EA010350B1 - Антитела против cd3 и способы их применения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к антителам, направленным на антиген CD3, и к способам применения таких антител. В частности, настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, направленным против CD3. Предоставляются нуклеотидные последовательности, кодирующие иммуноглобулиновые молекулы легких и тяжелых цепей, и аминокислотные последовательности, содержащие данные молекулы, в частности последовательности, содержащие иммуноглобулиновые молекулы легких и тяжелых цепей, в частности последовательности, соответствующие непрерывным последовательностям легких и тяжелых цепей, перекрывающим каркасные области и/или области, определяющие комплементарность (CDR), конкретно от FR1 до FR4 или от CDR1 до CDR3. Также предоставляются гибридомы или другие клеточные линии, экспрессирующие такие иммуноглобулиновые молекулы и моноклональные антитела.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение, в общем, относится к полностью человеческим антителам против СЭЗ. а также к способам их применения.

Предществующиий уровень техники

Иммунная система организма служит в качестве защиты против различных состояний, включая, например, травму, инфекцию и неоплазию, и опосредована двумя отдельными, но взаимосвязанными системами, клеточной и гуморальной иммунной системами. В общем, гуморальная система опосредована растворимыми продуктами, называемыми антителами или иммуноглобулинами, которые способны соединяться с продуктами, распознаваемыми системой как чужеродные для организма, и нейтрализовать их. В отличие от этого, клеточная иммунная система вовлекает мобилизацию особых клеток, называемых Т-клетками, которые выполняют различные терапевтические роли.

Иммунная система людей и животных включает в себя два основных класса лимфоцитов: клетки тимусного происхождения (Т-клетки) и клетки костно-мозгового происхождения (В-клетки). Зрелые Тклетки выходят из тимуса и циркулируют в тканях, лимфатической системе и кровяном русле. Т-клетки проявляют иммунологическую специфичность и непосредственно вовлечены в клеточноопосредованные иммунные реакции (такие как отторжение транплантата). Т-клетки действуют против различных чужеродных структур (антигенов) или в ответ на их появление. Во многих случаях данные чужеродные антигены экспрессируются на клетках хозяина в результате инфекции. Однако чужеродные антигены также могут происходить от самого хозяина, измененного неоплазией или инфекцией. Хотя Тклетки сами не секретируют антитела, они обычно требуются для секреции антител вторым классом лимфоцитов, В-клетками.

Имеются различные субпопуляции Т-клеток, которые, в общем, определяются антигенными детерминантами, находящимися на их клеточных поверхностях, а также функциональной активностью и распознаванием чужеродного антигена. Некоторые субпопуляции Т-клеток, такие как СЭ8+ клетки, являются киллерными/супрессорными клетками, которые играют регуляторную функцию в иммунной системе, тогда как другие, такие как ί.Ό4+ клетки, служат для стимуляции воспалительных и гуморальных реакций.

Переход в митоз человеческих периферических Т-лимфоцитов может стимулироваться различными агентами, включая чужеродные антитела, моноклональные антитела и лектины, такие как фитогемагглютинин и конканавалин А. Хотя активация преимущественно происходит за счет связывания митогенов в специфических участках на клеточных мембранах, природа данных рецепторов и механизм их активации не вполне выяснены. Индукция пролиферации является только одним признаком активации Т-клеток. Другие признаки активации, определенной как изменения фонового или покоящегося состояния клетки, включают в себя повышение продукции цитокинов и активности цитотоксических клеток.

Активация Т-клеток является комплексным феноменом, который зависит от участия различных молекул клеточной поверхности, экспрессированных на отвечающей популяции Т-клеток. Например, антигенспецифичный Т-клеточный рецептор (ТсК) состоит из связанного дисульфидными связями гетеродимера, содержащего две клонально распределенных интегральных мембранных цепи гликопротеинов, альфа и бета (α и β), или гамма и дельта (γ и 5), нековалентно ассоциированных с комплексом инвариантных белков с низкой молекулярной массой, обычно обозначаемых как СЭ3 (ранее обозначаемых как Т3).

Альфа- и бета-цепи ТсК определяют специфичность антигена. Структуры СО3 представляют добавочные молекулы, являющиеся элементами трансдукции сигналов активации, инициированных после связывания ТсК. альфа-бета (ТсК αβ) со своим лигандом. Имеются обе константных области гликопротеиновых цепей ТсК, и вариабельные области (полиморфизмы). Полиморфные вариабельные области ТсК определяют субпопуляции Т-клеток с различной специфичностью. В отличие от антител, которые распознают целые или более малые фрагменты антигена, комплекс ТсК взаимодействует только с малым пептидом антигена, который должен презентироваться в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС). Молекулы МНС представляют другой, высокополиморфный набор молекул, случайно распределенных по виду. Так, активация часто требует тройного взаимодействия ТсК и чужеродного пептидного антигена, связанного с основными белками МНС.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, направленным против СО3. Примеры моноклональных антител включают в себя описанные здесь 28Р11, 27Н5, 23Р10 и 15С3. Альтернативно, моноклональное антитело представляет собой антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и 28Р11, 27Н5, 23Р10 или 15С3. Данные антитела, соответственно, обозначаются здесь как антитела 1ιιιί.Ό3. Антитело йиСО3 имеет одну или несколько следующих характеристик: антитело связывается с СО3-положительными (СО3+) клетками, но не с СО3-отрицательными (СО3-) клетками; антитело йиСО3 индуцирует антигенную модуляцию с вовлечением изменения (например, снижения) уровня экспрессии на клеточной поверхности или активность СО3 или Т-клеточного рецептора (ТсК); антитело 1ιιιί.Ό3 ингибирует связывание мышиного моноклонального антитела ОКТ3

- 1 010350 против человеческого белка с Т-лимфоцитами; или антитело 1шСГО3 связывает эпитоп СЭ3. который полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность ЕМОО1ТОТРУКУ818ОТ (8ЕО ГО N0:21). Антитела 1шСГО3 по изобретению конкурируют с мышиным антителом против СГОЗ ОКТ3 за связывание с ΟΌ3. и воздействие антитела 1шСГО3 удаляет или маскирует СГОЗ и/или ТсК без воздействия на экспрессию на клеточной поверхности ΟΌ2. СГО4 или СВ8. Маскировка СГОЗ и/или ТсК приводит к потере или снижению активации Т-клеток, что требуется при аутоиммунных заболеваниях, где происходит бесконтрольная активация Т-клеток. Отрицательная регуляция СГОЗ приводит к пролонгированному эффекту сниженной активации Т-клеток. например. на период. по меньшей мере. нескольких месяцев, по сравнению с преходящей супрессией, наблюдаемой с использованием традиционного иммуносупрессорного агента. например циклоспорина.

Антигенное модулирование относится к перераспределению и элиминации комплекса СГОЗ-Тклеточный рецептор на поверхности клетки, например лимфоцита. Снижение уровня экспрессии на клеточной поверхности или активности ТсК. на клетки означает, что количество или функция ТсК снижены. Модулирование уровня экспрессии на клеточной поверхности или активности СГОЗ означает, что количество СГОЗ на клеточной поверхности или функция СГОЗ изменена, например снижена. Количество СГОЗ или ТсК, экспрессированного на плазматической мембране клетки, снижается, например, интернализацией СГОЗ или ТсК после контакта клетки с антителом 1шСГО3. Альтернативно, после контакта клетки с антителом 1шСГО3 СГОЗ или ТсК маскируются.

Ингибирование связывания мышиного моноклонального антитела ОКТ3 против человеческого белка с Т-лимфоцитом определяется снижением способности мышиного антитела ОКТ3 образовывать комплекс с СГОЗ на клеточной поверхности Т-лимфоцита.

Антитело 1шСГО3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2, 6, 10 или 22, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4, 8, 16-20 или 25-26. Предпочтительно, три СЭК тяжелой цепи включают в себя аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90, 92, 95, 97 98, 99% или более идентичности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из СУОМИ (8ЕО ГО N0: 27); У1АЛГОО8ККУУУГО8УКО (8ЕО ГО N0: 28); ОМОУА'ШГОЕ (8ЕО ГО N0:29); 8УОМН (8ЕО ГО N0:33); 11\\ЛГОО8КК\УА1)8УКО (8ЕО ГО N0:34); ОТОУХАТГОР (8ЕО ГО N0: 35) и А1\УХОКК0ОУАО8УКО (8Е0 ГО N0:44), и три СЭК легкой цепи включают в себя аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности КА§Р§У88УЬА (8ЕО ГО N0: 30); ИА8ПКАТ (8ЕО ГО N0:31); О('Ж8\\\ТРЕТ (8ЕО ГО N0: 32); КА8Р8У888УЬА (8ЕО ГО N0: 36); ОА88КАТ (8ЕО ГО N0: 37); ООУО88РГГ (8ЕО ГО N0: 38); КА8РО188АЬА (8ЕО ГО N0: 39); УА88ЬР8 (8ЕО ГО N0: 40); ООУУ8ТЕТ (8ЕО ГО N0:41); ОА88ЬО8 (8ЕО ГО N0: 42); \\'А8ОО188УЕА (8ЕО ГО N0: 43); О('Ж8\\\'Р\\'Т (8ЕО ГО N0:45); ОА88ЬЕ8 (8ЕО ГО N0: 46) и 00ЕУ8УР1Т (8Е0 ГО N0: 47). Антитело связывает СГОЗ.

Антитело йиСОЗ по изобретению характеризуется по меньшей мере двумя или более (т.е. двумя или более, тремя или более, четырьмя или более, пятью или более, шестью или более, семью или более, восемью или более, девятью или более, десятью или более, одиннадцатью или более) из следующих характеристик: антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (\Н), кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии ΌΡ50 У_Н или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии ΌΡ50 У_Н; антитело содержит вариабельную область легкой цепи (У_ъ), кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии Ь6 У_ъ или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии Ь6 У_ъ; антитело содержит У_ъ, кодируемую генной последовательностью человеческой зародышевой линии Ь4/18а Уь или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной генной последовательности человеческой зародышевой линии Ь4/18а Уь; антитело включает в себя область СГОК1 У_Н, содержащую аминокислотную последовательность УОМН (8Е0 ГО N0: 58); антитело включает в себя область СГОК2 У_Н, содержащую аминокислотную последовательность И8УКО (8Е0 ГО N0: 59); область СГОК2 У_Н, содержащую аминокислотную последовательность 1\УХ1ОХ₂ХзХ₄Х₅УХ₆П8УКО (8Е0 ГО N0: 60); область СГОКЗ У_Н, содержащую аминокислотную последовательность Х_лХ|;ОУХ_сХ|.)Е0Х_е (8Е0 ГО N0: 61); область СИКЗ У_Н, содержащую аминокислотную последовательность ОТОУЖУЕОР (8Е0 ГО N0: 62) или аминокислотную последовательность ОМОУХУНЕОБ (8Е0 ГО N0: 63); антитело включает в себя аминокислотную последовательность УТУ88 (8Е0 ГО N0: 64) в положении, которое является С-концевым по отношению к СИКЗ-области, где положение, которое является С-концевым по отношению к СИКЗ-области, входит в вариабельную область; антитело включает в себя аминокислотную последовательность ОТЬУТУ88 (8Е0 ГО N0: 65) в положении, которое является С-концевым по отношению к СЭКЗ-области, где положение, которое является Сконцевым по отношению к СИКЗ-области, входит в вариабельную область; антитело включает в себя аминокислотную последовательность \ХОКОТЕУТУ88 (8Е0 ГО N0: 66) в положении, которое является С-концевым по отношению к СИКЗ-области, где положение, которое является С-концевым по отношению к СИКЗ-области, входит в вариабельную область; антитело связывается с эпитопом, который час

- 2 010350 тично или полностью включает в себя аминокислотную последовательность ЕМСС1ТОТРУКУ818СТ (8ЕО ΙΌ N0: 67); и антитело включает в себя мутацию в тяжелой цепи в аминокислотном остатке в положении 234, 235, 265 или 297 или в их сочетаниях, и где высвобождение цитокинов из Т-клетки в присутствии указанного антитела снижено по сравнению с высвобождением цитокинов из Т-клетки в присутствии антитела, которое не включает в себя мутацию в тяжелой цепи в положении 234, 235, 265 или 297, или в их комбинации. Нумерация описанных здесь остатков тяжелой цепи соответствует индексу ЕЙ (см. КаЬа! с1 а1., РгсИсиъ οί 11ппшпо1ощса1 1п1сгс51. ИЗ ЭерЕ οί НеаИЪ & Нитап Зетсех (1983)), как показано, например, в патентах США № 5624821 и 5648260, содержание которых полностью включено сюда в качестве ссылки.

В некоторых аспектах антитело 1шСЭ3 содержит мутацию аминокислот. Мутация находится в константной области. Мутация приводит к образованию антитела, которое имеет измененную эффекторную функцию. Эффекторная функция антитела изменена путем изменения, т.е. повышения или снижения сродства антитела в отношении эффекторной молекулы, такой как Ес-рецептор или компонента комплемента. За счет изменения эффекторной функции антитела возможно контролировать различные аспекты иммунного ответа, например усиление или подавление различных реакций иммунной системы. Например, мутация приводит к получению антитела, которое способно снижать высвобождение цитокина из Тклетки. Например, мутация происходит в тяжелой цепи в аминокислотном остатке 234, 235, 265 или 297 или в их комбинации. Предпочтительно, мутация приводит к появлению остатка аланина в положении 234, 235, 265 или 297, или остатка глутаминовой кислоты в положении 235, или их комбинации. Термин «цитокин» относится ко всем человеческим цитокинам, известным в данной области, которые связывают внеклеточные рецепторы, экспрессированные на клеточной поверхности, и за счет этого модулируют функцию клетки, включая в качестве неограничивающих примеров Ш-2, ΙΕΝ-гамма, ΤΝΕ-α, Ш-4, 1Ь-5, Ш-6, Ш-9, Ш-10 и Ш-13.

Высвобождение цитокинов может приводить к токсичному состоянию, известному как синдром высвобождения цитокинов (СК.З), обычному клиническому осложнению, которое происходит, например, при использовании антитела против Т-клеток, такого как АТС (антитимоцитарный глобулин) и ОКТ3 (мышиное антитело против человеческого СО3). Данный синдром характеризуется интенсивным высвобождением цитокинов, таких как ΤNΕ, ΙΕΝ-гамма и 1Ь-2 в циркуляторное русло. СК.З происходит в результате одновременного связывания антител с СЭ3 (посредством вариабельной области антитела) и с Ес-рецепторами и/или рецепторами комплемента (через константную область антитела) на других клетках, с активацией за счет этого Т-клеток с высвобождением цитокинов, которые продуцируют системный воспалительный ответ, характеризующийся гипотензией, повышенной температурой и ознобом. Симптомы СР8 включают в себя лихорадку, озноб, тошноту, рвоту, гипотензию и одышку. Таким образом, антитело 1шСЭ3 по изобретению содержит одну или несколько мутаций, которые предотвращают опосредованное константной областью тяжелой цепи высвобождение одного или нескольких цитокинов ίη νίνο.

Полностью человеческие антитела против СЭ3 по изобретению включают в себя, например, мута234 235 234 235 цию Ь Ь А Е в Ес-области, так что высвобождение цитокинов после воздействия антитела 1шСЭ3 значительно снижено или отменено (см., например, фиг. 11 А, 11В). Как описано ниже в примере

234 235 234 235

4, мутация Ь Ь А Е в Ес-области антител 1шСЭ3 по изобретению снижает или отменяет высвобождение цитокинов там, где антитела 1шСЭ3 воздействуют на лейкоциты человека, в то время как мутации, описанные ниже, поддерживают значительную способность к высвобождению цитокинов. Например, значительное снижение в высвобождении цитокинов определяется сравнением высвобождения цитокинов после воздействия антитела 1111003, имеющего мутацию Ь²³⁴ Ь²³⁵ А²³⁴ Е²³⁵ в Ес-области, до уровня высвобождения цитокинов после воздействия другого антитела против СО3, имеющего одну или несколько описанных здесь мутаций. Другие мутации в Ес-области включают в себя, например, Ь²³⁴ _Ь ²з5^а²³⁴А²³⁵, Ь²³⁵^Е²³⁵, \ >А и О ' >А^; '.

Альтернативно, антитело 1ιι.ιί.Ό3 кодируется нуклеиновой кислотой, которая включает в себя одну или несколько мутаций, которые замещают остаток нуклеиновой кислоты остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии. Под «остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии» подразумевается остаток нуклеиновой кислоты, который имеется в природе в гене зародышевой линии, кодирующем константную или вариабельную области. «Ген зародышевой линии» представляет собой ДНК, находящуюся в зародышевой клетке (т.е. клетке, которой суждено стать яйцеклеткой или сперматозоидом). «Мутация зародышевой линии» относится к наследуемому изменению конкретной ДНК, которое происходит в зародышевой клетке или в зиготе на стадии единичной клетки, и затем переносится на потомство, например мутация вводится в каждую клетку организма. Мутация зародышевой линии является противоположностью соматической мутации, которая приобретается единичной клеткой организма. В некоторых случаях нуклеотиды в последовательности ДНК зародышевой линии, кодирующей вариабельную область, мутированы (т.е. имеют соматическую мутацию) и замещены другим нуклеотидом. Таким образом, антитела по изобретению включают одну или несколько мутаций, которые замещают нуклеиновую кислоту остатком нуклеиновой кислоты зародышевой линии. Гены антитела зародышевой линии вклю- 3 010350 чают, например, ΌΡ50 (инвентарный номер: 1МСТ/ЕМВЬ/СепБапк/ППШ:Ь06618) , Ьб (инвентарный номер: 1МСТ/ЕМВЬ/СепВапк/ППВ1:Х01668) и Ь4/18а (инвентарный номер: ЕМВЬ/СепВапк/

ΌΌΒ1:Ζ00006).

Тяжелая цепь антитела 1шСГО3 происходит из гена V (вариабельной цепи) зародышевой линии, такого как, например, ген зародышевой линии ΌΡ50. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности для гена зародышевой линии ΌΡ50 включают, например, последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности, показанные ниже:

ЕдвЕЕсаСдд адаааЕадад адасЕдадЕд ЕдадЕдааса ЕдадЕдадаа ааасЕддаге СдЕдЕддсаЕ ЕЕЕсЕдаЕаа сддЕдЕссЕЕ сЕдЕЕЕдсад дьдьссадьд ЬсаддЕдсад сЕддЕддадЕ сЕдддддадд сдЕддЕссад ссЕдддаддЕ ссседадасЕ сЕссЕдЕдса дсдЕседдаЕ ЕсассЕЕсад ЕадсЕаЕддс аЕдсасЕддд Ессдссаддс Ессаддсаад дддсЕддадЕ дддЕддсадЕ ЕаЕаЕддЕаЕ даЕддаадСа аСаааЕасЕа ЕдоадасЕсс дЕдаадддсс даЕЕсассаЕ сЕссададас ааЕЕссаада асасдеЕдЕа ЕсЕдсаааЕд аасадссЕда дадссдадда сасддсЕдсд ЕаЕЕасЕдЕд сдададасас ад (ЗЕО Ю НО: «8) νθθανθΙ.νΕ8 ΟΟβννΟΡΰΚδ ЫШЗСАА5ЕР ΤΡδδΥΟΜΗΗν КОАРСКСЬЕИ νΑνΐΗΥΙΧ33Ν

КУУАЕЗУКСК РТ18ЯБН8КН ТЬУЬОМЦЗЬК АБОТАУУУСА К (ЗЕО 1Ц НО: 69)

Антитела 1шСГО3 по изобретению включают в себя область вариабельной тяжелой цепи (ν_Η), кодируемую генной последовательностью ν_Η человеческой зародышевой линии ΌΡ50. Последовательность гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50 показана, например, в 8ЕО ГО N0: 48 на фиг. 5. Антитела НиСГОЗ по изобретению включают в себя область ν_Η, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична в отношении последовательности гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 90, 95, 96, 97% гомологична в отношении последовательности гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50 и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологична в отношении последовательности гена зародышевой линии ν_Η ΌΡ50. ^-область антитела 1шС'ГО3 имеет по меньшей мере 80% гомологии в отношении аминокислотной последовательности νυ-области, кодируемой последовательностью гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50. Предпочтительно, аминокислотная последовательность ^-области антитела 1шСГО3 имеет по меньшей мере 90, 95, 96, 97% гомологии в отношении аминокислотной последовательности ν_Ηобласти, кодируемой последовательностью гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50 и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологии в отношении последовательности, кодируемой последовательностью гена ν_Η зародышевой линии ΌΡ50.

Антитела 1шС'ГО3 по изобретению также включают в себя вариабельную область легкой цепи (УД, кодируемую последовательностью гена ν₂ человеческой зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а. Последовательность гена ν_£ человеческой зародышевой линии Ь6 показана, например, в 8ЕО ГО N0: 74 на фиг. 6, и последовательность гена ν_£ человеческой зародышевой линии Ь4/18а показана, например, в 8Е0 ГО N0: 53 на фиг. 7. Альтернативно, антитела 1шС'ГО3 включают в себя νι,-область. кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична в отношении последовательности гена ν человеческой зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а. Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 90, 95, 96, 97% гомологии в отношении последовательности гена ν₂ зародышевой линии Ь6 или Ь4/13а и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологии в отношении последовательности гена ν₂ зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а. νΗ-область антитела 1шСГО3 имеет по меньшей мере 80% гомологии в отношении аминокислотной последовательности νι-области, кодируемой последовательности гена νι, зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а. Предпочтительно, аминокислотная последовательность ^.-области антитела 1шСГО3 имеет по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97% гомологии в отношении аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью гена ν зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а и более предпочтительно по меньшей мере 98, 99% гомологии в отношении последовательности, кодируемой последовательностью гена ν₂ зародышевой линии Ь6 или Ь4/18а.

Антитела 1шСГО3 по изобретению имеют, например, частично консервативные аминокислотные последовательности, которые происходят из зародышевой линии ΌΡ50. Например, область СГОЯ1 антител 1шСГО3 по изобретению имеет, по меньшей мере, непрерывную аминокислотную последовательность УСМЫ ЛЕС) ГО N0: 58).

СГОЯ2 антител 1шСГО3 включает в себя, например, по меньшей мере, непрерывную аминокислотную последовательность ΌδνΚΟ (8Е0 ΙΌ N0: 59). Например, область СГОВ2 включает в себя непрерывную аминокислотную последовательность Ι^ΥΧ₁ΟΧ₂Χ₃Χ.₁Χ₅ΥΧ₆Ό8νΚΟ ЛЕО ΙΌ N0: 60), в которой Х_ь Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ представляют собой любую аминокислоту. Например, Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой гидрофильные аминокислоты. В некоторых антителах 1шСГО3 по изобретению Х₁ представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту, Х₂ представляет собой аргинин или серии, Х₃ представляет собой лизин или аспарагин, Х₄ представляет собой лизин или глутамин, Х₅ представляет собой аспарагиновую кислоту, аспарагин или тирозин и/или Х₆ представляет собой валин или аланин. Например, область 0ΌΒ2 ν_Η включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ΑΙ\\'Υ\(.,ΗΚ(')Ι)ΥΑΙΛνΚ(.ι (8Ер ГО N0: 69), II\\Л1)СЛКК\ЛА1Л\’КС1 ЛЕС) ГО N0: 70),

- 4 010350 νΐΑΥΏ68ΚΚΥΥνΌ8νΚ6 (8ЕЦ ΙΌ N0: 71) и νΐΑΥΏ68ΝΚΥΥΑΌ8νΚ6 (8ЕЦ ΙΌ N0: 72).

Область СОК3 антител 1ιιιί.'Ό3 содержит, например, по меньшей мере одну непрерывную аминокислотную последовательность Χ_ΑΧ_ΗΟΥΧ^Χ_υΕΌΧ_Ε. (8ЕЦ ΙΌ N0:61), в которой Χ_Α, Х_в, Х_С, Х_в и Х_Е представляют собой любую аминокислоту. В некоторых антителах 1шС.О3 по изобретению Х_А и Х_в представляют собой нейтральные аминокислоты, Х_в представляет собой ароматическую аминокислоту и/или Х_Е представляет собой гидрофильную аминокислоту. Например, Х_А представляет собой глицин или глутамин, Х_в представляет собой треонин или метионин, Х_с представляет собой аспарагин или триптофан, Х_в представляет собой триптофан или гистидин и/или Х_Е представляет собой пролин или лейцин. Например, область ί.'ΌΡ3 включает в себя непрерывную аминокислотную последовательность ΟΤΟΥΝΑΕΌΡ (8ЕЦ ГО N0: 62) или непрерывную аминокислотную последовательность ΟΜΟΥΑΗΡΏΌ (8ЕЦ ГО N0: 63).

Антитела 1шСГО3 включают в себя каркасную область 2 (ЕКА2), которая содержит аминокислотную последовательность ΑνΚΟΑΡΟΚΟΕΡΑν (8ЕЦ ΙΌ N0: 73). Антитела 1шСГО3 по изобретению включают в себя каркасную область 3 (ΕΚ.Α3), которая содержит аминокислотную последовательность КΡΤI8К^N8ΚNΤ^Υ^^ΜN8^КΑЕ^ΤΑVΥΥСΑ (8ЕО ГО N0: 74).

Некоторые антитела 1шСГО3 включают в себя непрерывную аминокислотную последовательность ντνδδ (8ЕЦ ΙΌ N0: 64) в положении, которое находится с С-конца относительно СОК3-области. Например, антитело содержит непрерывную аминокислотную последовательность ОТЬντνδδ (8ЕЦ ΙΌ N0: 65) в положении, которое находится с С-конца относительно СОК3-области. Другие антитела 1шСГО3 включают в себя непрерывную аминокислотную последовательность ΑΟΚΟΤΌντνδδ (8ЕЦ ΙΌ N0: 66), в положении, которое находится с С-конца относительно СОК3-области. Остаток аргинина в 8ЕЦ ΙΌ N0: 66 показан, например, в последовательностях ν_Η антитела 1ιιιί.’Ό3 28Е11 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2) и антитела БиСО3 23Е10 (8ЕЦ ГО N0: 6).

В другом аспекте антитело относится к способам лечения, профилактики или ослабления симптома, связанного с иммунитетом нарушения путем введения субъекту антитела 1шСГО3. Субъекту необязательно далее вводят второе средство, неограничивающими примерами которого являются противовоспалительные соединения и иммунодепрессанты. Например, субъектам с диабетом Ι типа или с латентным аутоиммунным диабетом взрослых (ΌΑΌΑ) также вводят второе средство, например ОЬР-1 или соединение покоящихся бета-клеток (т.е. соединение, которое снижает или иначе ингибирует высвобождение инсулина, например соединение, открывающее калиевые каналы).

Подходящие соединения включают в качестве неограничивающих примеров метотрексат, циклоспорин А (включая, например, микроэмульсию циклоспорина), такролимус, кортикостероиды, статины, интерферон-бета, ремикад (инфликсимаб), энбрел (этанерцепт) и гумиру (адалимумаб).

Данный субъект страдает или предрасположен к развитию связанного с иммунитетом нарушения, такого как, например, аутоиммунного заболевания или воспалительного нарушения.

В другом аспекте изобретение относится к способам введения антитела 1шСГО3 по изобретению субъекту перед, во время и/или после трансплантации органа или ткани. Например, антитело 1шСГО3 по изобретению применяют для лечения или профилактики отторжения после трансплантации органа или ткани.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи антитела 1шСГО3 28Е11. На фиг. 1А показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а фиг. 1В представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1А, где СОК. выделены прямоугольниками. На фиг. 1С показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а фиг. ΕΌ представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1С, где СОК выделены прямоугольниками.

Фиг. 2 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела 1ιιιί.'Ό3 23Е10, причем фиг. 2А представляет нуклестидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, фиг. 2В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 2А, фиг. 2С представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, и фиг. 20 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 2С.

Фиг. 3 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела 1шСГО3 27Η5. Фиг. 3А представляет нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи; фиг. 3В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 3А; фиг. 3С представляет пять нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельную область легкой цепи для клона 27Н5; фиг. 3Ό представляет пять аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидными последовательностями, показанными на фиг. 3С; и фиг. 3Е представляет собой

- 5 010350 выравнивание пяти легких цепей из клона 27Н5, где звездочка (*) в последнем ряду (отмеченная ΚΕΥ) представляет консервативную аминокислоту в данном столбце; двоеточие (:) в строке ΚΕΥ представляет консервативную мутацию; и точка (.) в строке ΚΕΥ представляет полуконсервативную мутацию.

Фиг. 4 является серией представлений нуклеотидной последовательности и аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела 1ιιιί.Ό3 15С3, причем фиг. 4А представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, фиг. 4В представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 4А, фиг. 4С представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи для клона 15 С3, и фиг. 4Ό представляет аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 4С.

Фиг. 5 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области тяжелой цепи антител 1ιιιΟΌ3 15С3, 27Н5 и 28Ε11, а также последовательность зародышевой линии ΌΡ-50, соединительную последовательность человеческой тяжелой цепи 5-02 и соединительную последовательность человеческой тяжелой цепи 2. Для каждой последовательности показаны области СОЕ.

Фиг. 6 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области Ук1П 15С3 (вариабельная легкая цепь 1, т.е. «УЪ1») и антитела 1ιιιΟΌ3 28Ε11, а также последовательность зародышевой линии Ь6, человеческую соединительную последовательность каппа 4 и человеческую соединительную последовательность каппа 1. Для каждой последовательности обозначены области СОЕ.

Фиг. 7 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области ν_ΚΙ 15 С3 (вариабельная легкая цепь 1, т.е. «УЪ2») и УЪ2 антитела 1ιιιΟΌ3 27Н5, а также последовательность зародышевой линии Ь4/18а, человеческую соединительную последовательность каппа 4 и человеческую соединительную последовательность каппа 5. Для каждой последовательности обозначены области СОК.

Фиг. 8 представляет собой выравнивание, отображающее вариабельные области ν_ΚΙΙ антитела 1ιιιί.Ό3 УЪ1 27Н5 и ΌΡΚ22, а также человеческую соединительную последовательность каппа 5. Для каждой последовательности обозначены области СОК.

Фиг. 9А представляет собой график, на котором показано связывание молекул ΟΌ3 на поверхности клеток 1игка1 с использованием различных антител против СЭ3. включая антитела 1ιιιί.Ό3 28Ε11, 27Н5УЪ1, 27Н5УЪ2, 15С3УЪ1 и 15С3УЪ2 по изобретению. Фиг. 9В представляет собой график, на котором показана способность различных антител против СЭ3, включая антитела 1ιιιί.Ό3 28Ε11, 27Н5УЪ1, 27Н5УЪ2, 15С3УЪ1 и 15С3УЪ2 по изобретению, ингибировать связывание мышиного антитела против ί.Ό3 ОКТ3 с СО3-положительными клетками. Фиг. 9С представляет собой график, на котором показано антигенное модулирование ί.Ό3 и ТСК с поверхности человеческих Т-клеток периферической крови различными антителами против СЭ3, включая антитела 1ιιιί.Ό3 28Ε11, 27Н5УЪ1, 27Н5УЪ2, 15С3УЪ1 и 15С3УЪ2 по изобретению. Фиг. 9Ό представляет собой график, на котором показан эффект различных антител против СО3, включая антитела 1ιιιί.Ό3 28Ε11, 27Н5УЪ1, 27Н5УЪ2, 15С3УЪ1 и 15С3УЪ2 по изобретению на пролиферацию Т-клеток.

Фиг. 10 представляет собой иллюстрацию, на которой показан профиль связывания полностью человеческого моноклонального антитела 28Ε11 с пептидным чипом, происходящим из аминокислотной последовательности СО3-эпсилон.

Фиг. 11 представляет собой серию графиков, на которых показан уровень высвобождения цитокинов после воздействия антитела 1ιιιί.Ό3 дикого типа 28Ε11 (28Ε1ΓΨΤ), мутантного антитела 1ιιιί.Ό3 28Ε11, имеющего мутацию Ь²³⁴ Ь²³⁵^А²³⁴ А²³⁵ (28Е11АА), и мутантное антитело 1ιιιί.Ό3 28Ε11, имеющее мутацию Ь²³⁴ Ь²³⁵^А²³⁴ Ε²³⁵ (28Е11АЕ) . На фиг. 11А показан уровень высвобождения ΤΝΕ-альфа после воздействия данных антител, а фиг. 11В обозначает уровень высвобождения интерферона-гамма.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, специфичным в отношении эпсилон-цепи СЭ3 (СЭ3з). Антитела соответственно обозначаются здесь как антитела 1ιιιί.Ό3.

ί.Ό3 представляет собой комплекс по меньшей мере из пяти мембраносвязанных полипептидов в зрелых Т-лимфоцитах, которые нековалентно ассоциированы друг с другом и с Т-клеточным рецептором. Комплекс ί.Ό3 включает в себя цепи гамма, дельта, эпсилон, зета и эта (также обозначенные как субъединицы). Не относящиеся к человеку моноклональные антитела были разработаны против некоторых из данных цепей, например мышиные антитела ОКТ3, 8Ρ34, ИСНТ1 или 64.1. (см., например, .Типе, е1 а1., 1. 1ттипо1. 136: 3945-3952 (1986); Уапд, е1 а1., 1. 1ттипо1. 137: 1097-1100 (1986); и Нау^агб, е1 а1., 1ттипо1. 64:87-92 (1988)).

Антитела 1ιιιί.Ό3 по изобретению продуцировали путем иммунизации трансгенных мышей двух линий, мышей НиМаЬ™ и мышей ΚΜ™ (Мебатех, РтшсеФп, Нью-Джерси).

Антитела 1ιιιί.Ό3 по изобретению имеют одну или несколько следующих характеристик: антитело связывается с СО3-положительными (СЭ3+) клетками, но не с СЭ3-отрицательными (СЭ3-) клетками; антитело 1ιιιί.Ό3 индуцирует антигенную модуляцию с вовлечением изменений уровня экспрессии на клеточной поверхности ί.Ό3 или Т-клеточного рецептора (ТсК) или антитело 1ιιιί.Ό3 ингибирует связы

- 6 010350 вание мышиного моноклонального антитела ОКТ3 против человеческого белка с Т-лимфоцитами. Антитела 1шСГО3 по изобретению конкурируют с мышиным антителом против СЭ3 ОКТЗ за связывание с СЭ3. и воздействие на антитело 1шСГО3 удаляет или маскирует СЭ3 и/или ТсЯ без воздействия на экспрессию на клеточной поверхности СГО2. СЭ4 или СЭ8. Маскировка СЭ3 и/или ТсЯ приводит к потере или снижению активации Т-клеток.

Антитела 1шСГО3 по изобретению связываются с СЭ3. который полностью или частично включает в себя аминокислотные остатки от положения 27 до положения 43 процессированной эпсилонсубъединицы человеческого СГО3 (т.е. без лидерной последовательности). Аминокислотная последовательность эпсилон-субъединицы человеческого СГО3 показана, например, в инвентарных номерах СепВапк N1’ 000724; ААА52295; Р07766; А32069; САА27516; и ААН49847. Например, антитело 1иСО3 связывается с эпитопом СГО3. которое полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность ΕΜΟΟΙΤΟΤΡΥΚνδΙδΟΤ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 67). Типовое моноклональное антитело 1ιιιί.’Ό3. которое связывается с данным эпитопом. представляет собой описанное здесь антитело 28Е11. Антитело 28Ε11 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (δΕΟ ГО N0:2). кодируемую последовательностью нуклеотидной кислоты. показанной ниже в δΕΟ ГО N0: 1. и вариабельную область легкой цепи (δΕΟ ГО N0: 4). кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. показанной в δΕΟ ГО N0: 3 (фиг. 1А-Ш).

Аминокислоты. составляющие определяющие комплементарность области (СОЯ). установленные С1ю11иа е! а1. 1989. Е. А. КаЬа! е! а1.. 1991. выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 1В и ГО и фиг. 5 и 6). (См. Сйо!Ыа. С. е! а1.. №Щ1гс 342: 877-883 (1989); КаЬа!. ЕА. е! а1.. 8едиепсе8 оГ Рго!еш оГ 1ттипо1ощса1 йИегей. ΕίΓιΗ Ебйюп. ϋδ Оерайтеп! оГ Неа1!1 апб Нитап 8егу1се5. ϋδ Ооуегптеп! Рг1Ш1пд 0Шсе (1991)). СОЯ тяжелой цепи антитела 28Ε11 имеют следующие последовательности: ΟΥΟΜΗ (δΕΟ ГО N0: 27). νΙ\ΥΌΟδΚΚΥΥνθδνΚΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 28) и ΟΜΟιΥΛΥΙ ΙΕΌΙ. (δΕΟ ΙΌ N0: 29). СОЯ легкой цепи антитела 28Ε11 имеют следующие последовательности: Κ,ΛδΟδνδδΥΕΛ (δΕΟ ΙΌ N0: 30) 1)/^МЕЛТ (δΕΟ ГО N0: 31) и ОО1т\\ТРЕТ (δΕΟ ГО N0: 32).

>28Г11 УН нуклеотидная последовательность: (ЗЕф Ю N0:1)

САОстссАсстостооАстсссоаосзАсзасатастссАЕСстссзоАаатссстаАСАст стсстетссАасетстесзАттсААсттсАатсастАтсасАтасй.стсзостсссссАоа СТССАСССААСС(ЗССТСОА<ЗТООСТ(ЗССАСТТАТАТС(ЗТАТ<ЗАТСЗОАА(ЗТААОАААТАС ТАТСТАОАСТСССТОДАСООССССТТСАССАТСТССАОАОАСААТТССААСААСАСССТ СТАТСТССАААТОААСАСССТОАОАаССОАСОАСАССССТСТСЗТАТТАСТСЭТОСОАОАС АААТОаССТАСТСССАСТТСОАТСТСТСОСОСССТОаСАСССТСбТСАСТОТСТССТСА >28ίΊ1 νΗ аминокислотная последовательность: (ЗЕф Ю N0:2)

0У0ЬЦЕ5Саа7У0₽СКЗЫгЬ5САА£СГКЕЗ|С¥СМН|Нта0АРбКаЪЕИУА[У1НУ1)С£ККУ| |УУР5УкЦкЕТ I ЗВРЙЗКЫТЬУЬОМЙЗЬКАЕРТАУУУСАфМСУМНРРЦяСКаТЬУТУЗЗ >28Р11 УН нуклеотидная последовательность: (ЗЕЙ И) N0:3)

САААТТОТСТТСАСАСАСТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАаОСаАААСАСССАС

ССТСТССТаСАООаССАОТСАСАСТаТТАОСАаСТАСТТАСССТСОТАССААСАОАААС

СТСОССАОССТСССАСССТССТСАТСТАТеАТССАТССААСАСССССАСТОаСАТСССА

СССАСЗСТТСАСТСССАСТС(3(ЗТСТаССАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТА<ЗА <ЭССТОАА<ЗАГТТТаСА<ЗТТТАТТАСТбТСАС1САССаТА(ЗСААСТ<ЗСССТССаСТСАСТТ ТСаасССАСССАССААС<ЗТ(ЗСАаАТСААА

Антитело 23Ε10 включает вариабельную область тяжелой цепи (δΕΟ ΙΌ N0:6). кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. показанной ниже в δΕΟ ΙΌ N0: 5. и вариабельную область легкой цепи (δΕΟ ГО N0: 8). кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты. показанной в δΕΟ ГО N0: 7.

Аминокислоты. составляющие определяющие комплементарность области (СОЯ). установленные С1ю11иа е! а1. 1989. Е. А. КаЬа! е! а1.. 1991. выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 2В. 20). СОЯ тяжелой цепи антитела 23Ε10 имеют следующие последовательности: ΟΥΟΜΗ (δΕΟ ГО N0: 27). νΙ\ΥΌΟδΚΚΥΥνθδνΚΟ (δΕΟ ГО N0: 28) и ΟΜΟιΥΛΥΙ ΙΕΌΙ. (δΕΟ ГО N0: 29). СОЯ легкой цепи антитела 23Ε10 имеют следующие последовательности: Κ,ΛδΟδνδδΥΕΛ (δΕΟ ГО N0: 30). ^АδNЯАΤ (δΕΟ ГО N0: 31) и С)С)1т\\ТР1 ,Τ (δΕΟ ГО N0: 32).

- 7 010350

23Р10 УН нуклеотидная последовательность: (8Е<2 10 N0: 5)

САСЗСТССАССТаСТССАСТССССССОАОСССТССТССАСТСТСССАССТСССТаАСАСТ СТССТСТССАССОТСТСОАТТСААСТТСАСТСОСТАТСССАТССАСТССбТСССССАСС СТССА(ЗаСАА®ЗОССТ(ЗОАСТеС<ЗТСССАЗТТАТАТ<3<ЗТАТ0АТ<3<ЗАА(ЗТАА<ЗАААТАС ТАТСТАОАСТСССТСААСесССССТТСАССАТСТССАСАбАСААТТССААСААСАСССТ СТАТСТССАААТаААСАСССТСАаАОСССАССАСАСеССТСТСТАТТАСТбТСССАеАС АААТОСССТАСТСеСАСТТССАТСТСТбССЗССССТСОСАСССТССТСАСТСТСТССТСА

23Р10 УН аминокислотная последовательность: (3Εβ Ю НО: 6)

0У0ЬУ036ССУУ08СК8ЬКЪ8САА8дРКРЗ)ЗУОМН|НУК0АРОКОЬЕНУАУ|1ЙУРС5ККУ| |УУР8УКе|КРТ18КРН8КНТЬУЬОМН8ЬКОЕРТАУ¥УСАК|ОМСУИНРРЬ|НСЙОТЦУТУ88

2ЗРЮ УН нуклеотидная последовательность: (ВЕС ΙΏ N0: 7)

САААТТСТСТТОАСАСАОТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАСООСАААСАОССАС ССТСТССТССАССОССАСТСАСАСТОТТАСЗСА13СТАСТТА(ЗССТСЗСТАСС!ААСА(ЗАААС СТССССАСССТСССАдССТССТСАТСТАТСАТССАТССААСАОССССАСТОССАТСССА ОССАИЗТТСАСТСбСАСТССОТСТОССАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАОС СТАСА СССТОААОАТТТТССАСТТТАТТАСТаТСАОСАСССТАССААСТССССТССеСТСАСТТ ТССаСССАССОАССААССТСЗОАСАТСААА

23Р10 УН нуклеотидная последовательность: (ЗЕО 10 НО: 8)

ЕТУЪТОЗРАТЬЗЬЗРСЕКАТЬЗС^АЗОЗуЗЗУЫ^ГУООКРСОАРКРЫУбАЗККАТрТР АКРЗСЗСЗСТРРТЬТ! 38РЕРЕРРАУУУфСК8№?РРЬ1|РСССТКУЕ1 К

Антитело 27Н5 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (δΕΟ ΙΌ N0:10), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной ниже в δΕΟ ΙΌ N0: 9, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, показанных ниже в δΕΟ ΙΌ N0: 1620, и кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, показанными в δΕΟ ΙΌ N0: 11-15. Как описано здесь в примере 2, гибридома одного клона, выделенная из трансгенных мышей НиМАЬ™, может продуцировать много легких цепей из единичной тяжелой цепи. Каждая продуцируемая комбинация тяжелых или легких цепей тестируется на оптимальное функционирование, как описано в примере 2.

Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (ΟΌΚ), установленные Οιοίΐιία с1 а1. 1989, Е. А. КаЬа! с1 а1., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 3В, 3Ό, 5 и 7-8). ΟΌΚ. тяжелой цепи антитела 27Н5 имеют следующие последовательности: δΥΟΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 33), П№¥ООБКККГ¥АОБУКО (δΕΟ ΙΌ N0: 34) и ΟΤΟΥΧΑΤΌΡ (δΕΟ ΙΌ N0: 35). 0ΌΒ легкой цепи антитела 27Н5 имеют следующие последовательности: КА§р§У888¥ЬА (δΕΟ ΙΌ N0: 36); СА88ВЛТ (δΕΟ ΙΌ N0: 37); ρρΥΟδδΡΙΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 38); КАБрОКЗАЕА (δΕΟ ΙΌ N0: 39); ¥А88ЬР8 (δΕΟ ΙΌ N0: 40); ΟΟΥΥδΤ'ΕΤ' (δΕΟ ΙΌ N0: 41); ОА88ЬО8 (δΕΟ ΙΌ N0: 42); и (δΕΟ ΙΌ N0: 43).

>27Н5 УН нуклеотидная последовательность: (ЗЕф Ю НО: 9)

САССТаСАССТОСТС<ЗА<ЗТСС80ССОАСССатаОТССАСССТ(3(ЗОАССТСССТаА(ЗАСТ СТССТОТССАСССТСТССАТТСАССТТСАСААССТАТСССАТССАСТСССТССаССАСС СТССАОССААСССССТСОАОТСССКЗССААТТАТАТОСТАТОАТСОААСТААААААААС ТАТОСАСАСТСССТСААОСССССАТТСАССАТСТССАСАОАСААТТССААСААСАСССТ СТАТСТССАААТОААСАСЗССТОАОАССССЗАССАСАССЭОСТСТСТАТГАСТСТССОАСАС ОААСТССОТАСААСТООТТСОАССССТСЗОаСССАОСаААСССТбОТСАССаТСТССТСА >27Н5 УН аминокислотная последовательность: (ЗЕО Ю НО:

10)

ОУОЬУЕ8СССУУОРОВ8ЬКЬ8СААЗ<ЗРТРК^У<ЗМН|ИУкОАРОКОРЕИУА|11ИУ1Х38ККН| |УАР8УКС|КРТ13ΚΟΝ3 ΚΝΤΡΥΡΟΜΝ5ΡΚΑΕΡΤΑνΥΥΟΑΙ^ΤαΥΝΗΓΡΡ|ΗΰΟΰΤΡνΤν38

- 8 010350 >2785 VI* 1 нуклеотидная последовательность: (8Е6 Ю ΝΟ: 11)

ОАААТтаТ(ЗТТ(ЗАСАСАОТСТССАСОСАСССТСТСТТТСТСТССА(ЗеаС5ААА0АаССАС ССТСТССТССАаОаССАЗТСАСАаТОТТАОСАССАССТАСТТАСССтеОТАССАССАЗА ААССТСОССА0ССТСССАСССТССТСАТСТАТ®ЗТССАТССАСЗСАаоаССАСТазСАТС ССАСАСАССТТСАСТСаСАОТааСТСТСОСАСАЗАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСАСТ ОСАСССТОААаАТГТТОСАвТОТАТТАСТОТСАССАОТАТСеТАССТСАСССАТСАССТ ТСОСССААОССАСАССАСТСОАСАТТАДА >27Н5 УТ.2 нуклеотидная последовательность: (8Е6 ΙΡ ΝΟ: 12)

САСАТССТСАТОАСССАСТСТССАТССТСССТСТСТОСАТСТСТАОСАСАСАСАСТСАС САТСАСТТеССООССААСТСАОеССАТТАССАСТССТТТАСССТаСТАТСАССАОАААС САООСАААОСТССТААОСТССТСАТСТАТТАТОСАТССАСТТТОСАААСТаССбТСССА ТСАА&ЗТТСАСССССАСТСОАТСТССОАСССАТТАСАСТСТСАССАТСАССАСССТССА (ЗССТОААОАТТТТОСААСГГАТТАСТСТСААСАСТАТТАТАОТАСССТСАСТТТССССС ОАОаСАССААССТаоАОАТСААА >27Н5 УЬЗ нуклеотидная последовательность: (ВЕС ΙΡ N0: 13)

САСАТСОТСАТСЗАСССАЗТСТССАТССТСССТОТСТССАТСТСТАССАСАСАОАСТСАС САТСАСТТОССОаССААСТСАОСбСАТТАОСАСТОСТТТАСССТОСТАТСАОСАСАААС САССЗСАААССТССТААСЗСТССТОАТСТАТСАТСССТССАСТТТСОСААСТССЭОСТСССА ТСААОаТТСАОСОбОАбТООАТСТаеСАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАСССТОСА ОССТОААОАТТТТОСААСТТАТТАСТСТСААСАОТАТТАТАОТАСССТСАСТТТСаЭСС САСОСАССААССТСОАЗАТСААА >27Н5 УЪ4 нуклеотидная последовательность: (8Е6 ΙΡ N0:

14) (ЗАСАТССАСАТСАСССАСТСТССАТТСТСССТСТСТОСАТСТЗТАССАаАСАОАСТСАС САТСАСТТССТаССССАОТСА®ЗССАТТА(ЗСАСТТАТТТАСССТСОТАТСАССАААААС САОСААААОССССТААОСТСТТСАТСТАТТАТОСАТССАСТТТССАААОТООвОТСССА ТСААССТТСАССЗОСАСТаОАТСТСЗаОАССОАТТАСАСТСТСАССАТСАеСАОССТССА СССТОААСАТТТТССААСТТАТТАСТСТСААСАСТАТТАТАОТАСССТСАСТТТСОеСС ОАССОАССААССТСОАОАТСААА >27Н5 УЪ5 нуклеотидная последовательность: <3Εβ ΙΡ N0:

15)

ОАСАТСОАОАТОАСССАСТСТССАТТСТСССТОТСТаСАТСТСТАСаАСАСАОАСТСАС САТСАСТТаСТСОСССАСТСАССЗСАТТАСЗСАСТТАТТТАСССТОСТАТСАССАААААС САССААААСССССТААССТСТТСАТСТАТТАТаСАТССАбТТТССАААСТОСССТСССА ТСААсетТСАСССССАСТССАТСТСССАССаАТТАСАСТСТСАССАТСАОСАОССТССА СССТОААСАТТТТССААСТТАТТАСТСТСААСАСТАТТАТАСТАСССТСАСТТТСООСй САОССАССААСаТССАОАТСААА >27Н5 УЪ1 аминокислотная последовательность: (ЗЕб ΙΡ

ΝΟ:

16)

Е1УЪТб8РКТЬБЬЗРОЕЮ1ТЬ8С|^8б8У538У1Л^ббКР<ЗбАРЯЬЬ1У|13А38КАф1

ΡΡΚΓ3<33α3<3ΤΡΕΤίΤΙ5ΒΡΡΡΕΡΕΑνΥΥφ0ΥΟ53ΡΙΐΐΡ50ΟΤΗΡΕΙΚ >27Н5 УЪ2 аминокислотная последовательность: (ЗЕб ΙΡ

ΝΟ:

17)

Р1ЬМТбЗРЗЗЬ5АЗУСРНУТ1ТС^АЗба133АЬА|1ТУ00КР13КАРКЬШУ[УА35РбЗ|СУР бКРЗСЗСЗаТРУТЬТТЗЗЬбРЕРРАТУУфбУУЗТЪ^РОаСТКУВТК >27Н5 УЬЗ аминокислотная последовательность: (ЗЕб 10 N0:

18)

Р1УМТО5Р35ЬЗАЗУаРВУ¹Т1ТфА50в153А1лА]НУ00КРаКАРКЬЫУрА53Ь<35|дур

8КРЗС8О8дТРРТЬТ1581<0РЕРРАТУУС|00УУ5ТЬТР|СС<ЗТКУЕ1К >27Н5 УЪ4 аминокислотная последовательность: (8Е6 Ю N0:

19)

Р1РМТйЗРР5Ь5АЗУ13РВУТ1ТС|ИА30С155УЫ^ГГа12КРАКАРКЬР1У^УА53Ъ05|еУР

ЗКГЗСЗСЗОТРУТЬТ! 35Ь0РЕРРАТУУфс>УУ5ТЬТР|0С6ТКУЕ1 К >27Н5 УЪ5 аминокислотная последовательность: (ЗЕб Ш N0:

20)

Р1ЕМТ08РРЗЬ8АЗУСРНУТ1ТфА80С188УЬА|ИУООКРАКАРКЬГ1У|УА851,05|дУР

ЗКРЗОЗОЗОТРУТЬТТЗЗЬбРЕРРАТУУфОУУЗТЬТфОСТКУЕТК

Антитело 15 С3 включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (8Еф ГО N0: 22), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной ниже в 8Еф ГО N0: 21, и вариабельную область

- 9 010350 легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, показанных ниже в 8ЕО ГО N0: 25-26 и кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, показанными в 8Е0 ГО N0: 23-24. Как описано здесь в примере 2, гибридома одного клона, выделенная из трансгенных мышей НиМАЬ™, может продуцировать много легких цепей из единичной тяжелой цепи. Каждая продуцируемая комбинация тяжелых или легких цепей тестируется на оптимальное функционирование, как описано в примере 2.

Аминокислоты, составляющие определяющие комплементарность области (СГОК), установленные С1ю11иа с1 а1. 1989, Е. А. КаЬа! с1 а1., 1991, выделены ниже прямоугольниками (см. также фиг. 4В, 4Ό и 57). СОЕ тяжелой цепи антитела 15С3 имеют следующие последовательности: 8УСМН (8Е0 ГО N0: 33), А1\\'¥\С1НКС)1)¥А1)8\КС, (8Ер ГО N0: 44) и ΟΤΟΥΝ^ΕΌΡ (8ЕО ΙΌ N0: 35). СОК тяжелой цепи антитела 15С3 имеют следующие последовательности: ΡΛ8Ο8ν88ΥΕΛ (8Е0 ΙΌ N0: 30); ^А8NКАΤ (8Е0 ΙΌ N0: 31); ^^К8N\Ρ\Τ (8ЕО ΙΌ N0: 45); КА8рб188АЬА (8ЕО ΙΌ N0: 39); ОА88ЕЕ8 (8ЕО ΙΌ N0: 46); ΟΟΕ^ΥΡΙΤ (НЕС) ΙΌ N0: 47).

>1503 УН нуклеотидная последовательность: (3Ε2 Ю ΝΟ: 21)

СА(ЮТОСАОСТ^ТВСАСТСТаз<ЗССАОвСаТСЕТССАСССС<ЗСаАООТСССТ(ЗАаАСТ СТССТСТаТАСССТСТаОАТТСАССТТСАОТАОСТАТОНСАТаСАСТООаТССНССАСС СТССАОССААООСОСТООАетасОтеССАвСТАТАТОСТАТААТОСААОААААСААОАС ТАТССАОАСТСССТСААССССССАТТСАССАТСТССАОАЕАСААТТССААСААСАСССТ ОТАТСТОСАААТОААСА<ЗССТЕАЗАСССаАОаАСАСа<ЗСТаТаТАТТАСТОТАС<ЗА<3(ЗС СААСТССНТАСААТТНСТТССАССССТОаСОССАОООААСССТООТСАСССТСТССТСА >1503 УН аминокислотная последовательность: (ЗЕО ΙΡ N0:

22)

ОУОЬУОЗСССУУОРСКЗЬКЬЗСУА8СГТРЗ|ЗУСМфУКОАРСКОЬЕНУА|А1ИУЦСККОЕ| |УАР5УК0|КРТ13КРЫ5ЮШ.УЬ0МИеЬ1Ц^РТАУУУСТ143ТдИГНРРР|ИС<2СТЬУТУ35 >15СЗ УЫ нуклеотидная последовательность: (ЗЕ<2 ГО N0: 23)

САААТТ(ЗТОТТСАСАСА<ЗТСТССА<ЗССАСССТСТСТТТОТСТССА(ЭСИЗАААОАСЗССАС ССТСТССТССАССаССАСТСАСАСТСТТАССАССТАСТТАСССТССТАССААСАСАААС СТСЗСССА(ЗОСТСССАСССТССТСАТСТАТ(ЗАТаСАТССААСАа<ЗОССАСТС5САТСССА ОССАССТТСАОТаССАОТОСОТСТЭбОАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСССТАОА СССТСААСАТТТТССАСТТТАТТАСТСТСАССАСССТАССААСТССССОТССАССТТ’СС аССААСВСАССААСЗОТСЗСАААТСААА >1503 УЪ2 нуклеотидная последовательность: (ЗЕ(2 ГО N0: 24) бССАТССАСТТОАСССАЗТСТССАТССТСССТСТСТЕСАТСтеТАТОАОАСАСАСТСАС САТСАСТТ0ССССССААСТСА0СЗСАТТАССАСТССТТТАСССТССТАТСАССАСАААС САОООАААаСТССТААССТССТаАТСТАТОАТаССТССАатТТССАААОТВСЗвОТСССА ТСААСЕТТСАОССССАаТООАТСТОССАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАСССТССА СССТСААОАТТТТССААСТТАТТАСТОТСААСАСТТТААТАОТТАСССТАТСАССТТСа СССААБССАСАСОАСТССАСАТТААА >1503

аминокислотная последовательность: (ЗЕй

25)

Е1У1ТСЗРАТЦЗЬ5РСЕНАТЬЗС^АЗСЗУ38УЬАУУ00КРС0АРЕЬЫТрАЗЫНАТ)31Р

АНГЗаЗСЗСТРГТЬТ183ЬЕРЕРГАУУУфОР.5МЙРЙТ|РСООТКта1К >1503

аминокислотная последовательность: (3Εζ>

26)

А10ЬТОЗРЗЗЬЗАЗУаРЕУТ1ТС^АЗОе133АЦД|ИГУООКРСКАРКРЫУрд5зЬЕЗ|ОУР зкезсзсзстрртьтι з зьореррату уфогцз υρ ι т^соеткьЕ тк

Антитела 1шСГО3 по изобретению также включают в себя антитела, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентична в отношении аминокислотной последовательности 8ЕС ГО N0: 2, 6, 10 или 22, и/или вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97 98, 99% или более идентична в отношении аминокислотной последовательности 8ЕС ГО N0: 4, 8, 16-20 или 25-26.

Альтернативно, моноклональное антитело представляет собой антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и 28Е11, 27Н5, 23Е10 или 15С3.

Кроме определенных иначе случаев, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно подразумеваются обычными специалистами в данной области. Далее, кроме случаев, когда контекст требует иного, термины в единственном числе включают в себя множественное число, и термины во множественном числе включают в себя единственное число. В общем, описанные здесь номенклатуры и способы, используемые в связи с клеточной и тканевой культурой, молекулярной биологией и химией белков и олиго- или полинуклеотидов и гибридизации, соответствуют хорошо известным и обычно используемым в данной области. Стандартные способы используют для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и культуры ткани и трансформации (т.е. электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и способы очистки проводят по спецификациям производителя или как это обычно выполняется в данной области и описано здесь. Сле

- 10 010350 дующие способы и процедуры, в общем, проводят обычными способами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более специфичных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данной спецификации. См., например, 8ашЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (26 еб. , Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ. (1989)). Описанные здесь номенклатуры, лабораторные процедуры и способы, используемые в связи с аналитической химией, химией органического синтеза, и медицинской и фармацевтической химией, соответствуют хорошо известным и обычно используемым в данной области. Для химического синтеза, химического анализа, получения и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов используют стандартные способы.

Используемые в соответствии с настоящим описанием следующие термины, кроме указанных иначе случаев, следует понимать как имеющие следующее значение.

Используемый здесь термин «антитело» относится к иммуноглобулиновым молекулам и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина (1д), т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий участок, специфично связывающий антиген (иммунно взаимодействующий с ним). Такие антитела включают в себя в качестве неограничивающих примеров поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Т_аЬ, Р_аЬ' и Т(_аЬ')₂ и экспрессионную библиотеку Т_аЬ. Под «специфичным связыванием» и «иммунным взаимодействием» подразумевается, что антитело взаимодействует с одной или несколькими антигенными детерминантами требуемого антигена и не взаимодействует (т.е. не связывается) с другими полипептидами или связывается с ними с намного меньшим сродством (К_б>10^-6) с другими полипептидами.

Основная структурная единица антитела, как известно, включает в себя тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну «легкую» (примерно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (примерно 50-70 кДа). Ν-концевая часть каждой цепи включает в себя вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, непосредственно ответственных за распознавание антитела. С-концевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как 1дМ, 1дЭ, 1дА и 1дЕ соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены «1»-областью размером примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает в себя «Э»-область длиной примерно 10 или более аминокислот. В общем, см. Рипбашеп1а1 1ттипо1оду СН. 7 (Раи1, V.. еа., 2пб еб. Кауеп Рге55. Ν.Υ. (1989)). Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют связывающий участок антитела.

Используемый здесь термин «моноклональное антитело» (МАЬ) или «композиция моноклонального антитела» относится к популяции молекул антитела, которые содержат молекулы только одного вида антитела, состоящие из уникального продукта гена легкой цепи и уникального продукта гена тяжелой цепи. В частности, определяющие комплементарность области (СИР.) моноклонального антитела идентичны в отношении всех молекул популяции. МАЬ содержат антигенсвязывающий участок, способный к иммунному взаимодействию с конкретным эпитопом антигена, характеризующийся уникальным сродством связывания с ним.

В общем, молекулы антитела, полученные от людей, относятся к любому из классов 1дО, 1дМ, 1дА, 1дЕ и 1дЭ, которые отличаются один от другого природой тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Конкретные классы имеют также подклассы, такие как 1дС|, 1дО₂ и другие. Более того, у людей легкая цепь может представлять собой каппа-цепь или лямбда-цепь .

Термин «антигенсвязывающий участок» или «связывающая часть» относится к части иммуноглобулиновой молекулы, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий участок образован аминокислотными остатками Ν-концевых вариабельных («V») областей тяжелых («Н») и легких («Ь») цепей. Три высокодивергентных участка в ν-областях тяжелой и легкой цепей, обозначенные как «гипервариабельные области», расположены между более консервативными фланкирующими участками, известными как «каркасные области» или «РК». Таким образом, термин «РК» относится к аминокислотным последовательностям, которые находятся в природе между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и прилегают к ним. В молекуле антитела три гипервариабельных области легкой цепи и три гипервариабельных области тяжелой цепи расположены друг относительно друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связывающего антигена, и три гипервариабельных области каждой из тяжелых и легких цепей обозначены как «определяющие комплементарность области» или «СЭК». Нумерация аминокислот каждого домена проводится в соответствии с определениями КаЬа1 8ес.|иепсе5 о! Рго1еш8 о! 1ттипо1ощса1 1п(егеь1 (№Шопа1 1и81йи1е8 о! Неа11й, ВеИекба, Мб. (1987 апб 1991)), или СЬо1Ь1а & Ьекк 1. Мо1. Вю1. 196: 901-917 (1987), Сйо1Ыа е1 а1. Уинге 342: 878-883 (1989).

Используемый здесь термин «эпитоп» включает в себя любую белковую детерминанту, способную специфично связываться с иммуноглобулином, ксРу или Т-клеточным рецептором. Термин «эпитоп» включает в себя любую белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных группировок молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, и обычно имеют спе

- 11 010350 цифичные трехмерные структурные характеристики, а также специфичные характеристики заряда. Говорят, что антитело специфично связывается с антигеном, когда константа диссоциации составляет <1 мкМ; предпочтительно <100 нМ и наиболее предпочтительно <10 нМ.

Используемые здесь термины «иммунологическое связывание» и «свойства иммунологического связывания» относятся к нековалентным взаимодействиям того типа, который происходит между иммуноглобулиновой молекулой и антигеном, в отношении которого иммуноглобулин является специфичным. Сила или сродство взаимодействий иммунологического связывания может выражаться в виде константы диссоциации (К_б) взаимодействия, причем более низкая К_б означает более сильное сродство. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов подвергают количественному анализу с использованием способов, хорошо известных в данной области. Один из таких способов включает в себя измерение скорости образования и диссоциации комплекса антигенсвязывающего участка/антигена, где указанные скорости зависят от концентраций партнеров в комплексе, сродства взаимодействия, геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, «константа скорости прямой реакции» (К_оп) и «константа скорости обратной реакции» (Кой) могут определяться расчетом концентраций и истинных скоростей ассоциации и диссоциации (см. №1игс 361:186-87 (1993)). Отношение К_ой/К_оп обеспечивает отмену всех параметров, не связанных со сродством, и равно константе диссоциации К_б. (В общем, см. Эау1е8 е! а1. (1990) Аппиа1 Веу Вюсйет 59: 439-473). Говорят, что антитело по настоящему изобретению специфично связывается с эпитопом СИЗ, когда равновесная константа связывания (К_б) составляет <1 мкМ, предпочтительно <100 нМ, более предпочтительно <10 нМ и наиболее предпочтительно от <100 пМ примерно до 1 пМ, что измеряется такими анализами, как анализы связывания радиоактивного лиганда, известные специалистам в данной области.

Специалистам в данной области понятно, что возможно определить без излишнего экспериментирования, имеет ли человеческое моноклональное антитело ту же специфичность, что и человеческое моноклональное антитело по изобретению (например, моноклональное антитело 28Р11, 27Н5, 23Р10 или 15С3) путем установления того, препятствует ли первое связыванию второго с антигенным полипептидом СЭ3. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело конкурирует с человеческим моноклональным антителом по изобретению, что показано снижением связывания человеческого моноклонального антитела по изобретению, то два моноклональных антитела связываются с одним и тем же или близкородственным эпитопом. Другой путь определения того, имеет ли человеческое моноклональное антитело специфичность человеческого моноклонального антитела по изобретению, состоит в предварительной инкубации человеческого моноклонального антитела по изобретению с антигенным полипептидом СЭ3, с которым оно обычно взаимодействует, и последующем добавлении тестируемого человеческого моноклонального антитела для определения того, ингибируется ли способность тестируемого человеческого антитела связывать антигенный полипептид СЭ3. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело ингибируется, то, по всей вероятности, оно имеет ту же, или функционально эквивалентную, эпитопную специфичность, что и моноклональное антитело по изобретению.

Различные процедуры, известные в данной области, используются для продукции моноклональных антител, направленных против белка, такого как белок СЭ3, или против его производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов (см., например, АпйЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\\' Ε, апб Ьапе Ό, 1988, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, что включено сюда в качестве ссылки). Полностью человеческие антитела представляют собой молекулы антитела, в которых вся последовательность легкой цепи или тяжелой цепи, включая СЭВ, происходит из человеческих генов. Такие антитела называются здесь «человеческие антитела» или «полностью человеческие антитела». Человеческие моноклональные антитела получают, например, с использованием процедур, описанных здесь в примере 1. Человеческие моноклональные антитела также получают с использованием способа триомы; способа человеческой В-клеточной гибридомы (см. КохЬог, е! а1., 1983 1ттипо1 Тобау 4: 72) и способа ЕВУ-гибридомы для продукции человеческих моноклональных антител (см. Со1е, е! а1., 1985 1п: ΜΟΝΟΟΕΟΝΑΕ ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 ΑΝΏ ΟΑΝΟΕΒ ΤΗΕΒΑΡΥ, А1ап В. Ь188, 1пс., рр. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут использоваться и могут продуцироваться с использованием человеческих гибридом (см. Со!е, е! а1., 1983. Ргос №111 Асаб 8с1 И8А 80: 2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейн-Барр ш уйто (см. Со1е, е! а1., 1985 1п: ΜΟΝΟΟΕΟΝΑΕ ΑΝΤΙΒΟΏΙΕ8 ΑΝΏ САХСЕВ ΤΗΕΒΑΡΥ, А1ап В. Ь188, 1пс., рр. 77-96).

Антитела очищают хорошо известными способами, такими как хроматография с использованием белка А или белка О, которые предоставляют в основном фракцию 1дС иммунной сыворотки. Впоследствии или специфичный антиген, который относится к искомому иммуноглобулину, или, альтернативно, его эпитоп, может иммобилизоваться на колонке для очистки иммуноспецифичного антитела путем иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, Ώ. ^МНк1п8оп (Тйе 8с1еп1181 опубликовано Тйе 8с1епЦ8Е 1пс., Рййабе1рй1а РА, Уо1. 14, №. 8 (Артб 17, 2000), рр. 25-28).

Когда требуется модифицировать антитело по изобретению в плане эффекторной функции, усиливается, например, эффективность антитела в лечении связанных с антителом заболеваний. Например, в

- 12 010350

Ес-область вводят остаток(ки) цистеина, обеспечивая таким образом образование дисульфидной связи в данной области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредованной комплементом гибелью клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АОСС) (см. Сагоп е! а1., 1. Ехр Меб., 176: 1191-1195 (1992) и Зйорек, 1. 1шшипо1., 148: 2918-2922 (1992)). Альтернативно, может конструироваться антитело, которое имеет двойные Ес-области и за счет этого могут характеризоваться усиленным лизисом комплемента и способностями ΛΌΟΟ (см. §1еуеп8оп е! а1., Апб-Сапсет Эгид Эещдп, 3: 219-230 (1989)).

Изобретение также относится к Ε_ν, Е_аЬ, Е_аЬ' и Е(аЬ')2 фрагментам йиСО3, к одноцепочечным антителам 1111003, биспецифическим антителам 1шСО3 и антителам-гетероконъюгатам 1шС03.

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют специфичность связывания по меньшей мере для двух различных антигенов. В настоящем случае необходимо, чтобы одна из связывающих специфичностей соответствовала СО3. Вторая связывающая мишень представляет собой другой антиген, и преимуществом является белок клеточной поверхности, или рецептор, или субъединица рецептора.

Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар иммуноглобулиновой тяжелой цепи/легкой цепи, где тяжелые цепи имеют различную специфичность (М1к!еш апб Сие11о, Иа!иге, 305:537-539 (1983)). По причине случайного ассортимента иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей, данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь десяти различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы обычно выполняется путем стадий аффинной хроматографии. Сходные процедуры описаны в XVО 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 г., и в Тгаипескег е! а1., ЕМВО 1. , 10: 3655-3659 (1991).

Вариабельные домены антитела с требуемой специфичностью связывания (участки комбинации антитело-антиген) могут подлежать слиянию с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно происходит с константными доменами тяжелой цепи иммуноглобулина, включающего в себя по меньшей мере часть шарнира, области СН2 и СН3. Предпочтительно иметь первую константную область (СН1) тяжелой цепи, содержащую участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из продуктов слияния. ДНК, кодирующие продукты слияния иммуноглобулиновой тяжелой цепи и, если требуется, иммуноглобулиновой легкой цепи, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм хозяина. Для дальнейших подробностей по получению биспецифических антител см., например, Зитекй е! а1. , Ме!йоб§ ΐπ Епхуто1оду, 121:210 (1986).

Согласно другому подходу, описанному в νθ 96/27011, поверхность взаимодействия между парой молекул антител может конструироваться с целью максимизации процента гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность взаимодействия включает в себя по меньшей мере часть области СН3 константного домена антитела. В данном способе одна или несколько малых аминокислотных боковых цепей поверхности взаимодействия первой молекулы антител замещают более объемными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсаторные «полости» идентичного или сходного размера, что и крупная(ые) боковая(ые) цепь(и), формируют на поверхности второго антитела замещением крупных аминокислотных боковых цепей на менее объемные (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера над другими ненужными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, Е(аЬ')2 антител). Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть получены с использованием химического связывания. Вгеппап е! а1., 8с1епсе 22 9: 81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела расщепляют протеолитически с образованием Е(_аЬ')₂-фрагментов. Данные фрагменты восстанавливают в присутствии образующего комплекс с дитиолом агента арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных мостиков. Полученные Е_аЬ фрагменты затем преобразуют в производные динитробензоата (ΤΝΒ). Одно из производных Е_аЬ'-ТИВ затем преобразуют обратно в Е_аЬ'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Е_аЬ'-ТИВ с образованием биспецифического антитела. Продуцированные биспецифические антитела могут использоваться в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.

Кроме того, Е_аЬ'-фрагменты могут быть непосредственно получены из Е. сой и химически связаны с образованием биспецифических антител. 8йа1аЬу е! а1. 1. Ехр. Меб. 175: 217-22 5 (1992) описывают продукцию молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела Е(_аЬ32. Каждый Е_аЬ,фрагмент отдельно секретировался из Е. сой и подвергался направленному химическому связыванию 1п νίΙΐΌ с образованием биспецифического антитела. Биспецифическое антитело, образованное таким образом, было способно связываться с клетками, гиперэкспрессировавшими рецептор ЕгЬВ2 и с нормальны

- 13 010350 ми человеческими Т-клетками, а также опосредовать лизисную активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против опухолевых клеток-мишеней молочной железы.

Также описаны различные способы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела могут продуцироваться с использованием лейциновых застежек. Ко§1е1пу е! а1., 1. 1ттипо1. 148 (5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой застежки из белков Рок и 1ип связывали с Е,_|Ь-частями двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антитела восстанавливали в области шарнира с образованием мономеров и затем обратно окисляли с образованием гетеродимеров антител. Данный способ также может использоваться для продукции гомодимеров антитела. Технология «диатела», описанная НоШпдег е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8εί. ϋδΑ 90: 6444-6448 (1993), предоставляет альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Данные фрагменты включают в себя тяжелый домен вариабельной цепи (У_Н), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (У_ь) линкером, слишком коротким для обеспечения образования пары двух доменов одной цепи. В соответствии с этим, У_Н- и У_ъ-домены одного фрагмента принуждают к образованию пары с комплементарными У_ъ- и У_Н-доменами другого фрагмента, с образованием таким образом двух антигенсвязывающих участков. Другой стратегией получения биспецифических фрагментов антител, о которой имеется сообщение, является применение одноцепочечных димеров Ρν (κΡν) (см. СгиЬег е! а1., 1. 1ттипо1. 152: 5368 (1994)).

Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела (Тиб е! а1., 1. 1ттипо1. 147: 60 (1991)).

Типовые биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых происходит из белкового антигена по изобретению. Альтернативно, направленное против антигена плечо иммуноглобулиновой молекулы может комбинироваться с плечом, которое связывает триггерную молекулу на лейкоците, такую как молекула Т-клеточного рецептора (например, ί.Ό2. СЭ3. СЭ28 или В7), или Рс-рецепторы для 1дС (РсуК.), например РсуШ (СЭ64). ЕсуРН (СЭ32) и РсуКШ (СЭ16), так что механизмы клеточной защиты фокусируются на клетке, экспрессирующей конкретный антиген. Биспецифические антитела также могут использоваться для направления цитотоксических агентов на клетки, которые экспрессируют конкретный антиген. Данные антитела имеют антигенсвязывающее плечо и плечо, которое связывает цитотоксический агент или хелатор радионуклида, например ЕОТиВЕ, ΌΡΤΑ, ΌΘΤΑ или ТЕТА. Другое интересующее биспецифическое антитело связывает описанный здесь белковый антиген и далее связывает тканевой фактор (ТЕ).

Антитела-гетероконъюгаты также относятся к объему настоящего изобретения. Антителагетероконъюгаты составлены из двух ковалентно объединенных антител. Такие антитела, например, предложены для направления клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения инфекции ВИЧ (АО 91/00360; АО 92/200373; ЕР 03089). Предусмотрено, что антитела могут быть получены ш уйго с использованием известных в синтетической химии белка способов, включая те, которые включают в себя перекрестно связанные агенты. Например, иммунотоксины могут конструироваться с использованием реакции обмена дисульфидных мостиков или с образованием тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реагентов включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и те, что описаны, например, в патенте США № 4676980.

Изобретение также относится к иммуноконъюгатам, включающим в себя антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного, или животного происхождения, или его фрагментов), или радиоактивный изотоп (т. е. радиоактивный конъюгат).

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут использоваться, включают в себя цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагмент дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Ркеиботопак аегцдтока), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфасарцин, белки А1еигйе8 Гогби, белки диантина, белки Рйу1о1аса атепсапа (ΡΑΡΙ, ΡΑΡΙΙ, и РАР-8), ингибитор Мотогбюа сйагапба, курцин, кротин, ингибитор 8араопапа оГйсшаШ, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продукции радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды. Примеры включают в себя ²¹²В1, ¹³¹Ι, ¹³¹1п, ⁹⁰Υ и ⁸⁶Ре.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с использованием различных бифункциональных агентов для связывания белков, таких как Ы-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (8ΡΌΡ), иминотиолан (ΙΤ), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-НСЬ), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис-(п-азидобензил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис-(п-диазонийбензил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6диизоцианат) и бис-соединения активного фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано Уйеба е! а1., 8с1епсе 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХΌΤΡΑ) представляет собой типовой хелатирующий агент для конъюгации радионуклида с антителом (см. АО 94/11026).

- 14 010350

Специалистам в данной области понятно, что очень разнообразные возможные радикалы могут присоединяться к полученным в результате антителам или к другим молекулам по изобретению (см., например, Сонщда1е Уасстек, СоШпЬийопк !о МютоЬю1о§у аий 1ттипо1оду, 1. М. Стике аий К. Е. ЬеМк, 1т (ейк), Сагдег Ргекк, Ые\т Уогк, (1989), полное содержание которого включено сюда в качестве ссылки).

Связывание осуществляется любой химической реакцией, которая будет связывать две молекулы, при том, что антитело и другой радикал сохраняют соответствующую им активность. Данное связывание может включать в себя многие химические механизмы, например ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координатное связывание и образование комплекса. Предпочтительное связывание, однако, является ковалентным. Ковалентное связывание достигается путем прямой конденсации существующих боковых групп или путем внедрения извне молекул-мостиков. Многие бивалентные или поливалентные связывающие агенты могут использоваться в связывании белковых молекул, таких как антитела по настоящему изобретению, с другими молекулами. Например, репрезентативные связывающие агенты могут включать в себя органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные сложные эфиры, диизоцианаты, глутаровый альдегид, диазобензол и гексаметилендиамины. Данный список не предназначен для полного перечисления различных классов связывающих агентов, известных в данной области, но, тем не менее, типичен для более обычных связывающих агентов (см. К111еп апй ЫпйКтот, 1оит. 1ттип. 133: 1335-2549 (1984); 1апкеп е! а1., 1ттипо1од1са1 Ке\зе\\'8 62: 185216 (1982); и УйеНа е! а1., 8с1епсе 238: 1098 (1987)). Предпочтительные линкеры описаны в литературе (см., например, Катакпкйпап. 8. е! а1., Сапсег Кек. 44: 201-208 (1984), которые описывают применение МВ8 (М-малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидный эфир), см. также патент США № 5030719, в котором описано применение галогенированного производного ацетилгидразида, связанного с антителом путем олигопептидного линкера). В частности, предпочтительные линкеры включают в себя: (ί) ЕИС (1этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид; (ίί) 8МРТ (4-сукцинимидилокарбонилальфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол (Р1егсе Сйет. Со., кат.№21558С); (ίίί) 8РИР (сукцинимидил6[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексанат (Р1егсе Сйет. Со., кат.№ 21651С); (ίν) сульфо-ЬС-8РПР (сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамид]гексаноат (Р1егсе Сйет. Со., кат.№ 2165-С); и (ν) сульфо-ΝΗ8 (Ν-гидроксисульфосукцинимид: Р1егсе Сйет. Со., кат. № 24510), конъюгированный с ЕИС.

Описанные выше линкеры содержат компоненты, которые имеют различные признаки, что ведет к образованию конъюгатов с отличающимися физико-химическими свойствами. Например, сульфо-ЫН8эфиры алкилкарбоксилатов более стабильны, чем сульфо-ЫН8-эфиры ароматических карбоксилатов. ЫН8-эфиры, содержащие линкеры, менее растворимы, чем сульфо-ЫН8-эфиры. Далее, линкер 8МРТ содержит стерически блокированную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышенной стабильностью. Дисульфидные связи в общем менее стабильны, чем другие связи, поскольку дисульфидная связь расщепляется ш νίΡΌ, что приводит к меньшей доступности конъюгата. СульфоΝΗ8, в частности, может усиливать стабильность карбодиимидных связей. Карбодиимидные связи (такие как ЕИС) при использовании с сульфо-ЫН8 образуют сложные эфиры, которые более устойчивы к гидролизу, чем сама по себе карбодиимидная связь.

Используемый здесь термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид геномного происхождения, происхождения из кДНК, или синтетического происхождения, или какую-либо их комбинацию, причем благодаря своему происхождению «выделенный полинуклеотид» (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым «выделенный полинуклеотид» находится в природе, или его частью, (2) функционально связан с полинуклеотидом, который не связан с ним в природе, или (3) не встречается в природе как часть более длинной последовательности.

Указанный здесь термин «выделенный белок» означает белок, происходящий из кДНК, рекомбинантной РНК, или белок синтетического происхождения, или некоторую их комбинацию, причем благодаря своему происхождению или источнику получения «выделенный белок» (1) не ассоциирован с белками, с которыми он находится в природе, (2) лишен других белков из того же источника, например лишен морских белков, (3) экспрессирован клеткой из другого вида или (4) не встречается в природе.

Термин «полипептид» используется здесь в качестве общего термина для обозначения нативного белка, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, нативные белковые фрагменты и аналоги представляют собой виды полипептидного рода. Предпочтительные полипептиды по изобретению включают в себя человеческие иммуноглобулиновые молекулы тяжелой цепи, представленные на фиг. 1В, 2В, 3В и 4В, и иммуноглобулиновые молекулы легкой цепи, представленные на фиг. 1Ό, 2Ό, 3Ό и 4Ό, а также молекулы антитела, образованные комбинацией, включающей в себя иммуноглобулиновые молекулы тяжелой цепи с иммуноглобулиновыми молекулами легкой цепи, такие как иммуноглобулиновые молекулы легкой цепи каппа, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.

Используемый здесь термин «встречающийся в природе», применяемый к объекту, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может выделяться из источника в природе и которая не была умышленно модифицированной человеком в лаборатории или

- 15 010350 иначе, является встречающейся в природе.

Используемый здесь термин «функционально связанный» относится к тому, что положения компонентов, описанных таким образом, находятся в отношениях, позволяющих им функционировать в предназначенной им манере. Контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с последовательностями контроля.

Используемый здесь термин «последовательность контроля» относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких последовательностей контроля отличается в зависимости от организма хозяина в прокариотах, причем такие последовательности контроля в общем включают в себя промотор, участок связывания рибосомы, и последовательность терминации транскрипции у эукариот, в общем, такие последовательности контроля включают в себя промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин «последовательность контроля», как подразумевается, включает в себя как минимум все компоненты, присутствие которых существенно для экспрессии и процессинга, и также может включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых предпочтительно, например лидерные последовательности и последовательности партнера слияния.

Указанный здесь термин «полинуклеотид» означает полимерный ряд нуклеотидов по меньшей мере из 10 оснований в длину, рибонуклеотидов, или дезоксирибонуклеотидов, или модифицированной формы каждого типа нуклеотидов. Термин включает в себя одно- или двухцепочечные формы ДНК.

Указанный здесь термин «олигонуклеотид» включает в себя встречающиеся в природе и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом встречающимися в природе и не встречающимися в природе олигонуклеотидными связями.

Олигонуклеотиды представляют собой подмножество полинуклеотидов, в общем включающее в себя в длину 200 оснований или менее. Предпочтительно, олигонуклеотиды составляют от 10 до 60 оснований в длину и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 оснований в длину. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными, например для зондов, хотя олигонуклеотиды могут быть и двухцепочечными, например для применения в конструкции генного мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению представляют собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды.

Указанный здесь термин «встречающиеся в природе нуклеотиды» включает в себя дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Указанный здесь термин «модифицированные нуклеотиды» включает в себя нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобным. Указанный здесь термин «олигонуклеотидные связи» включает в себя олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фосфороаниладатные, фосфороимидатные, и подобные им (см., например, ЬаР1апсЬе е! а1. Ыис1. Ас1бк Кек. 14: 9081 (1986); 8!ес е! а1. 1. Ат. СНет. 8ос. 106: 6077 (1984), 8!ет е! а1. Ыис1. Ас1бк Кек. 16: 3209 (1988), Ζοη е! а1. Αηΐί Сапсег Эгид Оек1дп 6: 539 (1991); Ζοη е! а1. О11допис1еоббек апб Апа1одиек: А Ргасбса1 АрргоасЬ, рр. 87-108 (Р. Ескк!ет, Еб., ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, ОхГогб Епд1апб (1991)); 8!ес е! а1. и. 8. Ра!еп! Ыо. 5,151,510; ИЫтапп апб Реутап СЬетюа1 Кеу1е^к 90: 543 (1990)). Олигонуклеотид, если требуется, может включать в себя метку для детекции.

Указанный здесь термин «селективно гибридизоваться» означает детектируемо и специфично связываться. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты по изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в условиях гибридизации и отмывки, которые минимизируют ощутимые количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Условия высокой жесткости могут использоваться для достижения селективных условий гибридизации, как это известно в данной области и обсуждается здесь. В общем, гомология последовательности нуклеиновой кислоты между полинуклеотидами, олигонуклеотидами и фрагментами по изобретению и интересующей последовательностью нуклеиновой кислоты, составляет по меньшей мере 80% и более, обычно с предпочтительно возрастающими значениями гомологии, равными по меньшей мере 85, 90, 95, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности гомологичны, если имеется частичная или полная идентичность между их последовательностями. Например, 85% гомология означает, что 85% аминокислот идентичны при выравнивании последовательностей на предмет максимального совпадения. Для максимального совпадения последовательностей допускаются пропуски (в одной из двух совпадающих последовательностей) предпочтительно длиной 5 или менее остатков, более предпочтительно 2 или менее остатков. Альтернативно и предпочтительно, две белковые последовательности (или происходящие от них полипептидные последовательности длиной по меньшей мере 30 аминокислот в длину) гомологичны, в применении здесь этого термина, если они имеют коэффициент выравнивания более 5 (в единицах стандартного отклонения), полученный с использованием программы АЫСЫ с матрицей данных по мутациям и штрафом за пропуск 6 или более (см. ОаубоГГ, М. О., ш Абак оГ Рго!ет 8ес.|иепсе апб 81гис!иге, рр. 101-110 (Уо1ите 5, Ыа!юпа1 Вютебюа1 КекеагсН Роипбабоп (1972)) апб 8ирр1етеп! 2 !о Инк уо1ите, рр. 110). Две последовательности или их части более предпочтительно гомологичны, если их аминокислоты идентичны на 50% или более, при оптимальном выравнивании с использованием программы АЬЮЫ.

Используемый здесь термин «соответствует» означает, что полинуклеотидная последовательность

- 16 010350 гомологична (т. е. идентична, а не строго эволюционно связана) всей последовательности полинуклеотида сравнения или ее части, или что полипептидная последовательность идентична полипептидной последовательности сравнения. В противоположность этому используемый здесь термин «комплементарен» означает, что комплементарная последовательность гомологична всей последовательности полинуклеотида сравнения или ее части. Для иллюстрации нуклеотидная последовательность «ТАТАС» соответствует последовательности сравнения «ТАТАС» и комплементарна последовательности сравнения «СТАТА».

Следующие термины используются для описания отношений последовательностей между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями: «последовательность сравнения», «окно сравнения», «идентичность последовательности», «процент идентичности последовательности» и «существенная идентичность». «Последовательность сравнения» представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основы для сравнения последовательности, причем последовательность сравнения может быть подмножеством более длинной последовательности, например сегментом полноразмерной кДНК или генной последовательности, приведенной в списке последовательностей, или может представлять собой полную последовательность кДНК или генную последовательность. В общем, последовательность сравнения составляет по меньшей мере 18 нуклеотидов или 6 аминокислот в длину, часто по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот в длину и часто по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот в длину. Поскольку две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности могут каждая (1) включать в себя последовательность (т. е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), которая сходна между двумя молекулами, и (2) могут далее включать в себя последовательность, которая различается между двумя полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями, сравнения последовательностей между двумя (или более) молекулами обычно проводят путем сравнения последовательностей двух молекул в «окне сравнения» для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательности.

Используемый здесь термин «окно сравнения» относится к концептуальному сегменту по меньшей мере 18 следующих друг за другом положений нуклеотидов или 6 аминокислот, в которых полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность может сравниваться с последовательностью сравнения по меньшей мере из 18 следующих друг за другом нуклеотидов или 6 аминокислотных последовательностей, и где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать в себя дополнения, делеции, замены и тому подобное (т.е. пропуски) в количестве 20% или менее по сравнению с последовательностью сравнения (которая не содержит дополнения или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться по алгоритму локальной гомологии 8ιηί11ι апб ^а!егтап Α6ν. Арр1: Ма!б. 2: 482 (1981), по алгоритму гомологичного выравнивания №еб1етап апб ХУипксН I. Мо1. Βίο1. 48: 443 (1970), по способу поиска сходства Реагкоп апб Ыртап Ргос. №И. Асаб. Зс1. (И.8.А.) 85: 2444 (1988), с использованием компьютеризованных реализаций данных алгоритмов (САР, ВЕЗТЕ1Т, ЕАЗТА и ТЕАЗТА в программном обеспечении \У|ксопкБ1 Сепебск Зойгаге Раскаде Ве1еаке 7.0, (Сепебск Сотри!ег Сгоир, 575 Заепсе Иг., Маб1коп, Висконсин), Сепе^огкк или МасУес!ог или путем инспекции и выбирают лучшее выравнивание (т.е. в результате которого получают самый высокий процент гомологии в окне сравнения), сгенерированное различными способами.

Термин «идентичность последовательности» означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности идентичны (т. е. на основе отношения нуклеотида к нуклеотиду или остатка к остатку) в пределах окна сравнения. Термин «процент идентичности последовательности» рассчитывается путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения, с определением числа положений, в которых в обеих последовательностях случается идентичное основание нуклеиновой кислоты (т.е. А, Т, С, С, и или I) или остаток для получения числа совпадающих положений, причем это число делят на общее число положений в окне сравнения (т. е. размер окна) и умножают результат на 100 с получением процента идентичности последовательности.

Используемый здесь термин «существенная идентичность» означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где полинуклеотид или аминокислота содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 85-процентную идентичность последовательности, предпочтительно идентичность последовательности по меньшей мере от 90 до 95%, более обычно, идентичность последовательности по меньшей мере 99%, по сравнению с последовательностью сравнения в окне сравнения, равном по меньшей мере 18 нуклеотидным (6 аминокислотным) положениям, часто в окне, равном по меньшей мере 24-48 нуклеотидным (8-16 аминокислотным) положениям, где процент идентичности последовательности рассчитывается путем сравнения последовательности сравнения с последовательностью, которая может включать в себя делеции или добавления, составляющие всего 20% или менее от последовательности сравнения в окне сравнения. Последовательность сравнения может представлять собой подмножество более длинной последовательности.

Используемые здесь двадцать обычных аминокислот и их аббревиатуры соответствуют общепринятому применению. См. 1ттипо1оду - А Зупбюбк (2пб Еб1боп, Е. З. Со1иЬ апб Ό. В. Сгеп, Ебк., Зтаиег Аккос1а!ек, Зипбег1апб, Макк. (1991)). Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати обычных

- 17 010350 аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α,α-двухзамещенные аминокислоты, N алкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры необычных аминокислот включают в себя: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, е-^^№триметиллизин, е-№ацетиллизин, Офосфосерин, №ацетилсерин, №формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, п-№метиларгинин и другие сходные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой здесь записи полипептида левостороннее направление представляет собой ^концевое направление и право стороннее направление представляет собой С-концевое направление в соответствии со стандартным применением и правилом.

Сходным образом, кроме указанных иначе случаев, левосторонний конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5'-конец, левостороннее направление двухцепочечных нуклеотидных последовательностей обозначается как 5'-направление. Добавочные последовательности, лежащие в 5' и 3'-направлении от образующихся РНК-транскриптов, обозначаются как области последовательностей направления транскрипции на цепи ДНК, имеющей ту же последовательность, что и РНК, и те из них, которые лежат в 5'-направлении от 5'-конца транскрипта РНК, обозначаются как «вышележащие последовательности», при этом области последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что РНК, и находящиеся в 3'-направлении от 3'-конца РНК-транскрипта, обозначаются как «нижележащие последовательности».

По отношению к полипептидам термин «существенная идентичность» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, посредством программ ΟΑΡ или ВЕ8ТΡΙΤ с использованием значений веса пропуска по умолчанию характеризуются по меньшей мере 80%ной идентичностью по последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью по последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью по последовательности и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ной идентичностью по последовательности.

Предпочтительно, положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, включает в себя глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, включает в себя серин и треонин; группа аминокислот, имеющих амидосодержащие боковые цепи, включает в себя аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, включает в себя фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, включает в себя лизин, аргинин и гистидин и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, включает в себя цистеин и метионин. Предпочтительные группы консервативных замен аминокислот включают в себя: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовую кислоту-аспарагиновую кислоту и аспарагинглутамин.

Как обсуждается здесь, минорные вариации в аминокислотных последовательностях антител или иммуноглобулиновых молекул, как предусматривается, относятся к настоящему изобретению, с обеспечением того, что вариации аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95% и наиболее предпочтительно 99%. В частности, предусматриваются консервативные аминокислотные замены. Консервативные замены соответствуют тем, которые имеют место в семействе аминокислот, которые относятся к их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты, в общем, подразделяются на семейства: (1) кислые аминокислоты включают в себя аспартат и глутамат; (2) основные аминокислоты включают в себя лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты включают в себя аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и (4) незаряженные полярные аминокислоты включают в себя глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильные аминокислоты включают в себя аргинин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофильные аминокислоты включают в себя аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Другие семейства аминокислот включают в себя (ί) серин и треонин, которые представляют собой семейство алифатических гидроксисодержащих аминокислот; (ίί) аспарагин и глутамин, которые представляют собой амидосодержащее семейство; (ίίί) аланин, валин, лейцин и изолейцин, которые представляют собой алифатическое семейство; и (ίν) фенилаланин, триптофан и тирозин, которые представляют собой ароматическое семейство.

Например, следует ожидать, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или сходная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет иметь большого влияния на связывание или свойства полученной в результате молекулы, особенно если замена не вовлекает аминокислоту в каркасном участке. Там, где изменение аминокислоты, приводящее к образованию функционального пептида, может легко определяться путем анализа специ

- 18 010350 фичной активности полипептидного производного. Здесь подробно описаны анализы. Фрагменты или аналоги антител или иммуноглобулиновых молекул могут быть легко получены специалистами в данной области. Предпочтительные Ν- или С-концы фрагментов или аналогов происходят вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут идентифицироваться сравнением данных нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с доступными общественности или коммерческими базами данных последовательностей. Предпочтительно, используются компьютеризованные способы сравнения для идентификации мотивов последовательности или предсказанных доменов конформации белка, которые имеют место в других белках с известной структурой и/или функцией. Известны способы идентификации белковых последовательностей, которые сворачиваются в известные трехмерные структуры. Во\\зе е! а1. 8аепсе 253: 164 (1991). Таким образом, следующие примеры демонстрируют, что специалист в данной области может выявить мотивы последовательности и структурные конформации, которые могут использоваться для определения структурных и функциональных доменов по изобретению.

Предпочтительные аминокислотные замены представляют собой те, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют сродство связывания образования белковых комплексов, (4) изменяют сродство связывания и (5) создают или модифицируют физикохимические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать в себя различные мутеины с последовательностью, отличной от встречающейся в природе пептидной последовательности. Например, единичные или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны во встречающейся в природе последовательности (предпочтительно в части полипептида вне домена(ов) межмолекулярных контактов). Консервативная аминокислотная замена существенно не меняет структурных характеристик родительской последовательности (например, заменившая аминокислота не ведет к нарушению спирали, которая имеется в родительской последовательности, или не нарушает другие типы вторичной структуры, которой характеризуется родительская последовательность). Примеры известных в данной области полипептидных вторичных и третичных структур описаны в Рго!ешк, 8!гис!игек апб Мо1еси1аг Рг1пс1р1ез (Сге1д1!оп, Еб., V. Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Υо^к (1984)); ШтобисДоп !о Рго!ет 81гис1иге (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе, ебк., 6аг1апб РиЬНзЬтд, №\ν Уогк, Ν. Υ. (1991)); и Т1югп1оп е! а1. №1иге 354:105(1991).

Используемый здесь термин «полипептидный фрагмент» относится к полипептиду, который имеет Ν-концевую и/или С-концевую делецию, но где оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям встречающейся в природе последовательности, предсказанной, например, из полноразмерной последовательности кДНК. Фрагменты обычно составляют в длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 14 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, обычно по меньшей мере 50 аминокислот и даже более предпочтительно по меньшей мере 70 аминокислот.

Используемый здесь термин «аналог» относится к полипептидам, которые составлены из сегмента длиной по меньшей мере 25 аминокислот, по существу, идентичного в отношении части предсказанной аминокислотной последовательности и имеющего по меньшей мере одно из следующих свойств: (1) специфичное связывание с СЭ3 в подходящих условиях связывания, (2) способность блокировать соответствующее связывание с СЭ3 или (3) способность ингибировать рост СО3-экспрессирующих клеток ш νΐΐΐΌ или ш νί\Ό. Обычно полипептидные аналоги содержат консервативные аминокислотные замены (или добавления или делеции) по отношению к встречающейся в природе последовательности. Аналоги обычно составляют в длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно 50 аминокислот или более, и могут часто по длине соответствовать полноразмерному встречающемуся в природе полипептиду.

Аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными таковым исходного пептида. Данные типы непептидного соединения называются «пептидные миметики» или «пептидомиметики». РаисЬеге, 1. Абν. Эгид Кек. 15: 29 (1986), VеЬе^ апб Рге1бшдег ΤΙΝ8 р. 392 (1985); и Е\'апк е! а1. 1. Меб. СЬет. 30: 1229 (1987). Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризованного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно сходны с используемыми в терапии пептидами, могут применяться для продукции эквивалетного терапевтического или профилактического эффекта. В общем, пептидомиметики структурно сходны с теоретическим полипептидом (т.е. полипептидом, который имеет биохимические свойства или фармакологическую активность), таким как человеческое антитело, но имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из -СН₂ИН-, -СН₂8-, -СН₂-СН₂-, -СН=СН-(цис или транс), -СОСН₂-, СН(ОН)СН₂- и -СН₂8О-, способами, хорошо известными в данной области. Системная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательностью Ό-аминокислотой того же типа (например, Ό-лизином вместо Ь-лизина) может использоваться для получения более стабильных пептидов. Кроме того, фиксированные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или, по существу, идентичную консенсусу вариацию последовательности, могут генерироваться способами, известными в данной области (Κί/о апб С1егаксЬ Апп. Ке\'. ВюсНет. 61: 387 (1992)); например добавлением внутреннего цистеинового остатка, способного образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид.

- 19 010350

Термин «агент» используется здесь для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов.

Используемые здесь термины «метка» или «меченный» относится к введению детектируемого маркера, например, путем введения радиоактивной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых групп, которые могут быть выявлены меченным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которая может выявляться оптическими или калориметрическими методами). В некоторых ситуациях метка или маркер также могут быть терапевтическими. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов известны в данной области и могут использоваться. Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают в себя следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵8, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ^1П1п, ¹²⁵1, ¹³¹1), флуоресцентные метки (например, Е1ТС, родамин, лантаниды фосфора), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, (β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные, биотиновые группы, предварительно выявленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательность пары лейциновых застежек, участки связывания вторичных антител, связывающие металл домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяются к спейсерным плечам различной длины для снижения потенциального стерического препятствия. Используемый здесь термин «фармацевтическое средство или лекарственное средство» относится к химическому соединению или композиции, способной к индукции требуемого терапевтического эффекта, при надлежащем введении пациенту.

Другие химические термины используются здесь по общепринятому применению в данной области, например, как в Т1е МсСга\\-НП1 Ою!юпагу о£ С1ет1са1 Тегтк (Рагкег, 8., Еб., Мсбга^-НШ, 8ап ЕгапсЕсо (1985)).

Термин «антинеопластическое средство» используется здесь для обозначения функционального свойства ингибирования или прогрессии неоплазии у человека, в частности злокачественного (ракового) очага, такого как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Ингибирование метастазирования часто представляет собой свойство антинеопластического средства.

Используемый здесь термин «по существу, чистый» означает, что указанный вид молекулы является преобладающим присутствующим видом (т.е. на молярной основе он наиболее обилен, чем любой другой вид молекулы в композиции) и предпочтительно, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой указанный вид молекулы составляет по меньшей мере примерно 50% (на молярной основе) от всех присутствующих видов макромолекул.

В общем, по существу, чистая композиция включает в себя более чем примерно 80% всех видов макромолекул, присутствующих в композиции, более предпочтительно более чем примерно 85, 90, 95 и 99%. Наиболее предпочтительно, указанный вид очищен до существенной гомогенности (контаминантные виды не могут детектироваться в композиции общепринятыми способами детекции), при этом композиция состоит, по существу, из одного вида макромолекул.

Термин «пациент» включает собой людей и субъектов ветеринарии.

Человеческие антитела и гуманизация антител

Антитело 1шС.'О3 получали, например, путем иммунизации ксеногенных мышей, способных вырабатывать полностью человеческие антитела (см. пример 1). Антитело 1дС НиСЭ3 получали, например, путем преобразования антитела 1дМ анти-СО3, выработанного трансгенными мышами (см. пример 2).

Альтернативно, такое антитело 1шС.'О3 получали, например, с использованием способов фагового дисплея, с помощью антител, содержащих только человеческие последовательности. Такие подходы хорошо известны в науке, например описаны в νθ 92/0104 7 и патенте США № 6521404, которые включены здесь в виде ссылки. При таком подходе, комбинаторную библиотеку фагов, несущих случайные пары легких и тяжелых цепей, исследовали с использованием естественных или рекомбинантных источников СЭ3 или их фрагментов.

Изобретение включает в себя способы получения антител 1шС.'О3 с помощью процесса, в котором по меньшей мере одна стадия включает в себя иммунизацию трансгенных животных белком СЭ3 человека. Некоторые из локусов эндогенных тяжелых и/или каппа легких цепей этих ксеногенных животных неспособны к перестройке, необходимой для образования генов, кодирующих иммуноглобулины в ответ на антиген. Кроме того, по меньшей мере один локус тяжелой цепи человека и по меньшей мере один локус легкой цепи человека были стабильно трансфицированы животным. Таким образом, в ответ на введение антигена человеческие локусы перестраивались для выработки генов, кодирующих различные человеческие области, иммуноспецифичные для антигена. После иммунизации, таким образом, ксеногенные мыши вырабатывали В-клетки, которые секретировали полностью человеческие иммуноглобулины.

Различные способы получения ксеногенных животных хорошо известны в науке. Например, см. патенты США № 6075181 и 6150584. Согласно одной стратегии, гены ксеногенного (человеческого) иммуноглобулина с тяжелыми и легкими цепями вводили в зародышевую линию хозяина (например, сперматозоиды или ооциты) и на отдельных стадиях соответствующие гены хозяина делали нефункционирующими путем инактивации с помощью гомологичной рекомбинации. Гены человеческого иммуноглобу

- 20 010350 лина с тяжелыми и легкими цепями реконструировали в соответствующих эукариотических или прокариотических микроорганизмах и полученные в результате фрагменты ДНК вводили подходящему хозяину, например в пронуклеарные или фертильные мышиные ооциты или эмбриональные стволовые клетки. Инактивации локусов эндогенного иммуноглобулина хозяина достигали путем направленного повреждения соответствующих локусов гомологичной рекомбинацией в клетках хозяина, в частности в эмбриональных стволовых клетках или в пронуклеарных или фертильных мышиных ооцитах. Направленное повреждение может включать в себя введение нарушения или делеции в локус-мишень или делецию локуса-мишени в сочетании с введением в локус, например, опознавательного маркера. В случае эмбриональных стволовых клеток образуются химерные животные, происходящие частично из модифицированных эмбриональных стволовых клеток и способные к передаче генетических модификаций в зародышевой линии. Скрещивание хозяев с введенными локусами человеческого иммуноглобулина с линиями с инактивированными эндогенными локусами позволяет получить животных, продуцирующих чисто ксеногенные, например человеческие, антитела.

Согласно альтернативной стратегии по меньшей мере части локусов человеческих иммуноглобулинов с тяжелыми и легкими цепями использовали для замещения непосредственно соответствующих локусов эндогенных иммуноглобулинов путем гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках. Это приводило к одновременной инактивации и замещению эндогенного иммуноглобулина. Вследствие этого образовывались химерные животные, у которых клетки, происходящие из эмбриональных стволовых клеток, могли передаваться в зародышевых линиях.

Например, клон В-клеток, экспрессирующий человеческое антитело анти-СП3, выделяли из ксеногенных животных и иммортализовывали в соответствии с различными способами, известными в науке. Эти В-клетки могут быть получены непосредственно из крови животных или из лимфоидных тканей, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, селезенку, миндалины, лимфоузлы и костный мозг. В итоге, иммортализованные В-клетки сохраняли и культивировали ш νίΙΐΌ для получения значительных, клинически применимых количеств антитела 1шСЭ3. Альтернативно, гены, кодирующие иммуноглобулины с одним или более различными человеческими областями, могут быть выявлены и экспрессированы в клетках разных типов, включающих в себя, но не ограничивающихся ею, систему культуры клеток млекопитающих, с целью получения непосредственно антител или их отдельных цепей, состоящих из одноцепочечных молекул Ρν.

Кроме того, полный набор полностью человеческих антител анти-СП3, выработанных ксеногенными животными, может быть исследован для идентификации одного такого клона с оптимальными характеристиками. Эти характеристики включают в себя, например, сродство связывания с человеческим белком СЭ3, стабильность взаимодействия, а также изотип полностью человеческого антитела анти-СЭ3. Клоны из полного набора, имеющие желаемые характеристики, использовали затем как источник нуклеотидных последовательностей, кодирующих различные желаемые участки, для дальнейших манипуляций для получения антител с этими характеристиками в альтернативных системах клеток, с использованием общепринятых рекомбинантных или трансгенных способов.

Эта общая стратегия была продемонстрирована вместе с образованием первых линий ХепоМои8е™, как опубликовано в 1994 г. См. Огееп е! а1., Сепейс8 7:13-21 (1994). Этот подход в дальнейшем обсуждался и использовался в заявках на выдачу патента США 07/466008, поданной 12 января 1990 года, 07/610515, поданной 8 ноября 1990 года, 07/919297, поданной 24 июля 1992 года, 07/922649, поданной 30 июля 1992 года, 08/031801, поданной 15 марта 1993 года, 08/112848, поданной 27 августа 1993 года, 08/234145, поданной 28 апреля 1994 года, 08/376279, поданной 20 января 1995 года, 08/430938, поданной 27 апреля 1995 года, 08/464584, поданной 5 июня 1995 года, 08/464582, поданной 5 июня 1995, 08/463191, поданной 5 июня 1995 года, 08/462837, поданной 5 июня 1995 года, 08/486853, поданной 5 июня 1995 года, 08/486857, поданной 5 июня 1995 года, 08/486859, поданной 5 июня 1995 года, 08/462513, поданной 5 июня 1995 года, 08/724752, поданной 2 октября 1996 года и 08/759620, поданной 3 декабря 1996 года, и в патентах США № 6162963, 6150584, 6114598, 6075181 и 5939598, патентах Японии № 3068180 В2, 3068506 В2 и 3068507 В2. См. также Мепбех е! а1., ΝΗίπτο СепеНс8 15:146-156 (1997) и Сгееп апб ^акоЬоν^!8, 1. Εxр. Меб. 188:483-495 (1998). См. также европейский патент № ЕР 04 63151 В1, решение о выдаче опубликовано 12 июня 1996, заявку на международный патент № ΧΥΟ 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 года, заявку на международный патент № ΧΥΟ 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 года, ΧΥΟ 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 года, ΧΥΟ 00/76310, опубликованную 21 декабря 2000 года.

В альтернативном подходе некоторые применяли «минилокусный» способ. При минилокусном способе экзогенный локус 1д мимикрировали путем включения участков (индивидуальных генов) локуса 1д. Таким образом, один или более генов УН, один или более генов Ό_Η, один или более генов 1_Н, константную область ти и вторую константную область (предпочтительно область константы гамма) формировали в конструкцию для введения животному. Этот подход описан в патенте США № 5545807, выданном 8игаш е! а1., в патентах США № 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5877397, 5874299 и 6255458, каждый выдан ЬопЬегд и Кау, в патентах США № 5591669 и 6023010, выданных КптрепГой и Вет8, в патентах США № 5612205, 5721367 и 5789215, выданных

- 21 010350

Вегпк е! а1., и в патенте США № 5643763, выданном С1ю1 и Оипп, и в заявках СепРНагт [п!егпа!юпа1 на патент США 07/574748, поданной 29 августа 1990 года, 07/575962, поданной 31 августа 1990 года, 07/810279, поданной 17 декабря 1991 года, 07/853408, поданной 18 марта 1992 года, 07/904068, поданной 23 июня 1992 года, 07/990860, поданной 16 декабря 1992 года, 08/053131, поданной 26 апреля 1993 года, 08/096762, поданной 22 июля 1993 года, 08/155301, поданной 18 ноября 1993 года, 08/161739, поданной 3 декабря 1993 года, 08/165699, поданной 10 декабря 1993 года, 08/209741, поданной 9 марта 1994 года. См. также европейский патент № 0546073 В1, заявки на международный патент № АО 92/03918, АО 92/22645, АО 92/22647, АО 92/22670, АО 93/12227, АО 94/00569, АО 94/25585, АО 96/14436, АО 97/13852 и АО 98/24884 и патент США № 5981175. См. далее Тау1ог е! а1., 1992, С1еп е! а1., 1993, ТиаП1оп е! а1., 1993, С1ю1 е! а1., 1993, ЬопЬегд е! а1., (1994), Тау1ог е! а1., (1994) и ТиаШоп е! а1., (1995), Р1кбМ1б е! а1., (1996).

Преимуществом минилокусного подхода является быстрота, с которой конструкции, включающие в себя порции локуса Ι§, могут быть созданы и введены животным. Однако соразмерным и значительным недостатком минилокусного подхода является в теории недостаточное многообразие, представленное при введении малых количеств генов У, Ό и 1. Действительно, опубликованные работы подтверждают это опасение. Развитие В-клеток и продукция антител животными, полученными с использованием минилокусного подхода, представляются недостаточными. Таким образом, исследования, сопутствующие настоящему изобретению, были в основном направлены на введение больших порций локуса Ц с целью достижения большего разнообразия и в стремлении перестроить иммунный спектр животных.

Кит также показал образование человеческих антител у мышей, которым вводили путем микроклеточного слияния большие участки хромосом или целые хромосомы. См. заявки на европейский патент № 773288 и 843961.

Успешное срабатывание человеческих анти-мышиных антител (НАМА) привело промышленность к производству химерных или иначе гуманизированных антител. Поскольку химерные антитела имеют человеческую константную область и вариабельную иммунную область, ожидается, что у человека будут наблюдаться определенные анти-химерные антительные ответы (НАСА), особенно при длительном применении антител или при применении больших доз антител. Следовательно, было бы желательным получение полностью человеческих антител против СЬ3 с целью избежать опасений и/или эффектов ответа НАМА или НАСА.

Получение антител со сниженной иммуногенностью также осуществлено через гуманизацию и представляет способы с использованием соответствующих библиотек. Обнаружено, что мышиные антитела или антитела других животных могут быть гуманизированы или приматизированы с использованием способов, хорошо известных в науке. См., например, Аш!ег апб Натк Iттипо1 Тобау 14:43 46 (1993) и Апд1И е! а1. Сп!, Яеу1е\\ъ т Iттипо1. 12125-168 (1992). Интересующие антитела могут быть созданы способами с использованием рекомбинантной ДНК для замены СН1, СН2, СН3, шарнирного домена и/или скелетного домена с соответствующей человеческой последовательностью (см. АО 92102190 и патенты США № 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). Также известно в науке использование кДНК Ι§ для конструирования генов химерного иммуноглобулина (Ьш е! а1., Ρ.Ν.Α.8. 84:3439 (1987) и I. Iттиηо1. 139:3521 (1987)). мРНК изолировали из гибридомы или другой клетки, вырабатывающей антитела, и использовали для получения кДНК. Интересующую кДНК амплифицировали полимеразной цепной реакцией с использованием специфичных праймеров (патенты США № 4683195 и 4683202). Альтернативно, создавали и изучали библиотеку для изолирования интересующей последовательности. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, затем подвергали слиянию с последовательностью человеческой константной области. Последовательности генов человеческих константных областей можно найти в КаЬа! е! а1. (1991) 8ециепсек оГ РгсИетк оГ 1ттипо1одюа1 Мегек!, Ν.ΙΉ. публикация № 91-3242. Человеческие гены участка С легкодоступны из известных клонов. Выбор изотипа будет определяться желаемыми эффекторными функциями, такими как фиксация комплемента или активность в клеточной цитотоксичности, зависящей от антител.

Предпочтительными изотипами являются Ι§Ο1, Ι§Ο3 и Ι§Ο4. Может быть использована как каппа, так и лямбда легкая цепь константных областей. Химерное, гуманизированное антитело затем экспрессируют общепринятыми способами.

Фрагменты антител, такие как Ρν, Р(аЬ')₂ и РаЬ, могут быть получены путем расщепления интактного белка, например с помощью протеазы или химическим расщеплением. Альтернативно, может быть создан процессированный ген. Например, химерный ген, кодирующий порцию фрагмента Р(аЬ')₂, может включать в себя последовательности ДНК, кодирующие домен СН1 и шарнирную область цепи Н, с последующим трансляционным стоп-кодоном, для получения процессированной молекулы.

Транскрипционные последовательности областей Н и Ь, 1 могут применяться для создания олигонуклеотидов, использующихся как направляющие для введения полезных сайтов рестрикции в область I для последующего связывания сегментов области У с сегментами области С. Содержащая область С кДНК может быть модифицирована путем направленного мутагенеза сайта для помещения сайта рестрикции в аналогичную позицию человеческой последовательности.

Векторы экспрессии включают в себя плазмиды, ретровирусы, эписомы, происходящие от ΥΑΟ,

- 22 010350

ΕΒν и тому подобное. Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально полноценную последовательность СН или СЬ человеческого иммуноглобулина с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными таким образом, что любая последовательность УН или УЬ-31 может быть легко введена и экспрессирована. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между сайтомдонором сплайсирования в введенной области ί и сайтом-акцептором сплайсирования, предшествующим человеческой области С, а также в областях сплайсирования, находящихся в пределах человеческих СН экзонов. Полиаденилирование и окончание транскрипции происходит в естественных хромосомных сайтах ниже кодирующих областей. Полученное в результате химерное антитело может быть присоединено к любому сильному промотору, включающему в себя ретровирусные ЬТК, например ранний промотор 8У-40 (Окауата е1 а1., Мо1. Се11. Вю. 3:280 (1983)), ЬТК вирус саркомы Роуза (Согтап е1 а1. , Ρ.ΝΑ.8. 79:6777 (1982)) и ЬТК вирус лейкемии мышей Молони (6го88сйеб1 е1 а1. Се11 41:885 (1985)). Также, что будет особенно ценно, могут использоваться естественные 1д-промоторы и им подобные.

Далее, человеческие антитела или антитела других животных могут быть получены с использованием способов дисплейного типа, включающих в себя, без ограничения, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомальный дисплей и другие способы, хорошо известные в науке, и полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как созревание сродства, как это хорошо известно в науке. \Упд1Ц апб Нате, выше, Напев апб Ρ1исΐйаи ΡΕΛ8 И8А 94:4937-4942 (1997) (рибосомальный дисплей), ΡηπηΕν апб 8тйй Сепе 73:305-318 (1988) (фаговый дисплей), 8сой Т1В8 17:241-245 (1992), Стг1а е1 а1. Ρ^δ И8А 87:6378-6382 (1990), Ки88е1 е1 а1. Шс1. Аабв Кевеагсй 21:10811085 (1993), НодапЬоот е1 а1. 1ттипо1. Кеу1е^8 130:43-68 (1992), С1и8\\'е11 апб МсСаГГейу ΤIΒΤΕСН; 10:80-8А (1992) и патент США № 5733743. Если дисплейные способы используются для получения антител, не являющихся человеческими, то такие антитела могут быть гуманизированы, как описано выше.

Используя эти способы, могут быть созданы антитела к клеткам, экспрессирующим СЬ3, самому СЬ3, формам СЬ3, их эпитопам или пептидам и, кроме того, к библиотекам экспрессии (см., например, патент США № 5703057), которые затем могут быть исследованы, как описано выше, на активность, как описано выше.

Разработка и создание других лекарств

В соответствии с настоящим изобретением и на основе активности антител, полученных и охарактеризованных здесь в отношении СЬ3, разработка других способов лечебного воздействия, помимо молекул антител, упрощается. Такие способы воздействия включают в себя, без ограничения, усовершенствованные антительные лекарства, такие как биспецифические антитела, иммунотоксины и радиоактивно меченые лекарства, создание пептидных лекарств, генную терапию, особенно интратела, антисмысловые лекарства и малые молекулы.

Например, в связи с биспецифическими антителами, биспецифические антитела могут быть созданы таким образом, что будут содержать: (ί) два конъюгированных антитела: одно со специфичностью к СЬ3, а другое ко второй молекуле, (ίί) одно антитело, имеющее одну цепь, специфичную к СЬ3, и вторую цепь, специфичную ко второй молекуле, или (ίίί) одноцепочечное антитело, имеющее специфичность к СЬ3 и другой молекуле. Такие биспецифические антитела могут быть созданы с использованием хорошо известных способов, например в связи с (ί) и (ίί), см., Еапдег е1 а1., 1ттипо1 МеШобв 4:72-81 (1994) и \Упд1И апб Нате, выше, а в связи с (ίίί) см., например, Тгаипескег е1 а1., ΙπΙ. ί. Сапсег (8ирр1.) 7:51-52 (1992). В каждом случае вторая специфичность может быть создана к рецепторам активации, относящимся к тяжелым цепям, включающим в себя, без ограничения, СО 16 или СЭ64 (см., например, Ьео е1 а1., 18:127 (1997)), или СЭ89 (см., например, Уа1егшв е1 а1., В1ооб 90:4485-4492 (1997)). Биспецифические антитела, полученные в соответствии с вышеизложенным, будут, вероятно, способны убивать клетки, экспрессирующие СЬ3, и особенно те клетки, в отношении которых эффективны антитела к СЭ3 по изобретению.

В связи с иммунотоксинами антитела могут быть модифицированы и применены в способах, использующих иммунотоксины, хорошо известных в науке. См., например, УйеНа 1ттипо1 Тобау 14:252 (1993). См. также патент США № 5194594. В связи с получением радиомеченых антител такие модифицированные антитела также легко могут применяться в используемых способах, хорошо известных в науке. См., например, .Типдйапв е1 а1. ш Сапсег СйетоЛегару апб ВюШегару 655-686 (2б ебН1оп, СНаГпег апб Ьопдо, ебв., Ырртсой Кауеп (1996)). См. также патенты США № 4681581, 4735210, 5101827, 5102990 (ΡΕ 35500), 5648471 и 5697902. Каждый из иммунотоксинов и радиомеченых молекул будут, вероятно, способны убивать клетки, экспрессирующие СЬ3, и особенно те клетки, в отношении которых эффективны антитела к СЬ3 по изобретению.

В связи с созданием лекарственных пептидов путем использования структурной информации, относящейся к СЬ3 и антителам к ним, такими как антитела по изобретению, или исследования пептидных библиотек могут быть созданы лекарственные пептиды, направленные против СЬ3. Разработка и исследование пептидных лекарств обсуждались также в НоидЫеп е1 а1., Вю1ес11пк|ие8 13:412-421 (1992), НоидИеп ΡΜ8 И8А 82:5131-5135 (1985), Ρ^Π е1 а1., ВюйсЬтдиев 13:901-905 (1992), В1аке апб ΠΐΐζϊΌηνίδ ВюСоп)ида1:е СНет. 3:510-513 (1992). Иммунотоксины и радиомеченые молекулы также могут быть получены и способом, сходным с пептидными молекулами, как обсуждалось выше в связи с анти

- 23 010350 телами. Если предположить, что молекула СЭ3 (или ее форма, такая как сплайсинговый вариант, или альтернативная форма) является функционально активной в процессе заболевания, также представляется возможным разработать генные и, кроме того, антисмысловые лекарства с использованием общепринятых способов. Такие способы воздействия могут применяться для изменения функции СЭ3. В связи с этим, антитела по настоящему изобретению облегчают разработку и использование соответствующих функциональных анализов, помимо прочего. Разработка и стратегия для антисмысловых лекарств обсуждается в деталях в заявке на международный патент № νθ 94/29444. Разработка и стратегии для генной терапии хорошо известны. Однако, в частности, использование способов генной терапии, включающих в себя интратела, могут доказать свои явные преимущества. См., например, Сйеп е! а1., Нитап Сепе Тйегару 5:595-601 (1994) и Магаксо, Сепе Тйегару 4:11-15 (1997). Общий подход к разработке и соображения, касающиеся генных лекарств, также обсуждаются в заявке на международный патент № XV О 97/38137.

Тщательно изученные сведения по структуре молекулы СЭ3 и ее взаимодействию с другими молекулами в соответствии с настоящим изобретением, такими как антитела по изобретению, и другими, могут быть использованы для рациональной разработки других терапевтических воздействий. В этом отношении, рациональные способы разработки лекарств, такие как рентгеновская кристаллография, компьютерное молекулярное моделирование (САММ), способ количественного или качественного соотношения структура-активность (О8ЛК) и подобные способы, могут применяться для фокусирования усилий по разработке лекарств. Рациональная разработка позволяет предсказывать белковые или синтетические структуры, которые могут взаимодействовать с молекулой или ее специфическими формами, что может быть использовано для изменения активности СЭ3. Такие структуры могут быть синтезированы химически или экспрессированы в биологических системах. Этот подход был рассмотрен в Саркеу е! а1., Сепейса11у Епдшеегей Нитап ТйегареиЕс Эгидк (8ЮскЮп Ргекк, ΝΥ (1988)). Далее, могут быть разработаны и синтезированы комбинаторные библиотеки для использования в программах скрининга, таких как высокоэффективные программы скрининга.

Лекарственные формы и введение лекарств

Было бы желательно, чтобы введение лекарственных веществ в соответствии с изобретением происходило с приемлемыми носителями, наполнителями и другими агентами, которые включаются в лекарственную форму для улучшения транспортировки, доставки, переносимости и тому подобного. Множества подходящих лекарственных форм могут быть найдены в справочнике, известном всем фармакологическим химикам: КеттдГоп'к РйагтасеиЕса1 8с1епсек (15!й ей, Маск РиЬНкЫпд Сотрапу, Еак!оп, РА (1975)), особенно в Части 87, написанной В1аид и 8еутоиг. Эти лекарственные формы включают в себя, например, порошки, пасты, мази, гели, воски, масла, жиры, везикулы, содержащие липиды (катионные или анионные) (такие как ЫроГесБп™), конъюгаты ДНК, обезвоженные абсорбирующие пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, карбоваксовые эмульсии (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любые из вышеуказанных смесей могут быть пригодны для лечения в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивая то, что активный ингредиент лекарственной формы не инактивируется лекарственной формой, и лекарственная форма является физиологически совместимой и переносимой с учетом пути введения. См. также Ва1йпск Р. Рйагтасеийса1 ехс1р1епГ йеνе1οртепΐ: Гйе пеей Гог ргес11шса1 дшйапсе. Кеди1. Тохюо1 Рйагтасо1. 32 (2):210-8, ’№апд V. куорЫПхаНоп апй йеνе1οртепΐ оГ ко11й рго!еш РйагтасеиЕса1к. 1пГ. 1. Рйагт. 203 (12):1-60 (2000), Сйагтап νΝ Ыр1йк, БрорЫНс йгидк, апй ога1 йгид йейуегу-коте етегдтд сопсерК 1 Рйагт 8с1.89 (8):967-78 (2000), Ротее11 е! а1. Сотрепйшт оГ ехар1епГк Гог рагепГега1 Гогти1а!юпк, РЭА 1 Рйагт 8с1 Тесйпо1. 52:238-311 (1998) и ссылки, приведенные здесь для дополнительной информации, относящейся к лекарственным формам, наполнителям и носителям, хорошо известным фармакологическим химикам.

Терапевтические лекарственные формы по изобретению, которые включают в себя антитела 1шСЭ3 по изобретению, использовали для лечения или облегчения симптомов, связанных с иммунными нарушениями, такими, например, как аутоиммунное заболевание или воспалительное нарушение.

Аутоиммунные заболевания включают в себя, например, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД (АШ8), который является вирусным заболеванием с аутоиммунным компонентом), очаговое облысение, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную болезнь внутреннего уха (АГЕЭ), аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЕР8), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТР), болезнь Бехчета, кардиомиопатию, глютеиновую болезнь; синдром хронической усталости (СЕГО8), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (С1РЭ), рубцующий пемфигоид, болезнь холодовой агглютинации, крест-синдром, болезнь Крона, болезнь Дегоса, ювенильный дерматомиозит, дискоидную волчанку, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, фибромиалгию-фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гиллана-Барра, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (1ТР), 1дА-нефропатию, инсулин-зависимый сахарный диабет, ювенильный хронический артрит (болезнь Стилла), ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Меньера, спаечную болезнь, множественный склероз, мигастению гравис,

- 24 010350 пернициозную анемию, узелковый полиартрит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейнауда, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию (прогрессирующий системный склероз (Р88), также известный как системный склероз (88)), синдром Шегрена, синдром Моэрша-Вольтмана, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

Воспалительные нарушения включают в себя, например, хронические и острые воспалительные нарушения. Примеры воспалительных нарушений включают в себя болезнь Альцгеймера, астму, атопическую аллергию, аллергию, атеросклероз, бронхиальную астму, экзему, гломерулонефрит, болезнь «трансплантат против хозяина», гемолитические анемии, остеоартрит, сепсис, инсульт, трансплантации тканей и органов, васкулиты, диабетическую ретинопатию и повреждения легких, вызванные вентиляцией.

В одном варианте осуществления композиции антитела 1шСЭ3 по изобретению вводили в сочетании со вторым агентом, таким как, например, 6ЬР-1 или соединениями, ингибирующими бета-клетки (то есть соединениями, которые уменьшают или иным образом ингибируют высвобождение инсулина, такими как активаторы калиевых каналов). Примеры подходящих 6ЬР-1 соединений описаны, например, в опубликованной заявке на патент США 20040037826, а подходящие соединения, ингибирующие бетаклетки, описаны в опубликованной заявке на патент США 20030235583, каждая из которых полностью включена здесь в виде ссылки.

В другом варианте осуществления композиции антитела ЬиСО3, использовавшиеся для лечения нарушений, связанных с иммунитетом, вводили в комбинации с любым из различных известных противовоспалительных и/или иммуносупрессивных соединений. Приемлемые известные соединения включают в себя, но не ограничиваются ими, метотрексат, циклоспорин А (включающий в себя, например, микроэмульсию циклоспорина), такролимус, кортикостероиды, статины, интерферон бета, ремикад (инфликсимаб), энбрел (этанерцепт) и хумира (адалимумаб).

Например, в лечении ревматоидного артрита композиции антитела 1шСЭ3 по изобретению могут вводиться совместно с кортикостероидами, метотрексатом, циклоспроином А, статинами, ремикадом (инфликсимабом), энбрелом (этанерцептом) и/или хумирой (адалимумабом).

В лечении увеита композиции антитела 1шСЭ3 могут вводиться в сочетании, например, с кортикостероидами, метотрексатом, циклоспроином А, циклофосфамидом и/или статинами. Аналогично, пациенты, страдающие такими заболеваниями, как болезнь Крона или псориаз, могут получать лечение комбинацией композиции антитела 1шСЭ3 по изобретению с ремикадом (инфликсимабом) и/или хумирой (адалимумабом).

Пациенты с множественным склерозом могут получать комбинацию композиции антитела 1шСЭ3 по изобретению в сочетании, например, с ацетатом глатирамера (копаксон), интерфероном бета-1а (авонекс), интерфероном бета-1а (ребиф), интерфероном бета-1Ь (бетасерон или бетаферон), митоксантроном (новантрон), дексаметазоном (декадрон), метилпреднизолоном (депомедрол) и/или преднизоном (дельтазон) и/или статинами.

Настоящее изобретение также включает в себя способы лечения или облегчения симптомов, связанных с иммунозависимыми нарушениями, или симптомов, связанных с отторжением после трансплантации органов. Например, композиции по изобретению используют для лечения или облегчения симптомов любых аутоиммунных заболеваний и воспалительных нарушений, описанных здесь.

Терапевтические композиции по изобретению также используют как иммуносупрессивные агенты при трансплантации органа или ткани. Используемый здесь термин иммуносупрессивный агент относится к агенту, чье действие на иммунную систему ведет к немедленному или отсроченному снижению активности по меньшей мере одного пути, вовлеченного в иммунный ответ, независимо от того, является ли этот ответ естественным или патологическим, является ли этот ответ частью врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или обеих. Эти иммуносупрессивные композиции антитела 1шСЭ3 вводят субъекту до, в процессе и/или после трансплантации органа или ткани. Например, антитело 1шСЭ3 по изобретению используют в лечении или предотвращении отторжения после трансплантации органа или ткани.

В одном варианте осуществления иммуносупрессивные композиции антитела 1шСЭ3 по изобретению вводят в сочетании со вторым агентом, таким как, например, 6ЬР-1 или соединением, ингибирующим бета-клетки, как описано выше.

В другом варианте осуществления эти иммуносупрессивные композиции антитела 1шСЭ3 вводят в сочетании с любым из различных известных противовоспалительных и/или иммуносупрессивных соединений. Приемлемые противовоспалительные и/или иммуносупрессивные соединения для использования с антителами 1шСЭ3 по изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, метотрексат, циклоспроин А (включающий в себя, например, микроэмульсию циклоспроина), такролимус, кортикостероиды и статины.

В другом варианте осуществления по изобретению, антитело 1шСЭ3 вводят человеку при определе

- 25 010350 нии присутствия аутореактивных антител у человека. Такие аутореактивные антитела известны в науке как антитела со сродством связывания к одному или более белкам, экспрессируемым эндогенно в организме человека. В одном аспекте по изобретению человека тестируют на наличие аутореактивных антител, специфично вовлеченных в одно или более аутоиммунное заболевание, как хорошо известно в науке. В одном специальном варианте осуществления человека тестируют на наличие антител против инсулина, декарбоксилазы глутаминовой кислоты и/или белка ΙΑ-2, после чего вводят антитело 1шСЭ3 при положительном результате определения одного или более таких аутореактивных антител.

В другом варианте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения рекрутинга иммунных клеток в человеческие ткани. Антитело 1шСЭ3 по изобретению вводят субъекту при необходимости предотвращения и лечения состояний, связанных с ненормальным или нерегулируемым рекрутингом иммунных клеток в тканевые области, вовлеченные в заболевание человека.

В другом варианте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения экстравазации и диапедеза иммунных клеток в человеческие ткани. Таким образом, антитела 1шСЭ3 по изобретению вводят для предотвращения и/или лечения состояний, связанных ненормальной или нерегулируемой инфильтрацией иммунных клеток в тканевые области, вовлеченные в заболевание человека.

В другом варианте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения эффектов, опосредованных высвобождением цитокинов в организме человека. Термин «цитокины» относится ко всем человеческим цитокинам, известным в науке, которые связывают экстрацелюллярные рецепторы на поверхности клеток и, таким образом, изменяют клеточную функцию и включают в себя, не ограничиваясь ими, ΙΕ-2, ГЕ^д, Т№-а, ΙΕ-4, ΙΕ-5, Ιϋ-6, ΙΕ-9, Ш-10 и Ш-13.

Высвобождение цитокинов может вести к токсическому состоянию, известному как синдром высвобождения цитокинов (СК8), частое клиническое осложнение, которое развивается, например, при использовании анти-Т-клеточных антител, таких как ΑΤΟ (анти-тимоцитарный глобулин) и ОКТЗ (мышиное антитело анти-СЭ3 человека). Этот синдром характеризуется избыточным высвобождением цитокинов, таких как ΤNЕ, ГЕ№гамма и Ш-2, в циркуляцию. СК8 развивается как результат одновременного связывания антител к СЭ3 (через различные области антитела) и рецепторов Ес и/или рецепторов комплемента (через константную область антитела) на других клетках, активируя, таким образом, Т-клетки к высвобождению цитокинов, вызывающих системный воспалительный эффект, характеризующийся гипотензией, лихорадкой и слабостью. Симптомы СК8 включают в себя жар, ознобы, тошноту, рвоту, гипотензию и диспноэ. Таким образом, антитело 1шСЭ3 по изобретению содержит одну или более мутаций для предотвращения ненормального высвобождения и продукции одного или более цитокин(ов) ίη νίνο.

В другом варианте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку для предотвращения, уменьшения или снижения эффектов, опосредованных высвобождением цитокиновых рецепторов в организме человека. Термин «цитокиновые рецепторы» относится ко всем человеческим цитокиновым рецепторам, известным в науке, которые связывают один или более цитокин(ов), описанных здесь, и включает в себя, не ограничиваясь ими, рецепторы вышеупомянутых цитокинов. Таким образом, антитело 1шСЭ3 по изобретению вводят для лечения и/или предотвращения состояний, опосредованных ненормальной активацией, связыванием или лигированием одного или более цитокинового рецептора(ов) в организме человека. В дальнейшем предполагается, что введение антитела 1шСЭ3 ίη νίνο уменьшит внутриклеточную сигнализацию, опосредованную цитокиновым рецептором(ами) в организме человека.

В одном аспекте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку при снижении функции панкреатических бета-клеток. В одном варианте осуществления пациента тестируют на функцию бета-клеток, секрецию инсулина или уровень с-белка, как это известно в науке. Затем, при обнаружении существенного снижения одного из показателей пациенту вводят в соответствии с определенным режимом дозирования антитело 1шСЭ3 для предотвращения дальнейшего прогрессирования аутоиммунного нарушения функции бета-клеток.

Диагностические и профилактические лекарственные формы

Полностью человеческие анти-СЭ3 ΜΑΒ по изобретению используют в диагностических и профилактических лекарственных формах. В одном варианте осуществления 1шСЭ3 ΜΑΒ по изобретению вводят пациентам, у которых есть риск развития одного из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний.

Предрасположенность пациента к одному или более из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний может быть определена с использованием генотипических, серологических или биохимических маркеров. Например, присутствие определенных подвидов ΗΕΑ и серологических аутоантител (против инсулина, ΟΑΌ65 и ΙΑ-2) показательны для диабета Ι типа.

В другом варианте осуществления по изобретению антитело 1шСЭ3 вводят человеку, у которого диагностированы одно или более из вышеуказанных аутоиммунных заболеваний. После диагностики антитело 1шСЭ3 вводят для устранения или обратного развития эффектов аутоиммунитета. В одном таком примере человеку с диагностированным диабетом Ι типа вводили достаточную дозу антитела 1шСЭ3

- 26 010350 для восстановления функции поджелудочной железы и минимизации повреждения, вызванного аутоиммунной инфильтрацией поджелудочной железы. В другом варианте осуществления человеку с диагностированным ревматоидным артритом вводили антитело НиСЭ3 для уменьшения инфильтрации иммунными клетками и разрушения суставов конечностей.

Антитела по изобретению также применимы для определения СЭ3 в образцах пациента и соответственно применимы в диагностике. Например, антитела 1шС.'О3 по изобретению применимы в анализах ш νίϋΌ, например ЕЫ8А, для определения уровней СЭ3 в образцах пациента.

В одном варианте осуществления антитело 1шС.'О3 по изобретению иммобилизируют на твердом носителе (например, луночном планшете). Иммобилизированные антитела служат как антитела-ловушки для любых СО3, которые могут присутствовать в тестируемом образце. Перед контактом иммобилизированных антител с образцом пациента твердую подложку промывали и обрабатывали блокирующим агентом, таким как белок норки или альбумин, для предотвращения неспецифической адсорбции аналита.

В дальнейшем лунки обрабатывали тестируемым образцом, в котором ожидалось присутствие антигена, или раствором, содержавшем стандартное количество антигена. Таким образцом может быть, например, образец сыворотки субъекта, у которого ожидается присутствие уровней циркулирующего антигена, признанных диагностическими для патологии. После удаления тестируемого образца или стандарта твердую подложку обрабатывали вторым антителом, меченным для детекции. Меченное второе антитело служит как детектируемое антитело. Измеряют уровень детектируемой метки и определяют в тестируемом образце концентрацию антигена ί'.Ό3 путем сравнения со стандартной кривой, полученной для стандартного образца.

Ожидается, что на основе результатов, полученных с использованием антител 1шС.'О3 по изобретению в диагностических анализах ш νί^Ό, будет возможно определять стадию заболевания (например, аутоиммунного или воспалительного нарушения) у субъекта, основываясь на уровнях экспрессии антигена ί'.Ό3. Для конкретного заболевания образцы крови берут у субъектов, у которых диагностированы разные стадии прогрессирования заболевания и/или на разных стадиях лечения заболевания. Используя группу образцов, позволяющую получить статистически значимые результаты для каждой стадии прогрессирования или лечения, определяют концентрационные уровни антигена, которые могут быть признаны характерными для каждой стадии заболевания.

Все публикации и патентная документация, цитируемые здесь, включены в виде ссылки, если каждая такая публикация или документация были специфичными и показательными для включения здесь в виде ссылки. Цитирование публикаций и патентной документации не предполагает допущения, что они относятся к предшествующему уровню техники, и также не допускает указания на контекст или датировку данных источников. Что касается изобретения, описанного здесь в письменной форме, то специалисту в данной области ясно, что оно может воплощаться различными вариантами осуществления, и описанные ниже примеры служат только для иллюстративных целей и не ограничивают следующую формулу изобретения.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры, включающие в себя проведенные эксперименты и полученные результаты, приведены только для иллюстративных целей и не являются лимитирующими по настоящему изобретению.

Пример 1. Получение антител 1шС.'О3.

Иммунизационные стратегии: для получения полностью человеческих антител 1шС.'О3 использовали две линии трансгенных мышей, мыши НиМаЬ® и мыши КМ™ (Мебагех, Рппсе!оп N1). Первоначальные иммунизационные стратегии следовали хорошо документированным протоколам, из литературы, для получения мышиных антител (см., например, Кипд Р, е! а1., 8с1епсе; 206(4416):347-9 (1979); Кипд РС, е! а1., Тгапкр1ап! Ргос. (3 8ирр1 1):141-6 (1980); Кипд РС, е! а1., 1п! I 1ттипор1агтасо1.3 (3):175-81). Стандартные протоколы, известные в науке, оказались непригодными для получения полностью человеческих антител анти-йиСО в мышах НиМАЬ® или КМ™. Например, следующие иммунизационные стратегии были безуспешны и не позволили получить функционирующие антитела как в мышах НиМАЬ®, так и в КМ™:

иммунизация только тимоцитами или только Т-клетками;

иммунизация только рекомбинантным человеческим ί'.Ό3 материалом; иммунизация рекомбинантным СЭ3 материалом в наполнителе Егеипб; иммунизация клетками в наполнителе Егеипб;

иммунизация тимоцитами или Т-клетками, вводимыми в сочетании с растворенным СЭ3;

иммунизация тимоцитами или Т-клетками, вводимыми в сочетании с рекомбинантными ί'.Ό3экспрессирующими клетками.

При использовании первоначальных иммунизационных стратегий на мышах ВАЬВ/с, а не в НиМАЬ® или КМ™, эти стратегии позволяли получить мышиные антитела анти-СО3, а не человеческие антитела анти-СО3.

Одновременно разрабатывали новые иммунизационные стратегии, варьируя следующие параметры:

- 27 010350 типы используемых антигенов;

частота инъекций;

типы используемых наполнителей;

типы используемых способов совместного стимулирования;

используемые пути иммунизации;

типы вторичной лимфоидной ткани, используемой для слияния.

Разрабатывали серии новых иммунизационных стратегий, включающих в себя, например: (ί) иммунизацию вирусными частицами, экспрессирующими только СЭ3, и (ίί) иммунизацию костимуляторными сигналами (например, СЭ40, СЭ27 или их комбинациями), вводившимися совместно с Т-клетками, тимоцитами или с клетками, которые были трансфицированы для экспрессии рекомбинантного СЭ3.

В первой новой иммунизационной стратегии, обозначенной здесь как «протокол гиперстимуляции», мышей НиМАЬ® (Мебагех, 1пс., Рппсе!оп, N1) или КМ™ (Мебагех, 1пс., Ктп) иммунизировали первой инъекцией человеческих клеток, например тимоцитов или Т-клеток. В промежутках времени от 1 до 8 недель после инъекции тимоцитов и/или Т-клеток мыши получали одну или более последующих «гиперстимулирующих» инъекций.

Гиперстимулирующая инъекция включает в себя, например, растворимый белок СЭ3 (например, рекомбинантный растворимый белок СЭ3), дополнительные инъекции тимоцитов или Т-клеток, клетки, трансфицированные СЭ3, вирусные частицы, экспрессирующие высокие уровни СЭ3 и их комбинации. Например, гиперстимулирующая инъекция содержит комбинацию растворимого белка СЭ3 и клетки, трансфицированные ί.Ό3.

Преимущественно, в протоколах стимулирующей гипериммунизации, иммунизированные мыши получали две финальные гиперстимулирующие инъекции на 6 и 3 сутки перед слиянием лимфатических узлов и/или селезенки. Например, у мышей КМ™ ткань слияния происходит из селезенки, у мышей НиМАЬ® ткань слияния происходит из лимфатических узлов и/или ткани селезенки.

В одном примере протокола стимулирующей гипериммунизации одну мышь НиМАЬ® иммунизировали трижды человеческими тимоцитами (~10⁶ клеток) в 0, 7 и 28 сутки. Китайскую линию клеток яичника (СНО), трансфицированных кДНК, кодирующей человеческие цепи СЭ3 δ и ε (СНО/СО3, ~10⁶ клеток), затем вводили на 47 и 65 сутки.

Другую стимуляцию вирусными частицами, экспрессирующими высокие уровни ί.Ό3δε на своей поверхности, проводили на 79 сутки. В итоге, мышам вводили растворимый рекомбинантный человеческий ί.Ό3δε на 121 и 124 сутки перед слиянием лимфатических узлов на 127 сутки.

Все иммунизации проводили подкожно с КгЫ (Сопха Согр., ЗеаШе XVА) в качестве наполнителя. Всего в слиянии было задействовано 8,5х10⁶ клеток. Только семь из 470 исследованных гибридом вырабатывали полностью человеческие антитела анти-СО3, и все полностью человеческие антитела анти-СЭ3 были молекулами 1дМ. Два из этих антител анти-СЭ3 были отобраны как кандидаты для клинического терапевтического применения (фиг. 1-3).

Во втором примере протокола стимулирующей гипериммунизации одну мышь КМ™ дважды иммунизировали растворимым рекомбинантным человеческим ί.Ό3δε на 0 и 25 сутки. Человеческие тимоциты (~10⁶ клеток) использовали затем для стимуляции на 40, 49 и 56 сутки. Растворимый рекомбинантный ί.Ό3δε инъецировали дважды на 70, 77, 84 и 91 сутки. Линию мышиных Т-клеток, трансфицированных кДНК, кодирующей δ и ε цепи человеческого СЭ3 (ЕЬ4/СО3, ~10⁶ клеток), инъецировали на 98 сутки. В конце мышам вводили растворимый рекомбинантный человеческий ί.Ό3δε на 101 сутки, перед слиянием селезенки на 104 сутки. Иммунизацию проводили интраперитонеально с А1ит в качестве наполнителя, кроме 70 дня, когда в качестве наполнителя применяли Ρίδί. СрС использовали как костимуляторный агент на 0, 25, 84 и 91 сутки. В целом слиянию подвергали 1,27х10⁸ клеток. Только пять из 743 исследованных гибридом продуцировали полностью человеческие антитела анти-СО3, и все полученные антитела были молекулами 1дС. Одно из этих антител анти-СЭ3 было отобрано как кандидат для клинического терапевтического применения (фиг. 4).

Критерии отбора: кандидатов на клиническое терапевтическое применение отбирали с использованием следующих критериев. Во-первых, анализировали связывание антител с СО3-позитивными клетками по сравнению с СЭ3-негативными клетками. Для этого 1игка! СО3-позитивные клетки (1+) и 1игка!негативные клетки (Ι-) инкубировали с различными антителами и анализировали связывание путем проточной цитометрии (фиг. 9А). Во-вторых, конкурентный анализ, в котором способность антителакандидата ингибировать связывание мышиных анти-человеческих моноклональных антител ОКТ3 с СО3-позитивными клетками, применяли с использованием клеток ί+ и конкуренцию определяли путем проточной цитометрии (фиг. 9В). Затем, антигенную модуляцию СЭ3 и ТСВ на поверхности Т-клеток периферической крови человека изучали путем проточной цитометрии (фиг. 9С). В конце, предпринимали анализ пролиферации Т-се11 с использованием Т-клеток периферической крови человека, окрашенных СЕЗЕ, и деление клеток определяли путем проточной цитометрии (фиг. 9Ό).

Пример 2. Изменение изотипа антител анти-СЭ3 человека.

Некоторые антитела БиСО3, полученные с использованием новых протоколов, описанных в приме

- 28 010350 ре 1, были антителами 1дМ. Эти антитела 1дМ «преобразовывали» в антитела 1дО, преимущественно в антитела 1дО1. Например, антитела 1дМ преобразовывали путем способа клонирования, в котором область УЭ1 гена, кодирующего антитело 1дМ, клонировали в ген тяжелой цепи 1дО1, полученный из вектора, содержащего ген, кодирующий аллотип Е гамма 1. Для преобразования легкой цепи последовательность 1дМ клонировали в вектор, содержащий область каппа. В мышах Мебагех, например НиМАЬ®, получали множественные легкие цепи, благодаря дефициту аллельных исключений.

Каждую комбинацию тяжелых и легких цепей трансфицировали в клетки с использованием РиОЕИЕ 6 (КосРе ΌίαβηοδίΒδ) трансфицирующего агента в соответствии с инструкцией производителя. Секретированные моноклональные антитела тестировали для оптимизации функционирования, например связывания с антигеном-мишенью, с использованием критериев отбора, описанных в примере 1.

Пример 3. Антигенная модуляция с использованием антител РиСЭЗ.

Антитела РиСЭЗ по изобретению способны к антигенной модуляции, которую определяют как перераспределение и элиминацию комплекса, индуцированного связыванием антитела. Экспрессия других молекул на клеточной поверхности Т-клеток, включающая в себя, например, СЭ4, не меняется при экспозиции с антителами анти-СВ3 по изобретению (фиг. 9С).

Пример 4. Уменьшение синдрома высвобождения токсичных цитокинов с помощью антител РиСЭЗ.

Преимущественно, антитела РиСЭЗ по изобретению включают в себя мутацию области Рс, такую как мутацию, изменяющую течение синдрома высвобождения цитокинов. Как описано выше, синдром высвобождения цитокинов (СВ8) является частым осложнением, развивающимся при использовании анти-Т-клеточных антител, таких как АТО (антитимоцитарный глобулин) и ОКТ3 (мышиные антитела анти-СЭЗ). Этот синдром характеризуется избыточным высвобождением цитокинов, таких как ТИЕ, ГЕЖгамма и 1Ь-2, в циркуляцию. Цитокины, выделяемые активированными Т-клетками, вызывают разновидность системного воспалительного ответа, сходного с наблюдаемым при тяжелых инфекциях и характеризующегося гипотензией, лихорадкой и слабостью. Симптомы СВ8 включают в себя, например, жар, ознобы, тошноту, рвоту, гипотензию и диспноэ.

Антитела РиСЭЗ по изобретению содержат одну или более мутаций, которые предотвращают высвобождение одного или более цитокин(ов), опосредованное константной областью, содержащей тяжелые цепи, ίη νίνο. В одном варианте осуществления антитела РиСЭЗ по изобретению являются молекулами 1дО, имеющими одну или более из следующих мутаций в модифицированном скелете 1дО γ1: γ1 N2 97А, в котором остаток аспарагина в положении 297 замещен остатком аланина; γ1 Ь234/А, Ь235/А, в котором остатки лейцина в положениях 234 и 235 замещены остатками аланина; γ1 Ь234/А; Ь235/Е, в котором остаток лейцина в положении 234 замещен остатком аланина, тогда как остаток лейцина в положении 235 замещен остатком глутаминовой кислоты; γ1 Ь235/Е, в котором остаток лейцина в положении 235 замещен остатком глутаминовой кислоты; и γ1 Ό2 65/А, в котором остаток аспартата в положении 265 замещен остатком аланина. Описанные здесь остатки, содержащие тяжелые цепи, взяты из индекса Еи (смотри КаЬа1 е1 а1., РгсИеиъ о£ 1ттипо1одюа1 1п1егеЦ', И8 Эер1. о£ НеаРР & Нитап 8егтюе5 (1983)), как показано, например, в патентах США № 5624821 и 5648260, содержание которых полностью включено здесь в виде ссылки.

Другие модификации скелета 1дО γ1, которые могут быть использованы в антителах РиСЭЗ по изобретению, включают в себя, например, А330/8, в котором остаток аланина в положении 330 замещен остатком серина, и/или Р331/8, в котором остаток пролина в положении 331 замещен остатком серина.

Полностью человеческие антитела СЭЗ по изобретению, имеющие мутацию Ь²³⁴Ь²³4а²³⁴Е²³⁵ в области Ес, имеют уникальную функцию - элиминацию высвобождения цитокинов в присутствии антител РиСЭЗ. Предшествующие исследования исключали из использования Ь^Е мутации (см., например, Хи е1 а1., Се11и1аг 1ттипо1оду, 200, рр. 16-26 (2000), на стр. 23). Однако именно эти две мутации в положени234 235 234 235 ях 234 и 235 (т.е., Ь Ь ^А Е ) элиминируют синдром высвобождения цитокинов, как показано на ίη νίΙΐΌ аналитической системе мононуклеарных клеток периферической крови человека (фиг. 11 А, 11В). В этом анализе мононуклеарные клетки периферической крови человека изолировали с использованием градиента фиколла, меченного СЕ8Е, и клетки, меченные СЕ8Е, высаживали затем на 96-луночные плашки. Различные моноклональные антитела добавляли в разных разведениях и инкубировали в течение 72 ч при 37°С. Через 6 ч 50 мкл супернатанта отбирали для изучения выделения ТХЕ с помощью ЕЫ8А. Через 48 ч 50 мкл супернатанта отбирали для изучения выделения №N-7 с помощью ЕЬ18А. Через 72 ч клетки собирали и анализировали пролиферацию с помощью ЕАС8 с использованием интенсивности СЕ8Е-мечения.

Таким образом, в противоположность дикому типу тяжелых цепей и в противоположность сериям других мутаций, описанным другими исследователями (например, То1егХ (мутации агликозилирования), ВРюЧопе (мутации Е^Е^^А^А²³⁵) (см., например, патент США № 5885573)), которые все показывали значительный уровень эффекта, связанного с выделением цитокинов, мутации Ь²³⁴Ь²³4А²³⁴Е²³⁵ антител РиСЭЗ по изобретению не проявляли феномен высвобождения цитокинов. Уровень проявления эффекта высвобождения цитокинов был 100% для дикого типа Ес, около 50-60% для мутаций ВРюЧопе

- 29 010350 (Ь Ь А А ) и неопределимым для мутаций А1а/С1и Рс, описанных здесь (фиг. 11 А, 11В).

Пример 5. Пептидный анализ идентификации эпитопа связывания антител йиСО3.

Синтез и исследование способом ΕΌΙδΑ большого количества пептидов использовали для определения аминокислотных остатков, входящих в эпитоп, для различных моноклональных антител (см., например, Сеу8еп е! а1., 1 1ттипо1 Ме!йоб8, νо1. 102(2):259-74 (1987)). В экспериментах, описанных здесь, анализы перекрывающихся пептидов, происходящих из аминокислотной последовательности эпсилонцепи ΕΌ3, были получены от 1епш (Вегйп, Сегтапу) и затем тестированы на места связывания полностью человеческими анти-СГО3 мАЬ по изобретению.

Пептиды в анализах получали с использованием способа δΡΟΤ синтеза для прямого химического синтеза на мембранной основе (см. Ргапк апб Ονе^\ν^п. Ме!й Мо1 Вю1, νо1. 66:149-169 (1996); Кгатег апб 8сйпе1бег-Мегдепег, Ме!й Мо1 Вю1, νо1. 87:25-39 (1998)). Линейные 14-мерные пептиды ковалентно связывали с целлюлозной основой \йа!тап 50 С-концами, оставляя Ν-концы свободными (т.е. несвязанными). При использовании стандартных способов вестерн-блоттинга с данными пептидами, связанными с твердой фазой, показано, что моноклональное антитело 28Р11 распознавало перекрывающийся набор аминокислот поблизости от Ν-конца (фиг. 10).

Другие варианты осуществдения

Поскольку изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, приведенное выше описание предназначено для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей формулы изобретения.

Claims (49)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против СГО3 или его фрагмент, где указанное антитело имеет следующие характеристики:

   a) связывается с СЭ3-положительными (ΕΌ3+) клетками, но не с СО3-отрицательными (ΕΌ3-) клетками;

   b) модулирует уровень экспрессии СГО3 на клеточной поверхности или его активность и

   c) снижает уровень экспрессии Т-клеточного рецептора на клеточной поверхности или его активность.
2. 2. Антитело по п.1, где указанное антитело ингибирует связывание мышиного моноклонального антитела ОКТ3 против человеческого белка с Т-лимфоцитом.
3. 3. Антитело по п.1, где указанное антитело связывается с эпитопом, который полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность ΕΜССIΤ^ΤΡУКVδIδСΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 67).
4. 4. Антитело по п.1, где указанное антитело включает в себя мутацию в тяжелой цепи в аминокислотном остатке в положении 234, 235, 265 или 297 или сочетания таких мутаций и снижает высвобождение цитокинов из Т-клетки.
5. 5. Антитело по п.4, где указанная мутация приводит к появлению в указанном положении аланина или глутаминовой кислоты.
6. 6. Антитело по п.1, где указанное антитело имеет изотип ΙβΟ1 и содержит по меньшей мере первую мутацию в положении 234 и вторую мутацию в положении 235, где указанная первая мутация приводит к появлению остатка аланина в положении 234, а указанная вторая мутация приводит к появлению остатка глутаминовой кислоты в положении 235.
7. 7. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело имеет тяжелую цепь с тремя СОВ, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СΥСΜΗ (δΕΟ ГО ΝΟ: 27); УНУУЭСЗККУ ΥνΌδνΗΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 28); С)\1СУ\\'1 ΙΡΌΕ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 29); 8УСМН (δΕΟ ГО ΝΟ: 33); IIVУ^СδККNΥΑ^δVКС (δΕΟ ГО ΝΟ: 34); ΟΤΟΥΝ\ΡΌΡ (δΕΟ ГО ΝΟ: 35) и ΑΙ^ΥΝΟΒ^ΏΥ ΑΌδνίΧΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 44), и легкую цепь с тремя СОВ, которые включают в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей ВА8О8 νδδΥΕΑ (δΕΟ ГО ΝΟ: 30); ΏΑδ^ΑΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 31); (δΕΟ ГО ΝΟ: 32); ВА8Р8νδδδΥΌΑ (δΕΟ ГО ΝΟ: 36); СΑδδΒΑΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 37); ρρΥΟδδΡΙΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 38); ВАЯрС^АЬА (δΕΟ ГО ΝΟ: 39); ΥΑδδΌρδ (δΕΟ ГО ΝΟ: 40); ΟΟΥΥδΤΕΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 41); ΏΑδδΌΟδ (δΕΟ ГО ΝΟ: 42); \\'ΑδΟΟΙδδΥΕΑ (δΕΟ ГО ΝΟ: 43); ^^ΒδN\Ρ\Τ (δΕΟ ГО ΝΟ: 45); ΟΑδδΕΕδ (δΕΟ ГО ΝΟ: 46) и ΟΟΡΝδΥΡΙΤ (δΕΟ ГО ΝΟ: 47), где указанное антитело связывается с СГО3.
8. 8. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело имеет тяжелую цепь с тремя СОВ, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей СΥСΜΗ (δΕΟ ГО ΝΟ: 27); νΙ\νΥΌΟδΙ<Ι<Ύ ΥΜΙδνΕΟ (δΕΟ ГО ΝΟ: 28); ^ΜСΥVΗΡ^^ (δΕΟ ГО ΝΟ: 29); δΥСΜΗ (δΕΟ ГО ΝΟ: 33); IIVУ^СδККNΥΑ^δVКС (δΕΟ ГО ΝΟ: 34); ΟΤΟΥΝ\ΡΌΡ (δΕΟ ГО ΝΟ: 35); и ΑIVУNСΒК^^Υ ΑΌδνίΧΟ (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 44), где указанное антитело связывается с СГО3.
9. 9. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело включа

   - 30 010350 ет в себя вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ N0: 2, 6, 10 и 22, где указанное антитело связывается с 0Ό3.
10. 10. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело имеет легкую цепь с тремя СОЯ, содержащими аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей ΚΑέΟδνδδΥΣΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 30); ΏΑδΗΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 31); ΡΟΚ^^Ρ^ (δΕΟ ΙΌ N0: 32); ΚΑδΟδνδδδΥΌΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 36); ΟΑδδΚΑΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 37); ΟΟΥΕιδδΡΙΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 38); ΚΑδΟΟΙδδΑΌΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 39); ΥΑδδΌΟδ (δΕΟ ΙΌ N0: 40); ΟΟΥΥδΤΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 41); ΌΑδδΌΟδ (δΕΟ ΙΌ N0: 42); ΛΑδΟΕιΙδδΥΡΑ (δΕΟ ΙΌ N0: 43); ΟΟΡδΧ\\'Ρ\\'Τ (δΕΟ ΙΌ N0: 45); ΌΑδδΌΕδ (δΕΟ ΙΌ N0: 46) и ΟΟΕΧδΥΡΙΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 47), где указанное антитело связывается с СО3.
11. 11. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело, где указанное антитело включает в себя вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ N0: 4, 8, 16-20, 25 и 26, где указанное антитело связывается с СО3.
12. 12. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против СО3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя вариабельную область тяжелой цепи (ν_Η), включающую в себя 0ΌΚ1 и СОЯ2, где указанная область кодируется генной последовательностью ΌΡ50 ν_Η человеческой зародышевой линии или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной в отношении генной последовательности ΌΡ50 ν_Η человеческой зародышевой линии.
13. 13. Антитело по п.12, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичная в отношении последовательности ΌΡ50 ν_Η зародышевой линии, гомологична в отношении генной последовательности ΌΡ50 ν_Η зародышевой линии по меньшей мере на 90%.
14. 14. Антитело по п.12, где указанное антитело далее включает в себя вариабельную область легкой цепи (УО, кодируемую генной последовательностью Ь6 ν₂ человеческой зародышевой линии или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной в отношении генной последовательности Ь6 ν_Β зародышевой линии.
15. 15. Антитело по п.14, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичная в отношении последовательности Ь6 зародышевой линии, гомологична в отношении генной последовательности Ь6 νι. зародышевой линии по меньшей мере на 90%.
16. 16. Антитело по п.12, где указанное антитело далее включает в себя вариабельную область легкой цепи (Уь), кодируемую генной последовательностью Ь4/18а ν_Β человеческой зародышевой линии, или последовательностью нуклеиновой кислоты, гомологичной в отношении генной последовательности Ь4/18а νι. зародышевой линии.
17. 17. Антитело по п.16, в котором указанная последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичная в отношении последовательности Ь4/18а ν_Β зародышевой линии, гомологична в отношении генной последовательности Ь4/18а νι. зародышевой линии по меньшей мере на 90%.
18. 18. Выделенное, полностью человеческое антитело против СО3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя СОЯ 1-область ν_Η, содержащую аминокислотную последовательность УОМН (δΕΟ ΙΟ N0: 58).
19. 19. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против СО3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя СОЯ2-область ν_Η, содержащую аминокислотную последовательность ΏδνΚΟ (δΕΟ ГО N0: 59).
20. 20. Антитело по п.19, в котором указанная СОЯ2-область ν_Η включает в себя аминокислотную последовательность Ι\\Ύ.\·Ει.\;.\₃.\₄.\,Υ.\.ΌδνΚ(., (δΕΟ ГО N0: 60).
21. 21. Антитело по п.20, в котором Х_ь Х₂, Х₃, Х₄, Х₅ и Х₆ представляет собой любую аминокислоту.
22. 22. Антитело по п.20, в котором Х_ь Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой гидрофильные аминокислоты.
23. 23. Антитело по п.20, в котором Х₁ представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту.
24. 24. Антитело по п.20, в котором Х₂ представляет собой аргинин или серии.
25. 25. Антитело по п.20, в котором Х₃ представляет собой лизин или аспарагин.
26. 26. Антитело по п.20, в котором Х₄ представляет собой лизин или глутамин.
27. 27. Антитело по п.20, в котором Х₅ представляет собой аспартат, аспарагин или тирозин.
28. 28. Антитело по п.20, в котором Х₆ представляет валин или аланин.
29. 29. Антитело по п.20, в котором указанная СОЯ2-область ν_Η включает в себя аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ΑΙ\ΥΧΟΡΚ0ΌΥΑΌδνΚΟ (δΕΟ ГО N0: 69), ΙΙΛΥΟΟδΚΚΧΥΑΟδνΚΟ (δΕΟ ГО N0: 70), νΙ\ΥΌ6δΚΚΥΥνθδνΚ6 (δΕΟ ГО N0: 71) и \Ί\\'ΥΙ)(.ιδΧΚΥΥΑΙ)δνΚΕι (δΕΟ ГО N0: 72).
30. 30. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против СО3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя СОЯ3-область ν_Η, содержащий аминокислотную последовательность \-,\_ВС1А\ Х ΕΙ)\.. (δΕΟ ГО N0: 61) .
31. 31. Антитело по п.30, в котором Х_Л, Х_В, Х_С, Х_в и Х|. представляют собой любую аминокислоту.
32. 32. Антитело по п.30, в котором Х_Л и Х_В представляют собой нейтральные аминокислоты.
33. 33. Антитело по п.30, в котором Х_в представляет собой ароматическую аминокислоту.
34. 34. Антитело по п.30, в котором Х_Е представляет собой гидрофобную аминокислоту.

    - 31 010350
35. 35. Антитело по п.30, в котором Х_А представляет собой глицин или глутамин.
36. 36. Антитело по п.30, в котором Х_В представляет собой треонин или метионин.
37. 37. Антитело по п.30, в котором Х_С представляет собой аспарагин или триптофан.
38. 38. Антитело по п.30, в котором Х_с представляет собой триптофан или гистидин.
39. 39. Антитело по п.30, в котором Х_Е представляет собой пролин или лейцин.
40. 40. Антитело по п.30, в котором указанная СОК₃-область включает в себя аминокислотную последовательность СТСУШУЕОР (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 62) или аминокислотную последовательность Ο\10ιΥ\\ΊΙ1Ί)1. (8ЕОΙΌ ΝΟ: 63).
41. 41. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против ί.'Ό3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя каркасную область 2 (Р\К2), содержащую аминокислотную последовательность \\'\ИС)АРС,КС,ЕЕ\\'\ (8Ер ΙΌ ΝΟ: 73).
42. 42. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против ί.'Ό3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя каркасную область 3 (Р\К3), содержащую аминокислотную последовательность 1КЛ181Ю\8К\ТРУЧХА1№РИАЕ1)ТА\УУСА (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 74).
43. 43. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против ί.'Ό3 или его фрагмент, где указанное антитело включает в себя вариабельную область, расположенную в С-концевом направлении от СЭК3 -области, где указанная вариабельная область содержит аминокислотную последовательность νΓνδδ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 64) в положении, которое находится в С-концевом направлении от СЭК3области.
44. 44. Антитело по п.43, где указанное антитело включает в себя вариабельную область, расположенную в С-концевом направлении от СОК3-области, где указанная вариабельная область содержит аминокислотную последовательность СТБ\Т\88 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 65) в положении, которое находится в Сконцевом направлении от СПК3-области.
45. 45. Антитело по п.43, где указанное антитело включает в себя вариабельную область, расположенную в С-концевом направлении от СОК3-области, где указанная вариабельная область содержит аминокислотную последовательность \СКСТБ\Т\88 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 66) в положении, которое находится в Сконцевом направлении от СПК3-области.
46. 46. Выделенное, полностью человеческое моноклональное антитело против ί.'Ό3 или его фрагмент, где указанное антитело связывает эпитоп, который полностью или частично включает в себя аминокислотную последовательность ЕМСС[ТОТРУК\8!8СТ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 67).
47. 47. Выделенное антитело по любому из предшествующих пунктов, где указанное антитело включает в себя мутацию в тяжелой цепи в аминокислотном остатке в положении 234, 235, 265 или 297 или комбинацию таких мутаций и где высвобождение цитокинов из Т-клетки в присутствии указанного антитело снижено по сравнению с высвобождением цитокинов из Т-клетки в присутствии антитела, которое не включает в себя мутацию в тяжелой цепи в положении 234, 235, 265 или 297, или комбинацию таких мутаций.
48. 48. Антитело по п.47, в котором указанная мутация приводит в появлению остатка аланина или глутаминовой кислоты в указанном положении.
49. 49. Антитело по п.47, где указанное антитело содержит по меньшей мере первую мутацию в положении 234 и вторую мутацию в положении 235, где указанная первая мутация приводит к появлению остатка аланина в положении 234, а указанная вторая мутация приводит к появлению остатка глутаминовой кислоты в положении 235.