グリコド | Ｇｄｐ−フコースを産生可能な酵母組換え細胞 |
| WO2012142659A1 (en) * | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited | Site-selective modification of proteins |
| JP6095571B2 (ja) * | 2011-09-20 | 2017-03-15 | 国立大学法人 和歌山大学 | 新規シアロ糖鎖の製造方法 |
| WO2013130917A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Ambrx, Inc. | Interleukin-3 polypeptide conjugates their uses |
| JP6324660B2 (ja) * | 2013-03-19 | 2018-05-16 | 国立大学法人 和歌山大学 | 新規（２→３）結合型シアロ糖鎖の製造方法 |
| WO2015031147A1 (en) * | 2013-08-26 | 2015-03-05 | Duoibes Albert R | Catalyst and related methods |
| US20160130324A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof |
| BR112018010160A8 (pt) | 2015-11-19 | 2019-02-26 | Shire Human Genetic Therapies | inibidor da c1 esterase humana recombinante e usos do mesmo |
| EP3210626B1 (en) * | 2016-02-26 | 2024-11-27 | biolitec Holding GmbH & Co KG | Conjugates of porphyrinoid photosensitizers and glycerol-based polymers for photodynamic therapy |
| WO2023133352A2 (en) * | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Climax Foods Inc. | System and method for protein selection |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0737682A1 (en) * | 1995-04-11 | 1996-10-16 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Substituted thiophene derivative and agricultural and horticultural fungicide containing the same as active ingredient |
| JPH11302110A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302108A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302107A (ja) * | 1998-04-15 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302111A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302109A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JP2001072512A (ja) * | 1999-09-03 | 2001-03-21 | Mitsui Chemicals Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JP2001072511A (ja) * | 1999-09-03 | 2001-03-21 | Mitsui Chemicals Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| WO2005122770A2 (de) * | 2004-06-21 | 2005-12-29 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Beizmittel zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen |
| WO2006036827A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Fungicidal mixtures of thiophene derivative |
| WO2006082723A1 (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | 植物病害防除組成物及びその防除方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin |
| US5470949A (en) * | 1992-12-15 | 1995-11-28 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Method for making amino acid glycosides and glycopeptides |
| US5589356A (en) * | 1993-06-21 | 1996-12-31 | Vanderbilt University | Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement |
| AU749383B2 (en) * | 1998-07-02 | 2002-06-27 | Genencor International, Inc. | Chemically modified proteins with a carbohydrate moiety |
| WO2001068565A2 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | The Regents Of The University Of California | Chemoselective ligation by use of a phosphine |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| JP2002176998A (ja) * | 2000-12-15 | 2002-06-25 | Meiji Milk Prod Co Ltd | ムチン型糖ペプチドおよび糖タンパク質製造法 |
| US7767643B2 (en) * | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| HUP0600342A3 (en) * | 2001-10-25 | 2011-03-28 | Genentech Inc | Glycoprotein compositions |
| JP2003235561A (ja) * | 2002-02-21 | 2003-08-26 | Kazuhito Fujiyama | 植物型糖鎖を持つ糖タンパク質を動物型糖鎖を持つ糖タンパク質に変換する方法 |
| US7301006B2 (en) * | 2002-07-16 | 2007-11-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and materials for the synthesis of modified peptides |
| CN103215228A (zh) * | 2003-04-17 | 2013-07-24 | 斯克利普斯研究院 | 扩展真核生物遗传密码 |
| EP2793027B1 (en) * | 2003-06-18 | 2019-11-13 | The Scripps Research Institute | Unnatural reactive amino acid genetic code additions |
| WO2005000862A2 (en) * | 2003-06-24 | 2005-01-06 | Isis Innovation Limited | Reagents and methods for the formation of disulfide bonds and the glycosylation of proteins |
-
2005
- 2005-04-08 GB GBGB0507123.8A patent/GB0507123D0/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-04-06 EP EP06726677A patent/EP1871784A2/en not_active Withdrawn
- 2006-04-06 BR BRPI0609088-5A patent/BRPI0609088A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 WO PCT/GB2006/001274 patent/WO2006106348A2/en active Application Filing
- 2006-04-06 JP JP2008504845A patent/JP2008534665A/ja active Pending
- 2006-04-06 CN CNA2006800200961A patent/CN101198619A/zh active Pending
- 2006-04-06 NZ NZ562996A patent/NZ562996A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 MX MX2007012544A patent/MX2007012544A/es unknown
- 2006-04-06 AU AU2006232642A patent/AU2006232642A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-06 CA CA002603936A patent/CA2603936A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-06 KR KR1020077025889A patent/KR20080007575A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-04-06 EA EA200702193A patent/EA013265B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 US US11/910,883 patent/US20110059501A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-08 IL IL186500A patent/IL186500A0/en unknown
- 2007-10-22 ZA ZA200709105A patent/ZA200709105B/xx unknown
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0737682A1 (en) * | 1995-04-11 | 1996-10-16 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Substituted thiophene derivative and agricultural and horticultural fungicide containing the same as active ingredient |
| JPH11302107A (ja) * | 1998-04-15 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302110A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302108A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302111A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JPH11302109A (ja) * | 1998-04-24 | 1999-11-02 | Mitsui Chem Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JP2001072512A (ja) * | 1999-09-03 | 2001-03-21 | Mitsui Chemicals Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| JP2001072511A (ja) * | 1999-09-03 | 2001-03-21 | Mitsui Chemicals Inc | 植物病害防除剤組成物 |
| WO2005122770A2 (de) * | 2004-06-21 | 2005-12-29 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Beizmittel zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen |
| WO2006036827A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Fungicidal mixtures of thiophene derivative |
| WO2006082723A1 (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | 植物病害防除組成物及びその防除方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| DATABASE WPI Week 200658 Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 2006-569245 XP002402131 -& WO 2006/082723 A1 (MITSUI CHEM INC) 10 August 2006 (2006-08-10) abstract * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 02, 29 February 2000 (2000-02-29)-& JP 11 302107 A (MITSUI CHEM INC), 2 November 1999 (1999-11-02) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraph [0007], paragraphs [0011], [0012]; compound 2 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 02, 29 February 2000 (2000-02-29)-& JP 11 302109 A (MITSUI CHEM INC), 2 November 1999 (1999-11-02) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraphs [0005], [0006], paragraphs [0013], [0014], paragraph [0030]; compound 2 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 02, 29 February 2000 (2000-02-29)-& JP 11 302110 A (MITSUI CHEM INC), 2 November 1999 (1999-11-02) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraph [0004], paragraphs [0011], [0012]; compound 2 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 02, 29 February 2000 (2000-02-29]-& JP 11 302108 A (MITSUI CHEM INC), 2 November 1999 (1999-11-02) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraphs [0004], [0005]; compounds (A1),(A2) paragraph [0008], paragraphs [0014], [0015]; compound 2 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 02, 29 February 2000 (2800-02-29) -& JP 11 302111 A (MITSUI CHEM INC), 2 November 1999 (1999-11-02) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraphs [0004]-[0006]; claims 3-6 paragraphs [0011]-[0013], paragraphs [0026], [0030]-[0032] * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 20, 10 July 2001 (2001-07-10)-& JP 2001 072511 A (MITSUI CHEMICALS INC), 21 March 2001 (2001-03-21) cited in the application siehe auch Englische Übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstract paragraphs [0004]-[0009], paragraphs [0010], [0011], paragraphs [0015]-[0017]; compound 2 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 2000, no. 20, 10 July 2001 (2001-07-10)-& JP 2001 072512 A (MITSUI CHEMICALS INC), 21 March 2001 (2001-03-21) siehe auch Englische übersetzung auf http://dossier.ipdl.ncipi.go.jp abstrac paragraphs [0004]-[0012] paragraphs [0017], [0018] * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2006232642A1 (en) | 2006-10-12 |
| WO2006106348A3 (en) | 2007-01-04 |
| CN101198619A (zh) | 2008-06-11 |
| WO2006106348A2 (en) | 2006-10-12 |
| EP1871784A2 (en) | 2008-01-02 |
| GB0507123D0 (en) | 2005-05-11 |
| BRPI0609088A2 (pt) | 2010-11-16 |
| EA200702193A1 (ru) | 2008-04-28 |
| IL186500A0 (en) | 2008-01-20 |
| MX2007012544A (es) | 2008-02-25 |
| NZ562996A (en) | 2009-08-28 |
| CA2603936A1 (en) | 2006-10-12 |
| ZA200709105B (en) | 2008-08-27 |
| KR20080007575A (ko) | 2008-01-22 |
| US20110059501A1 (en) | 2011-03-10 |
| JP2008534665A (ja) | 2008-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA013265B1 (ru) | Гликозилирование белков | |
| Wright | Crystal structure of a wheat germ agglutinin/glycophorin-sialoglycopeptide receptor complex. Structural basis for cooperative lectin-cell binding. | |
| Watson et al. | Structure determination of the intact major sialylated oligosaccharide chains of recombinant human erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells | |
| Yu et al. | Recent progress in synthetic and biological studies of GPI anchors and GPI-anchored proteins | |
| Watt et al. | A convergent strategy for the preparation of N-glycan core di-, tri-, and pentasaccharide thioaldoses for the site-specific glycosylation of peptides and proteins bearing free cysteines | |
| JP4787155B2 (ja) | タンパク質のジスルフィド結合形成およびグリコシル化の方法とそれに用いられる試薬 | |
| US5426178A (en) | Synthesis of anti-inflammatory compounds, and novel trisaccharides useful in the synthesis of anti-inflammatory compounds | |
| Richardson et al. | Exploring neoglycoprotein assembly through native chemical ligation using neoglycopeptide thioesters prepared via N→ S acyl transfer | |
| Andersen et al. | Monosaccharide and oligosaccharide analysis of isoelectric focusing-separated and blotted granulocyte colony-stimulating factor glycoforms using high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection | |
| WO1995003315A2 (en) | Saccharides, their synthesis and use | |
| Magnadóttir et al. | The carbohydrate moiety of serum IgM from Atlantic cod (Gadus morhua L.) | |
| Stubbs et al. | Preparative purification of tetraantennary oligosaccharides from human asialyl orosomucoid | |
| WO1995015969A1 (en) | Glycozylhydrazines, preparation, immobilization and reactions of: glycoprotein analysis and o-glycan removal | |
| Maki et al. | Isolation and characterization of high-mannose type glycans containing five or six mannose residues from hen egg yolk | |
| EP0413675B1 (en) | Method for producing synthetic N-linked glycoconjugates | |
| Nagano et al. | Detection of isoforms of recombinant human erythropoietin by various plant lectins after isoelectric focusing | |
| Yamashita et al. | Purification and characterization of a Fuc alpha 1–> 2Gal beta 1–> and GalNAc beta 1–>-specific lectin in root tubers of Trichosanthes japonica. | |
| Singha et al. | Multivalent II [β-d-Galp-(1→ 4)-β-d-GlcpNAc] and Tα [β-d-Galp-(1→ 3)-α-d-GalpNAc] specific Moraceae family plant lectin from the seeds of Ficus bengalensis fruits | |
| Cudic et al. | Improved synthesis of 5‐hydroxylysine (Hyl) derivatives | |
| Cudic et al. | Preparation of glycosylated amino acids suitable for Fmoc solid-phase assembly | |
| EP4481052A1 (en) | Complex-type sugar asparagine and method for producing same | |
| EP4349996A1 (en) | Method for producing glycopeptide | |
| Borgia et al. | Difficulties encountered during glycopeptide syntheses | |
| Martín | Automated Solid-Phase Based Methodologies for the Synthesis of Glycosylated Biomolecules | |
| Baj | Development of Receptors for Aqueous Carbohydrate Recognition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |