EA019661B1

EA019661B1 - Моноклональные антитела против angptl3

Info

Publication number: EA019661B1
Application number: EA200970556A
Authority: EA
Inventors: Э-чиан Ли; Грегори Ландес; Сеокдзоо Хонг; Урви Десай; Дэвид Пауэлл; Сяо Фэн
Original assignee: Лексикон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-06
Publication date: 2014-05-30
Also published as: EP2121751B1; US7935796B2; KR20090088925A; JP2010512320A; US8742075B2; CA2672049C; CN101855241A; IL199216A; TW200846364A; EA200970556A1; DK2121751T3; AU2007332855B2; ES2618830T3; PL2121751T3; BRPI0720218A2; CN101855241B; MX2009006082A; KR101503937B1; NO20092215L; EP2121751A2

Abstract

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с ANGPTL3. Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам, нейтрализующим по меньшей мере одну активность ANGPTL3. Настоящее изобретение также относится к способам лечения расстройства, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, с использованием нейтрализующих моноклональных антител.

Description

В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки на патент США № 60/873834, поданной 8 декабря 2006 г., которая вводится в настоящее описание в различных целях посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с ангиопоэтин-подобным белком 3 (АЫСРТЬЗ). Настоящее изобретение относится к способам применения моноклональных антител, которые специфически связываются с ангиопоэтин-подобным белком 3 (АЫСРТЬЗ). Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим моноклональные антитела, которые специфически связываются с ангиопоэтин-подобным белком 3 (АЫ6РТЬ3).

Введение

Ангиопоэтин-подобный белок 3 (АЫСРТЬ3) является консервативным белком у млекопитающих нескольких видов. Ь1 С. (2006) Сигг. Ορίη. Είρίάοΐ. 17 (2): 152-156. АЫСРТЕ3 содержит Ν-концевой суперспирализованный домен и С-концевой фибриноген-подобный домен. Сопкйп Ό. е1 а1. (1999) Сеготкк 62:477-482. Ν-концевой суперспирализованный домен опосредует олигомеризацию АNСРТ^3. Се, Н. е1 а1. (2005) 1. Μρίά Век. 46(7):1484-1490. Олигомеризованный АНСРТЕ3 подвергается протеолитическому процессингу ίη νίνο, что приводит к отщеплению фибриноген-подобного домена. Οηο М. е! а1. (2003) 1. Βΐοΐ. Сйет. 278 (43):41804-41809.

АНСРТЕ3 экспрессируется преимущественно в печени. ΚοίκΗί В. е! а1. (2002) Να!. Сепе!. 30 (2):151157. АNСРТ^3, очевидно, ингибирует липопротеин-липазную (ЛПЛ) активность и способствует замедлению клиренса липопротеина очень низкой плотности (ЛОНП). ЗНиш/идаота Т. е! а1. (2002) 1. Βΐοΐ. Сйет. 277 (37): 33742-33748. У мышей со спонтанными ΚΚ/Зап-мутациями имеется инсерция в экзоне 6 гена Апдр!13, и у таких мышей обнаруживается заметная сывороточная гиполипидемия. ΚοίκΗί е! а1. (2002) №11. Сепе!., 30 (2): 151-157. Опосредованная аденовирусом экспрессия АНСРТЕ3 или непосредственное введение АNСРТ^3 приводит к устранению гиполипидемии у ΚΚ/Зап-мышей. ΚοίκΗί е! а1. (2002) №11. Сепе!. 30 (2): 151-157. Было обнаружено, что у Апдр!13-дефицитных мышей, а именно у самцов мышей, которые получали корм, и у самок мышей, которые либо получали корм, либо содержались в условиях голодания, наблюдались пониженные уровни триглицеридов. ΚοκΚΓ А. е! а1., (2005) Επάο^ίπο1. 146:4943-4950. Было также обнаружено, что у этих мышей, а именно у самцов и у самок мышей, которые получали корм и содержались в условиях голодания, наблюдаются пониженные уровни холестерина. ΚοκΒτ А. е! а1., (2005) Β^ο^μΕ 146:4943-4950. Было обнаружено, что у мышей, страдающих диабетом, индуцированным стрептозотоцином, а именно у бй/бй-мышей и у οЬ/οЬ-мышей, наблюдается повышенный уровень экспрессии Апдр!13. 1пика1 Κ. е! а1., (2004) Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 317(4): 1075-1079; ЗЫтатига, М. е! а1. (2004) Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 322 (3): 1080-1085.

Описание сущности изобретения

В некоторых своих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое связывается с А№СРТЬ3 и нейтрализует по меньшей мере одну активность А№СРТЬ3. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является мышиное моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является гуманизированное моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления указанным моноклональным антителом является человеческое моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело снижает уровень по меньшей мере одного липида в сыворотке ш νίνο.

В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом А№СРТЬ3, имеющим аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 59. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом А№СРТЬ3, имеющим аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 60. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом АНСРТЕ3, имеющим аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 9. В некоторых вариантах осуществления указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом АКСРТЕ^, имеющим аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 10.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 20, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 28. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 22, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 30. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 32. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 68. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕС Ш ΝΟ: 66,

- 1 019661 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 70.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 4.7.1. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 4.8.3. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 4.9.1. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 1.315.1. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 5.35. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 5.50.

В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является 8сРу-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является РаЬ-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является Р(аЬ')2-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональным антителом является РаЬ'-фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с ΛΝ6ΡΤΕ3 и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где указанная тяжелая цепь включает: а) аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из 8Е0 ГО N0: 19-26 и 63-66; Ь) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 35, 36 и 37; с) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 38, 39 и 40; б) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 41, 42 или 43; е) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 53, 54 и 55; ί) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 71, 72 и 73; или д) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 74, 75 и 76; где указанное антитело нейтрализует по меньшей мере одну активность ЛНСРТБ3. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь аантитела содержит СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 35, СЭР2. представленную в 8Е0 ГО N0: 36, и СЭР3. представленную в 8Е0 ГО N0: 37. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 38, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 39, и СОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 40. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭКЕ представленную в 8Е0 ГО N0: 41, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 42, и СОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 43. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭКЕ представленную в 8Е0 ГО N0: 53, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 54, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 55. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 71, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 72, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 73. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 74, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 75, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 76.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с АНСРТБ3 и включает тяжелую цепь и легкую цепь, где указанная тяжелая цепь содержит: а) аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из 8Е0 ГО N0: 19-26 и 63-66; Ь) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 35, 36 и 37; с) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 38, 39 и 40; б) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 41, 42, или 43; е) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 53, 54 и 55; ί) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 71, 72 и 73; или д) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N08: 74, 75 и 76; где указанное антитело нейтрализует по меньшей мере одну активность АЫСРТЕ3; и где указанная легкая цепь включает: а) аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из 8Е0 ГО N0: 27-34 и 67-70; Ь) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 44, 45 и 46; с) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 47, 48 и 49; б) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 50, 51 или 52; е) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 56, 57 и 58; ί) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 77, 78 и 79; или д) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 80, 81 и 82. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 35, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 36, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 37; а легкая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 44, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 45, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 46. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела содержит СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 38, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 39, и СОК3, представленную в 8Е0 ГО N0: 40; а легкая цепь антитела включает СЭКЕ представленную в 8Е0 ГО N0: 47, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 48, и СОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 49. В неко

- 2 019661 торых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела включает СЭР1. представленную в 8ЕО ГО N0: 41, СИК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 42, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 43; а легкая цепь антитела включает СИК1, представленную в 8Е0 ГО N0: 50, СИК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 51, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 52. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 53, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 54, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 55; а легкая цепь антитела включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 56, СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 57, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 58. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 71, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 72, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 73; а легкая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 77, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 78, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 79. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 74, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 75, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 76; а легкая цепь антитела включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 80, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 81, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 82.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с АНСРТБЗ и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где указанная легкая цепь включает: а) аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из 8Е0 ГО N0: 27-З4 и 67-70; Ь) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 44, 45 и 46; с) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 47, 48 и 49; б) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 50, 51 или 52; е) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 56, 57 и 58; Г) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 77, 78 и 79; или д) по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 80, 81 и 82; где указанное антитело нейтрализует по меньшей мере одну активность АЫСРТЕЗ. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела включает СЭК.1, представленную в 8Е0 ГО N0: 44, СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 45, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 46. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь антитела включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 47, СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 48, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 49. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает СИК1, представленную в 8Е0 ГО N0: 50, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 51, и СИКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 52. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 56, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 57, и СОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 58. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 77, СПК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 78, и СОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 79. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает СГОКР представленную в 8Е0 ГО N0: 80, СОК2, представленную в 8Е0 ГО N0: 81, и СГОКЗ, представленную в 8Е0 ГО N0: 82.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое связывается с АНСРТБЗ и нейтрализует по меньшей мере одну активность АЫСРТЕЗ, где аффинность указанного антитела по отношению к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, по меньшей мере в З раза превышает аффинность антитела по отношению к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность любой одной из 8Е0 ГО N0: 84, 8Е0 ГО N0: 85, 8РР) ГО N0: 86, 8РР) ГО N0: 87, 8РР) ГО N0: 88, 8РР) ГО N0: 90 и 8РР) ГО N0: 92. В некоторых вариантах осуществления аффинность указанного антитела по отношению к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, по меньшей мере в З раза превышает аффинность антитела по отношению к каждой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 85, 8Е0 ГО N0: 86, 8Е0 ГО N0: 87, 8Е0 ГО N0: 88 и 8Е0 ГО N0: 90. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, которое связывается с АНСРТБЗ и нейтрализует по меньшей мере одну активность АНСРТЕЗ, где указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 с К_с менее 50 нМ. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 с К_с менее З0 нМ. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 с К_с менее 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9 с К_с менее 5 нМ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело, описанное выше. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения расстройства, ассоциирующегося с нарушением метаболизма липидов, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения уровня одного или нескольких липидов в сыворотке, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения гипертриглицеридемии, где указанный способ

- З 019661 включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения гиперхолестеринемии, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения ожирения, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диабета, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения ишемической болезни сердца, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу лечения синдрома нарушения метаболизма, где указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам антител 1.315.1,

4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 2 показаны уровни холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам антител 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 3 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам анти-ЛХСРТЬ3 антитела 4.8.3, анти-ЛМСРТЬ4 антитела 14Ό12 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 4 показаны уровни холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам анти-ЛМСРТЬ3 антитела 4.8.3, анти-АЫСРТЬ4 антитела 14Ό12 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 5 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам анти-АЫСРТЬ3 антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, анти-ЛМСРТЬ4 антитела 14Ό12 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 6 показаны уровни холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм, и у мышей, содержащихся в условиях голодания, через 4 дня после инъекции этим мышам анти-ЛМСРТЬ3 антител

4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, анти-ЛМ6РТЬ4 антитела 14Ό12 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 7 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей через 4 дня (верхняя панель) и через 8 дней (нижняя панель) после инъекции этим мышам антител 1.125.1, 1.132.1, 1.173.2, 1.315.1,

1.424.1, 1.431.1 и контрольного анти-КЬН антитела, как описано в примере 1.

На фиг. 8 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей после инъекции различных доз вируса Аб5-11Лпдр113Т или 2х 10⁹ вирусных бляшек контрольного вируса, как описано в примере В.

На фиг. 9 показано связывание антител 4.1.1, 4.4.1, 4.6.3, 4.7.1, 4.8.1, 4.8.2, 4.8.3 и 4.9.1 с АЫ6РТЬ3§Р1, ЛХСРТЬ3Т и контрольным белком ВТ8324, как описано в примере Н.

На фиг. 10 показано сопоставление путем выравнивания последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи антител 4.7.1 (8ЕО Ш N0: 19), 4.8.3 (8Е0 Ш N0: 21) и 4.9.1 (8Е0 Ш N0: 23). Кроме того, показана консенсусная последовательность тяжелой цепи (8Е0 Ш N0: 25), а также области последовательностей тяжелой цепи, соответствующих сигнальному пептиду (8Р), каркасной области 1 (Г\УЫ). гипервариабельной области (комплементарность-определяющей) области 1 (СЬЫ). каркасной области 2 (Е^К.2), гипервариабельной области 2 (СПК.2), каркасной области 3 (Е^К3), гипервариабельной области 3 (СЭР3) и каркасной области 4 (Г\УР4).

На фиг. 11 показано сопоставление путем выравнивания вариабельных областей легкой цепи антител 4.7.1 (8Е0 Ш N0: 27), 4.8.3 (8Е0 Ш N0: 29) и 4.9.1 (8Е0 Ш N0: 31). Кроме того, представлена консенсусная последовательность легкой цепи (8Е0 Ш N0: 33), а также области последовательностей легкой цепи, соответствующих сигнальному пептиду (8Р), каркасной области 1 (Е^К1), гипервариабельной области 1 (СОК!), каркасной области 2 (Е^В2), гипервариабельной области 2 (СПК.2), каркасной области 3 (Е^К.3), гипервариабельной области 3 (СОК3) и каркасной области 4 (Г\УР4).

На фиг. 12 показана ЛПЛ-активность ίη νίίτο после обработки мышей моноклональными антиАНСРТЬ3 антителами 4.9.1, 4.8.3, 1.315.1, 4.7.1 и 1.173.2, как описано в примере Ь.

На фиг. 13 проиллюстрирована ίη νίνο фармакокинетика некоторых мышиных моноклональных анти-АЫСРТЬ3 антител, как описано в примере N.

На фиг. 14 проиллюстрировано связывание антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и 5.50 с аланинсканирующими мутантами пептида 8Р1, как описано в примере Н.

На фиг. 15 показаны уровни триглицеридов в сыворотке у мышей через 4 дня (верхняя панель) и 7 дней (нижняя панель) после инъекции антител 5.35 или 5.50, как описано в примере 1.

- 4 019661

На фиг. 16 показаны уровни холестерина в сыворотке у мышей через 4 дня (верхняя панель) и 7 дней (нижняя панель) после инъекции антител 5.35 или 5.50, как описано в примере 1.

На фиг. 17 проиллюстрирована ίη νίνο фармакокинетика антител 5.35 и 5.50, как описано в примере N.

На фиг. 18 проиллюстрирована ίη νίνο фармакокинетика антител 4.7.1, 4.9.1, 5.35 и 5.50, как описано в примере N.

На фиг. 19 проиллюстрировано снижение уровней триглицеридов и холестерина в сыворотке у АроЕ-мышей, которым инъецировали антитела 5.35 и 5.50 и контрольное анти-КЬН антитело.

Подробное описание различных вариантов изобретения

В данной заявке при употреблении какого-либо существительного в единственном числе также подразумевается, что оно может иметь значение существительного во множественном числе, если это не оговорено особо. В данной заявке употребление единственного числа означает по меньшей мере один, если это не оговорено особо. В настоящей заявке союз или означает и/или, если это не оговорено особо. Кроме того, термин включающий, а также другие формы, такие как включает и включенный, имеют неограничивающее значение. Кроме того, такие термины как элемент или компонент охватывают элементы или компоненты, включающие одну единицу, и элементы или компоненты, включающие более чем одну единицу, если это не оговорено особо.

Заголовки приведенных здесь разделов приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение описанной здесь сущности изобретения. Все документы или части документов, цитируемых в данной заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, справочную литературу и монографии, точно и во всей своей полноте вводятся в описание настоящей заявки посредством ссылки и могут быть использованы в любых целях. В том случае, если в одной или в нескольких включенных в описание данной заявки ссылках на литературу и аналогичные материалы приводится определение термина, которое противоречит определению термина в данной заявке, то такие противоречия могут быть урегулированы в соответствии с описанием настоящей заявки.

А. Некоторые определения

Используемые здесь термины полипептид, пептид и белок являются взаимозаменяемыми и означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также означают аминокислотные полимеры, содержащие природные аминокислоты, а также аминокислотные полимеры, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей природной аминокислоты. Аминокислотные полимеры могут иметь любую длину.

Используемый здесь термин антитело означает интактное антитело или фрагмент антитела, которые конкурируют с интактным антителом за связывание с антигеном. Фрагментами антител являются, но не ограничиваются ими, ЕаЬ-, ЕаЬ'-, Е(аЬ')₂-, Εν-, 5сЕу- и Еб-фрагменты, димерные антитела и другие фрагменты антител, которые сохраняют по меньшей мере часть вариабельной области интактного антитела (см., например, Нибкоп с1 а1. (2003) Ναι. Меб. 9:129-134). В некоторых вариантах осуществления фрагменты антител получают путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антител получают с применением техники рекомбинантных ДНК.

Термин нативный полипептид означает природный полипептид. Термин нативное антитело означает природное антитело.

Термин моноклональное антитело означает антитело, происходящее, в основном, из гомогенной популяции антител, которые специфически связываются с одним и тем же эпитопом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело секретируется гибридомой. В некоторых таких вариантах гибридому получают с применением некоторых методов, известных специалистам (см., например, КоЫег & МЙ51е1п (1975) №Шге 256:495-499). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). В некоторых вариантах осуществления термин моноклональное антитело означает фрагмент антитела, выделенный из библиотеки фагового представления (см., например, С1асккоп е1 а1. (1991) №11иге 352:624-628, и Магкк е1 а1. (1991) 1. Мо1. Βίο1. 222:581-597). Описание способов получения различных других моноклональных антител (см., например, руководство Наг1о\у апб Ьапе (1988) АпбЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаФгу, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ)).

Термин химерное антитело означает антитело, состоящее из компонентов, происходящих по меньшей мере от двух различных источников. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает часть антитела, происходящего от первой молекулы, присоединенной ко второй молекуле, например, часть антитела, происходящего от второй молекулы. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает часть антитела, происходящего от не человеческого антитела, присоединенного к части антитела, происходящего от человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает всю вариабельную область или часть вариабельной области антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком, и присоединенного к константной области антитела, происходящего от человека.

Термин гуманизированное антитело означает не человеческое антитело, которое было модифицировано так, чтобы оно имело более близкое сходство (в аминокислотной последовательности) с челове

- 5 019661 ческим антителом. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой тип химерного антитела. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки, находящиеся за пределами антигенсвязывающих остатков вариабельной области не человеческого антитела, являются модифицированными. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело конструируют путем замены всей гипервариабельной области (СИВ) человеческого антитела или ее части на всю СИВ другого антитела или ее часть, такого как не человеческое антитело, обладающее нужной специфичностью связывания с антигеном. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает вариабельные области, в которых все или в основном все СИВ соответствуют СИВ не человеческого антитела, и все или в основном все каркасные области (ТВ) соответствуют ТВ человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело также включает константную область (Ре) человеческого антитела.

Термин человеческое антитело означает моноклональное антитело, которое содержит последовательности человеческого антитела и не содержит последовательностей антитела, происходящего от животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело может содержать синтетические последовательности, не обнаруженные в нативных антителах. Этот термин не ограничивается каким-либо конкретным методом получения антител. Так, например, в различных вариантах осуществления человеческое антитело может быть получено методом с применением трансгенных мышей, методом фагового представления, с использованием человеческих В-лимфоцитов или рекомбинантными методами.

Термин нейтрализующее антитело или антитело, которое нейтрализует означает антитело, снижающее по меньшей мере одну активность полипептида, содержащего эпитоп, с которым специфически связывается данное антитело. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело снижает активность ίη νίΐτο и/или ίη νίνο.

Термин антигенсвязывающий сайт означает часть антитела, способную специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий сайт доставляется одной или несколькими вариабельными областями антитела.

Термин эпитоп означает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или с Т-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой область антигена, которая специфически связывается с антителом. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может включать химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные или сульфонильные группы. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может обладать специфическими трехмерными структурными свойствами (например, конформационный эпитоп) и/или иметь конкретный заряд.

Указание на то, что данный эпитоп является таким же, как и другой эпитоп, означает, что конкретное антитело специфически связывается с обоими эпитопами. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, имеющие различные первичные аминокислотные последовательности, могут содержать эпитопы, которые являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления эпитопы, которые являются одинаковыми, могут иметь различные первичные аминокислотные последовательности. Считается, что различные антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если они конкурируют за специфическое связывание с этим эпитопом.

Антитело специфически связывается с антигеном, если оно преимущественно распознает антиген в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с конкретным эпитопом. В некоторых вариантах осуществления указанное антитело обладает способностью связываться с различными антигенами, при условии, что такие различные антигены содержат этот конкретный эпитоп. В некоторых случаях, например, гомологичные белки от различных видов могут содержать один и тот же эпитоп. В некоторых вариантах осуществления считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации (К_с) составляет <1 мкМ, в некоторых вариантах осуществления - если константа диссоциации составляет <100 нМ, а в некоторых вариантах осуществления - если константа диссоциации составляет <10 нМ.

Термин АЫСРТЬЗ» означает ангиопоэтин-подобный белок 3, имеющий аминокислотную последовательность, происходящую от любого позвоночного или млекопитающего, включая, но не ограничиваясь ими, человека, коров, кур, грызунов, мышей, крыс, свиней, овец, приматов, обезьян и морских свинок, если это не оговорено особо. Этот термин также означает фрагменты и варианты нативного АЫСРТЬЗ, которые сохраняют по меньшей мере одну ίη νίνο или ίη νίΐτο активность нативного АЫСРТЬЗ. Этот термин охватывает полноразмерные непроцессированные формы предшественника АЫСРТЬЗ, а также зрелые формы, образующиеся в результате посттрансляционного отщепления сигнального пептида, и формы, образующиеся в результате протеолитического процессинга фибриногенового домена. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный непроцессированный мышиный АЫбРТЬЗ имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 1 (СснЬанк рег. № №_038941). В некоторых вариантах осуществления полноразмерный непроцессированный человеческий

- 6 019661

ЛЫбРТЬЗ имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 3 (СепЬапк рег. № ΝΡ_055310).

Термин Аидр113 означает нуклеиновую кислоту, кодирующую ΛΝ0ΡΤΕ3.

Термин ЛПЛ означает липопротеин-липазу, имеющую аминокислотную последовательность, происходящую от любого позвоночного или млекопитающего, включая, но не ограничиваясь ими, человека, коров, кур, грызунов, мышей, крыс, свиней, овец, приматов, обезьян и морских свинок. В некоторых вариантах осуществления липопротеин-липаза катализирует гидролиз триацилглицерина в хиломикронах и липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) с образованием диацилглицерина и аниона свободной жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления липопротеин-липаза также обладает способностью гидролизовать диацилглицерин.

Термин агент означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов.

Термин антагонист ΆΝ0ΡΤΕ3 означает агент, снижающий активность ΛΝ0ΡΤΕ3.

Термин агонист ΆΝ0ΡΤΕ3 означает агент, повышающий активность ΛΝ0ΡΤΕ3.

Термин пациент включает человека и животных. В некоторых вариантах осуществления пациентом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек.

Термин фрагмент эталонного полипептида означает непрерывную последовательность аминокислот любой части эталонного полипептида. Фрагмент может иметь любую длину, но меньшую чем длина эталонного полипептида.

Термин вариант эталонного полипептида означает полипептид, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций по сравнению с эталонным полипептидом.

Термин консервативная аминокислотная замена означает замену аминокислот полипептида другой аминокислотой, имеющей аналогичные свойства, такие как размер или заряд. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий консервативную аминокислотную замену, сохраняет по меньшей мере одну активность полипептида, не содержащего таких замен. Консервативная аминокислотная замена может включать неприродные аминокислотные остатки, которые обычно вводятся в результате химического пептидного синтеза, а не синтеза в биологических системах. Результатами таких замен являются, но не ограничиваются ими, пептидомиметики и другие реверсивные или инвертированные формы аминокислотных молекул.

Природные остатки могут быть подразделены на классы на основе общих свойств боковых цепей:

1) гидрофобные: норлейцин, Ме1. А1а, Уа1, Ьеи, 11е;

2) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ет, ΤΙιγ, Аки, С1п;

3) кислотные: Акр, С1и;

4) основные: Ηίκ, Ьук, Агд;

5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: С1у, Ρτο; и

6) ароматические: Ττρ, Τ\τ, Ρίκ.

Так, например, неконсервативные замены могут включать замену аминокислоты одного из этих классов на аминокислоту другого класса. Такие замененные остатки могут быть введены в области человеческого антитела, гомологичные областям не человеческих антител, или в не гомологичные области молекулы.

В соответствии с некоторыми вариантами изобретения такие замены могут быть введены с учетом гидропатического индекса аминокислот. Каждая аминокислота имеет свой гидропатический индекс, что обусловлено их гидрофобностью и зарядом. Такими индексами являются изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

Специалистам известно, что в некоторых случаях, гидропатический индекс аминокислот играет важную роль в сообщении белку интерактивной биологической функции. Ку1е е1 а1., 1. Μο1. Βίο1., 157:105-131 (1982). Известно, что в некоторых случаях некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими аналогичный гидропатический индекс или аналогичное гидропатическое число, и при этом, их биологическая активность сохраняется. В некоторых вариантах осуществления при введении модификаций с учетом гидропатического индекса могут быть сделаны замены ами нокислот с гидропатическим индексом в пределах ±2. В некоторых вариантах осуществления этот гидропатический индекс находится в пределах ±1, а в некоторых вариантах осуществления ±0,5.

Также очевидно, что замена аминокислот на подобные аминокислоты может быть эффективно осуществлена с учетом гидрофильности, а в частности, если биологически функциональный белок или полипептид предназначен для его применения в иммунологии, например, в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления самая высокая локальная усредненная гидрофильность белка, регулируемая гидрофильностью смежных аминокислот такого белка, коррелирует с его иммунногенностью и антигенностью, то есть с биологическими свойствами белка.

Такие аминокислотные остатки могут приобретать нижеследующие величины гидрофильности: ар

- 7 019661 гинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4).

В некоторых вариантах осуществления при осуществлении модификаций на основе аналогичных величин гидрофильности могут быть введены замены аминокислот с величинами гидрофильности в пределах ±2, в некоторых вариантах осуществления в пределах ±1, а в некоторых вариантах осуществления в пределах ±0,5. На основе гидрофильности можно также идентифицировать эпитопы от первичных аминокислотных последовательностей. Эти области также называются эпитопными коровыми областями.

Репрезентативные аминокислотные замены представлены в табл. 1.

Таблица 1. Аминокислотные замены

Исходный остаток	Репрезентативные замены
А1а	Уа1, Ьеи, 11е
Агд	Ьуз, СТп, Азп
Азп	С1п
Азр	СТи
Суз	Зег, А1а
Й1п	Азп
С1и	Азр
С1у	Рго, АТа
Н1з	Азп, С1п, Ьуз, Агд
Не	Ьеи, УаТ, Ме!, АТа, РЬе, норлейцин
Ьеи	Норлейцин, Не, Уа1, Ме!, А1а, РЬе
Ьуз	Агд, 1, 4-диаминомасляная кислота, С1п, Азп
Ме!	Ьеи, РЬе, 11е
РЬе	Ьеи, УаТ, Не, А1а, Туг
Рго	А1а
Зег	ТЬг, А1а, Суз
ТЬг	Зег
Тгр	Туг, РЬе
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег
Уа1	Не, Ме!, Ьеи, РЬе, АТа, норлейцин

Специалист в данной области может самостоятельно определить подходящие варианты описанных здесь полипептидов с применением хорошо известных методов. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может самостоятельно идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть заменены без нарушения активности путем доставки областей, которые, как очевидно, не играют важной роли в сообщении такой активности. В некоторых вариантах осуществления можно идентифицировать остатки и части молекул, которые являются консервативными среди аналогичных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления даже в те области, которые могут играть важную роль в сообщении биологической активности или образовании структуры, могут быть введены консервативные аминокислотные замены, не нарушающие биологической активности или не оказывающие негативного влияния на полипептидную структуру.

Кроме того, в соответствии с некоторыми осуществлениями изобретения могут быть проведены исследования структуры-функции, позволяющие идентифицировать остатки в аналогичных полипептидах, которые играют важную роль в сообщении активности или образовании структуры. В некоторых вариантах осуществления, исходя из такого сравнения, могут быть предсказаны аминокислотные остатки в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, играющим важную роль в сообщении активности аналогичным белкам или образовании структуры этих белков. В соответствии с некоторыми осуществлениями изобретения специалист в данной области может выбрать химически аналогичные аминокислотные замены для каждого предсказанного и играющего важную роль аминокислотного остатка.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения специалист в данной области может также проанализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в аналогичных полипептидах. В некоторых вариантах осуществления, исходя из такой информации, специалист в данной области может предсказать трехмерную структуру аминокислотных остатков антитела путем выравнивания аминокислотных остатков антитела. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения специалист в данной области не может внести радикальные модификации в предска

- 8 019661 занные аминокислотные остатки на поверхности белка, поскольку такие остатки могут участвовать в играющих важную роль взаимодействиях с другими молекулами. Кроме того, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, специалист в данной области может получить тестируемые варианты, содержащие одну аминокислотную замену в каждом нужном аминокислотном остатке. В некоторых вариантах осуществления указанные варианты могут быть затем скринированы с помощью известных анализов на активность. В некоторых вариантах осуществления, указанные варианты могут быть использованы для сбора информации о подходящих вариантах. Так, например, в некоторых вариантах осуществления, в том случае, если обнаруживается, что модификация конкретного аминокислотного остатка приводит к нарушению активности, к нежелательному снижению или к какому-либо другому нежелательному изменению активности, то варианты с такими модификациями являются нежелательными. Другими словами, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, исходя из информации, полученной при проведении таких рутинных экспериментов, специалист в данной области может легко определить, в какие именно положения аминокислот не следует вводить дополнительные замены как отдельно, так и в их комбинациях с другими мутациями.

Ряд научных публикаций посвящен предсказаниям вторичной структуры. См., например, Мои1! 1., Сигг. Θρίη. Вю!есЬпо1. (1996) 7(4): 422-427; Сйои е! а1., (1974) Вюсйет1к!гу. 13(2): 222-245; Сйои е! а1. (1974) Вюсйетщйу 113 (2): 211-222; Сйои е! а1. (1978) Αάν. Еп/уто1. Ве1а!. Агеак Мо1. Вю1. 47:45-148; Сйои е! а1. (1976) Αηη. Κην. Вюсйет. 47:251-276; и Сйои е! а1. (1979) Вю]э11ук. 1. 26: 367-384. Кроме того, в настоящее время имеются компьютерные программы, облегчающие предсказание вторичной структуры. Один из методов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Так, например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательностей более чем на 30% или сходство более чем на 40%, часто имеют сходные структурные топологии. Все большее пополнение базы данных структур белка (РОВ) значительно облегчает предсказание вторичной структуры, включая предсказание потенциального числа складок в структуре полипептида. См., например, Но1т е! а1. (1999) Ыис1. Ααά. Век. 27 (1): 244-247. Было высказано предположение (Вгеппег е! а1., (1997) Сигг. Ор. 81гиск Вю1. 7 (3): 369-376), что в данном полипептиде или белке существует ограниченное число складок, и что после разрешения значительного числа структур, предсказание структуры может быть гораздо более точным.

Дополнительными методами предсказания вторичной структуры являются потоковая обработка сообщений (см., например, 1опек, Ό. (1997) Сигг. Ορίη. 8!гис!. Вю1. 7(3):377-387; 8ίρρ1 е! а1. (1996) 8!гис!иге 4(1):15-19), анализ профилей (см., например, Во\\(е е! а1., (1991) 8с1епсе 253:164-170; СпЬккоу е! а1., (1990) МеШ Еп/лт. 183:146-159; Οπΐικ^ν е! а1. (1987) Ргос. Ыа!. Асаб. 8ск И8А 84 (13):4355-4358) и поиск эволюционной взаимосвязи (см., например, Но1т е! а1. (1999) Ыис1. Ααά. Век. 27 (1) :244-247; и Вгеппег е! а1. (1997) Сигг. Ορ. 8!гис!. Вю1. 7(3): 369-376 (1997)).

В некоторых осуществлениях изобретения вариант эталонного антитела включает вариант гликозилирования, в котором число и/или тип сайтов гликозилирования были изменены по сравнению с сайтами гликозилирования аминокислотной последовательности эталонного антитела. В некоторых осуществлениях изобретения вариант полипептида содержит большее или меньшее число сайтов Ν-связанного гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом. Сайт Ν-связанного гликозилирования отличается тем, что он имеет следующую последовательность: Акп-Х-8ег или Акп-Х-Тйг, где аминокислотный остаток, определенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков с получением такой последовательности приводит к созданию потенциально нового сайта для присоединения цепи Ν-связанного углевода. Альтернативно замены, которые приводят к элиминации этой последовательности, позволяют удалять существующую цепь Ν-связанного углевода. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к перегруппировке цепей Ν-связанного углевода, где один или несколько сайтов Ν-связанного гликозилирования (обычно сайтов, которые являются природными) элиминируются, а вместо них образуются один или несколько новых Ν-связанных сайтов. Репрезентативными вариантами антител являются цистеиновые варианты, где по сравнению с аминокислотной последовательностью эталонного антитела один или несколько цистеиновых остатков делетированы или заменены другой аминокислотой (например, серином). В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты могут быть использованы в том случае, если антитела должны быть подвергнуты рефолдингу с образованием биологически активной конформации, например, после выделения нерастворимых телец включения. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют меньшее число цистеиновых остатков, чем нативный полипептид. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют четное число цистеиновых остатков, что позволяет минимизировать взаимодействия, вызываемые неспаренными цистеинами.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения аминокислотными заменами являются замены, которые (1) приводят к снижению чувствительности к протеолизу, (2) приводят к снижению чувствительности к окислению, (3) приводят к изменению аффинности связывания с образованием белковых комплексов, (4) приводят к изменению аффинности связывания и/или (4) сообщают таким полипептидам другие физико-химические или функциональные свойства либо приводят к изменению этих свойств. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения в природную последовательность (в

- 9 019661 некоторых вариантах осуществления в часть полипептида, находящегося за пределами домена(ов), образующего(их) межмолекулярные контакты) могут быть внесены одна или множество аминокислотных замен (в некоторых вариантах осуществления консервативных аминокислотных замен). В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена обычно не оказывает какого-либо значительного влияния на структурные свойства исходной последовательности (например, в некоторых вариантах осуществления замена аминокислоты не должна разрушать спираль, которая присутствует в исходной последовательности, либо она не должна нарушать вторичную структуру других типов, которая характеризует данную исходную последовательность). Примеры некоторых известных вторичных и третичных структур полипептидов описаны, например, в публикациях Рго1сш8. 81гнс1игс5 апб Мо1еси1аг РппС1р1с5 (Сте1дЫоп Еб., Н. Ртеешап апб Сотрапу, Ыете Уогк (1984)); 1п1тобисбоп 1о Рто1еш 81гис1иге (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе, еб§., Сат1апб РиЬШйшд, Ыете Уогк, Ν.Υ. (1991)); и Т1югп1оп 1. М. е1 а1. (1991) Ыа1иге 354:105-106.

Термин процент идентичности или % идентичности, если он употребляется по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты, означает процент идентичных нуклеотидов по меньшей мере между двумя полинуклеотидными последовательностями, которые были подвергнуты выравниванию с помощью поисковой программы выравнивания локальных оснований ВЬА8Т (Ваис Ьоса1 Айдптеп! 8еатсй Тоо1). См. ТаШюса е1 а1. (1999) РЕМ8 М1стоЫо1. Ьей. 174:247-250. Программа ВЬА8Т (версия 2.2.10) имеется в общедоступной базе данных Национального центра биотехнологической информации (ΝΟΕΙ), ВеШекба, МИ. Для выравнивания двух полинуклеотидных последовательностей используется пакет инструментальных программ В1а§1 2 Зециепсек, в который входит программа ЫаЧп с установленными параметрами по умолчанию, такими как:

Матрица: не используется «Цена» за соответствие: 1

Штраф за несоответствие: -2

Штраф за пробел-пропуск: 5

Штраф за пробел-удлинение: 2

Выпадение знака Оар_х: 50

Ожидание: 10,0

Размер «слова»: 11

Фильтр: имеется

Термин процент идентичности или % идентичности, если он употребляется по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты, означает процент идентичных аминокислот по меньшей мере между двумя полипептидными последовательностями, которые были подвергнуты выравниванию с помощью поисковой программы выравнивания локальных оснований ВЬА8Т (Ваис Ьоса1 Айднтеп! 8еатсй Тоо1). См. ТаШюса е1 а1. (1999) РЕМ8 М1сгоЬю1. Ье11. 174:247-250. Программа ВЬА8Т (версия 2.2.10) имеется в общедоступной базе данных Национального центра биотехнологической информации (ΝΟΒΙ), ВеШекба, МИ. Для выравнивания двух полипептидных последовательностей используется пакет инструментальных программ В1а§1 2 Зециепсек, в который входит программа ЫаЧр с установленными параметрами по умолчанию, такими как:

Матрица: ВЬ03имб2

Штраф за пробел-пропуск: 11

Штраф за пробел-удлинение: 1

Выпадение знака Сар_х: 50

Ожидание: 10,0

Размер «слова»: 3

Фильтр: имеется

Термин эффективная доза или эффективное количество означает количество агента, например, нейтрализующего антитело, которое ослабляет симптомы у пациента или дает нужный биологический эффект. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза или эффективное количество являются достаточными для снижения по меньшей мере одной активности ΑΝΟΡΕΕ3. В некоторых вариантах осуществления эффективную дозу или эффективное количество определяют, как описано ниже, в части У.С.

Термин лечение охватывает терапевтические и профилактические/превентивные меры, если это не оговорено особо. Индивидуумами, нуждающимися в лечении, являются, но не ограничиваются ими, индивидуумы, уже страдающие конкретным состоянием или расстройством, а также индивидуумы, которые подвержены риску развития у них конкретного состояния или расстройства (например, индивидуумы, нуждающиеся в профилактическом/превентивном лечении). Термин лечение означает введение пациенту агента в терапевтических и/или профилактических/превентивных целях.

- 10 019661

Термин терапевтическое средство означает средство, которое может быть введено ίη νίνο для достижения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта.

Термин терапевтическое антитело означает антитело, которое может быть введено ίη νίνο для достижения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта.

Термины выделенная нуклеиновая кислота и выделенный полинуклеотид являются взаимозаменяемыми. Репрезентативными выделенными полинуклеотидами являются, но не ограничивается ими, геномная ДНК, РНК, кДНК, синтетическая ДНК или РНК или некоторые их комбинации. Выделенный полинуклеотид (1) не ассоциируется со всеми полинуклеотидами или с их частью, в которой выделенный полинуклеотид встречается в природе, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не ассоциируется в природе, или (3) не присутствует в природе как часть более крупной последовательности.

В. Структура нативных антител и некоторых фрагментов антител

Нативное антитело обычно имеет тетрамерную структуру. Тетрамер обычно включает две идентичные пары полипептидных цепей, каждая из которых имеет одну легкую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 50-70 кДа). В нативном антителе тяжелая цепь содержит вариабельную область, ν_Η, и три константных области, С_н1, С_н2 и С_н3. Домен ν_Η находится у аминоконца тяжелой цепи, а домен С_н3 находится у карбоксиконца. В нативном антителе легкая цепь содержит вариабельную область V и константную область С_ъ. Вариабельная область легкой цепи находится у аминоконца легкой цепи. В нативном антителе вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий сайт. Константные области обычно ответственны за эффекторную функцию.

Нативные человеческие легкие цепи обычно классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Нативные человеческие тяжелые цепи обычно классифицируются как цепи мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела, а именно 1дМ, Ι§Ό, 1дС. 1дА и 1дЕ, соответственно. 1дС имеет подклассы, включая, но не ограничиваясь ими, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. 1дМ имеет подклассы, включая, но не ограничиваясь ими, 1дМ1 и 1дМ2. 1дА имеет подклассы, включая, но не ограничивается ими, 1дА1 и 1дА2. В нативных человеческих легких и тяжелых цепях, вариабельные и константные области обычно связаны с областью ί, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область Ό, состоящую примерно из 10 или более аминокислот. См., например, Рипбатеп!а1 1ттипо1оду (1989) СИ. 7 (Раи1, еб., 2пб еб. Рахеп Ргекк, Ν.Υ.).

В нативном антителе вариабельные области обычно имеют одинаковую общую структуру, в которой относительно консервативные каркасные области (РК) связаны друг с другом тремя гипервариабельными областями, также называемыми комплементарность-определяющими областями (СЭК). СЭК, происходящие от двух цепей каждой пары, обычно расположены на одной цепи с каркасными областями, что позволяет им связываться с конкретным эпитопом. Вариабельные области легкой и тяжелой цепи, от Ν-конца до С-конца, обычно содержат домены РК1, СЭРк РК2, СЭК2, РК3, СЭК3 и РК4. СОК на тяжелой цепи обозначаются Η1, Η2 и Н3, а СОК на легкой цепи обозначаются Ь1, Ь2 и Ь3. Обычно СЭК3 представляет собой наибольший источник молекулярной вариабельности в антигенсвязывающем сайте. В некоторых случаях, например, в случае Н3, эта область может состоять по меньшей мере из двух аминокислотных остатков или более чем из 26 остатков. Присвоение аминокислот каждому домену обычно осуществляют в соответствии с определениями по Кабату и др. (КаЬа! е! а1. (1991) Зесщепсек о£ Рго1ешк о£ 1ттнпо1о§1са1 1п1егек( (№Шопа1 1пкН(и(ек о£ ВенНк РиЬНса(1оп № 91-3242, νοί. 1-3, Ве1кекба, МО); по Чотия (СЬо1Ыа С. & Ьекк А.М. (1987) I. Мо1. Вю1. 196:901-917; или СЬо1Ыа С. е! а1. Уинге 342:878-883 (1989)). В настоящей заявке термин СЭК означает СЭК, происходящую от легкой цепи или тяжелой цепи, если это не оговорено особо.

РаЬ-фрагмент включает одну легкую цепь и Ο_Η1 и вариабельную область одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы РаЬ не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. РаЬ'-фрагмент содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая включает дополнительную константную область, простирающуюся между доменами Ο_Η1 и Ο_Η2. Межцепочечная дисульфидная связь может образовываться между двумя тяжелыми цепями РаЬ'-фрагмента с образованием молекулы Р(аЬ')2.

Ρν''-фрагмент содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, но не содержит константных областей. Одноцепочечный Ρν (ксРν)-фрагмент содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соединенные друг с другом гибким линкером с образованием одной полипептидной цепи, содержащей антигенсвязывающую область. Примеры одноцепочечных антител подробно обсуждаются в \УО 88/01649 и в патентах США №№ 4946778 и 5260203. В некоторых случаях одна вариабельная область (то есть вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи) может обладать способностью распознавать антиген и связываться с этим антигеном.

Используемый здесь термин тяжелая цепь означает полипептид, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, взятую отдельно или в комбинации с легкой цепью и достаточную для сообщения этому полипептиду специфичности к данному антигену.

Используемый здесь термин легкая цепь означает полипептид, содержащий последовательность вариабельной области легкой цепи, взятую отдельно или в комбинации с тяжелой цепью и достаточную

- 11 019661 для сообщения этому полипептиду специфичности к данному антигену.

С. Некоторые антитела

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически связываются с АЫСРТЬЗ. В некоторых таких вариантах моноклональными антителами являются нейтрализующие моноклональные антитела, снижающие по меньшей мере одну активность АЫбРТЬЗ ίη νίνο и/или ίη νίίτο.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение уровня по меньшей мере одного липида в сыворотке ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение уровня триглицеридов в сыворотке ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело вызывает снижение уровней общего холестерина ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛНСРТЬЗ вызывает снижение уровней свободных жирных кислот (РРА) ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение по меньшей мере двух из этих уровней ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ снижение по меньшей мере трех из этих уровней ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней триглицеридов в сыворотке ЬПЬг-дефицитных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней общего холестерина у ЬПЬг-дефицитных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ЛЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней триглицеридов в сыворотке АроЕ-дефицитных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней общего холестерина у АроЕ-дефицитных мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней триглицеридов в сыворотке у бЬ/бЬ-мышей ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АЫСРТЬЗ вызывает снижение уровней уровни общего холестерина у бЬ/бЬ-мышей ίη νίνο.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с мышиным АЫСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с человеческим АЫСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом в АЫСРТЬЗ от других видов (то есть к антителам, которые обнаруживают перекрестную реактивность). В некоторых вариантах осуществления антитела специфически связываются с мышиным АЫСРТЬЗ и человеческим АЫСРТЬЗ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с эпитопом в Ν-концевом суперспирализованном домене АNСРТ^3. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с эпитопом в Νконцевом суперспирализованном домене мышиного АNСРТ^3. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области мышиного АNСРТ^3. расположенной от остатка 17 до остатка 240 8ЕО ГО N0: 1 (8Е0 ГО N0: 59). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с областью 8Р1 мышиного АNСРТ^3. расположенной от остатка З2 до остатка 57 8Е0 ГО N0: I (8Е0 ГО N0: 9). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АNСРТ^3. которая включает аминокислоты З4-З7 и 40 8Е0 ГО N0: 1 (аминокислоты З-6 и 9 8Е0 ГО N0: 9). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АN^РТ^3. которая включает аминокислоты ЗЗ-З7 и 40 8Е0 ГО N0: 1 (аминокислоты 2-6 и 9 8Е0 ГО N0: 9). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АNСРТ^3. которая включает аминокислоты З4-З7, 40 и 42 8Е0 ГО N0: 1 (аминокислоты З-6, 9 и 11 8Е0 ГО N0: 9). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АN^РТ^3. которая включает аминокислоты З4-З7 и 40-42 8Е0 ГО N0: 1 (аминокислоты З-6 и 911 8ЕО ГО N0: 9).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые специфически связываются с эпитопом в ^концевом суперспирализованном домене человеческого АNСРТ^3. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области человеческого АN^РТ^3. расположенной от остатка 20 до остатка 14З 8Е0 ГО N0: З (8Е0 ГО N0: 60). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с областью 8Р1 челове

- 12 019661 ческого АЫбРТЬЗ, расположенной от остатка 32 до остатка 57 8ЕО ГО N0: 3 (8Е0 ГО N0: 10). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного ΑΝ0ΡΤΕ3, которая включает аминокислоты 34-37 и 40 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 3-6 и 9 8Е0 ГО N0: 10). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного ΑNСΡΤ^3. которая включает аминокислоты 33-37 и 40 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 2-6 и 9 8Е0 ГО N0: 10). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного ΑNСΡΤ^3. которая включает аминокислоты 34-37, 40 и 42 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 3-6, 9 и 11 8Е0 ГО N0:10). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного ΑNСΡΤ^3. которая включает аминокислоты 34-37 и 40-42 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 3-6 и 9-11 8Е0 ГО N0: 10).

В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, с аффинностью, которая по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает аффинность связывания нейтрализующего моноклонального антитела с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность любой одной из 5 ЕС) ГО N0: 84, 5ЕС) ГО N0: 85, 5ЕС) ГО N0: 86, 5ЕС) ГО N0: 87, 5ЕС) ГО N0: 88, 5ЕС) ГО N0: 90 и 5ЕС) ГО N0: 92. В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, с аффинностью, которая по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает аффинность связывания нейтрализующего моноклонального антитела с каждой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 84, 8Е0 ГО N0: 85, 5ЕС) ГО N0: 86, 5ЕО ГО N0: 87, 5ЕО ГО N0: 88, 5ЕО ГО N0: 90 и 5ЕО ГО N0: 92. В некоторых вариантах осуществления аффинность определяют, как описано в примере Н(2).

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующими моноклональными антителами являются не человеческие моноклональные антитела. В некоторых таких вариантах нейтрализующими моноклональными антителами являются моноклональные антитела грызунов. В некоторых таких вариантах нейтрализующими моноклональными антителами являются мышиные моноклональные антитела. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующими моноклональными антителами являются химерные моноклональные антитела. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующими моноклональными антителами являются гуманизированные моноклональные антитела. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующими моноклональными антителами являются человеческие моноклональные антитела. В некоторых вариантах осуществления химерные, гуманизированные и/или человеческие моноклональные антитела могут быть использованы в качестве терапевтических антител для лечения человека.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующими моноклональными антителами являются фрагменты антител. Репрезентативными фрагментами антител являются, но не ограничиваются ими, ЕаЬ-, ЕаЬ'-, Е(аЬ')₂-, Εν-, 8сЕу- и Еб-фрагменты, димерные антитела и другие фрагменты антител.

В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с человеческим ΑNСΡΤ^3 с К_с менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 300 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 30 нМ, менее 25 нМ, менее 20 нМ, менее 15 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ или менее 2 нМ. В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с человеческим пептидом 8Р1 с К_с менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 300 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 30 нМ, менее 25 нМ, менее 20 нМ, менее 15 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ или менее 2 нМ. В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, с К_с менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 300 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 30 нМ, менее 25 нМ, менее 20 нМ, менее 15 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ или менее 2 нМ. В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, с К_с менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 300 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 30 нМ, менее 25 нМ, менее 20 нМ, менее 15 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 4 нМ, менее 3 нМ или менее 2 нМ.

В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΑNСΡΤ^3 связывается с мышиным ΑNСΡΤ^3 (8Е0 ГО N0: 1) с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 200 раз превышает аффинность связывания с мышиным ΑNСΡΤ^4 (8Е0 ГО N0: 107). В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΑNСΡΤ^3 связывается с человеческим ΑNСΡΤ^3 (8Е0 ГО N0: 3) с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей ме

- 13 019661 ре в 200 раз превышает аффинность связывания с человеческим АЫ6РТЬ4 (8ЕО ГО N0: 108). В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΑΝΟΡΤΕ3 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность области 8Р1 мышиного ΑΝΟΡΤΕ3 (8ЕО ГО N0: 9), с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 200 раз превышает аффинность связывания с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность области 8Р1 мышиного ΑΝΟΡΤΕ4 (8ЕО ГО N0: 109). В различных вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ΑΝΟΡΤΕ3 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность области 8Р1 человеческого АЫСРТЬЗ (8Е0 ГО N0: 10), с аффинностью, которая по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз или по меньшей мере в 200 раз превышает аффинность связывания с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность области 8Р1 человеческого АХСРТЕ4 (8ЕО ГО N0: 110).

Настоящее изобретение относится к репрезентативным нейтрализующим моноклональным антителам, обозначенным 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35 и 5.50. Антитела 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и 5.50 связываются с эпитопом в положениях остатков 32-57 мышиного АХСРТЕ3 или человеческого АНСРТЬ3 (8ЕО ГО N0: 9 и 10). В некоторых вариантах осуществления антитела 4.7.1 и 4.9.1 связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АНСРТЬ3 или человеческого АХСРТЕ3. которая включает аминокислоты 33-37 и 40 8ЕО ГО N0: 2 или 8ЕО ГО N0: 3 (аминокислоты 2-6 и 9 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 10). В некоторых вариантах осуществления антитела 5.35 и 5.50 связываются с эпитопом в области 8Р1 мышиного АХСРТЕ3 или человеческого АЫ6РТЬ3, которая включает аминокислоты 34-37 и 40-42 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 3-6 и 9-11 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 10). В некоторых вариантах осуществления антитело 4.8.3 связывается с эпитопом в области 8Р1 мышиного АНСРТЬ3 или человеческого АЫ6РТЬ3, которая включает аминокислоты 34-37, 40 и 42 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 3 (аминокислоты 3-6, 9 и 11 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 10). Антитело 1.315.1 связывается с эпитопом в положениях остатков 42-116 мышиного АХСРТЕ3 (8Е0 ГО N0: 61).

Антитела 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35 и 5.50 нейтрализуют по меньшей мере одну активность АХСРТЕ3. Таким образом, предполагается, что антитела, которые связываются с эпитопом, связанным по меньшей мере с одним из антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 1.315.1, 5.35 и 5.50 (например, в человеческом или мышином АНСРТЬ3), также должны обладать нейтрализующей активностью. Некоторые нейтрализующие моноклональные антитела против АХСРТЕ3 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из 8Е0 ГО N0: 9, 10, 12, 13 и 61. Некоторые нейтрализующие моноклональные антитела против АХСРТЕ3 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из 8Е0 ГО N0: 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АХСРТЕ3 связывается с пептидом, имеющим последовательность 8Е0 ГО N0: 61. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против АХСРТЕ3 связывается с пептидом, имеющим последовательность 8Е0 ГО N0: 12, и пептидом, имеющим последовательность 8Е0 ГО N0: 13.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 4.7.1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 4.8.3. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 4.9.1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 5.35. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 5.50. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нейтрализующим моноклональным антителам, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 1.315.1.

Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:20. Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:22. Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 24. Некоторые нейтрализующие антитела включают легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 28. Некоторые нейтрализующие антитела включают легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 30. Некоторые нейтрализующие антитела включают легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 32.

Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 20, и легкую цепь, содержащую аминокислотную по

- 14 019661 следовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 28. Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 22, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 30. Некоторые нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 24, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 Ш N0: 32.

1. Химерные и гуманизированные моноклональные антитела

В некоторых вариантах осуществления не человеческие антитела являются химерными. В некоторых вариантах осуществления мышиные моноклональные антитела, которые специфически связываются с человеческим АХСРТЕЗ, являются химерными. Некоторые репрезентативные методы получения химерных антител описаны, например, в публикации Моглзоп е! а1. (1984) Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А 81:6851-6855; №иЬегдег е! а1. (1984) №11игс 312:604-608; Такеба е! а1. (1985) №11игс 314:452-454 и в патентах США №№ 6075181 и 5877397.

В некоторых вариантах осуществления не человеческие антитела являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления мышиные моноклональные антитела, которые специфически связываются с человеческим АХСРТЕЗ, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления мышиные моноклональные антитела, которые направлены против мышиного АХСРТЕЗ, но которые специфически связываются (то есть перекрестно реагируют) с человеческим АНСРТЬ3, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела сохраняют специфичность связывания и обладают пониженной иммуногенностью (например, они индуцируют пониженный ответ, заключающийся в продуцировании человеческого антимышиного антитела (НАМА)) при их введении человеку. В некоторых вариантах осуществления гуманизация может быть достигнута с применением определенных методов, включая, но не ограничиваясь ими, присоединение СИЯ и конструирование человеческих последовательностей, как более подробно описано ниже.

В некоторых вариантах гуманизированных антител одну или несколько гипервариабельных областей (СИЯ), происходящих от вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антитела с нужной специфичностью связывания (донорного антитела), присоединяют к человеческим каркасным областям (РЯ) акцепторного антитела.

Репрезентативные методы присоединения СИЯ описаны, например, в патентах США №№ 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Оиееп е! а1. (1989) Ргос. №1'1 Асаб. 8с1. И8А 86:10029-10033. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько СИЯ от вариабельных областей тяжелой и легкой цепей присоединяют к консенсусным человеческим РЯ акцепторного антитела. В некоторых вариантах осуществления для создания консенсусных человеческих РЯ, РЯ, происходящие от нескольких аминокислотных последовательностей человеческой тяжелой цепи или легкой цепи, сопоставляют путем выравнивания для идентификации консенсусной аминокислотной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления некоторые аминокислоты РЯ в акцепторном антителе заменяют аминокислотами РЯ донорного антитела. В некоторых таких вариантах аминокислотами РЯ донорного антитела являются аминокислоты, которые участвуют в сообщении аффинности связывания донорного антитела с антигеном-мишенью. См., например, патенты США №№ 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Онееп е! а1. (1989) Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А 86:10029-10033. В некоторых вариантах осуществления в целях моделирования донорных и/или акцепторных антител для идентификации остатков, которые вероятно участвуют в связывании с антигеном и/или в образовании структуры антигенсвязывающего сайта, используют компьютерные программы, облегчающие отбор остатков, таких как остатки РЯ, которые должны быть заменены в донорном антителе.

В некоторых вариантах осуществления СИЯ донорного антитела присоединяют к акцепторному антителу, содержащему человеческую константную область. В некоторых таких вариантах РЯ также присоединяют к акцептору. В некоторых вариантах осуществления СИЯ донорного антитела происходят от одноцепочечного Ρν-антитела. В некоторых вариантах осуществления РЯ донорного антитела происходят от одноцепочечного Ρν-антитела. В некоторых вариантах осуществления присоединенные СИЯ в гуманизированном антителе дополнительно модифицируют (например, путем введения аминокислотных замен, делеций или инсерций) для повышения аффинности связывания гуманизированного антитела с антигеном-мишенью. В некоторых вариантах осуществления присоединенные РЯ в гуманизированном антителе дополнительно модифицируют (например, путем введения аминокислотных замен, делеций или инсерций) для повышения аффинности связывания гуманизированного антитела с антигеном-мишенью.

В некоторых вариантах осуществления не человеческие антитела могут быть гуманизированы методом конструирования человеческих последовательностей. См., например, патенты США №№ 5766886 и 5869619. В некоторых вариантах конструирования человеческих последовательностей, информация о структуре вариабельных доменов антитела (например, информация, полученная в результате моделирования кристаллических структур и/или молекул) может быть использована для оценки вероятности того, что данный аминокислотный остаток в вариабельной области (а) будет участвовать в связывании с антигеном, (Ь) будет находиться на поверхности антитела (то есть будет доступным для растворителя), или (с) будет скрыт в вариабельной области антитела (то есть будет участвовать в сохранении

- 15 019661 структуры вариабельной области). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления получают консенсусные последовательности человеческой вариабельной области для идентификации остатков, которые являются консервативными среди человеческих вариабельных областей. В некоторых вариантах осуществления такая информация позволяет определить, следует ли осуществлять замену аминокислотного остатка в вариабельной области не человеческого антитела.

Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СЭК1. СЭВ2 и СЭВЗ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СИВ1, СИВ2 и СИВЗ антитела 4.8.З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СИВ1, СИВ2 и СИВЗ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СИВ1, СЭВ2 и СИВЗ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СЭРЕ СЭВ2 и СЭВЗ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую СЭРЕ СЭВ2 и СЭВЗ антитела 1.З15.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела

4.8.З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 1.З15.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела

4.8.З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат тяжелую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 1.З15.1.

Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СЭРЕ СЭВ2 и СЭВЗ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СИВ1, СЭВ2 и СИВЗ антитела 4.8.З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СЭРЕ СЭВ2 и СЭВЗ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СИВ1, СЭВ2 и СЭВЗ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СЭРЕ СЭВ2 и СЭВЗ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую СОВ1, СЭВ2 и СЭВЗ антитела 1.З15.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 4.8.З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере одну СОВ антитела 1.З15.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 4.7.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 4.8. З. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 4.9.1. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 5.З5. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 5.50. Некоторые нейтрализующие антитела содержат легкую цепь, включающую по меньшей мере две СОВ антитела 1.З15.1.

2. Изотипы антител

В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 принадлежит к любому изотипу, выбранному из 1дМ, Ι§Ό, 1дС, 1дА и 1дЕ. В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 принадлежит к изотипу 1дС. В некоторых таких вариантах антитело принадлежит к подклассу 1дС1, 1дС2, 1дСЗ или 1дС4. В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 принадлежит к изотипу 1дМ. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит к подклассу 1дМ1 или 1дМ2. В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 принадлежит к изотипу 1дА. В некоторых таких вариантах антитело принадлежит к подклассу 1дА1 или 1дА2. В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 содержит человеческую легкую цепь каппа и человеческую тяжелую цепь 1дС1 или 1дС2. В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 содержит мышиную легкую цепь каппа и мышиную тяжелую цепь 1дС1 или 1дС2.

3. Модифицированные антитела

В различных вариантах осуществления антитело модифицируют для изменения одного или нескольких его свойств. В некоторых вариантах осуществления модифицированное антитело по сравнению с немодифицированным антителом может обладать определенными преимуществами, такими как повы

- 16 019661 шенная стабильность, более длительное пребывание в кровотоке или пониженная иммуногенность (см., например, патент США № 4179337). В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируют путем его присоединения к не белковой молекуле. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируют путем изменения статуса гликозилирования антитела, например, путем изменения числа, типа, связи и/или положения присоединения углеводных цепей к данному антителу. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируют так, чтобы оно не было гликозилированным.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько химических молекул связаны с аминокислотным остовом и/или с углеводными остатками антитела. Некоторые репрезентативные методы присоединения химических молекул к антителу известны специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, реакции ацилирования или реакции алкилирования. См., например, ЕР 0401384; Ма11к е! а1. (1992), Ехр. НетаЮ1.. 20:1028-1035; Егапс1§ (1992) Еосик оп Сго\\111 РасЮгк 3(2):4-10, риЫСНеб Ьу МебСспрГ Моийат Соий, Епегп Вагпе! Ьапе, Ьопбоп N20 ΘΕΌ, ИК; ЕР 0154316; ЕР 0401384; АО 92/16221; АО 95/34326; АО 95/13312; АО 96/11953; АО 96/19459 и АО 96/19459. В некоторых вариантах осуществления любые из этих реакций осуществляют в целях генерирования антитела, которое является химически модифицированным у своего аминоконца.

В некоторых вариантах осуществления антитело связано с детектируемой меткой, такой как ферментативная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируют путем его присоединения к одному или нескольким полимерам.

В некоторых вариантах осуществления антитело присоединено к одному или нескольким водорастворимым полимерам. В некоторых таких вариантах присоединение к водорастворимому полимеру способствует уменьшению вероятности осаждения данного антитела в водной среде, такой как физиологическая среда. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело присоединено к водорастворимому полимеру. В соответствии с некоторыми осуществлениями изобретения специалист в данной области может выбрать подходящий водорастворимый полимер в зависимости от конкретных факторов, включая, но не ограничиваясь ими, такой фактор, как применение конъюгата полимер/антитело для лечения данного пациента, и если он применяется, то при выборе учитывается фармакологический профиль антитела (например, время полужизни, доза, активность, антигенность и/или другие факторы).

Некоторыми репрезентативными клинически приемлемыми водорастворимыми полимерами являются, но не ограничивается ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ); пропиональдегид полиэтиленгликоля; сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля; монометоксиполиэтиленгликоль; карбоксиметилцеллюлоза; декстран; поливиниловый спирт (ПВС); поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан; поли-1,3,6триоксан; сополимер этилена/ангидрида малеиновой кислоты; поли-в-аминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры); поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль; гомополимеры полипропиленгликоля (ППГ) и другие полиалкиленоксиды; сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида; полиоксиэтилированные полиолы (ПОП) (например, глицерин) и другие полиоксиэтилированные полиолы; полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза, колоновые кислоты или другие углеводные полимеры; и фиколл, декстран или их смеси. Некоторыми репрезентативными ПЭГ являются, но не ограничиваются ими, некоторые формы, которые используются специалистами в данной области для модификации антител, такие как моно-(С_£-С_£0)алкокси- или арилокси-ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления для такой модификации предпочтение может быть отдано ПЭГ-пропиональдегиду из-за его стабильности в воде.

В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер может иметь любую молекулярную массу. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер является разветвленным или неразветвленным. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу примерно 2-100 кДа, включая все значения между граничными значениями данного интервала. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу примерно 5-40 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу примерно 10-35 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу примерно 15-30 кДа.

В некоторых вариантах осуществления антитело присоединено к ПЭГ (то есть данное антитело является ПЭГилированным). В различных вариантах осуществления ПЭГ обладает низкой токсичностью по отношению к млекопитающим. См., например, Сагрейег е! а1. (1971) Тохюо1. Арр1. Рйагтасо1. 18:3540. Следует отметить, что ПЭГ-аддукт аденозин-дезаминазы был разрешен в Соединенных Штатах для введения человеку в целях лечения тяжелого комбинированного синдрома иммунодефицита. В различных вариантах осуществления ПЭГ может способствовать снижению иммуногенности антител. Так, например, в некоторых вариантах осуществления присоединение ПЭГ к антителу, имеющему не человеческие последовательности, может приводить к снижению антитенности такого антитела при его введении человеку.

В некоторых вариантах осуществления полимер присоединяют к одному или нескольким реакционноспособным аминокислотным остаткам антитела. Некоторыми репрезентативными реакционноспособными аминокислотными остатками являются, но не ограничиваются ими, альфа-аминогруппа аминоконцевой аминокислоты, эпсилон-аминогруппы лизиновых боковых цепей, сульфгидрильные группы

- 17 019661 цистеиновых боковых цепей, карбоксильные группы аспартильных и глутамильных боковых цепей, альфа-карбоксильная группа карбоксиконцевой аминокислоты, тирозиновые боковые цепи и активированные гликозильные цепи, связанные с некоторыми аспарагиновыми, сериновыми или треониновыми остатками. Некоторые репрезентативные активированные формы ПЭГ (реагенты ПЭГ), подходящие для непосредственного взаимодействия с белками, известны специалистам в данной области. Так, например, в некоторых вариантах осуществления, реагентами ПЭГ, подходящими для связывания с аминогруппами, являются, но не ограничиваются ими, активные сложные эфиры карбоновых кислот или карбонатные производные ПЭГ, например производные, в которых уходящими группами являются Νгидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. В некоторых вариантах осуществления реагенты ПЭГ, содержащие малеимидо- или галогенацетильные группы, используются для модификации сульфгидрильных групп. В некоторых вариантах осуществления реагенты ПЭГ, содержащие аминогруппы, гидразиновые группы и/или гидразидные группы, могут быть использованы в реакциях взаимодействия с альдегидами, образованными в результате окисления углеводных групп в белке периодатом.

В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет по меньшей мере одну реакционноспособную группу. В некоторых вариантах осуществления активированное производное водорастворимого полимера, такого как ПЭГ, получают посредством реакции взаимодействия водорастворимого полимера с активирующей группой. В некоторых вариантах осуществления активирующая группа может быть монофункциональной, бифункциональной или многофункциональной. Некоторыми репрезентативными активирующими группами, которые могут быть использованы для связывания водорастворимого полимера с двумя или более антителами, являются, но не ограничиваются ими, следующие группы: сульфон (например, хлорсульфон, винилсульфон и дивинилсульфон), малеимид, сульфгидрил, тиол, трифторметансульфонат, трезилат, азиридин, оксиран и 5-пиридил. В некоторых вариантах осуществления производное ПЭГ обычно является резистентным к гидролизу в течение длительного периода времени в водных средах при рН примерно 11 или менее. В некоторых вариантах осуществления производное ПЭГ, связанное с другой молекулой, такой как антитело, сообщает этой молекуле резистентность к гидролизу. Некоторыми репрезентативными гомобифункциональными производными ПЭГ являются, но не ограничиваются ими, ПЭГ-бис-хлорсульфон и ПЭГ-бис-винилсульфон (см. \У0 95/13312).

Ό. Некоторые методы получения моноклональных антител

1. Некоторые методы получения гибридом

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают гибридомными методами. Некоторые такие методы известны специалистам. См., например, КоЫег е1 а1. (1975) №11иге 256:495497; Наг1оте аиб Ьапе (1988) АибЬоб1ек: А ЬаЬога1огу Мапиа1 СИ. 6 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8рттд НагЬог, ΝΥ). В некоторых таких вариантах подходящих животных, таких как мыши, крысы, хомячки, обезьяны или другие млекопитающие, иммунизуют иммуногеном для продуцирования антителосекретирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления антитело-секретирующими клетками являются В-клетки, такие как лимфоциты или спленоциты. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты (например, человеческие лимфоциты) иммунизуют ίη у1уо для продуцирования антителосекретирующих клеток. См., например, ВоггеЬаск е1 а1. (1988) Ριτκ. ΝηΙ'Ι Асаб. 8с1. И8А 85:3995-3999.

В некоторых вариантах осуществления антитело-секретирующие клетки подвергают слиянию с иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия миелоидного типа, в результате чего получают гибридомные клетки. В некоторых вариантах осуществления гибридомные клетки, продуцирующие нужные антитела, идентифицируют, например, с помощью ЕЫ8А. В некоторых вариантах осуществления такие клетки могут быть затем субклонированы и культивированы стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления такие клетки могут быть также культивированы ίη у1уо в качестве асцитных опухолей в подходящем животном-хозяине. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела выделяют из среды для культивирования гибридом, из сыворотки или из асцитной жидкости стандартными методами разделения, такими как аффинная хроматография. Руководство по продуцированию гибридом и очистке моноклональных антител в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения приводится, например, в публикации Наг1оте & Ьапе (1988) АпбЬоб1ек: А ЬаЬота1огу Мапиа1 СЬ. 8 (Со1б 8рппд НагЬог ЕаЬота1оту, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ).

В некоторых вариантах осуществления мышиные моноклональные антитела получают путем иммунизации генетически модифицированных мышей иммуногеном. В некоторых таких вариантах мышами являются ΛΝ6ΡΤΕ3-дефицитные мыши, у которых функция ΛΝΟΡΤΕ3 частично или полностью отсутствует. В некоторых таких вариантах указанными мышами являются дефицитные по гену мыши, у которых отсутствует весь ген, кодирующий ΛNСΡΤ^3. или его часть. В некоторых вариантах осуществления таких дефицитных по гену мышей иммунизуют мышиным ΛNСΡΤ^3. В некоторых вариантах осуществления таких дефицитных по гену мышей иммунизуют человеческим ΛNСΡΤ^3.

В некоторых вариантах осуществления человеческие моноклональные антитела вырабатываются у трансгенных животных (например, у мышей), способных продуцировать человеческие антитела. См., например, патенты США №№ 6075181 А и 6114598 А и \У0 98/24893 А2. Так, например, в некоторых

- 18 019661 вариантах осуществления человеческие гены иммуноглобулина вводят (например, с использованием дрожжевых искусственных хромосом и человеческих хромосомных фрагментов или путем интеграции в зародышевую линию) мышам, у которых эндогенные гены 1д являются инактивированными. См., например, Ια+οϋονίΐδ е! а1. (1993) №11игс 362:255-258; Тошд/ика е! а1. (2000) Ргос. N01'1 Асаб. 8с1. И8А 97:722727; и Менбех е! а1. (1997) №11. Сенек 15:146-156 (описание линии трансгенных мышей XеηοМοиκе II®).

В некоторых вариантах осуществления таких трансгенных мышей иммунизуют иммуногеном. В некоторых таких вариантах получают лимфатические клетки (такие как В-клетки) у мышей, экспрессирующих антитела. В некоторых таких вариантах выделенные таким образом клетки подвергают слиянию с иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия миелоидного типа, в результате чего получают гибридомные клетки. В некоторых таких вариантах гибридомные клетки скринируют и отбирают для идентификации клеток, которые продуцируют антитела против представляющего интерес антигена. Некоторые репрезентативные методы и трансгенные мыши, подходящие для продуцирования человеческих моноклональных антител, описаны, например, в публикациях Ι;ι1<οόονίΐ5 е! а1. (1993) №11иге 362:255-258; Ι;ι1<οόονίΐ5 (1995) Сигг. 0ρίη. Βίοί^1ηο1. 6:561-566; Εοη^Γ§ е! а1. (1995) Ιη!'1 Реу. Iттиηο1. 13:65-93; Е1кЬ»11б е! а1. (1996) Βίο^1ηο1. 14:845-851; \1епбе/ е! а1. (1997) Сенек 15:146-156;

Сгссн (1999) 1Ь Iттиηο1. Мебюбк 231:11-23; ^тд/ика е! а1. (2000) Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 97:722-727; и рассматриваются в публикации ЬбПе е! а1. (2000) Iттиηο1. ^бау 21:364-370; и в заявке \¥0 98/24893. В некоторых вариантах осуществления человеческие моноклональные антитела против ЛНСРТкЗ являются подходящими для их использования в качестве терапевтических антител. См., например, ниже, часть У.С.

2. Некоторые методы представления

В некоторых вариантах осуществления человеческие моноклональные антитела продуцируют методом представления, таким как, например, любой из методов, описанных ниже.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело продуцируют методами фагового представления. Некоторые репрезентативные методы фагового представления антител известны специалистам и описаны, например, в публикации НοοдеηЬοοт, 0уег\зе\\· οΓ Аш^бу РНаце-Э15р1ау ТесЬм^^у аиб Нк Арр^сИю!^, Ггот Мебюбк ίη ΜοΚαιΓίΓ Βίο1οβ.ν: Аш^бу РЬаде Э1кр1ау: Мебюбк аиб Рю^^к (2002) 178:1-37 (0'Впеп аиб Л^ιкен. ебк., Нитаη Ргекк, ^(ολΥΗ, N1). Так, например, в некоторых вариантах осуществления библиотеку антител представляют на поверхности нитчатого фага, такого как нелитический нитчатый фаг Гб или М13. В некоторых вариантах осуществления такими антителами являются фрагменты антител, такие как ксГу, ЕаЬ, Εν, имеющие сконструированные межмолекулярные дисульфидные связи для стабилизации пары У_Н-У_Ъ, и димерные антитела. В некоторых вариантах осуществления могут быть затем выбраны антитела с нужной специфичностью связывания. Некоторые репрезентативные варианты методов фагового представления антител более подробно описаны ниже.

В некоторых вариантах осуществления библиотека фагового представления антител может быть получена некоторыми методами, известными специалистам. См., например, НοοдеηЬοοт, 0уеп/е\\· οΓ Аηί^Ьοбу РЬаде-Э1кр1ау ТесЬиο1οду аиб 1!к АррИс^ю^, Ггот Мебюбк ίη ΜοΚαιΓίΓ Вю^ду: Ат^бу РЬаде Э1кр1ау: Мебюбк аиб РтЮ^Ь (2002) 178:1-37 (0'Впеп аиб Л^ιкен. ебк., Нитаη Ргекк, ^(ολΥΗ, N1). В некоторых вариантах осуществления набор вариабельных генов получают с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК и кДНК, происходящих от мРНК антитело-секретирующих клеток. Так, например, в некоторых вариантах осуществления кДНК получают из мРНК В-клеток. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, амплифицируют, например, с помощью ПЦР.

В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи клонируют в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи произвольно объединяют в процессе клонирования, в результате чего получают библиотеку кДНК, кодирующую различные кску или ЕаЬ. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют, а затем клонируют в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют путем постадийного клонирования в подходящий вектор.

В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируют в вектор фагового представления, такой как фагмидный вектор. Некоторые репрезентативные фагмидные векторы, такие как рСЕ81, известны специалистам. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, присутствуют на одном и том же векторе. Так, например, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую кску, клонируют в полноразмерный ген III или его часть с сохранением рамки считывания, где указанный ген кодирует минорный белок оболочки фага рШ. В некоторых таких вариантах фагмида направляет экспрессию гибрида ^ΕνψΟ на поверхность фага. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления, кДНК, кодирующую тяжелую цепь (или легкую цепь), клонируют в полноразмерный ген III или его часть с сохранением рамки считывания, а кДНК, кодирующую легкую цепь (или тяжелую цепь), клонируют в тот же самый вектор ниже сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность направляет экспрессию легкой цепи (или тяжелой цепи) в периплазму клетки-хозяина, где тяжелая и легкая цепи подвергаются сборке с образованием ЕаЬ-фрагментов.

- 19 019661

Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления, кДНК, кодирующая тяжелую цепь, и кДНК, кодирующая легкую цепь, присутствуют на отдельных векторах. В некоторых таких вариантах кДНК тяжелой цепи и легкой цепи клонируют по отдельности, одну в фагмиду, а другую в фаговый вектор, где указанные кДНК содержат сигналы для ш νίνο рекомбинации в клетке-хозяине.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантную фагмиду или фаговые векторы вводят в подходящего бактериального хозяина, такого как Β^ο1ί. В некоторых вариантах осуществления, осуществляемых с использованием фагмиды, хозяина инфицируют хелперным фагом для доставки структурных белков фага, что позволяет экспрессировать фаговые частицы, несущие гибридный белок антителор111 на поверхности фага.

В некоторых вариантах осуществления синтезированные библиотеки антител конструируют с использованием наборов вариабельных генов, которые подвергают реаранжировке ш νίίτο. Так, например, в некоторых вариантах осуществления отдельные сегменты генов, кодирующих тяжелую или легкую цепи (У-Э-1 или У-1, соответственно), произвольно объединяют с помощью ПЦР. В некоторых таких вариантах в СОВ и, возможно, в РВ, может быть внесено дополнительное разнообразие последовательностей, например, с помощью ПЦР с вероятностью ошибки. В некоторых таких вариантах дополнительное разнообразие последовательностей может быть внесено в СОВ3, например, в Н3 тяжелой цепи.

В некоторых вариантах осуществления библиотеки представления на неиммунизованном или универсальном фаге конструируют, как описано выше, с использованием нуклеиновой кислоты, происходящей от неиммунизованного животного. В некоторых вариантах осуществления неиммунизованным животным является человек. В некоторых вариантах осуществления библиотеки представления на иммунизованном фаге конструируют, как описано выше, с использованием нуклеиновой кислоты, происходящей от иммунизованного животного. В некоторых вариантах осуществления иммунизованными животными являются человек, крысы, мыши, хомячки или обезьяны. В некоторых вариантах осуществления животных иммунизуют любыми иммуногенами, описанными ниже.

Некоторые репрезентативные универсальные библиотеки фагового представления человеческих антител получают из коммерчески доступных источников. Некоторыми репрезентативными библиотеками являются, но не ограничиваются ими, серии библиотек НиСЛЬ® от Мο^ρйοЗуκ АС (Майтк!ге1б/Мишсй, Сегтапу); библиотеки от Сгисе11 (Ье1беп, !йе №!йет1апбк), полученные методами МАйк!тас!®£; библиотека Рай-фрагментов п-СУЭеВ™ от Вю1пуеп1 (Ьипб, З\тебеп); и библиотеки, поставляемые компанией СатЬпбде Аηί^йοбу Тесйгю^ду (Сатйпбде, υΚ).

В некоторых вариантах осуществления отбор антител, обладающих нужной специфичностью связывания, из библиотеки фагового представления осуществляют путем проведения последовательных стадий пэннинга». В некоторых вариантах такого пэннинга препараты фаговых библиотек обрабатывают антигеном. В некоторых вариантах осуществления комплексы фаг-антиген промывают, а несвязанный фаг удаляют. В некоторых вариантах осуществления связанный фаг выделяют, а затем амплифицируют путем инфицирования бактерией Е^П. В некоторых вариантах осуществления фаг, продуцирующий моноклональное антитело, может быть клонирован путем сбора одиночных бляшек. В некоторых вариантах осуществления вышеописанную процедуру повторяют.

В некоторых вариантах осуществления антигеном, используемым в пэннинге, является любой из иммуногенов, описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления антиген иммобилизуют на твердом носителе для облегчения очистки антигенсвязывающего фага с помощью аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления антиген подвергают биотинилированию, что позволяет отделять связанный фаг от несвязанного фага с использованием магнитных сфер, покрытых стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления антиген может быть иммобилизован на клетках (для прямого пэннинга), в криосрезах тканей или на мембранах (например, на найлоновых или нитроцеллюлозных мембранах). Другие варианты некоторых процедур пэннинга могут быть проведены рутинными методами, известными специалистам.

В некоторых вариантах осуществления для продуцирования моноклональных антител используют дрожжевую систему представления. В некоторых таких системах антитело экспрессируется в виде гибридного белка с полноразмерным дрожжевым белком АСА2 или его частью, которые становятся представленными на поверхности стенки дрожжевой клетки. В некоторых вариантах осуществления дрожжевые клетки, зкспрессирующие антитела с нужной специфичностью связывания, могут быть затем идентифицированы путем обработки этих клеток флуоресцентно меченым антигеном. В некоторых вариантах осуществления дрожжевые клетки, связывающиеся с антигеном, могут быть затем выделены с помощью проточной цитометрии. См., например, Βοбе^ е! а1. (1997) ΝιΙ. В^есйшЕ 15:553-557.

3. Некоторые методы осуществления аффинного созревания

В некоторых вариантах осуществления аффинность антитела по отношению к конкретному антигену повышают путем обеспечения условий аффинного созревания антитела (или прямой эволюции) ш νίίτο. 1п νίνο нативные антитела подвергаются аффинному созреванию посредством соматической гипермутации с последующим отбором. Некоторые ш νίίτο способы имитируют такой ш νίνο процесс, что позволяет продуцировать антитела, аффинность которых аналогична аффинности нативных антител или

- 20 019661 превышает такую аффинность.

В некоторых вариантах аффинного созревания в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область антитела, обладающего нужной специфичностью связывания, вводят мутации. См., например, Нибкоп е1 а1. (2003) №1. Меб. 9:129-134; Вгекке е1 а1. (2002) №11. Яеу1е^к 2: 5262. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в вариабельную область тяжелой цепи, легкой цепи или обеих этих цепей. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в одну или несколько СИЯ. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в Н3, Ь3 или в обе эти цепи. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в одну или несколько РЯ. В некоторых вариантах осуществления библиотеку мутаций создают, например, в виде библиотеки фагового, рибосомного или дрожжевого представления, так, чтобы антитела с повышенной аффинностью могли быть идентифицированы стантартными методами скрининга. См., например, Вобег е1 а1. (2000) Ргос. №1'1 Асаб. δα. И8А 97:1070110705; Роо1е е1 а1. (2000) Ргос. ΝηΐΊ Асаб. δα. И8А 97: 10679-10681; НоодепЬоот, Оуегу1ете о£ АпбЬобу Р11ас|е-И|8р1ау ТесНпо1оду апб Из АррНсайопк, £гот МеШобк т Мо1еси1аг Вю1оду: АпбЬобу РНаде И1кр1ау: МеШобк апб Рго1осо1к (2002) 178:1-37 (О'Впеп апб Айкеп, ебк., Нитап Ргекк, ТоЮ\уа, N1) и Напек е1 а1. (1998) Ргос. №ΐ'1 Асаб. 8с1. И8А 95:14130-14135.

В некоторых вариантах осуществления мутации вводят посредством сайт-специфического мутагенеза, исходя из информации о структуре антитела, например, антигенсвязывающего сайта. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят посредством комбинаторного мутагенеза СИЯ. В некоторых вариантах осуществления всю последовательность, кодирующую вариабельную область или ее часть, подвергают неспецифическому мутагенезу, например, с использованием клеток-мутаторов Е.сой., посредством реаранжировки гомологичных генов или с помощью ПЦР с вероятностью ошибки. В некоторых вариантах осуществления, мутацию вводят методом перестановки ДНК. См., например, Статей е1 а1. (1996) N31. Меб. 2:100-102; Регтег е1 а1. (2004) Титог Вю1. 25:7-13.

В некоторых вариантах осуществления для продуцирования антител с повышенной аффинностью используют перестановку цепей. В некоторых вариантах перестановки цепей одну из цепей, например легкую цепь, заменяют набором легких цепей, а другую цепь, например, тяжелую цепь, оставляют неизмененной для обеспечения специфичности. В некоторых таких вариантах создают библиотеку антител с перестановленными цепями, где неизмененная тяжелая цепь экспрессируется в комбинации с каждой легкой цепью, происходящей от набора легких цепей. В некоторых вариантах осуществления такие библиотеки могут быть затем скринированы на антитела с повышенной аффинностью. В некоторых вариантах осуществления тяжелые и легкие цепи последовательно заменяют. В некоторых вариантах осуществления заменяют только вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей. В некоторых вариантах осуществления заменяют только часть вариабельных областей, например, СИЯ тяжелой и/или легкой цепей. См, например, Нибкоп е1 а1. (2003) №1. Меб. 9: 129-134; Вгекке е1 а1. (2002) №1. Яеу1е^к 2: 52-62; Капд е1 а1. (1991) Ргос. №ΐ'1 Асаб. 8ά. И8А 88: 11120-11123; Магкк е1 а1. (1992) Вю1есйпо1. 10: 779-83.

В некоторых вариантах осуществления мышиные моноклональные антитела, которые специфически связываются с человеческим ΑNСΡТ^3 (включая, но не ограничиваясь ими, мышиные моноклональные антитела, которые продуцируются против мышиного ΑNСΡТ^3. но которые специфически связываются (то есть перекрестно реагируют) с человеческим ΑNСΡТ^3). подвергают последовательной перестановке цепи. В некоторых вариантах осуществления, например, тяжелую цепь данного мышиного моноклонального антитела объединяют с новым набором человеческих легких цепей и отбирают антитела с нужной аффинностью. В некоторых таких вариантах легкие цепи выбранных антител затем объединяют с новым набором человеческих тяжелых цепей, и отбирают антитела с нужной аффинностью. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления отбирают человеческие антитела, обладающие нужной специфичностью и аффинностью связывания с антигеном.

Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления, тяжелую цепь данного мышиного моноклонального антитела объединяют с новым набором человеческих легких цепей, и в первом раунде перестановки отбирают антитела с нужной аффинностью. В некоторых вариантах осуществления легкую цепь исходного мышиного моноклонального антитела объединяют с новым набором человеческих тяжелых цепей, и во втором раунде перестановки отбирают антитела с нужной аффинностью. В некоторых вариантах осуществления человеческие легкие цепи, происходящие от антител, отобранных в первом раунде перестановки, объединяют с человеческими тяжелыми цепями антител, отобранных во втором раунде перестановки. Так, например, в некоторых вариантах осуществления отбирают человеческие антитела, обладающие нужной специфичностью и аффинностью связывания с антигеном.

В некоторых вариантах осуществления применяют метод рибосомного представления, который является альтернативой отбору антител с созреванием аффинности. В некоторых вариантах метода рибосомного представления нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, амплифицируют с помощью ОТПЦР, проводимой между стадиями отбора. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для введения мутаций в нуклеиновую кислоту могут быть использованы полимеразы, участвующие в ПЦР с вероятностью ошибки. Неограничивающий пример такого метода подробно описан в публикации Напек е1 а1. (1998) Ргос. №ΐ'1 Асаб. 8с1. И8А 95: 14130-14135.

- 21 019661

4. Некоторые рекомбинантные методы

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают рекомбинантными методами. См., например, патент США № 4816567. В некоторых таких вариантах нуклеиновую кислоту, кодирующую цепи моноклональных антител, клонируют и экспрессируют в подходящую клеткухозяина. Так, например, в некоторых вариантах осуществления РНК может быть получена из клеток, экспрессирующих нужное антитело, таких как зрелые В-клетки или гибридомные клетки, стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления РНК может быть затем использована для получения кДНК стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую полипептид тяжелой или легкой цепи, амплифицируют, например, с помощью ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируют в подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор затем трансформируют или трансфицируют в подходящую клетку-хозяина, такую как клетка-хозяин, которая эндогенно не продуцирует данное антитело. Некоторыми репрезентативными клетками-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, Е.со11, клетки СО8, клетки яичника китайского хомячка (СНО) и миеломные клетки. В некоторых вариантах осуществления, в которых тяжелая и легкая цепи коэкспрессируются в одном и том же хозяине, может быть выделено реконструированное антитело.

В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую или легкую цепь, может быть модифицирована. Так, например, в некоторых вариантах осуществления константная область мышиной тяжелой или легкой цепи может быть заменена константной областью человеческой тяжелой или легкой цепи. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления может быть получено химерное антитело, которое имеет константные области человеческого антитела, но при этом сохраняют специфичность связывания мышиного антитела.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные антитела могут быть экспрессированы в некоторых клеточных линиях. В некоторых вариантах осуществления последовательности, кодирующие конкретные антитела, могут быть использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения такая трансформация может представлять собой любой известный метод введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Некоторыми репрезентативными методами являются, но не ограничиваются ими, упаковка полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукция клетки-хозяина вирусом (или вектором), а также осуществление некоторых процедур трансфекции, известных специалистам и описанных в патентах США №№ 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455. В некоторых вариантах осуществления используемая процедура трансформации может зависеть от способности данного хозяина к трансформации. Некоторые репрезентативные методы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, опосредуемая декстраном трансфекция, преципитация фосфатом кальция, опосредуемая полибреном трансфекция, слияние протопластов, электропорация, инкапсуляции полинуклеотида(ов) в липосомы и прямая микроинжекция ДНК в ядро.

Некоторые репрезентативные клеточные линии млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве экспрессирующих хозяев, известны специалистам, и такими клеточными линиями являются, но не ограничиваются ими, многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки почек обезьян (СО8), человеческие клетки гепатоцеллюлярной карциномы (например, Не]э С2) и ряд других клеточных линий. В некоторых вариантах осуществления клеточные линии могут быть отобраны путем определения клеток, которые продуцируют высокие уровни антител, специфически связывающихся с ΑΝΟΡΤΕ3.

Е. Некоторые полипептидные иммуногены

В некоторых вариантах осуществления, для продуцирования антител, животных иммунизируют иммуногеном. В некоторых вариантах осуществления таким иммуногеном является полипептид, содержащий ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления иммуногеном является полипептид, содержащий фрагмент ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления таким иммуногеном является полипептид, содержащий Ν-концевой суперсприрализованный домен ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления таким иммуногеном является полипептид, содержащий область 8Р1 ΑΝΟΡΤΕ3.

В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает мышиный ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает человеческий ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает мышиный ΑΝΟΡΤΕ3, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 Ш ΝΟ: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает человеческий ΑΝΟΡΤΕ3. содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 Ш ΝΟ: 3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент мышиного ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент 8Е0 Ш ΝΟ: 1 от остатка 17 до остатка 240. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 59. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит 8ЕО Ш ΝΟ: 1 от остатка 32 до остатка 57. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 9. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 61. В

- 22 019661 некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит фрагмент человеческого АЫСРТЬ3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит фрагмент 8ЕО ΙΌ N0: 3 от остатка 20 до остатка 243. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 60. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит фрагмент 8Е0 ΙΌ N0: 1 от остатка 32 до остатка 57. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10.

В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит любой пептид, состоящий примерно из 10-20 смежных аминокислот от остатка 17 до остатка 240 8Е0 ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит любой пептид, состоящий примерно из 10-20 смежных аминокислот от остатка 20 до остатка 243 8Е0 ΙΌ N0: 3. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит один или несколько пептидов, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 9, 10, 12, 13, 59, 60 и 61. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит пептид, выбранный из 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, содержащий одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 59 и 60. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 12, 13 и 61. В некоторых вариантах осуществления выбирают пептид, который, вероятно, является иммуногенным. В некоторых таких вариантах выбранный пептид, вероятно, является гидрофильным и/или находится на поверхности нативного АНСРТЬ3 и имеет определенную укладку. Репрезентативный метод отбора подходящих иммуногенных пептидов описан, например, в руководстве Аи8иЬе1 е! а1. (1989) Ситгеп! РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг В1о1оду СИ. 11.14 (ίοΐιη \УПеу & 8οηδ, НУ); и Наботе апб Ьапе (1988) АпбЬоб1е§: А ЬаЬотаЮту Мапиа1 СИ. 5 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота!огу, Со1б 8рппд НагЬог, NΥ).

Для того чтобы определить, является ли пептидный сегмент белка гидрофильным, а поэтому он находится на поверхности белка, существуют определенные репрезентативные алгоритмы, известные специалистам в данной области. В некоторых таких алгоритмах для достижения указанных предсказаний используется информация о первичной последовательности белка. Некоторые такие алгоритмы разработаны на основе метода, описанного, например, Норр & \Уооб5 (1981) Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А 78:38243828, или Ку!е & Ооо1И(1е (1982) ί. Мо1. В1о1. 157: 105-132. Для предсказания вторичной структуры белка на основе информации о первичной аминокислотной последовательности белка существуют некоторые репрезентативные алгоритмы, известные специалистам. См., например, Сотдап е! а1. (1982) Сотри!. Ргодгатк Вютеб. 3: 163-168. Некоторые такие алгоритмы разработаны на основе метода, описанного, например, СИои & Рактап (1978) Апп. Кеу. ВюсИет. 47: 25-276. В некоторых вариантах осуществления пептидные сегменты, которые, как было предсказано, образуют α-витки, а поэтому они могут находиться на поверхности белка, могут быть выбраны в качестве иммуногенов.

В некоторых вариантах осуществления животное иммунизуют иммуногеном и одним или несколькими адъювантами. В некоторых вариантах осуществления адъювант используют для повышения иммунного ответа в зависимости от вида хозяина. Некоторыми репрезентативными адъювантами являются, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные соли, такие как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, поверхностно-активные вещества, хитозан, лизолецитин, полиолы плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии и человеческие адъюванты, которые могут быть использованы, такие как ВСС (бацилла Кальметта-Герена) и СогупеЬасЮгшт ратуит. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ на иммуноген, например пептидный иммуноген, может быть увеличен посредством присоединения иммуногена к другой иммуногенной молекуле или белкуносителю. Некоторыми репрезентативными белками-носителями являются, но не ограничиваются ими, гемоцианин лимфы улитки (КЬН), столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид, овальбумин, холерный токсоид и их иммуногенные фрагменты. Репрезентативный метод присоединения пептидных иммуногенов к белкам-носителям описан, например, в руководстве Аи8иЬе1 е! а1. (1989) Ситгеп! РгоЮсоК ш Мо1еси1аг Вю1оду СИ. 11.15 (До1т \УПеу & 8опк, КУ) и Наботе & Ьапе (1988) АпбЬоб1е§: А ЬаЬотаЮту Мапиа1 СИ. 5 (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬотаЮту, Со1б 8рппд НагЬог, ПУ).

В некоторых вариантах осуществления любой из вышеописанных иммуногенов может быть получен стандартными рекомбинантными методами. Так, например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий мышиный или человеческий АNСРΤ^3. или фрагмент этого полинуклеотида, могут быть клонированы в подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 8Е0 ΙΌ N0: 6. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор затем вводят в подходящую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления полипептид затем выделяют из клетки-хозяина стандартными методами. Некоторые репрезентативные методы экспрессии рекомбинантных белков описаны, например, в руководстве Аи8иЬе1 е! а1. (1991) Ситгеп! РтоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду СИ. 16 (бо11п \УПеу & 8опк, МУ).

Р. Некоторые анализы

1. Некоторые анализы на связывание

В некоторых вариантах осуществления антитела подвергают скринингу на связывание с АНСРТЬ3 с применением некоторых рутинных методов детектирования связывания антитела с антигеном. Так,

- 23 019661 например, в некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связываться с ΛΝ6ΡΤΡ3 анализируют стандартными методами иммуноблоттинга, такими как Вестерн-блот-анализ. См., например, АикиЬе1 е! а1. (1992) Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду СИ. 10.8 (1оИп ^йеу & Зопк, ΝΥ); Иаг1о\\· апб Ьапе (1988) Ап!1Ьоб1ек: А БаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8рппд ИагЬог БаЬога!огу, Со1б 8рппд ИагЬог, ΝΥ). В некоторых вариантах осуществления ΛNСРΤ^3. используемый в таких анализах, может быть либо изолированным, либо он может присутствовать в сложной смеси белков и/или макромолекул.

В некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связываться с АЫСРТБ3 анализируют с помощью анализа на конкурентное связывание, который позволяет оценивать способность антитела-кандидата конкурировать с известным анти-ΛNСРΤ^3 антителом за связывание с АУСРТЬ·.!. В некоторых вариантах осуществления известным анти-ΛNСРΤ^3 антителом является любое из моноклональных антител, описанных ниже в части νΐ.Τ В некоторых вариантах осуществления анализ на конкурентное связывание осуществляют с помощью ЕБ18А. См., например, Иаг1о\\· & Ьапе (1988) АпйЬоб1ек: А БаЬога!огу Мапиа1 СИ. 14 (Со1б 8рппд ИагЬог БаЬога!огу, Со1б 8рппд ИагЬог, ΝΥ).

В некоторых вариантах осуществления анализ на связывание проводят для количественной оценки кинетики связывания (например, константы скорости) или аффинности связывания (например, константы ассоциации или диссоциации) антитела против АУСРТЬ^. В некоторых вариантах осуществления кинетику или аффинность связывания определяют в твердой фазе с использованием иммобилизующего антигена (например, АУСРТЬ^) на твердом носителе. Иммобилизованный антиген захватывает антитело из раствора. В некоторых вариантах осуществления кинетику или аффинность связывания определяют в твердой фазе с использованием иммобилизующего антитела (например, антитела против АУСРТЬ·.!) на твердом носителе. Иммобилизованное антитело захватывает антиген из раствора.

В некоторых вариантах осуществления кинетику связывания или аффинность связывания определяют методами на основе ЕБ18А. В некоторых вариантах осуществления кинетику связывания или аффинность связывания определяют биосенсорным методом, таким как метод поверхностного плазмонного резонанса В1асоге (В1асоге, Р|кса1а\\'ау, Ν1). Некоторые такие методы известны специалистам в данной области. См., например, МсСаГГейу е! а1. (ебк.) (1996) АпйЬобу Епдшееппд: А Ргасйса1 АрргоасИ (1КБ, ОхБогб, иК); Со1бЬегд е! а1. (1993) Сигг. Орт. 1ттипо1. 5:278-281; Каг1ккоп е! а1. (1991) 1. 1ттипо1. Ме!Иобк 145:229-240; Ма1тсртк1 (1993) Сигг. Орт. 1ттипо1. 5:282-286, а обзорное описание см. в публикации Иоодепкоот, Оуепте\у оГ АпйЬобу РИаде-ЭйрИу ТесИпо1оду апб 1!к Аррйсайопк, йот Ме!Иобк ш Мо1еси1аг Вю1оду: АпйЬобу РИаде О1кр1ау: Ме!Иобк апб Рго!осо1к (2002) 178:1-37 а! 19 (О'Впеп апб Айкеп, ебк., Итпап Ргекк, То1о\уа, Ν1).

В некоторых вариантах осуществления определяют кинетику связывания или аффинность связывания РаЬ-фрагмента, который специфически связывается с ΛNСРΤ^3. В некоторых случаях РаЬфрагменты не обладают способностью к мультимеризации. Однако, в некоторых случаях, мультимеризация может затруднять определение кинетики связывания и аффинности связывания в твердофазных методах. См., например, ^одепЬоот, Оуег\те\у оГ АпйЬобу РИаде-01кр1ау ТесИпо1оду апб Йк АррйсаЦопк, Ггот Ме!Иобк ш Мо1еси1аг Вю1оду: АпйЬобу РИаде О1кр1ау: Ме!Иобк апб Рго!осо1к (2002) 178:1-37 а! 19 (О'Впеп апб Айкеп, ебк., Итпап Ргекк, ТоЮ\\'а, Ν1). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагмент, который специфически связывается с ΛNСРΤ^3. может быть использован в анализе на связывание, в котором антиген иммобилизован на твердом носителе, таком как, например, анализ ЕБ18А или В1асоге. В некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагменты получают из интактного антитела, которое специфически связывается с АУСРТИ.!, с применением ферментативных методов. В некоторых вариантах осуществления РаЬ-фрагменты получают путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих РаЬ-фрагменты, в системе рекомбинантной экспрессии, такой как система, описанная выше в части ν.Ό.3.

В некоторых вариантах осуществления кинетику связывания или аффинность связывания антитела против АЫСРТБ3 определяют методами с использованием жидкой фазы. В таких методах кинетику или аффинность связывания определяют для комплекса антитело-антиген в растворе. Некоторые такие методы известны специалистам в данной области. Неограничивающим примером такого метода является кинетический анализ на исключение или КтЕхА. См., например, В1аке е! а1. (1996) 1. Вю1. СИет. 271 :27677-27685; Эгаке е! а1. (2004) Апа1. Вюскет. 328:35-43 (сравнение твердофазного метода В1асоге и метода с использованием жидкой фазы К1пЕхА). В некоторых вариантах осуществления оборудование для проведения К1пЕхА поставляется компанией 8ар1бупе 1пк1гнтеп1к, 1пс. (Во1ке, ГО).

В некоторых вариантах осуществления кинетику связывания или аффинность связывания поливалентного антитела или антитела, которое подвергается мультимеризации, определяют методом с использованием жидкой фазы. В некоторых случаях кинетику связывания или аффинность связывания поливалентного антитела или антитела, которое подвергается мультимеризации, определяют с помощью анализа в жидкой фазе.

В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-АЫСРТБ3 антитела, измеренная по его К_с, составляет 10^-6 М или менее. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-ΛNСРΤ^3 антитела составляет примерно 10^-7 М, примерно 10^-8 М или примерно 10^-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления анти-ΛNСРΤ^3 антитело может быть использовано в ка

- 24 019661 честве терапевтического антитела. См., например, Нибюн с1 а1. (200З) N31. Меб. 9: 129-1З4. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания, составляющая менее чем 10^-9 М (например, аффинность связывания в пределах от примерно 500 до примерно 0,5 пМ, включая, но не ограничиваясь ими, аффинность связывания от примерно 100 до примерно 5 пМ), может быть достигнута, например, с применением методов аффинного созревания. См., например, Βοбе^ е1 а1. (2000) Ргос. N31'1 Асаб. 8с1. И8А 97: 10701-10705. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-АNСРТ^3 антитела составляет менее чем примерно 5х 10^-8 М.

В некоторых вариантах осуществления моноклинальное антитело против мышиного АNСРТ^3 подвергают скринингу на специфическое связывание с человеческим АNСРТ^3 с применением некоторых рутинных методов детектирования, например, методов, описанных в настоящей заявке. Способность моноклонального антитела связываться (то есть перекрестно реагировать) с мышиным и человеческим АNСРТ^3 указывает на присутствие одного и того же эпитопа в мышином и человеческом АNСРТ^3. В некоторых вариантах методов детектирования, которые проводят в денатурирующих условиях (например, в вестерн-блот-анализе), способность перекрестно реагировать означает, что мышиное моноклональное антитело связывается с одним и тем же самым линейным эпитопом в мышином и человеческом АNСРТ^3. В некоторых вариантах методов детектирования, которые проводят в не денатурирующих условиях, способность перекрестно реагировать означает, что мышиное моноклональное антитело связывается с одним и тем же самым эпитопом (например, с линейным эпитопом или с конформационным эпитопом) в мышином и человеческом АNСРТ^3.

2. Некоторые методы картирования эпитопов

В различных вариантах осуществления эпитоп, с которым связывается моноклональное антитело, идентифицируют с помощью любого из различных анализов. Некоторые репрезентативные анализы описаны, например, в публикации Μοιτίδ, Мебюбк ίη Μο^αιΡίΓ Βίοίοβν. νοί. 66: Ер1ГОре Марртд Рю^ток (1996) (Нитам Ргекк, ^ΐο·™, N1). Так, например, картирование эпитопов может быть достигнуто с помощью анализов на экспрессию генных фрагментов или анализов с использованием пептидов. В некоторых вариантах анализов на экспрессию генных фрагментов, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты АNСРТ^3. экспрессируют в прокариотических клетках и выделяют. В некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связываться с этими фрагментами затем оценивают, например, посредством иммунопреципитации или иммуноблоттинга. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты АNСРТ^3. транскрибируют и транслируют ίη νίίτο в присутствии радиоактивных аминокислот. Затем радиоактивно меченые фрагменты АNСРТ^3 тестируют на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления фрагменты АNСРТ^3 получают путем протеолитической фрагментации. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют с использованием библиотек рандомизированных пептидов, представленных на поверхности фага или дрожжей. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют путем тестирования библиотеки перекрывающихся синтетических пептидных фрагментов АNСРТ^3 на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют с помощью анализа на конкурентное связывание, такого как анализ, описанный ниже. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может быть затем определен методом аланинсканирующего мутагенеза, например, как описано ниже.

3. Некоторые анализы на конкурентное связывание

В некоторых вариантах осуществления идентифицируют моноклональные антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом АNСРТ^3. с которым связывается представляющее интерес моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют путем картирования эпитопа, например, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют с помощью рутинных анализов на конкурентное связывание. См., например, ΗπΊολν & Ьам (1988) Ай^бхек: А ^аЬο^аΐο^у Маша1 с11. 14 (С.о1б 8ргшд ΗπΤογ ^аЬο^аΐο^у, Сю1б 8ргшд ΗπΤογ, NΥ). В неограничивающем репрезентативном анализе на конкурентное связывание АNСРТ^3 или его фрагмент иммобилизуют на лунках многолуночного планшета. В некоторых вариантах осуществления представляющее интерес моноклональное антитело метят флуоресцентной меткой (в некоторых вариантах флуоресцеинизотиоцианатом) с применением стандартных методов. В некоторых вариантах осуществления в лунки добавляют смеси представляющего интерес меченого моноклонального антитела и немеченого тестируемого моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления флуоресценцию в каждой лунке количественно оценивают для определения уровня блокирования связывания представляющего интерес меченого моноклонального антитела немеченым тестируемым моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела, предположительно, имеют общий эпитоп, если каждое антитело блокирует связывание другого антитела на 50% или более. Репрезентативные анализы на конкурентное связывание также описаны, например, в публикации Μοττίκ, МеРюбк ίη Μο^αιΡίΓ Βίοίοβν νο1.66: Ер1ГОре Марртд Р^οΐοсο1κ (1996) (Нитам Ргекк, ТсФ^а, N1). Неограничивающий репрезентативный анализ на конкурентное связывание описан ниже в части νΐ.Ο.

- 25 019661

4. Некоторые анализы на идентификацию нейтрализующих антител

В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела скринируют на антитела, которые являются нейтрализующими, то есть снижают активность АНСРТЬЗ ίη νίνο и/или ίη νίΐτο. В некоторых вариантах осуществления активностью АЫСРТЬЗ является способность АНСРТЬЗ ингибировать ЛПЛ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело идентифицируют по его способности повышать ЛПЛ-активность в присутствии АНСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, по сравнению с контрольным антителом, повышает ЛПЛ-активность по меньшей мере примерно на 20, З0, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95%. Некоторые репрезентативные анализы на определение ЛПЛ-активности ίη νίνο и ίη νίΐτο известны специалистам.

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое снижает активность АНСРТЬЗ ίη νίνο, идентифицируют по его способности снижать уровень по меньшей мере одного липида в сыворотке. Некоторыми репрезентативными сывороточными липидами являются, но не ограничиваются ими, триглицериды, холестерин и свободные жирные кислоты. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело по сравнению с контрольным антителом снижает уровень по меньшей мере одного липида в сыворотке по меньшей мере примерно на 10, 20, З0, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95%. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое снижает активность АНСРТЬЗ ίη νίνο, идентифицируют по его способности нейтрализовать некоторые побочные эффекты, обусловленные приемом пищи, содержащей жир, или сообщать толерантность к таким побочным эффектам. Некоторыми репрезентативными побочными эффектами являются, но не ограничиваются ими, увеличение массы тела, ожирение, непереносимость глюкозы (гипергликемия), инсулинорезистентность (гиперинсулинемия), стеатоз печени (жирная печень) и аккумуляция липидов в клетках мышечной ткани.

С. Некоторые фармацевтические композиции и способы лечения с использованием нейтрализующих моноклональных антител

В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело может быть использовано в качестве терапевтического антитела. Некоторыми репрезентативными нейтрализующими антителами, используемыми в качестве терапевтических антител, являются, но не ограничиваются ими, химерные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела. Применение некоторых антител в качестве терапевтических средств известно специалистам в данной области. Так, например, с середины 1980-х гг. Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (ΡΌΑ) было разрешено к применению свыше двенадцати антител в качестве терапевтических средств. См., например, Нибюо е1 а1. (200З) N31. Меб. 9: 129-1З4; Сига (2002) №11иге 417: 584-586; Вгекке е1 а1. (2002) N31. Кеу1е\\ъ 2: 52-62. Некоторыми антителами, применение которых было разрешено ΡΌΑ, являются антитела, которые могут быть использованы для лечения различных раковых заболеваний, воспалений и вирусных инфекций, а также для предупреждения отторжения трансплантата. См., например, Сига (2002) №11иге 417: 584-586; Вгекке е1 а1. (2002) N31. Кеу1е\\'5 2: 52-62. Кроме того, в настоящее время, клинические испытания проходят свыше двенадцати антител. См., например, Вгекке е1 а1. (2002) №1. Кеу1е\\ъ 2: 52-62.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения расстройства, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, где указанный способ включает введение эффективного количества нейтрализующего антитела против АНСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения острого заболевания, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, где указанный способ включает введение эффективного количества нейтрализующего антитела против АЫСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения хронического заболевания, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, где указанный способ включает введение эффективного количества нейтрализующего антитела против АНСРТЬЗ. В некоторых вариантах осуществления способ лечения расстройства, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, также включает введение эффективного количества нейтрализующего антитела против АНСРТЬТ. См., например, публикацию РСТ № 00 2006/074228.

Используемый здесь термин нарушение метаболизма липидов включает, но не ограничивается ими, расстройства, которые могут приводить к развитию вторичной гиперлипидемии (включая гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию). Некоторыми репрезентативными расстройствами, ассоциированными с нарушением метаболизма липидов, являются, но не ограничиваются ими, атеросклероз, дислипидемия, гипертриглицеридемия (включая гипертриглицеридемию, индуцированную лекарственными средствами, гипертриглицеридемию, индуцированную диуретиками, гипертриглицеридемию, индуцированную употреблением алкоголя, гипертриглицеридемию, индуцированную действием агента, блокирующего β-адренергические рецепторы, гипертриглицеридемию, индуцированную эстрогеном, гипертриглицеридемию, индуцированную глюкокортикоидами, гипертриглицеридемию, индуцированную ретиноидами, гипертриглицеридемию, индуцированную циметидином, и наследственную гипертриглицеридемию), острый панкреатит, ассоциированный с гипертриглицеридемией, хиломикронный синдром, хиломикронемия, заболевание, ассоциированное с дефицитом Аро-Е, заболевание, ассоциированное с дефицитом или с недостаточной активностью ЛПЛ; гиперлипидемия (включая наследственную

- 26 019661 комбинированную гиперлипидемию), гиперхолестеринемия, подагра, ассоциированная с гиперхолестеринемией, ксантоматоз (подкожные отложения холестерина), заболевание коронарной артерии (также называемое ишемической болезнью сердца), воспаление, ассоциированное с заболеванием коронарной артерии; рестеноз, заболевания периферических сосудов и инсульт. Некоторыми репрезентативными нарушениями метаболизма липидов являются, но не ограничиваются ими, расстройства, ассоциированные с изменением массы тела, такие как ожирение, метаболический синдром, включая независимые компоненты метаболического синдрома (например, центральное ожирение, заболевание, ассоциированное с изменением содержания сахара в крови натощак/преддиабет/диабет, гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия и гипертензия), гипотиреоидит, уремия и другие состояния, ассоциированные с увеличением массы тела (включая быстрое увеличение массы тела), потерей массы тела, длительной потерей массы тела или с риском увеличения массы тела после ее потери. Некоторыми репрезентативными расстройствами, ассоциированными с нарушением метаболизма липидов, являются, но не ограничиваются ими, родственные расстройства, ассоциированные с нарушением уровня сахара в крови, такие как диабет, гипертензия и синдром поликистоза яичника, ассоциированный с инсулинорезистентностью. Некоторыми репрезентативными расстройствами, ассоциированными с нарушением метаболизма липидов, являются, но не ограничиваются ими, заболевание, ассоциированное с трансплантацией почек, нефротический синдром, синдром Кушинга, акромегалия, системная красная волчанка, дисглобулинемия, липодистрофия, гликогеноз типа I и болезнь Аддисона.

Расстройствами, ассоциированными с нарушением метаболизма липидов, являются, но не ограничиваются ими, вторичная гипертриглицеринемия (ГТГ, включая, но не ограничиваясь ею, ГТГ типа I, V и IV), включая, но не ограничиваясь ими, ГТГ, ассоциированная с нарушением питания (включая, но не ограничиваясь ими, заболевание, ассоциированное с чрезмерным употреблением алкоголя) и приемом лекарственных средств (включая, но не ограничиваясь ими, экзогенный эстроген, тамоксифен, ретиноиды, тиазиды, хлорталидон, бета-блокаторы, ингибиторы протеазы (включая, но не ограничиваясь ими, ритонавир), а также вливанием пропофола и парентеральными вливаниями липидов)), расстройства, ассоциированные с нарушением метаболизма (включая, но не ограничиваясь ими, диабет, осложнения при беременности, хроническая почечная недостаточность, гипотиреоидит, наследственная гиперлипидемия и панкреатит).

Расстройствами, ассоциированными с нарушением метаболизма липидов, являются, но не ограничиваются ими, нарушения липидного обмена, ассоциированные с нарушением функции сосудов; нарушения липидного обмена, ассоциированные с пролиферативными заболеваниями, включая, но не ограничиваясь ими, новообразования (включая, но не ограничиваясь ими, рак предстательной железы, почек, печени, молочной железы, яичника, легких и поджелудочной железы); расстройства, возникающие в результате воспаления, включая, но не ограничиваясь ими, расстройства, ассоциированные, например, с инфекционными заболеваниями; заболевания, ассоциированные с заживлением ран; синдромы иммунодефицита (СПИД и другие синдромы, включая, но не ограничиваясь ими, синдромы, ассоциированные с нарушением развития организма), образование рубцов, атеросклероз, рестеноз и отторжение трансплантата, аутоиммунные расстройства и хронические воспалительные заболевания и расстройства, которыми являются, но не ограничиваются ими, заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, и расстройства, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Крона, колит, воспалительное заболевание кишечника, острый артрит, включая болезнь Лайма, инсулинзависимый диабет, специфические аутоиммунные заболевания органов, рассеянный склероз, тиреоидит Хашимото и болезнь Грейвса; синдром Сьегрена, контактный дерматит, псориаз, склеродермия, реакция трансплантат против хозяина, саркоидоз, малярия, сепсис, панкреатит, атопические состояния, включая, но не ограничиваясь ими, астму и аллергию, включая, но не ограничиваясь ими, аллергический ринит, аллергии желудочно-кишечного тракта, включая, но не ограничиваясь ими, пищевые аллергии, эозинофилию, конъюнктивит и гломерулонефрит; расстройства, ассоциированные с нарушением свертывания крови, эндотоксический шок и другие опосредуемые воспалением расстройства, такие как апноэ во сне и бессонница.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения расстройства, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, где указанный способ включает введение эффективного количества антитела против АКСРТЬ-Л и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство вводят в эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления дополнительным терапевтическим средством является другое антитело против АКСРТЬ-Л. В некоторых вариантах осуществления дополнительным терапевтическим средством является нейтрализующее антитело против АНСРТЕА. См., например, публикацию РСТ № \¥0 2006/074228. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой средство, не являющееся антителом. В некоторых вариантах осуществления дополнительным терапевтическим средством является средство, которое снижает уровень одного или нескольких липидов в сыворотке. Некоторыми дополнительными репрезентативными терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, ингибиторы синтеза холестерина (статины), такие как ингибиторы НМС-СоА-редуктазы (например, ловастатин, сим

- 27 019661 вастатин, правастатин и флувастатин); секвестранты желчных кислот, такие как холестирамин и другие смолы; ингибиторы секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), такие как ниацин; липофильные антиоксиданты, такие как пробукол; ингибиторы ацил-СоА-холестерин-ацилтрансферазы; антагонисты фарнезоидного рецептора X; активаторы белка, активирующего расщепление регуляторного белка, связывающегося со стиролом (8САР); ингибиторы белка-переносчика микросомных триглицеридов (МТР) и АроЕ-родственный пептид. В некоторых вариантах осуществления дополнительным терапевтическим средством является средство, повышающее уровень липопротеинов высокой плотности (ЛВП). Неограничивающими примерами таких средств являются, но не ограничиваются ими, ингибиторы белка-переносчика холестерилового эфира (СЕТР).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество антитела против ΑΝΟΡΤΕ3 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или адъювант. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела против ΑΝΟΡΤΕ3 и эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства в комбинации с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солюбилизатором, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство выбирают из описанных выше средств.

В некоторых вариантах осуществления вещества, применяемые для приготовления фармацевтических композиций, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает вещества, которые могут быть использованы для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмомолярности, вязкости, чистоты, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости диссоциации или высвобождения, адсорбции или пенетрации данной композиции. В некоторых вариантах осуществления веществами, подходящими для приготовления такой композиции, являются, но не ограничиваются ими, аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин); противомикробные средства; антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, сульфит натрия и бисульфит натрия); буферы (например, борат, бикарбонат, трис-НС1, цитраты, фосфаты и другие органические кислоты); агенты, придающие объем (например, маннит и глицин); хелатообразующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΑ)); агенты, образующие комплексы (например, кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин и гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза и декстрины); белки (например, сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины); красители, ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (например, натрия); консерванты (например, хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и пероксид водорода); растворители (например, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль); спирты ряда сахаров (например, маннит и сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (например, плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты (например, полисорбат 20 и полисорбат 80), тритон, трометамин, лецитин, холестерин и тилоксапал); агенты, повышающие стабильность (например, сахароза и сорбит); агенты, повышающие тоничность (например, галогениды щелочных металлов (например, хлорид натрия или калия), маннит и сорбит); носители для доставки; разбавители; наполнители; и фармацевтические адъюванты. (Кеттдоп'к РЬагтасеийса1 8с1епсе§, 18⁴¹¹ ЕбШоп, А. К. Сеппаго, еб., Маск РиЬШЫпд Сотрапу (1990).

В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑNСΡΤ^3 или другая терапевтическая молекула связаны с носителем, увеличивающим время полужизни таких молекул. Некоторые репрезентативные носители, увеличивающие время полужизни таких молекул, известны специалистам. Некоторыми такими носителями являются, но не ограничиваются ими, Ес-домен, полиэтиленгликоль и декстран. Некоторые такие носители описаны, например, в опубликованной заявке РСТ № АО 99/25044.

В некоторых вариантах осуществления оптимальная фармацевтическая композиция может быть получена самим специалистом в данной области в зависимости, например, от нужного способа введения, формы доставки и желаемой дозы. См., например, ЕеттЦоп'к РЬагтасеийса1 8с1епсе§, см. выше. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, скорость ш νί\Ό высвобождения или скорость ш νί\Ό клиренса нейтрализующего антитела.

В некоторых вариантах осуществления основной наполнитель или носитель в фармацевтической композиции, по своей природе, может быть водным или безводным. Так, например, в некоторых вариантах осуществления подходящими наполнителями или носителями могут быть вода для инъекции, физиологический раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, в которые могут быть добавлены другие вещества, обычно используемые в композициях для парентерального введения. Некоторыми репрезентативными носителями являются, но не ограничиваются ими, нейтрально забуференный физиологический раствор и физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат трис-буфер с рН примерно 7,0-8,5

- 28 019661 или ацетатный буфер с рН примерно 4,0-5,5, которые могут также включать сорбит или его подходящий заменитель. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, может быть получена для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей нужную степень чистоты, с необязательными технологическими добавками (Кеттдои'к Рйагтасеийса1 8аспсс5. см. выше), в форме лиофилизованного осадка или водного раствора. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, может быть приготовлена в виде лиофилизата с использованием соответствующих наполнителей, таких как сахароза.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для парентерального введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, для перорального введения. Некоторые репрезентативные методы получения фармацевтически приемлемых композиций известны специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления компоненты композиции присутствуют в концентрациях, которые являются подходящими для данного участка введения. В некоторых вариантах осуществления для поддержания композиции при физиологическом рН или при несколько более низких рН, обычно при рН в пределах примерно от 5 до 8, используются буферы.

В некоторых вариантах осуществления, в которых рассматривается парентеральное введение, фармацевтическая композиция может быть получена в форме апирогенного парентерально приемлемого водного раствора, содержащего нужное антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие дополнительных терапевтических средств, в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления носителем для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, получают в виде соответствующим образом консервированного стерильного изотонического раствора. В некоторых вариантах осуществления препарат может включать композицию нужной молекулы с агентом, таким как микросферы для инъекций, биологически разлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), сферы или липосомы, которые могут быть приготовлены для регулируемого или пролонгированного высвобождения продукта, который затем может быть доставлен с помощью депо-инъекции. В некоторых вариантах осуществления может быть также использована гиалуроновая кислота, которая может увеличивать время пребывания препарата в кровотоке. В некоторых вариантах осуществления для введения нужной молекулы могут быть использованы имплантируемые устройства, содержащие лекарственное средство для доставки.

В некоторых вариантах осуществления может быть приготовлена фармацевтическая композиция, предназначенная для введения путем ингаляции. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, может быть приготовлено в виде сухого порошка для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления раствор для ингаляции, содержащий антитело против ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, может быть приготовлен вместе с пропеллентом для доставки в виде аэрозоля. В некоторых вариантах осуществления растворы могут быть введены путем распыления.

В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат может быть введен перорально. В некоторых вариантах осуществления антитело ΑNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, подходящего для введения таким способом, может быть приготовлено в виде смеси с носителями, либо в отсутствие носителей, обычно используемых для приготовления твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В некоторых вариантах осуществления капсулы могут быть предназначены для высвобождения активной части композиции в область желудочно-кишечного тракта в условиях максимизации ее биологической доступности и минимизации пресистемной деградации. В некоторых вариантах осуществления, для облегчения абсорбции антитела против ΑNСΡΤ^3 в присутствии или в отсутствие дополнительных терапевтических средств, может быть включено по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления могут быть также использованы разбавители, ароматизаторы, низкоплавкие воски, растительные масла, замасливатели, суспендирующие агенты, дезинтеграторы для таблеток и/или связующие агенты.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает эффективное количество антитела против ΑNСΡΤ^3. в сочетании по меньшей мере с одним терапевтическим средством, или в его отсутствие, а также в смеси с нетоксичными носителями, подходящими для изготовления таблеток. В некоторых вариантах осуществления растворы в виде унифицированной лекарственной формы могут быть приготовлены путем растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем носителе. Некоторыми репрезентативными примерами наполнителей являются, но не ограничиваются ими, инертные разбавители (например, карбонат кальция, карбонат натрия, бикарбонат натрия, лактоза и фос

- 29 019661 фат кальция); связующие вещества (например, крахмал, желатин и аравийская камедь) и замасливающие агенты (например, стеарат магния, стеариновая кислота и тальк).

Для специалиста в данной области очевидно, что могут быть приготовлены и другие фармацевтические композиции, включая препараты, содержащие антитело против ΛNСΡΤ^3. в сочетании по меньшей мере с одном дополнительным фармацевтическим средством, или в его отсутствие, в виде препаратов с пролонгированным или регулируемым высвобождением. Некоторыми репрезентативными препаратами с пролонгированным или регулируемым высвобождением являются, но не ограничиваются ими, липосомные носители, биологически разлагаемые микрочастицы, пористые сферы и депо-инъекции. Некоторые репрезентативные методы получения некоторых композиций известны специалистам. В некоторых вариантах осуществления препаратами с пролонгированным высвобождением могут быть полупроницаемые полимерные матрицы в форме сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Некоторыми репрезентативными матрицами пролонгированного высвобождения являются, но не ограничиваются ими, полиэфиры, гидрогели, полилактиды (см., например, патент США № 3773919 и ЕР 058481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (см., например, 81бтап е! а1. (1983) В1оро1утегк 22:547-556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (см., например, Ьапдег е! а1. (1981) ί. Вютеб. Ма!ег. Кек. 15:167-277 и Ьапдег (1982) СЬет. ΤесЬ. 12:98-105), этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., см. выше) и поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988). В некоторых вариантах осуществления композиции пролонгированного высвобождения могут включать липосомы, которые в некоторых вариантах осуществления могут быть получены любыми из некоторых методов, известных специалистам. См., например, Еррйет е! а1. (1985) 1’гос. Асаб. 8с1. И8А, 82: 3688-3692; ΕΡ 036676; ΕΡ 088046 и ЕР 143949.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, которая может быть использована для т у1уо введения, обычно является стерильной. В некоторых вариантах осуществления такая стерильность может быть достигнута путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. В некоторых вариантах осуществления, в том случае, если указанная композиция является лиофилизованной, стерилизация с применением этого метода может быть проведена либо до, либо после лиофилизации и разведения. В некоторых вариантах осуществления композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизованной форме или в виде раствора. В некоторых вариантах осуществления композиции для парентерального введения обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, в пакет или флакон с раствором для внутривенного введения, имеющий крышку, протыкаемую иглой для подкожных инъекций.

В некоторых вариантах осуществления после приготовления фармацевтической композиции она может храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизованного порошка. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут храниться либо в готовой форме, либо в форме (например, лиофолизованной), которую разводят перед введением.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам для приготовления унифицированной разовой дозы лекарственной формы. В некоторых вариантах осуществления каждый набор может содержать первый контейнер, включающий осушенный белок, и второй контейнер, включающий водную композицию. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает наборы, содержащие однокамерные или многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы, заполненные жидкостью, и шприцы, заполненные лиофилизатом).

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество фармацевтической композиции, которая может быть применена в терапии и которая содержит антитело против ΛNСΡΤ^3 в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, зависит, например, от условий и целей лечения. Для специалиста в данной области очевидно, что соответствующие дозы, используемые для лечения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, могут варьироваться в зависимости, частично, от доставляемой молекулы, показаний, для которых используется антитело против ΛNСΡΤ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, способа введения и комплекции пациента (массы тела, поверхности организма или размера органа) и/или состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В некоторых вариантах осуществления для достижения оптимального терапевтического эффекта, врачклиницист может подобрать нужную дозу и изменить способ введения. В некоторых вариантах осуществления типичная доза, в зависимости от вышеупомянутых факторов, может составлять от примерно 0, 1 мг/кг массы тела пациента до примерно 100 мг/кг или более. В некоторых вариантах осуществления доза может составлять от 0,1 до примерно 100 мг/кг, от 1 до примерно 100 мг/кг или от 5 до примерно 100 мг/кг, включая все численные значения (включая дроби) в любых вышеупомянутых интервалах. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от примерно 10 до примерно 60 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления доза составляет примерно 10 мг/кг массы тела, примерно 20 мг/кг массы тела, примерно 30 мг/кг массы тела, примерно 40 мг/кг массы тела, примерно 50 мг/кг массы тела или примерно 60 мг/кг массы тела.

В некоторых вариантах осуществления дозу нейтрализующего антитела против ΛNСΡΤ^3 для человека определяют с учетом эффективной дозы того же самого антитела для мышей. В некоторых вари

- 30 019661 антах осуществления дозу нейтрализующего антитела против ΆΝΟΕ^ο для человека определяют, как описано в руководстве Сшйансе Γοτ Мийту: Е8Йта1шд 111е Мах1тит 8аГе 81агЦпд Όοκβ ίη Ιηίιίαΐ Сйшса1 ТпаЕ Γοτ Т11сгарси11с5 ίη Айи11 Неа11йу νοΙιιηΐοοίΈ И.8. ЭсраПтсШ οΓ НсаПЬ ;·ιηά Ηитаη 8егу1се5, Ροοά ;·ιηά Эгид Айт^^та^^ ;·ιηά Сейег Γοτ Эгид Еνа1иаΐ^οη ;·ιηά Векеатсй (СЭЕВ), Л.11у 2005 (Рйа^тасο1οду ;·ιηά ^χ^οίο^). В некоторых вариантах осуществления доза нейтрализующего антитела против АNСРТ^3 для человека составляет от 0,07 г до 7 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза нейтрализующего антитела против АNСРТ^3 для человека составляет от 0,1 до 5 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза нейтрализующего антитела против АNСРТ^3 для человека составляет от 0,1 мг/кг до 2 мг/кг. В различных вариантах осуществления нейтрализующее антитело против АNСРТ^3 вводят пациенту два раза в неделю, один раз в неделю, один раз через каждые две недели или один раз в месяц.

В некоторых вариантах осуществления подходящая доза может быть определена самим специалистом, например, на основе информации, полученной в исследованиях на животных.

В некоторых вариантах осуществления частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров антитела против АNСРТ^3 и от любых других дополнительных терапевтических средств, если они присутствуют в данном препарате. В некоторых вариантах осуществления врач-клиницист может вводить композицию до тех пор, пока введение данной дозы не будет приводить к достижению нужного эффекта. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления, композиция может быть введена в виде разовой дозы, либо в виде двух или более доз (которые могут содержать, а могут и не содержать одинаковое количество нужной молекулы) в течение определенного периода времени, либо в виде непрерывного вливания с помощью устройства для имплантации или катетера. В некоторых вариантах осуществления дополнительная коррекция соответствующей дозы может быть осуществлена рутинным способом самим специалистом в данной области и находиться в пределах его компетенции. В некоторых вариантах осуществления соответствующие дозы могут быть определены на основе соответствующих данных зависимости доза-ответ. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело против АNСРТ^3. В некоторых вариантах осуществления пациент получает фармацевтическую композицию, содержащую антитело против ΆNСРТ^3. в виде одной, двух, трех или четырех доз в день. В некоторых вариантах осуществления пациент получаетфармацевтическую композицию, содержащую антитело против АNСРТ^3, в виде одной, двух, трех, четырех, пяти или шести доз в неделю. В некоторых вариантах осуществления пациент получает фармацевтическую композицию, содержащую антитело против АNСРТ^3, в виде одной или двух доз в месяц.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят в соответствии с известными методами, например перорально, путем внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, интрацеребральной инъекции (вовнутрь паренхимы), интрацеребровентрикулярной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриглазной инъекции, интраартериальной инъекции, инъекции в воротную вену или инъекции в участок поражения, с использованием систем пролонгированного высвобождения или устройств для имплантации. В некоторых вариантах осуществления композиции могут быть введены путем инъекции ударной дозы или непрерывно путем вливания, или с помощью устройства для имплантации.

В некоторых вариантах осуществления композиция может быть введена местно путем имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором абсорбирована или в котором инкапсулирована нужная молекула. В некоторых вариантах осуществления, в которых используется устройство для имплантации, такое устройство может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и доставка нужной молекулы может быть осуществлена путем диффузии, введения ударной дозы с пролонгированным высвобождением или непрерывного введения.

В некоторых вариантах осуществления может оказаться желательным использование фармацевтической композиции, содержащей антитело против ΆNСРТ^3. в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства ех νίνο. В некоторых таких случаях клетки, ткани и/или органы, взятые у пациента, обрабатывают фармацевтической композицией, содержащей антитело против АNСРТ^3, в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируют обратно пациенту.

В некоторых вариантах осуществления антитело против АNСРТ^3 в присутствии или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства доставляют путем имплантации некоторых клеток, которые были генетически сконструированы с применением таких методов, как методы, описанные в настоящей заявке, для экспрессии и секреции полипептидов. В некоторых вариантах осуществления такими клетками могут быть клетки животного или человека, и такие клетки могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть иммортализованными. В некоторых вариантах осуществления, для уменьшения вероятности иммунного ответа, клетки могут быть инкапсулированы в целях предотвращения их инфильтрации в окружающие ткани. В некоторых вариантах осуществления материалы для инкапсуляции обычно являются биосовместимыми, полупроницаемыми полимерными оболочками или мембранами, что позволяет высвобождать белковый(ые) продукт(ы) и при этом предотвращать деструкцию клеток под действием иммунной системы пациента или других вредных факторов действия окружающих тканей.

- З1 019661

H. Некоторые способы детектирования и диагностики

В некоторых вариантах осуществления антитела против АХСРТЬ3 используют для обнаружения присутствия АЫСРТЬ3 ίη νίνο или ίη νίίΓΟ. В некоторых вариантах осуществления уровень АХСРТЕ3 ίη νίνο коррелирует с патологическим состоянием пациента, таким как нарушение липидного метаболизма, что позволяет диагностировать указанное состояние у данного пациента. Некоторые репрезентативные патологические состояния, которые могут быть диагностированы с использованием антитела против АНСРТЕ3, указаны выше.

Некоторые репрезентативные методы детектирования известны специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, ЕЬ18А, радиоиммуноанализ, иммуноблоттинг, вестерн-блотанализ, иммунофлуоресцентный анализ и иммунопреципитация. В некоторых вариантах осуществления антитела против АЫСРТЬ3 являются модифицированными так, что в результате этого они могут быть непосредственно детектированы, например, путем присоединения метки к данному антителу. Некоторыми репрезентативными метками являются, но не ограничиваются ими, флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы, электронноплотные реагенты, ферменты и лиганды. В некоторых вариантах осуществления антитела против АЫСРТЬ3 детектируют с использованием меченого второго антитела, которое связывается с антителами определенного класса (например, с козьим антимышиным антителом).

I. Некоторые методы скрининга на антагонисты и агонисты АЫСРТЬ3

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу скрининга агента, который связывается с АХСРТЕ3. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает обработку АХСРТЕ3 одним или несколькими агентами-кандидатами в подходящих условиях и оценку связывания АЫСРТЬ3 с одним или несколькими агентами-кандидатами. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает использование антитела против АЫСРТЬ3 в анализе на конкурентное связывание. В некоторых вариантах осуществления используют первую связывающую смесь, содержащую антитело против АЫСРТЬ3 и АХСРТЕ3. Затем измеряют уровень связывания АЫСРТЬ3 с указанным антителом в первой связывающей смеси (Мо). Также используют вторую связывающую смесь, содержащую антитело, АХСРТЕ3 и скринируемый агент. Затем измеряют уровень связывания АХСРТЕ3 с антителом во второй связывающей смеси (М₁). Уровень связывания в первой связывающей смеси сравнивают с уровнем связывания во второй связывающей смеси, например, путем вычисления отношения М₁/М₀. Считается, что агент обладает способностью связываться с АЫСРТЬ3, если уровень связывания антитела с АЫСРТЬ3 во второй связывающей смеси меньше, чем уровень связывания антитела с АЫСРТЬ3 в первой связывающей смеси. В некоторых вариантах осуществления агент, который связывается с АЫСРТЬ3, вызывает снижение уровня связывания антитела с АЫСРТЬ3 по меньшей мере примерно на 10% (то есть М₁/М₀<0,9), по меньшей мере примерно на 30% (то есть М₁/М₀<0,7), по меньшей мере примерно на 50% (то есть, М₁/М₀<0,5), по меньшей мере примерно на 70% (то есть М₁/М₀<0,3), по меньшей мере примерно на 80% (то есть М₁/М₀<0,2), по меньшей мере примерно на 90% (то есть М₁/М₀<0,1) или по меньшей мере примерно на 95% (то есть М1/Мо<0,05).

В некоторых вариантах осуществления АЫСРТЬ3, используемый в любом из способов скрининга, описанных выше, представляет собой ^концевой суперспирализованный домен АХСРТЕ3 или его фрагмент. На основании наблюдений заявителей, из которых следует то, что некоторые антитела, связывающиеся в ^концевом суперспирализованном домене АЫСРТЬ3, могут снижать уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке ίη νίνο, можно сделать вывод, что агент (например, антитело или агент, не являющийся антителом), идентифицированный в способе скринига как агент, связывающийся с N концевым суперспирализованным доменом АЫСРТЬ3, является кандидатом-антагонистом активности АЫСРТЬ3. В некоторых вариантах осуществления агент (например, антитело или агент, не являющийся антителом), идентифицированный в способе скрининга как агент, связывающийся с областью 8Р1 в N концевом суперспирализованном домене АЫСРТЬ3, является кандидатом-антагонистом активности АЫСРТЬ3.

В некоторых вариантах осуществления антагонистическая активность подтверждается тем, что антагонист-кандидат нейтрализует активность АЫСРТЬ3 в анализе ίη νίνο или ίη νίΐτο. Некторые репрезентативные анализы описаны в настоящей заявке. Специалист в данной области может выбрать и/или адаптировать соответствующий анализ из числа описанных здесь и/или известных анализов. В некоторых вариантах осуществления антагонисты АХСРТЕ3 используются для лечения расстройств, ассоциированных с нарушением метаболизма липидов.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам скрининга агентов, которые связываются с фибриногеновым доменом АЫСРТЬ3. В некоторых вариантах осуществления агент, который связывается с фибриногеновым доменом АНСРТЕ3, может повышать активность АХСРТЕ3. Таким образом, агент (например, антитело или агент, не являющийся антителом), идентифицированный в способе скрининга как агент, связывающийся с фибриногеновым доменом АЫСРТЬ3, является кандидатом-агонистом активности АХСРТЕ3. В некоторых вариантах осуществления агонистическая активность подтверждается тем, что агонист-кандидат повышает активность АЫСРТЬ3 в анализе ίη νίΐτο или ίη νίνο. Некоторые репрезентативные анализы описаны в настоящей заявке. Специалист в дан

- 32 019661 ной области может выбрать и/или адаптировать соответствующий анализ из числа известных анализов или анализов, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления агонист АКСРТЬ^ используют для лечения некоторых расстройств, ассоциированных с избыточной потерей массы, таких как нервная анорексия, нервная булимия и кахексия (истощение), ассоциированные с такими заболеваниями, как рак, кистозный фиброз и СПИД.

Некоторыми репрезентативными агентами, которые могут быть скринированы на связывание с АКСРТЬ^, являются, но не ограничиваются ими, антитела, небольшие молекулы (например, органические соединения, металлоорганические соединения, соли органических и металлоорганических соединений, сахариды, аминокислоты, нуклеозиды и нуклеотиды), аптамеры, пептиды и пептидомиметики. Некоторыми репрезентативными пептидами являются растворимые пептиды, которые включают, но не ограничиваются ими, члены рандомизированных пептидных библиотек (см., например, Ьат е! а1. (1991) Шиле 354:82-84; Ηου^!^ е! а1. (1991) НаШте 354:84-86) и члены комбинаторных библиотек химических молекул, состоящих из аминокислот с И- и/или Ь-конфигурацией; и фосфопептиды, которыми являются, но не ограничиваются ими, члены рандомизированных или частично расщепленных упорядоченных фосфопептидных библиотек (см., например, Зοηдуаηд (1993) Се11 72:767-778).

В некоторых вариантах осуществления технологии компьютерного моделирования и поиска позволяют идентифицировать соединения или модифицировать уже идентифицированные соединения, которые связываются с АКСРТЬ^. Некоторыми репрезентативными системами молекулярного моделирования являются, но не ограничиваются ими, программы СНАВММ и ЦиАЭТА (ΤοΡ^η ^τροιι^ο^ \Уа1!йат, МА). Программа СНАВММ позволяет осуществлять минимизацию энергии и определять динамику молекул. Программа ЦиАИТА позволяет осуществлять конструирование, графическое моделирование и анализ молекулярной структуры. ЦиАИТА позволяет осуществлять интерактивное конструирование, модификацию, визуализацию и анализ взаимодействия молекул друг с другом.

1. Нуклеиновые кислоты-антагонисты АКСРТЬ^

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая снижает уровень экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей АКСРТЬ^. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая АКСРТЬ^, кодирует мышиный АКСРТЬ^. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая АКСРТЬ^, кодирует человеческий АКСРТЬ^. В некоторых вариантах осуществления выделенной нуклеиновой кислотой является антисмысловая нуклеиновая кислота. В некоторых таких вариантах антисмысловой нуклеиновой кислотой является одноцепочечная молекула ДНК, которая стимулирует расщепление мРНКмишени по механизму, действующему на основе РНКазы Н. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой нуклеиновой кислотой является олигонуклеотид длиной примерно 8-30 нуклеотидов (включая все численные значения между граничными значениями данного интервала). В некоторых вариантах осуществления антисмысловой нуклеиновой кислотой является олигонуклеотид длиной примерно 18-26 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления термин антисмысловая нуклеиновая кислота охватывает молекулу РНК, которая снижает уровень экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени по механизму интерференции РНК (РНКи). Некоторыми репрезентативными молекулами РНК, подходящими для их использования в РНКи, являются, но не ограничиваются ими, короткие интерферирующие РНК (киРНК), микро-РНК (миРНК), небольшие некодирующие РНК (ннРНК) и небольшая модулирующая РНК (нмРНК). Описание некоторых репрезентативных механизмов РНКи и молекул РНК, используемых в РНКи, можно найти, например, в публикации ΝονΗ™ е! а1. (2004) НаШте 430: 161-164.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к киРНК, которая снижает уровень экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей АКСРТЬ^. В некоторых вариантах осуществления киРНК представляет собой олигонуклеотид длиной примерно 18-26 нуклеотидов (включая все величины длин нуклеотидов между граничными значениями данного интервала). В некоторых вариантах осуществления киРНК представляет собой олигонуклеотид длиной примерно 20-24 нуклеотида или олигонуклеотид длиной примерно 21-23 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления киРНК представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах осуществления киРНК индуцирует расщепление молекулы мРНК-мишени, комплементарной антисмысловой цепи киРНК. См., например, Νονίππ е! а1. (2004) ХаИие 430: 161-164.

На активность антисмысловой нуклеиновой кислоты, такой как антисмысловая молекула ДНК или киРНК, часто влияет вторичная структура мРНК-мишени. См., например, Уюкетк е! а1. (2003) 1. Вю1. Сйет. 278:7108-7118. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, антисмысловую нуклеиновую кислоту выбирают так, чтобы она была комплементарна области мРНК-мишени, которая является доступной для спаривания оснований. В некоторых вариантах осуществления подходящую область мРНК-мишени идентифицируют путем осуществления скрининга методом прогулки по геному, например, путем эмпирического тестирования ряда антисмысловых олигонуклеотидов на их способность гибридизоваться с различными областями мРНК-мишени и/или снижать уровень экспрессии мРНКмишени. См., например, Уюкетк е! а1. (2003) 1. Вю1. Сйет. 278:7108-7118; Н111 е! а1. (1999) Ат. 1. Векр1г. Се11 Мο1. Вю1. 21: 728-737. В некоторых вариантах осуществления подходящую область мРНК-мишени

- 33 019661 идентифицируют с использованием компьютерной программы или родственного алгоритма предсказания вторичной структуры мРНК в целях обнаружения областей мРНК-мишени, которые не гибридизуются с любыми другими областями мРНК-мишени. См., например, Н111 е! а1. (1999) Αт. ί. ^κρίΓ. Се11 Мо1. Вю1. 21: 728-737. В некоторых вариантах осуществления для идентификации подходящей области мРНК-мишени используют комбинацию обоих вышеупомянутых методов. См., например, НШ е! а1. (1999) Α^ 1. ΚηκρίΓ. Се11 Мо1. Вю1. 21: 728-737.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения активности ΑΝΟΡΤΕ3 путем снижения уровня экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает снижение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ΑΝΟΡΤΕ3, в клетках 1п νίΙΐΌ или 1п νί\Ό. В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает введение антисмысловой нуклеиновой кислоты, снижающей уровень экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ΑΝΟΡΤΕ3, в клетку 1п νίΙΐΌ или 1п νί\Ό. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая ΑΝΟΡΤΕ3, кодирует человеческий ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая ΑΝΟΡΤΕ3, кодирует мышиный ΑΝΟΡΤΕ3.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения расстройства, ассоциированного с нарушением метаболизма липидов, например, любого из расстройств, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления указанный способ включает введение пациенту эффективного количества антисмысловой нуклеиновой кислоты, снижающей экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей ΑΝΟΡΤΕ3. В некоторых вариантах осуществления антисмысловую нуклеиновую кислоту доставляют в орган, в котором экспрессируется нуклеиновая кислота, кодирующая ΑΝΟΡΤΕ3.

ΑΝ6ΡΤΕ3 экспрессируется, главным образом, в печени. Οίΐ^ Υ. е! а1. (2005) ΤΚΗΝΟ8 Мо1. Меб. 11(10):473-479. У мышей кратковременное голодание, очевидно, не влияет на экспрессию. Οίΐ^ Υ. е! а1. (2005) ΤΚΗΝΟ8 Мо1. Меб. 11 (10):473-479. Однако, после кормления мышей кормом, содержащим холестерин, уровень экспрессии повышается, и этот уровень также повышается у некоторых мышей с моделью ожирения и диабета (например, у бЬ/бЬ- и оЬ/оЬ-мышей) и мышей с диабетом типа I, индуцированным стрептозотоцином, что дает основание предположить, что ΑΝΟΡΤΕ3 может участвовать в развитии дислипидемии при диабете и метаболическом синдроме. Οίΐ^ Υ. е! а1. (2005) ΤΚΗΝΟ8 Мо1. Меб. 11 (10):473-379. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антисмысловую нуклеиновую кислоту доставляют в печень. Некоторые репрезентативные методы 1п νί\Ό введения антисмысловых нуклеиновых кислот и пролонгированной доставки антисмысловых нуклеиновых кислот 1п νί\Ό. включая пролонгированную доставку в конкретные органы, такие как печень, описаны, например, в публикации КНап е! а1. (2004) ί. Эгид Τа^деΐ^ηд 12:393-404. В некоторых вариантах осуществления пролонгированная доставка достигается путем введения антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая инкапсулирована в биологически разлагаемом полимере или содержится в этом полимере в какой-либо другой форме. Так, например, в некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота может содержаться в микросферах из полигликолевой кислоты (ΡΕ6Α) (например, 0,5-20 мкм; М\У=3000). В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота конъюгирована с липофильной молекулой. См. КНап е! а1. (2004) I. Эгид Τа^де!^ηд 12: 393-404.

VI. Примеры

A. Содержание мышей и исследования режимов питания

Исследования, проводимые на мышах, осуществляли в соответствии с нормами, установленными Федеральными регуляторными органами. Мыши содержались при 24°С с постоянным циклом смены дня и ночи: 12 ч-день/12 ч-ночь, и имели свободный доступ к воде и корму для грызунов (калорийность -22% жира) (продукт № 5021; Ρηγιηη, 8!. Ьошк, МΟ), как указано ниже. Мыши, называемые ниже мышами, которые содержались в условиях голодания, не получали корма в течение 16 ч.

B. 1п νί\Ό сверхэкспрессия человеческого ΑΝΟΡΤΕ3 у мышей кДНК, кодирующую полноразмерный человеческий ΑΝ6ΡΤΕ3 (8ЕО Ш ΝΟ: 6), встраивали в Α6 Е1-делетированную область аденовирусного вектора ρΕΑΩ, в результате чего кДНК находилась под контролем промотора цитомегаловируса. См. Н1!! е! а1., Сопк!гисбоп апб ρ^оρадаΐ^оη о£ Нитап абепоу|гнк месЮгк, т Се11 Вю1оду: Α ЬаЬога!огу НапбЬоок νθ1. 1, ρρ. 500-512 (I. Е. Се11к, еб., 2^пб еб. 1998). Полученную конструкцию, Α65-1ιΑι^ρ113Τ, использовали для инфицирования клеток СНО. Пустой вирус Α65 также использовали для инфицирования клеток СНО в качестве контроля. Экспрессию человеческого ΑΝΟΡΤΕ3 подтверждали с помощью Вестерн-блот-анализа инфицированных экстрактов из клеток СНО.

Α65-1ιΑι^ρ113Τ инъецировали мышам С57ВБ/61 в хвостовую вену в следующих дозах: 2х10⁹ в.б. (вирусных бляшек), 1х10⁹ в.б., 5х10⁸ в.б., 2х10⁸ в.б. Пустой вектор Α65 инъецировали мышам С57ВБ/61 в хвостовую вену в дозе 2х10⁹ вирусных бляшек (в.б.) в качестве контроля. Каждая группа включала пять мышей. Через четыре дня у мышей, инфицированных аденовирусом, брали пробы крови, и в течение этого времени мышам обычно давали корм (то есть мыши не содержались в условиях голодания). Уровни триглицеридов в сыворотке измеряли с помощью устройства СоЬак 1п!едга 500 (ВосНе, Ваке1, 8\\'Цхег1апб).

- 34 019661

Результаты представлены на фиг. 8. В этом эксперименте у мышей, инфицированных 2х10⁹ в.б. или 1х10⁹ в.б. Аб5-11Апдр113Т, уровни триглицеридов в сыворотке были значительно выше, чем у мышей, инфицированных пустым вектором Аб5, используемым в качестве контроля.

С. Получение и очистка мышиного и человеческого АКСРТЬ^

Для экспрессии рекомбинантного мышиного АКСРТЬ^ клетки СНО инфицировали 1,5х 10¹¹ в.б. рекомбинантного аденовируса Аб5-тАпдр11Т. Аб5-тАпдр!1Т экспрессирует мышиный АНСРТЕЭ с НХ₆меткой у С-конца (между АКСРТЬ^ и Н18₆-меткой находится глициновый остаток), обозначаемый тАНСРТЕЭТ (8ЕО ГО N0: 2). Через 16-24 ч среду заменяли бессывороточной средой (средой ЕХ-СЕЬЬ 325-РР СНО, 14335, 1ЯН, Ьепеха, К8). После этого кондиционированную среду собирали, а затем в течение всех 5 процедур сбора через каждые 24-36 ч указанную среду заменяли свежей бессывороточной средой.

Кондиционированную среду (1 л) загружали в 10-12-миллилитровую колонку со смолой, образующей хелатный комплекс с никелем (В801-01, [пуйгодеп, СагкЬаб, СА). Колонку промывали 5 колоночным объемами буфера для промывки (10 мМ имидазола, 20 мМ трис, рН 7,8, 500 мМ ШИ). Связанный тАХСРТЕЭТ элюировали элюирующим буфером (500 мМ имидазол, 20 мМ трис, рН 7,8, 500 мМ ШИ) и собирали в 1,5-мл фракции. Присутствие тАХСРТЕЭТ в собранных фракциях определяли с помощью вестерн-блот-анализа и простого окрашивания синим красителем. Фракции, содержащие тАNСРТ^3Т. объединяли, разделяли на аликвоты и замораживали при -70°С.

Для экспрессии рекомбинантного человеческого АКСРТЬ^ клетки СНО инфицировали 1,5x10 в.б. рекомбинантного аденовируса Аб5-11Апдр11Т. Аб5-11Апдр11Т экспрессирует человеческий АКСРТЬ^ с Н18₆-меткой у С-конца (между АКСРТЬ^ и Н18₆-меткой находится глициновый остаток), обозначаемый НАХСР^оТ (8ЕО ГО N0: 4). НАХСРТЕЭТ экспрессировали и очищали, как описано выше для тАИСР^Т.

Ό. Получение и очистка ^N'-тАNСРТ^3Т и ^N'-11АNСРТ^3Т

Полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 17-240 мышиного АКСРТЬ^, клонировали в экспрессионный вектор рЕТ22Ь(+) (Ноуадеп). Этот вектор кодирует №концевую лидерную последовательность ре1В, а также С-концевую Н18-метку. Полученный экспрессионный вектор называется рЕТ-N'-тАNСРТ^3Т. После трансляции белка и удаления всех аминокислот, за исключением 11 аминокислот последовательности ре1В, N'-тАNСРТ^3Т имела последовательность, показанную в 8ЕО ГО N0:7.

Эта последовательность содержит 11 аминокислот последовательности ре1В, за которыми следуют аминокислоты 17-240 мышиного АКСРТЬ^ (подчеркнуты в табл. 7), а за ними находится линкер из 2 аминокислот и Н18₆-метка.

Аналогичным образом, полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 20243 человеческого АКСРТЬ^, клонировали в зкспрессионный вектор рЕТ22Ь(+) (Штадем). Этот вектор кодирует №концевую лидерную последовательность ре1В, а также С-концевую Н18-метку. Полученный экспрессионный вектор был обозначен рЕТ-N'-11АNСРТ^3Т. После трансляции белка и удаления всех аминокислот, за исключением 11 аминокислот последовательности ре1В, N'-11АNСРТ^3Т имел последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 8. Эта последовательность содержит 11 аминокислот последовательности ре1В, за которыми следуют аминокислоты 20-243 мышиного АКСРТЬ^ (подчеркнуты в табл. 7), а за ними находится линкер из 2 аминокислот и Н18₆-метка.

N'-тАNСРТ^3Т или N'-11АNСРТ^3Т были экспрессированы и очищены из Е.со11 следующим образом. 10 мл среды ЬВ, содержащей 50 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл карбенициллина, инокулировали одной рЕТ-N'-тАNСРТ^3Т-трансформированной колонией Е.соН. Эту культуру инкубировали при 37°С в течение ночи. Затем 10 мл культуры переносили в 500 мл среды ЬВ, не содержащей антибиотиков, и инкубировали при 37°С до тех пор, пока 0Ό₆₀₀ не достигала 0,6 (примерно в течение 2 ч). Затем добавляли 1РТС до конечной концентрации 1 мМ, и культуру инкубировали со встряхиванием при 200 об/мин и при 30°С в течение 4 ч. После этого культуру помещали на 5 мин на лед. Клетки осаждали путем центрифугирования при 8000 об/мин на роторе ГОА/6.25 в течение 15 мин. Затем клеточный осадок ресуспендировали в 50 мл буфера для лизиса (50 мМ трис, рН 7,5, 0,5 М №0, 1% тритон Х-100, 1х смеси ингибиторов протеазы (ЯосНе) и 0,25 мл РМ8Р (0,1 М в изопропаноле)). Затем лизированные клетки центрифугировали при 9700 об./мин на роторе 1А25.5 в течение 30 мин. Супернатант удаляли, а затем осветляли путем центрифугирования при 28000 об/мин на роторной установке 8\У28 в течение 30 мин. После этого рекомбинантные N'-тАNСРТ^3Т или N'-11АNСРТ^3Т могут быть выделены из осветленного супернатанта с помощью хроматографии на РгоЬопб (N1) (1пуйгодеп).

Для выделения рекомбинантного N'-тАNСРТ^3Т или N'-11АNСРТ^3Т из нерастворимого осадка, оставшегося после центрифугирования лизированных клеток, осадок промывали 30 мл буфера для лизиса и центрифугировали при 9700 об./мин на роторе 1А25.5. Стадию промывки повторяли два раза, а всего проводили три промывки. Затем нерастворимый белок, присутствующий в осадке, растворяли в 10 мл денатурирующего буфера (50 мМ трис, рН 8,0, 6 М гуанидин-НС1). После этого раствор центрифугировали на роторе 1А25.5 при 28000 об./мин в течение 30 мин. Затем супернатант загружали на колонку с 5

- 35 019661 мл смолы Γι^οι^. Эту колонку промывали 50 мл промывочного буфера (50 мМ трис, рН 8,0, 1 М №0, 8 М мочевины, 15 мМ имидазола). Рекомбинантныый белок подвергали рефолдингу на колонке в градиенте 50 мл промывочного буфера ренатурирующего буфера (50 мМ трис, рН 8,0, 1 М N101, 0,5% Твин 20). Затем рекомбинантный белок элюировали элюирующим буфером (ренатурирующим буфером, содержащим 250 мМ имидазола). Фракции, содержащие рекомбинантный белок, собирали и диализовали против буфера для хранения (50 мМ трис, рН 8,0, 100 мМ НаО, 0,2% Твин 20). Очищенный №тАКСРТЕЗТ или N'-ЬАNСРТ^3Т разделяли на аликвоты и хранили при -70°С.

Е. Получение и очистка 8Р1 и 8Р2-КЕН

Очищенный 8Р1 (8Е0 ГО N0: 9 и 10) аиб 8Р2-КЕН (8Е0 ГО N0: 62) закупали у фирмы 81дта Сегюкук (ТЬе \Vοοб1аηбк. Техак). Последовательности области 8Р1 АХСРТЕЗ мыши и человека являются одинаковыми. 8Р2-КЕН получали путем присоединения цистеина к СООН-концу 8Р1, а затем конъюгирования гемоцианина лимфы улитки с пептидом посредством цистеина стандартными методами, известными специалистам.

Е. Продуцирование моноклональных антител против АКСРТЕ-Л у Аидр!:13-дефицитных мышей

Моноклональные антитела, которые перекрестно реагируют с человеческим и мышиным АКСРТЕ-Л, были продуцированы у Аидр!13-дефицитных мышей трех групп из 5-8 мышей, каждой из которых вводили различные серии инъекций антигена. Животных группы 1 примировали тАХСРТЕЗТ (8Е0 ГО N0: 2), продуцированным и очищенным как описано выше. Животным группы 1 также вводили четыре ударных дозы тАКСРТЕ-ЛТ. Перед сбором лимфоидной ткани вводили последнюю ударную дозу тАКСРТЕ-ЛТ. Животных группы 2 примировали ^N'-ЬАNСРТ^3Т (8Е0 ГО N0: 8), продуцированным и очищенным как описано выше. Животным группы 2 вводили одну ударную дозу ^N'-тЛNСРТ^3Т (8Е0 ГО N0: 7), продуцированного и очищенного как описано выше, а затем три раза вводили тАКСРТЕ-ЛТ (8Е0 ГО N0: 2). Перед сбором лимфоидной ткани вводили последнюю ударную дозу НАХСРТЕЗТ (8Е0 ГО N0: 4). Животных группы 3 примировали НАХСРТЕЗТ (8Е0 ГО N0: 4), продуцированным и очищенным как описано выше, а затем вводили одну ударную дозу НАХСРТЕ-ЛТ, после чего вводили две ударные дозы синтетического пептида 8Р2-КЕН (8Е0 ГО N0: 62), продуцированного и очищенного как описано выше. Перед сбором лимфоидной ткани двум животным группы 3 с высоким титром вводили последнюю ударную дозу 8Р2-КЕН (8Е0 ГО N0: 62). Остальным животным группы 3 (называемой группой 4) вводили четыре дополнительных ударных дозы синтетического пептида 8Р2-КЬН (8Е0 ГО N0: 62), продуцированного и очищенного, как описано выше. Перед сбором лимфоидной ткани животным группы 4 вводили последнюю ударную дозу 8Р2-КЬН (8Е0 ГО N0: 62).

Каждую мышь примировали, и этим животным вводили ударные дозы, как описано ниже. Каждую мышь внутрибрюшинно примировали 40 мкг очищенного антигена в полном адъюванте Фрейнда. Через две недели мышам внутрибрюшинно вводили ударную дозу 30 мкг очищенного антигена в неполном адъюванте Фрейнда (ГЕА), после чего еще через две недели мышам снова внутрибрюшинно вводили ударную дозу 20 мкг очищенного антигена в ГОА. Альтернативно, могут быть использованы адъюванты на основе хитозана. См., например, патенты США №№ 5912000, 5965144 и 5980912. Через одну неделю после введения второй ударной дозы титры сыворотки измеряли с помощью ЕЫЗА, как описано ниже, с использованием планшетов, покрытых антигеном тАКСРТЕ-Л. Через две недели после введения второй ударной дозы мышам внутрибрюшинно вводили ударную дозу 10 мкг очищенного антигена в ША. Через одну неделю после введения третьей ударной дозы титры сыворотки снова измеряли с помощью ЕЫЗА, как описано выше. Мышам группы 4 непрерывно внутрибрюшинно вводили ударные дозы до достижения высоких титров. После достижения высоких титров последние ударные дозы вводили с использованием примирующего антигена (группы 1 и 2) или антигена в ударной дозе (группы 3 и 4). Последнюю ударную дозу вводили приблизительно через 2,5 недели после введения предпоследней ударной дозы, а затем внутривенно вводили 10 мкг очищенного антигена.

Через три дня после введения последней ударной дозы у иммунизованных мышей собирали спленоциты, и эти спленоциты подвергали слиянию с миеломными клетками (N80 с использованием ПЭГ1500 в качестве агента для слияния. Полученные продукты слияния клеток разводили в гибридомной среде и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Через 1 день к гибридомным культурам добавляли среду НАТ. При необходимости среду заменяли каждые три или четыре дня.

После отбора и культивирования, проводимого в течение 10-14 дней, гибридомы скринировали с помощью ЕЫ8А. Гибридомы, выделенные у мышей группы 1, скринировали с использованием тАКСРТЕЗТ, ЬАNСРТ^3Т и N'-ЬЛ№СРТ^3Т. Гибридомы, выделенные у мышей группы 2, скринировали с использованием тАКСРТЕ-ЛТ и ЬАNСРТ^3Т. Гибридомы, выделенные у мышей группы 3 и 4, скринировали с использованием ПАКСРТЕ-ЛТ и синтетического пептида, представляющего собой область 8Р1

ЕЫ8А осуществляли, как описано ниже.

С. ЕЫ8А-методы

Антитела скринировали на связывание с антигеном с помощью ЕЫ8А. Антитела, выделенные у животных каждой группы, скринировали на связывание с тАКСРТЕЗТ, ЬАNСРТ^3Т, N'-ЬАNСРТ^3Т

- 36 019661 и/или с пептидом 8Р1 йΑNСΡТ^3. 96-луночные планшеты Мтс Мах1-8огр 1ттипоР1а1ек™ (Мтс #446612, ЯоккПбе, Иептагк) сенсибилизировали путем добавления 50 мкл на лунку 2,5 мкг/мл раствора тАХСРТк3Т, НАХСРТк3Т, N'-йΑNСΡТ^3Т и/или пептида 8Р1 НАХСРТк3 в сенсибилизирующем буфере (карбонат-бикарбонатном буфере ВирН™, Р1егсе #28382, ЯоскГогб, 1Ь) в течение ночи при 4°С. Затем сенсибилизирующий буфер удаляли, и планшет блокировали путем добавления 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1% В1оскег™ В8А, Р1егсе #37525, в РВ8) в течение двух часов при комнатной температуре. После этого в лунки добавляли 50 мкл супернатанта гибридомы (неразведенного или разведенного в блокирующем буфере) или выделенного анти-ΑNСΡТ^3 антитела (неразведенного или разведенного в блокирующем буфере), и смесь инкубировали по меньшей мере в течение одного часа при комнатной температуре. Лунки четыре раза промывали РВ8/твином 20. Затем в лунки добавляли 100 мкл разведенного (1:5000-1:10000) ПХ-конъюгированного козьего антитела против мышиных 1дС (Р1егсе #31446), и смесь инкубировали в течение одного часа при 37°С. Лунки шесть раз промывали РВ8/твином 20. Анти-АХСРТк3 антитело детектировали путем добавления в лунки 50 мкл раствора ТМВ (тетраметилбензидина) (в наборе с субстратом 1ттипоРиге^Я ТМВ 8нЬк1га1е Κίΐ, Р1егсе #34021) в течение 5-10 мин. Планшеты считывали с помощью спектрофотометрии при 450 нм на микропланшете-ридере (Мо1еси1аг Иеуюек, 8иппууа1е, СА). Н. Эпитопное картирование моноклональных антител 1. Связывание антитела с некоторыми пептидами АНСРТЬ3 Шесть антител, выделенных у мышей группы 1, тестировали с помощью ЕЬ18А-анализа с захватом антител, который проводили на связывание с тремя различными пептидами, состоящими из 50 аминокислот, и находящимися у Ν-конца мышиного ΑNСΡТ^3, и с Ν'тАЫСРТЬ3Т. Тестируемые антитела обозначали 1.251.1, 1.132.1, 1.173.2, 1.315.1, 1.424.1 и 1.431.1. Эти антитела тестировали на связывание с пептидом 8¹⁷-С⁶⁶ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11), пептидом И⁴²-Е⁹¹ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 12), пептидом Ц⁶⁷-М¹¹⁶ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 13) и №тА^РТЬ3Т (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7).

Результаты этого эксперимента представлены в табл. 2.

Таблица 2. Антитело, связывающееся с пептидами АЫСРТЬ3

	Мышиный пептид АЫСРТЬЗ
Антитело	з¹⁷-ск	ЕХ-Е'¹	₀67 _м11б	Ν'-шАНСРТЬЗТ
1.251.1	-	+	-	+
1.132.1	-	-	-	-
1.173.2	-	4-	+	+
1.315.1	-	+	-	+
1.424.1	-	+	-	+
1.431.1	-	-	-	-

Ни одно из тестируемых антител не связывалось с пептидом 8¹⁷-С⁶⁶. Антитела 1.251.1, 1.173.1,

1.315.1 и 1.424.1 связывались с пептидом И⁴²-Е⁹¹ и с Х'-тАХСРТк3Т. Антитело 1.173.1 также связывалось с пептидом Ц⁶⁷-М¹¹⁶. Антитела 1.132.1 и 1.431.1 не связывались ни с одним из тестируемых пептидов и с Х'-тАХСРТк3Т, что позволяет предположить, что указанные антитела связываются с эпитопом, находящимся за пределами области, расположенной между 8¹⁷ и Ό²⁴⁰ тАХСРТЬ3.

Восемь антител из группы 3 тестировали с помощью анализа ЕЫ8А с захватом антител на связывание с синтетическим пептидом, имеющим последовательность области 8Р1 АЫСРТЬ3 (обозначаемой АХСРТЬ3 8Р1) Е1%81ША\1М)1)\ЗШ.А\С11Л.С)1.С11161. (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8:9 и 10) и полноразмерного Намеченного человеческого АЫ6РТЬ3Т:

МГТ1КЫЬГ1УР1Л^г155КЮ0ОЙ35Е^,О5Ь5РЕРК5НГАМЬ00УК1

ЪАНСЬЬ0ЬСНСЬКОГ7НКТКСС1ЫО1Е0КЬЫ1Г005ГУОЬЗЬ0ТЗЕ1КЕЕЕКЕЬККТТУКЬ0У

КМЕЕУКНМЗЬЕЬ№КЬЕЗЬЪЕЕК1ЬЬ(ЗОКУКУЬЕЕОЪТМЫО№РЕТРЕНРЕУТЗЬКТЕУЕКО

0№1КОЬЬОТУЕООУКОЬЦООН301КЕ1Е№ЪНРТ31СЕРТЕ15ЕЗЗКРКАРКТТРГЬОЬЫЕ1

ΚΝνΚΗΟΟΙΡΑΕσΤΤΙΥΝΚαΕΗΤ3αΜΥΑΙΚΡ3Ν30νΓΗνΥΟ0νΐ3Ο3ΡΗΤΕΙ0ΗΕΙΟ630ΝΕΝΕ

ΤΜΕΝΥΚΥαΓΰΚΕΟΘΕΕΗ1,ΰ1,ΕΚΙΥ3ΐνΚι23ΝΥνΕΚΙΕΕΕϋΗΚΌΝΚΗΥΙΕΥ3ΓΥ1,σΝΗΕΤΝΥΤΙ, ΗΕνΑΙΤσΝνΡΝΑΙΡΕΝΚϋΕνΕ3ΤΚΟΗΚΑΚΟΗΓΝΟΡΕεΥ3(30ΗΚΗΗΟΕΟΰΕΝΜΕΝΟΚΥΝΚ₽ΚΑΚ 5КРЕККРСЬЗИКЗОКСКЬУ31КЗТКМЪ1НРТОЗЕЗГЕСНННННН (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ_: 4), _и полноразмерного человеческого АХСРТЬ3 (с использованием АХСРТк3Т, продуцированного как описано выше) (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3). В качестве контроля использовали неродственный рекомбинантный белок.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 9. Антитела 4.1.1, 4.4.1, 4.8.1 и 4.8.3 связывались с АЫ6РТЬ3 8Р1 лучше, чем полноразмерный АЫ6РТЬ3Т. Антитела 4.7.1 и 4.9.1 связывались как с АЫ6РТЬ3 8Р1, так и с АХСРТЬ3Т. Антитело 4.6.3 связывалось с полноразмерным АЫ6РТЬ3Т, но не связывалось с АХСРТЬ3 8Р1. И наконец, антитело 4.8.2 связывалось со всеми протестированными белками, включая контрольный белок.

- 37 019661

Антитела из группы 4 тестировали на связывание с ΗΑNСΡΤ^3Τ и с пептидом ΗΑNСΡΤ^3 8Р1 (данные не приводятся). Антитела 5.35 и 5.50 связывались с обоими антигенами и были выбраны для дальнейшего анализа.

2. Аланин-сканирующий мутагенез пептида 8Р1

Эпитопы для антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и 5.50 были затем определены с использованием аланин-сканирующего мутагенеза пептида 8Р1. Пептид 8Р1 дикого типа имеет последовательность ЕРК8ЯΕΑМ^^^VКI^ΑNС^^^^СНС^ (8ЕЦ ГО N0: 9). Была получена серия из 26 мутантов, в которой каждая из 26 аминокислот пептида 8Р1 дикого типа была заменена аланином, как показано в табл. 3.

Таблица 3. Мутантные пептиды 8Р1

Пептид	Последовательность	ЗЕО Ю ΝΟ;
5Р1	Е РКЗКЕАМЬООУКI ЬА№ЬЫ2ЪСНСЬ	9
мутант 1	АРК5 ΗΓΆΜΠϋϋνΚIЬАНСЬЬОЬСНСЬ	83
мутант 2	ЕАКЗКГАМЬООУКХЬАМСЬЬОЪСНСЬ	84
мутант 3	ЕРА5НЕАМЬООУК1ЬАИ6ЬЬОЬСНСЬ	85
мутант А	ЕРКАКГАМЬООУКИАЫСЬЬОЬСНбЬ	86
мутант 5	ЕРКЗАГАМЬООУК1ЬАЫСЬЬСП(ЗНСЬ	87
мутант 6	ЕРК5НААМЬ0ВУК1ПАЫСЬЬСПСНСЬ	88
мутант 7	Ε ΡΚ3ΚΕΑΜΕ00νΚΙЬАМСЬЬОПСНСЬ	9
мутант 8	Ε РКЗ К ААЬПОУКIЪАИСЬЬОЪСНСЬ	89
мутант 9	Ε РКЗК ΕΆΜΑΟϋνΚ I ЬАЫСЬЬ<2ПСНСЬ	90
мутант 10	Ε РКЗВ ГЛМЬАОУКIЪАИСЬЕСЪСНСЬ	91
мутант 11	ΕΡΚ3ΕΤΆΜΕΞ;ΑνΚΙΑΑΜι3ΐ,Τ.Α·Α3ΗΟΙ..	92

мутант 12	ЕРКЗКЕАМПООАК11.АНСЬЬ<2П6НСЬ	93
мутант 13	ЕРК8НГАМЬ0РУЛ11А№Л,Ь01,бНСЬ	94
мутант 14	Ε РКЗК ГАМЕООУКАЬАЫ6ЕЫ2ЬСНСЪ	95
мутант 15	ЕРКЗКЕАМЕЕОУКГААтеЬЬОЬСНСЬ	96
мутант 16	ЕРК5КГАМЬЕ0УК1ЬАПСЬЬСЬ0НСЬ	9
мутант 17	Ε ΡΚ5ΚΓΑΜΕ0βνΚΙПААСЬЕОЕСНСТ	97
мутант 18	Ε ΡΚΒΚΓΑΜΕϋϋνΚΙЬАИАЬЬСЬСНСЪ	98
мутант 19	ЕРКЗКРАМЬООУК1ЬАЫСАЬОЕСНСЪ	99
мутант 20	ЕРКЗЕЕАМЕПЕУК1ЕАЫСЬА<2Е6НСЕ	100
мутант 21	ЕР:<ЗКЕАМЬСС'7К1ЕАНЗЬЬАЬСНС-Ь	101
мутант 22	ЕРКЗКЕАМЬЕ07К1ЬАНеЬЫЭА0НеЬ	102
мутант 23	ЕРКЗКГАМЬ00УК11АЫСЫ.01ЛНС1,	103
мутант 24	ЕРКЗКГАМЕЕ0УК1ЬАМСЬЫЭЬСАСЬ	104
мутант 25	ЕРКЗКГАМЬООУКПАЫСЬЬОЬбИАЕ	105
мутант 26	ЕРКЗКГАМЕООУКИАЫбЪЫЭЬбНСА	106

У мутанта 7 и мутанта 16 в положениях 7 и 16 присутствует аланин, как и в последовательности дикого типа. Поэтому эти мутанты» имеют последовательность пептида 8Р1 дикого типа, и не были подвергнуты мутагенезу.

Антитела 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и 5.50 были протестированы с помощью анализа ЕЫ8А с захватом» антитела на связывание с синтетическими пептидами, представленными в табл. 3 (за исключением пептидов мутант 7 и мутант 16), следующим образом. Аланиновые мутанты получали с использованием генного кластера Е1ад-8ИМ0-8Р1 с помощью ПЦР, проводимой посредством точкового мутагенеза. Е1ад представляет собой метку Под, а 8иМ0 представляет собой небольшой модификатор, родственный убихитину. Каждый мутант подвергали трансляции ίη νίίτο, и концентрацию нормализовали с помощью вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела против Пад М1. Уровень связывания антитела с каждым мутантом определяли с применением ЕЫ8А-метода, описанного ниже. Пептид 8Р1 дикого типа и каждый мутантный пептид отдельно захватывали в лунках ЕЫ8А-планшета, который был сенсибилизирован моноклональным антителом против Пад М1. Затем в лунки добавляли биотинилированное антитело (4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 или 5.50). Связывание антитела с пептидом детектировали с использованием ПХ-конъюгированного стрептавидина (Р1егсе #21124), проявленного с использованием

- 38 019661

ТМВ, как обсуждается в примере С.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 14. В каждой из гистограмм, представленных на этой фигуре, пептид 8Р1 дикого типа обозначен 0 и расположен на самом конце каждой гистограммы справа. Как видно из этого эксперимента, эпитоп для антител 4.7.1 и 4.9.1 включает аминокислоты 26 и 9 пептида 8Р1 (аминокислоты 33-37 и 40 мышиного ΑNСΡΤ^3; аминокислоты 33-37 и 40 человеческого ΑNСΡΤ^3). Как видно из этого эксперимента, эпитоп для антител 5.35 и 5.50 включает аминокислоты 3-6 и 9-11 пептида 8Р1 (аминокислоты 34-37 и 40-42 мышиного ΑNСΡΤ^3; аминокислоты 34-37 и 40-42 человеческого ΑNСΡΤ^3). Как видно из этого эксперимента, эпитоп для антитела 4.8.3 включает аминокислоты 3-6, 9 и 11 пептида 8Р1 (аминокислоты 34-37, 40 и 42 мышиного ΑNСΡΤ^3; аминокислоты 34-37, 40 и 42 человеческого ΑNСΡΤ^3). Таким образом, было обнаружено, что все нейтрализующие антитела 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и 5.50 связываются с эпитопом в области 8Р1 ΑNСΡΤ^3, которая включает аминокислоты 34-37 и 40 ΑNСΡΤ^3.

I. Определение изотипа

Изотипы антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50 и 1.315.1 определяли стандартными методами. Антитела 4.7.1 и 5.50 имеют изотип 1дС2Ь; антитела 4.8.3, 1.315.1 и 5.35 имеют изотип 1дС2а, а антитело 4.9.1 имеет изотип 1дС1.

Предсказанное время полужизни антитела 1дС2Ь в сыворотке составляет от 3 до 3,5 дней. Предсказанное время полужизни антитела 1дС2а в сыворотке составляет от 6 до 12 дней. Предсказанное время полужизни антитела 1дС1 в сыворотке составляет от 8 до 11 дней.

I. 1п νί\Ό введение моноклональных антител против ΑNСΡΤ^3

Моноклональные антитела против ΑNСΡΤ^3 вводили мышам для того, чтобы определить, могут ли такие антитела эффективно снижать уровни триглицеридов и/или холестерина у мышей. В первом эксперименте 8-недельным мышам-альбиносам С57, которые получали стандартный корм (корм с1то\\-Геб»), инъецировали 30 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на грамм массы тела. Анти-ΑNСΡΤ^3 антитела, протестированные в этом эксперименте, обозначали 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1. В качестве контроля вводили анти-КЬН антитело. Пяти мышам инъецировали каждое из этих антител. Через четыре дня определяли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке мышей, которые получали корм, и мышей, содержащихся в условиях голодания.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 показаны уровни триглицеридов через четыре дня после введения антител 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 и анти-КЬН антитела мышам, которые получали корм, и мышам, которые содержались в условиях голодания. После очистки антитела

4.7.1 собирали два пика. Каждый из этих пиков вводили мышам отдельно (4.7.1-Р1 и 4.7.1-Р2). Введение всех четырех анти-ΑNСΡΤ^3 антител приводило к статистически значимому снижению уровня триглицеридов в сыворотке у мышей, которые получали корм, по сравнению с мышами, которым вводили антиКЬН антитело. Однако в этом эксперименте ни одно из этих анти-ΑNСΡΤ^3 антител не вызывало снижения уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, которые содержались в условиях голодания. Действительно, в этом эксперименте антитело 4.7.1 вызывало повышение уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, содержащихся в условиях голодания.

На фиг. 2 показаны уровни холестерина через четыре дня после введения антител 1.315.1, 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1 и анти-КЬН антитела мышам, которые получали корм, и мышам, которые содержались в условиях голодания. Как описано выше, в этом эксперименте были протестированы два отдельных пика антитела 4.7.1. И в этом случае, введение всех антител приводило к статистически значимому снижению уровня холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм, по сравнению с мышами, которым вводили анти-КЬН антитело. Однако в этом эксперименте ни одно из этих анти-ΑNСΡΤ^3 антител не вызывало снижения уровней холестерина в сыворотке у мышей, которые содержались в условиях голодания.

Во втором эксперименте 8-недельным мышам-альбиносам С57, которые получали корм с1то\\-Геб, инъецировали 30 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на грамм массы тела. В этом эксперименте было протестировано аНΤη-ΑNСΡΤ^3 антитело 4.8.3. Анти-КЬН антитело вводили в качестве контроля. Кроме того, для сравнения тестировали анти-ΑNСΡΤ^4 антитело 14Ό12. См., например, публикацию РСТ № АО 2006/074228. Пяти мышам инъецировали каждое из этих антител. Через четыре дня измеряли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке животных, которые получали корм, и животных, которые содержались в условиях голодания.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 3 и 4. На фиг. 3 показаны уровни триглицеридов в сыворотке мышей, получавших корм, и мышей, содержавшихся в условиях голодания, которым вводили анти-ΑNСΡΤ^3 антитело 4.8.3, анти-ΑNСΡΤ^4 антитело 14Ό12 или анти-КЬН антитело. В этом эксперименте антитело 4.8.3 вызывало статистически значимое снижение уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, получавших корм, и мышей, содержавшихся в условиях голодания. С другой стороны, в этом эксперименте антитело 14Ό12 вызывало статистически значимое снижение уровней триглицеридов в сыворотке только у мышей, содержащихся в условиях голодания.

На фиг. 4 показаны уровни холестерина в сыворотке мышей, которые получали корм, и мышей, которые содержались в условиях голодания, и которым вводили анти-ΑNСΡΤ^3 антитело 4.8.3, анти

- 39 019661

АНСРТЬ4 антитело 14Ό12 или анти-КЬН антитело. В этом эксперименте антитело 4.8.З способствует статистически значимому снижению уровней холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм, и мышей, которые содержались в условиях голодания. С другой стороны, в этом эксперименте антитело 14Ό12 способствует статистически значимому снижению уровней холестерина в сыворотке только у мышей, содержащихся в условиях голодания.

В третьем эксперименте 8-недельным мышам-альбиносам С57, которые получали стандартный корм (корм Χολν-Μ), инъецировали З0 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на грамм массы тела. В этом эксперименте были протестированы анти-АЫСРТЬЗ антитела 4.7.1, 4.8.З и 4.9.1. АнтиКЬН антитело вводили в качестве контроля. Кроме того, для сравнения тестировали анти-АНСРТЬ4 антитело 14Ό12. Десяти мышам инъецировали каждое из этих антител. Через четыре дня измеряли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке животных, которые получали корм, и животных, которые содержались в условиях голодания.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 5 и 6. На фиг. 5 показаны уровни триглицеридов, измеренные через четыре дня после введения им антител 4.7.1, 4.8.З, 4.9.1, 14Ό12 и анти-КЬН антитела мышам, которые получали корм, и мышам, которые содержались в условиях голодания. В этом эксперименте анти-АЫСРТЬЗ антитела 4.8.З и 4.9.1 вызывали статистически значимое снижение уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, которые получали корм. Неспособность антитела 4.7.1 снижать уровни триглицеридов у животных, которые получали корм, может быть частично обусловлена присутствием антитела 1дС2Ь, которое, как было предсказано, имеет время полужизни в сыворотке только З-З,5 дней. В этом эксперименте анти-АЫСРТЬЗ антитела 4.7.1, 4.8.З и 4.9.1, а также анти-АНСРТЬ4 антитело 14Ό12 вызывало снижение уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, которые содержались в условиях голодания.

На фиг. 6 показаны уровни холестерина, измеренные через четыре дня после введения антител 4.7.1, 4.8.З, 4.9.1, 14Ό12 и анти-КЬН антитела мышам, которые получали корм, и мышам, которые содержались в условиях голодания. В этом эксперименте анти-АНСРТЬЗ антитела 4.7.1, 4.8.З и 4.9.1, а также анти-АНСРТЬ4 антитело 14Ό12 вызывали снижение уровней холестерина в сыворотке у мышей, которые получали корм. Однако в этом эксперименте только анти-АНСРТЬЗ антитело 4.9.1 и антиАЫСРТЬ4 антитело 14Ό12 вызывали снижение уровней холестерина в сыворотке у мышей, которые содержались в условиях голодания.

В четвертом эксперименте 8-недельным мышам-альбиносам С57, которые получали стандартный корм (корм Πιοιν-Μ), инъецировали З0 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на г массы тела. В этом эксперименте были протестированы анти-АЫСРТЬЗ антитела 1.125.1, 1.1З2.1, 1.17З.2, 1.З15.1,

1.424.1 и 1.4З1.1 Анти-КЬН антитело вводили в качестве контроля. Каждая группа содержала пять мышей. Через четыре дня и через 8 дней измеряли уровни триглицеридов в сыворотке животных, которые получали корм, и животных, которые содержались в условиях голодания.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 7. В этом эксперименте антитело 1.З15.1 вызывало статистически значимое снижение уровней триглицеридов в сыворотке через 4 дня и через 8 дней.

В пятом эксперименте 8-10-недельным мышам-альбиносам С57, которые получали стандартный корм (корм Πιοιν-Μ), инъецировали 0, З, 10, З0 или 90 мкг моноклонального антитела в объеме 10 мкл на грамм массы тела. В этом эксперименте были протестированы анти-АЫСРТЬЗ антитела 5.З5 и 5.50. Пяти мышам инъецировали каждое из этих антител в каждой дозе. Через четыре дня и через семь дней измеряли уровни триглицеридов и холестерина в сыворотке животных, которые получали корм.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 15 и 16. На фиг. 15 представлены уровни триглицеридов в сыворотке через четыре дня и через семь дней после инъекции мышам различных количеств антител 5.З5 и 5.50. В этом эксперименте оба антитела 5.З5 и 5.50 вызывали снижение уровней триглицеридов в сыворотке через четыре дня после инъекции мышам З0 или 90 мг/кг антитела. В этом эксперименте антитело 5.50 также способствовало снижению уровней триглицеридов в сыворотке через четыре дня после инъекции мышам З или 10 мг/кг антитела. В этом эксперименте через семь дней еще наблюдалось снижение уровней триглицеридов в сыворотке у мышей, которым инъецировали 10, З0 или 90 мг/кг антитела 5.50, однако по прошествии семи дней дальнейшее снижение уровней триглицеридов в сыворотке продолжалось только у мышей, которым вводили 90 мг/кг антитела 5.З5.

На фиг. 16 представлены уровни холестерина в сыворотке у мышей, которым инъецировали различные количества антител 5.З5 и 5.50. В этом эксперименте у мышей, которым инъецировали З0 или 90 мг/кг антитела 5.З5 или 10, З0 или 90 мг/кг антитела 5.50, через 4 дня наблюдалось снижение уровня холестерина в сыворотке. У мышей, которым инъецировали 90 мг/кг антитела 5.З5 или 90 мг/кг антитела 5.50, через семь дней уровни холестерина в сыворотке продолжали снижаться.

К. Введение моноклональных антител против АЫСРТЬЗ АроЕ-дефицитным мышам

Было обнаружено, что у АроЕ-дефицитных мышей развивалась спонтанная гиперхолестеринемия. См., например, Р1ебгаБДа е1 а1. (1992) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 89(10): 4471-5 и Ζ1ι;·ιη§ е1 а1. (1992) δοίспсс 258 (5081): 468-71. Для того чтобы определить, могут ли некоторые моноклональные антитела против АЫСРТЬЗ вызывать снижение уровней холестерина и триглицеридов в сыворотке у АроЕ

- 40 019661 дефицитных мышей, был проведен следующий эксперимент. Трем группам из восьми 14-недельных АроЕ-дефицитных мышей (Та^шс Ашта1 Μοбе1κ, штамм В6.129Р2-Арοе^ίт1υηсN11) внутрибрюшинно инъецировали З0 мг/кг анти-КЬН антитела, З0 мг/кг антитела 5.З5 или З0 мг/кг антитела 5.50. Каждой мыши вводили одну инъекцию на день 0 и одну инъекцию на день 4. Все мыши получали стандартный корм (корм с1ю\\-Геб). У каждой мыши, которая получала корм, уровни триглицеридов и уровни холестерина в сыворотке определяли на день 0 (перед инъекцией), день 4, день 8 и день 12.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 19. На 4-й день антитело 5.З5 вызывало снижение уровней триглицеридов в сыворотке на З6%. Такое снижение продолжалось в течение еще 8 дней, но прекращалось на 12-й день. На 4-й день антитело 5.50 вызывало снижение уровней триглицеридов в сыворотке на 60%. Такое снижение продолжалось в течение еще 8 дней, и такие значительно пониженные уровни триглицеридов в сыворотке сохранялись еще 12 дней.

Антитело 5.З5 вызывало снижение уровней холестерина на 17%, хотя такое снижение достигалось только на 8-й день эксперимента, и несколько снижалось через 12 дней. Антитело 5.50 вызывало снижение уровней холестерина на 4-й день, и такое снижение продолжалось на 8-й и 12-й день эксперимента, а в конце эксперимента оно достигало в целом З0%.

Эти результаты показали, что антитела 5.З5 и 5.50 вызывали снижение уровней триглицеридов и холестерина в сыворотке у АроЕ-мышей. В этом эксперименте более эффективное снижение уровней триглицеридов и уровней холестерина в сыворотке обнаруживало антитело 5.50, что может быть обусловлено более продолжительным временем полужизни этого антитела в сыворотке.

Ь. Ιη νίίτο введение моноклональных антител против АNСРТ^3

Влияние мышиного моноклонального анти-АNСРТ^3 антитела на ЛПЛ-активность тестировали с помощью анализа ίη νίίτο. Для получения ЛПЛ-кондиционированной среды клетки НЕК29ЗР (экспрессионная система Ргеек1у1е™ 29З) (Ιηνίΐτο^η, Саг1кЬаб, СА) трансфицировали ЛПЛ-экспрессирующим вектором, включающим ДНК, кодирующую ЛПЛ, с С-концевой меткой РЬАС в плазмиде ΙΚΕ8 риго (ΟΊοη1ес1г Μοиηίа^η V^еν. СА).

Трансформированные клетки культивировали в среде для отбора (в среде Ргеек1у1е™ 29З 8ук1ет (С1ВС0 ВВЬ, баййегкЬигд, МЭ), в которую был добавлен 1хпенициллин-стрептомицин-глутамин (Ιηνίΐτο^η, Саг1кЬаб, СА) и 2,4 мкг/мл пуромицина). Клетки пронумеровывали и осаждали путем центрифугирования. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в свежей среде Ргеек1у1е'™ 29З, содержащей 1хСР8, без пуромицина, при концентрации 1х10⁶ клеток/мл. После инкубирования в течение 48 ч кондиционированную среду, содержащую ЛПЛ, собирали из клеточной культуры, разделяли на 5 мл-аликвоты, а затем замораживали при -70°С и хранили до использования.

ЛПЛ-активность в кондиционированной среде анализировали путем добавления к аликвотам кондиционированной среды 200 мг/дл Шгайрхб® (РРагтас1а & υρ)ο1ιη), 12 мМ глюкозы, 5 единиц/мл гепарина и 200 мкл 5% мышиной сыворотки (как источника Аро С-ΙΙ). Затем эту среду инкубировали при З7°С. Образцы собирали через 2, 4 и 6 ч, а затем сразу замораживали при -70°С и хранили до проведения анализов. ЛПЛ-кондиционированную среду анализировали на ЛПЛ-активность путем измерения уровней РРА с использованием неразведенной кондиционированной среды и кондиционированной среды, разведенной в отношениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 и 1:З2. Уровни РРА определяли через 2, 4 и 6 ч с использованием набора \ν;·ι1<ο РРА (\νη1<ο Сйетюа1 И8А, Шс., ΡΚΙιιηοιΠ, νΆ).

Также определяли способность моноклональных антител нейтрализовать активность АNСРТ^3 в ίη νίίτο анализе на ЛПЛ-активность. В анализе на ЛПЛ-активность ίη νίίτο измеряли уровни РРА с использованием набора \ν;·ι1<ο РРА (\ν;·ι1<ο Сйетка1 И8А, Шс., ΒίΠιιηοΐ'Π, VА). Отдельные анализы на ЛПЛактивность проводили в присутствии 25 нМ мышиного АNСРТ^3 и четырех концентраций (0,8, 2, 10 и 50 мкг/мл) каждого из 5 моноклональных антител (антител 4.9.1, 4.8.З, 1.З15.1, 4.7.1 и 1.17З.2). Результаты представлены на фиг. 12. Для каждого антитела нейтрализующая активность была продемонстрирована по способности антитела повышать ЛПЛ-активность, то есть спасать ЛПЛ от ее ингибирования под действием АNСРТ^3. Нейтрализующая активность была определена как процент увеличения ЛПЛактивности в присутствии АNСРТ^3 и анти-АNСРТ^3 антитела по отношению к ЛПЛ-активности в присутствии только АNСРТ^3. Четыре антитела (4.9.1, 4.8.З, 1.З15.1 и 4.7.1) обладали способностью спасать ЛПЛ-активность более чем на 50% в зависимости от их концентрации. Полученный результат показал, что эти антитела обладают способностью спасать ЛПЛ-активность посредством нейтрализации активности АNСРТ^3. В противоположность этому, антитело 1.17З.2 не обладало какой-либо значимой способностью спасать ЛПЛ-активность, а поэтому оно служило в качестве внутреннего негативного контроля.

М. Аффинность связывания моноклональных антител против АNСРТ^3

Константы аффинности антител 4.7.1, 4.8.З и 4.9.1 по отношению к N'-НАNСРТ^3Т и НАNСРТ^3Т и константы аффинности антител 4.7.1, 4.9.1, 5.З5 и 5.50 по отношению к пептиду 8Р1 определяли с использованием системы В[АС’0РЕ® З000 (СЕ НеаННсаге, Иррка1а, 8νебеη). В!АС0ЯЕ® З000 представляет собой систему биомолекулярного анализа в реальном времени для детектирования и количественной оценки взаимодействий белок-белок с применением метода поверхностного плазмонного резонанса. С

- 41 019661 помощью системы В1АС0КЕ® 3000, в соответствии с инструкциями производителей, определяли нижеследующие константы аффинности: константу равновесной диссоциации (КО), константу скорости ассоциации (к_оп) и константу скорости диссоциации (к_о{£).

Каждую константу аффинности антител 4.7.1, 4.8.3 и 4.9.1 по отношению к белковым антигенам Ν'Ι^ΝΟΡΤΕοΤ и Ι^ΝΟΡΤΕοΤ определяли следующим образом. Поверхность чипа В1АС0КЕ СМ5 покрывали белковым антигеном путем присоединения 10 мкг/мл Ν'-Ι^ΝΟΡΤΕοΤ или 20 мкг/мл Ι^ΝΟΡΤΕοΤ к поверхности чипа с использованием набора для связывания с амином (продукт № ВК-1000-50, СЕ НеаЛЬсате, Иррка1а 8теебеп). Фазы ассоциации и диссоциации, которые использовали для определения констант ко_п и к_о££, получали путем первой инжекции ЕаЬ-фрагмента антитела (приготовленного с использованием набора для получения ЕаЬ (продукт № 44885, Ρ^е^се. Коск£огб, 1Ь 61105) в соответствии с инструкциями производителя) в систему В1АС0КЕ® 3000, имеющую чип с покрытием, нанесенным на его поверхность, в течение 2 минут при скорости потока 30 мкл/мин. Концентрации тестируемых ЕаЬфрагментов составляли 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 12,5 нМ, 6,25 нМ, 3,125 нМ, 1,5625 нМ, 0,78125 нМ и 0 нМ. Фазу инжекции использовали для определения константы скорости ассоциации или к^. После каждой инжекции ЕаЬ-фрагмент подвергали диссоциации из белкового антигена путем пропускания через буфер В1АС0КЕ Μ8-ΕΡ (продукт № ВК-1001-88, СЕ НеаЛЬсате, Иррка1а 8теебеп) в течение 5 мин на комплексе антиген-ЕаЬ, находящемся на поверхности чипа В1АС0КЕ СМ5. Эту фазу диссоциации использовали для определения константы скорости диссоциации или к_о££. Перед следующей инжекцией поверхность чипа В1АС0КЕ регенерировали путем инжекции 10 мМ НС1 при скорости потока 100 мкл/мин в течение 30 с. Сенсорограммы В1АС0КЕ для анализа данных получали путем вычитания профиля неспецифического связывания эталонной поверхности (иммобилизованной эквивалентными уровнями неродственных белков) из профилей ЕаЬ-специфического связывания антител 4.7.1, 4.8.3 и 4.9.1 на поверхностях чипа. Параметры аффинности, включая величины К_с, ко_п и ко_££, определяли путем построения общей кривой по данным ассоциации и диссоциации для модели связывания 1:1 с поправкой на перенос массы с использованием компьютерной программы В1Аеуа1иЛоп 8ойтеате Уетыоп 3.0 (СЕ НеаЛЬсаге, Иррка1а 8теебеп).

Каждую константу аффинности антител 4.7.1, 4.9.1, 5.35 и 5.50 по отношению к пептидному антигену 8Ρ1 определяли следующим образом. Поверхность чипа В1АС0КЕ СМ5 покрывали Ес-фрагментом антитела против мышиного 1дС путем присоединения 90 мкг/мл Ес-фрагмента козьего антитела против мышиного 1дС IттиηοΡи^е (продукт № 31170, Ρ^е^се. Коск£огб, 1Ь 61105) к поверхности чипа с использованием набора для связывания с амином (продукт № ВК-1000-50, СЕ НеаЛЬсате, Иррка1а 8теебеп). Затем антитело захватывали на поверхности чипа В1АС0КЕ с Ес-фрагментом антитела против мышиного 1дС путем инжекции антитела при скорости потока 10 мкл/мин в течение 30 с. Фазы ассоциации и диссоциации, которые использовали для определения констант к_оп и к_о££, получали путем первой инжекции пептида 8Ρ1 в систему В1АС0КЕ® 3000, имеющую чип с антителом, нанесенным на его поверхность, в течение 2 мин при скорости потока 30 мкл/мин. Концентрации тестируемых пептидов 8Ρ1 составляли 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,78125 и 0 нМ. Фазу инжекции использовали для определения константы скорости ассоциации или коп. После каждой инжекции пептид 8Ρ1 подвергали диссоциации из антитела путем пропускания через буфер В1АС0КЕ №8ΈΡ (продукт № ВК-1001-88, СЕ НеаЛЬсате, Иррка1а 8теебеп) в течение 5 мин на комплексе пептид-антитело, находящемся на поверхности чипа В1АС0КЕ СМ5. Эту фазу диссоциации использовали для определения константы скорости диссоциации или к_о££. Перед следующей инжекцией поверхность чипа В1АС0КЕ регенерировали путем инжекции 10 мМ НС1 при скорости потока 100 мкл/мин в течение 30 с. Сенсорограммы В1АС0КЕ для анализа данных получали путем вычитания профиля неспецифического связывания эталонной поверхности (захватывающей эквивалентные уровни неродственного мышиного 1дС) из профилей антигенспецифического связывания антител 4.7.1, 4.9.1, 5.35 и 5.50 на поверхностях чипа. Параметры аффинности, включая величины К_с, ко_п и к_о££, определяли путем построения общей кривой по данным ассоциации и диссоциации для модели связывания 1:1 с поправкой на перенос массы с использованием компьютерной программы В1Аеуа1иЛоп 8ойтеаге Уетыоп 3.0 (СЕ НеаЛЬсате, Иррка1а 8теебеп).

Результаты этого эксперимента представлены в табл. 4, 5 и 6. Каждое антитело тестировали в дубликате, и результаты каждого эксперимента представлены ниже.

- 42 019661

Таблица 4. Аффинности антител по отношению к N'-ИАNСРΤ^3Τ

Антитело	К_о (нМ)	к_оп (М^_1сек'^г)	к_оЕ1 (сек”¹)
4.7.1	49,5	1,8510*	9, 1510'·
4.7.1	77,5	1,16x10^й	8, 9910'*
4.8.3	210	9,’θθχίθ’	1, 90*10~²
4.8.3	251	1,09*10^й	2,75*10'²
4.9.1	45, 4	Ϊ731ΧΪ0³	5, 9310'·
4.9.1	55	1,3310*	7, 3410'*

Таблица 5. Аффинности антител по отношению к ИАNСРΤ^3Τ

Антитело	К_с (нМ)	к_оп (И ¹сек'¹)	Ε_οίί (сек'¹)
4.7.1	45, 3	1,76*10⁵	7, 9610·
4.7.1	117	8, 12*10⁴	9, 53x10'**
4.8.3	970	2,23x10’	2, 16х10'^г
4.8.3	450	6,00x1ο*¹	2,73*10²
4.9.1	48,1	1,29*10^й	6, 22x10'**
4.9.1	45,2	1,72х10^ь	7,77x10'·* ~~

Таблица 6. Аффинности антител по отношению к пептиду 8Р1

Антитело	К„ (нМ)	к_оп (М'¹сек“¹)	к_о£( (сек'¹)
4.7.1	26, 1	2,09x10^й	5, 46*10'³
4.9.1	46, 1	1,69x10^й	7, 7810'·
5.35	1,80	8,35*10^ь	1,5*10’³
5.50	1,78	1,0810*	1,93x10'**

N. Ш у1уо фармакокинетика некоторых моноклональных антител против АNСРΤ^3

Для определения фармакокинетики этих антител (антитела 4.7.1, 4.8.3 и 4.9.1) 1п у1уо каждое антитело отдельно вводили четырем различным мышам путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 30 мг на кг. Через определенные промежутки времени, указанные на фиг. 13, у мышей брали кровь и получали сыворотку. Уровни анти-АNСРΤ^3 антитела, присутствующего в сыворотке, определяли путем сравнения титров, определенных с помощью ЕЫ8А с захватом антитела, с титрами, определенными по стандартной кривой, построенной с использованием серийных разведений того же самого антитела, которое было инъецировано мышам в ЕШ5А с захватом антитела. ЕШ5А с захватом антитела проводили, как описано в примере С. Результаты представлены на фиг. 13.

Для определения фармакокинетики антител 5.35 и 5.50 1п у1уо уровни антител измеряли у мышей через 4, 7 д и 12 дней после инъекции, как описано в примере 1, в пятом эксперименте. Уровни антиАNСРΤ^3 антитела, присутствующего в сыворотке, определяли с помощью ЕШ5А с захватом антитела, где использовали планшеты, сенсибилизированные рекомбинантным человеческим АЫСРТЬ3. Концентрацию антитела в сыворотке определяли путем сравнения с концентрацией, вычисленной по стандартной кривой, построенной с использованием серийных разведений того же самого антитела, которое инъецировали мышам в ЕШ5А с захватом антитела. ЕШ5А проводили, как описано в примере С.

Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 17. В этом эксперименте антитело 5.50 имеет более продолжительное время полужизни 1п у1уо, чем антитело 5.35. В отличие от антитела 5.35, у антитела 5.50 более продолжительное время полужизни коррелировало с повышенной эффективностью 1п У1уо, как было определено в эксперименте, обсуждаемом в примере 1, и как показано на фиг. 15 и 16.

Фармакокинетика антител 4.7.1, 4.9.1, 5.35 и 5.50 у мышей С57 после одной инъекции им 30 мг/кг антитела проиллюстрирована на фиг. 18. Концентрацию антитела определяют с помощью анализа ЕЫ8А с захватом антитела, проводимого, как описано в примере С. Концентрацию антитела в сыворотке определяли путем сравнения с концентрацией, вычисленной по стандартной кривой, построенной с использованием серийных разведений того же самого антитела, которое инъецировали мышам в ЕЫ8А с захватом антитела. В этом эксперименте антитела 5.50 и 4.9.1 имели примерно одинаковое время полужизни. Кроме того, время полужизни антител 5.50 и 4.9.1 превышало время полужизни антител 5.35 и 4.7.1, у которых оно было примерно одинаковым в данном эксперименте. Кроме того, Стах антител 5.35 и 5.50 были приблизительно эквивалентными, и превышали Стах антитела 4.9.1, которая, в свою очередь, превышала Стах антитела 4.7.1 в данном эксперименте.

O. Последовательности некоторых моноклональных антител против АNСРΤ^3

Были определены вариабельные области тяжелой и легкой цепи антител 4.7.1, 4.8.3, 4.9.1, 5.35 и

- 43 019661

5.50. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.7.1 показана в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 19 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 20 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область легкой цепи антитела 4.7.1 показана в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 27 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕЦ ГО ΝΟ: 28 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.8.3 показана в ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 21 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 22 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область легкой цепи антитела 4.8.3 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 29 (с Νконцевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 30 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.9.1 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 23 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 24 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область легкой цепи антитела 4.9.1 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 31 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 32 (без Νконцевого сигнального пептида). Вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.35 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 63 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 64 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область легкой цепи антитела 5.35 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 67 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 68 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.50 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 65 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 66 (без Ν-концевого сигнального пептида). Вариабельная область легкой цепи антитела 5.50 показана в ЗЕО ГО ΝΟ: 69 (с Ν-концевым сигнальным пептидом) и в ЗЕО ГО ΝΟ: 70 (без Ν-концевого сигнального пептида).

Выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи антител 4.7.1, 4.8.3 и 4.9.1 проиллюстрировано на фиг. 10. Также показана консенсусная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи (ЗЕО ГО ΝΟ: 25). Консенсусная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи без сигнального пептида представлена в табл. 7 (ЗЕО ГО ΝΟ: 26).

Выравнивание вариабельных областей легкой цепи антител 4.7.1, 4.8.3 и 4.9.1 проиллюстрировано на фиг. 11. Также показана консенсусная последовательность вариабельных областей легкой цепи (ЗЕО ГО ΝΟ: 33). Консенсусная последовательность вариабельных областей легкой цепи без сигнального пептида представлена в табл. 7 (ЗЕО ГО ΝΟ: 34).

Р. Гуманизация некоторых моноклональных антител против АКСРТЬ^

В нижеследующем протоколе описана гуманизация антитела 4.7.1. Антитела 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50 и

1.315.1 могут быть гуманизированы одним и тем же методом. Гуманизированный вариант антитела 4.7.1 был обозначен йи4.7.1.. Гуманизированные варианты антител 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50 и 1.315.1 были обозначены йи4.8.3, йи4.9.1, йи5.35, йи5.50 и йи1.315.1 соответственно.

Каркасные области каждой тяжелой и легкой цепи человеческого антитела выбирали из серии семейство-специфичных каркасных областей консенсусной последовательности человеческого антитела, исходя из их гомологии каркасным областям мышиного антитела, присутствующим в антителе 4.7.1. Отобранные человеческие каркасные области диверсифицировали в конкретных положениях аминокислот для выявления разнообразия каркасных областей в выбранном семействе У-генов. Полинуклеотиды, кодирующие СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3 тяжелой цепи антитела 4.7.1, клонировали в библиотеку полинуклеотидов, кодирующих диверсифицированные каркасные области тяжелой цепи человеческого антитела. Полученная библиотека была названа библиотекой вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела 4.7.1. Полинуклеотиды, кодирующие СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3 легкой цепи антитела 4.7.1, клонировали в библиотеку полинуклеотидов, кодирующих диверсифицированные каркасные области легкой цепи человеческого антитела. Полученная библиотека была названа библиотекой вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела 4.7.1. Библиотеку вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела 4.7.1 и библиотеку вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела 4.7.1 клонировали в вектор фагового представления в одноцепочечном Ру(ксРу)фрагменте.

Библиотеку фагового представления ксРу скринировали на антиген-мишень, например, человеческий АКСРТЬ^, путем проведения 2-3 раундов связывания для отбора на ксРу с высокой аффинностью. Затем ксРу экспрессировали в растворимой форме и тестировали на нужную аффинность и/или нейтрализующую активность ίη νί!το. После этого вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи ксРу, отобранные на нужную аффинность и активность, экспрессировали в виде полноразмерных 1дС или ксРу-СЬ-ПЭГ (СЬ представляет собой константную область легкой цепи человеческого антитела) и тестировали на ίη νίνο активность, например, на способность снижать уровни триглицеридов и/или холестерина в сыворотке мышей. ПЭГ присоединяли к группе СЬ посредством цистеина.

О. Аффинное созревание некоторых моноклональных антител против АКСРТЬ^

В нижеследующем протоколе описано аффинное созревание антитела 4.7.1. Аффинное созревание антител 4.8.3, 4.9.1, 5.35, 5.50 и 1.315.1 может быть осуществлено одним и тем же методом. Аналогичным образом, аффинное созревание антител йи4.7.1, йи4.8.3, йи4.9.1, йи5.35, йи5.50 и йи1.315.1 может быть осуществлено одним и тем же методом.

Полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела 4.7.1, подвергали неспецифическому мутагенезу, например, с помощью ПЦР с вероятностью ошибки. ПЦР с вероятностью ошибки осуществляли с использованием набора для неспецифического мутагенеза СеηеМο^ρй® II (З!га!адепе, Ьа ίοΡη, СА) в со

- 44 019661 ответствии с инструкциями производителей.

Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела 4.7.1, также подвергали неспецифическому мутагенезу, например, с помощью ПЦР с вероятностью ошибки. ПЦР с вероятностью ошибки осуществляли с использованием набора для неспецифического мутагенеза СеηеМο^ρй® II (^т-Иадеие, Ьа άοΙΙη, СА) в соответствии с инструкциями производителей. Неспецифически мутированный полинуклеотид тяжелой цепи и неспецифически мутированный полинуклеотид легкой цепи клонировали в вектор фагового представления в одноцепочечом Ρν (8сРу)-фрагменте.

Затем библиотеку фагового представления ксРу скринировали на антиген-мишень, например, на человеческий ΆNСРТ^3. путем проведения 2-З раундов связывания для отбора на ксРу с высокой аффинностью. Затем 8сΡν экспрессировали в растворимой форме и тестировали на нужную аффинность и/или нейтрализующую активность ίη νίΐτο. После этого вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи 8сΡν, отобранные на нужную аффинность и активность, экспрессировали в виде полноразмерных 1дС или ксРу-СЬ-ПЭГ и тестировали на ίη νίνο активность, например на способность снижать уровни триглицеридов и/или холестерина в сыворотке мышей.

Отобранные аффинно-зрелые антитела, если они еще не были гуманизированы, могут быть затем гуманизированы, как описано выше в примере Р.

Хотя в приведенных выше примерах описаны т1ет айа некоторые нейтрализующие моноклональные антитела против мышиного АNСРТ^3 и их действие ίη νίνο у мышей, однако для специалиста в данной области совершенно очевидно, что могут быть продуцированы нейтрализующие моноклональные антитела против человеческого ΆNСРТ^3. и такие антитела имеют одинаковые или аналогичные эффекты ίη νίνο у человека. Этот вывод основан частично на обнаружении того факта, что человеческий и мышиный АNСРТ^3 представляют собой эволюционно консервативные белки, обладающие общими структурными и функциональными свойствами. ίίοηΗίη Ό. е1 а1. (1999) Се^тЦк 62: 477-482. Так, например, аминокислотные последовательности человеческого и мышиного АNСРТ^3 идентичны примерно на 76%. Человеческий и мышиный ΆNСРТ^3 также имеют общие вторичные структурные элементы, например Ν-концевой суперспирализованный домен и С-концевой фибриноген-подобный домен. Кроме того, человеческий ΆNСРТ^3 имеет функцию, аналогичную функции мышиного АNСРТ^3, на что указывает способность человеческого АNСРТ^3 повышать уровни липидов в сыворотке при его сверхэкспрессии у мышей. Κοίκΐιί е1 а1. (2002) №11. Сспс1. З0 (2): 151-157.

Специалисту в данной области в общих чертах известно, что мыши обычно применяются в качестве моделей для лечения различных состояний и заболеваний с использованием нейтрализующих антител. Так, например, нейтрализующие антитела были использованы для лечения заболевания, вызываемого прионами, диабета и воспаления у мышей. См., например, \У1Ше е1 а1. (200З) №11игс 422: 80-8З; СаШеаи е1 а1. (1997) 01аЬе1С8 46: 9З7-940; и ΡοΟιικγ е1 а1. (2002) 1. Iттиηο1. МеПюйк 259:149-157. В последнем исследовании было обнаружено, что моноклональные антитела, нейтрализующие мышиный 1Ь-18, вырабатывались у 1Ь-18-дефицитных мышей. Такие мышиные моноклональные антитела обладали способностью подавлять индуцированный липополисахаридом воспалительный ответ у мышей дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод, что вышеупомянутые примеры подтверждают возможность использования нейтрализующих моноклональных антител против человеческого ΆNСРТ^3 для лечения патологических состояний у человека.

- 45 019661

Таблица 7. Таблица последовательностей

Описание	ЗЕО Ю ΝΟ:	Последовательность
мышиныйАМСРТБЗ рег. Ν» ΝΡ_038941)	1	МНТГКЬРЬГУ νΡ1ΛΠΑ3Κνυ РОЬЗЗРОЗАР ЗБРКЗЛРАМЬ ОПУКИАИСЬ ЪОЪСНСЬКОГ νΗΚΤΚΟΟίΝϋ 1Г0КХЛ1ГО0 ЗРУЩвБЬКТК БИСЕББКЁЬК ηΤΤ3Τ1ι3νΚΝ ΕΒνΚΝΜενΐΙ, МЗКЬЕЗЬЬЕЕ ΚΤΑΧΟΗΚν^Α ЬВЕОЬТЫЫЪ ЗРАОВДеНРВ УТЗЬКЗГУЕО 0П№1РЕЬЬ0 ЗУЕЕйУКфЬЗ ΟΏΗΜφΙΚΕίΕ КОЬЕКТОЮЕ РЗЕМЗЬЗЗКЗ ЯАРКТТРРЬО ЬМЕТЕНТЕОП ОЕРА£)С5АУУ ШЮТНТЗСЗУУ ΤΙΚΡΕΝ5ΟΟΡ ЯУУСОТОЗОЗ РИТЫОНЮТ Ο5ΟΟΕΝΕΤΗΕ НУЕКОРОКЬП ОЕГИЕОБЕК! ΥΑΐνΟΟΒΗΥΙ ЬКЬВйООИКО £ΚΗΥΥΕΥ5ΓΗ ЫЗЗНЕТМУТЬ ΗΨΑΕΙΑΟΝΙΡ САЪРЕНТОЬМ РЗТНИНКАКС дьусрезузо «ЗИНЯМРХСОТ ΝΉΕΝΟΚΥΝΚΡ ЕТК5РРЕКЯР 01УИАРОЗКК 1ЛА1К53КММ ЬОРТГ
γπΑΝ<3ΡΤ1_3Τ	2	МНТ1КЬРЬК¥ УРЕУТАЗКУО РРЬЗЗГОЗАР ЗЕРКБНРАМЪ ΟΟνΚΙΙΛΝΟΕ ьотхадоъко? νΗΚΤΚΟφΙΝΏ ΐρςΚΕΝΙΡΌΟ 5ΓΥΡΕ5ΕΚΤΝ ΒΙΚΕΕ6ΚΕΕΚ ЙТТЗТЬОУКМ ЕЕУКНМЗТЕЪ НЗКЪЕЗЬЬЕЕ КТАЦЖКУВА ЬВВОЬТИЫЬ ЗРАСАфЕНРЕ νΤ3ΕΚ£ΡνΕ0 0ПЫ91КЕЫД} ЯУВЕОУК^ЬЗ ООНМ£>ТКЕТЕ ЮЭЪПКТСЮВ РЗВНЗЪЗЕКЗ ΚΑΡΚΤΤΡΡΙΛ} ЬКВТЕЫТЕф) ΟβΡΑΠϋδΑνΥ ΝΚΟΕΗΤβσνΥ Т1КРКН30СК КУУСТТОеСЗ РИТЫ0НРКО ΟΕφΟΡΝΕΤΗΒ ΝΥΕΚΟΡΌΕΚΟ ОЕРНШЬЕК! ΥΑΐνΟΟΒΝΥΙ ΙΛΕΕΙφϋΉΚΒ ЗКНУУЕУЗРН ЬСЗНБТИУТЬ ΗνΑΕΤΑΟΝΤΡ ОАЪРЕНТСЬМ Ρ3ΤΗΝΗΚΑΚ<3 ОЬУСРЕЗУЗО ОИЧТОГОЮТЕ ННЪВДЗКУНКР РТКЗНРЕККП ОТУИРРОЗЯК ЬУА1К55КММ ЕОРТТСННННН Η
человеческий ΑΝβΡΤί3 рег. № ΝΡ„065310)	3	МРТ1КЫХР1 νΜ*νΐ83Κ10 ОЕЯЗЗГОЗЪЗ РЕРКЗКГАМЬ ΠΟνκίΐΑΗβΕ ЬОЬСНСЬКОР νΗΚΤΚβφΙΝϋ ΙΡςΚϋΝΙΡΟΟ ЗЕПОЬЗЬфТЗ ΕΙΚΕΕΕΚΕΕΡ ΚΤΤΥΚΣφνΚΝ ВВУКНМЗЪЕЬ ИЗКЬЕЗЬЪЕЕ КХЬВДОКУКУ ХЕВДЕТЫЫО КОРЕТРЕНРЕ νΤ3ΙΛΤΡνΕΚ ОЕ№ТКОЪЬО ΤνΕϋΟΥΚΟυϊ ΟΟΗΘΟΙΚΕΙΒ ΝΏΙιΚΚΤδΙΏΕ ΡΤΒΙ5Ε55ΚΡ ЕАРР.ТТРРЬС? ЬМЕ1КЫУКШ> □1РАЕСТТ1У ЫЖЗЕНТЗСМУ ΑΐΚΡ5Ν5ζ}νΡ’ НУУСОУГЗОЗ РМТЫСИПЮ 080ΝΡΝΕΤΗΕ НУКТСРОКЪП СВРНЕСЬЕК1 Υ3ΐνΚ£8ΝΥν ЬК1ЕЬВОИКО ΚΚΗΥΙΕΥ5ΡΥ ЬОМНЕТМУТЬ ΗΕνΑΙΤΟΗνΡ ΝΑΙΡΕΝΚϋΙ,ν ГЗТТОНКАКС НРЯСРЕСУЗО □ГИННЕССЕ ΝΝΙ1Κ3ΚΥΝΚΡ КАК8КРЕРНР ΟΙδΗΚδΟΝΟΒ ЬУЗТКЗТКМЬ ТНРТОЗЕЗРЕ
Γ1ΑΝ<3ΡΤΙ_3Τ	4	МРТХКЫХР1 УРЪУТЗЗРЛО СрКЗЗГОЗЪЗ РЕРКЗЯГАИЬ ηονΚΤΕΑΝΟΙ- ьоъанськор νΗΚΤΚσΟΙΝΡ ΙΓΟΚΕΝΙΡΌΟ ЗРУГББЪОТЗ ЕТКВЕЕКВЬН ВТТУКЬфУКЫ ЕВУКЫМЗЬЕ[\| ЫЗКЬЕЗЪЬЕЕ ΚΙΒ1/0<3ΚνκΥ ЬЕЕдЬТЫЫО Ν^ΡΕΤΡΕΗΡΒ утзьктгуек ооыз1коъьо τνΕυςγκ^ΕΝ οοηεοικειβ НОЬЕНТЗЮЕ РТЕ1БЪ83КР ΗΑΡΚΤΤΡΡΙΛ? £ЛЕ1ККУКН0 βϊΡΑΕσΤΤΙΥ ΝΡΟΕΗΤδΟΜΥ А1В₽ЗИ52УР НУУСВУХЗОЗ РКТЫйНКЮ СЗОИРЫВТИЕ ЫУКУОРОКЬО ОЕГМЫЗЬЕКЛ γ$ινκς3ΝΥν ыивьвонго нкнугвузру ыяшвтють ΗίνΑΙΤαΝνΡ ΝΑΙΡΕΝΚΠΕν Р8Т«0НКАК<5 НРЯСРЕСУвО СИНИНЕЕООВ ΝΝΙιΝΟΚΥΝΚΡ накзкреркр аьзмкзоыак ЬУ5ТК5ТЮ4Ь 1НРТЮ5Е5РЕ ЗННЯЯНН
мышиный АпдрИЗ	5	ТСАСОАОСОА ОААСТТССАА АТТОСТТААА АТТСААТААТ

- 46 019661

(рег. № ΝΜ 013913) (πιΗΝΑ/βΟΝΑ)		ТОАОДСАААА ААТОСАСАСА АТТАААТТАТ ТССТТТТТСТ ТОТТССТТТА СТААТТССАТ ССАОАОТООА ТССАОАССТТ ТСАТСАТТТО АТТСТаСАСС ТТСАСАСССА АААТСААОАТ ТТЭСТАТСТТ ООАТСАТОТС ААААТТТТАС СОАДТСЮССТ ССТССАССТС ООТСАТСОАС ТТАААОАТТТ ТОТССДТААС АСТААОООАС АААТТААСФА САТАТТТСАЗ АА5СТСААСА ТАТТТСАТСА СТСТТТТТАТ ОАССТАТСАС ТТССААССАА ТОАААТСААА СААСАС6ААА АООАОСТАА5 ААСДАСТАСА ТСТАСАСТАС ААСТТААААА ΟΟΑΟΟΑΰΟΤα АА6ААСАТСТ САСТАОААСТ ОААСТСАААС СТТОАСАОТС ТССТ00ААЗА оаасасаосс сттсаасаса аоотсаооос тттссаозао САОСТААССА АСТТААТТСТ ААОСССДССТ 0С30СТСА0С АОСАСССАОА ЛЗТААСАТСА СТСААААСТТ ТТСТАОААСА ОСААОАСААС АССАТДАОАС ААСТССТССА ОА(ЗТОТСОАА СААСАСТАТА ААСААТТААС ТСААСАОСАС АТССАОАТАА ААОДААТАОА ААДССДССТС ДОАДАОДСТС ОТДТТСДАСА АСССТСАСАА ААТТСТСТТТ СТТСТААДТС ААОАОСДССА АСДАСТАСТС ССССТСТТСА ДСТОДАССАА АСАвДАДАТА САОААСААСА тсассттсст сссоастост стоссоггта ТААСАОАСОС ОААСАТАСАА (ЗТввСХЗТбТД ОАСТДТТААА ССААОАААСТ СССААббОТТ ТААТОТСТАС ТОТОАТАССС ААТСАОСЗСАО ТССАТССАСА ТТААТТСДАС АССООАААСА ТОССТСАСАС САСТТСААСС АААСАТООСА АААСТАСОАА ААССССТТТС ООАСОСТСОА ТСОАСААТТТ ГаСТТССССС ТАОАОААОАТ СТАТОСТАТА СТССААСАОТ СТААСТАСДТ ТТТАОаАСТС ОАвСТАСАДа АСТСОАААОА САЗСААЗСАС ТДСОТТОААТ АСТССТТТСА ССТОСССАОТ САССАААССА АСТАСАСОСТ АСАТОПЗССТ ОАОАТТдСТВ дСААТАТССС ТООТОСССГС ССАОА0САСА САОАССТОАТ □ТТТТСТАСА ТО6ААТСАСА ОАССАААОЗС АСАОСТСТАС ТОТССМДАА оттастсаос тоостсгатэа тоодатоаса τατοτοοαοα АААСДАССТА ΑΑΊΌΟΑΑΑΑΤ ДСААСАААСС САОДДССАДА ТССАОАССАС АСАСААОААО АОД6АТСТАС ТООАОАССТС АОАССАСААА (ЗСТСТАТССТ АТСАААТСАТ ССААААТОАТ ОСТССАОССС АССАССТААб ААОСТТСААС ТОААСТСАОА СААААТАДДА ОАТСААТААА ТТАААТАТТА ААОТССТССС ОАТСАСТОТА ОТААТСТООТ АТТААААТТТ ΤΑΑΊΌΟΑΑΑΟ СТТОАСААТТ СААТТТСААТ ТАООТТТААА СТСАТТЭТТА АОАТСАОАТА ТСАССОААТС ААССТАААСА АААТТТАТСТ тгттс
человеческий АпдрНЗ (рег. № ΝΜ 014495) (ι-ηΗΝΑ/οϋΝΑ)	6	ТТССАОААОА АААСАЭТТСС АСОТТОСТТСЗ ААЛТТОАААА ТСААОАТААА ААТОТТСАСА АТТААЙСТСС ТТСТТТТТАТ тетТССГСТА 6ТТАТТТССТ ССА6ААТТ5А ТСААОАСААТ ТСАТСЛТТТб АТТСТСТАТС ТССАбАбССА АААТСААОАТ ТТ6СТАТ6ТТ АОАСОАТСТА ААААТТТТАб ССААТЗСССТ ССТТСА6ТТ0 ОСАСАТООТС ТТАААСАСТТ ТбТССАТААС АСбААПбОСС АААТТААТбА САТАТГТСАА АААСТСААСА ТАТТТСАТСА ОТСТТТТТАТ САТСТАТСбС ТбСАААССАб ТОАААТСААА ЗДАЗДАОААА АССААСТбАб ААОААСТАСА ТАТАААСТАС ААбТСААААА ТОААСА36ТА ААбААТАТСТ САСТТОААСТ СААСТСАААА СТТОАААССС ТССТАОААСА АААААТТСТА СТТСААСААА ААСТСАААТА ТТТА6АА6А9 СААСТААСТА АСТТААТТСА АААТСААССТ ОАААСТССАб ААСАСССАОА АОТААСТТСА СТТАЛААСТТ ТТСТАСАААА АСААбАТААТ АОСЛТСАААО АССТТСТССА САССбТСбАА ОАССААТАТА ААСААТТААА ССААСАЙСАТ АбТСАААТАА ААСАААТАОА АААТСАОСТС АбААббАСТА 6ТАТТСААОА АСССАСАОАА АТТТСТСТАТ СТТССААбСС ААОАЙСАССА АСААСТАСТС ССТГТСТТСА ОТТбААТСАА АТААЗАААТС

- 47 019661

		ТААААСАТОА ТОССАТТССТ (ЗСТЗААТОТА ССАССАТТТА ТААСАОАСКЗТ ОААСАТАСАА ЗТСССАТСТА ТСССАТСАОА СССАОСААСТ СТСААСТТТТ ТСАТСТСТАС ТСТСАТОТТА ТАТСАССТАС ТССАТОСАСА ТТААТТСААС АТСОААТАОА ТСЗАТСАСАА ААСТТСААТв АААССТОЭСЗА ЗДАСТАСААА ТАТОСТТТТб ССАСССТТСЛ. ТССАСААТТТ ТССТТССССС ТАОАСААОАТ АТАСТССАТА ОТОААССААТ СТААТТАТСТ ТТТАСвААТТ САОТТЗОААО АСТбОАААСА СААСАААСАТ ТАТАТГ6ААТ АТТСТТТТТА СТТЗООАААТ САСОАААССА АСТАТАСОСТ АСАТСТАОТТ ЗОЗАТТАСТб 6СААТОТССС СААТЗСААТС ССООААААСА ААЗАТТТСКЭТ ОТТТТСТАСТ ТОССАТСАСА ААЗСААААСС АСАСТТСААС ТОТССАЗАЗС ОТТАТТСАФЗ лавстсстса тзосатоатс астст®заоа ААЛСААССТА ААТ06ТАААТ АТААСАААСС ААЗАвСАААА ТСТААВССАЗ АЗАЗЗАОААО АОСАТТАТСТ Т6ОААЗТСТС ААААТССААС вТТАТАСТСТ АТААААТСАА ССААААТСТТ (ЗАТССАТССА АСАСАТТСАС ААА6СТТТ0А АТОААСТОАС ОСАААТТТАА ААСССААТАА ТТТАААСАТТ ААССТСАТТС СААОТТААТв Т0ОТСТААТА АТСТОСТАТТ АААТССТГАА САСАААССТТ САСАААТАОА ттттттггат сттааастса СТ6ТСТАТТТ ААОАТТАААС АТАСААТСАС АТААССТГАА АОААТАСОЭТ ТТАСАТТТСТ СААТСААААТ ТСТТАТААТА СТАТТТОТТТ ТАААТТТТОТ ЗАТЗТСЗЗАА ТСААТТГТА0 АТЗОТСАСАА ТСТАОАТТАТ ААТСААТАС6 ТОААСТТАТТ АААТААСТТТ ТСТАААТААА АААТПАСАО АСТТГТАТТТ ТАААА0ОСАТ САТАТСАвСТ ААТАТСАСАА СТТТСССАСТ ТТААААААСТ АСТАСТСТТО ТТААААСТСТ АААСТТОАСТ АААТАСА6А0 ОАСТОСТААТ ТСТАСАОТТС ТТАААТеГТЗ ТЛСТАТТААТ ТТСААААСТА ААААТСЗТСА ОСАСАОАОТА ТаТСТААААА ТСТОТААТАС АААТТТТГАА АСТСАТССТГ САТТТТОСТА СААААТААТТ ТООАЙТАААТ ЗТТТОАТАТЙ АТТГАТТТАТ САААССТААТ 6АА6СА0ААТ ТАААТАСТСТ АТТААААТАА ОТТСССТОТС ТТТАААСААА ТООАОАТОАС ТАСТААОТСА САТТОАСТТТ ААСАТОАвЗТ АТСАСТАГАС СТТАТТ
ΓΝ’-<ηΑΝΘΡΤΙ_3Τ	7	εηνορο ьззрозарзе ркзкеамыю укилизыл
ЫЗДОЫФРУН ΚΤΚΟΟΙΝϋΙΡ ΟΚΚΝΤΡϋΟεΡ ΥΟΕ3Ι*ΡΤΝΕΙ
КЕЕЕКЕЬККТ ΤΒΤΙφνΚΝΕΕ УКММЭТЕЬКЭ КЬЕВЬЬЕЕКТ
АЬОНКУЕАЪЕ ЕОЫКЫЬЗР АСАОВНРЕЦТ ЗЬКЗГУЕООО
Ν£Ι*ΕΙ#1Ο5ν ΕΒΟΥΚΟΙ^ΟΟ ΗΜΟΙΚΕΙΕΚΟ ЬЙКТОЮЕРЭ
ЕЫЗЬЗЗКЗЕА РКТТРРЬОЫГ ВТЕИТЕООЬБ нннннн
τΝ'-ΙιΑΝΘΡΤί3Τ	8	ϋΟΙ)Ν33 РРЗЬЗРЕРКЗ ЕРАМЬОРУК! ЬАНбЬЬОЬОН
сыфрунктк βοϊΜΟϊΡΌΚΒ шгоозгтоь зьотзехкее
ЕКВЬККТТУК ΕΟνΚΝΕΕνΚΝ МЗЬЕЪЫЗКЬВ ЗЬБЕЕКТЫХ)
ОКУКЗЪВБОЬ ТНЫОНОРБТ РВНРВУТЗЬК ΤΕνΕΚΏϋΝΒΙ I
КОЫдОТУЕРО ΥΚΟυΐΟΟΗβΟ ΓΚΕΙΕΝΟΕΚΚ Τ5Ι0ΕΡΤΕΙ5
ЬЗЗКРРАРКТ ТРЕЬбЪКЕТК. КУКНГХЗГРЬЕ нннннн
область γπΑΝ(3ΡΤΙ_3 8Ρ1	9	ЕРКЗНГДМЬРОУК1ХАНОЬЬ01Х?Н<ЗЪ
область ΗΑΝΘΡΤ13 8Р1	10	Еркзагймы)оук11лд<зьь<эьсн<зь

- 48 019661

3^1/-0’^ж пептид	11	ЗЕУОРОЬЗЗРОЗАРЗЕРКЗЕРАМЬООУТСТОАМЗЬ ЬОЬбИОЬКВГУНКТКО
ϋ^4ϊ-Ε“¹ пептид	12	ОУЕС11Л»ЮЬЬ0ЬСНСЬКЛРУНКГКС01МО1Р0КЫ41ГО0 ЗЕТОЬЗЬКТНЕ
О^в'-М^11впептид	13	ΟΙΝΟΙ РОКГЖ РООЗГУОЬ$ЬКТ№1КЕВВКВЬК ΚΤΤδΤΟςνΚΝΕΒνΚΝΜ
1 141 1 < пегттмд	14	1КЕЕЕКЕЬКР.ТТЗТ1Х}УКМЕЕУИТМЗУЕЬ№КЬЕЗВЬЕВ КТАЬОНКУЙАЬ
ап/ о1оЬ ° пептид	15	ЗУЕ1ЛЗКЬЕ£Ы.ЕЕКТА10НКТЛгАЬЕВй1.ТЫЫЬ ЗРАОАОЕНРЕУТЗЬКЗ
лип с -и пептид	16	ВЕОЪТИЫЬЗРА<ЗАОЕНРВУТ5ЬК8РУЕООТ»181ВЕЫ₁а 8νΕΕζ)ΥΚ0ϋ80
р«чц/1·	17	ΡνΈ0αο»5ΙΚΕίΕ08νΕΕ0ΥΚ0Ο800ΗΜ0ΙΚΕΙΕ КОЬККТОЮЕРЗВИЗЬ
л19Н п^а41 ” « Ό пептид	18	0НМ01КЕ1ЕКСЬПКТ310ЕР5ЕХ5Ь58К5ВАРКТТР₽ЬО ЦНВТВЛТЕфОЮ
вариабельная область тяжелой цели антитела 4.7.1	19	МЕЯЗН1РЪРЪ ЬЗОТАОТНЗЕ УОЬСОЗОРЕЬ УКРОАЗУКМЗ СКАЗОПТТЗ УУМННУКОКР ОООЬЕИКЗУР ΝΡΥΝ03ΤΚΥΝ ЕКРКЭКАТЬТ 3ΟΚ333ΤΑΥΜ ЕЬЗЗЬТЗЕОЗ АУУУСАКЕЗО ΥΥ6ΥΡΟΥΗΟ6 (ЗТТЬТУЗЗА
вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.7.1 без сигнального пептида	20	в удьодзсрвь укрсазукнз сказоутртз УУМННУКОКР <5<?6ЬЕИЮТР ΝΡΥΝΓΧ3ΤΚΥΝ ВКРКОКАТЬТ 5ЮК838ТАУМ ВЬЗЗЬТЗЕЛЗ ΑνΥΥΩΑΗΕΟϋ ΥΥΟΥΡΟΥΗΟζ} «ЭТТЬТУЗЗА
вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.8.3	21	МВИ5Н1РЬРЬ ЬЗОТАСУНЗЕ УОЬООЗСРЕЬ УКРОАЗУЕМЗ СКА53УТР12 СУМНИУКОКР бООЬВНЮУ! ΝΡΥΝΟΟΓΚΥΝ ΕΚΡΚ6ΚΑΊΧΤ 80Κ883ΤΑΥΜ Е0Я31/Г8Е08 АУУУСАВЕОО υυουρουηοο сттътузяа
вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.8.3 без си шального пептида	22	Е УЗЬОфЗСРЕЬ УКРСАЗУКМЗ СКАЗСУТР13 СУМННУКйКР ООЗЬЕИКЗУГ ΝΡΥΝΟ3ΤΚΥΗ ЕКЕКОКАТЬТ 5ΟΚ833ΤΑΥΜ ЕЬЗЗЬТЗЕОЗ АУУУСАКЕСР ΥΥΟΥΡΟΥΗΟΟ СТТЬТУЗЗА
вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.9.1	23	МЕИЗН1РЬРЬ ЬЗЗТАСУНЗВ УОЬООЗвРЕЬ УКРСАЗУКМЗ сказоутгтз γνΜΗκνκςκρ οοαι,ΕΗίαγι νρυνοοτκυν ΕΝΡΚαΚΑΤΕΤ 5ΟΚ333ΤΑΥΜ ЕГЗЗЬТЗЕОЗ АУУУСАКЕГЮ ΥΥΟΥΡΟΥΗΟΟ ОТТЪТУЗЗА
вариабельная область тяжелой цепи антитела 4.9.1 без сигнального пептида	24	В УСЬООЗОРЕЪ УКРОАЗУКМЗ СКАЗСУТРТЗ УУМНИУКОКР бОСЬЕНТОГГ ΝΡΥΝΕΜ3ΤΚΥΝ ЕЫРКСКАТЬТ 30Κ888ΤΑΥΜ ЕГЗЗЬТ8ЕРЗ АУУУСАЙЕСО ΥΥΟΥΡΟΥΗΟί} ©ттьтузза
консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи	25	МЕИЗНТРЪРЬ ЬЗСТАОУНЗЕ уоьоазорвь УКРОАЗУКМЗ СКАЗОУТРТЗ УУМНИУКОКР ОСаЬЕНИУ! ΝΡΥΜΓΧ3ΤΚΥΝ ЕКРКСКАТЬТ 80Κ333ΤΑΥΜ ЕЬЗЗЪТЗЕОЗ АУУУСАВЕОР ΥΥΟΥΡϋΥΜΟΟ ОТТЬТУЗЗА

- 49 019661

консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цели без сигнального пеппада	26	В УОЬООЗОРЕЬ УКЕЧЗАЗУКМЗ СКА5СУТРТЗ ТУМНИУКОКР ОваЪЕИЮТ! ΝΡΥΝΒβΤΚΥΝ ЕКГКСКАТЬТ 3ΡΚ335ΤΑΥΜ ЕЕЗЗЬТЗЕСЗ ΑνΥΥΟΑΡ,ΕΟΟ УУСУРОУИСО сттъттезд
вариабельная область легкой цепи антитела 4.7.1	27	МЗЗАОГЬЗЬЬ ЪЬСРССТЯСЕ 1£МТС7Т531 ЗАЗЬЗЗК’.’ТТ
ЗСРЛЗООТЗЛ РЬМНГООКРО ΟΤνΚΙΛΙΥΥΤ 3Κ1Η3σνΡ3Β РЗОЗОЗСТОУ ЗЬТ13ИЬЕ0В О1АТУРС00С НТЬРРТРССО ТИБЕТ КЕ
вариабельная область легкой цепи антитела 4.7.1 без сигнального пептида	28	ϋ 1(}МТ0ТТ351к ЗАЗЬСЛКУТГ 3σΚΑ30ΟΙ3Ν ГЬЫИУОДКРП <3ΤνΚΙιΜΥΥΤ зкьнзоурзк езсзсзстоу ЗЫЧЗШВДЕ ΠΙΑΊΎΓΟΟΟΟ ЫТЬРРТЕСОа ТКЬЕТКЕ
вариабельная область легкой цепи антитела 4.8.3	29	МЗЗАОГЬОЫ. ЪЬСРОСГКСЕ ЮМТОТТЗЗЬ ΞΑείΛϋΚνΤΙ ЗСИАЗ<2О1КМ ΥΕΝΗΥΟςΚΡΟ (ЗТУКЬЫУУТ ЗКЬНЗЗУРЗР, рзазсзстоу збттзыбкое ϋίΑΤΥΡΟοοα ΝΠ,ρρτροασ ТКБВ1КЕ
вариабельная область лептой цепи антитела 4.8.3 без сигнального пептида	30	В Ι0ΜΤςΤΤ33Ε 3Α8£Χ5ΒΚντΐ ЗСМАЗООХЫЯ υγνηυοοκρο ΰτνκι^ιγγτ ЗКЬНЗСУРЗР РЗСЗСЗСТПУ 3Ι/ΓΙ£ΝΙκΚ9Ε ϋΙΆΤΥΡΓΟΟΟ ΝΤΕΡΡΤΡΟσΟ τκχεικκ
вариабельная область легкой цели антитела 4.9.1	31	ИЗЗАОРЬСВЪ ЬЬСРООАКСО ГОМТОТТЗЗЬ 8А31*ООЙУТ1
зснАЗСггтр.н уьннуоокро отцкьыуут зкьнзст/рзр. РЗОЗОЗОТОУ ЗБТГЗНБЕОЕ МАТУРСООО РГГБРРТРССО ТИБЕТ КР.
вариабельная область легкой цепи антитела 4.9.1 без сигнального пептида	32	ϋ ТОМТОТТЗЗЬ ЗАЗЬСОЙТТ! ЗСКАЗОБ1НЫ ΥΕΝΗΥΟΟΚΡϋ ОТУКБЫУУТ ЗКБНЗОТРЗК РЗСЗСЗСТОУ зьт1зиье>2е ϋίΑΤΎΡσοοα лтбрртргзос τρχεικκ
консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи	33	МЗЗАОРЬОЪЬ ББСРООХКСО 10МТОТТЗЗБ ЗАЗЬСГЖУТТ 5СНА5$Ю1ХЫ ΥΠίΗΥΟφΚΡΟ ΟΤΥΚΙΧΙΥΥΤ ЗКЬНЗОУРЗК РЗСЗСЗСТОУ 8ЪТ1вМЬЕС>Е ОГАТУРС00С ИТЬРРТРССС ΊΤΧΕΙΚΚ
консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи без сигнального пептида	34	О ЮМТОТТЗБЬ ЗАЗЬСОЮТ! ЗСВА8001ХЫ ΥΕΝΗΥΟΟΚΡΒ ОТУКЪЫУГГ £&ЬНЭД7Р5£ Ρ5Ο3Ϊ336ΤΟΥ δΕΤΙδΝΙκΕΟΕ ΟΙΑΤΥΡΟΟΟβ ЫТЬРРТРЗОС ТКЬЕ1КН
С0П1 тяжелой цепи антитела 4.7.1	35	сутртзуумн
СРК2 тяжелой цепи антитела 4.7.1	36	ΥΡΝΡΪΝΏΟΤΚΪΗΕΚΡΚα
ЗОЕЗ тяжелой цепи антитела 4.7.1	37	Κ3ΕΥΥ<3ΥΡΟΥ
СРР1 тяжелой цепи антитела 4.8.3	38	αγτριεονΜΚ
СОК2 тяжелой цели антитела 4.8,3	39	ΥΙΝΡΥΝΟΟΤΚΥΝΕΚΡΚΕ
СРЕЗ тяжелой цепи антитела 4.8.3	40	ΕαϋΥΥΟΥΓΟΥ

- 50 019661

СЭР1 тяжелой цепи антитела 4.9. Ϊ	41	СУТРТЗУУМН
ССЖ2 тяжелой цепи антитела 4.9.1	42	ΥΙΝΡΥΝΤΧ5ΤΚΪΝΕΝΡΚΟ
С№3 тяжелой цепи антитела 4.9.1	43	Εοογγαγττγ .
СОК1 лепюй цели антитела 47.	44	ΚΑδς0Ι3ΝΡίΝ
СЭН2 легкой цепи антитела 47.1	45	УТЗЕЪНЗ
СВДЗ легкой цепи антитела 47.1	46	ΟΟΟΝΤΕΡΡΤ
СЭР1 легкой цепи антитела 4,3.”	47	НАЗООНПТУЬН
СОР2 легкой цепи антитела 4.8.3	46	УТЗВЬНЗ
СО АЗ легкой цепи антитела 4,8.3	49	00ОЙП.РРТ
С0К1 легкой цепи антитела 4.9.1	50	ΡΛ300ΙΚΝΥΙ»Η
С№2 легкой цепи антитела 4.9.1	51	ΥΤ5ΚΕΗ3
СОКЗ легкой цепи антитела 4.9.1	52	ОООМТЬРРТ
консенсусная последовательность СОК1 тяжелой цепи	53	СУТРТЗУЖН
консенсусная тосуйщоватольность СОК2 тяжелой цели	54	ΥΙΝΡΥΚΕβΤΚΥΝΕΚΡΚβ
консенсусная последовательность СЕЖЗ тяжелой цепи	55	ΒΟΕΥΎΟΥΡΕΥ
консенсусная последовательность СОМ легкой цели	56	КА30Е1ХКУЬЫ
консенсусная последовательность СОР2 легкой цели	57	УТЗКЬИЗ
консенсусная поспедойтельность СЕЖЗ легкой цели	58	00ΟΝΤΕΡΡΤ
мышиныйАНС!РТ1_3 8¹⁷-О²⁴⁰	59	δΚνϋ РЕЬЗЗЕЕЗАР ΞΒΡΚ3ΚΡΆΜΕ ΟΟνΚΙΙΑΝΟΈ ЫЗХХЗНОЬКОР νΗΚΤΚσζ>ΙΝΟ ГРСКЬНТГОС ЗРУЮЬЗЬР.ТЫ ΕΙΚΕΒΕΚΕΙ.Ρ ΕΤΤ5ΤΜ5νΚΝ ВВУКИМЗУЕЬ ЫЗРХЕЗЬЬЕЕ ΚΤΑΕΟΚΚνΚΑ. ЬЕЕфЬТЫЫЕ ЗРАОАфЕНРЕ УТЗЪКЗГУЕО аОН31НЕЫХ) ЗТЕЕрУКОЪЗ СЮИМ01КЕ1В коькктоюе РЗЕЛЗЬЗЗКЗ НАРР.ТТРРЦ2 βΝΕΤΕΝΤΕΟϋ
человеческий ΑΝΟΡΤΙ.3 ϋ^-Ρ²⁴³	60	Е 0ΒΝ38ΡΕ3Ι·3 РЕРКЗКРАМЬ ОЕУКНАЫаЬ ЪОЪСНСЬКОР νΗΚΤΚΟΟΙΗϋ 1ЕОК1Л1РЕО ЗЕУОЬЗЬОТЗ ЕГКЕЕВКЕЪК ΚΤΊΎΚΕΟνΚΝ ЕЕУКЫМЗЬЕЬ МЗКЬЕЗЬЪВБ ΚΤϋΟΟΚνΚΥ ЬБЕОЬТНЪКЗ ΝΟΡΕΤΡΕΗΡΕ УТЗЬКТРУЕК 0ОН31КЕЫС ТУЕЕОУКОЬМ Ο0Η50ΙΚΕΙΕ НОЬНКТЗЩЕ РТБ15ЬЗЗКР НАРКТТРРЬО ΕΝΕΙΚΝνΚΗΒ ΟΙΡ
мышиный ΑΝ6ΡΤΙ.3	61	ΟνΚΙΕΑΝΟΕ ЪОЪОНаьКЕР νΗΚΤΚΏΟΙΝϋ ТРОКЬЫТРОС!

- 51 019661

		зрупдзькты еткеввкедп кттвтъсукн её7ютм
8Р2-КШ	62	ЕРКЗКГАМЬООУКПЛМаЬЬОЬОНСЬС
вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.35	63	нокътезш. ыураут/ьяо утёкезсрст ънреотьтьт
СЗГЗЗРЗЬКТ РЗЬАТЗЯТВО РЗЗКЗЬЕИДС ΠΙΒΚΕΡΗΚ’Γχ' иетъкзльтх зкоззккфгр ιλιμπτοταώ такуусакье ТСТСРАУКСО СТЬУТУЗАА
вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.35 без сигнального пептида	64	ζ} νΤϋΚΕδΟΡεί ЬНРЗДТЬТЬТ СЗРЗСКЗЫ1Т ροϊΑνοΗίκο рзексьЕньа нтнноонкуу нсуькзеилч ЗКЛЗЗКВДУР ΙΛΙΑΝνυΤΑϋ ТАКУУСАНЬЕ КЗТОРАУИСО σπιντνδΑΑ
вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.50	65	МОНЗНТРЬРЬ ъзотаоуьзб уоьоозсреь νκρβΑβνκιβ СКАЗОРТРТО ΥΥΜΜΗνκΟδΗ ОЕЗЬЕНТООТ ΝΡΝΝΟΟΤΙΥΝ СКРЙСКАТЬТ νϋΚ38δΤΑΥΜ ЕЬЯЗЬТЗЕОЗ АУУУСТКЪРН ΥΡ0νΗ(3Τ<3ΤΤ ντν83Α
вариабельная область тяжелой цепи антитела 5.50 без сигнального пептида	66	В \’СЬ005СРЕЬ νΚΡΟΑβνκΙΘ СКАЗОГТРТР ΥΥΜΝΝνΚΟδΗ СВЗЬЕИГСОГ ΝΡΝΝΟΘΤΙΥΝ ОКЕКСКАТЬТТОКБЗЗТАУМ ЕЬВЗЬТЗЕОЗ ΑΥΥΥΟνΚΕΡΜ УИЖЮТСТТ ντν53Α
вариабелная область легкой цепи антитела 5,35	67	МКСЬАЕГЬОЬ ЬУЬН1Р<ЭА1О П1УЪТОЗТРЗ УРУТРОЕЗУЗ 15СН53К5ЬЬ Ο£Ν6ΙΤΪΙιΎΝ РЬОЯРООЗРО ЬЫУКНЗКЬА 50νΡϋΕΡ505 С5ЕТАРТЬЙ1 ЗКУЕАЕГЛгаУ УУСМОРЕЕУР гтроАаткьЕ ъкгсз
вариабельная область полюй цепи антитела 5.35 без сигнального пептида	68	ШУЪТфЗТРЗ ν₽νΤΡ(3Ε3ν3 15СЙ53К5Ы1 сзиситуьуи РЬОЕРСОЗРО 1ЫУКМЗК1А ЗСУРОНГ&ЗЗ С5ЕТАРТБЕ1 3ΚνΕΑΕϋν(3ν УУСМОРЬВУР РТРОАОТКЬВ ΕΝΟ
вариабельная область легкой цепи антитела 5.50	69	мкьтаып. мртиразззв т/ъмтотрьеь рузьсмазт
ЗСР.ЗЗОЗТЬН ЗНСЫТУЬЕКР ЬОКРвОЗРКЬ ЫУКУЗККРЗ етроягзазс зотоктшз еуеаеоызуу усгосзнуру ТРОССТК11В1 кк
вариабельная область легкой цепи антитела 5.50 без сигнального пептида	70	□ УЪМТфТРЬЗЬ РУЗЬОООАЗ! 5СЬ35081ЬН 3Ν0ΝΤΥΒΕΗΓ ьакрсазркь Ι>ΙΥΚν5ΝΗΓ5 αν₽ϋΚΕ3Ο3β 5ОТОКТЬК15 КТЕАЕОЬбУУ УСРфСЗНУРУ ТЯЭОТТКГ»Е1 кк
СОР1 тяжелой цепи антитела 5.35	71	СРЗЮТРСБАУСЗ
СОК2 тяжелой цепи антитела 5.35	72	Н1ННГЮНКУУН(ЗУЬКЗ
СОРЗ тяжелой цепи антитела 5.35	73	ЬЕТОТСЕАУ
СЭР1 тяжелой цепи антитела 5.50	74	ΕΡΤΡΤΟΥΥΜΝ
СРК2 тяжелой цепи антитела 5.50	75	бхирдаовтткнохткс
СОРЗ тяжелой цели антитела 5.50	76	ЬРНУРЮУ
СОР1 легкой цепи	77	кззкзЕьизикэттуьу

- 52 019661

антитела 5.35
СЭК2 легкой цепи антитела 5.35	78	ЕИЗК1Л5
СОКЗ легкой цепи антитела 5.35	79	ИОРЬБУРРТ
С1Ж1 лепюй цепи антитела 5.50	80	Н5г<25И.И5ЫСЫТУЬЕ
СБК2 легкой цепи антитела 5.50	81	КУ5ИКРЗ
СОКЗ легкой цепи антитела 5.50	82	ЕОСЗНУРТГ
мутант 1	63	АРКЗВРАМЬООУКИЛИСЬЬОЬбНСЬ -
мутант 2	84	ВАКЗКГАМ1ДЮУК1 ЪАНвЬЬОЬвНГЗЬ
мутант з	85	ЕРАЗКРАМЪООУКИЛИаЦЬОЦСНЙЬ
мутант 4	86	ΕΡΚλΧΡΑΜΙΧϋνΚΙ ΙΛΝ<3ΙΧςΐΧ5Η<3Ε
мутант 5	87	Ε₽Κ3ΑΕΑΜΪΧ0νκΐ ЬАНСЪЬОГХНОС
мутант 6	88	ерк5шм1лн>ук1 ииюььоьснсь
мутант 8	89	ЕРКЗКГААЬВЭТК!
мутант 9	90	ΕΡΚδΚΡΑΜΛϋΟνκΐ ЪАМСЬЬСЬСНдЦ
мутант 10	91	ΕΡΚ3ΚΡΑΜΙΛϋνκΐ ЬАМСЬЬйШНСЬ
мутант 11	92	е₽кзкгамыжук1 ыигздьодензь
мутант 12	93	ЕРКЗКРАМЬПОАКТ ЬАИСЬЪОШНЦЬ
мутант 13	94	ЕРКЗКРАМЬР0УА1 ьАнсылзшнеь
мутант 14	95	ЕРкгнгамшлгкАЪАНсъьодензь
мутант 15	96	ЕРК5КРАМЬВЛ\ПС1*АЫ(ЗЬЬОЬвН<;ь
мутант 17	97	ЕРКЗКРАМЬПОУК1ЬАА<ЭЬЪОЬОН<31.
мутант 18	98	ЕРКЗКРАМЪРОУКИЛНЛЬЬОЬСНСЪ
мутант 19	99	ЕРКЗНРАНШРУКИЛНСЛЬОЬСНГЗЪ
мутант 20	100	ЕРКЗКРАМЬСОУК11ЛНС1Л<2ЪОН<ЗЬ
мутант 21	101	ВРКЗКРАМЫЛЛГК! ЬАТКЗЫЛЬСНСЬ
мутант 22	102	ЕРКБКГАМЫтеУК! ЬАМЭБЬОЛвНСЗЪ
мутант 23	103	ЕРКЕКРАМЬООУКПЛНОЫЛЛАНЭЬ
мутант 24	104	ЕРК8ИРАМЫИ>УК1ЬАНСЫХ}ЬСАвЬ
мутант 25	105	В₽К8ЯРАМЬОРУК1ХЛНОЫИ2ЬаНАЬ
мутант 26	106	ЕРКЗКГАМЬОРУК1ЕАН<ЭЕЬ0ЬСН6А
мыш иным ΑΝβΡΤΙ.4 (рег. № ΝΡ.065606)	107	тгсаррадаа 1у1сааЪ«д1 1заддградр еррг£азч/4е ппИаЬдИя 1дЬд1геЬуе гСгдд1да1« ггтаасдпас ддркдкйар! к<3зес1гуред дСреС1дз1д Ьд1кадпэк1 дд1£дкуадд дгу1вкдп1г 1дп1дздШ1 1ар£Ъ1с1пду <2к1згдкк1е ктСдИдТЛе пасЬШграг £сде1£деде гЬвд1£д1др 1дзрр£1упс етСвЗддкру 1дгг1адвуб £пдвыеаукй д£д<1рдде£ы 1д1ектЬз1(. дЗгдзч1ауд 1д<3ч3дпак1 1д£р1И1дде скау51д1ге ррапе1дасп уврпд1в1р£ аСмбдсЦкНг д«11псаке18 ддх*г£дС’СвИ зп1пдду£Ье аргдгдеткк д1£«к1;щкдг уур1даЬ.£11 1дртеаСааз
человеческий ΑΝ6ΡΤ1.4 (рег. № ΝΡ 647475)	106	тадарСадаа 1ш1сааСау1 1задддрудз карг£аз»3е тпу1аЪд11д 1ддд1геИае гСгзд1ва1е гг1засдзас ддЪедзЬШр 1арезгу<3ре У1кв1дкд1к адпвг!дд1£ НкуадддгЫ екдЫгадЫ дзд£д11<1Ьк ЫЗДвтакра
		хгкхЛретад руЗраИпувг 1Ьг1ргЗсде Идудегдзд 1£е1дрддвр р£1упсктСв Цддисухдгг Ь<1двуй£пгр кеаукад£дд рВде£«1д1е куЪзгЬдЗгп εΓίβνςΙτά» ддпаеНдСг уЫддебСау з1д1саруад д1даЕ£уррз д1зур£зг»<1 ддксИггйкп сакз1еддим £дссеЬзп1п дду£тгв£рдд гдк1ккд1£м кеыгдгуур1 даЪСтИдрт ааеаае .
область δΡ 1 мышиного ΑΝ<3ΡΤΙ 4	109	ОРЕРРЕРАЗН ОЕМНЪЬАНаЬ ЬОЬОНбЬ
область ЗР1 человеческого ΑΝ6ΡΠ-4	110	ЗК5РКРАЗИ0 ЕМНУТАНСЬЬ СЬОООЬ

- 53 019661

Список последовательностей <110> ЬЕХЮОЫ РНАКМАСЕиТЮАЬЗ, ΙΝΟ.

<120> МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ΑΝΟΡΤ13 <130> 07705.0026-00304 <14 0>

<14 1>

<150> 60/373,834 <151> 2006-12-08 <160> 112 <170> РаЬепЫп νβΓΞίοη 3.3 <210> 1 <211> 455 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 1

МёЬ 1

Н13

ТЬг

Пе

Ьуз 5

Ьеи

РЬе

Ьеи

РЬе

Уа1 10

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

Не 15

А1а

Зег

Агд

Уа1

Азр

Рго

Азр

Ьеи

Зег

РЬе

Азр

5ег

А1а

Рго

Зег

С1и

20

25

30

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

А1а

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

35

40

45

С1у

Ьеи

Ξΐη

Ьеи

С1у

Η13

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Уа1

Η13

Ьуз

ТЬг

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

Не

Азп

Азр

11е

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

11е

РЬе

Азр

е1п

65

70

75

80

Зег

РЬе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

Азп

(Ли

Не

Ьуз

С1и

85

90

95

Ьуз

С1и

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

ТЬг

Ьеи

С1п

Уа1

Ьуз

Азп

(Ни

С1и

10 0

105

НО

Уа1

Ьуз

Азп

Мер

Зег

С1и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

115

120

125

С1и

Ьуз

ТЬг

А1а

Ьеи

С1п

Η1Ξ

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

С1и

С1п

130

135

140

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

Зег

Рго

А1а

С1у

А1а

С1п

С1и

Н13

Рго

31и

145

150

155

160

- 54 019661

Уа1

ТЬг

Зег Ьеи Ьуз 165

Зег

РЬе

ν$1

31и

С1п 170

С1п

АЗр

Азп

Зег

11е 175

Агд

С1и

Ьеи

С1п

Зег

Уа1

С1и

01п

Туг

Ьуз

С1п

Ьеи

Зег

31п

С1п

180

185

190

Н15

МеС

С1п

Не

Ьуз

С1и

11е

С1и

Ьуз

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

С1у

Не

195

200

205

С1п

С1и

Рго

Зег

С1и

Азп

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

Агд

А1а

Рго

Агд

210

215

220

ТЬг

Рго

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

61и

ТЬг

С1и

Азп

ТЬг

С1и

С1п

Азр

225

230

235

240

Азр

Ьеи

Рго

А1а

Азр

Суз

Зег

А1а

Уа1

Туг

Азп

Агд

С1у

С1и

Н13

ТЬг

245

250

255

Зег

С1у

νβΐ

Туг

ТЬг

11е

Ьуз

Рго

Агд

Азп

Зег

С1п

С1у

РЬе

Азп

Уа1

260

265

270

Туг

Суз

Азр

ТЬг

С1п

Зег

С1у

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

Ьеи

Не

С1п

Н13

Агд

275

280

265

Ьуз

Азр

<31у

Зег

С1п

Азр

РЬе

Азп

С1и

ТЬг

Тгр

С1и

Азп

Туг

С1и

Ьуз

290

295

300

31у

РЬе

С1у

Агд

Ьеи

Азр

С1у

С1и

РЬе

Тгр

Ьеи

61у

Ьеи

С1и

Ьуз

11е

305

310

315

320

Туг

А1а

Не

Уа1

С1п

Зег

Азп

Туг

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

С1и

Ьеи

С1п

325

330

335

АЗр

Тгр

Ьуз

Азр

Зег

Ьуз

Н13

Туг

Уа1

С1и

Туг

Зег

РЬе

Н13

Ьеи

С1у

340

345

350

Зег

Н15

С1и

ТЬг

Азп

Туг

ТЬг

Ьеи

Н1з

Уа1

А1а

С1и

Не

А1а

С1у

Азп

355

360

365

Не

Рго

С1у

АХа

Ьеи

Рго

С1и

Н13

ТЬг

АЗр

Ьеи

Мес

РЬе

Зег

ТЬг

тгр

370

375

380

Азп

Н18

Агд

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Ьеи

Туг

Суз

Рго

61и

Зег

Туг

Зег

С1у

ЗЭ5

390

395

400

С1у

Тгр

Азп

Азр

11е

Суз

С1у

31и

Азп

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

405

410

415

- 55 019661

Туг Азп Ьуз Рго Агд ТИг Ьуз Зег Агд Рго С1и Агд Агд Агд С1у Не
420	425	430

Туг Тгр Агд Рго С1п	Зег Агд Ьуз Ьеи Туг А1а	11е Ьуз Зег Зег Ьуз
435	440	445

МеЬ Μβϊ Ьеи С1п Рго ТНг ТЬг

450 455 <210> 2 <211> 462 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 2

Мес 1

ΗΪ5

ТЬг

Не

Ьуз 5

Ьеи

РЬе

Ьеи

РЬе

Уа1 10

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

11е 15

А1а

Зег

Агд

Уа1

Азр

Рго

Азр

Ьеи

Зег

РЬе

Азр

Зег

А1а

Рго

Зег

61и

20

25

30

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

35

40

45

С1у

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

Н15

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Уа1

ΗΪ3

Ьуз

ТЬг

50

55

60

Ьуз

С1у

01п

Х1е

Азп

Азр

11е

РЬе

61п

Ьуз

Ьеи

Азп

Не

РЬе

Азр

О1п

65

70

75

80

Зег

РЬе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

Азп

31и

11е

Ьуз

С1и

85

90

95

Ьу5

С1и

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

ТЬг

Ьеи

С1п

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

100

105

но

Уа1

Ьуз

Азп

МеГ

Зег

Уа1

С1и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

115

120

125

С1и

Ьуз

ТЬг

А1а

Ьеи

61п

Н15

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

61и

С1и

О1п

130

135

140

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Зег

Рго

А1а

С1у

А1а

С1п

(31и

ΗΪ3

Рго

С1и

145

150

155

160

Уа1

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

РЬе

Уа1

С1и

С1п

А5р

Азп

Зег

Не

Агд

165

170

175

- 56 019661

С1и

Ьеи

Ьеи 61п 130

Зег Уа1

61и С1и С1п 185

Туг

Ьуз

С1п Ьеи

5ег 190

С1п

Н13

МеЬ

С1п

11е

Ьуз

31и

Не

С1и

Ьуз

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

ТНг

С1у

11е

195

200

205

С1п

С1и

Рго

Зег

С1и

АЗП

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

Агд

А1а

Рго

Агд

210

215

220

ТЬг

ТИг

Рго

Ьеи

ΰΐη

Ьеи

Азп

01и

ТЬг

С1и

Азп

ТЬг

С1и

С1п

Азр

225

230

235

240

Азр

Ьеи

Рго

А1а

Азр

Суз

Зег

А1а

Уа1

Туг

АЗП

Агд

С1у

С1и

Н13

ТЬг

245

250

255

Зег

31у

Уа1

Туг

ТИг

11е

Ьуз

Рго

Агд

Азп

Зег

С1п

С1у

РНе

Азп

Уа1

260

265

270

Туг

Суз

Азр

ТНг

С1п

Зег

С1у

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

Ьеи

11©

С1п

Н1з

Агд

275

280

285

Ьуз

Азр

С1у

Зег

С1п

Азр

РЬе

Азп

С1и

ТЬг

Тгр

С1и

Азп

Туг

С1и

Ьуз

290

295

300

С1у

РЬе

С1у

Агд

Ьеи

Азр

61у

С1и

РЬе

Тгр

Ьеи

С1у

Ьеи

61и

Ьуз

Не

305

310

315

320

Туг

А1а

Не

Уа1

С1п

Зег

АЗП

Туг

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

(Ни

Ьеи

С1п

325

330

335

Азр

Тгр

Ьуе

Азр

Зег

Ьуз

Н13

Туг

Уа1

С1и

Туг

Зег

РЬе

Н15

Ьеи

31у

340

345

350

Зег

Н13

<31и

ТЬг

Азп

Туг

ТЬг

Ьеи

Н15

Уа1

А1а

(Пи

11е

А1а

С1у

А5П

355

360

365

Не

Рго

61у

А1а

Ьеи

Рго

61и

Н15

ТЬг

Д5Р

Ьеи

Мес

РЬе

5ег

ТЬг

Тгр

370

375

380

Азп

Н13

Агд

А1а

Ьуз

С1у

С1п

Ьеи

Туг

Суз

Рго

С1и

Зег

Туг

Зег

С1у

385

390

395

400

С1у

Тгр

Азп

Азр

Не

Суз

С1у

С1и

Азп

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

405

410

415

Туг

А5П

Ьуз

Рго

Агд

ТЬг

Ьуз

Зег

Агд

Рго

С1и

Агд

С1у

Не

420

425

430

- 57 019661

Туг

Тгр

Агд 435

Рго

С1п

Зег

Агд

Ьуз 440

Ьеи

Туг

А1а

Не

Ьуз 445

Зег

Ьуз

Μθί

Ме£

Ьеи

С1п

Рго

ТЬг

ТНг

С1у

Нгз

450

455

460

<210> 3

<211> 460

<212> БЕЛОК

<213> Ното заргепз

<400> 3

меъ

РНе

ТНг

Не

Ьуз

Ьеи

РНе

Не

Уа1

Рго

Ьеи

Уа1

11е

Зег

1

5

10

15

5ег

Агд

Не

Азр

С1п

Азр

Азп

Зег

РНе

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1и

20

25

30

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РНе

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

35

40

45

С1у

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

Нгз

61у

Ьеи

Ьуз

Азр

РНе

Уа1

Нгз

Ьуз

ТЬг

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

Не

Азп

Азр

11е

РНе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

Не

РНе

Азр

С1п

65

70

75

80

5ег

РНе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

С1п

ТНг

Зег

С1и

Не

Ьуз

С1и

85

90

95

Ьуз

61и

Ьеи

Агд

ТЬг

Туг

Ьуз

Ьеи

С1П

Уа1

Ьуз

Азп

ст

С1и

100

105

НО

Уа1

Ьуз

Азп

Мер

Зег

Ьеи

С1и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

115

120

125

01и

<Э1и

Ьуз

Не

Ьеи

С1п

Ьуз

Уа1

Ьуз

Туг

Ьеи

С1и

С1п

130

135

140

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

Не

С1п

Азп

61п

Рго

С1и

ТЬг

Рго

<31и

Нгз

Рго

61и

145

150

155

160

Уа1

ТНг

Зег

Ьеи

Ьуз

ТЬг

РНе

Уа1

С1и

Ьуз

С1п

Азр

Азп

Зег

Не

Ьуз

165

170

175

Азр

Ьеи

С1п

ТНг

УаЬ

61и

Азр

С1п

Туг

Ьуз

С1п

Ьеи

Азп

С1п

180

185

190

- 58 019661

Нгз

Зег

С1п 195

Не

Ьуз

С1и

11е

С1и 200

Азп

С1п

Ьеи

Агд

Агд 205

ТЬг

Зег

11е

01η

С1и

Рго

ТЬг

С1ц

11е

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Рго

Агд

А1а

Рго

Агд

210

215

220

ТЬг

Рго

РЬе

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

61и

11е

Агд

Азп

Уа1

Ьуз

Нгз

Азр

225

230

235

240

31 у

Не

Рго

А1а

С1и

Суз

ТЬг

11е

Туг

Азп

Агд

С1у

С1и

Н13

ТЬг

245

250

255

Зег

С1у

МеП

Туг

А1а

11е

Агд

Рго

Зег

Азп

Зег

С1п

Уа1

РЬе

Н1з

Уа1

260

265

270

Туг

Су5

Аэр

Уа1

Пе

Зег

С1у

Зег

Рго

Тгр

ТЬг

Ьеи

11е

С1п

Нгз

Агд

275

280

285

11е

Азр

С1у

Зег

61п

Аэп

РЬе

Аэп

С1и

ТЬг

Тгр

С1и

Дэл

Туг

Ьуз

Туг

290

295

300

С1у

РЬе

С1у

Агд

Ьеи

Аэр

С1у

С1и

РЬе

Тгр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1и

Ьуз

Не

305

310

315

320

Туг

Зег

Не

Уа1

Ьуз

С1п

Зег

Азп

Туг

Уа1

Ьеи

Агд

Не

С1и

Ьеи

61и

325

330

335

А5р

Тгр

Ьуз

Азр

Азп

Ьуз

Нгз

Туг

11е

С1и

Туг

Зег

РЬе

Туг

Ьеи

С1у

340

345

350

Азп

Н1з

01и

ТЬг

Азп

Туг

ТЬг

Ьеи

Нгз

Ьеи

Уа1

А1а

Не

ТЬг

С1у

Αδη

355

360

365

Уа1

Рго

Азп

А1а

Не

Рго

С1и

Азп

Ьуз

Азр

Ьеи

Уа1

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

370

375

380

Азр

Н15

Ьуз

А1а

Ьуз

С1у

Нгз

РЬе

Азп

Суз

Рго

61и

С1у

Туг

Зег

С1у

385

390

395

400

С1у

Тгр

Η1Ξ

Азр

С1и

Суз

С1у

С1и

Азп

Ьеи

Азп

<31 у

Ьуз

405

410

415

Туг

Азп

Ьуз

Рго

Агд

А1а

Ьуз

Зег

Ьуз

Рго

СЬи

Агд

С1у

Ьеи

420

425

430

Зег

Тгр

Ьуз

Зег

С1п

Азп

61у

Агд

Ьеи

Туг

Зег

Не

Ьуз

Зег

ТЬг

Ьуз

435

4 4 0

445

- 59 019661

МеС Ьеи Не Н18 Рго ТЬг Аэр Зег 61и Зег РЬе С1и

450 455 460 <210> 4 <211> 467 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 4

МеС 1

РЬе

ТЬг

Не

Ьуз 5

Ьеи

РЬе

Не 10

7а1

Рго

Ьеи

7а1

11е 15

Зег

Агд

Не

Азр

С1п

А$р

Азп

Зег

РЬе

Азр

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61и

20

25

30

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

А1а

Мес

Ьеи

Азр

7а1

Ьуз

Пе

Ьеи

А1а

Азп

35

40

45

С1у

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

Н1з

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Уа1

Н13

Ьуз

ТЬг

50

55

60

Ьуз

С1у

С1п

11е

Азп

Азр

11е

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

Не

РЬе

Азр

С1п

65

70

75

80

Зег

РЬе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

С1п

ТЬг

Зег

С1и

11е

Ьуз

С1и

О1и

С1и

85

90

95

Ьуз

О1и

Ьеи

Агд

ТЬг

Туг

Ьуз

Ьеи

С1 п

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

100

105

110

Уа1

Ьуз

Азп

Мес

Зег

Ьеи

С1и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

115

120

125

О1и

С1и

Ьуз

Не

ьеи

Ьеи

01п

О1п

Ьуз

Уа1

Ьуз

Туг

Ьеи

61и

61п

130

135

140

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

11е

31п

Азп

61п

Рго

61 и

ТЬг

Рго

(31и

Н13

Рго

С1и

145

150

155

160

Уа1

ТНг

Зег

Ьеи

Ьуз

ТЬг

РЬе

Уа1

61и

Ьуз

61п

Азр

Азп

Зег

11е

Ьуз

165

170

175

Азр

Ьеи

С1п

ТЬг

Уа1

С1и

Азр

С1п

Туг

Ьуз

01п

Ьеи

Азп

61п

31п

180

185

190

Н15

Зег

О1п

11е

Ьуз

С1и

11е

61и

Азп

(л1П

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

Не

195

200

205

- 60 019661

61η

61и 210

Рго

ТНг

61и

Не

5ег 215

Ьеи

Зег

Ъуз

Рго 220

Агд

А1а

Рго

Агд

ТНг

Рго

РНе

Ьеи

61п

Ъеи

А$л

61и

Не

Агд

АЗП

Уа1

Ъуз

Н1з

Азр

225

230

235

240

61у

11е

Рго

А1а

61и

Суз

ТНг

ТЬг

11е

Туг

Азп

Агд

С1у

С1и

Н13

ТКг

245

250

255

Зег

61у

Ме!

Туг

А1а

11е

Агд

Рго

Зег

Азп

Зег

С1п

Уй1

РЬе

Н13

Уа1

260

265

270

Туг

Суз

Азр

УаЪ

Не

Зег

61у

Зег

Рго

Тгр

ТНг

Ьеи

11е

С1п

Н15

Агд

275

280

285

Не

Азр

С1у

Зег

61п

Азп

РНе

Азп

61и

ТКг

Тгр

61и

Азп

Туг

Ьуз

Туг

290

295

300

61у

РНе

61у

Агд

Ьеи

Азр

61у

С1и

РНе

Тгр

Ьеи

61у

Ьеи

61и

Ъуз

Не

305

310

315

320

Туг

Зег

Не

Уа1

Ъуз

С1п

Зег

АЗП

Туг

νεί

Ьеи

Агд

Не

С1и

Ъеи

С1и

325

330

335

Азр

Тгр

Ъуз

Азр

Азп

Ъуз

Н13

Туг

11е

61и

Туг

Зег

РЬе

Туг

Ъеи

61 у

340

345

350

Азп

Н15

61и

ТНг

Азп

Туг

ТНг

Ъеи

Н13

Ъеи

Уа1

А1а

11е

ТНг

61у

Азп

355

360

365

Уа1

Рго

Азп

А1а

Т1е

Рго

6111

Азп

Ьуз

Азр

Ъеи

Уа1

РЬе

Зег

ТНг

Тгр

370

375

380

Азр

Н1з

Ьуз

А1а

Ъуз

61у

Н13

РНе

Азп

Суз

Рго

61и

С1у

Туг

Зег

СЪу

385

390

395

400

61у

Тгр

Н15

Азр

С1и

Суз

61у

61и

Азп

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

405

410

415

Туг

Азп

Ъуз

Рго

Агд

А1а

Ъуз

£ег

Ъуз

Рго

61и

Агд

С1у

Ьеи

420

425

430

Зег

Тгр

Ъуз

Зег

61п

Азп

С1у

Агд

Ъеи

Туг

Зег

Не

Ьуз

Зег

ТНг

Ъуз

435

440

445

МеС

Ьеи

Не

Н15

Рго

ТНг

Азр

Зег

61и

Зег

РЬе

61и

С1у

Н13

Нгз

Н13

450

455

460

- 61 019661

Ηίδ ΗΪ3 ΗΪ5

465 <210> 5 <211> 1605 <212> ДНК <213> Μυ£ п1изси1из

<400> 5 Асаддаддда	даадААссаа	аХХдеХАааа	аААдааАааА	Ададасаааа	ааАдсасаса	60
аААаааААаА	АссААХААдА	ХдАХссАААа	дАааААдсаА	ссададАдда	АссадассАА	120
АсаХсаАААд	аААсАдсасс	ААсададсса	аааАсаадаА	ААдсАаАдАА	ддаАдаАдАс	180
ааааХАААад	сдааХддссХ	ссАдсадсАд	ддАсаАддас	ААааадаААА	АдАссаАаад	240
асАаадддас	аааХХаасда	саХаАААсад	аадсАсааса	АаАААдаАса	дАсАААААаА	300
дассАаАсас	ХАсдаассаа	АдаааАсааа	даададдааа	аддадсАаад	аадаасАаса	360
АсАасасАас	аадХХааааа	сдаддаддГд	аадаасаХдА	садАадаасА	даасАсааад	420
сАХдададАс	АдсАддаада	даадасадсс	сААсаасаса	аддАсадддс	АААддаддад	480
садсхаасса	асАХааХАсА	аадсссадсЬ	ддддсХсадд	адсасссада	адАаасаХса	540
сАсаааадАА	ААдХадааса	дсаадасаас	адсаАаадад	аасАссАсса	дадАдАддаа	600
даасадАаАа	аасааААаад	Асаасадсас	аАдсадаАаа	аадаааАада	ааадсадсАс	660
адааадасАд	дАаХХсаада	асссАсадаа	ааААсАсААА	сААсАаааАс	аададсасса	720
адаасАасАс	ссссАсХАса	асХдаасдаа	асадааааХа	садаасаада	АдассААссА	780
дссдасАдсХ	еХдеедХХАа	Хаасададдс	даасаХасаа	дАддсдАдАа	сасАаААааа	840
ссаадааасА	сссаадддАА	ХааАдХсХас	АдАдаАассс	ааАсаддсад	АссаХддаса	900
АХааХАсаас	ассддааада	АддсХсасад	дасААсаасд	ааасаХддда	ааасАасдаа	960
аадддсАААд	ддаддсАсда	АддадааААА	АддААдддсс	АададаадаА	сАаАдсАаАа	1020
дХссаасадА	сХаасАасаХ	АААасдасАс	дадсАасаад	асАддааада	садсаадсас	1080
ХасдХАдааА	асХссХАХса	ссАдддсадА	сасдааасса	асАасасдсА	асаХдХддсА	1140
дадаААдсАд	дсааАаАссс	АддддсссАс	ссададсаса	садассАдаА	дХХААсАаса	1200
АддааХсаса	дадсаааддд	асадсАсАас	АдАссадааа	дААасАсадд	АддеХддАдд	1260
ХддааАдаса	ХаАдХддада	ааасаассАа	ааАддааааА	асаасааасс	садаассааа	1320
Ассадассад	ададаадаад	адддаХсАас	АддадассАс	ададсадааа	дсАсАаАдсА	1380
аАсаааХсаА	ссааааХдаХ	дсАссадссс	ассассАаад	аадсгАсаас	АдаасАдада	1440
сааааХаааа	даАсааХааа	ААаааАаААа	аадАссАссс	даАсасАдАа	дАааАсАддА	1500
аА А аааа X X С	ХааХддааад	сААдадааАА	дааАААсааА	АаддАААааа	сАсаААдХАа	1560

- 62 019661

ада!сада!а	Ссассдаа0с	аасд!аааса	ааа000аСс1:	е000с	1605
<210> 6 <211> 2126 <212> ДНК <213> Ното	зархепз
<400> 6 !!ссадаада	ааасад1;0сс	асд!!дс!!д	ааа00даааа	1;саада0ааа	аа0д00саса	60
а!!аадс!сс	0000000030	!д!6сс!с!а	д00з0ССссС	ссадааССда	0саадасаа£	120
!са!са!!!д	а00с0с0а0с	!ссададсса	ааа0саада1:	1:0дс0а£д00	адасдаИд0а	180
аааа!!!!ад	ссааСддссИ	ссССсадИд	ддасаСддСс	С0ааадас1:0	0д0сса0аад	240
асдаадддсс	аааССааСда	сасаСССсаа	ааасСсааса	0ар00да0са	д0с00000аС	300
да!с!а!сдс	Сдсаааесад	!дааа!сааа	дзадаадааа	аддаасЬдад	аадаас1аса	3 60
1а!ааас1ас	аадСсааааа	!даададд!а	аадаа0а0д0	сас00даас0	саас0саааа	420
сЬЬдааадсс	Ьсе0адаада	ааааа!!с!а	с00саасааа	аад0дааа0а	000адаадад	480
саас!аасга	ас00аа0£са	ааа!саасс!	дааасЬссад	аасасссада	ад0аас00са	540
сССаааасЫ:	ССдСадаааа	асаада!аа!	адсаьсааад	асс00с0сса	дассдЪддаа	600
дассаабаЪа	аасзаЬЬааа	ссаасадса!	эд0сааа0аа	эадааакада	ааа£садс0с	660
адааддас1а	д0а00саада	асссасадаа	а000с0сса^	О00ссаадсс	аададсасса	720
адаасСасСс	СС0£0С0Соа	д!!даа!даа	а0аадааа1:д	СаааасаСда	0ддса0ЬссС	780
дссдаа!д!а	ссассаСССа	!аасададд!	дааса0асаа	дСддса0д0а	СдссаСсада	840
сссадсаасС	сП саадЫ; С С	!са!д!с!ас	0д0да0дССа	0&0садд0ад	£оса0ддаса	900
(Паа! !саас	аСсдаа0ада	!дда!сасаа	аас00саа!:д	ааасд0ддда	даас0асааа	960
!а!ддССЫ.д	ддаддсЬСда	бддадаа!!.!	0дд00дддсс	0ададаада0	а0асСсса0а	1020
д1даадсааС	сСаа00а0д0	1 Ыасдаа!!	дад00ддаад	ас0ддааада	саасаааса0	1080
!а!а!!даа!	31:(:0001:1:1:3	с!!дддааа!	сасдаазссз	ас0а0асдс0	аса0с0ад'Ы:	1140
дсдаЫасбд	дсаа0д0ссс	саабдсааЬс	ссддааааса	аада000дд0	дьееесьасг	1200
!ддда!саса	аадсаааадд	асас!!саас	0д0ссададд	д00ак0садд	аддсЬдд0дд	1260
!ддса!да!д	ад0д0ддада	ааасаассба	аа0дд0ааа0	а0аасааасс	аададсаааа	1320
!с!аадссад	ададдадаад	адда!!а!с!	0ддаадЬс1:с	аааа0ддаад	д00а0ас0с£	1380
а!аааа!саа	ссаэаа0д00	да!сса!сса	асадаССсад	ааадсМгСда	аЪдаасСдад	1440
дсааатаа	ааддсааСаа	СИааасаС!	аасс0са00с	саадС1:аа0д	0ддСсСаа0а	1500
а1:.::.дд!.а1.(	ааа0сс00аа	дадааадс!!	дадаааСада	ίΐί000Ц0а0	с00ааад0са	1560
с!д!с!а!!Е	аада00ааас	а!асаа!сас	а^аассССаа	адаа0ассд0	00асаС00с0	1620
саатсаааа!	0с00а0аа1а	с!а!1!д!!Ь	0заа0000д0	да0дЬдддаа	0саас000ад	1680

- 63 019661

аСддСсасаа	СсСадаССаС	ааСсааСаад	СдаасССаьС	аааСаасССС	СсСаааСааа	1740
аааСССадад	асССССаССС	сааааддсас	саСаСдадсС	ааСаСсасаа	сСССсссадС	1800
ССаааааасС	адЬасСсССд	ССаааасСсС	ааасССдасС	аааСасадад	дасСддСааС	1860
ЬдСасадССс	ССаааСдССд	СадСаССааС	ССсаааасСа	ааааСсдСса	дсасададСа	1920
СдСдСааааа	сссдсаасао	аааСССССаа	ассдасдосс	сассссдсса	саааасаасс	1980
СддадСаааС	дСССдаСаСд	аСССаСССас	дааассСааС	даадсадааС	СаааЬасСдС	2040
ассаааасаа	дССсдсСдСе	СССааасааа	СддадаСдас	СасСаадСса	саССдасССС	2100
аасаСдаддС	аСсасСаСас	сССаСС				2126

<210> 7 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетическая конструкция <400> 7

5ег 1

Агд

Уа1

Азр

Рго 5

Азр

Ьеи

Зег

РЬе 10

Азр

Зег

А1а

Рго

Зег 15

01 и

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РНе

А1а

МеС

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

11е

Ьеи

А1а

Азп

20

25

30

С1у

Ьеи

С1п

Ьеи

Б1у

Н15

31у

Ьеи

Ьуз

Азр

РНе

Уа1

Н1з

Ьуз

ТЬг

35

40

45

Ьуз

С1у

С1п

Пе

Азп

Азр

Т1е

РНе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

11е

РЬе

Азр

«31п

50

55

60

Зег

РНе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

Азп

61и

Не

Ьуз

С1и

61и

65

70

75

80

Ьуз

С1и

Ьеи

Агд

ТНг

Зег

ТЬг

Ьеи

С1п

7а1

Ьуз

Азп

С1и

85

90

95

νβΐ

Ьуз

Азп

МеС

8ег

Уа1

01и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

5ег

Ьеи

100

105

110

С1и

Ьуз

ТНг

А1а

Ьеи

С1п

Н13

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

<31и

С1и

С1п

115

120

125

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

5ег

Рго

А1а

С1у

А1а

С1п

С1и

Н15

Рго

С1и

130

135

140

- 64 019661

Уа1 145

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

зег 150

РЬе

Уа1

С1и

С1п

С1п 155

Азр

Азп

Зег

Не

Агд 160

61ц

Ьеи

С1п

Зег

Уа1

61и

С1и

С1п

Туг

Ьуз

С1Ь

Ьеи

Зег

61Ь

61П

165

170

175

Н18

Мех

С1п

Не

Ьуз

61и

11е

С1и

Ьуз

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

61у

11е

180

185

190

61П

С1и

Рго

Зег

<31и

Азп

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

Агд

А1а

Рго

Агд

195

200

205

ТЬг

Рго

Ьеи

(51п

Ьеи

Азп

61и

ТЬг

С1и

Азп

ТЬг

61и

61п

Азр

210

215

220

Ьеи С1и Н1з Н1з Н1з Н1з Н15 Н1з

225 230 <210> 8 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 8

Азр С1п 1

А5р Азп

Зег 5

Зег

РЬе Азр

Зег

Ьеи 10

Зег

Рго

С1и

Рго

Ьуз 15

Зег

Агд

РЬе

А1а

МеЬ

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

С1у

Ьеи

20

25

30

С1п

Ьеи

61у

Н1з

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Уа1

Н15

Ьуз

ТЬг

Ьуз

С1у

61п

35

40

45

Не

Азп

Азр

Не

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

Не

РЬе

Азр

С1п

Зег

РЬе

Туг

50

55

60

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

61п

ТЬг

Зег

61и

Не

Ьуз

Е1и

61и

С1и

Ьуз

С1и

Ьеи

65

70

75

80

Агд

ТЬг

Туг

Ьуз

Ьеи

С1п

Уа1

Ьуз

Азп

(31и

61 и

Уа1

Ьуз

Азп

85

90

95

Мер

Зег

Ьеи

61и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

61и

Зег

Ьеи

61и

С1и

Ьуз

100

105

но

Не

Ьеи

61п

Ьуз

Уа1

Ьуз

туг

Ьеи

61и

(31п

Ьеи

ТЬг

Азп

115

120

125

- 65 019661

ьеи

Не 130

С1п

Азп

С1п

Рго

С1 и 135

ТЬг

Рго

С1и

Н13

Рго 140

С1и

Уа1

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

ТЬг

РЬе

Уа1

С1и

Ьуз

С1п

Азр

Азп

Зег

Не

Ьуз

Азр

Ьеи

145

150

155

160

01 п

ТЬг

Уа1

С1и

Азр

С1п

Туг

Ьуз

СЬп

Ьеи

Азп

О1п

С1п

Н13

Зег

С1п

165

170

175

Не

Ьуз

С1и

Не

С1и

Азп

С1п

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

11е

С1п

С1и

Рго

180

185

190

ТЬг

С1и

Не

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Рго

Агд

А1а

Рго

Агд

ТЬг

Рго

195

200

205

РЬе

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

61и

Не

Агд

Азп

Уа1

Ьуз

Н13

Азр

С1у

Не

Рго

210

215

220

Ьеи

С1и

Лаз

Н1з

Н13

Н15

225 230 <210> 9 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Ми® тизси1из <400> 9

С1и	Рго	Ьуз	Зег	Агд	РЬе	А1а	Ме!	Ьеи	Азр Азр УаЬ	Ьуз Не Ьеи А1а
1				5					10	15
Азп	61у	Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Нгз	С1у	Ьеи

25 <210> 10 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 10

С1и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а	Мес Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз Не Ьеи А1а
1	5	10	15

Азп С1у Ьеи Ьеи С1п Ьеи С1у Н13 С1у Ьеи

25

<210> <211> <212> <213>	11 50 БЕЛОК Миз тизсиЬиз
<4 00>	Н

- 66 019661

Бег 1	Агд	Уа1	Аэр	Рго 5	Азр	Ьеи	Бег
Рго	Ьуз	Бег	Агд 20	РЬе	АХа	МеС	Ьеи
61у	Ьеи	Ьеи 35	Й1п	Ьеи	С1у	Н13	С1у 40

Бег	РЬе 10	Азр	Бег	АХа	Рго	Зег 15	С1и
Азр 25	Азр	Уа1	Ьуэ	Не	Ьеи 30	А1а	Азп
Ьеи	Ьу5	Азр	РЬе	Уа1 45	ΗΪ3	Ьуз	ТНг

Ьуз 01у <210> 12 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из

<40О> 12	Не	Ьеи А1а Азп 5	Б1у
Азр УаХ 1	Ьуз
Ьуз	Азр	РНе	Уа1 20	ΗΪ5	Ьуз	ТНг	Ьуз
Ьуз	Ьеи	Азп 35	11е	РНе	Азр	С1п	Бег 40

Ьеи Ьеи <31 п Ьеи СХу Н1з С1у Ьеи

10	15
О1у С1п Не	Азп Азр Не РНе С1п
25	30
РЬе Туг Азр	Ьеи Бег Ьеи Агд ТЬг
	45

Азп С1и <210> 13 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз гпизси!из

<400> 13
С1п 1	11е	Азп	Азр	11е 5	РЬе	ОХп	Ьуз
Туг	Азр	Ьеи	Зег 20	Ьеи	Агд	ТЬг	Азп
Ьеи	Агд	Агд 35	ТНг	ТЬг	Бег	ТЬг	Ьеи 40
А5П	МеС 50

Ьеи Азп 11е РЬе Азр С1п Зег РЬе

10	15
С1и Не Ьуз С1и	С1и <51и Ьуз С1и
25	30
С1п Уа1 Ьуз Азп	С1и О1и 7а1 Ьуз
	45

<210> 14 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси!из

- 67 019661 <400> 14

11е 1

Ьуз

61и

61 и

61 и 5

Ъуз

61и

Ьеи

Агд

Агд 10

ТНг

ТЬг

Зег

ТЬг

Ъеи 15

С1п

Уа1

Ьуз

Азп

61и

С1и

Уа1

Ьуз

Азп

МеС

Зег

Уа1

61и

Ъеи

Азп

Зег

Ьуз

20

25

30

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

61 и

С1и

Ъуз

ТЬг

А1а

Ъеи

С1п

Н13

Ьуз

Уа1

Агд

40 45

А1а Ьеи <210> 15 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЪиз <400> 15

Зег 1

Уа1

61и

Ъеи

Азп 5

Зег

Ьуз

Ьеи

61и

Зег 10

Ьеи

Ъеи

61и

Ьуз 15

ТЬг

А1а

Ьеи

61п

Н15

Ьуз

Уа1

Агд

А1а

Ьеи

61и

61п

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

20

25

30

11е

Ьеи

Зег

Рго

А1а

61у

А1а

61 ь

61и

Ηί®

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Зег

Ъеи

40 45

Ьуз 5ег <210> 16 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 16

61и 1

61и

61п

Ьеи

ТЬг 5

Азп

Ьеи

11е

Ьеи

5ег 10

Рго

А1а

61у

А1а

61п 15

С1и

Н1з

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

5ег

РЬе

Уа1

61и

61п

Азр

Азп

20

25

30

Зег

11е

Агд

61и

Ьеи

Ъеи

61п

Зег

Уа1

С1и

61и

61п

Туг

Ъуз

С1п

Ьеи

35

40

45

Зег 61п <210> 17 <211> 50

- 68 019661 <212> БЕЛОК <213> Миз шизси1из <400> 17

РНе 1

Уа1

61υ

О1П

С1П 5

Азр

Азп

Зег

11е

Агд 10

С1и

Ьеи

С1п

Зег 15

Уа 1

С1и

С1п

Туг

Ьуз

С1п

Ьеи

Зег

61п

С1п

Н13

Меи

61п

11е

Ьуз

С1и

20

25

30

11е

С1и

Ьуз

С1п

Ьеи

Агд

Ьуз

ТИг

С1у

Не

С1п

С1и

Рго

Зег

С1и

Азп

40 45

Зег Ьеи <210> 18 <211> 50 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из

<400> 18

61п

Ьеи

Агд

Ьуз

ТНг 15

С1у

С1п 1

Н13

Мее

С1п

Не 5

Ьуз

С1и

Не

<31и

Ьуз 10

11е

С1п

С1и

Рго

Зег

С1и

Азп

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Зег

Агд

А1а

Рго

20

25

30

Агд

ТНг

Рго

Ьеи

С1п

Ьеи

Аэп

С1и

ТНг

С1и

Азп

ТНг

С1и

С1п

35

40

45

Азр Азр <210> 19 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 19

Ме£ 1

С1и

Тгр

Зег

Тгр 5

Не

РНе

Ьеи

РНе

Ьеи 10

Ьеи

Зег

С1у

ТНг

А1а 15

С1у

Уа1

Н13

Зег

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

Зег

61у

Рго

С1и

Ьеи

νβΐ

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

МеГ

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТНг

РНе

35

40

45

- 69 019661

ТНг

Зег 50

Туг Уа1

МеЬ

Н13

Тгр 55

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз

Рго 60

31у С1п

С1у

Ьеи

С1ч

Тгр

Не

С1у

Туг

РЬе

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

С1у

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

65

70

75

80

С1и

Ьуз

РЬе

Ьу5

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

Θ5

90

95

ТЬг

А1а

Туг

Ме[

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

НО

Туг

Суз

А1а

Агд

С1и

61 у

Αερ

Туг

С1у

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

115

120

125

61у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

130

135

<210> 20 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция

<400> 20

Рго

С1и 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

Е1п

Зег

61у

Зег

Уа1

Ьуз

меь

Зег

Суз

Ьу®

А1а

Зег

61у

Туг

ТНг

РЬе

ТНг

Зег

Туг

20

25

30

Уа1

МеЬ

НЬз

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз

Рго

61у

61п

61у

Ьеи

61 и

Тгр

11е

35

40

45

С1у

Туг

РЬе

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

<31у

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

61и

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТНг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

С1и

61 у

Азр

Туг

С1у

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

61у

С1П

С1у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

115

120

- 70 019661 <210> 21 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 21

МеЬ 1

С1и Тгр

Зег

Тгр 5

Не

РЬе

Ьеи

РЬе

Ьеи 10

Ьеи

Зег

С1у

ТЬг

А1а 15

С1у

Уа1

ΗΪ®

Зег

С1и

Уа1

61п

Ьеи

С1п

5ег

<51 у

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

61у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Мес

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

35

40

45

Не

Зег

Суз

Уа1

Ме!

ΗΪ5

Тгр

Уа1

Ьуз

ΰΐη

Ьуз

Рго

61у

О1п

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Не

С1у

Туг

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

(Пу

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

65

70

75

80

С1и

Ьуз

РЬе

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

85

90

95

ТЬг

А1а

Туг

МеЬ

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Суз

А1а

Агд

С1и

С1у

Азр

Туг

С1у

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

115

120

125

О1у

С1п

01у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

130

135

<210> 22 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 22
С1и Уа1 С1п	Ьеи С1п С1п Бег С1у	Рго С1и Ьеи Уа1 Ьуз	Рго С1у А1а
1	5	10	15

Бег Уа1 Ьуз МеС	Бег Суз Ьуз А1а Бег С1у Туг ТЬг РЬе Не Зег Суз
20	25	30

- 71 019661

νβΐ МеС

Н1з 35

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз 40

Рго С1у

С1П

С1у

Ьеи 45

С1и

Тгр

Не

Б1у

Туг

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

С1у

ТНг

Ьуз

Туг

Азп

С1и

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

ТНг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеС

С1и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Тун

Суз

85

90

95

А1а

Агд

С1и

С1у

Азр

Туг

С1у

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

01у

100

105

но

ТНг

Ьеи

ТНг

Уа1

Зег

А1а

115

120

<210> 23 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 23

МеС 1

*31и

Тгр

Зег

Тгр 5

Не

РНе

Ьеи

РНе

Ьеи 10

Ьеи

Зег

51у

ТЬг

А1а 15

61у

Уа1

Н1э

Зег

С1и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

МеС

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

ТНг

РНе

35

40

45

ТНг

Зег

Туг

Уа1

МеС

Н1з

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Не

61у

Туг

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

(Ну

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

65

70

75

80

С1и

Азп

РЬе

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТНн

Зег

Азр

Ьуз

Зег

85

90

95

ТНг

А1а

Туг

МеС

С1и

РНе

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

- 72 019661

Туг Туг Суз А1а Агд 61и С1у Азр Туг Туг 61у Туг РНе Азр Туг Тгр

115 120 125

С1у 61п 61у ТИг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег А1а

130 135 <210> 24 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 24

61и Уа1 1

61п

Ъец <31п 5

С1п 5ег 61у

Рго

61и 10

Ьеи

νβΐ

Ьуз

Рго

61у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Меь

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61у

Туг

ТНг

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

20

25

30

Уа1

Мер

ΗΪ3

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз

Рго

61у

С1п

61у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Туг

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

61у

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

61и

Азп

РЬе

50

55

60

Ьуз

61 у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Ьуз

5ег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

Ί0

75

80

МеГ

61и

РЬе

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

61и

Азр

5ег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

61и

С1у

Азр

Туг

61 у

Туг

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

61п

61у

100

105

но

ТНг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

115

120

<210> 25 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 25

МеЬ 61и Тгр Зег Тгр 11е РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег 61у ТЬг А1а 61у

10 15

- 7З 019661

Уа1

Н13

Зег

61и 20

Уа1

61п

Ьеи

С1п С1п 25

Зег

С1у

Рго

61и

Ьеи 30

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

МеЬ

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

51у

Туг

ТНг

РНе

35

40

45

ТИг

Зег

Туг

Уа1

Мен

Н1з

Тгр

Уа1

Ьуз

61п

Ьуз

Рго

61у

С1п

61у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

11е

61 у

Туг

Не

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

61 у

ТЬг

Ьуз

Туг

Азп

65

70

75

80

61и

Ьуз

РНе

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТНг

Ьеи

ТНг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

85

90

95

ТЬг

А1а

Туг

Мес

61и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

100

105

но

Туг

Суз

А1а

Агд

С1и

61у

Азр

Туг

61у

Туг

РНе

Азр

Туг

Тгр

115

120

125

61у

61п

61у

ТЬг

ТНг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

130

135

<210> 26 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 26

61и 1

Уа1

С1п

Ьеи

61п 5

С1п

Зег

61у

Рго 61и 10

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

мес

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТИг

РНе

ТНг

Зег

Туг

20

25

30

Уа1

МеЕ

Η1Ξ

Тгр

Уа1

Ьуз

61П

Ьуз

Рго

61у

61п

С1у

Ьеи

61и

Тгр

11е

35

40

45

61у

Туг

11е

Азп

Рго

Туг

Азп

Азр

61у

ТИг

Ьуз

Туг

Азп

61и

Ьуз

РНе

50

55

60

Ьуз

61у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

00

МеС

61и

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

- 74 019661

А1а Агд С1и С1у	Азр Туг Туг Б1у Туг РЬе Азр Туг Тгр 61у С1п 61у
	100	105	110
ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг	Уа1 Бег Зег А1а
	115	120
<210>	27
<211>	127
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 27

Мес 1

Зег

А1а

61п 5

РЬе

Ьеи 61у

Ьеи

Ьеи Ьеи Ьеи 10

Суз

РЬе

61п 15

□ 1у

ТЬг

Агд

Суз

Азр

Не

61п

Мер

ТНг

61п

ТИг

ТНг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

20

25

30

Зег

Ьеи

61у

Азр

Агд

Уа1

ТИС

Не

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Азр

Не

35

40

45

Зег

Азп

РЬе

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

61п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТИг

Уа1

Ьуз

50

55

60

Ьеи

Не

Туг

ТИг

Зег

Агд

Ьеи

Н1з

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

65

70

75

80

РЬе

Зег

61у

Зег

С1у

Зег

61 у

ТНг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТИг

11е

Зег

АЗП

85

90

95

Ьеи

С1и

61 п

С1и

Азр

Не

А1а

ТНг

Туг

РНе

Суз

С1п

61 п

61у

Азп

ТЬг

100

105

110

Ьеи

Рго

ТЬг

РЬе

61у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

115

120

125

<210> 28 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 28

Азр Не 61п МеС ТЬг С1п ТЬг ТЬг Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ьеи С1у

10 15

- 75 019661

Азр

Агд Уа1

ТЬг 20

Не

Зег

Суз

Агд

А1а 25

Зег

61п

Азр

11е

Зег 30

Азп

РЬе

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

ΗΪ5

Зег

61 у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

б1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Азп

Ьеи

61и

61п

65

70

75

80

С1и

Азр

11е

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

Б1п

С51п

61у

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

61 у

61у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

51и

Не

Ьуз

Агд

100

105

<210> 29 <211> 127 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 29

Не! 1

Зег

А1а

61п 5

РЬе

Ьеи

31у Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

Суз

РЬе

С1п 15

В1у

Не

Агд

Суз

С1и

Не

С1п

МеЬ

ТЬг

С1п

ТЬг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

20

25

30

Зег

Ьеи

61 у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Суз

Тгр

А1а

Зег

С1п

Азр

Не

35

40

45

Азп

Авп

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

С1п

61п

Ьуз

Рго

Азр

61у

ТЬг

Уа1

Ьуз

50

55

60

Ьеи

11е

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Н1з

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

65

70

75

80

РЬе

Зег

61у

Зег

<31у

Зег

61 у

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

АЗП

85

90

95

Ьеи

Ьуз

61П

61и

Азр

Не

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

Б1п

61п

61у

Азп

ТЬг

100

105

но

- 76 019661

Ьеи Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд

115 120 125 <210> 30 <211> 108 <212> ВЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 30

С1и 1

11е

С1п

Мер

ТЬг 5

С1П

ТЬг

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Ьеи 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Суз

Тгр

А1а

Зег

61п

Азр

Не

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

01п

С1п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТЬг

Ча1

Ьуз

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Нхз

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

61у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Азп

Ьеи

Ьуз

С1п

65

70

75

80

О1и

Азр

Не

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1ь

С1у

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

Й1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

100

105

<210> 31 <211> 127 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 31

МеЬ 1

Зег

А1а

С1П 5

РЬе

Ьеи

С1у

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

Суз

РЬе

С1п 15

С1у

А1а

Агд

Суз

Азр

Не

61п

Мес

ТНг

61 п

ТИг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

20

25

30

Зег

Ьеи

<31 у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61п

Азр

11е

35

40

45

- 77 019661

Агд Азп 50

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг 55

С1п

Ьуз

Рго Азр 60

С1у

ТНг

νάΐ

Ьуз

Ьеи

Не

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Н15

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зет

Агд

65

70

75

80

РЬе

Бег

01 у

Бег

С1у

Зег

С1у

ТИг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Азп

85

90

95

Ьеи

С1и

С1п

С1и

Азр

Не

А1а

ТНг

Туг

РЬе

Суз

01п

С1п

С1у

Азп

ТНг

100

105

по

Ьеи

Рго

ТИг

РНе

01у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

115

120

125

<210> 32 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 32

Азр 1

11е

С1п МеС

ТНг 5

С1п

ТЬг

Бег

Бег Ьеи 10

Бег

А1а

Бег

Ьеи 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТНг

Не

Бег

Су5

Агд

А1а

Зег

С1п

А5р

11е

Агд

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

А5П

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТЬг

7а1

Ьу5

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Н15

Бег

С1у

Уа1

Рго

Бег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

Туг

Бег

Ьеи

ТЬе¹

11е

Бег

Азп

Ьеи

С1и

С1п

65

70

75

80

61и

Азр

11е

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1у

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

61у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

100

105

<210> 33 <211> 127 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 78 019661 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <220>

<221> МОЬ_НЕЗ <222> (17) .. (17) <223> Вариабельная аминокислота <220>

<221> МОО_КЕЗ <222> (49) . . (49) <223> Вариабельная аминокислота <400> 33

Ме! 1

Зег

Бег

А1а

61п 5

РЬе

Ьеи

01 у

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

Суз

РЬе

С1п 15

С1у

Хаа

Агд

Суз

Азр

11е

С1п

Ме!

ТЬг

01 п

ТЬг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

20

25

30

Зег

Ьеи

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

01п

Азр

11е

35

40

45

Хаа

Азп

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

50

55

60

Ьеи

Не

Туг

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Н13

Зег

51у

Уа1

Рго

Зег

Агд

65

70

75

80

РЬе

Зег

61у

Зег

61у

Зег

О1у

ТЬг

Азр

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

АЗП

85

90

95

Ьеи

С1и

С1п

С1и

Азр

11е

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

С1п

С1у

Азп

ТЬг

100

105

110

Ъеи

Рго

ТЬг

РЬе

01 у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

Агд

115

120

125

<210> 34 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <22О>

<221> МОО_НЕ5 <222> (30)..(30) <223> Вариабельная аминокислота <400> 34

Авр Не 01п Ме! ТЬг С1п ТЬг ТЬг Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ьеи 61у

10 15

- 79 019661

Азр

Агд

ТЬг 20

Не

Зег

Суз

Агд

А1а 25

Зег

С1п Азр

Не

Хаа 30

Азп

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

61п

С1п

Ьуз

Рго

Азр

С1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

Туе

ТЫ

Зег

Агд

Ьеи

НЬз

Зег

<31у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

СЬу

50

55

60

Зег

б1у

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Азп

Ьеи

С1и

С1п

65

70

75

80

С1и

Азр

Не

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

С1п

СЬу

Азп

ТЬг

Ьеи

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

СХу

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

100

105

<210 35 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400 35

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 7а1 Мее НЬз

5 10 <210> 36 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400 36

Туг РЬе Азп Рго Туг Азп Азр С1у ТЬг Ьуз Туг Азп 61и Ьуз РЬе Ьуз

10 15

С1у <210 37 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

- 80 019661 пептид <400> 37

С1и С1у Азр Туг Туг С1у Туг РНе Азр Туг

10 <210> 38 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 38 <31у Туг ТНг РЬе Не Зег Суз Уа1 МеС Шз

10 <210> 39 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 39

Туг Не Азп Рго Тус Азп Азр С1у ТЬг Ьуз Туг Азп С1и Ьуз РЬе Ьуз

10 15

С1у <210> 40 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 40 <Э1и С1у Азр Туг Туг С1у Туг РЬе Азр Туг

10 <210> 41 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 41

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг Уа1 Мес Н13

- 81 019661 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

БЕЛОК

Искусственная последовательность

Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400>

Туг Не Азп Рго Туг Азп Азр С1у ТЬг Ьуз Туг Азп С1и Азп РЬе Ьуз

С1у <210>

<211 >

<212>

<213>

ВЕЛОК

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности:

пептид синтетическим <400>

С1и 01 у Азр Туг Туг 61у Туг РЬе Азр Туг

10 <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Искусственная последовательность <220>

<223>

Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400>

Агд А1а Зег 61п Азр 11е Зег Азп. РЬе Ьеи Азп <210>

<211>

<212>

<213>

БЕЛОК

Искусственная последовательность <220>

<223>

Туг ТЬг Зег Агд Ьеи Нгз Зег

5 <210> 46

- 82 019661 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <4003 46

С1п 61п С1у Азп ТНг Ьеи Рго Рго ТНг

5 <210> 47 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 47

Тгр А1а Зег С1п Азр II© Азп Азп Туг Ьеи Азп

5 10 <210> 48 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 48

Туг ТНг Зег Агд Ьеи Ηιβ Зег

5 <210> 49 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 49

61η 51п 61у Азп ТНг Ьеи Рго Рго ТНг

5 <210> 50 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

- 83 019661 <400> 50

Агд А1а Зег <31п Авр 11е Агд Азп Туг Ьеи Азп

10 <210> 51 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 51

Туг ТЬг Зег Агд Ьеи Низ Зег

5 <210> 52 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 52

С1п С1п С1у Азп ТЬг Ьеи Рго Рго ТЬг

5 <210> 53 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22 0>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 53

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 1/а1 Ме! Н1з

5 10 <210> 54 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 54

Туг Не Азп Рго Туг Азп Азр Б1у ТЬг Ьуз Туг Азп С1и Ьуз РЬе Ьуз

10 15

С1у

- 84 019661 <210> 55 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетическая консенсусная последовательность <400> 55

61ц <31 у Азр Туг Туг <31у Туг РЬе Азр Туг

10 <210> 56 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <220>

<221> МОЕ0ЕЕ5 <222> {7) .. (7) <223> Вариабельная аминокислота <400> 56

Агд А1а 5ег С1п Азр Не Хаа Азп Туг Ьеи Азп

5 10 <210> 57 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 57

Туг ТЬг Зег Агд Ьеи Н1з 5ес

5 <210> 58 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <400> 58

О1п 61п С1у Азп ТЬг Ьеи Рго Рго ТЬг

5 <210> 59 <211> 224

- 85 019661 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЬиз

<400> 59

Азр

Рго 5

Азр

Ьеи

Бег

Зег

РЬе 10

Азр

Бег

А1а

Рго

Бег 15

СХи

Зег 1

Агд

Уа!

Рго

Ьуз

Зег

Агд

РЬе

АХа

МеЬ

Ьеи

Азр

Уа!

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

20

25

30

СХу

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

Нгз

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

УаХ

Н13

Ьуз

ТЬг

35

40

45

Ьуз

С1у

61п

Не

Азп

Азр

Пе

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

Пе

РЬе

Азр

СХп

50

55

60

Бег

РЬе

Туг

Азр

Ьеи

Бег

Ьеи

Агд

ТЬг

Азп

СХи

Пе

Ьуз

С1и

СХи

65

70

75

80

Ьуз

СХи

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

ТЬг

Ьеи

СХп

УаХ

Ьуз

А5П

С1и

85

90

95

УаХ

Ьуз

Азп

МеЬ

Бег

УаХ

СХи

Ьеи

Азп

Бег

Ьуз

Ьеи

СХи

Зег

Ьеи

100

105

110

СХи

Ьуз

ТЬг

А1а

Ьеи

СХп

Н13

Ьуз

Уа!

Агд

А1а

Ьеи

С1и

СХи

СХп

115

120

125

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Не

Ьеи

Зег

Рго

А1а

С1у

А1а

С1п

СХи

Нгз

Рго

СХи

130

135

140

УаХ

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

РЬе

Уа1

СХи

С1п

СХп

Азр

Азп

Зег

11е

Агд

145

150

155

160

С1и

Ьеи

С1п

Зег

Уа!

С1и

61и

СХп

Туг

Ьуз

С1п

Ьеи

Зег

С1п

СХп

165

170

175

Н1в

МеГ

С1п

Не

Ьуз

С1и

Не

СХи

Ьуз

СХп

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

С1у

Не

180

185

190

С1п

СХи

Рго

Бег

С1и

Азп

Бег

Ьеи

Зег

Ьуз

Бег

Агд

АХа

Рго

Агд

195

200

205

ТЬг

Рго

Ьеи

СХп

Ьеи

Азп

СХи

ТЬг

СХи

Азп

ТЬг

С1и

СХп

Азр

2X0

215

220

<210> 60 <211> 224 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз

- 86 019661

<4ОО> 60

Азр 1

С1п Азр Азп

Зег 5

Зег

РНе

Азр

Зег

Ьеи 10

Зег

Рго

61и

Рго

Ьуз 15

Зег

Агд

РЬе

А1а

Мес

Ьеи

Азр

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

А1а

Азп

61у

Ьеи

20

25

30

С1п

Ьеи

С1у

Нгз

С1у

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Уа1

Н13

Ьуз

ТЬг

Ьуз

61у

<31п

35

40

45

Не

Азп

Азр

Не

РЬе

С1п

Ьуз

Ьеи

Азп

11е

РЬе

Азр

61п

Зег

РЬе

Туг

50

55

60

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

□ 1п

ТЬг

Зег

61и

Не

Ьуз

61и

С1и

61и

Ьуз

61и

Ьеи

65

70

75

80

Агд

ТЬг

Туг

Ьуз

Ьеи

61п

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

61и

Уа1

Ьуз

Азп

85

90

95

Мер

Зег

Ьеи

61и

Ьеи

Азп

Зег

Ьуз

Ьеи

С1и

Зег

Ьеи

С1и

61и

Ьуз

100

105

но

Не

Ьеи

61п

Ьуз

Уа1

Ьуз

Туг

Ьеи

С1и

61и

□ 1п

Ьеи

ТЬг

Азп

115

120

125

Ьеи

Не

61 п

Азп

61п

Рго

61и

ТЬг

Рго

61и

Нгз

Рго

61и

Уа1

ТЬг

Зег

130

135

140

Ьеи

Ьуз

ТЬг

РЬе

νβΐ

61и

Ьуз

61п

Азр

Азп

Зег

Не

Ьуз

Азр

Ьеи

145

150

155

160

61п

ТЬг

Уа1

61и

Азр

61п

Туг

Ьуз

61п

Ьеи

Азп

61 п

61п

Н1з

Зег

С1п

165

170

175

11е

Ьу®

С1и

Не

61и

Азп

61п

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

Не

61п

61и

Рго

180

185

190

ТЬг

61и

Не

Зег

Ьеи

Зег

Ьуз

Рго

Агд

А1а

Рго

Агд

ТЬг

Рго

195

200

205

РЬе

Ьеи

С1п

Ьеи

Азп

61и

Не

Агд

Азп

Уа1

Ьуз

Н1з

Азр

61у

Не

Рго

210

215

220

<210>	61
<211>	75
<2125	БЕЛОК
<213>	Миз гпизсиЬиз
<400>	61

- 87 019661

Азр 1

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи А1а 5

Азп

<31у

Ьеи

Ьеи 10

С1п

Ьеи

О1у

Н13

Б1у 15

Ьеи

Ьуз

Азр

РЬе

Н15

Ьуз

ТИг

Ьуз

С1у

61 п

Не

Азп

Азр

11е

РНе

С1п

20

25

30

Ьуз

Ьеи

Азп

11е

РНе

Азр

61п

Зег

РЬе

Туг

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

35

40

45

Азп

С1и

Не

Ьуз

С1и

61и

Ьуз

С1и

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

ТЬг

50

55

60

Ьеи

С1п

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

Уа1

Ьуз

Азп

МеС

65

70

75

<210> 62 <211> 27 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 62 61и Рго Ьуз 1	Зег	Агд 5	РЬе	А1а	МеЬ	Ьеи	Азр 10	Азр Уа1 Ьуз	11е Ьеи АЬа 15
Азп 01у Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Н15	61 у	Ьеи	Суз
	20					25
<210> 63 <211> 139 <212> ВЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 63

МеЪ 1

61у

Агд

Ьеи

ТЬг 5

Зег

РЬе

Ьеи

Ьеи 10

Ьеи

Не

Уа1

Рго

А1а 15

Туг

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

61и

Зег

61у

Рго

С1у

11е

Ьеи

Н1з

20

25

30

Рго

Зег

61п

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

35

40

45

Азп

ТЬг

РЬе

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

61у

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

Зег

С1у

Ьуз

50

55

60

- 88 019661

<31у 65

Ьеи 61и

Тгр

Ьеи 61у 70

Я1з

Не Тгр Тгр

Азр 75

Азр

Н13

Ьуз

Туг

Туг 80

Азп

С1у

Уа1

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

Зег

Ьуз

85

90

95

Ьуз

<31п

Уа1

РЬе

Ьеи

Агд

11е

А1а

Азп

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

100

105

110

Агд

Туг

Суз

А1а

Агд

Ьеи

С1и

ТЬг

С1у

ТЬг

С1у

РЬе

А1а

Туг

Тгр

115

120

125

61у

01п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

130 135 <210> 64 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 64

(31п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

С1и

Зег

С1у Рго

С1у 10

11е

Ьеи

Н13

Рго

Зег 15

С1п

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Су5

Зег

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Азп

ТЬг

РЬе

20

25

30

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

С1у

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Зег

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

б1у

Н13

Не

Тгр

АЗр

Азр

Ηιβ

Ьуз

Туг

Азп

С1у

Уа1

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

Зег

Ьуз

С1п

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Ьеи

Агд

Не

А1а

Азп

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Агд

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Ьеи

С1и

ТЬг

С1у

ТЬг

С1у

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

100

105

110

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

115

120

<210> 65 <211> 136

- 89 019661 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности-, синтетическая конструкция <400> 65

МеС 1

61у

Тгр Зег

Тгр 5

11е

РНе

Ьеи

РЬе

Ьеи Ьеи 10

Зег С1у

ТНг

А1а 15

С1у

Уа1

Ьеи

Зег

61и

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

01п

Зег

С1у

Рго

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

20

25

30

Рго

С1у

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

Не

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

РНе

ТНг

РНе

35

40

45

ТЬг

Анр

Туг

Мех

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

О1п

Зег

Н13

С1у

61и

Зег

Ьеи

50

55

60

01и

Тгр

Не

С1у

Азр

Не

Азп

Рго

Азп

АЗП

С1у

ТЬг

Не

Туг

Азп

65

70

75

80

С1п

Ьуз

РЬе

Агд

С1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

АЗр

Ьуз

Зег

85

90

95

ТЬг

А1а

Туг

Мер

С1и

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Аэр

Зег

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Суз

Уа1

Агд

Ьеи

Рго

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

Тгр

<31у

ТНг

61у

115

120

125

ТЬг

ТНг

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

А1а

130

135

<210> 66 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 66

С1и 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Зег

61у

Рго

С1и Ьеи 10

Уа1

Ьу5

Рго

С1у 15

А1а

Зег

Уа1

Ьуз

11е

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТНг

РЬе

ТНг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

Мех

Азп

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Зег

Н13

С1у

С1и

Зег

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

- 90 019661

С1у

Авр 50

Не Азп

Рго Азп

Азп 55

Б1у

С1у Ткг

Не

Туг 60

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

Агд

С1у

Ьуз

А1а

Ткг

Ьеи

Ткг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Ткг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ме!

61ц

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

Ткг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

Ьеи

Рго

Тгр

Туг

РЬе

Азр

7а1

Тгр

Б1у

ТЬг

С1у

ТЬг

Уа1

100

105

110

Ткг Уа1 Зег Зег А1а

115 <210> 67 <211> 133 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 67

Ме! 1

Агд

Суз

Ьеи

А1а 5

51 и

Рке

Ьеи

С1у

Ьеи 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Тгр

Не 15

Рго

С1у

А1а

11е

С1у

Азр

11е

Уа1

Ьеи

Ткг

61п

Зег

Ткг

Рго

Зег

Уа1

Рго

20

25

30

Уа1

ТЫ

Рго

С1у

01и

Зег

Уа1

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Ьуз

Зег

35

40

45

Ьеи

Азр

Зег

Азп

С1у

Не

Ткг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

РЬе

Ьеи

61п

Агд

50

55

60

Рго

61у

С1п

Зег

Рго

61п

Ьеи

Не

Туг

Агд

Ме!

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

65

70

75

80

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

61 у

Зег

61у

Зег

61и

ТЬг

А1а

Рке

85

90

95

Ткг

Ьеи

Агд

11е

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

61и

Азр

Уа1

61у

Уа1

Туг

100

105

110

Суз

Ме!

61п

Рго

Ьеи

61и

Туг

Рго

РЬе

ТЬг

Рке

С1у

А1а

С1у

Ткг

Ьуз

115

120

125

- 91 019661

Ьеи 61и Ьеи Азп С1у

130 <210> 68 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 68

Азр 1

Не

Уа1

Ьеи ТЬг 5

61п

Зег

ТЬг

Рго Зег 10

Уа1

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

61у

С1и

Зег

Уа1

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

Азп

С1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

РНе

Ьеи

61п

Агд

Рго

61у

61п

Зег

35

40

45

Рго

61п

Ьеи

11е

Туг

Агд

МеЬ

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

61у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

61 у

Зег

61у

Зег

61 и

ТЬг

А1а

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Уа1

61у

Уа1

Туг

Суз

Мер

61п

Рго

85

90

95

Ьеи

01 и

Туг

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

61у

А1а

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

61и

Ьеи

Азп

100

105

110

61у <210 69 <211> 132 <212> БЕЛОК <21Э> Искусственная последовательность <220>

<400> 69

МеР

Ьуз Ьеи

Рго

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

Ьеи

МеР

РЬе

Тгр

11е

Рго

А1а

1

5

10

15

Зег

Зег Зег

Азр

Уа1

Ьеи

МеЬ

ТЬг

61п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

20

25

30

- 92 019661

Зег

Ьеи

СЬу Азр 35

СЬп

АЬа

Зег

11е Зег 40

Суз

Агд

Зег

Зег 45

СЬп

Зег

Не

Ьеи

Н13

Зег

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

СЬи

Тгр

РЬе

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго

50

55

60

СЬу

СЬп

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

65

70

75

80

СЬу

УаЬ

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

85

90

95

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

А1а

СЬи

Азр

Ьеи

СЬу

УаЬ

Туг

Суз

100

105

110

РЬе

СЬп

СЬу

Зег

Нтз

УаЬ

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

115

120

125

СЬи Не Ьуз Агд

130 <210> 70 <2И> 113 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая конструкция <400> 70

Азр 1

УаЬ

Ьеи

МеЬ

ТЬг 5

С1п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

УаЬ

Зег

Ьеи 15

СЬу

Азр

СЬп

АЬа

Зег

1Ье

Зег

Суз

Агд

Зег

СЬп

Зег

Пе

Ьеи

Н1з

Зег

20

25

30

Азп

СЬу

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

СЬи

Тгр

РЬе

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

Зег

35

40

45

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

Азр

Ьеи

СЬу

УаЬ

Туг

Суз

РЬе

СЬп

С1у

85

90

95

Зег

Нтз

УаЬ

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

СЬу

С1у

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Не

Ьуз

ЬОО

105

110

- 93 019661

Агд <210> 71 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 71

61у РЬе Зег Ьеи Азп ТЬг РЬе СЬу Ьеи АЬа νβΐ СЬу

10 <210> 72 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 72

Нтз Не Тгр Тгр Азр Азр Н1з Ьуз Туг Туг Азп СЬу УаЬ Ьеи Ьуз 5ег

10 15 <210> 73 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 73

Ьеи С1и ТЬг СЬу ТЬг СЬу РЬе А1а Туг

5 <210> 74 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 74

СЬу РЬе ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Туг Мер Азп

5 10 <210> 75 <211> 17

- 94 019661 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 75

Азр Не Азп Рго Азп Азп С1у С1у ТЬг Не Туг Азп С1п Ьуз РЬе Агд

10 15

С1у <210> 76 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 76

Ьеи Рго Тгр Туг РЬе Азр Уа1

5 <210> 77 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 77

Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азп С1у Не ТЬг Туг Ьеи Туг

10 15 <210> 78 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 78

Агд МеЬ Зег Ьуз Ьеи А1а Зег

5 <210> 79 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 95 019661 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 79

МеИ С1п Рго Ьеи О1и Туг Рго РЬе ТЬг

5 <210> 80 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 80

Агд Бег Зег С1п Зег 11е Ьеи Н15 Зег Аэп С1у Азп ТЬг Туг Ьеи С1и

10 15 <210> 81 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 81

Ьуз Уа1 Зег Азп Агд РЬе Зег

5 <210> 82 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400> 82

РНе С1п С1у Зег Ηΐ3 УаЬ Рго Туг ТЬг

5 <210> 83 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 83

А1а Рго Ьуз Зег Агд РНе А1а МеГ Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз Не Ьеи А1а

10 15

- 96 019661

Азп '31у Беи Ьеи С1п Ьеи С1у НЬз 01у Ьеи

25 <210> 84 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 84 01и А1а Ьуз 1	Зег	Агд 5	РЬе	А1а	МеЬ	Ьеи	Азр Азр УаЬ 10	Ьуз Не Ьеи А1а 15
Азп 61у Ьеи	Ьеи 20	СЬп	Ьеи	С1у	Н13	СЬу 25	Ьеи
<210> 85 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 95 С1и Рго А1а 5ег	Агд	Р1эе	А1а	МеЬ	Ьеи	Азр Азр Уа1 Ьуз	11е Ьеи А1а
1	5					10	15
Азп 61у Ьеи Ьеи	СЬп	Ьеи	СЬу	Н1з	СЬу	Ьеи
20					25
<210> 86 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 86 С1и Рго Ьуз АЬа Агд	РЬе АЬа	МеЬ	Ьеи	Азр Азр УаЬ 10	Ьуз 11е Ьеи А1а 15
1	5
Азп СЬу Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	СЬу	ΗΪ3	С1у	Ьеи
	20					25
<210> 87
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

- 97 019661 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<400> 87 <31 и Рго Ьу5	5ег	А1а	РНе	А1 а	МеГ	Ьеи	Азр Азр Уа1	Ьуз Не Ьеи А1а
1		5					10	15
Азп СЬу Ьеи	Ьеи	СЬп	Ьеи	С1у	Н15	СЬу	Ьеи
	20					25
<210 88 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 88 СЬи Рго Ьу5 1	8ег	Агд А1а А1а МеЬ 5	Ьеи	Азр Аэр УаЬ Ьуз 10	Не Ьеи А1а 15
Азп СЬу Ьеи	Ьеи	СЬп	Ьеи	61у	Нтз	СЬу	Ьеи
	20					25
<210> 89 <2П> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 89 СЬи Рго Ьуз 1	Зег	Агд 5	Р1эе	АЬа АЬа Ьеи	Азр Азр УаЬ Ьуз 10	11е Ьеи АЬа 15
Азп <31 у Ьеи	Ьеи	СЬп	Ьеи	СЬу	Нтз	СЬу	Ьеи
	20					25
<2Ь0> 90 <2Н> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 90

61и Рго Ьуз Зег Агд РЬе АЬа МеЬ А1а Азр Азр УаЬ Ьуз Не Ьеи АЬа

10 15

А5п С1у Ьеи Ьеи СЬп Ьеи СЬу Н13 С1у Ьеи

25

- 98 019661 <210> 91 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 91

61и Рго Ьуз Зег Агд РНе А1а Меб Ьеи А1а Азр Уа1 Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

Азп

<210> 92 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности; синтетический пептид <400> 92

С1и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а Меб Ьеи Азр А1а Уа1 Ьуз Не Ьеи А1а

10 15

Азп

Ьеи С1у Н1з С1у Ьеи

<210> 93 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 93

С1и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а МеГ Ьеи Азр Азр А1а Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

Азп 61у Ьеи Ьеи С1п Ьеи 61у Ηί$ 01у Ьеи

25 <210> 94 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 99 019661

<400> 94 С1и Рго Ьуз 1	Бег Агд 5	РЬе А1а	МеЬ	Ьеи	Азр Азр Уа1 А1а 10	Не Ьеи А1а 15
Азп С1у Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Н15	С1у	Ьеи
	20					25
<210> 95 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 95 61и Рго Ьуз	Бег	Агд		А1а	Мег	Ьеи	Азр Азр Уа1	Ьуз А1а Ьеи А1а
1		5					10	15
Азп С1у Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Н13	С1у	Ьеи
	20					25
<210> 96 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<400> 96 С1и Рго Ьуз 1	Бег	Агд 5	РЬе	А1а	Мер	Ьеи	Азр Азр Уа1 10	Ьуз Не А1а А1а 15
Азп <31у Ьеи	Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Н15	С1у	Ьеи
	20					25
<210> 97 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 97

С1и Рго Ьуз Бег Агд РЬе А1а МеЬ Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

А1а С1у Ьеи Ьеи С1п Ьеи С1у Н15 С1у Ьеи

25

- 100 019661 <210> 98 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 98 61и Рго Ьуз Зег Агд	РЬе	А1а	МеЬ	Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз 10	11е Ьеи А1а 15
1	5
Азп А1а Ьеи Ьеи	С1п	Ьеи	С1у	Н15	С1у Ьеи
20					25
<210> 99
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<22 3> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 99

С1и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а МеС Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

Азп С1у А1а Ьеи б1п Ьеи 61у Н13 С1у Ьеи

25 <210> 100 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 100 С1и Рго Ьуз Зег Агд	РЬе	А1а	Мех	Ьеи	Азр Азр Уа1 Ьуз 10	11е Ьеи А1а 15
1	5
Азп С1у Ьеи	А1а	С1п	£еи	С1у	Η1Ξ	СЬу	Ьеи
	20					25
<210> 101
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 101

- 101 019661

С1и Рго Ьуз 1	Зег	Агд 5	РКе	А1а	МеЕ Ьеи	Азр Азр УаЬ 10	Ьуз Не Ьеи А1а 15
Азп СЬу Ьеи	Ьеи	АЬа	Ьеи	61 у	Нгз	СЬу	Ьеи
		20					25
<210>	102
<211>	26
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственней последовательности: синтетический пептид <400> 102

61и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а МеЕ Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз Не Ьеи А1а

10 15

Азп С1у Ьеи Ьеи С1п АЬа С1у Н13 СЬу Ьеи

25 <210> 103 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 103 61и Рго Ьуз 5ег	Агд	РНе	АЬа	Мел	Ьеи	Азр Азр Уа1 Ьу5	11е Ьеи А1а
1	5					10	15
Азп СЬу Ьеи Ьеи	61п	Ьеи	АЬа	ΗΪ3	СЬу	Ьеи
20					25
<210> 104 <211> 26 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 104

СЬи Рго Ьуз Зег Агд РНе А1а МеЕ Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

Азп С1у Ьеи Ьеи С1п Ьеи СЬу А1а С1у Ьеи

25 <210> 105 <211> 26

- 102 019661 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<400> 105 31и Рго Ьуз 1	Зег	Агд 5	РНе	А1а	МеГ	Ьеи	Азр Азр Уа1 10	Ьуз 11е Ьеи А1а 15
Азп О1у Ьеи	Ьеи 20	61п	Ьеи	С1у	Н1 з	А1а 25	Ьеи
<210> 106 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 106

С1и Рго Ьуз Бег Агд РНе А1а Μβΐ. Ьеи Азр Азр 7а1 Ьуз Не Ьеи А1а

10 15

Азп С1у Ьеи Ьеи С1п Ьеи С1у Н15 01у А1а

25 <210> 107 <211> 410 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЬиз

<400> 107

ТЬг

А1а

С1у

А1а

А1а 10

Ьеи

Уа1

Ьеи

Суз

А1а 15

А1а

МеЬ Агд 1

Суз А1а

Рго 5

ТНг

А1а

С1у

Ьеи

Зег

А1а

31п

31у

Агд

Рго

А1а

С1п

Рго

С1и

Рго

20

25

30

Рго

Агд

РНе

А1а

Бег

Тгр

Азр

61и

МеГ

Азп

Ьеи

А1а

Н1з

у

Ьеи

35

40

45

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

ΗΪ5

С1у

Ьеи

Агд

С1и

Н13

Уа1

61и

Агд

ТЬг

Агд

С1у

50

55

60

С1п

Ьеи

С1у

А1а

Ьеи

С1и

Агд

МеГ

А1а

Суз

С1у

АЗП

А1а

Суз

65

70

75

80

С1п

С1у

Рго

Ьу5

С1у

Ьуз

Азр

А1а

Рго

РЬе

Ьуз

Азр

Зег

С1и

Азр

Агд

85

90

95

- 103 019661

Уа1

Рго С1и СЬу 100

СЬп

ТЬг

Рго

СЬи ТЬг 105

Ьеи

СЬп

5ег

Ьеи

СЬп но

ТЬг

СЬп

Ьеи

Ьуз

А1а

СЬп

Азп

Зег

Ьуз

11е

СЬп

Ьеи

Рке

С1п

Ьуз

УаЬ

АЬа

115

120

125

С2п

С1п

СЬп

Агд

Туг

Ьеи

Зег

Ьуз

С1П

Азп

Ьеи

Агд

11е

СЬп

Азп

Ьеи

130

135

140

С1п

5ег

СЬп

11е

Азр

Ьеи

АЬа

Рго

ТЬг

Н1з

Ъеи

Азр

Азп

СЬу

Уа1

145

150

155

160

Азр

Ьу5

ТЬг

5ег

Агд

СЬу

Ьуз

Ьеи

Зег

Ьуз

Мек

Ткг

СЬп

Ьеи

11е

165

170

175

б1у

Ьеи

ТЬг

Зег

Азп

АЬа

ТЬг

Н1з

Ьеи

Н1з

Агд

Рго

А1а

Агд

Азр

Суз

180

185

190

С1п

С1и

Ьеи

РЬе

СЬп

СЬи

С1у

СЬи

Агд

Н13

Зег

С1у

Ъеи

РЬе

СЬп

Не

195

200

205

С1п

Рго

Ьеи

СЬу

Зег

Рго

РЬе

Ьеи

УаЬ

Азп

Суз

С1и

МеГ

ТЬг

Зег

210

215

220

Агр

СЬу

Тгр

ТЬг

УаЬ

Не

СЬп

Агд

Ьеи

Азп

С1у

Зег

УаЬ

Азр

225

230

235

240

Рке

Азп

СЬп

Зег

Тгр

С1и

А1а

Туг

Ьуз

Азр

СЬу

Рке

С1у

Азр

Рго

СЬп

245

250

255

С1у

61и

РЬе

Тгр

Ьеи

СЬу

Ьеи

СЬи

Ьуз

МеЬ

Нтз

Зег

11е

ТЬг

СЬу

Азр

260

265

270

Агд

С1у

Зег

СЬп

Ьеи

АЬа

Уа1

СЬп

Ьеи

СЬп

Азр

Тгр

Азр

СЬу

Азп

АЬа

275

280

285

Ьу5

Ьеи

е1п

РЬе

Рго

Пе

Нтз

Ьеи

С1у

СЬу

С1и

А$р

ТЬг

АЬа

Туг

290

295

300

Зег

Ьеи

СЬп

Ьеи

ТЬг

СЬи

Рго

ТПг

АЬа

АЗП

С1и

Ьеи

С1у

АЬа

ТЬг

Азп

305

310

315

320

Уа1

Зег

Рго

Азп

СЬу

Ьеи

5ег

Ьеи

Рго

РЬе

Зег

Ткг

Тгр

Азр

СЬп

Азр

325

330

335

Н1н

Азр

Ьеи

Агд

СЬу

Азр

Ьеи

Азп

Сун

А1а

Ьуз

8ег

Ьеи

Зег

СЬу

340

345

350

- 104 019661

Тгр Тгр

РЬе 355

С1у ТЬг

Суз

Зег

Н15 360

Зег

Азп Ьеи Азп

01у 365

61п

Туг

РЬе

Н13

Зег

11е

Рго

Агд

С1п

Агд

С1п

СИи

Агд

Ьуз

СИу

11е

РЬе

Тгр

370

375

380

Ьуз

ТЬг

Тгр

Ьуз

Й1у

Агд

Туг

Рго

Ьеи

61П

А1а

ТЬг

Ьеи

385

390

395

400

Не

С1п

Рго

МеЬ

0111

А1а

ТЬг

А1а

Бег

405 410 <210> 108 <211> 406 <212> БЕЛОК <213> Ното зарюпз <400> 108

МеГ 1

Зег

С1у А1а

Рго 5

ТЬг

А1а

С1у

А1а А1а 10

Ьеи

МеО

Ьеи

Суз

А1а 15

А1а

ТЬг

А1а

Уа1

Ьеи

Зег

А1а

С1П

61у

С1у

Рго

Уа1

С1П

Зег

Ьуз

Зег

20

25

30

Рго

Агд

РЬе

А1а

Зег

Тгр

Азр

С1и

МеЬ

Азп

Уа1

Ьеи

А1а

Н15

С1у

Ьеи

35

40

45

Ьеи

С1п

Ьеи

С1у

С1п

61у

Ьеи

Агд

С1и

Н1з

А1а

СИи

Агд

ТЬг

Агд

Зег

50

55

60

С1п

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

С1и

Агд

Ьеи

Зег

А1а

Суз

С1у

Зег

А1а

Суз

65

70

75

80

61п

СИу

ТЬг

С1и

СИу

Зег

ТЬг

Азр

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Рго

СИи

Зег

Агд

85

90

95

Уа1

Азр

Рго

СИи

Уа1

Ьеи

Н13

Зег

Ьеи

61п

ТЬг

С1п

Ьеи

Ьуз

А1а

01п

100

105

110

Азп

Зег

Агд

11е

О1П

01П

Ьеи

РЬе

Нгз

Ьуз

Уа1

А1а

С1п

Агд

115

120

125

Н13

ьеи

01и

Ьуз

ΰΐη

Н13

Ьеи

Агд

11е

О1п

Н13

Ьеи

61п

Зег

61п

РЬе

130

135

140

С1у

Ьеи

Азр

Н13

Ьуз

Н1 5

Ьеи

Азр

Н1 я

61и

Уа1

А1а

Ьуз

Рго

А1а

145

150

155

160

Агд

Ьуз

Агд

Ьеи

Рго

С1и

МеЬ

А1а

С1п

Рго

Уа1

Азр

Рго

А1а

Н13

165

170

175

- 105 019661

Азп Уа1

Зег

Агд Ьеи 180

Н15

Агд

Ьеи

Рго Агд 185

Азр

Суз

(51п

61и 190

Ьеи

РЬе

<31п

Уа1

С1у

С1и

Агд

С1п

Зег

61 у

Ьеи

РЬе

С1и

Не

С1п

Рго

С1п

61у

195

200

205

Зег

Рго

РЬе

Ьеи

Уа1

Азп

Суз

Ьуз

Ме!

ТЬг

Зег

Азр

<31у

С1у

Тгр

210

215

220

ТЬг

Уа1

Не

31п

Агд

ΗΪ3

Азр

С1у

Зег

Уа1

Азр

РЬе

Азп

Агд

Рго

225

230

235

24 0

Тгр

С1и

А1а

Туг

Ьуз

А1а

С1у

РЬе

(31у

Азр

Рго

Н15

С1у

С1и

РЬе

Тгр

245

250

255

Ьеи

С1у

Ьеи

С1и

Ьуз

Уа1

Н15

Зег

11е

ТЬг

С1у

Азр

Агд

Азп

Зег

Агд

260

265

270

Ьеи

А1а

Уа1

(31п

Ьеи

Агд

Азр

Тгр

Азр

С1у

Азп

А1а

С1и

Ьеи

С1п

275

280

285

РЬе

Зег

Уа1

Н13

Ьеи

С1у

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Туг

Зег

Ьеи

С1п

Ьеи

290

295

300

ТЬг

А1а

РГО

Уа1

А1а

С1у

61П

Ьеи

61у

А1а

ТЬг

ТЫ

Уа1

Рго

Зег

305

310

315

320

С1у

Ьеи

Зег

Уа1

Рго

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

Азр

61п

Азр

Н1з

Азр

Ьеи

Агд

325

330

335

Агд

Азр

Ьуз

Азп

Суз

А1а

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

<31 у

<31у

Тгр

РЬе

<31 у

340

34 5

350

ТЬг

Суз

Зег

ΗΪ3

Зег

Азп

Ьеи

Азп

С1у

С1п

Туг

РЬе

Агд

Зег

Не

Рго

355

360

365

С1п

Агд

<31п

Ьуз

Ьеи

Ьуз

С1у

Не

РЬе

Тгр

Ьуз

ТЬг

Тгр

Агд

370

375

380

<31 у

Агд

Туг

Рго

Ьеи

<31п

А1а

ТЬг

ТЫ

Мес

Ьеи

11е

61П

Рго

Мес

385

390

395

400

А1а А1а С1и А1а А1а Зег

405 <210> 109 <211> 27

- 106 019661 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 109

С1п Рго 01и Рго Рго Агд РЬе А1а Зег Тгр Азр С1и МеГ Азп Ьеи Ьеи

10 15

А1а Н1з С1у Ьеи Ьеи 01п Ьеи 01у Н1з С1у Ьеи

25 <210> 110 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Ното гаргепз

<400 110
Зег Ьуз Зег	Рго Агд РЬе А1а	Еег Тгр Азр С1и Ме!	Азп Уа1 Ьеи А1а
1	5	10	15

Н1з С1у Ьеи Ьеи С1п	Ьеи О1у С1п С1у Ьеи
20	25

<210> 111 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая бхНхз метка <400> 111

Н13 Н13 Н15 Н15 Н15 Н15

5 <210> 112 <211> 26 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 112

01и Рго Ьуз Зег Агд РЬе А1а МеГ Ьеи Азр Азр Уа1 Ьуз 11е Ьеи А1а

10 15

Азп 31у Ьеи Ьеи С1п Ьеи С1у Н13 01у Ьеи

Claims

1. Моноклональное антитело, которое связывается с АНСРТБ3 и нейтрализует по меньшей мере одну активность АНСРТБ3, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где:

a) тяжелая цепь содержит:

ί) аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 20, 22, 24, 26, 64 и 66; или ίί) по меньшей мере одну СОЯ, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 81 У) ΙΌ ΝΟ: 35-43, 53-55 и 71-76;

b) легкая цепь содержит:

ί) аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 28, 30, 32, 34, 68 и 70; или ίί) по меньшей мере одну СОЯ, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 81 У) ΙΌ ΝΟ: 44-52, 56-58 и 77-82.

2. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело представляет собой мышиное моноклональное антитело.

3. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.

4. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело.

5. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело способствует снижению уровня по меньшей мере одного липида сыворотки ίπ у1уо.

- 107 019661

6. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом ΆΝΟΡΤΕ3, имеющим аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: 59.

7. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом ΛΝ0ΡΤΕ3. имеющим аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: 60.

8. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом ΆΝ0ΡΤΕ3, имеющим аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: 9.

9. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело связывается с эпитопом ΆΝ0ΡΤΕ3, имеющим аминокислотную последовательность 8ЕР ГО N0: 10.

10. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело включает:

a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 20 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 28;

b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 22 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 30;

c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 24 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 32;

б) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 64 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 68; или

е) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 66 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 70.

11. Моноклональное антитело по п.1, где:

a) тяжелая цепь включает СЭК1, представленную в ЖР ГО N0: 35, СОК2, представленную в ЖР ΙΌ N0: 36, и СОК3, представленную в ЖР ΙΌ N0: 37; и легкая цепь включает СОК1, представленную в ЖР ΙΌ N0: 44, СОК2, представленную в ЖР ΙΌ N0: 45, и СОК3, представленную в ЖР ΙΌ N0: 46;

b) тяжелая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ΙΌ N0: 38, СОК2, представленную в ЖР ΙΌ N0: 39, и СОК3, представленную в ЖР ΙΌ N0: 40; и легкая цепь включает СОК1, представленную в ЖР ГО N0: 47, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 48, и СОК3, представленную в ЖР ГО N0: 49;

c) тяжелая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 41, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 42, и СОК3, представленную в ЖР ГО N0: 43; и легкая цепь включает СОК1, представленную в ЖР ГО N0: 50, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 51, и СОК3, представленную в ЖР ГО N0: 52;

б) тяжелая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 53, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 54, и СОР3, представленную в ЖР ГО N0: 55; и легкая цепь включает СОР1, представленную в ЖР ГО N0: 56, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 57, и СОР3, представленную в ЖР ГО N0: 58;

е) тяжелая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 71, СОК2, представленную в ЖР ГО N0: 72, и С0Р3, представленную в ЖР ГО N0: 73; и легкая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 77, С0Р2, представленную в ЖР ГО N0: 78, и С0Р3, представленную в ЖР ГО N0: 79; или

ί) тяжелая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 74, С0Р2, представленную в ЖР ГО N0: 75, и С0Р3, представленную в ЖР ГО N0: 76; и легкая цепь включает СГОРИ представленную в ЖР ГО N0: 80, С0Р2, представленную в ЖР ГО N0: 81, и С0Р3, представленную в ЖР ГО N0: 82.

12. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 20, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 28.

13. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 22, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 30.

14. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 32.

15. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 68.

16. Моноклональное антитело по п.1, где указанное моноклональное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЖР ГО N0: 66, и вариабельную область легкой

- 108 019661 цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 70.

17. Моноклональное антитело по п.1, где указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, с Кц менее чем 50 нМ.

18. Моноклональное антитело по п.17, где указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, с Кц менее чем 30 нМ.

19. Моноклональное антитело по п.17, где указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, с К_о менее чем 10 нМ.

20. Моноклональное антитело по п.17, где указанное антитело связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, с Кц менее чем 5 нМ.

21. Моноклональное антитело по п.1, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела.

22. Моноклональное антитело по п.21, где указанное антитело представляет собой ксΕν-фрагмент, ЕаЬ-фрагмент, Е(аЬ')₂-фрагмент или ЕаЬ'-фрагмент.