DK175750B1 - Monoklonale antistoffer, der genkender gamma-atrialt natriuretisk polypeptid, hybridomceller, der producerer sådanne antistoffer, og fremstilling og anvendelse deraf - Google Patents

Description

DK 175750 B1 i i

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer, som genkender den N-terminale ende af y-atrialt natriuretisk polypeptid (i det følgende betegnet γ-ΑΝΡ), hybridomceller, der producerer de monoklonale antistoffer, og en fremgangsmåde til immunassay af y-ANP under anvendelse af det monoklonale antistof.

5 ANP er et polypeptid, der er indeholdt i granuler, der fremstilles af atrial myocyt, og som udviser en natriuretisk indvirkning såvel som en stærk diuretisk indvirkning. Efter AJ. de Bold et al. opdagede stærk natriuretisk aktivitet, diuretisk aktivitet og hypotensiv aktivitet i atriale ekstrakter (Life Sci. 28, s. 89-94, 1981), 10 er en række polypeptider betegnet atriale natriuretiske polypeptider (ANP) blevet isoleret samlet fra menneske- og rotteatriale væv, og det er blevet foreslået, at polypep-tiderne er forbundet med homeostase af legemsvæske og blodtryksregulering (K. Kanagawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, s. 131-139, 1984).

15 Sådanne polypeptider findes ikke alene i mennesker, men også i rotter, og betegnes henholdsvis hANP og rANP. hANP og rANP'erne underklassificeres hver i tre typer, nemlig α, β og y. I nærværende sammenhæng forkortes humant ANP af I y-typen og rotte-ANP af γ-typen henholdsvis y-hANP og γ-rANP. Når det ikke er 20 nødvendigt at specificere ANP-kilden eller -underklassen, betegnes det simpelt hen "ANP".

α-hANP består af 28 aminosyrerester. Cys[7], dvs. cystein ved den 7. position fra den N-terminale ende, danner en disulfidbinding med Cys[23], dvs. cystein ved 25 den 23. position, og peptidsekvensen mellem Cys[7) og Cys[23] danner derfor en ringstruktur (Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, s. 131-139, 1984). α-hANP er forskelligt fra α-rANP, idet aminosyreresten ved den 12. stilling fra den N-terminale ende er Met i den førstnævnte, medens den er Ile i den sidstnævnte (Biochem.

Biophys. Res. Commun., 117, s. 839-865, 1983). β-hANP er en antiparallel α-30 hANP-dimer (ikke-eksamineret japansk patentpublikation nr. 184098/1985).

γ-hANP består af 126 aminosyrerester (se fig. 1 i den medfølgende tegning), og dens sekvens indeholdende aminosyre 99-126 i den C-terminale ende svarer nøjagtig til α-hANP (Nature, 313, s. 397, 1985).

35

I DK 175750 B1 I

I 2 I

I ! Under anvendelse af polyklonalt kaninantiserum mod a-ANP[17-28] er et I

I radioimmunassay (RIA) til måling af ANP blevet udviklet, hvilket assay både

påviser α-hANP og a-rANP (K. Nakao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 124, I

I s. 815-821, 1984), og det er blevet vist, at a-ANP cirkulerer gennem legemet som I

5 et hormon efter udskillelse fra hjertet (A. Sugawara et al., Hypertension 8 (Suppl. I

I I), 1-151-155, 1986). I

I På den anden side viser undersøgelser med RIA og kromatografiske analyser, at I

I ANP også forekommer i centralnervesystemet (N. Morii et al., Biochem. Biophys. I

I 10 Res. Commun., 127, s. 413-419, 1985), og at de vigtigste ANP-molekyler i rotte- I

I 1 hjernen og -rygmarven er a-rANP[4-28] og a-rANP[5-28] (S. Shiono et a!., I

I Biochem. Biophys. Res. Commun., 135, s. 728-734, 1986; N. Morii et al., ibid. 145, I

I 196-203, 1987). Det er også blevet vist, at ANP i hjernen og rygmarven fungerer I

I som et neuropeptid, medens ANP i det cirkulerende blod fungerer som et hormon I

I 15 (N. Nakao et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 65, s. 1756-1761, 1987). I

Det ovenfor nævnte polyklonale kaninantiserum mod a-ANP kan ikke skelne ANP i I

I det cirkulerende blod fra ANP i hjernen og rygmarven, men det et blevet anvendt I

I på forskellig måde. Fx blev antiserumet anvendt i immunhistokemiske undersøgel- I

20 ser (M. Kawata et al., Neuroscience 16, s. 521-546, 1985). Derudover blev anti- I

serumet injiceret i den cerebrale ventrikel hos en rotte for at neutralisere indvirk- I

ningen af endogent ANP i hjernen, hvorved vandindtag blev forøget (G. Katsuura et I

I al., European J. Pharmacol. 121, S. 285-287, 1986). I

25 Polyklonale antistoffer mod ANP indeholdt i antiserumet er således anvendelige i I

forskellige henseender. Antiserumet har imidlertid uundgåelige ulemper, idet I

forsyningen af det er lille, det indeholder forskellige antistoffer, der genkender flere I

forskellige epitoper, og det indeholder unødvendige antistoffer mod andre antige- I

ner end ANP. I

I 30 I

Af de ovennævnte grunde har der været en ivrig efterspørgsel efter monoklonalt I

antistof mod ANP, og adskillige monoklonale antistoffer med forskellige specific!- I

tetstyper er blevet beskrevet for nylig (A. Joh et al., Life Sci. 38, s. 1991-1997, I

I 1986; R. Milne et al., Mol. Immunol. 24, s. 127-132, 1987; C.C. Glembotski et al., I

I 35 Endocrinology, 121, s. 843-852, 1987; S. Naomi et al., Hybridoma 6, s. 433-440, I

3 DK 175750 B1 1987; J.P. Stasch et al., European J. Pharmacol. 129, s. 165-168, 1986). Nærværende opfindere har også udviklet monoklonale antistoffer KY-ANP-I og KY-ANP-II, der begge genkender a-ANP (japanske patentansøgninger nr. 218662/1987 og 47280/1983).

5

Pi den anden side er der allerede blevet etableret forskellige radioimmunassays for ANP, hvilke udnytter antiserum (Science 228, s. 323-325, 1985; Nature 314, s.

264-266, 1985; Biochem. Biophys. Res. Common., 124, s. 815-821, 1984; ibid 124, s. 663-668, 1984; ibid. 125, s. 315-323, 1984). I én af disse referencer er det 10 beskrevet, at antiserum CR-3 viste sig at genkende ANP’s C-terminale fragment [17-28] ifølge et sådant immunassay. Derudover er radioimmunassay for γ-ΑΝΡ, der udnytter antiserum, blevet beskrevet (Hypertension, bind 11, nr. 2, 1-52-56, 1988). Immunhistokemiske analyser og neutraliseringsanalyser, der anvender monoklonale antistoffer mod ANP, kendes også.

15

Som anført ovenfor er der for nylig sket bemærkelsesværdige fremskridt inden for den ANP-relaterede forskning. Monoklonale antistoffer, der er i stand til specifikt at genkende γ-ΑΝΡ, og mere effektive immunassays for γ-ΑΝΡ, der udnytter sådanne monoklonale antistoffer, er imidlertid endnu ikke blevet tilvejebragt.

20

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte monoklonale antistoffer, som besidder karakteristika for en hybridomcelle, som kan opnås ud fra FERM BP-1998, hvilke antistoffer specifikt genkender den N-terminale γ-ANP-sekvens, og som udviser høj affinitet over for γ-ΑΝΡ sammen med hybridomceller, som kan 25 producere sådanne antistoffer. Herudover angår den en meget sensitiv fremgangsmåde til måling af γ-ΑΝΡ under anvendelse af sådanne antistoffer.

De monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse genkender u hovedsage-lig 25 aminosyrerester fra den første aminosyrerest til den 25.

30 aminosyrerest på den N-terminale ende af γ-ΑΝΡ. For simpelhedens skyld er det segment, der består af sådanne aminosyrerester, beskrevet som γ-ΑΝΡ[1-25] i , nærværende sammen-hæng. Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen genkender både γ-hANP og γ-rANP. Antistofferne tillader meget sensitiv måling af γ-ΑΝΡ i RIA. Nar antistoffet anvendes i kombination med et hvilket som helst kendt 35 antistof, der genkender a-ANP, såsom CR-3, 11A-A11, KY-ANP-I eller KY-ANP-II, er

I DK 175750 B1 I

I 4 I

det yder-mere muligt at udføre sandwich-enzymimmunassay (EIA) med meget høj I

sensitivitet, fordi γ-ΑΝΡ[99-126] er identisk med a-ANP[l-28), i det mindste hvad I

I angår humant ANP. I

I 5 Andre aspekter af den foreliggende opfindelse omfatter; H

(a) Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen i et immunassay for H

I γ-ΑΝΡ; I

10 (b) Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen i en in vitro- I

diagnostisk fremgangsmåde og I

I . (c) En fremgangsmåde til fremstilling af hybridomceller eller monoklonale I

: antistoffer ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde omfatter inokulering af et I

15 dyr med γ-ΑΝΡ samt opnåelse af antistof-producerende celler derfra, idet I

fusionering af de antistof-producerende celler med myelomceller, og udvælgelse I

blandt fusionsprodukterne af én, der er i stand til at producere et monoklonalt I

antistof, som genkender den N-terminale ende, og eventuelt dyrkning af det valgte I

I fusionsprodukt for at producere det ønskede monoklonale antistof. I

20 I

I Det er nu lykkedes for nærværende ansøger at opnå monoklonale antistoffer, som I

I genkender γ-hANP’s N-terminale ende, og at tilvejebringe en særdeles sensitiv I

metode til måling af γ-hANP under anvendelse af I

antistofferne. Fremgangsmåden til fremstilling af de monoklonale antistoffer og I

25 fremgangsmåden til γ-hANP-måling er forklaret nedenfor i detaljer. I

I 1) Fremstilling af en hybridomcelle, der producerer et monoklonalt I

antistof I

30 Som tidligere nævnt svarer γ-ΙγΑΝΡ[99-126] nøjagtigt til a-hANP[l-28]. Derfor I

anvendes et fragment, der består af hele γ-ΙιΑΝΡ[1-98] eller en del deraf, som et I

antigen til fremstilling af et antistof, der er specifikt over for γ-hANP. Fragmentet I

konjugeres med et hvilket som helst andet protein med højere molekylvægt såsom I

bovint serumalbumin eller bovint thyroglobulin, når det anvendes som et immuno- I

35 gen. Det således opnåede konjugat emulgeres i et passende adjuvans såsom I

5 DK 175750 B1

Freund's komplette adjuvans og anvendes derefter til immunisering af mus.

Immunisering udføres ved gentagne gange at inokulere intraperitonealt, subkutant eller intravenøst den ovennævnte emulsion i mus med intervaller på adskillige 5 uger. Tre til syv dage efter den sidste immunisering tages milten ud, og den anvendes som en kilde til antistofproducerende celler. Samtidig fremstilles myelomceller, der har en hensigtsmæssig markør såsom hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferasedeficiens (HGPRT) eller thymidinkinasedeficiens (TK').

De antistofproducerende celler og myelomcellerne fusioneres derefter til 10 fremstilling af en hybridomcelle.

Som dyrkningsmedium for hybridomcellevæksten kan der anvendes sådanne medier som Eagle’s MEM, Dulbecco's modificerede medium eller RPMI-1640 med tilsætning af ca. 15% føtalt kalveserum (FCS), selv om mediet ikke er begrænset 15 dertil.

Myelomcellerne og miltcelleme blandes først i et forhold på ca. 1:10 i nærværelse af et fusioneringsmiddel. 50%'s polyethylenglycol (PEG) anvendes sædvanligvis som fusioneringsmiddel på grund af dets høje fusionseffektivitet. Fusionerede celler 20 selekteres ved HAT-selektionsmetoden. Hybridomcellerne, der er indeholdt i kultur-supernatanten, screenes ifølge konventionelle metoder såsom membran-fluorescens-antistofteknik, enzymbundet immunsorbentassay (ELISA-metode), immunologisk vævsfarvningsmetode og RIA for at selektere hybridom-celler, der er i stand til at udskille ønsket immunglobulin. Med det formål at sikre homogeniteten 25 af de selekterede hybridomceller udføres genkloning som følger: normale miltceller placeres som et fødelag i en 96-brønds mikroplade, og de selekterede hybridomceller placeres derpå i en mængde, der ikke overskrider én celle pr. brønd, og screening udføres igen på dyrkede kloner. Homogene hybridomceller opnås ved at gentage en sådan subkloningsproces.

30 2) Produktion af monoklonalt antistof

De ovenfor opnåede hybridomceller dyrkes in vitro eller in vivo til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse. Når dyrkningen udføres in 35 vitro, kan konventionelle medier såsom de medier, der er nævnt ovenfor, anven-

I DK 175750 B1 I

I I

des med tilsætning af FCS. Efter dyrkning i mediet i 3-5 dage opnås det monoklo- I

H nåle antistof fra kultursupernatanten. Nar dyrkningen udføres in vivo, inokuleres I

I hybridomcellen i et pattedyrs bughule. En eller to uger herefter opsamles ascites- I

væske, fra hvilken monoklonalt antistof opnås. I sammenligning med in vitro- I

I 5 dyrkning fremstiller in v/Vo-dyrkning en langt større mængde antistof og fore- I

trækkes derfor. I

I Det monoklonale antistof, der er opnået fra kultursupernatant eller ascitesvæske, I

oprenses ved kendte metoder såsom ammoniumsulfatfraktionering, adsorption til I

I 10 protein A-søjle og DEAE-Sepharose®-søjlekromatografi eller en kombination af I

disse.

I Nærværende opfindere har opnået et monoklonalt antistof mod y-ANP i overens- I

I stemmelse med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, hvilket antistof blev I

15 betegnet KY-ANP-III, og har undersøgt dets karakteristiske egenskaber. Det I

I monoklonale antistof udviste høj affinitet over for y-hANP {Ks = 5,3 x 109Μ_1). I

Antistoffet udviste stærk krydsreaktivitet med y-hANP[l-25] og y-hANP[l-72]. Kun I

I en svag krydsreaktivitet blev imidlertid observeret med y-hANP[l-10] og y- I

20 hANP[17-25]. Dette antyder, at de første 25 aminosyrerester i y-hANP's N- I

I terminale ende er de vigtigste for antistoffets genkendelse. Antistoffet udviste også

krydsreaktivitet med y-rANP. I

I Hybridomcellen KY-ANP-III, som fremstiller det monoklonale antistof, KY-ANP-III, I

I 25 ifølge den foreliggende opfindelse er blevet deponeret hos the Fermentation I

Research Institute, Agency of the Industrial Science & Technology, Higashi 1-1-3, I

I Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, den 18. maj 1988 under navnet muse- I

I hybridomcelle KY-ANP-III, Bikoken Joki nr. 1887 (FERM BP-1887) i overensstem- I

I melse med Budapest-traktaten. I

I 30 I

I Som et immunassay for y-ANP under anvendelse af det monoklonale antistof KY- I

ANP-III ifølge den foreliggende opfindelse kan RIA, som anvender et enkelt I

I antistof, eller sandwich-EIA nævnes. Hvad angår RIA kan en kompetitiv metode I

I nævnes, i hvilken, således som det er vist i det nedenfor angivne eksempel, en I

I 35 prøve, der skal analyseres, eller et standard-y-ANP og en forudbestemt mængde I

7 DK 175750 B1 isotopmærket y-ANP lades binde kompetitivt til antistoffet, og den radioaktivitet, der er bundet til antistoffet, måles.

Sandwich-EIA udføres under anvendelse af antistoffet KY-ANP-III i kombination 5 med et andet antistof, fx det ovennævnte antiserum CR-3, ΚΥΆΝΡ-Ι og KY-ANP-II, som alle reagerer med y-ANP[99-126] på en måde som den, der er beskrevet nedenfor.

Som en fast fase til immobilisering af antistoffet kan der anvendes sådanne bærere 10 som glas- eller plastperler eller -kugler, rør og plader, som er kommercielt tilgængelige, og som generelt anvendes i immunassay som bærer for en antigen-antistofreaktion. Et antistof, der genkender a-ANP eller y-ANP, adsorberes til en hvilken som helst af disse bærere. Adsorptionen udføres sædvanligvis ved at lade antistoffet komme i kontakt med bæreren natten over i en phosphatbuffer 15 ved pH 6-10, fortrinsvis ved omkring neutral pH, ved stuetemperatur. Bæreren, på hvilken antistoffet er blevet adsorberet, opbevares på et koldt sted i nærværelse af et antiseptisk middel såsom natriumazid.

Både monoklonal antistoffer og polyklonale antistoffer kan anvendes i den 20 ovennævnte fremgangsmåde. Separation og oprensning af det antistof, der skal anvendes i ovennævnte fremgangsmåde, kan udføres på følgende måde.

Ascites eller antiserum indeholdende antistoffet fraktioneres med natriumsulfat og passeres derefter gennem en DEAE-cellulosesøjle, hvorved IgG opnås. Det således 25 opnåede IgG spaltes med pepsin til frembringelse af et F(ab')2-fragment, som derefter reduceres med 2-mercaptoethylamin til opnåelse af anti-α-ΑΝΡ Fab' eller anti-γ-ΑΝΡ Fab‘. Fremstilling af Fab' ud fra IgG er detaljeret beskrevet i J.

Immunoassay, 4, s. 209-327, 1983, og den samme procedure kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

30

Til mærkning af antistoffet kan der som enzym anvendes basisk phosphatase, β-D-galactosidase, peroxidase, glucoseoxidase, etc. I forbindelse med den foreligge-nde opfindelse er det imidlertid særlig foretrukket at anvende peberrodsperoxidase.

Som et bindingsdannende middel, der anvendes for at konjugere enzymet med 35 antistoffet, kan der anvendes N,N‘-o-phenylendimaleimid, N-succinimid-4-(N-

I DK 175750 B1 I

I I

maleimidomethyljcyclohexanoat, N-succinimid-6-maleimidohexanoat, N-succini- I

mid I

I -3-(2-pyridyldithio)propionat, 4,4'-dithiopyridin og andre kendte midler. I

Reaktionen mellem det bindingsdannende middel og enzymet og antistoffet udføres I

5 i overensstemmelse med konventionelle metoder med nødvendige modifikationer I

afhængig af typen af det enkelte bindingsdannende middel. I

Som det vil forstås på basis af ovenstående, kan antistoffragmentet såsom Fab’, I

I Fab og F(ab’)2 anvendes i stedet for antistoffet i sig selv. Det enzymmærkede I

10 antistof kan endvidere være polyklonalt eller monoklonalt antistof. Oprensningen af I

det enzymmærkede antistof opnået under anvendelse af det ovennævnte bindings- I

dannende middel ved affinitetskromatografi tilvejebringer et meget mere sensitivt I

I immunassaysystem. I

IS Det oprensede enzymmærkede antistof opbevares på et koldt og mørkt sted med

tilsætning af en stabilisator såsom thimerosal eller glycerin eller kan lyofiliseres. I

I Ved fremstillingen af de ovennævnte reagenser til immunassay immobiliseres der I

I enten et antistof, der genkender γ-ANP's N-terminale ende, hvor et antistof, der I

I 20 genkender α-AIMP, er enzymmærket, eller, hvor et antistof, der genkender γ-ΑΝΡ, I

I er enzymmærket, immobiliseres der et antistof, der genkender a-ANP. Da immo- I

I biliseringen af et antistof sædvanligvis kræver store mængder antistof, foretrækkes I

immobiliseringen af et monoklonalt antistof, som stabilt kan opnås i en stor I

I mængde. Et polyklonalt antistof, der er fremstillet ud fra antiserum, kan imidlertid I

25 også anvendes uden besvær. H

I Et antistof, der skal enzymmærkes, kan også enten være et monoklonalt antistof I

I eller et polyklonalt antistof, under den forudsætning at antistoffet genkender et I

I sted, der er forskelligt fra det, der genkendes af det immobiliserede antistof. Fx I

I 30 kan KY-ANP-III ifølge den foreliggende opfindelse anvendes som immobiliseret I

I antistof, medens det ovennævnte antiserum CR-3, KY-ANP-I eller KY-ANP-II kan

I anvendes som enzymmærket antistof og omvendt. I

I tegningerne viser I

I 35 fig. 1 en aminosyresekvens af y-hANP, I

i DK 175750 B1 9 fig. 2 et Scatchard-plot af bindingen mellem [125I]-y-hANP[l-25] og det monoklonale antistof KY-ANP-III. Ascites indeholdende KY-ANP-III i blev inkuberet med [12SI]-rhANP[l-25] (12-800pM, 500 μΙ/rør) i 48 timer ved 4°C, og den specifikke binding blev målt efter adskillelse 5 med dextranbelagt trækul, fig. 3 viser en typisk standardkurve fory-hANP i RIA, hvor KY-ANP-III anvendes, og krydsreaktionskurver for beslægtede peptider. [125I]- y-hANP[l-25] og standard-y-hANP eller beslægtede peptider i forskellige koncentrationer blev inkuberet med KY-ANP-III i 24 timer ved 4eC. De symboler, der anvendes i fig. .3, • 10 har følgende betydninger: *.....7-hANP[i-25], o.....7-hANP[1-72), A.....7-hANP{l-67], Δ.....y-hANP[l-16], φ.....y-hANPfl-10) , Q.....7-hANP[ 17-25) , 1 .....7-hANP og □.....7-ANP.

15 Den foreliggende opfindelse er yderligere illustreret og beskrevet i det efterfølgende eksempel. Opfindelsen er ikke begrænset i omfang til det følgende eksempel.

EKSEMPEL

20

Fremstilling af hvbridomcelle

Syntetisk y-hANP[l-25] (5,0 mg) og bovint thyroglobulin (10 mg) blev opløst i 1,6 ml destilleret vand. Til denne opløsning blev dråbevis sat en opløsning af 20 25 mg l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid i 0,2 ml destilleret vand i løbet af en periode på 10 minutter ved en temperatur på 4°C, hvorefter blandingen blev omrørt ved 0°C i 4 timer i nitrogenatmosfære. Blandingen blev derefter dialyseret 4 gange mod 1,0 I destilleret vand i løbet af en periode på 3 dage. Dialysatet blev delt i 5 portioner,, som blev opbevaret ved -20°C (se Biochem. Biophys. Res.

30 Commun., 124, s. 815-821, 1984).

Til hver af de opbevarede opløsninger (hver indeholdende 300 ug y-hANP[l-25j) blev sat destilleret vand indtil 1,2 ml, og hver af opløsningerne blev derefter suspenderet i 1,2 ml Freund’s komplette adjuvans. En ca. 2 ml portion blev 35 injiceret intraperitonealt og subkutant i 10 BALB/c-hunmus (200 μΙ pr. dyr). Dyrene

I DK 175750 B1 I

I 10 I

blev derefter injiceret subkutant 7 gange med 7,5-30 pg y-hANP[l-25] suspenderet

i komplet adjuvans pr. dyr med ca. 4 ugers intervaller. Seks dage efter den sidste I

immunisering med intravenøs injektion af 30 ug y-hANP[l-25] blev musenes milte taget ud og anvendt til cellefusion.

I 5 I

De ovenfor opnåede miltceller og myelomceller X63-Ag8.553 blev blandet (1:10) i I

I Dulbecco's medium (DMEM), og blandingen blev centrifugeret ved 1500 I

I omdr./minut i 5 minutter ved 4°C. De opnåede pellets blev løsnet ved opvarmning I

I ved 37°C, og derefter blev 1 ml 50%’s PEG4000 (PEG 1 g/DMEM 1 ml) dråbevis I

I 10 tilsat ved 37°C i løbet af 1 minut. Blandingen fik lov at stå i 2 minutter ved 37°C, I

I hvorefter den blev fortyndet ved dråbevis tilsætning af 10 ml DMEM ved 37°C i I

1 2 3 4 5 løbet af 5 minutter. Blandingen blev derefter vasket ved centrifugering ved I

I 4°C med DMEM indeholdende 15% FCS. I

15 Efter den ovennævnte cellefusion blev de resulterende hybridomceller selekteret i I

I HAT-medium indeholdende 15% føtalt kalveserum. I løbet af hybridomcelledyrk- I

ningen blev antistofproduktionen i dyrkningsmediet periodisk undersøgt ved RIA I

I under anvendelse af [12SI]-y-hANP[l-25]. Hybridomcellevækst blev observeret i I

H næsten alle brønde, hvoraf 0,8% (3 brønde) fremstillede antistoffer. Celler, der I

I 20 producerede antistoffer, blev klonet to gange ved den begrænsende fortyndings- I

H metode med anvendelse af musethymusceller som fødeceller. En klon, som H

I producerer et antistof med den stærkeste reaktivitet, dvs. KY-ANP-III, blev I

I tilvejebragt. For at undersøge KY-ANP-III’s egenskaber blev klonen dyrket I

I yderligere. I

I 25 I

I Fremstilling af monoklonalt antistof I

BALB/c-mus blev forbehandlet ved at injicere 0,5 ml pristan pr. dyr intraperitonealt H

2

I to gange med intervaller på 1-2 uger. Hver mus blev injiceret intraperitonealt med I

3

I 30 5 x 106 celler af hybridomcellen KY-ANP-III suspenderet i 200 μΙ DMEM. Ascites, I

4

I der blev taget fra musene, blev oprenset ved hjælp af en protein A-Sepharose CL- I

5

I 4B-søjle til opnåelse af det monoklonale antistof KY-ANP-III. I

11 DK 175750 B1

Egenskaber af monoklonalt antistof

Det ovenfor opnåede monoklonale antistofs isotype blev bestemt ved Ouchterlony’s metode (musemonoklonal typebestemmelseskit, Miles). Affinitetskonstanten blev 5 bestemt ved Scatchard-metoden ved hjælp af RIA, der forklares i det følgende. Antistofspecificiteten blev analyseret ved at undersøge krydsreaktiviteten med forskellige ANP-beslægtede peptider ved RIA.

Det opnåede monoklonale antistof blev bestemt til at høre til IgGi-subklassen ved 10 Ouchterlony's metode. Affinitetskonstant, målt ved Scatchard-metoden, viste en høj affinitet, hvor Ks-værdien mod y-hANP[l-25] var 5,3 x 109M‘1 (se fig. 2).

RIA

15 RIA, der anvendte monoklonalt antistof, blev udført i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet i Hypertension, bind 11, nr. 2, 1-52-56, 1988, som omfatter anvendelse af polyklonalt antiserum.

De anvendte reagenser blev hver gang opløst i 0,05M phosphatbufferopløsning 20 (pH 7,4) indeholdende 0,1% gelatine (Merck), 1 mM Na2EDTA, 0,2 mM cystin, 0,1% Triton® X-100 og 0,01% merthiolat.

En blanding af 100 μΙ fortyndet (1:105) ascitesopløsning indeholdende KY-ANP-II1, 100 μΙ af en prøve eller fortyndet opløsning af standard-γ-ΑΝΡ, 200 μΙ af den oven-25 nævnte buffer og 100 μΙ [125I]-y-hANP[l-25] (ca. 10.000 cpm) fik lov til at reagere ved 4°C i 48 timer. Reaktionsblandingen blev derefter tilsat og blandet med 1 ml dextranbelagt trækul og fik lov til at reagere ved 4°C i 15 minutter. Reaktionsblandingen blev derefter centrifugeret ved 4°C i 30 minutter ved 3000 omdr./min., og supernatantens radioaktivitet blev målt med en y-tæller, hvorved antistoftiteren 30 af den fortyndede opløsning af prøven blev opnået. Den specifikke aktivitet af [l25I]-y-hANP[l-25] var 570 pCi/pg. Nar museascites blev anvendt efter at være blevet fortyndet til 1:5 x 105, var bindingsgraden med et sporstof ca. 25%.

Det ovennævnte 125I-y-hANP[l-25] blev fremstillet ved chloramin-T-metoden. Dvs.

35 y-hANP[l-25J (1 pg) blev blandet med Na125I (1 mCi), til hvilket 10 μΙ chloramin-T

I DK 175750 B1 I

i 12 I

(5,25 mg/ml) var sat. Ti sekunder herefter blev 20 μΙ natriumpyrosulfit H

I (4,5 mg/ml) tilsat. Til blandingen blev der yderligere sat 1 ml 2%'s gelatine, og H

I derefter blev den resulterende 125I-y-hANP oprenset med Sep-Pak® C18 (Waters H

I Co., Ltd.). I

I 5 I

I y-hANP-standardkurven bestemt i RIA under anvendelse af det monoklonale

I antistof ifølge den foreliggende opfindelse og krydsreaktiviteten med beslægtede H

peptider er vist i fig. 3. H

I io Da KY-ANP-III ifølge den foreliggende opfindelse genkender γ-rANP såvel som γ- I

I hANP, er antistoffet ikke alene egnet til måling af humant ANP, men også af ANP

I fra forskellige forsøgsdyr såsom rotter og mus. KY-ANP-III kan anvendes sammen I

I med andre kendte antistoffer mod ANP for at bestemme γ-hANP med høj sensi- I

I tivitet. Tilvejebringelsen af metoden til måling af γ-hANP under anvendelse af det H

I 15 monoklonale antistof ifølge den foreliggende opfindelse har gjort det muligt let og I

I præcist at diagnosticere forskellige sygdomme, som ledsages af abnormitet i I

I legemsvæskebalancen såsom hjertesygdomme, nyresygdomme, hypertension H

I (essentiel og sekundær), ødematøse lidelser (cirrose, nephrose, cataplektisk ødem, H

I etc.) og dehydratisering, og til at følge op på behandlingsresultaterne.

I 20 I

Claims (6)

1. Hybridomcelle, der har de karakteristiske egenskaber fra en hybridomcelle, der | kan opnås ud fra FERM BP-1887. j 5 :

2. Monoklonalt antistof, der hovedsagligt genkender de første 25 syrerester i den N-terminale ende af γ-ΑΝΡ, og som produceres af en hybridomcelle ifølge krav 1.

3. Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge krav 2, i et immunassay for γ-ΑΝΡ. 10

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor immunassayet er et radioimmunassay eller et enzymimmunassay.

5. Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge krav 2, i en in v/'tro-diagnostisk 15 fremgangsmåde.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af en hybridomcelle ifølge krav 1 eller et monoklonalt antistof ifølge krav 2, hvilken fremgangsmåde omfatter inokulering af et dyr med γ-ΑΝΡ samt opnåelse af antistof-producerende celler derfra, fusionering 20 af de antistof-producerende celler med myelomceller, og udvælgelse blandt fusionsprodukterne af én, der er i stand til at producere et monoklonalt antistof, som genkender den N-terminale ende af γ-ΑΝΡ, og eventuelt dyrkning af det valgte fusionsprodukt for at producere det ønskede monoklonale antistof. *