EA016806B1

EA016806B1 - Композиции для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, уменьшения депрессии, достижения анксиолитических эффектов, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения, способ получения композиций и их применение

Info

Publication number: EA016806B1
Application number: EA200900643A
Authority: EA
Inventors: Андре Леонардус Рос Де; Люппо Эденс; Рудольф Франсискус Вильгельмус Корнелис Бековен Ван; Александер Люсия Леонардус Дюшато; Йорис Клок
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2012-07-30
Also published as: US9228219B2; ES2382910T3; ATE548462T1; EP2079847A1; US20160082070A1; US9993515B2; US20110086803A1; US20130231278A1; EA200900643A1; EP2079847B1; WO2008052995A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей водорастворимые триптофансодержащие пептиды и имеющей отношение триптофана к уровню суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина больше чем 0,15, который включает гидролиз лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, для приготовления гидролизата, имеющего DH между 5 и 45, и получение таким способом композиции для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, достижения анксиолитических эффектов, уменьшения депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к пептидам, содержащим остатки триптофана.

Сведения о предшествующем уровне техники

Уровни серотонина в мозге связаны с настроением, внимательностью, бдительностью, наступлением сна и качеством сна, анксиолитическими эффектами, депрессией, контролем эмоциональных реакций, аппетитом и сексуальным поведением. Существует множество публикаций, в которых изменения уровней серотонина в мозге коррелируют с наличием природной аминокислоты Ь-триптофана (Тгр, или XV). Вследствие этой корреляции способы увеличения уровней триптофана в плазме привлекают много внимания. Сообщалось, что триптофан в количестве около 1 г/день на индивидуума вызывает клинически значимые эффекты (Маткив с1 а1., Ат. 1. С1ш. ΝιιΙγ. 2005; 81, 1026-1033). Один способ увеличения уровней триптофана в плазме включает потребление белковых препаратов, обогащенных белком сыворотки молока альфа-лактальбумином. Препараты альфа-лактальбумина легко доступны и имеют относительно высокую концентрацию триптофана. Однако подходы, в которых альфа-лактальбумин дается как таковой, см., например, ΌΕ 4130284 и ДР 2279700, не принимают во внимание, что главным определяющим фактором (детерминантой) уровней триптофана и серотонина в мозге является не единственно концентрация триптофана в плазме, а так называемое отношение Ττρ/ΕΝΑΑ (Еегп8(тот и ΧνιιΠιηαη. Баепсе 1971, 173, 149-152). Данное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ представляет собой молярное отношение триптофана относительно уровней больших нейтральных аминокислот (ΣΝΑΑ: т.е. суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина) в плазме. Эти ΣΝΑΑ конкурируют с триптофаном за поглощение в мозге, вероятно, вследствие того, что используется одинаковый механизм транспорта через гематоэнцефалический барьер. Следовательно, наиболее эффективным путем увеличения концентраций триптофана в мозге является доставление препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Некоторое количество публикаций а.о. νθ 02/46210 относится к получению пептидных фракций из альфа-лактальбумина, имеющего улучшенные отношения Ττρ/ΕΝΑΑ. Очевидно, применение свободного триптофана, т.е. свободной аминокислоты, может дать простейший и самый недорогой подход для обеспечения препаратов с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ. Однако во многих странах существует законодательство, которое строго регулирует поставку свободного триптофана. Максимальные допустимые уровни свободного триптофана в разных заявочных формах отличаются по странам. Для обеспечения дополнительного поступления триптофана с пищей более естественным путем более современные подходы нацелены на обеспечение белков, богатых триптофаном. Как упоминалось, альфа-лактальбумин, а также его гидролизаты, приобрели популярность как безопасная альтернатива для увеличения уровней триптофана в плазме. Однако применение альфа-лактальбумина в качестве отправной точки для препаратов, богатых триптофаном, сопровождается препятствиями в плане максимальных отношений Ττρ/ΕΝΑΑ и затрат. Альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин образуют основные белковые компоненты сыворотки. Так как в промышленном масштабе полное разделение альфа-лактальбумина и бета-лактоглобулина является сложным, следствием является то, что рентабельные препараты альфа-лактальбумина будут также содержать беталактоглобулин. Тогда как альфа-лактальбумин имеет молярное содержание триптофана 5,3%, содержание триптофана в бета-лактоглобулине составляет только 2%. Тогда как альфа-лактальбумин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ 0,11, бета-лактоглобулин имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ не больше чем 0,04. Итак, очевидно, что любое загрязнение препарата альфа-лактальбумина бета-лактоглобулином будет значительно понижать отношение Ττρ/ΕΝΑΑ окончательного продукта.

С учетом широкого интереса к препаратам, которые могут регулировать уровни серотонина в мозге, существует необходимость в улучшенных методах производства белковых и пептидных препаратов, имеющих высокий уровень отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, которые являются широко применимыми в различных пищевых и нутрицевтических продуктах.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей водорастворимый триптофансодержащий пептид, предпочтительно по меньшей мере два водорастворимых триптофансодержащих пептида, и имеющей отношение Ττρ/ΕΝΑΑ больше чем 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8, который включает гидролиз лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, для получения гидролизата, имеющего ΌΗ между 5 и 45, и при необходимости удаление части пептидов, содержащих аргинин или лизин. Предпочтительно композиция содержит Αν или ΟΝ\ν. более предпочтительно Αν и ΟΝ\ν. Гидролизат предпочтительно имеет ΌΗ между 10 и 40.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей по меньшей мере два различных водорастворимых пептида и в которой молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ композиции составляет по меньшей мере 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8. Предпочтительно эта композиция содержит Αν или ΟΝν, предпочтительно Αν и ΟΝ\ν и наиболее предпочтительно Αν и ΟΝν, в соответствии с чем молярное отношение Αν к ΟΝν составляет от 1 до 2 и от 10 до 1, предпочтительно от 1 до 2 и от 5 до 1. Кроме того, настоящее изобретение представляет композицию водорастворимых пептидов, которые богаты триптофаном. Преимущественно настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей по меньшей мере два различных ди- или трипептида, в соответствии с чем два пептида, выбранные из ди- или трипептидов, присутствуют в количестве по меньшей мере 5 мол.% общего количе

- 1 016806 ства ди- и трипептидов, и в которой композиции больше чем 30 мол.%, предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, даже более предпочтительно больше чем 60 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 70 мол.% и наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% пептидсвязанного триптофана присутствует в виде ди- или трипептида, предпочтительно композиция имеет отношение Ττρ/ΕΝΑΑ больше чем 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8. Под пептидсвязанным триптофаном подразумевается триптофан, который присутствует как аминокислота в пептиде.

Эта композиция является предпочтительно гидролизатом лизоцима или очищенным гидролизатом лизоцима. В одном варианте осуществления изобретения гидролизат лизоцима является особенно богатым остатками аргинина. Аргинин не принадлежит к группе больших нейтральных аминокислот (ΈΝΑΑ), но известен своим стимулирующим действием на инсулин. Мы обнаружили, что гидролизат согласно изобретению может вызывать более высокие отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме ίη νίνο. Весьма неожиданно было найдено, что отношения Ττρ/ΕΝΑΑ, обнаруженные в плазме крови, выше, чем Ττρ/ΕΝΑΑ отношение гидролизата. Еще одним преимуществом изобретения является то, что пептиды, содержащие Ττρ, являются очень маленькими, так что даже в комбинации с продуктами, богатыми белком, с менее подходящими отношениями Ττρ/ΕΝΑΑ, гидролизат может немедленно давать высокие отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме крови. Композиция дополнительно может содержать свободный триптофан. Предпочтительно гидролизат не содержит больше чем 1 вес.% (на сухое вещество) свободного триптофана.

Другим аспектом изобретения является применение композиции, которую получают, подвергая гидролизу лизоцим, предпочтительно лизоцима куриного яйца, или другой композиции согласно изобретению для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимательности, бдительности, наступления и качества сна, анксиолитических эффектов, депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения или для применения в качестве ингредиента при приготовлении питания, пищи для животных, корма, пищевой добавки или нутрицевтической композиции для настроения, когнитивной способности, аппетита, внимательности, бдительности, наступления и качества сна, анксиолитических эффектов, депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения. Кроме гидролизата лизоцима композиция может также содержать углеводы, а также соединения, рекомендованные для мозгового питания, для ослабления стресса или депрессии или для улучшения внимательности, настроения или характера сна.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению Αν, 8ν или ΟΝ\ν для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимательности, бдительности, наступления и качества сна, анксиолитических эффектов, депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения или для применения в качестве ингредиента при приготовлении пищи, корма, пищевой добавки или нутрицептической композиции для настроения, когнитивной способности, аппетита, внимательности, бдительности, наступления и качества сна, анксиолитических эффектов, депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения.

Раскрывается питание (включая детские молочные смеси), питание для животных, корм, пищевая добавка или нутрицептическая композиция, содержащая композицию, полученную согласно способу изобретения или композицию согласно изобретению, включающую ΟΝ\ν. §ν или Αν как имеющиеся пептиды.

Согласно следующему варианту осуществления применение водорастворимых триптофансодержащих пептидов или композиции изобретения для увеличения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, наиболее предпочтительно 30 мин после потребления пептидов или композиции или для приготовления нутрицевтической композиции для увеличения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, наиболее предпочтительно 30 мин после потребления пептидов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую триптофан, присутствующий в пептидной форме, который является пригодным для получения эффективного увеличения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме за очень короткий промежуток времени. Мы обратили внимание, что ди- и трипептиды, содержащие триптофан, преимущественно способствуют этому увеличению. В одном варианте осуществления изобретения лизоцим, предпочтительно лизоцим куриных яиц, ферментативно (предварительно) гидролизуется в процессе изготовления, т.е. лизоцим (куриных яиц) предпочтительно представляется в виде гидролизата. Поглощение в желудочно-кишечном тракте содержащих триптофан пептидов, предложенных в форме гидролизата, значительно облегчается. В другом варианте осуществления настоящей заявки лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат, в котором уровни пептидов, содержащих положительно заряженные остатки аргинина и лизина, понижены. Последние гидролизаты отличаются молекулярными отношениями Ττρ/ΕΝΑΑ выше чем 0,15. В еще одном варианте осуществления настоящей заявки лизоцим куриных яиц превращается в гидролизат, содержащий совокупность пептидов, в которой больше чем 50%, предпочтительно больше чем 60%, более предпочтительно больше чем 75% присутствующих пептидов имеют молекулярную массу ниже 500 Да. Это с условием, что распределение молекулярной массы пептидов, присутствующих в гидролизате, осуществляется, как описано в

- 2 016806 разделе Материалы и методы настоящей заявки.

Важным преимуществом последнего варианта осуществления является то, что триптофан, включенный в ди- и трипептиды, транспортируется через стенку кишечника в кровоток непосредственно после орального потребления. В результате уровни триптофана в плазме увеличиваются почти немедленно с непосредственным воздействием на уровни серотонина в мозге. Данные, представленные в примере 6 настоящей заявки, показывают, что остатки триптофана, существующие в форме таких ди- и трипептидов, очень быстро приводят к высоким отношениям Ττρ/ΕΝΆΛ. В этом отношении остатки триптофана, существующие в форме этих ди- и трипептидов, по-видимому, являются даже более эффективными, чем свободный триптофан. Согласно настоящему способу получают водорастворимую пептидную фракцию, имеющую молекулярное отношение Ττρ/ΕΝΆΛ по меньшей мере 0,15 при условии, что аминокислотный анализ гидролизата выполняют, как описано в разделе Материалы и методы настоящей заявки.

Еще одно важное преимущество предложенного триптофана в форме ди- и трипептидов состоит в том, что поглощение в желудочно-кишечном тракте этих пептидов является таким быстрым, что их можно употреблять в комбинации с продуктами питания, содержащими белок, такими как молочные продукты, которые от природы имеют менее благоприятное отношение Ττρ/ΕΝΆΛ, и это даже приводит к эффективному увеличению отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме в течение 90-минутного, предпочтительно 60-минутного, более предпочтительно 30-минутного периода после потребления.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции изобретения, например водорастворимых пептидов, содержащих триптофан, для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, наиболее предпочтительно 30 мин после потребления пептидов, или для приготовления нутрицевтической композиции для получения повышенного отношения Ττρ/ΕΝΆΛ в плазме в течение 90 мин, предпочтительно 60 мин, наиболее предпочтительно 30 мин после потребления пептидов. Предпочтительно потребление белка или белоксодержащей пищи происходит в то же самое время или почти в то же самое время, как водорастворимых пептидов. Отношение Ττρ/ΕΝΆΛ означает увеличение этого отношения по сравнению с ситуацией до потребления или поглощения композиции изобретения.

Белок или полипептид определен здесь как цепочка, содержащая больше чем 30 аминокислотных остатков.

Пептид или олигопептид определен здесь, как цепочка, содержащая по меньшей мере две аминокислоты, которые связаны через пептидную связь. Термины пептид и олигопептид считаются синонимами (как общепризнано) и каждый термин может быть использован взаимозаменяемо, как требует контекст.

Водорастворимым пептидом является пептид, который является растворимым в воде при значении ρΗ 5,0.

Все (олиго)пептидные и полипептидные формулы или последовательности здесь написаны слева направо в направлении от аминоконца к карбоксиконцу, в соответствии с установившейся практикой. Однобуквенный код аминокислот, использованный здесь, является общеизвестным в данной области техники и может быть найден в 8ашЬтоок, с1 а1. (Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2⁶ еб. Со1б δρτίη^ НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б δρτίη^ НагЬог ЬаЬога1огу Ртезз, Со1б δρτίη^ НагЬог, ΝΥ, 1989).

Под белковым гидролизатом, гидролизатом или гидролизованным белком имеют в виду продукт, который образуется путем ферментативного гидролиза белка, обогащенный гидролизат является фракцией белкового гидролизата, например обогащенной выбранными пептидами, или в котором пептиды или полипептиды удалены из гидролизата. Значит, обогащенный гидролизат является предпочтительно смесью пептидов (или пептидной смесью). Пептидная смесь изобретения является, следовательно, смесью по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех, более предпочтительно по меньшей мере четырех пептидов, содержащих триптофан. Более предпочтительно смесь содержит совокупность пептидов, в которой больше чем 50%, предпочтительно даже больше чем 60% и наиболее предпочтительно больше чем 75% присутствующих пептидов имеет молекулярную массу ниже 500 Да. Триптофансодержащий пептид означает пептид, который содержит по меньшей мере один остаток аминокислоты Ь-триптофана.

Отношение Ττρ/ΕΝΑΑ представляет молярное отношение триптофана относительно уровней других больших нейтральных аминокислот (ΕΝΑΑ: т.е. сумма тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина). Кроме отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме, отношение Ττρ/ΕΝΑΑ относится только к пептидсвязанным аминокислотам. Таким образом, свободный триптофан, тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и валин не принимаются в расчет в Ττρ/ΕΝΑΑ отношении.

Пептидсвязанные аминокислоты являются аминокислотами, которые являются частью пептида, а не свободными аминокислотами.

Отношение Τ\τ/Βί.ΆΑ представляет молярное отношение тирозина относительно уровней разветвленных аминокислот (Βί.ΆΑ: т.е. сумма лейцина, изолейцина и валина). Предпочтительно отношение Τ\τ/Βί.ΆΑ составляет выше чем 0,1, предпочтительно выше чем 0,12.

Благоприятное наступление и качество сна определяют как спокойное вхождение в сон в течение 45 мин после отхождения ко сну.

- 3 016806

Настроение определяют как эмоциональное состояние ума и предпочтительно оценивают с помощью вопросника Профиль настроения (ΡΘΜ8) (см. пример 6 настоящей заявки).

Когнитивную способность определяют как комбинированные навыки, имеющие отношение к таким областям, как способность решать проблему, обучение, память и язык.

Аппетит определяют, как желание есть, возбуждаемое чувством голода.

Внимательность определяют как внимательное или бдительное состояние ума, предпочтительно оцененное с помощью теста Макуорта (МасктеоПй С1оск Тс51) и задания на слежение (Сгй1са1 Тгаскшд Та§к) (см. пример 9 настоящей заявки).

Анксиолитическими действиями являются действия, которые приводят к ослаблению чувства страха, боязни или беспокойства.

Депрессию определяют как состояние ума, отличающееся тяжелым и настойчивым ощущением потери желаний.

Термин сексуальное поведение используют здесь, как синоним для либидо.

В \νϋ 02/46210 описан способ увеличения уровня триптофана в гидролизатах белков сыворотки молока. В использованном способе сыворотку сначала подвергают гидролизу при кислом значении рН с помощью одной или больше кислых протеаз, предпочтительно с помощью пепсина, реннина, кислой грибковой протеазы, химозина, папаина, бромелаина, химопапаина или фицина. Предпочтительными условиями инкубации являются значения рН между 1,5 и 3,5, и условия выбирают так, чтобы производить пептиды, имеющие гидрофобную природу. Гидролиз сознательно осуществляют таким образом, что остатки триптофана становятся включенными в большие гидрофобные пептиды. Гораздо меньше остатков триптофана присутствует в небольших, более водорастворимых пептидах. В следующей технологической операции рН повышают от 4,0 до 6,0, чтобы способствовать осаждению этих больших триптофансодержащих пептидов, таким образом, облегчая их селективное восстановление из гидролизата сыворотки. Однако способ, как описано, имеет несколько недостатков. Полученный триптофан присутствует в больших кислото-нерастворимых пептидах, а это означает, что применение, например, в кислых напитках будет проблематичным. Сверх того факта, что триптофан присутствует в относительно больших пептидах, поглощение триптофана в кровь будет замедленным, таким образом ограничивая возможности применения препарата в качестве ингредиента пищи или напитка, особенно в комбинации с другими белками. Другим препятствием применения таких больших пептидов является то, что подобные пептиды могут давать повышение аллергических реакций. Такие реакции на белки сыворотки молока хорошо известны.

Настоящее изобретение преодолевает эти препятствия раскрытием простого процесса гидролиза, начиная с белка, который является доступным с точки зрения индустрии и отличается высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ. Настоящий способ имеет выход триптофана больше чем 30%, исходя из триптофана в белке и дает водорастворимую пептидную композицию, содержащую триптофан. Факт, что большая часть остатков триптофана заключена в ди- и трипептиды, означает немедленное поглощение в кровоток. Как будет раскрыто, это свойство дает возможность включения гидролизата в большое разнообразие пищевых или нутрицевтических продуктов. Совершенно неожиданно настоящее изобретение также раскрывает, что после орального потребления гидролизат согласно изобретению может вызывать более высокие отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме крови, чем отношение Тгр/ΕΝΑΑ существующего гидролизата. Наконец, триптофансодержащая пептидная смесь также отличается очень низкой антигенностью.

Согласно настоящему изобретению лизоцим куриных яиц используют как подходящий субстрат для представления препаратов с высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ. Лизоцим присутствует в яичном белке в концентрации 3-4%. Используя его исключительно высокую изоэлектрическую точку, лизоцим промышленным способом выделяют из яичных белков с помощью простой катионной хроматографической очистки. Конечный продукт является почти чистым, и этот в промышленном отношении доступный продукт имеет содержание молекулярного триптофана 7,8% и молекулярное отношение Тгр/ΕΝΑΑ по меньшей мере 0,15. Таким образом, чистый лизоцим имеет отношение Тгр/ΕΝΑΑ, которое значительно выше, чем чистого альфа-лактальбумина и/или бета-лактоглобулина. Следовательно, гидролизат лизоцима согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет молярное отношение Тгр/ΕΝΑΑ, которое является выше чем 0,15, более предпочтительно отношение Тгр/ΕΝΑΑ является выше чем 0,20, даже более предпочтительно отношение Тгр/ΕΝΑΑ является выше чем 0,23, еще более предпочтительно отношение Тгр/ΕΝΑΑ является выше чем 0,25 и наиболее предпочтительно отношение Тгр/ΕΝΑΑ является выше чем 0,30. Вообще, молярное отношение Тгр/ΕΝΑΑ составляет ниже 3,0. По существу, лизоцим представляет предпочтительную отправную точку для триптофансодержащих пептидов или композиций. Лизоцим (ЕС3.2.1.17) является ферментом, способным гидролизовать пептидогликановые связи в стенках бактериальных клеток, приводя к лизису клеток. Вследствие его бактериального действия лизоцим играет важную роль в защите хозяина, предотвращая инфекции. При физиологических условиях молекула лизоцима является очень устойчивой к протеолитической атаке. Эту необычную устойчивость можно объяснить на эволюционной почве: так как инвазивная бактерия способна выделять большое разнообразие протеаз, молекула лизоцима, восприимчивая к таким протеазам, будет быстро инактивирована. Протеазная устойчивость проиллюстрирована для а.о. лизоцимов желудка жвачных животных (ЭоЬкоп с! а1.,

- 4 016806

1. ΒίοΙ. Скет. 1984, 259 (18) 11607-11616). Можно предполагать, с точки зрения структуры, что наличие четырех дисульфидных связей в молекуле усиливает протеазную устойчивость лизоцима. На основе данных, представленных в примере 1 настоящей заявки, лизоцим куриных яиц может считаться настолько устойчивым к протеолитической атаке, что маловероятно, что молекула может быть эффективно переварена в соответствующей части кишечного тракта человека. Результатом этой протеазной устойчивости является то, что, несмотря на очень привлекательное отношение Тгр/ΓΝΛΛ. интактный лизоцим не является подходящим источником для повышения уровней триптофана в плазме просто потому, что остатки триптофана не выделяются при физиологических условиях, существующих в желудочно-кишечном тракте.

После потребления с пищей белки, присутствующие в пище, постепенно гидролизуются до более мелких фрагментов, затем транспортируются через стенку тонкой кишки и поступают в кровь. В желудочно-кишечном тракте некоторое количество различных протеаз, которые образуются в желудке, поджелудочной железе и тонкой кишке, являются активными для того, чтобы гидролизовать пищевые белки. Эндопротеазы, такие как пепсин, трипсин и химотрипсин, расщепляют белки с большой молекулярной массой на более мелкие олигопептиды. Затем эти олигопептиды дополнительно гидролизуются с помощью ряда других ферментов, таких как ди- и трипептидил пептидазы, давая ди- и трипептиды, и с помощью амино- и карбоксипептидаз, давая свободные аминокислоты. За эффективный транспорт через стенку кишечника в кровоток ответственными являются системы носителей, специфических для транспорта свободных аминокислот или ди- и трипептидов. После потребления с пищей свободные аминокислоты или ди- и трипептиды непосредственно включаются в кровоток. Пептиды, более крупные, чем трипептиды, требуют дополнительного ферментативного расщепления для того, чтобы стало возможным усвоение.

Мы обнаружили, что гидролизат согласно изобретению также является эффективным, если он включен в пищевые матриксы (ίοοά таБтсек), имеющие высокое содержание белка, как, например, молочные продукты. Это является совершенно неожиданным, так как пищевые матриксы, содержащие белок, показывают высокую загруженность ΕΝΑΑ и, таким образом, можно ожидать, что уменьшают эффект продуктов с высокими отношениями Тгр/ΕΝΑΑ. Возможным объяснением этого неожиданного феномена является то, что обычные пищевые продукты включают интактные, а не в значительной степени гидролизованные белки. Характерный размер распределения гидролизата согласно изобретению представлен на фиг. 3. Согласно этому чертежу большинство пептидов, включающих триптофан и тирозин, имеют молекулярную массу ниже 500 Да. Принимая во внимание очень высокую молекулярную массу триптофана (Μ\ν = 186) и тирозина (Μ\ν = 163) и факт, что присутствуют только очень низкие уровни свободного триптофана, можно сделать вывод, что большинство из этих пептидов будет представлять собой три- или дипептиды. Так как триптофан имеет значительно более высокий молярный коэффициент поглощения, чем тирозин, при использованной длине волны пиковые значения будут относиться главным образом к триптофансодержащим пептидам.

Так как триптофансодержащие ди- и трипептиды согласно изобретению адсорбируются намного быстрее, чем, например, большое количество ΕΝΑΑ, представленных негидролизованными матриксными белками, мы предполагаем, что это является причиной того, что даже в присутствии больших количеств матриксных белков можно получить высокие отношения Тгр/ΕΝΑΑ. Такое объяснение является особенно уместным для пищевых матриксов, содержащих казеины и зерновые белки, так как такие белки показывают плохую растворимость в кислых условиях желудка. Однако это также применимо к матриксам, содержащим более растворимые интактные белки, например белки сыворотки молока, так как усвоение таких белков в желудочно-кишечном тракте является относительно медленным, вследствие этого поглощение получающихся пептидов является также значительно отсроченным по сравнению с содержащими триптофан ди- и трипептидами согласно изобретению. Согласно данным, представленным в примере 6, такая задержка составляет от 30 до 60 мин: достаточно длинная, чтобы адсорбировать все содержащие триптофан ди- и трипептиды. Следовательно, поглощение белка или белоксодержащей пищи может происходить в то же самое время или почти в то же самое время, как водорастворимых пептидов. Почти в то же самое время означает, что поглощение пептидов происходит в течение 60 мин, предпочтительно 30 мин после поглощения белка.

Интересно, что наши настоящие экспериментальные данные также, по-видимому, указывают, что гидролизат согласно изобретению может генерировать отношения Тгр/ΕΝΑΑ в крови людейдобровольцев, которые выше, чем отношение Тгр/ΕΝΑΑ гидролизата. Несмотря на то что такой феномен неизвестен, а здесь появляется, согласно нашим самым лучшим знаниям общепринятое объяснение этого эффекта отсутствует, и мы полагаем, что это может быть вызвано чрезвычайно высоким содержанием аргинина в молекуле лизоцима. Предложенная в настоящее время рабочая гипотеза раскрывается здесь, чтобы объяснить экспериментальные данные, показанные в примерах. Эта гипотеза используется, чтобы предложить нынешнее представление изобретателей, но настоящее изобретение ни в коем случае не связано и не ограничено этой гипотезой. Итак, настоящее изобретение действует (остается в силе) независимо от правильности гипотезы. Увеличенное количество инсулина в крови стимулирует поглощение аминокислот из крови в периферическую ткань, особенно мышечную. Однако триптофан в значительной

- 5 016806 степени ускользает от этого пути вследствие того факта, что в крови триптофан связан с плазменным белком альбумином. В результате увеличенные уровни инсулина снижают концентрации ΕΝΑΑ, а не триптофана, таким образом повышая отношение Ττρ/ΕΝΑΑ в крови. Так как потребление углеводов вызывает секрецию инсулина и стимулирует поглощение ΕΝΑΑ в периферических тканях и в особенности в мышцах, отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме увеличиваются при потреблении углеводов (Еетпкбот и Уибтап, 1972, Ме1аЬокт, νοί. 21, Νο. 4, 337-342). Также известно, что кроме потребления углеводов секрецию инсулина стимулируют отдельные аминокислоты. Если уровни аминного азота в плазме, получающиеся в результате вливания отдельных аминокислот, очень сходны, то инсулиновые ответы варьируют значительно, Е1оуб е1 а1. (1. С1ш. БггекР 45(9): 1487-502) определили уменьшенный инсулиновый ответ для аминокислот аргинин > лизин > лейцин > фенилаланин > валин > метионин. С точки зрения того факта, что лизоцим особенно богат аминокислотой аргинином, заманчиво предположить, что инсулинстимулирующий эффект, инициируемый аргинином, приводит к высоким отношениям Ττρ/ΕΝΑΑ. Так как известен инсулинстимулирующий эффект углеводов, гидролизаты согласно настоящему изобретению предпочтительно включаются в рецептуру в комбинации с углеводами.

В одном варианте настоящего изобретения лизоцим, предпочтительно лизоцим куриных яиц, ферментативно (предварительно) гидролизуется в процессе изготовления, т.е. лизоцим (куриных яиц) предоставляется предпочтительно в форме гидролизата или обогащенного гидролизата. Кишечная абсорбция содержащих триптофан пептидов, предложенных в форме такого (обогащенного) гидролизата, значительно облегчается. В другом варианте осуществления настоящей заявки лизоцим куриных яиц превращают в гидролизат или обогащенный гидролизат, содержащий совокупность триптофансодержащих пептидов, из которых больше чем 50%, предпочтительно больше чем 60%, более предпочтительно больше чем 75% из присутствующих пептидов имеют молекулярную массу ниже 500 Да. Предпочтительно такой (обогащенный) гидролизат не содержит больше чем 1 вес.% (на сухую массу) свободного триптофана. Анализ молекулярной массы триптофансодержащих пептидов, присутствующих в гидролизате, выполняют, как описано в разделе Материалы и методы настоящей заявки, и показан на фиг. 3. Важное преимущество последнего варианта осуществления состоит в том, что триптофан, включенный в ди- и трипептиды, транспортируется через стенку кишечника в кровоток немедленно после орального потребления. В результате уровни триптофана в плазме увеличиваются почти немедленно с непосредственным воздействием на уровни серотонина в мозге. Совершенно неожиданно данные, представленные в примере 6 настоящей заявки, показывают, что эффективность остатков триптофана, представленных в виде этих ди- и трипептидов, даже больше, чем свободного триптофана. Это наблюдение подчеркивает преимущества, предложенные настоящим изобретением.

В еще одном варианте осуществления настоящей заявки гидролизат лизоцима (куриных яиц) фракционируют для того, чтобы повысить содержание триптофана во фракции гидролизата. Эта фракция или обогащенный гидролизат предпочтительно имеет повышенное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ по сравнению с гидролизатом до фракционирования. Обогащение гидролизата или обогащенный гидролизат с дополнительным свободным триптофаном, также составляет часть настоящего изобретения. В предпочтительном варианте для получения такого обогащенного гидролизата применяют наше наблюдение, что лизоцим содержит необычно высокое количество основных остатков аргинина и лизина. Неожиданно, и в результате подобранных условий ферментативной инкубации, т.е. выбора эндопротеазы, имеющей предпочтение в отношении правильного расщепления (такой как субтилизин) в комбинации с условиями инкубации, которая дает высокое количество ди- и трипептидов, включающих триптофан, но почти не включающих остатки аргинина или лизина, мы можем получить обогащенный гидролизат лизоцима согласно изобретению. Таким образом, ΕΝΑΑ-содержащие пептиды, включающие остатки аргинина или лизина, могут быть отделены от пептидов, содержащих триптофан, которые не содержат таких основных остатков. Например, при доведении ρΗ гидролизата до значения между 4 и 6, более предпочтительно между 5,0 и 5,5, пептиды без таких основных остатков не будут иметь заряда и, следовательно, пониженной гидрофильности. Эти свойства можно применить с пользой, например, в процессе хроматографического или другого разделения для селективного удаления большой части пептидов, содержащих аргинин или лизин. Таким образом, заметно увеличивается содержание пептидов, содержащих триптофан, и необязательно отношение Ττρ/ΕΝΑΑ этого обогащенного гидролизата. Пептиды, включающие заряженный аргинин или лизин, можно удалить с помощью известных способов, таких как ионная хроматография, хроматографии гидрофобного взаимодействия или электродиализа. Практическую основу по применению таких характеристик в хроматографическом разделении соответственных пептидов можно найти в а.о. Рто1еш РитШсабоп НапбЬоок (изданном в Лтегбинп Рбаттас1а Вю1есб в настоящее время ОЕ НеаИбсате Вю-8аепсе8, О1едет, Бельгия). В еще более продвинутом способе очистки по отношению к препаратам, которые соединяют высокое содержание триптофана с высоким отношением Ττρ/ΕΝΑΑ, преимущественно используют наличие аминокислот с кислыми боковыми группами, такими как остатки глутамата (О1и) и аспартата (Ακρ) в лизоциме. При этом методе значение ρΗ гидролизата лизоцима согласно изобретению сначала подгоняют до 3,0 и затем хроматографируют через катионообменную смолу. При этом значении ρΗ пептиды, включающие О1и или Ακρ, будут проходить через колонку, другие пептиды будут связываться. Последующее элюирование с буфером ρΗ 5 будет извлекать все связанные пептиды без ос

- 6 016806 татков лизина или аргинина, как описано. Большая часть пептидов, содержащих триптофан, будет находиться в этой извлеченной фракции. Остальные связанные пептиды затем удаляют из колонки элюированием буфером даже с более высоким значением рН. Этот элегантный способ проиллюстрирован в примере 4 настоящей заявки.

Хотя для настоящего изобретения предпочтительно используют ионно-обменную хроматографию и/или хроматографию гидрофобного взаимодействия, другие подходящие способы хроматографического разделения, включая аффинную хроматографию и эксклюзионную хроматографию, также являются пригодными. Восстановление обогащенных триптофаном пептидов из полученных водных фракций может быть проведено способами, хорошо известными в данной области техники. Для того чтобы получить концентрированные и стойкие в хранении продукты, восстановление предпочтительно включает выпаривание и стадию сушки (распылением). Процессы нанофильтрации и экстракции, вовлекающие органические растворители, с последующими стадиями выпаривания/осаждения, также представляют способы для желательной очистки. Восстановление пептидов, обогащенных триптофаном, из органических растворителей выполняют предпочтительно выпариванием растворителя.

\νϋ 2006/009448 обеспечивает гидролизаты белка, полученные из белков куриных яиц, обладающие антигипертензивными свойствами, так же, как и пищевые продукты и пищевые добавки, содержащие эти гидролизаты. Этот документ раскрывает получение большого количества гидролизатов, включая гидролизаты, полученные из лизоцима куриных яиц. Все эти гидролизаты стремятся к понижению кровяного давления или предотвращению подъемов кровяного давления после орального приема у человека. νθ 2006/009448 также описывает получение гидролизатов лизоцима, полученных при щелочных условиях с использованием субтилизина (ЕС3.4.21.62; торговые названия Алкалаза или Протекс). В соответствии с высокой степенью гидролиза, который получают, эти гидролизаты лизоцима содержат большую часть пептидов с молекулярной массой ниже 500 Да. Однако нигде в тексте νθ 2006/009448 не сделана ссылка на тот факт, что лизоцим является источником белка, имеющим высокое содержание триптофана, который может положительно влиять на уровни серотонина в мозге. Также не упоминается, что гидролизаты лизоцима содержат водорастворимые пептиды, включающие высокие количества триптофана и относительно низкое количество ΕΝΑΑ. νθ 2006/009448 также не упоминает высокое содержание аргинина и лизина или в лизоциме или в гидролизатах лизоцима. Мы обнаружили, что на основе данных, представленных в настоящей заявке, высокое содержание триптофана в молекуле лизоцима в комбинации с повсеместным присутствием аргинина и лизина, делает лизоцим совершенным исходным материалом для получения высоких отношений Тгр/ΕΝΑΑ ίη νίνο. Кроме того, текст νθ 2006/009448 не упоминает преимущества, предоставляемые гидролизатом согласно настоящему изобретению, при его совместном потреблении с другими белоксодержащими пищевыми продуктами. Кроме использования мембранных фильтров, текст νθ 2006/009448 также не упоминает способы получения пептидных фракций из этих гидролизатов, имеющих подобранные аминокислотные композиции, или использования особых методов для увеличения содержания триптофана или для увеличения отношения Тгр/ΕΝΑΑ. Более того, преимущество предоставления сильно деградировавшего, гипоаллергенного гидролизата лизоцима не отмечено.

Несмотря на факт, что лизоцим оказался высоко устойчивым к протеолитическому гидролизу при физиологических условиях, т.е. при кислом значении рН с использованием пепсина, трипсина и химотрипсина в качестве протеаз, гидролизаты лизоцима согласно изобретению также могут быть получены при подобных менее благоприятных кислых условиях. Однако при таких условиях требуются относительно жесткие условия инкубации, такие как более высокие концентрации фермента, более высокие температуры и необязательно дополнительные эндопротеазы.

Данные, представленные в примере 4 настоящей заявки, показывают, что гидролизат лизоцима, полученный посредством инкубации лизоцима при щелочном значении рН с субтилизином, является особенно богатым дипептидом Αία-Тгр (Αν). Это открытие наводит на мысль, что химически синтезированный дипептид Αν может предоставить подходящую альтернативу для данного гидролизата лизоцима. Несмотря на то что применение синтетического дипептида имеет очевидные законодательные препятствия, важными преимуществами являются его экономическая эффективность и идеальное отношение Тгр/ΕΝΑΑ. Теоретически пригодными являются двадцать различных триптофансодержащих дипептидов, но наши исследования показали, что дипептиды Αία-Тгр (Αν) и 8ег-Тгр (δν) представляют особенно предпочтительные варианты для того, чтобы увеличить отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме через посредство синтетического дипептида. Получение дипептидов Αν и δν посредством химического синтеза возможно с помощью обыкновенных способов, например, как описано в Рерйбек: Сйеткйу и Вю1оду Ν. 8е\га1б и Η.Ό. 1акиЬке, Ебк. νίΚν-νί,Ή Уег1ад ОтЬН, 2002, глава 4. Особенно рентабельные способы химического пептидного синтеза, пригодные для крупномасштабного производства, основываются на применении алкилхлорформиатов или пивалоил хлорида для активации карбоксильной группы совместно с использованием сложных метиловых эфиров для С-концевой защиты и бензилоксикарбонильных (Ζ) или трет-бутилоксикарбонильных групп для Ν-защиты. Подробная методика для рентабельного синтеза дипептида δν предоставлена в примере 5.

При наличии гидролизатов лизоцима согласно настоящему изобретению предусматриваются другие

- 7 016806 новые и неожиданные применения, которые обладают техническими и экономическими преимуществами.

Новым применением может быть включение пептидов изобретения в различные детские смеси. Коровье молоко содержит 20% белка сыворотки молока, а молоко человека - от 40 до 60%. В результате, коровье молоко содержит меньше альфа-лактальбумина и, таким образом, триптофана, чем молоко человека. Нормальных, доношенных детей обычно кормят смесями на основе коровьего молока, продуктами, которые не обеспечивают профиль аминокислот, равноценный с профилем материнского молока. Хотя последствия недостаточного снабжения триптофаном полностью неизвестны, детские смеси с высоким содержанием триптофана могут иметь полезное действие на сознательное поведение и наступление сна и характерные особенности ребенка. Сильное показание к применению, что высокий уровень триптофана в плазме способствует быстрому наступлению спокойного сна у здоровых новорожденных, было представлено Уодшап и Ζοίδοί в N Епд1. 1. Меб. 1983 Νον. 10; 309(19): 1147-1149. Соответственно настоящее изобретение предоставляет композиции для детских смесей, в которых уровень триптофана повышают посредством использования (обогащенного) гидролизата, полученного из лизоцима (куриных яиц). Предпочтительно лизоцим (куриных яиц), использованный в подобных детских смесях, гидролизуют до такой степени, что предотвращается аллергенность, т.е. лизоцим куриных яиц предпочтительно представляется в виде гипоаллергенного гидролизата.

Согласно другой особенности изобретения (обогащенные) гидролизаты согласно изобретению могут быть использованы в заменителях пищи. Например, \¥О 2005/023017 описывает преимущества желатина в высоких дозах как пригодного компонента в заменителях пищи. Несмотря на то что он представляет отличные органолептические свойства, желатин не обеспечивает необходимое соотношение аминокислот, например он не включает незаменимую аминокислоту триптофан. Значит, для того чтобы прийти к композиции, имеющей надлежащее соотношение аминокислот, как требуется в соответствии с Директивой ЕС 96/8/ЕС, к таким желатинсодержащим композициям должен быть добавлен триптофан. В \УО 2005/023017 триптофан предпочтительно добавляют в виде богатых триптофаном белков, например порошка яичного белка или полного яичного порошка. Теперь мы обнаружили, что гидролизаты, содержащие триптофан, согласно настоящему изобретению предлагают улучшенное решение этой проблемы, так как эти гидролизаты поставляют триптофан в намного более концентрированной форме. Кроме того, лизоцим сам содержит все основные аминокислоты в необходимом количестве и, по существу, является питательно полным белком, который идеально подходит как заменитель еды.

Согласно еще одной особенности изобретения гидролизаты согласно изобретению используют для возбуждения аппетита. Совершенно неожиданно мы обнаружили, что препараты с высоким отношением Тгр/ΕΝΆΆ стимулируют уровни грелина в плазме. Грелин известен как гормон голода, и показано, что стимулирование выработки грелина увеличивает потребление пищи и вес тела у человека (\Угеп е! а1., 2001, 1. С11п. Епбоег1по1. Ме1аЬ. 86, 5992-5995). Вследствие этого неожиданного действия, гидролизаты согласно изобретению дают преимущества, например, в клиническом питании, так как тяжелобольной склонен воздерживаться от всей пищи, таким образом замедляя восстановление.

В соответствии с еще одной особенностью изобретения гидролизаты согласно изобретению используют для улучшения наступления и качества сна у младенцев, детей и взрослых. Проблемы со сном очень распространены среди индивидуумов, принадлежащих к разным возрастным группам, и связаны с медицинскими расстройствами. Гидролизаты согласно настоящему изобретению пригодны для лечения проблем, связанных со сном вообще, однако они представляют собой полезное средство для преодоления проблем, связанных с когнитивными, физиологическими, социальными и поведенческими нарушениями. Примерами являются осуществление здоровой гигиены сна, преодоление ассоциативного расстройства наступления сна или расстройства сна, связанного с циркадным ритмом. Данные продукты также могут быть полезны для улучшения наступления и качества сна и психического состояния, например, пациентов с фибромиалгией. Синдром фибромиалгии представляет собой хронический болевой синдром, который связан с сильно нарушенным наступлением и качеством сна и эмоциональным стрессом. Мы обнаружили, что регулярное потребление обогащенных триптофаном гидролизатов согласно изобретению улучшает наступление и качество сна у индивидуумов, страдающих от проблем, связанных со сном вообще.

Триптофансодержащие гидролизаты согласно настоящему изобретению предлагают дополнительные преимущества, такие как поставка (полу-) незаменимых аминокислот. Лизоцим не только имеет высокий уровень триптофана, но также включает значительное количество остатков тирозина. Тирозин является предшественником нейромедиатора дофамина и известно, что уровни тирозина в плазме оказывают влияние на уровни дофамина в мозге. Гидролизат лизоцима не только содержит меньше ΕΝΆΆ, чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана, но он также содержит меньше аминокислот с разветвленными цепями (ВСАА), чем другие известные пептиды с высоким содержанием триптофана. Это важно, так как известно, что ВСАА понижают присутствие в плазме предшественника дофамина тирозина. Итак, высокое Тгр/ΕΝΛΛ отношение в комбинации с высоким отношением Туг/ВСАА делает лизоцим уникальной молекулой. Следовательно, гидролизат лизоцима согласно изобретению очень хорошо подходит в качестве питания мозга, то есть для поставки незаменимых аминокислот,

- 8 016806 необходимых для надлежащих уровней нейромедиатора. Известна решающая роль системы дофамина в опосредовании подкрепления (геетагб) и мотивации и ее действие на концентрацию, память, внимательность, внимание, принятие решений и психомоторную координацию. Как показано в примере 9 настоящей заявки, потребление гидролизата лизоцима согласно изобретению имеет значительные благотворные эффекты на активность (бдительность), внимательность, концентрацию и психомоторную координацию. Это открытие показывает, что можно предполагать, что гидролизат лизоцима согласно изобретению стимулирует не только систему серотонина, но также систему дофамина.

Из этого открытия могут извлечь пользу отдельные группы индивидуумов. Например, женщины на протяжении менопаузальных лет в основном жалуются на снижение способности принятия решений, которое они относят к неспособности концентрироваться. Следовательно, гидролизат лизоцима согласно изобретению является особенно пригодным для борьбы с этими проблемами у женщин данной возрастной группы. В категории молодых женщин и женщин средних лет почти всеобщим является предменструальный синдром. Данный синдром характеризуется широким разнообразием симптомов, а часто встречающимися являются жалобы на депрессию и изменчивость настроения. Для борьбы с этими явлениями часто назначают селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, такие как флуоксетин, а для женщин с более умеренными симптомами, адаптацию диеты и предупреждение стресса. Исходя из результатов экспериментов, описанных в примерах 6 и 9 настоящей заявки, гидролизат лизоцима согласно изобретению представляет собой отличный способ лечения, особенно для таких более умеренных случаев. Кроме того, недостаточное количество дофамина связано с расстройством дефицита внимания и гиперактивности (ЛИНИ), так что можно ожидать, что гидролизат лизоцима облегчит симптомы этого расстройства. Удивительным является наше открытие, что благоприятные действия на послестрессовое поведение являются особенно заметными у стресс-устойчивых субъектов. Возможным объяснением может быть то, что подвергнутые стрессу люди, с (сверх)активной системой серотонина, нуждаются в триптофане из питья для пополнения запасов серотонина и таким образом не могут использовать этот триптофан для улучшения выполнения задач. В соответствии с этой линией рассуждения, стрессустойчивые люди без сверхактивной серотонинергической системы не нуждаются в триптофане для пополнения запасов серотонина и могут использовать его для улучшения их послестрессового поведения. Альтернативным объяснением может быть то, что эти эффекты происходят фактически вследствие стимулирующего действия дофаминергических процессов. Синтез дофамина может быть усилен пищевыми ингредиентами, богатыми тирозином, особенно в соединении с низкими уровнями аминокислот с разветвленными цепями (ВСАА). Эти рабочие гипотезы раскрыты здесь, чтобы объяснить экспериментальные данные в примерах, и использованы для того, чтобы дать текущее представление изобретателей. Однако настоящее изобретение ни в коем случае не является связанным или ограниченным этими гипотезами. Итак, настоящее изобретение остается в силе независимо от корректности этих гипотез. Как указано в другом месте, лизоцим не только имеет высокий уровень триптофана, но также включает значительное количество остатков тирозина.

Обогащенные гидролизаты согласно настоящему изобретению также повышают содержание цистеина в пищевых продуктах. Несмотря на то что цистеин не является незаменимой аминокислотой, концентрации цистеина ограничены во многих пищевых продуктах. Эндогенный синтез цистеина требует наличия метионина, причем подобно цистеину концентрации метионина ограничены во многих пищевых продуктах. Преимущество повышенного содержания цистеина в пище имеет отношение в числе других к антагонистическому эффекту метионина на повышение гомоцистеина в сыворотке. Это открытие описано в \νϋ 03/055335. Гидролизаты лизоцима согласно изобретению также отличаются высоким уровнем цистеина. Фактически, молекула лизоцима содержит даже больше остатков цистеина (8), чем остатков триптофана (6). В этом отношении гидролизаты согласно настоящему изобретению обеспечивают прекрасный источник для увеличения содержания цистеина в определенных продуктах. Обнаружено, что повышенные содержания цистеина важны для таких продуктов, как детские смеси. Не только для детской смеси, основанной на казеине и смесях казеина и белков сыворотки молока, но также для продуктов на основе сои и фактически для всех продуктов, богатых белком, в которых основной источник белка обеспечивается белком, содержащим относительно низкие количества триптофана или цистеина. Кроме белковых компонентов из коровьего молока и желатина, примерами таких белков являются белок кукурузы, белок дрожжей, белок горошка, белок сои и белок риса. Кроме того, упомянутые выше заменители пищи, содержащие высокие дозировки желатина, содержат недостаточные количества цистеина.

Обогащенные гидролизаты согласно настоящему изобретению или пептидная фракция, полученная из этого белкового гидролизата, или ди- или трипептид, который содержит триптофан, особенно §ν или Αν, могут быть использованы в любой подходящей форме, например, такой как пища или напиток, как пища для специального диетологического использования, как пищевая добавка, как нутрицевтик или даже в корм или пищу для животных. Гидролизат лизоцима может быть добавлен на любой стадии во время нормального процесса (получения) этих продуктов. При использовании в пище или напитках предпочтительными являются продукты с относительно низким содержанием белка для того, чтобы сохранить высокое отношение Тгр/ЬИАА в крови после потребления продуктов согласно изобретению. Кроме того, предпочтительно углеводы добавляют к пище или напиткам, содержащим гидролизат лизо

- 9 016806 цима, чтобы дополнительно улучшить высокое отношение Тгр/ΕΝ АА в крови после потребления. Подходящие пищевые продукты включают, например, зерновые плитки, хлебобулочные изделия, такие как кексы и печенье, и также жидкую пищу, такую как супы или порошкообразные концентраты супа. Кроме молочных продуктов, таких как молоко и йогурт, другие подходящие напитки включают неалкогольные и алкогольные напитки, а также жидкие препараты для добавления к питьевой воде и жидкой пище. Безалкогольные напитки являются предпочтительно минеральной водой, спортивными напитками, фруктовыми соками, лимонадами, чаями, концентрированными напитками, такими как выпиваемые залпом напитки (кйо1к), энергетическими напитками (например, напитки, содержащие глюкуронолактон, кофеин или таурин) и газированными напитками (например, лимонады, сода и кола). Предпочтительными комбинациями триптофанового гидролизата согласно изобретению являются комбинации с соединениями, рекомендованными для питания мозга, такими как железо, цинк, магний, витамины (особенно В2, В6, фолиевая кислота и С), омега-3 и ΌΗΆ жиры или жирные кислоты, глюкоза, САВА, холин, фосфатидилсерин, коэнзим 010. креатин, таурин и 5-НТР, или с соединениями, рекомендованными для ослабления стресса или депрессии, такими как валериана, шоколад, зверобой, 5-НТР, фосфатидилсерин, алкоголь, мелисса лимонная, зеленый чай или экстракты зеленого чая, ромашка или Б-аденозил метионин, или с соединениями, рекомендованными для улучшения внимательности, такими как кофеин, гуарана, женьшень, гинкго билоба, зверобой и 5-НТР, или с соединениями, рекомендованными для улучшения настроения, такими как САВА, 5-НТР, РЕА, зеленый чай или экстракты зеленого чая, гинкго билоба, шалфей или Б-аденозил метионин, или с соединениями, рекомендованными для улучшения сна, такими как, молочные пептиды, свободный триптофан, опиоидные пептиды или мелатонин. Примеры пищевых продуктов для специального диетологического использования включают категории спортивного питания, питания для похудения, детские смеси и клиническое питание. Термин пищевая добавка при использовании здесь обозначает продукт, принимаемый внутрь, который содержит соединение или смесь соединений, предназначенных для дополнения диеты. Соединение или смесь соединений в этих продуктах могут включать витамины, минералы, травы или другие лекарства из растительного сырья и аминокислоты. Пищевые добавки также могут быть экстрактами или концентратами и могут быть созданы во многих формах, таких как таблетки, капсулы, мягкие желатиновые капсулы, желатиновые капсулы, жидкости или порошки. Термин нутрицептический при использовании здесь обозначает пригодность и в диетологической, и в фармацевтической области применения. Нутрицевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть в любой форме, которая пригодна для введения в организм животного, включая организм человека, особенно в любой форме, которая является традиционной для перорального приема, например в твердой форме, такой как (добавки/дополнения для) пища или корм, пищевой или кормовой премикс (предварительно приготовленная смесь), таблетки, пилюли, гранулы, драже, капсулы, шипучие составы и таблетки, или в жидкой форме, такой как растворы, эмульсии или суспензии, как например, напитки, пасты и маслянистые суспензии. Составы с контролируемым (отсроченным) высвобождением, включающие гидролизаты согласно изобретению, также составляют часть изобретения. Кроме того, мультивитаминные и минеральные добавки могут быть добавлены к нутрицевтическим композициям настоящего изобретения для получения достаточного количества необходимого питательного вещества, которое отсутствует в некоторых диетах. Мультивитаминные и минеральные дополнения могут также быть пригодны для предотвращения болезни и защиты от обусловленных питанием потерь и дефицитов вследствие уклада жизни.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения композиции можно использовать как нутрицевтические дополнения, например, для улучшения настроения или улучшения когнитивных функций, таких как обучение, память, бдительность и внимательность, например, у пожилых людей, а также у более молодых людей, таких как студенты, которые готовятся к экзаменам, и у людей, которые, например, играют в компьютерные или Интернет игры. Как упоминалось раньше, для женщин в период пре- и постменопаузы композиции согласно изобретению представляют особенную значимость. Композиции согласно изобретению также являются особенно важными для спортивных людей; и для профессиональных спортсменов при планах тренировок, требующих больших затрат сил, а также для людей, занимающихся оздоровительным спортом, таких как играющих в теннис или гольф людей. Это означает, что настоящее изобретение относится к применению гидролизатов согласно изобретению, как представлено выше, и как добавки, улучшающей состояние, т.е. как средств для уменьшения раздражительности и слабости (в конечном счете, уменьшения риска перетренировки), уменьшения или предотвращения или облегчения физического и психического утомления, способствования спокойному сну, то есть для действия против бдительности и расстройств сна и для улучшения сна, и усиления энергии в более общих терминах, особенно увеличения выработки мозговой энергии, у больных или нормальных здоровых индивидуумов. Кроме того, для улучшения когнитивной способности вообще и особенно для поддержания или улучшения внимания и концентрации, памяти и способности к запоминанию, способности к обучению, языкового процессинга, принятия решений и умственной деятельности; для улучшения кратковременной, а также долговременной памяти; для увеличения умственной активности; для снижения ментальной усталости; для поддержания хорошего когнитивного здоровья, для поддержания сбалансированной когнитивной функции. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению гидролизатов

- 10 016806 согласно изобретению для увеличения аппетита. В случае необходимости получения рентабельных препаратов с высоким отношением Тгр/ΕΝΆΆ гидролизаты согласно изобретению необязательно содержат свободный триптофан.

Перечень чертежей

Фиг. 1. Молярное отношение Тгр/ΕΝΆΆ в плазме как функция времени после потребления продуктов подробно описано в примере 6. ВЕЕ = гидролизат казеина, АЕАС = интактный альфа-лактальбумин, Тгр = свободный триптофан, \УЕРБ = гидролизат лизоцима, обогащенный триптофаном, 8ΥΝ = синтетический дипептид Бег-Тгр.

Фиг. 2. Негативное настроение (оценка по тесту РОМБ (опросник для оценки психоэмоционального состояния), как функция времени после потребления продуктов, подробное описание в примере 6. ВЕЕ = гидролизат казеина, АЬАС = интактный альфа-лактальбумин, Тгр = свободный триптофан, \УЕРБ = гидролизат лизоцима, обогащенный триптофаном, БΥN = синтетический дипептид Бег-Тгр.

Фиг. 3. Распределение по размерам водорастворимой пептидной фракции гидролизата лизоцима. Гидролизат лизоцима, полученный согласно способу, описанному в примере 3, был исследован с помощью метода определения распределения молекулярной массы пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах, как подробно описано в разделе Материалы и методы. Измерения оптической плотности при 214 нм показали наличие пептидных связей. Измерения оптической плотности при 280 нм показали наличие ароматических боковых цепей триптофана и тирозина. Так как триптофан имеет более высокую молярную оптическую плотность, чем тирозин при этой длине волны, пиковые значения относятся в основном к пептидам, включающим триптофан.

Фиг. 4. Блок-схема проведения эксперимента, описанного в примере 9. Ηί§1ι: чувствительные к стрессу добровольцы; 1о\у: устойчивые к стрессу добровольцы; Нуйг: гидролизат лизоцима, обогащенный триптофаном; плацебо (р1асеЬо): гидролизат казеина.

Фиг 5. Блок-схема типичного дня эксперимента, описанного в примере 9. Напиток (йппк): потребление напитка, содержащего гидролизат, богатый триптофаном или плацебо; кровь (Ь1оой): забор крови для определения уровней аминокислот в плазме; функциональные характеристики (регГогшапсе): испытания на функциональные характеристики до и после неуправляемого стресса; стресс (к1гекк): арифметическая задача.

Фиг. 6. Отношения в плазме Тгр/ΕΝΑΑ (мкмоль/л) после приема внутрь плацебо (р1с) или гидролизата лизоцима (Тгр-11уйг) в эксперименте, описанном в примере 9. Черные обозначения: чувствительные к стрессу субъекты; незакрашенные символы: устойчивые к стрессу субъекты.

Фиг. 7. Результаты теста Макуорта (Маск\уог111 С1оск Тек!), выполненного, как описано в примере 9. Количество правильных ответов (вертикальная ось) после потребления плацебо (р1с; левая часть) или гидролизата, богатого Тгр (Тгр-йуйг; правая часть), до (до стресса) или после (после стресса) арифметической задачи. Черные обозначения: чувствительные к стрессу субъекты; незакрашенные символы: устойчивые к стрессу субъекты. Так как разные экспериментальные продукты были даны в отдельные дни, релевантные сравнения могут быть сделаны только между условиями до стресса и после стресса в пределах одних и тех же обработки и дня.

Фиг. 8. Результаты задания на слежение (Сййса1 Тгаскшд Такк), выполненного, как описано в примере 9. Коэффициент лямбда СТ (показывающий конечный уровень сложности, которого достиг субъект) представлен после приема внутрь плацебо (р1с) или гидролизата, богатого Тгр (Тгр-йуйг). Черные обозначения: чувствительные к стрессу субъекты; незакрашенные символы: устойчивые к стрессу субъекты.

Материалы и методы

Материалы.

Субтилизин под торговым названием Протекс 6Ь был получен от Оеиеисог (ЬеИеи, Нидерланды), пепсин от Бщта и смесь трипсин/химотрипсин (Рогсше РЕМ) от №уохутек (Вадкуаегй, Дания). Лизоцим был получен как Делвозим Ь (22% сухая масса) от ЭБМ Еоой БреааШек (Ое1й, Нидерланды).

Гидролизат казеина (ВЕЕ) получали, по существу, как описано Ейеик е! а1. (1. Адпс Еоой Сйет., 53(20) 7950-7957, 2005). Казеинат натрия был в значительной степени гидролизован Протексом 6Ь, а после понижения рН до 4,5 пролинспецифической эндопротеазой до достижения ΌΗ >20%. После ультрафильтрации фильтрат подвергали термообработке для инактивации любой оставшейся ферментативной активности и окончательно высушивали распылением. Интактный альфа-лактальбумин (АЬАС) был получен как Вюрше (>90% альфа-лактальбумина) от компании Эауйсо Еоойк 1п1егпайоиа1, 1пс. (Ье Беиег, Миннесота); гидролизат лизоцима, обогащенный триптофаном (^ЕРБ), был получен, как описано в примере 4; синтетический дипептид Бег-Тгр ('^ΥΝ) был получен, как описано в примере 5; чистый Ь-триптофан (ТВР) был получен как Ь-триптофан-400 от ОйЫса, А1теге, Нидерланды.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (БЭБ-РАСЕ).

Чистоту использованных препаратов лизоцима проверяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (БЭБ-РАОЕ). Все материалы, использованные для БЭБ-РАСЕ и окрашивания, были закуплены у компании 1пуйгодеи (Саг1кЬай, СА, США). Образцы получали, используя БЭБ-буфер согласно инструкциям производителя, и разделяли на 12% бис-трис гелях с применением буферной системы МЕБ

- 11 016806

8Ό8 согласно инструкциям производителя. Окрашивание выполняли с помощью 81тр1у В1ие 8аГе 81аш (Коллоидный кумасси 0250). До гидролиза лизоцим выглядел как единственная полоса на геле с молекулярной массой приблизительно 14 кДа.

ЖХ/МС/М8 исследование.

Для определения наличия пептидов, содержащих триптофан (в основном ди- и трипептидов) в гидролизатах ферментных белков, полученных способом согласно изобретению, использовали ВЭЖХ с применением масс-спектрометра с ионной ловушкой (ТНегто Е1ее1гои, Вгеба, Нидерланды), соединенного с насосом Р4000 (Тйегто Е1ее1гои, Вгеба, Нидерланды). Образованные пептиды отделяли с помощью колонки 1пейкй 3 ΟΌ8 3,3 мкм, 150x2,1 мм (Уапап Ве1дшт, Бельгия) в комбинации с градиентом 0,1% муравьиной кислоты в воде М1Ш О (М1Шроге, ВебГогб, МА, США; раствор А) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор В) для элюирования. Градиент начинают со 100% раствора А, выдерживают здесь в течение 10 мин, линейно увеличивая до 20% В за 25 мин и непосредственно переходя к исходным условиям, и выдерживают здесь 15 мин для стабилизации. Используемый инжектируемый объем составлял 50 мкл, скорость потока составляла 200 мкл/мин, а температуру колонки поддерживали при 55°С. Концентрация белка в инжектируемом образце составляла приблизительно 50 мкг/мл. Распознавание интересующих пептидов основано на времени удерживания протонированной молекулы и на использовании специализированной тандемной масс-спектрометрии М8/М8 для интересующих пептидов с применением оптимальной энергии столкновений около 30%. Определение количества пептидов, содержащих триптофан, выполняли с помощью метода внешнего стандарта.

Тетрапептид УУРР (М=410,2) использовали для того, чтобы настроить оптимальную чувствительность в способе М8 и оптимальную фрагментацию в способе М8/М8, выполняя постоянное введение 5 мкг/мл, приводящее к протонированной молекуле в М8 способе, и оптимальной энергии столкновений около 30% при М8/М8 способе, генерируя В- и Υ-ионные серии.

Перед началом ЖХ/МС/МС анализа ферментативные гидролизаты белка центрифугировали при температуре окружающей среды и 13000 об/мин в течение 10 мин, причем супернатант разбавляли деминерализованной водой 1:100, профильтрованной через устройство для фильтрования воды Мййроге (МИКО вода).

Аминокислотные анализы.

Профили аминокислот в плазме анализировали, как описано в примере 6, с помощью ВЭЖХ согласно методу уап Еук е! а1. (1. С’НготаЮдг. 1993: 620: 143-148).

Другие исследования аминокислот были выполнены по методу Р1соТад, как указано в руководстве по эксплуатации Атшо Ас1б Апа1ук1к 8ук1ет оГ \Уа1егк (МбГогб МА, США). С этой целью образцы были высушены и непосредственно дериватизированы с использованием фенилизотиоцианата. Присутствующие дериватизированные аминокислоты были количественно проанализированы с помощью методов ВЭЖХ, как описано. Так как во время обычного кислого гидролиза Тгр и Сук разрушаются, были использованы специальные способы для количественного определения этих двух аминокислот. Чтобы предотвратить деградацию Сук во время гидролиза, эту аминокислоту сначала окисляли до цистеиновой кислоты с помощью пероксида водорода и затем количественно определяли. Анализ триптофана основан на несколько модифицированном методе ^а!егк. В этом методе аликвоту пептидного раствора высушивают под вакуумом и затем проводят гидролиз в течение 1 ч при 150°С в атмосфере азота в метансульфокислоте 4 М, содержащей 0,2% триптамина. Продукт реакции сразу количественно определяли с помощью ВЭЖХ, оснащенной колонкой А111ес11 АШта С18 и флуоресцентной детекцией.

Степень гидролиза.

Степень гидролиза (ΌΗ), которую получали во время инкубации с различными протолитическими смесями, контролировали с помощью высокочувствительного теста ОРА (№е1кеп, Р.М.; Ре!егкеп, Ό.; ИатЬтапп, С. 1тргоуеб тебюб Гог беЮгтттд Гооб рго!еш бедгее оГ йубго1ук1к. 1оита1 оГ Еооб 8с1епсе 2001, 66, 642-646).

Азот по Кьельдалю.

Общее содержание азота по Кьельдалю измеряли методом впрыскивания в поток. Аммиак, выделенный из растворов, содержащих белок, количественно определяли при 590 нм, используя проточноинжекционную систему Теса!ог НА8ТАР 5000, оборудованную ТКИ Ме11юб Саккебе 5000-040, компьютером Пентиум 4 с программным обеспечением 8ОЕ1А и Теса!ог 5027 Аи!окатр1ег. Количество образца, соответствующее динамическому диапазону способа (0,5-20 мг N/1), помещали в пробирку для расщепления вместе с 95-97% серной кислотой и таблетку Кьельдаля (К)е11аЬ) подвергали гидролизу по плану 30 мин при 200°С, а затем 90 мин при 360°С. После инжектирования в систему НА8ТАР 5000 измеряют пик азота, из которого можно сделать заключение о количестве измеряемого белка.

Распределение молекулярной массы пептидов и белков, присутствующих в гидролизатах.

Анализ распределения размеров пептидов в образцах белков, обработанных протеазой, был выполнен на автоматизированной системе ВЭЖХ, оснащенной нагнетательным насосом, инъекционным устройством, способным впрыскивать образец 10-100 мкл, и УФ-детектором, способным контролировать элюат при 214 нм.

- 12 016806

Для этого исследования использовали колонку Бицсгбсх Ρβρΐίάβ НК 10/300 СЬ (Лтсг^Нат), уравновешенную буфером 20 мМ фосфата натрия/250 мМ хлорида натрия при ρΗ 7,0. После инжектирования образца (обычно 50 мкл) различные компоненты элюировали из колонки с помощью буфера за 90 мин при скорости потока 0,5 мл/мин.

Систему калибровали с применением смеси цитохрома С (Мм 13 500 Да), апротинина (Мм 6510 Да) и тетраглицина (Мм 246 Да) в качестве маркеров молекулярной массы.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение.

Примеры

Пример 1.

Лизоцим куриных яиц не расщепляется ни пепсином, ни трипсином/химотрипсином.

Для проверки его усвоения в желудочно-кишечном тракте человека лизоцим куриных яиц инкубировали ίη νίίτο с пепсином, а также со смесью трипсина и химотрипсина. Обе инкубации выполняли при условиях ρΗ, которые преобладают в желудке (пепсин) и двенадцатиперстной кишке (трипсин/химотрипсин). Для этого 5% (вес./вес.) раствора лизоцима инкубировали с ферментами (1% вес./вес. фермента к белку лизоцима) в течение 2 ч при 37°С. Для предотвращения больших изменений ρΗ в результате продолжающегося гидролиза белка инкубацию выполняли в буфере Мс Итане (0,2 М лимонная кислота плюс Να₂ΗΡΟ₄). Низкие значения ΌΗ, полученные после двух часов гидролиза при 37°С (см. таблицу), показывают, что молекула лизоцима не может быть разрушена при условиях, которые воспроизводят условия пищеварения в желудке, двенадцатиперстной кишке и тощей кишке, так как можно было ожидать, что успешный протеолиз приведет к значению ΌΗ по меньшей мере 10%. Следовательно, остатки триптофана, присутствующие в интактной молекуле лизоцима куриных яиц, не могли высвобождаться в желудочно-кишечном тракте, таким образом означая, что молекулы триптофана, присутствующие в интактном лизоциме куриных яиц, не могут способствовать уровням триптофана в плазме.

Гидролиз лизоцима пепсином и смесью трипсин/химотрипсин

Фермент	рН начальное	рН конечное	1)П начал. (%)	ϋΗ конечн. (%)
Пепсин	2.8	2.4	= 0	2.4
Пепсин	3.6	3.2	<1
Пепсин	4.6	4.3	1.0

трипсин/химотрипсин	4.6	4.3	< 1
трипсин/химотрипсин	5.9	5.5	<1
трипсин/химотрипсин	7.2	7.0	1.3

Пример 2.

Лизоцим куриных яиц эффективно расщепляется субтилизином при повышенных значениях ρΗ.

Для проверки чувствительности лизоцима к ферментному гидролизу при нефизиологическом значении ρΗ и ферментных условиях раствор лизоцима инкубировали ίη νίίτο с микробным субтилизином (ЕС 3.4.21.62) при щелочных условиях ρΗ. Для этого 5% (мас./мас.) раствор лизоцима инкубировали при значениях ρΗ 7,0, 8,0 и 9,0 с 12,5 мкл Протекса 6Ь на 1 г имеющегося белка лизоцима. Инкубацию проводили в течение 3 ч при 60°С при постоянном регулировании ρΗ с помощью 1 М ΝαΟΗ. Инкубации давали в результате немного мутные растворы без каких-либо значительных осадков. После стадии нагревания для инактивирования активности субтилизина значения ΌΗ при различных условиях инкубации измеряли по протоколу, описанному в разделе Материалы и методы. В противоположность результатам, полученным при физиологических условиях (см. пример 1), щелочные условия инкубации с использованием субтилизина приводят к полному гидролизу лизоцима. Инкубация при значении ρΗ 7,0 давала ΌΗ 6,3, инкубация при ρΗ 8,0-ΌΗ 11,2 и инкубация при ρΗ 9,0-ΌΗ 16,4. Последующий 8Ό8ΡΑСΕ-анализ продуктов реакции показал, что целая молекула лизоцима была разрушена, т.е. фрагменты большой молекулярной массы не выдерживали инкубацию с субтилизином. Кроме того, ВЭЖХ-анализ гидролизата на колонке ίτο\νηρ;·ι1< СК+ (Ьа1сс1) показал, что не происходила значительная рацемизация триптофансодержащих пептидов, даже после длительного нагревания при ρΗ 9,0.

Пример 3.

Гидролиз лизоцима с помощью протекса и идентичность образованных пептидов.

Раствор, содержащий 10% (вес./вес.) чистого лизоцима, доводили до значения ρΗ 8,2 с помощью ΝαΟΗ и нагревали до 52°С. Гидролиз начинали добавлением 25 мкл Протекса/г имеющегося белка. При непрерывном помешивании и поддерживании значения ρΗ 8,2, гидролиз продолжали в течение 5,5 ч до получения почти чистого раствора без видимого осадка. После стадии нагревания для инактивирования активности протекса брали образец для исследования ΌΗ. ΌΗ раствора оказался почти 30%. Термообработанный раствор подвергали ультрафильтрованию через фильтр 10 кДа с получением совершенно чистого раствора. Эту чистую жидкость использовали для исследования ЖХ/МС, распределения молекулярной массы присутствующих пептидов и белков, а также для ионообменной хроматографии.

Чтобы получить представление о распределении молекулярной массы присутствующих пептидов и белков, чистую жидкость подвергали изучению на размеры молекул, как описано в разделе Материалы

- 13 016806 и методы. Полученные результаты (см. фиг. 3) ясно показали, что почти все пептиды, включающие аминокислоты с ароматической боковой цепью (т.е. триптофан, тирозин и фенилаланин), имеют молекулярную массу ниже 500 кДа. С точки зрения высокой молекулярной массы этих аминокислот выводом является, что большинство из этих небольших пептидов являются или три- или дипептидами.

ЖХ/МС анализ был выполнен согласно методике, как описано в разделе Материалы и методы. При отборе пептидов, содержащих триптофан (V), могли быть обнаружены пептиды Αν, ΟΝ\ν. νίΚ, ΝΑν, ννΑ, νΑν, ΑνΚ, δΕΟΝν и незначительные количества νν и 8Κνν. Было установлено, что уровень свободного триптофана в гидролизате после инкубации представляет меньше чем 1% общего присутствующего триптофана (лизоцима).

Так как ди- и трипептиды легко адсорбируются транспортерами пептидов, присутствующими в стенке кишечника, существует небольшое сомнение, что остатки триптофана, присутствующие в таких пептидах, будут быстро адсорбироваться и приводить к увеличенным уровням триптофана в плазме после орального приема настоящего гидролизата лизоцима.

Пример 4.

Увеличение содержания триптофана в гидролизате.

Лизоцим включает неожиданное большое количество основных остатков аргинина и лизина. Кроме того, молекула лизоцима включает значительное количество кислых остатков глутамата и аспартата. Эти данные использовали для разработки новаторского и отличного способа очистки по отношению к гидролизатам, которые отличаются высокими отношениями Тгр/ΕΝΑΑ. Важным требованием для этого способа очистки является, однако, что только очень немного остатков триптофана обнаруживается в пептидах, также содержащих или остаток аргинина или лизина или остаток глутамата или аспартата. Как показано в примере 3, особый способ гидролиза, используемый здесь, дает всего лишь несколько триптофансодержащих пептидов, включающих остаток аргинина, и отсутствуют пептиды, содержащие остаток лизина, глутамата или аспартата.

Теория предсказывает, что различие максимального заряда между пептидами с и без остатка глутамата или аспартата может быть достигнуто около значения рН 3. Различие максимального заряда между пептидами с и без остатка аргинина или лизина может быть достигнуто около значения рН 5.

Для иллюстрации селективной возможности этого подхода гидролизат лизоцима получали согласно методу, указанному в примере 3. Затем значение рН гидролизата доводили до рН 3,1 с помощью уксусной кислоты и приблизительно 0,5 г белка наносили на колонку, заполненную ЗР Зерйатоке РР (СЕ НеаЕйсате, П1едет, Бельгия) (15-мл объем слоя) и уравновешенную 20 мм цитратом натрия рН 3,1. После промывки колонки одним объемом колонки натрийцитратного буфера для удаления большинства пептидов, включающих глутамат или аспартат, элюентный буфер заменяли 20 мм натрийцитратным буфером рН 5,1. Во время промывки колонки (тремя объемами колонки) последним буфером был элюирован ряд триптофансодержащих пептидов. Согласно ЖХ/МС исследованию дипептид Αν присутствовал в больших количествах так же, как и трипептиды 6Νν, ΝΑν, ννΑ, νΑν и небольшое количество пентапептида 8Ε6Νν. Аминокислотный анализ разных фракций рН 5,1 показал, что селективное соединение давало раствор, имеющий молекулярное Тгр/ΕΝΑΑ отношение 1,75 и выход триптофана почти 30%. Менее селективное соединение давало раствор с молекулярным Тгр/ΕΝΑΑ отношением 0,4 и выход триптофана 70%. Позднее колонку промывали (тремя объемами колонки) 20 мМ цитратом натрия рН 7,1. Согласно ЖХ/МС данным на этой стадии элюировали аргининсодержащие пептиды νίΚ, ΑνίΚ и, неожиданно, пептид νν. Окончательной промывкой колонки 1 М №ОН, водой и 1 М уксусной кислотой готовили колонку для следующего опыта.

Пример 5.

Химический синтез дипептида 8ет-Ттр.

Дипептид 8ет-Ттр синтезировали по стандартной пептидной технологии. На первой стадии Ζ-ЗегОН и Тгр-ОМе были связаны с помощью методологии двуокиси углерода (I. Αт. Скет. 8ос. 1967, 5012) с получением защищенного дипептида Ζ-Зег-Тгр-ОМе. Для этого Тгр-ОМе-НС1 суспендировали в тетрагидрофуране (ТНР) и потом добавили Ν-метилморфолин (ΝΜΜ). Смесь перемешивали в течение одного часа и потом добавляли к раствору Ζ-Зет в тетрагидрофуране/диметилформамиде (ТНР/ОМР). Добавляли второй эквивалент ΝΜΜ и смесь охлаждали до -15°С. Изобутил хлорформат добавляют с такой скоростью, что внутренняя температура не выходит за пределы -15°С. Потом смесь перемешивали в течение 3 ч, температуре позволяли подняться до температуры окружающей среды и осажденный ΝΜΜΉΟ удаляли фильтрованием. Фильтрат держали при 4°С в течение ночи, после чего любой дополнительный осадок отфильтровывали и фильтрат концентрировали под вакуумом. Осадок очищали с помощью колоночной хроматографии (З1О₂, этилацетат/гептан). Комбинированные фракции концентрировали, промывали водой, чтобы удалить какой-либо оставшийся ΌΜΡ, и концентрировали под вакуумом.

На второй стадии был выполнен ферментативный гидролиз Ζ-Зе^-Т^р-ОΜе с помощью алкалазы 2.5Б ΌΧ (Ιηΐ. I. Рерйбе Рго1ет Кек. 1990, 52) и последующий каталитический гидрогенолиз предоставлял требуемый пептид в виде не совсем белого твердого вещества. Для этого очищенный Ζ-Зе^-Т^р-ОΜе растворяли в ®иОН и добавляли воду и алкалазу 2,5Б ΌΧ (Ноуохутек, Вадкуаетб, Дания). Смесь перемеши

- 14 016806 вали до тех пор, пока (почти) весь исходный материал не был израсходован. Затем смесь концентрировали под вакуумом и осадок переносили в воду рН 7. Водную смесь экстрагировали этилацетатом для удаления какого-либо оставшегося материала и потом водную фазу подкисляли. Искомый продукт, т.е. Ζ8ег-Тгр-ОН, отделяли экстракцией с этилацетатом; экстракт высушивали над сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом.

На третьей стадии был получен дипептид 8ег-Тгр-ОН. Для этого концентрированный Ζ-Зег-Тгр-ОН растворяли в МеОН и воде (1:1), добавляли Рб/С и смесь перемешивали в положительной атмосфере водорода (5 бар). После завершения реакции катализатор плюс большую часть продукта удаляли фильтрованием, а фильтрат отбрасывали. Фильтр тщательно промывали водой ιηίΐΐίρ и фильтрат концентрировали под вакуумом, получая дипептид 8ег-Тгр-ОН в виде от белого до грязно-белого твердого вещества. Дополнительной очистки достигали взбалтыванием продукта в смеси ацетон-вода и отделением пептида фильтрованием. Это давало продукт, пригодный для орального потребления.

Пример 6.

Эффекты различных источников триптофана на отношения Тгр/ΕΝΑΑ в плазме и настроение у здоровых доноров.

Целью настоящего исследования было изучение у здоровых добровольцев профилей Тгр/ΕΝΑΑ в плазме и настроения после потребления различных препаратов, содержащих триптофан. Были исследованы следующие препараты:

интактный альфа-лактальбумин (см. Материалы и методы);

гидролизованный казеинат (ОН >20%; см. Материалы и методы); гидролизат лизоцима, обогащенный Тгр, с высоким отношением Тгр/ΕΝΑΑ (см. пример 4); синтетический дипептид 8\ν (пример 5);

свободный Ь-триптофан (см. Материалы и методы).

В исследовании участвовали восемнадцать здоровых студентов (9 мужчин и 9 женщин: возраст между 18-30 годами). Критериями для исключения из участия были хроническая и текущая болезнь, история психиатрической или медицинской болезни, применение лечения или лекарственного средства, потребление алкоголя (>2 единиц/день), метаболические, гормональные или кишечные болезни или отклоняющиеся от нормы привычки в питании (оцененные по вопросникам здоровья и образа жизни). Субъекты, участвующие в эксперименте, находились в нормальных пределах по индексу массы тела (ΒΜΙ в кг/м² между 20-25), причем субъектам-женщинам подбирали противозачаточные средства. Женщины принимали участие во время второй половины фолликулярной фазы (дни 4-10), тогда как женщины, применяющие контрацептивы, участвовали, когда они фактически использовали противозачаточные таблетки. Участники были некурящими и не употребляли алкоголь до и во время исследования. Все субъекты, участвующие в эксперименте, подписали форму информированного согласия. Это исследование было проведено согласно принципам ЕС о Надлежащей клинической практике (ССР), принятым 52 Всемирной Медицинской Ассоциацией Генеральной ассамблеи, Эдинбург, Шотландия, октябрь 2000.

Субъектам было предписано не принимать пищу в течение ночи; была позволена только вода или чай без сахара. В течение пяти экспериментальных утренних сессий субъекты посещали лабораторию для контроля концентраций Тгр/ΕΝΑΑ в плазме и настроения после потребления напитка, содержащего разные концентрации Тгр или ΕΝΑΑ. Порядок преподнесения разных напитков был уравновешен и в течение однонедельного периода было выделено четыре экспериментальных дня. На каждое утро эксперимента предоставлялось 312 мл напитка, содержащего разные концентрации триптофана (Тгр) или ΕΝΑΑ (табл. 1). Все напитки содержали 0,10 г заменителя сахара (ацесульфама) и были разбавлены чистой водой до достижения объема 312 мл. Руководил приемом разных напитков ассистент, действующий вслепую относительно диетических условий.

Таблица 1 Белок/аминокислотная композиция использованных напитков

Источник белка	Гидролизат казеина	Интактный лактальбумин	Гидролизат лизоцима, обогащенный Тгр	8ег-Тгр	Свободный Е-Тгр
Используемый код	ВЕР	АЕАС	№ЕР8	8ΥΝ	ТКР
грамм	20	20	300 мл раствора	1.20	0.82
Тгр (г)	0.40	0.80	0.80	0.80	0.80
Тгр/ΕΝΑΑ (молярное)	0.04	0.10	1.1	00	00

Образцы крови отбирали в двух повторах перед приемом и через 15, 30, 60, 90, 120, 180 и 210 мин после потребления в вакуумированные пробирки на 5 мл, содержащие натрийгепарин, и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Полученные супернатанты смешивали с сульфосалициловой кислотой (4 мг/100 мкл) и непосредственно хранили при -80°С до исследования. Анализ ами

- 15 016806 нокислот в плазме проводили с помощью ВЭЖХ, пользуясь колонкой 2-3 мкм В1зсйоГ δρйе^^зо^Ь ΟΌδ II, как описано Бук е! а1. (I. СНгошаЮдг. 1993: 620: 143-148). Отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме вычисляли делением молярной концентрации триптофана в плазме на сумму молярных концентраций в плазме больших нейтральных аминокислот валина, изолейцина, лейцина, тирозина и фенилаланина. Статистический анализ проводили посредством многомерного дисперсионного анализа и одномерного дисперсионного анализа (ΜΑΝΟνΑ и ΑΝΟνΑ) с использованием Общей Линейной Модели (СБМ: 8Р88 12,0 для νίηбо\тз). Все статистические данные были оценены с уровнем значимости Р = 0,05.

Значения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме.

Первый многомерный дисперсионный анализ с переменными Условие и Время в качестве факторов внутри субъектов на отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме обнаружил основной значимый эффект Времени и Условия и значимое взаимодействие УсловиехВремя. Самые высокие значимые увеличения отношения Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме были обнаружены (см. фиг. 1) после предоставления δΥΝ (увеличение 263% после 60 мин) и νΕΡδ (увеличение 255% после 90 мин). Увеличение Ττρ/ΕΝΑΑ после этих двух продуктов было значительно быстрее и выше, чем после приема или ΤΚΡ (увеличение 191% после 120 мин) или ΑΕΑΟ' (увеличение 67% после 120 мин). После потребления ΡΕΕ наблюдалось значимое падение Ττρ/ΕΝΑΑ, начиная с 60 мин до 210 мин (-27%).

Повышение Ττρ/ΕΝΑΑ на 255%, которое найдено с νΕΡδ, значительно превышало 50-70% увеличение, которое было найдено ранее с интактным альфа-лактальбумином (Магкиз е! а1., 2000; Вооу е! а1., 2006), и все ранее сообщенные увеличения 20-45% с другими продуктами питания, подобными углеводам (Магкиз, 2003). Тогда как считается, что 40-50% изменение Ττρ/ΕΝΑΑ в плазме является достаточным, чтобы изменить уровни синтеза Ττρ и 5-НТ и высвобождения в мозге (Магкиз е! а1., 2000), ожидается, что этот подъем 255% вызовет гораздо большее увеличение доступного Ττρ и 5-НТ в мозге и, следовательно, также может привести к большему высвобождению функционально активного 5-НТ в мозге.

Профиль состояния настроения (ΡΟΜδ).

Изменения настроения разных участников измеряли с помощью бумажной версии сокращенного варианта (ЭШсЕ зйойепеб уегзюп) анкеты Профиль состояния настроения ^а1б и Ме11епЬегдй, №б ^бз^ Рзус1ю1. 1990: 45: 86-90) по шкале νΑδ в пределах от полностью не согласен до полностью согласен. ΡΟΜδ включает пять разных дополнительных шкал для настроения; в пределах от Раздражения, Депрессии, Утомления и Напряженности, которые относятся к негативному состоянию настроения, до Энергичности, касающейся позитивного настроения.

Многомерный дисперсионный анализ с переменными Условие и Время в качестве факторов внутри субъектов на общие подсчеты настроения обнаружил значимый эффект времени и значительное взаимодействие УсловиехВремя; показывая, что настроение изменяется со временем, значительно различаясь между условиями. Соизмеримые улучшения настроения были обнаружены через 60 мин после приема VΕΡδ и таР. но только с приемом VΕΡδ настроение дополнительно улучшалось до 210 мин после приема по сравнению с 'ГКР. Наоборот, не было обнаружено изменений настроения после приема ΚΕΕ и ΑΕΑΟ'. Отсутствие влияния на настроение после интактного альфа-лактальбумина сравнимо с предыдущими исследованиями, показавшими умеренные благоприятные эффекты на настроение после интактного альфа-лактальбумина и только у стресс-уязвимых субъектов при подвергании острому стрессу (Магкиз е! а1., 2000; Магкиз е! а1., 2000, Магкиз, 2003). Хотя настроение также по-видимому улучшается после приема δΥΝ, этот эффект был незначительным при данной постановке эксперимента.

Эти текущие результаты наводят на мысль, что большое 255% увеличение в плазме Ττρ/ΕΝΑΑ может быть достаточным для улучшения настроения у нормальных не-стресс-уязвимых субъектов. Исходя из предыдущих данных, ожидается, что эти благоприятные эффекты гидролизата лизоцима, обогащенного Ττρ, на настроение могут быть даже больше у стресс-уязвимых субъектов при условиях сильного эмоционального стресса (Магкиз, 2003). Несмотря на наши ожидания, не наблюдалось значительных улучшений настроения после приема синтетического дипептида. Этот неожиданный результат можно приписать текущей постановке эксперимента или различиям в биодоступности триптофана из этих разных источников.

- 16 016806

Таблица 2

Изменения концентраций аминокислот в плазме (мкмоль/л) в определенное время после приема внутрь гидролизата казеина (ΚΕΕ), интактного альфа-лактальбумина (ΑΣΑΟ') или гидролизата лизоцима, обогащенного Ττρ (νΕΡδ)

Время (мин)
Аминокислота	Условие	0	30	60	90	120	180	210
	КЕР	0.07	0.10	0.18	0.15	0.12	0.09	0.08
Изолейцин	АЬАС	0.08	0.12	0.20	0.22	0.18	0.12	0.11
	ЗУЕРЗ	0.07	0.09	0.09	0.14	0.09	0.08	0.09
	КЕР	0.12	0.19	0.31	0.26	0.22	0.17	0.16
Лейцин	АЬАС	0.13	0.22	0.37	0.38	0.28	0.21	0.20
	ΨΕΡ8	0.13	0.14	0.14	0.13	0.13	0.13	0.14
	ВЕР	0.06	0.08	0.10	0.08	0.08	0.06	0.06
Фенилаланин	АЬАС	0.07	0.09	0.11	0.10	0.09	0.07	0.07
	5УЕР8	0.07	0.07	0.07	0.06	0.10	0.06	0.07
	КЕР	0.06	0.07	0.12	0.11	0.09	0.07	0.07
Тирозин	АЬАС	0.06	0.08	0.12	0.12	0.10	0.08	0.08
	ЗУЕР8	0.06	0.07	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06
Валин	КЕР	0.24	0.28	0.45	0.42	0.38	0.32	0.30
АЬАС	0.26	0.30	0.38	0.42	0.35	0.29	0.28

	ΨΕΡ8	0.26	0.27	0.25	0.25	0.25	0.25	0.26
	ВЕР	0.06	0.07	0.08	0.08	0.07	0.06	0.05
Триптофан	АЬАС	0.07	0.09	0.18	0.23	0.19	0.13	0.12
	ЗУЕР8	0.07	0.13	0.21	0.23	0.20	0.14	0.13
	ВЕР	0.52	0.67	1.14	1.01	0.86	0.73	0.65
ΕΝΑΑ	АЬАС	0.60	0.82	1.14	1.22	1.10	0.86	0.82
	тара	0.62	0.60	0.65	0.60	0.68	0.55	0.64
	КЕР	0.11	0.09	0.08	0.08	0.08	0.08	0.08
Ττρ/ΕΝΑΑ	АЬАС	0.12	0.12	0.15	0.18	0.2	0.18	0.17
	ЗУЕР8	0.11	0.19	0.36	0.39	0.35	0.25	0.22

Таблица 3

Изменения концентраций аминокислот в плазме (мкмоль/л) в определенное время после приема внутрь свободного И-Ττρ (ΤΚΡ) или синтетического дипептида 8ν (8ΥΝ)

Время (мин)
Амино-кислота	Условие	0	30	60	90	120	180	210
Изолейцин	ТВР	0.07	0.07	0.07	0.06	0.07	0.07	0.07
	8ΥΝ	0.06	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06	0.07
Лейцин	ТЕР	0.13	0.13	0.12	0.12	0.12	0.12	0.13
	8ΥΝ	0.11	0.14	0.12	0.12	0.12	0.12	0.13
Фенил-аланин	ТВР	0.07	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06
	8ΥΝ	0.06	0.07	0.06	0.06	0.06	0.06	0.06
Тирозин	ТВР	0.06	0.06	0.06	0.05	0.06	0.05	0.05
	8ΥΝ	0.05	0.06	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
Валин	ТВР	0.25	0.25	0.23	0.22	0.23	0.22	0.23
	8ΥΝ	0.21	0.26	0.22	0.22	0.22	0.21	0.23
Триптофан	ТВР	0.07	0.07	0.17	0.18	0.18	0.13	0.11
	8ΥΝ	0.06	0.13	0.21	0.18	0.15	0.11	0.10
ЬКАА	ТВР	0.62	0.59	0.55	0.50	0.58	0.52	0.53
	8ΥΝ	0.50	0.58	0.48	0.47	0.45	0.48	0.54
Ίϊρ'ΈΝΑΛ	ТВР	0.11	0.12	0.29	0.31	0.32	0.24	0.20
	8ΥΝ	0,11	0.22	0.40	0.37	0.31	0.22	0.19

Пример 7.

Крупномасштабный гидролиз лизоцима.

В крупномасштабном методе гидролиза лизоцима придерживались, по существу, метода, как описано в примере 3, с некоторыми незначительными модификациями. Раствор, содержащий 7,3% (вес./вес.) чистого лизоцима нагревали до 65°С, после чего ρΗ доводили до значения ρΗ 8,2, используя ΝαΟΗ. Гидролиз начинали добавлением 25 мкл Протекса 6Ь/г сухой массы. При непрерывном помешивании и поддержании значения ρΗ 8,2 и температуры 53°С гидролиз проводили в течение 2 ч. Затем значение ρΗ увеличивали до 9,0 и инкубацию продолжали в течение следующих 3,5 ч с получением раствора с некоторым количеством осадка. Затем ρΗ раствора понижали до 4,5 и раствор охлаждали до ниже 4°С. Чтобы получить совершенно чистый продукт, жидкость фильтровали через фильтр Ζ 2000 (Ра11), и потом избыток воды и соли удаляли нанофильтрованием. Полученный концентрат затем был подвергнут высокотемпературной (ΣΗΤ) обработке 7 с при 120°С, выпарен и окончательно высушен распылением до получения гидролизата лизоцима в сухом виде. Полученный таким образом продукт имеет молярное отношение Ττρ/ΕΝΑΑ около 0,19.

Пример 8.

- 17 016806

Приготовление напитка, содержащего гидролизат лизоцима.

Следующий рецепт иллюстрирует приготовление обезжиренного клубничного напитка, содержащего гидролизат лизоцима. К 10 г порошка гидролизата лизоцима (приготовленного согласно примеру 7) добавили 40 г глюкозы, 2,4 г лимонной кислоты, 0,38 г яблочной кислоты, 0,15 г сукралозы и 0,5 г клубничного ароматизатора (Ви1егеккепсе, Ζааηбат, Нидерланды). Эта смесь порошков быстро растворяют в 1 л воды с получением готового к употреблению напитка с высоким Тгр/ΕΝΑΑ и высоким отношением Туг/ВСЛЛ. Порошковая смесь является пригодной, например, для фасовки саше. Упакованные жидкие продукты могут быть получены с помощью различных известных технологий.

Пример 9.

Эффекты гидролизата лизоцима на послестрессовые функциональные характеристики у чувствительных к стрессу и устойчивых к стрессу здоровых добровольцев.

Целью настоящего исследования было сравнение эффектов гидролизата лизоцима, полученного согласно способу, описанному в примере 7, с плацебо (гидролизат казеинового белка; см. пример 6) по показателям уровней Тгр/ΕΝΑΑ и его влиянию на выполнение задач после стресса. Использованные тесты на функциональные характеристики, как известно, относились к аспектам бдительность и глазомоторный контроль индивидуумов.

В настоящем исследовании участвовали сорок индивидуумов, двадцать мужчин и двадцать женщин. Исходя из анкеты, заполненной перед исследованием, одна половина этой группы была определена как устойчивая к стрессу, другая половина - как чувствительная к стрессу. Критериями включения и исключения для индивидуумов, а также общего проведения исследования, были критерии, как описано в примере 6. Блок-схема плана исследования представлена на фиг. 4, а схема обычного дня исследования дана на фиг. 5.

Утром эксперимента субъекты приходили в лабораторию натощак. После прибытия им давали или напиток, содержащий гидролизат лизоцима, или плацебо, т.е. напиток, содержащий гидролизат казеина. Композиция исследуемого напитка и плацебо-напитка указана в табл. 4.

Таблица 4

Композиция использованных напитков

Источник белка	Гидролизат казеина	Гидролизат лизоцима
сокращение	плацебо	Тгр-гидр
г порошка /300 мл	13.6	14.4
Вода	286 г	285 г
заменитель сахара	0.1 г	0.1 г
г Тгр/300 мл	0.4	0.8
Тгр/ΕΝΑΑ отношение (молярное)	0.04	0.19

Через девяносто минут после потребления 300 мл напитка брали образцы крови для оценки отношений Тгр/ΕΝΑΑ (см. пример 6). Потом или группа устойчивых к стрессу либо группа подверженных стрессу субъектов проходила тест на функциональные характеристики, а затем группу подвергали стрессу. Этот стресс состоял из арифметической задачи, которую нужно было выполнить при звуковой стимуляции (раздражении). Субъектов убедили, что наличие или отсутствие звука зависело от их выполнения теста. На самом деле, арифметические задания были подтасованы таким образом, что все субъекты терпели неудачу в каждом испытании. Известно, что такая постановка вызывает психологический стресс и воспринимается как крайне не поддающаяся контролю (Ре1егк, М.Ь., Собаей, С.Ь.К., ВаШеих, К.Е. е! а1. (1998). Сагб^акси1аг и са1ес1ю1атше гекропке ΐο ехрептеШа1 йгекк: еГГесй о£ теп!а1 еГГоП и соШго11аЫ1йу. Ркусйопеигоепбосгто1оду. 23, 1-17). После арифметической задачи первый тест на функциональные характеристики повторяли, чтобы выразить количественно действие стресса на функциональные характеристики при условии действия отношений Тгр/ΕΝΑΑ в крови.

Выполняемыми тестами на функциональные характеристики были тест Макуорта (Маскетойй, Ν. (1948) Т1е Ьгеакбо\\'п оГ ν^д^1аηсе бшгпд рго1опдеб ν^κиа1 кеагсй. Оиаг! I. Ехр. Ркус1. 1, 6-21) и задание на слежение (1ех Н.К. е! а1., (1966) Α спбсаГ' 1гаскшд 1акк Гог тап-тасЫпе гекеагсй ге1а(еб ΐο Ле орегаЮг'к еГГесЛ'е бе1ау Вте. ΝΑδΑ СоШгас! Кер ΝΑδΑ СК: 1-105).

Тест Макуорта широко используется для измерения бдительности, внимательности и концентрации в течение продолжительного периода времени. Субъекты сидят напротив экрана компьютера, показывающего 60 точек, расположенных по кругу, имитирующих секундные метки на часах. Точки кратко освещаются при вращении по часовой стрелке при скорости одна на 500 мс. Обычно вращение продолжается с одним (на одну точку) скачком. Субъектам сообщили, что редко, через непостоянные интервалы, движение продолжается с двойным (на две точки) скачком с пропуском одной из точек в нормальной последовательности. Это должно было побуждать субъектов надавливать кнопку как можно быстрее. Всего было представлено тридцать таких случаев в 45-минутном тесте. Десять событий происходило в течение каждого последующего 15-минутного периода с интервалами в пределах от 8 с до 7,2 мин.

Задание на слежение используется в качестве задачи на функциональные перцептивно-моторные характеристики, которая измеряет способность контролировать показанный ошибочный сигнал в задании на компенсаторную перцептивно-моторную координацию первого порядка. Во время этого задания

- 18 016806 субъекты должны контролировать нестабильный курсор на экране компьютера, используя чувствительный джойстик. Ошибки будут появляться как горизонтальные отклонения курсора от средней точки на горизонтальной линейной шкале. Субъекты должны удерживать нестабильный курсор в центре оси, чтобы уменьшить отклонения назад к нулю, делая непрерывные компенсаторные движения джойстиком. Частота отклонений курсора увеличивается как стохастическая линейная функция времени, и, следовательно, субъекту необходимо делать компенсаторные движения со все более высокой частотой. Также компенсаторные ответы субъекта увеличиваются по частоте с возрастанием фазы задержки (ответ добавляют к, а не вычитают из ошибки) и в результате контроль теряется. Частота, при которой субъекты теряют контроль, является критической частотой. Тест был выполнен пять раз; среднюю критическую частоту вычисляли без самого низкого и самого высоко значения, как зависимую переменную этого теста.

Отношение Тгр/ЬМАА в плазме определяли через 90 мин после потребления напитков, обнаружили значительное действие (Р<0,0001) на изменения отношения Тгр/ЬЫАА в плазме при примененных экспериментальных условиях. Прием внутрь гидролизата лизоцима (Тгр-йубг) увеличивал значение Тгр/ЬЫАА в плазме до 0,25 мкмоль/л. Прием внутрь гидролизата казеина (р1с) на отношение Тгр/ЬХАА 0,08 мкмоль/л (фиг. 6). Значения для каждой из релевантных аминокислот представлены в табл. 5.

Таблица 5

Концентрации аминокислот (мкмоль/л) после приема внутрь плацебо (плацебо) или гидролизата лизоцима (Тгр-гидр)

	Туг	Уа1	Не	РЬе	Ьей 1 Тгр	ΕΝΑ А	Тгр/БИАА
плацебо	90	315	107	63	168 60	744	0,082
Тгр-гидр	73	266	120	58	152 ί 167	670	0,250

После потребления гидролизата казеина функциональные характеристики обеих групп индивидуумов, подвергнутых тесту Макуорта, значительно ухудшались при воздействии стресса. Однако потребление гидролизата лизоцима, богатого Тгр, предотвращало такие ухудшенные функциональные характеристики у устойчивой к стрессу группы. Совершенно неожиданно гидролизат, богатый Тгр, не предотвращал такие ухудшенные характеристики в подверженной стрессу группе. Полученные данные графически представлены на фиг. 7.

В задании на слежение значение лямбда СТ показывает конечный уровень сложности, которого достигают субъекты. Чем более высокое значение имеет лямбда СТ, тем лучше контроль. Данные, полученные в настоящем эксперименте, показывают, что после подвергания стрессу значение лямбда СТ было значительно выше при потреблении гидролизата, обогащенного Тгр. Среди индивидуумов, устойчивых к стрессу, можно было насчитать увеличение 16% относительно обработки плацебо. Также совершенно неожиданно в этом тесте значения лямбда СТ в подверженной стрессу группе не показали значимых различий между гидролизатом, богатым Тгр, и плацебо.

Claims

1. Композиция для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, достижения анксиолитических эффектов, уменьшения депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения, в частности, применяемая в качестве ингредиента при приготовлении пищи для человека, корма для животных, пищевой добавки или нутрицевтической композиции, полученная путем гидролиза лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, причем степень гидролиза (ИН) составляет между 5 и 45, и содержащая по меньшей мере два разных водорастворимых триптофансодержащих пептида, в которой отношение триптофана к уровню суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина композиции составляет по меньшей мере 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8.

2. Композиция по п.1, которая содержит А^^ и/или ΟΝ\ν. предпочтительно А^^ и ΟΝ\ν. в качестве триптофансодержащих пептидов.

3. Композиция по п.1, содержащая по меньшей мере два разных триптофансодержащих пептида, выбранных из ди- или трипептидов, при этом два пептида, выбранных из ди- или трипептидов, каждый, присутствуют в количестве по меньшей мере 5 мол.% от общего количества ди- и трипептидов, и в которой больше чем 30 мол.% общего триптофана присутствует как пептидсвязанный триптофан и предпочтительно больше чем 40 мол.%, более предпочтительно больше чем 50 мол.%, даже более предпочтительно больше чем 60 мол.%, еще более предпочтительно больше чем 70 мол.%, наиболее предпочтительно больше чем 80 мол.% пептидсвязанного триптофана присутствует в форме ди- или трипептида, предпочтительно композиция имеет отношение триптофана к уровню суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина больше чем 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8.

4. Композиция по п.2, в которой молярное отношение А^^ к ΟΝ\ν составляет между 1:2 и 10:1, предпочтительно между 1:2 и 5:1.

5. Композиция по любому из пп.1-4, которая дополнительно включает свободный триптофан.

6. Композиция для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, достижения анксиолитических эффектов, уменьшения депрессии,

- 19 016806 контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения, в частности, применяемая в качестве ингредиента при приготовлении пищи для человека, корма для животных, пищевой добавки или нутрицевтической композиции, содержащая водорастворимую фракцию гидролизата лизоцима, имеющего степень гидролиза (ΌΗ) между 5 и 45, и имеющая в составе по меньшей мере два разных водорастворимых триптофансодержащих пептида, в которой отношение триптофана к уровню суммы тирозина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина композиции составляет по меньшей мере 0,15, предпочтительно между 0,15 и 1,8.

7. Способ получения композиции по пп.1-5, который включает гидролиз лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, для получения гидролизата, имеющего степень гидролиза (ΌΗ) между 5 и 45, и при необходимости удаление части пептидов, содержащих аргинин или лизин.

8. Способ получения композиции по п.6, который включает гидролиз лизоцима, предпочтительно лизоцима куриных яиц, для получения гидролизата, имеющего степень гидролиза (ΌΗ) между 5 и 45, и при необходимости удаление части пептидов, содержащих аргинин или лизин.

9. Применение композиции по пп.1-6 для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, достижения анксиолитических эффектов, уменьшения депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения.

10. Применение композиции по пп.1-6 в качестве ингредиента при приготовлении пищи для человека, корма для животных, пищевой добавки или нутрицевтической композиции для улучшения настроения, когнитивной способности, аппетита, внимания, бдительности, наступления и качества сна, достижения анксиолитических эффектов, уменьшения депрессии, контроля эмоциональных реакций или сексуального поведения.

11. Пища для человека, корм для животных, пищевая добавка или нутрицевтическая композиция, содержащая композицию по пп.1-6.

12. Пища для человека по п.11, которая является детской смесью.