-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf ein Verfahren
zum Kontrollieren von Pflanzenzellwachstum, umfassend die Modulation des
Spiegels und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins
in einer Pflanzenzelle, wobei das Zellzykluskontrollprotein ausgewählt wird aus
der Gruppe bestehend aus p34cdc2 oder einem Homolog
oder Derivat davon, p13suc1, Cyclinen, cdc25
und Produkten der nim-1-, wee-1- und mik-1-Gene, allein oder in
Kombination, wobei sich das Derivat von p34cdc2 mindestens
in einer Substitution, Deletion und/oder Addition einer Aminosäure, eines
Kohlenhydrats oder einer Lipideinheit unterscheidet und in der Lage
ist, den Zellzyklus zu kontrollieren.
-
Spezieller
ist die vorliegende Erfindung darauf gerichtet, Pflanzenzellvermehrung
und -differenzierung durch Modulation der Spiegel des Zellzykluskontrollproteins
oder Modulation seiner Aktivität durch Ändern der
Spiegel von Enzymen, die darauf wirken, zu kontrollieren.
-
Die
Bildung einer Pflanze bezieht die Generierung von neuen Zellen durch
den Teilungszyklus und die Entwicklung von spezialisierter Struktur
und Metabolismus in diesen ein. Spezialisierung wird von einer sinkenden
Fähigkeit
zur Teilung begleitet, die mit besonderer Schnelle in Zellen von
monokotyledonen Pflanzen wie Getreide sinkt.
-
In
Hefe wird das Fortschreiten des Zellzyklus auf einigen Stufen kontrolliert.
Zum Beispiel aktiviert RAS einen Signalweg über MAP-Kinasen, was in der Aktivierung
von Transkriptionsfaktoren resultiert, die Zellwachstum lenken.
Obwohl RAS nicht als ein Zellzyklusgen angesehen wird, blockiert
die simultane Inaktivierung von RAS1, RAS2 und RAS-related in Hefezellen
diese in der späten
Mitose. Überexpression
von Hefe-RAS2 in Pflanzen war letal, aber die beschriebenen Effekte
waren offensichtlich nicht abhängig
von einem Genprodukt, da Transformierung mit RAS2 und einer inaktiven
Version davon im gleichen Effekt resultierte (Hilson et al., 1990:
Plant Mol. Biol. 14, 669–685).
-
Auf
der anderen Seite ist die cdc2-Genfunktion notwendig für das Forschreiten
durch die zwei Hauptkontrollpunkte, an denen der Hefe-Zellzyklus verzögert werden
kann, bis die Voraussetzungen von Zellgröße und Ernährung erfüllt sind (1; 2).
-
Der
mögliche
Beitrag der Änderung
des p34cdc2-Spiegels, um Zellteilung während der
Entwicklung zu kontrollieren, ist in irgendeinem Organismus wenig
untersucht worden. In Pflanzen wurde die Existenz eines p34cdc2-Homologs für verschiedene Arten gezeigt
(John et al., 1989; Plant Cell 1, 1185–1193; Ref. 6). Die Proteinspiegel
von p34cdc2 variieren während der verschiedenen Stadien
des Pflanzenzellzyklus und unterscheiden sich zwischen sich teilenden
Zellen und differenzierten Zellen (John et al., 1989; John et al.,
1990, J. Cell Sci. 97, 627–630).
Die Kontrolle der zwei Hauptkontrollpunkte des Zellzyklus wird durch
die Interaktion des cdc2-Genprodukts, p34cdc2,
mit stimulatorischen und inhibitorischen Elementen beeinflusst (3;
4). Pflanzen-p34cdc2 kann mit Hefe p13suc1, einem Protein, das die p34cdc2-Aktivität in Hefe
moduliert und das für
die Vervollständigung
der Mitose notwendig ist, interagieren. Die Anwesenheit von Pflanzenhomologen von
p13suc1 in verschiedenen Spezies legt nahe,
dass die Assoziierung zwischen p34cdc2 und
p13suc1 ähnliche
funktionelle Auswirkungen in Pflanzen hat wie in Hefe (John et al.,
1991; Protoplasma 161, 70–74).
-
Dementsprechend
zieht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Kontrollieren von
Pflanzenzellwachstum in Betracht, umfassend die Modulation des Spiegels
und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins
in der Pflanze für
einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Zellteilung
zu modifizieren oder kontrollieren, wobei das Zellzykluskontrollprotein
ausgewählt
wird aus der Gruppe bestehend aus p34cdc2 oder
einem Homolog oder Derivat davon, p13suc1,
Cyclinen, cdc25 und Produkten von nim-1-, wee-1- und mik-1-Genen, allein oder
in Kombination, wobei sich das Derivat von p34cdc2 durch
mindestens eine Substitution, Deletion und/oder Addition einer Aminosäure, eines Kohlenhydrats
oder einer Lipideinheit unterscheidet und in der Lage ist, den Zellzyklus
zu kontrollieren.
-
In
einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zum Aufrechterhalten, Verstärken oder zur Wiederaufnahme der
Pflanzenzellteilung, umfassend die Modulation des Spiegels und/oder
der katalytischen Aktivität
eines Zellzykluskontrollproteins wie oben definiert in einer Pflanzenzelle.
-
In
einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Modifizieren von Pflanzenwachstumsverhalten in der Anwesenheit von
einer oder mehreren Umweltbedingungen, umfassend die Modulation
des Spiegels und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins,
wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
In
einem weiteren Aspekt zieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Steigern der Korngröße in Betracht,
umfassend die Modulation des Spiegels und/oder der katalytischen
Aktivität
eines Zellzykluskontrollproteins, wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
In
noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zum Induzieren von Wurzelknöllchen in Pflanzen, umfassend
die Modulation des Spiegels und/oder der katalytischen Aktivität eines
Zellzykluskontrollproteins wie oben definiert in einer Pflanzenzelle.
-
Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Unterdrückung der
Pflanzenzellvermehrung, umfassend die Modulation des Spiegels und/oder
der katalytischen Aktivität
eines Zellzykluskontrollproteins, wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren, um die Zellzahl
oder Größe eines
Pflanzenorgans zu kontrollieren, umfassend die Modulation des Spiegels
und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins,
wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Stimulieren
von Kronen („canopy") wachstum einer
Pflanze, umfassend die Modulation des Spiegels und/oder der katalytischen
Aktivität
eines Zellzykluskontrollproteins, wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, um das Wachstum
von Pflanzenwurzel und Schote zu fördern, umfassend die Modulation
des Spiegels und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins,
wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beeinflussen des
Zellteilungsverhaltens in Stadien der Entwicklung, wenn die Zellzahl
den Endertrag einer Pflanze beeinflusst, wobei das Verfahren die
Modulation des Spiegels und/oder der katalytischen Aktivität eines Zellzykluskontrollproteins,
wie oben definiert, in einer Pflanzenzelle umfasst.
-
Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung auch transgene Pflanzen oder
Pflanzenzellen, die stabil transformiert sind mit einem Agens, das
in der Lage ist, die Expression eines Gens zu inhibieren, das ein
Zellzykluskontrollprotein codiert.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Zellzykluskontrollproteins,
wie oben definiert, eines Gens, das solch ein Protein codiert, eines
Inhibitors, Antagonisten oder Agonisten eines solchen Proteins oder von
p34cdc2 in Kombination mit Auxin zur Erhaltung, Verstärkung oder
Wiederaufnahme der Pflanzenzellteilung, zum Induzieren von Wurzelknöllchen in
Getreide oder um einer Pflanze in einem erhöhten Temperaturbereich Verbesserungen
des Wachstums, der Krankheitsresistenz, Wassernutzung, Korngröße, des
Wachstums unter Umweltbedingungen, hinsichtlich der Kontrolle des
Pflanzenzellwachstums, des Modifizierens von Pflanzenwachstumsverhalten,
des Unterdrückens
von Pflanzenproliferation, der Kontrolle der Zellzahl oder Größe eines
Pflanzenorgans, Stimulierung von Kronenwachstum, des Förderns des
Wachstums von Pflanzenwurzel oder Sproß oder des Beeinflussens des
Zellteilungsverhaltens, zu verleihen.
-
Im
Einklang mit dem Aspekt der vorliegenden Erfindung des Kontrollierens
von Pflanzenzellwachstum bedeutet „Pflanzenzelle" jegliche Zelle,
die in Kultur als eine einzelne Zelle oder eine Gruppe von Zellen
oder als ein Kallus existiert. Die Zellen können auch in einer sich entwickelnden
Pflanze in Kultur vorliegen oder können in einer Pflanze sein,
die in der Natur wächst.
Die Pflanzenzelle kann natürlich
vorkommend oder aus einer Pflanze isoliert sein oder kann eine rekombinante,
mutierte oder anderweitig derivatisierte Pflanzenzelle oder Gruppe
von Zellen sein. Die Pflanze kann entweder dicotyledon oder monokotyledon
sein, und in letzterem Fall können
die Zellzyklusgene zusätzlich
in einer anfänglichen
Phase verwendet werden, was die Regeneration aus Protoplastzellen
unterstützt.
Diese zusätzliche
Technik, um die Wiederaufnahme der Teilung zu unterstützen, wird
besonders wertvoll sein, wenn sie auf Weizen, Gerste, Hafer, Mais,
Reis oder andere ähnliche Feldfrüchte angewendet
wird.
-
Für die monokotyledonen
Pflanzen hat die vorliegenden Erfindung einen doppelten Vorteil:
(1) Erleichtern der Regeneration aus Protoplasten nach dem Einbringen
von irgendwelchen günstigen
Genen; und (2) die Zugabe von Zellzyklusgenen zu dem Genotyp der
Pflanze. Für
dikotyledone Pflanzen trifft der Vorteil (2) besonders zu, da sie
bereits leicht regenerierbar sind.
-
Vorzugsweise
ist das Zellzykluskontrollprotein p34cdc2,
einschließlich
seiner Derivate, wie oben definiert, und Homologe. Dieses Protein
kann homolog zu der Pflanzenzelle sein, die kontrolliert wird, d.h.
es ist natürlich
vorkommend in der Zelle, oder kann heterolog zu der Zelle sein,
d.h. das Protein oder seine genetischen Sequenzen können in
die Zelle aus einer Quelle eingebracht werden, die nicht aus der
selben Pflanze stammt. Zum Beispiel kann das Kontrollprotein von
einer anderen Pflanze sein oder kann von einer anderen eukaryontischen
Zelle wie einer Hefezelle sein. Das p34cdc2-Protein
oder Homolog oder Derivat davon kann auch ein Hybrid von Molekülen sein
und/oder durch eine genetische Hybridsequenz codiert werden.
-
Hierin
umspannt die Verwendung des Begriffs „p34cdc2 oder ähnliches
Molekül" alle solchen homologen
oder heterologen Derivate, wie oben definiert, und Homologe.
-
Die
vorliegende Erfindung erstreckt sich auf andere Zellzykluskontrollproteine,
so genannt, weil sie ähnlich
wie p34cdc2 wirken oder die p34cdc2-Aktivität kontrollieren.
Solche Proteine schließen
p13suc1, Cyclin, cdc25 und die Produkte
von nim-1, wee-1 und mik-1 oder Kombinationen davon, getrennt oder
zusammen mit p34cdc2 ein.
-
Mit „Derivate
von p34cdc2" ist jegliches Proteinmoleküle gemeint,
das eine Aminosäuresequenz aufweist,
die sich durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, -deletion
und/oder -addition im Vergleich zu der Sequenz im natürlich vorkommenden Molekül vor Derivatisierung
unterscheiden und in der Lage ist, den Zellzyklus zu kontrollieren.
Zusätzlich bezieht
sich der Begriff auf rekombinante oder synthetische Moleküle, die
einzelne oder multiple Aminosäuresubstitutionen,
-deletionen und/oder -additionen oder jegliche Substitutionen, Deletionen und/oder
Additionen eines assoziierten Moleküls wie eines Kohlenhydrats
oder einer Lipideinheit im Vergleich zu p34cdc2 tragen
und in der Lage sind, den Zellzyklus zu kontrollieren.
-
Praktischerweise
kann der Spiegel von p34cdc2 auf der genetischen
Ebene durch Manipulieren des cdc2-Genpromotors (oder seines Äquivalents)
kontrolliert werden. Zum Beispiel kann ein anderer Promotor inseriert
werden, der entwicklungsgemäß reguliert
oder durch einige andere Mittel reguliert werden kann. Verwendung
eines anderen Promotors kann eine Gelegenheit zur verstärkten Expression
und/oder größeren Kontrolle
der Expression liefern. Alternativ können multiple Kopien eines
homologen oder heterologen cdc2-Gens unter geeigneter Kontrolle
inseriert werden, um den Spiegel der Expression zu erhöhen. Es
würde auch
möglich
sein, Kontrollgene oder genetische Stellen zu manipulieren, die
die Expression des cdc2-Gens
unterstützen oder
regulieren. Ein Fachmann wird sofort die Vielfalt von Mitteln erkennen,
um die Expression eines homologen und/oder heterologen cdc2-Gens
in vivo zu kontrollieren, wie die Verwendung von Antisense- oder
Ribozym-Agenzien, um die Expression von inhibitorischen Genen zu
reduzieren, und alle solchen Mittel sind im Rahmen der vorliegenden
Erfindung umspannt. Zum Beispiel kann das Zellzyklusprotein wie
p34cdc2 auf der Ebene der Aktivität von Enzymen kontrolliert
werden, die auf das Zellzyklusprotein wirken.
-
Die
p34cdc2-Spiegel können auch auf der Protein-Ebene
kontrolliert werden. Solch eine Kontrolle ist mehr auf Wachstum
von Zellen in vitro anwendbar, aber die vorliegende Erfindung ist
nicht notwendigerweise so limitiert. Im Einklang mit diesem Aspekt
der vorliegenden Erfindung wird das Zellzykluskontrollprotein zum
Beispiel zu einer Kultur zugefügt
und in die Zellen durch verschiedene Verfahren wie Elektroporation
eingebracht. Aufreinigung des Proteins in eine geeignete Form ist
beschrieben worden (12). Eine Menge wird für einen Zeitraum und unter
Bedingungen verwendet, die ausreichend sind, um das Zellwachstum
zu modulieren.
-
In
Bezug auf das Verfahren zum Kontrollieren von Pflanzenwachstum kann
dies die stabile Integration von Zellzyklusgenen, die eines der
oben erwähnten
Zellzykluskontrollproteine codieren, in das Pflanzengenom unter
der Kontrolle von Promotoren involvieren, die in geeigneter Lage
und zu Zeiten exprimiert werden können, wie in früher Samenentwicklung
und in Meristemen. Dies kann in dikotyledonen Getreidepflanzen durch
konventionelle Verfahren der Transformierung wie mit Agrobacterium
gemacht werden. Es kann auch in monokotyledonen Pflanzen unter Verwendung
von publizierten Verfahren wie der biolistischen Microprojektil-Bombardierung gemacht werden,
um Gene in Zellen, die aus embryogenem Kallus stammen, einzubringen
gefolgt von Regenerierung.
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung ist, die Zellzyklusgene zu verwenden,
um die Anzahl von monokotyledonen Pflanzen, die transformiert werden können, und
die Leichtigkeit, mit der eine monokotyledone Pflanze transformiert
werden kann, zu erhöhen,
und zwar dadurch, dass es unnötig
gemacht wird, eine verlängerte
Suspensionskultur auszuführen.
-
Abhängig von
den einbezogenen Pflanzenzellen kann es nötig sein, die Zellmembran zu
behandeln und/oder das Protein selbst zu derivatisieren, um den
Eintritt in die Zielzelle zu ermöglichen.
Alternativ können
Inhibitoren, Antagonisten oder Agonisten der Aktivität des Zykluskontrollproteins
verwendet werden. Darüber
hinaus kann auch eine Kombination von solchen Verfahren angewendet
werden. In einer bestimmten Ausführungsform
wird p34cdc2 in Kombination mit einem Auxin
verwendet.
-
Im
Einklang mit der vorliegenden Erfindung ist daher entdeckt worden,
dass die Menge von p34cdc2 limitierend ist
für die
Zellteilung im Pflanzengewebe. Wenn eine Beendigung der Teilung
für eine Entwicklung
von spezialisierten Funktionen nötig
ist, wird dies durch das Absinken dieses Schlüssel-Zellzykluskontrollproteins
auf niedrige Spiegel bestimmt. In Geweben, die fähig sind, die Zellteilung fortzuführen, wird
dieses Protein vor der Teilung induziert (12). Darüber hinaus
haben die vorliegenden Erfinder entdeckt, dass Pflanzen-p34cdc2 mit einer regulatorischen Untereinheit
p13suc1 von Spalthefe interagiert, die einen
Anteil im Kontrollieren der Aktivität von Hefe-p34cdc2 spielt.
Ein Pflanzenhomolog von p13suc1 ist jetzt
gefunden worden. Die Funktion von p13suc1 ist nötig für die Vervollständigung
der Mitose in Spaltungshefe. Die Tatsache, dass das Pflanzen-p34cdc2-Protein mit einer regulatorischen Untereinheit
assoziiert, legt nahe, dass die anderen regulatorischen Interaktionen,
die genetisch in Hefen identifiziert worden sind, in Pflanzen wirken
können
und dass die regulatorischen Gene, die ursprünglich von Hefen genommen wurden,
verwendet werden könnten,
um Pflanzenzellteilung zu kontrollieren. Dementsprechend erstreckt
sich die vorliegende Erfindung nicht nur auf die direkte Kontrolle
von p34cdc2-Spiegeln, sondern auch auf die Kontrolle
von regulatorischen Elementen wie p13suc1,
wee-1, mik-1, nim-1 und cdc25, die indirekt in einer Modulation
der p34cdc2-Aktivität resultieren.
-
Die
vorliegende Erfindung wird besonders für die Regeneration von Pflanzen
nützlich
sein. Die reifen Zellen von Weizenblatt liefern zum Beispiel robuste
Protoplasten, die sehr geeignet sind für das Einbringen von DNA, aber
sie sind offenkundig schwer zu Pflanzen zu regenerieren. Es ist
nun entdeckt worden, dass diese Zellen niedrige Spiegel von p34cdc2 aufweisen und diese Spiegel nicht steigern können. Dies
scheint ein fundamentaler Unterschied zwischen der Organisation
von monokotyledonen Pflanzen und dikotyledonen Pflanzen zu sein.
In der letzteren Gruppe ist Wachstum apikal, und Verwundung resultiert
in der Herstellung von neuen Meristemzellen, die neues Gewebe wiederherstellen
können.
In den monokotyledonen Pflanzen gibt es hingegen keine terminalen
Meristeme, und das Wachstum erfolgt durch die fortgesetzte Teilung
von basalen Meristemen. Verwundung resultiert nicht in der Etablierung
von lokalisierten Meristemen. Dementsprechend kann durch Erhöhen der
Spiegel von p34cdc2 die Regenerierung zu
Pflanzen aus einzelnen oder Gruppen von Zellen ermöglicht werden.
-
Eine
bestimmte Anwendung ist der Einfluss der Teilungsaktivität in transformierten
monokotyledonen Protoplasten, um deren Teilung zu verstärken, wenn
die Zellen nicht kürzlich
einer verlängerten
Vermehrung in Suspensionskultur unterzogen wurden. Zu diesem Zweck
braucht der Einfluss auf die Teilung nur transient sein, und nicht-integrative
genetische Transformierung oder Einbringen des Proteins würde geeignet
sein. Diese Verwendung würde
es leichter machen, irgendein günstiges
Gen in monokotyledone Pflanzen einzubringen.
-
Die
Verwendung der Zellzykluskontrollproteine oder der genetischen Sequenzen,
die selbe codieren, um eine Wiederaufnahme der Teilung nach der Überführung von
Zellen in Protoplasten zu ermöglichen,
wird das Einbringen von Genen, die stabil in das Genom integriert
werden sollen, in monokotyledone Pflanzen erlauben. Die eingebrachten
Gene schließen
jene ein, die Verbesserungen in erhöhtem Temperaturbereich für Wachstum,
Krankheitsresistenz, Wassernutzung, Korngröße und Wachstum unter ungünstigen
Bedingungen verleihen.
-
Mit
Referenz auf das Letztere zieht die vorliegende Erfindung auch ein
Verfahren zum Modifizieren von Pflanzenwachstumsverhalten in der
Anwesenheit von einer oder mehreren Umweltbedingungen in Betracht,
wobei das Verfahren die Modulation des Spiegels von einem Zellzykluskontrollprotein, wie
oben definiert, in einer oder mehreren Pflanzenzellen umfasst, die
fähig sind
zur Teilung in der Pflanze über
einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Pflanze ausreichen, ihr
Wachstum zu modifizieren. Vorzugsweise ist die Pflanze eine monokotyledone
Pflanze wie Weizen, Gerste, Hafer, Mais, Reis oder eine ähnliche
Feldfrucht, und das Zellzyklusprotein ist p34cdc2 oder
ein ähnliches
Molekül.
Der Ausdruck „Umweltbedingung" wird in seiner breitesten Bedeutung
verwendet, um solche Bedingungen wie Wachstum bei erhöhten oder
erniedrigten Temperaturen, Ausgesetzsein gegenüber Krankheit und Überfluss
oder Mangel an Wasser oder einem anderen Nährstoff einzuschließen.
-
Im
Zusammenhang mit Korngröße und -Wachstum
können
die Zellzykluskontrollgene für eine
stabile Integration eingebracht werden. In diesem Fall würden die
Gene, die die Teilung fördern, auf
zwei Arten während
des gesamten Vorgangs verwendet werden:
- 1.
während
der Phase der Wiederaufnahme der Teilung nach der Protoplastenerzeugung
würde die
transiente Expression der Gene oder das Einbringen der Proteine,
die sie codieren, verwendet werden, um Teilung wieder zu initiieren;
- 2. zusätzlich
würden
die Zellzykluskontrollgene, die in DNA eingebracht wurden und auch
ein umstellbares Element wie Ac und einen selektierbaren Marker
wie neo enthalten, stabil integriert und verwendet werden, um Teilungsaktivität in der Pflanze
nach der Regeneration zu modifizieren. Die stabil integrierten Zellteilungsgene
würden verbesserte
Zellteilungseigenschaften in ausgewählten Geweben oder Umweltbedingungen
verleihen.
-
Darüber hinaus
gibt es die Möglichkeit,
dass ein Teil der Schwierigkeit, Wurzelknöllchen in Getreide zu induzieren,
die Unfähigkeit
ist, die nötige
lokalisierte Zellteilung zu induzieren. In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung können
zusätzliche Kopien
des p34cdc2-Gens zum Beispiel von Hefe und/oder
von Pflanzen in Getreidefrüchte
eingebracht werden. Das eingebrachte Gen kann unter der Kontrolle
eines konstitutiven Promotors stehen, da höhere Spiegel von p34cdc2 nicht inhibitorisch auf die Zellteilung
wirken, wo dies in Hefe getestet worden ist. Induzierbare Promotoren
können
auch angewendet und nur während
der Regeneration von transformierten Zellen induziert werden, wenn
es unerwartete Schwierigkeiten durch Erhöhen des Basisspiegels von p34cdc2 gibt. Es ist vorauszusehen, dass Pflanzen mit
erhöhten
Basisspiegeln von p34cdc2 oder mit Spiegeln,
die zum Zeitpunkt der Infektion mit Rhizobium erhöht sind,
besser in der Lage sein würden,
Knötchen
zum Fixieren von Stickstoff zu bilden.
-
Es
kann jedoch auch nötig
sein, die Pflanzenzellproliferation zu unterdrücken. Zum Beispiel ist es manchmal
der Fall, dass eine begrenzte Menge von Wasser nach einem Winterregen
verfügbar
ist und es vorteilhaft ist, das Pflanzenwachstum zu unterdrücken, so
dass die Wasserressourcen nicht erschöpft sind, bevor sich der wertvolle
Teil des Getreides entwickelt hat. Weizen, der nach dem Winterregen
gesät wird,
muss Korn ansetzen, bevor das Bodenwasser erschöpft ist. Vegetatives Pflanzenwachstum
und besonders Verdunsten von Wasser muss unterdrückt werden. Von chemischen
Agenzien, die Verdunsten reduzieren, ist gefunden worden, dass sie
persistierende ungünstige
Nebenwirkungen auf nachfolgendes Wachstum haben. Die vorliegende
Erfindung schlägt
vor, dass reduzierte Expression oder Aktivität von p34cdc2 reduziertes
Wachstum ohne toxische Nebenwirkungen erzielen könnte. Reduzierte Expression
oder Aktivität
von p34cdc2 kann auf eine Reihe von Wegen
erreicht werden, wie oben diskutiert wurde. In einem solchen Verfahren
kann ein dominant wirkendes dosisabhängiges Gen verwendet werden,
das die Aktivität
von p34cdc2 unterdrückt. Diese sind die wee-1-
und mik-1-Gene von Spalthefe. Es wird in Betracht gezogen, dass
deren kontrollierte Expression verwendet wird, um Feldfruchtwachstum
zu modulieren, um Wasserressourcen zu berücksichtigen. Dies würde das
Einbringen von wee-1 und/oder mik-1 erfordern, entweder konstitutiv,
um Zwergwuchs-Varietäten
zu bilden, oder induzierbar, so dass Zwergwuchs durch Anwendung
eines Induktors induziert werden könnte, wenn eine Gefahr besteht,
dass Wasser limitierend wird.
-
Die
vorliegende Erfindung ist auch nützlich
in anderen Bereichen der Kontrolle von Pflanzenwachstum. Zum Beispiel
ist es häufig
der Fall, dass die endgültige
Größe eines
Pflanzenorgans durch die Zellzahl in einer kritischen Phase der
Entwicklung bestimmt wird. Dies trifft bei vielen wichtigen Feldfrüchten wie
Getreide, Bohnen und Äpfeln
zu. Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um Zellteilung
in diesem Stadium zu stimulieren, um den Ertrag zu steigern.
-
Zusätzlich kann
Stimulierung von Kronenwachstum, um einen Schutz zu bilden, Wasserverlust durch
Verdunstung aus dem Boden reduzieren, während Pflanzen ruhend bleiben,
so dass mehr Wasser verfügbar
ist, wenn das Wachstum im Frühling wieder
aufgenommen wird. Dies trifft besonders für Weizen zu, der im Herbst
gesät wird.
-
Darüber hinaus
ist es wünschenswert,
die Wurzelpenetration im Boden zu fördern, so dass Pflanzen Wasser
ausnutzen können,
von dem der Bauer weiß,
dass es unter der Oberfläche
verfügbar ist.
Es ist auch wünschenswert,
dass Schotenwachstum nicht verlangsamt werden soll, wenn Wasser
limitierend ist, wenn der Bauer zukünftige Bewässerung vorschlägt. Die
Kontrollen in Pflanzen produzieren eine konservative Unterdrückung des
Wachstums bei der ersten Erkennung von Wasserstress, und in einer
landwirtschaftlichen Situation kann dies den Ertrag limitieren.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Kopien von dominant
wirkenden, dosisabhängigen
Genen einzubringen, die Teilungsaktivität stimulieren und durch Beeinflussen
von p34cdc2 wirken. Zwei Kandidatengene
sind nim-1 und cdc25. Die andere Strategie ist, Kopien von mutierten Formen
von cdc2 einzubringen, die nicht auf eine unterdrückende Modulation
der Aktivität
antworten. Die zwei mutanten Formen sind cdc2-1w und cdc2-3w. Für alle drei
Gene würde
eine Expression am effektivsten sein, wenn sie in einem geeigneten
Stadium der Entwicklung induziert wird. Eine Möglichkeit würde sein, den Nitratreduktase-Promotor zu verwenden und
seine Expression durch Anwendung von verdünntem Nitrat-enthaltenden Nährstoff
zu induzieren. Dieser Nährstoff
würde auch
das induzierte zusätzliche
Wachstum günstig
unterstützen.
Andere Induktoren könnten
ausgenutzt werden, und alle sind durch die vorliegende Erfindung
umspannt.
-
Zellzykluskontrollgene
können
angewendet werden, um Wachstum und Entwicklung in den wirtschaftlich
wertvollen Teilen von Feldfruchtpflanzen zu verbessern, einschließlich sowohl
dikotyledoner Pflanzen als auch monokotyledoner Pflanzen. In dieser
zweiten taxonomischen Gruppe würde
die zusätzliche
transiente Verwendung von Zellzykluskontrollgenen oder -proteinen,
um deren Regenerierbarkeit zu verbessern, vorteilhaft sein, aber
die biolistische Transformierung von embryogenem Kallus würde auch
ein möglicher
Weg sein für
das Einbringen der Gene.
-
Die
Zellzykluskontrollgene sind anwendbar, um Zellteilungsverhalten
in Stadien der Entwicklung zu beeinflussen, wenn die Zellzahl den
Endertrag von wirtschaftlich wertvollem Gewebe beeinflusst. Ein spezifisches
Beispiel ist die Anzahl von Zyklen der Kernteilung im Vielkern-Stadium
der Endospermentwicklung in Getreidekörnern.
-
Die
vorliegende Erfindung ist auch auf eine transgene Pflanze oder Pflanzenzelle
gerichtet, die ein künstlich
kontrolliertes Zellzyklusprotein, wie oben definiert, trägt, wie
p34cdc2 oder ein ähnliches Molekül in monokotyledonen
Pflanzen, wobei die Pflanzen Weizen, Gerste, Hafer, Mais, Reis oder
eine andere ähnliche
Feldfrucht einschließen.
Solch eine künstliche
Kontrolle schließt
das Einbringen von hoch konstitutiven oder induzierbaren Promotoren, multiple
Genwiederholungen und andere ähnliche Verfahren
und Techniken ein.
-
Im
Bezug auf die Regenerierung von monokotyledonen Pflanzen können monokotyledone
Protoplasten mit irgendeinem günstigen
Gen zur Expression in der regenerierten Pflanze (z.B. Gene für Resistenz
gegen Pilze oder Insektenschädlinge
oder Resistenz gegen Frieren und Gene, die Teilungsverhalten modifizieren)
durch zum Beispiel Elektroporation mit zwei Präparationen von DNA stabil transformiert
werden. Ein DNA würde
mindestens ein Gen tragen, das ein p34cdc2-ähnliches
Molekül
codiert, und ggf. vielleicht zusätzlich
ein Cyclin-codierendes Gen, beide unter der Kontrolle von konstitutiv
exprimierten Promotoren wie 35S oder seinem Verbund pEMU und beide
ohne einem Transposon-Element, das Integration anregen würde, und
auch ohne einen selektierbaren Marker, der die Persistenz dieser
Art von DNA erzwingen würde.
Diese DNA würde
lange genug persistieren, um ein paar Runden der die Teilung zu
fördern,
und zu Microcalli führen,
in denen sich Teilung fortsetzen wird (wie sie das in Geweben von sich
teilenden Zellen von Monokotyledonen tut, obwohl sie das nicht in
Einzelzellen von Monokotyledonen tut, wie sie nach der Protoplastenerzeugung
entstehen). Die andere DNA, die simultan eingebracht werden soll,
würde einen
selektierbaren Marker und ein Ac-Element benachbart zu dem (den)
Genen) enthalten, das (die) neue wünschenswerte Eigenschaften
verleiht (verleihen), die stabil in die regenerierte Pflanze eingebracht
und exprimiert werden sollen. Die Gene für stabile Transformierung würden jene
für Krankheits-
und Schädlingsresistenz
einschließen,
könnten
aber auch Gene für
verbessertes Teilungsverhalten, wie hierin vorher beschrieben, einschließen. Im
Fall von monokotyledonen Pflanzen würden sie unter der Kontrolle
von Endosperm- oder Blatt-Meristem-spezifischen Promotoren exprimiert werden.
-
Mikrocalli
werden durch Plattieren von transformierten Zellen auf festes Medium,
das Auxin-Hormone (2,4-D) enthält,
lebend erhalten. Mikrocalli werden dann auf selektives Medium übertragen
(z.B. enthaltend ein Antibiotikum des Kanamycin-Typs), um nicht transformierte Clone
abzutöten. Überlebende
Clone werden auf Medium übertragen,
das Auxin-Typ-Hormone (2,4-D NAA) und Cytokin-Typ-Hormone (Kinetin,
BAP) und ABA für
die Regenerierung von Sproß und
Wurzel enthält,
dann abgehärtet
und zum Züchten
ausgepflanzt. Diese Vorgehensweise hat zwei Vorteile gegenüber der
alternativen Vorgehensweise, die mit einigen Stämmen von Mais und vielleicht
Reis funktioniert. Die alternative Vorgehensweise bombardiert Klumpen
von Zellen (erhalten vom embryogenen Kallus) in Suspensionskultur und
versucht dann, Zellen, die keine neue genetische Information erhalten
haben, weil ihnen Resistenz gegen Kanamycin oder einem verwandten
Antibiotikum fehlt, zu töten,
wobei jene Resistenz mit der DNA, die die Gene trägt, die
stabil integriert werden sollen, zusammen eingebracht wird. Es ist
schwer, alle Zellen in jedem Klumpen, die nicht die neue DNA enthalten, zu
töten,
daher resultieren chimäre
Pflanzen. In der oben aufgeführten
Vorgehensweise sind Zellen jedoch vollkommen als individuelle Protoplasten
dispensiert, daher werden Chimären
vermieden. Der zweite Vorteil ist, dass Protoplasten eine größere Häufigkeit
von wahrer stabiler Integration in das Kern-Genom als in Satelliten-DNA
geben, so dass die Entwicklung von wahren Züchtungs-Feldfrüchten ermöglicht wird,
die in der Lage sind, die neuen Charaktere an jede Generation zu
vermitteln.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden,
nichtlimitierenden Figuren und Beispiele beschrieben.
-
1 ist
eine photographische Darstellung, die den Nachweis eines p34cdc2-Homologs
in einem Western-Blot von Proteinen aus der Zellteilungsregion von
Weizenblatt durch Sondieren mit EGV-Antikörper zeigt. Die Antikörperlösung wurde
geteilt und vorinkubiert (O) ohne Zusatz, (V) mit 20 nM EGV-Peptid
EGVPSTAIREISLLKE oder (T) mit 200 nM des veränderten Peptids EGTPSTAIREISLMKE mit
Substitutionen an der dritten und 14. Position. Die Lokalisationen
und Größen von
Markern sind auf der rechten Seite angezeigt.
-
2 ist eine graphische Darstellung, die
die Verteilung von (A) Blattsegmenten, die für die Analyse genommen wurden,
und (B) die Häufigkeit
von Zellen in der mitotischen Phase der Teilung in 90 mm langen
Keimlingsblättern
von Weizen zeigt, die nach 8 Tagen Keimung unter kürzlich beschriebenen
Bedingungen entnommen wurden. Vier mm lange Segmente wurden aufeinanderfolgend
zwischen 0 und 20 mm von der Blattbasis und über dieser in 10 mm-Abständen entnommen.
Platzieren von Probennummern im Diagramm weist auf das Zentrum von jedem
Segment hin. Der mitotische Index wurde in Proben bestimmt, die
in 4:1-Ethanol:Essigsäure
fixiert und mit Acetocarmin gefärbt
wurden. Ein hohes Auftreten von Teilung in der Meristemregion wird durch
Nachweis von Zellen in dieser kurzen Phase des Teilungszyklus angezeigt.
-
3 ist
eine photographische Darstellung, die die Änderungen während der Zelldifferenzierung in
(A) färbbaren
Proteinen und (B) Spiegel eines p34cdc2-Homologs, das in
Blattsegmenten nachgewiesen wurde, die, wie in 2A gezeigt,
geschnitten wurden, darstellt. Beispiele, enthaltend 50 μg Protein,
wurden durch PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen
und mit Ponceau S gefärbt, dann
wurde p34cdc2 mit Affinitäts-aufgereinigtem EGV-Antikörper sondiert
und unter Verwendung von 125I-markiertem
anti-Kaninchen-IgG-F (ab')2 nachgewiesen.
-
4 ist eine graphische Darstellung der Änderungen
in der Menge des p34cdc2-Homologs und Gesamtproteins während der
Blattzellenentwicklung. (A) Spiegel von p34cdc2-Protein
in 50 μg
Proben von Protein, (B) Konzentration von Gesamtprotein in Zellen
(Gesamtprotein pro Gramm frischer Gewebemasse), (C) durchschnittlicher
Gehalt an Gesamtprotein pro Zelle, (D) Menge an p34cdc2-Homolog
pro Zelle. Gesamtprotein in Extrakten, wie in 1 gemacht,
wurde durch Farbstoff-Bindung nach achtfacher Verdünnung unter
Verwendung von Ovalbumin-Standard geschätzt. Protein pro Zelle wurde durch
Multiplizieren der Proteinkonzentration, die in B gezeigt ist, mit
der durchschnittlichen frischen Zellmasse berechnet, die von früheren Messungen
der Zellzahl und frischer Masse erhalten wurde, die in diesem Labor unter
identischen Bedingungen gemacht wurden (5), und wurde durch Messung
der Zelldimensionen in diesen Proben bestätigt. Quantifizierung des p34cdc2-Homologs auf Western-Blots wurde durch
Sondieren mit EGV-Antikörper
und iodiertem Sekundärantikörper durchgeführt. Vollständige Sätze von
Proben wurden auf einzelnen Feldern von Nitrocellulose verarbeitet
und sind daher direkt vergleichbar.
-
5 ist
eine photographische Darstellung, die die Lokalisation von p13suc1-Protein im mitotischen Kern in lebenden
Tradescantia-Staubgefäß-Haarzellen
zeigt.
-
Das
p13suc1-Protein wurde direkt durch Anregung
einer kovalent gebundenen fluoreszenten Gruppe (FLUOS) nachgewiesen.
Das Protein wurde durch Mikroinjektion eines Volumens, das gleich
1 % des Zellvolumens ist, enthaltend 0,5 mg/ml Protein in 100 mM
KCI, eingebracht. Das Protein war authentisches p13suc1,
codiert durch das Spalthefe-suc1-Gen, überexprimiert in E. coli und
aufgereinigt zur Homogenität
vor der fluoreszenten Markierung.
-
Vom
p13suc1-Protein, das für Kontrolle der mitotischen
Aktivität
von p34cdc2 in Spalthefe nötig ist, wurde
gesehen, dass es im Kern konzentriert ist, sobald er in die Prophase
der Mitose eintritt. Man sieht, dass der helle Nucleus ein Drittel
des oberen Teils der Zelle einnimmt, und dunkle Chromosomen werden
gegen einen Hintergrund von p13suc1-Fluoreszenz
gesehen.
-
6 ist
eine photographische Darstellung, die die Lokalisation von p34cdc2-ähnlichem
Protein in Zinnien-Wurzelspitzenzellen zeigt.
-
Das
Protein wurde unter Verwendung eines Affinitäts-aufgereinigten polyclonalen
Antikörpers nachgewiesen,
der gegen das Peptid EGVPSTAIREISLLKE erzeugt wurde, das in allen
Zellzyklus-kontrollproteinen perfekt konserviert worden ist, die
mit p34cdc2 verwandt sind. Affinitäts-Aufreinigung verwendete
authentisches p34cdc2, das in E. coli überexprimiert
worden ist.
-
Eine
Konzentration von p34cdc2-ähnlichem Protein
in der Präprophasen-Bande
(PPB) wurde nachgewiesen (Pfeil).
-
7 ist
eine graphische Darstellung, die Spiegel von p34cdc2-ähnlichem
Protein (PSTAIR-Protein) während
synchroner Zellteilung in Suspensionskulturen von regenerierbaren
und nicht-regenerierbaren Nicotiana plumbaginifolia-Zellen zeigt.
Die regenerierbare Zelllinie war in der Lage, intakte Pflanzen nach
Transfer auf festes Medium zu regenerieren, und die nicht-regenerierbaren
Zellen verloren diese Fähigkeit
während
verlängerter
Vermehrung in der Suspensionskultur. Die zwei Zelllinien wurden
parallel gezüchtet,
und die Proteinproben von jeder wurden gemeinsam einer Elektrophose
unterworfen und Spiegel von p34cdc2-ähnlichem
Protein auf den gleichen Western-Blots geschätzt.
-
In
den Probenpaaren, die zu jedem Zeitpunkt genommen wurden, stammt
jene auf der linken Seite von der nicht-regenerierbaren Zelllinie.
-
Von
jeder Kultur wurde in Abständen
nach Freisetzung von einem Aphidicolin-Block, der Zellen in der
S-Phase ausrichtet, Proben genommen, und es resultierte eine synchrone
Zellteilung nach Transfer in Inhibitor-freies Medium. Die nichtregenerierbare
Zellline hatte konstitutive Spiegel von p34cdc2-ähnlichem
Protein, die fünfmal
jene der regenerierbaren Zelllinie waren.
-
Messungen
der Präprophasen-Bandenfrequenz
während
des Zeitraums von 15 h bis 23 h, wenn synchronisierte Zellteilung
in beiden Kulturen erfolgte, zeigten, dass von 400 Zellen in der
regenerierbaren Zelllinie 59 Phragmoplasten hatten und 63 Präprophasen-Banden
(PPB) hatten, was die Lokalisation des Phragmoplasten und der zukünftigen Kreuzungswand
(„cross
wall") bestimmte.
Im Gegensatz dazu zeigte eine viel größere Probe von 2000 Zellen
der nicht-regenerierbaren Zelllinie eine Abwesenheit von PPBs, obwohl
ein Nachweis von 292 Phragmoplasten darauf hinwies, dass die Probe
von sich teilenden Zellen genommen wurde. Fehlen von PPBs wies darauf
hin, dass degenerative Änderungen
während
der Suspensionskultur den Mechanismus zum Bestimmen der Teilungsebene
und daher der Orientierung, in der neue Zellen gebildet werden, eliminierten.
Solch eine Orientierung ist mehr nötig für Wachstum in eine Pflanze
als einen Kallus, und ihre Abwesenheit erklärt die nicht Regenerierbarkeit dieser
Kultur. Ein Schlüsselmerkmal dieser
Erfindung ist, dass sie einen Vorteil in der kontrollierten transienten
Erhöhung
der p34cdc2-Aktivität in transformierten Zellen
diagnostiziert. Dies wird die Notwendigkeit einer verlängerten
vorherigen Vermehrung von Zellen in Suspensionskultur, um eine Kapazität zur Wiederaufnahme
der Teilung nach Protoplastenbildung zu erhalten, vermeiden. Die
zufällige
Erhöhung
von p34cdc2 während der Suspensionskultur
ist unvorhersehbar und führt
normaler Weise zu unkontrollierter Teilung und Verlust der Kapazität, Pflanzen
zu regenerieren.
-
8 ist
eine graphische Darstellung, die Spiegel von p34cdc2-ähnlichem
Protein in Segmenten von Keimlings-Weizenblättern zeigt, gemessen nach deren
Transfer auf festes Medium, enthaltend 2,4-D, für 14 Tage vor dem Test.
-
Blätter von
axenisch gezüchteten
Keimlingen wurden in Segmente geteilt, und die Proteine wurden durch
SDS-PAGE fraktioniert, und p34cdc2-ähnliches
Protein wurde durch Affinitäts-aufgereinigten
Antikörper,
wie kürzlich
beschrieben, (11) geschätzt.
-
Zellen
in einem Gewebe, das von der Basis des Blattes genommen wurde, das
die Meristem-Zellteilungsregion umfasste, wurden durch 2,4-D stimuliert,
um die Synthese von p34cdc2-ähnlichem Protein
fortzusetzen und um die Teilung fortzusetzen. Zellen von irgendeiner
anderen Stelle im Blatt hatten sich differenziert und sprachen nicht
auf 2,4-D an, synthetisierten kein p34cdc2-ähnliches
Protein und teilten sich nicht. Diese reifen Zellen überleben
die Protoplastenbildung und können
eine Zellwand regenerieren. Sie würden zur Transformierung geeignet sein,
wenn sie stimuliert werden könnten,
um die Zellteilung durch Einbringen von Zellzyklusgenen für die transiente
Expression wieder aufzunehmen.
-
9 ist eine graphische Darstellung, die
einen Nachweis von p34cdc2-ähnlichem
Protein in einem Western-Blot von Proteinen zeigt, die von Karotten-Kotyledon-Explantaten nach
verschiedenen Tagen von 2,4-D-freiem (–) und 2,4-D-enthaltendem (+) Medium
extrahiert wurden. (LS = große
Rubisco-Untereinheit). Relative Mengen von p34cdc2-ähnlichem Protein
in Explantaten auf 2,4-D-enthaltendem (∎-∎) und
2,4-D-freiem (⦁-⦁)
Medium nach steigenden Zeitintervallen. Relative Einheiten sind
in Referenz 12 angegeben.
-
BEISPIEL 1
-
MATERIALIEN UND METHODEN
-
Pflanzen
-
Pflanzen
wurden exakt so gezüchtet,
wie es in einer früheren
Studie in diesem Labor beschrieben wurde (10).
-
Proteinextraktion, Elektrophorese
und Blot-Vefahren
-
Protein
wurde durch Mahlen in flüssigem Stickstoff
und hefiges Mischen bei 0°C
mit RIPA-Puffer, enthaltend das Detergenz Tween 20, und Inhibitoren
von Protease und Phosphatase, extrahiert (6). Proben, die 50 μg Protein
enthielten, wurden durch SDS-PAGE auf einem 10–15% Gradientengel aufgetrennt.
Die Proteine wurden auf Nitrocellulose übertragen und mit anti-EGVPSTAIREISLLKE-Antikörper (EGV-Antikörper), der
vor kurzem beschrieben worden ist (6; 7), nach Affinitäts-Aufreinigung des
Antikörpers
gegen Maus-p34cdc2-Fusionsprotein (8) sondiert.
Kontrollaufreinigungen ohne p34cdc2 ergaben keinen
reaktiven Antikörper.
Gebundener Antikörper wurde
mit alkalischer Phosphatase, wie kürzlich beschrieben (6), oder
mit 125I-markiertem anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2 bei
0,5 mCi I–1 (Amersham,
IM1340) unter Anwendung einer 24 h-Autoradiographie-Exposition nachgewiesen.
-
Quantifizierung des p34cdc2-Homologs
-
p34cdc2-Homolog wurde auf Western-Blots durch
Sondieren mit EGV-Antikörper
und iodiertem Sekundärantikörper quantifiziert.
Vollständige
Sätze von
Proben wurden auf einzelnen Feldern der Nitrocellulose aufgearbeitet
und sind daher direkt vergleichbar. Die Autoradiographie wurde verwendet, um
die p34-Banden zu lokalisieren, die dann für die radioaktive Zählung ausgeschnitten
und um die geringe Hintergruppe (gesehen in 3B),
die in jeder Bahn gemessen wurde, korrigiert wurden.
-
BEISPIEL 2
-
NACHWEIS VON ZELLZYKLUSKONTROLLPROTEIN
IN PFLANZENZELLEN
-
Nachweis des p34cdc2-Homologs
-
1 zeigt,
dass ein Homolog von p34cdc2 in Extrakten
der Zellteilungsregion von Weizenblättern unter Verwendung von
Antikörper,
der gegen die EGVPSTAIREISLLKE-Sequenz (EGV-Peptid) gebildet wurde,
die in p34cdc2 zwischen Hefen und Menschen,
aber nicht in anderen Proteinkinasen perfekt konserviert worden
ist, nachgewiesen wurde. Nach Affinitäts-Aufreinigung durch Bindung
an Säuger-p34cdc2 erkannte der Antikörper ein Weizenprotein, das
auch von Mr 34 × 103 war.
Die Erkennung war spezifisch für
die konservierte EGV-Peptidregion, da sie durch Kompetition mit
20 nM EGV-Peptid eliminiert wurde (1). Ein
analoges Peptid, codiert durch das PH085-Gen, das Ähnlichkeiten
mit cdc2, aber keinen Effekt auf Zellteilung hat (9), konnte nicht konkurrieren,
was darauf hinweist, dass der EGV-Antikörper eine Konfiguration innerhalb
der größten, perfekt
konservierten Region erkannte, die spezifisch für eine Zellzyklusfunktion ist.
-
Verteilung im Blatt
-
Segmente
wurden von der Basis zur Spitze des Keimlingsblatts genommen (2A),
und die Zellteilung wurde nur in den unteren 12 mm nachgewiesen
(2B), was sich mit der Region der Thymidin-Inkorporierung
in die Kern-DNA deckt. Die Änderungen
in der Abundanz von Proteinen während
der Differenzierung (3A) werden durch
das Auftreten der Mr 55 × 103-Einheit
der RUBISCO jenseits von 28 mm von der Basis veranschaulicht, was
mit dem Anstieg der Chloroplastenzahl und Beginn der Photosynthese
korreliert. Die elektrophoretische Mobilität des p34cdc2-Homolgs deckte sich
nicht mit jener von irgendwelchen abundanten Proteinen, und sein
Spiegel nahm drastisch außerhalb
der Region der aktiven Zellteilung im Vergleich zu jenem von anderen
Proteinen ab (3B). Dieses Absinken
des relativen Spiegels, quantifiziert in 4A, erfolgt
auf Grund einer Akkumulierung von anderen Proteinen, sobald differenzierende
Zellen sich in Größe, in Proteinkonzentration
(4B) und daher im gesamten Proteingehalt (4C)
steigern. Die Menge von p34cdc2-Homolog
pro Zelle (4D) wurde durch Verwendung des
Proteingehalts pro Zelle erhalten, um anzuzeigen, wie viele Zellen
das Protein erbrachten, das in 3B und 4A sondiert
wurde. Kein signifikanter Nettoabbau von p34cdc2 erfolgte
während
der Differenzierung, und das relative Absinken von 94% erklärt sich
durch die Beendigung entfällt
seiner Akkumulierung, während
eine umfangreiche Synthese von anderen Proteinen während der
Differenzierung erfolgt.
-
BEISPIEL 3
-
INTERAKTION ZWISCHEN P34CDC2 UND P13SUC1
-
Pflanzenproteine,
die als dem Zellzykluskontrollprotein p34cdc2 angesehen ähnlich werden,
sind funktionell sehr ähnlich
dem Hefe-p34cdc2-Protein. Die Signifikanz
davon ist, dass es einen schlüssigen genetischen
Beweis in Hefen für
die Zellteilungskontrollfunktionen von p34cdc2 gibt,
und die Ähnlichkeit der
Pflanzenproteine unterstützt
daher die Wahrscheinlichkeit, dass sich ähnliche Teilungskontrollfunktionen
in ihnen befinden.
-
Solcher
Beweis schließt
ein:
- a) Pflanzen-p34cdc 2-ähnliches
Protein, das die gleiche Größe von 34
kDa aufweist und die Aminosäuresequenz
EGVPSTAIREISLLKE (PSTAIR) enthält,
die vom Antikörper
erkannt wird, bindet auch an die Hefe-p13suc1-Untereinheit, die
an authentisches Hefe-p34cdc2 bindet. Das
gebundene Pflanzenprotein hat Proteinkinaseaktivität, die gegen
H1-Histon gerichtet ist, das Calcium oder cyclisches AMP nicht benötigt und
in dieser Hinsicht identisch mit authentischem Hefe-p34cdc2 ist.
- b) Pflanzen enthalten ein Homolog des p13suc1, das
die gleiche Größe hat wie
das Protein von Spalthefe und durch Antikörper gegen Hefe-p13suc1 erkannt wird. Punkte (a) und (b) zusammen
weisen darauf hin, dass das Pflanzen-p34cdc2 die
selbe Kapazität
für eine
Interaktion mit einem regulatorischen Protein beibehält, wie
es das Hefe-Enzym tut. P13suc1 ist in Hefe
für Wachstum
und für
Beendigen der Anaphase in der Mitose notwendig. Die Auswirkung der
Anwesenheit von einem Pflanzenprotein mit Homologie zu p13suc1 und der Bindung von Pflanzen-p34cdc2-ähnlichem Protein
an authentisches p13suc1 ist, dass Pflanzen-p34cdc2 durch Interaktion mit anderen Proteinen
des Netzwerks, das zuerst in Hefen charakterisiert wurde, reguliert
wird, wie wir es in unserem Patent vorschlagen.
-
Diese
Ergebnisse sind in John et al. (11) offenbart.
-
BEISPIEL 4
-
Dieses
Beispiel ist auf die Untersuchung gerichtet, ob (i) die intrazellulären Lokalisationen
von Proteinen, die mit p34cdc2 interagieren,
und (ii) die intrazelluläre
Lokalisation von p34cdc2 im Verhältnis zu potentiellen
Zielproteinen mit der Funktion von p34cdc2 im
Pflanzenzellzyklus konsistent ist.
- a) Das 13
kDa-Protein p13suc1 der Spalthefe ist in E.
coli überexprimiert,
zur Homogenität
aufgereinigt, kovalent mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester
markiert und zu 0,5 mg/ml in lebende Tradescantia-Staubgefäß-Haarzellen,
die sich aktiv teilten, mikroinjiziert worden. Das Protein wird
im Kern in der Prophase der Mitose konzentriert (5),
was konsistent ist mit dem Vorschlag, dass p34cdc2 in
der Mitose in Pflanzen agiert und durch Assoziierung mit regulatorischen
Untereinheiten wie p13suc1 reguliert wird.
- b) Die Lokalisierung von p34cdc2-ähnlichem
Protein ist durch Antikörperbindung
und Immunfluoreszenz-Mikroskopie in sich teilenden Pflanzenzellen nachgewiesen
worden. Das Protein ist im Cytoplasma und Kern lokalisiert, aber
wird in der frühen
Mitose an einer Haupt-Determinante
der Orientierung der Teilung lokalisiert, die eine Cytoskelletstruktur,
genannt die Präprophasen-Bande (PPB)
von Microtubuli, ist (siehe 6). Die
PPB markiert die Stelle der Orientierung der Kreuzungswand, die
die neuen (Tochter-) Zellen trennt, und bestimmt so die Richtung,
in der das Wachstum erfolgt. Regulierbare p34cdc2-Spiegel und
die Kapazität,
PPBs zu bilden, sind beides Schlüsselelemente
in der Kapazität,
Pflanzen aus kultivierten Zellen zu regenerieren. Solch eine Regenerierung
ist notwendig, wenn eingebrachte genetische Information für eine Feldfrucht-Verbesserung
ausgenützt
werden soll. Das doppelte Erfordernis von p34cdc2-Spiegel
und von der Kapazität,
PPBs zu bilden, ist ein Schlüsselelement
in der Kapazität,
Pflanzen aus kultivierten Zellen zu regenerieren. Solch eine Regenerierung
ist notwendig, wenn eingebrachte genetische Information für eine Feldfrucht-Verbesserung
ausgenützt werden
soll. Das doppelte Erfordernis einer p34cdc2-Regulierung
und PPB-Bildung
wird durch die gemeinsame Lokalisierung der zwei Elemente betont.
-
Eine
verwandte Untersuchungslinie hat versucht zu etablieren, ob andere
Proteine, die für
die p34cdc2-Funktion in anderen Reichen
nötig sind,
in Pflanzen vorhanden sind. Polymerasekettenreaktions (PCR)-Techniken
wurden verwendet, um Regionen von Pflanzengenen zu amplifizieren,
die homolog zu Zellzykluskontrollgenen sind. In Weizen wurde genetische
Information nachgewiesen, die ein p34cdc2-ähnliches
Protein und auch ein Protein wie die G-Klasse von Cyclinen codieren
kann, die mit p34cdc2 in der G1-Phase einen
Komplex bilden und von denen vorgeschlagen wurde, dass sie seine Funktionen
in der G1-Phase des Zellzyklus aktivieren. Die Anwesenheit dieses
Teils eines G1-Cyclingens und das Potential, es zu verwenden, um
monokotyledone Cycline unter Verwendung des PCR-amplifizierten Fragments
als eine Sonde zu clonieren, ist bedeutsam, da monokotyledone Zellen
allgemein die Teilung in der G1-Phase des Zellzyklus anhalten und ein
geeignetes Cyclin die Stimulierung der Teilung unterstützen wird.
-
Ein
anderer Ansatz ist gewesen, die molekulare Basis des Verlusts der
Regenerierbarkeit, der in Suspensionskulturen von Pflanzenzellen
erfolgt, direkt zu untersuchen.
-
Eine
verlängerte
Kultur von Pflanzenzellen in Suspension beinhaltet eine wiederholte
Verdünnung mit
frischem Medium und die gallmähliche
Vorherrschaft von Zellen, die sich unter solchen unnatürlichen
Bedingungen schneller teilen. Die Erfinder beobachteten in Suspensionskulturen
von Nicotiana plumbaginifolia, dass die fortgesetzte Selektion auf sich
schneller teilende Zellen, die unvermeidbar jedes Mal erfolgt, wenn
die Kultur verdünnt
wird, in erhöhten
Spiegeln von p34cdc2 und Verlust von Präprophasen-Banden
resultiert (detailliert dargestellt in 7).
-
Die
Hemmung der Zellteilung wurde in reifen Getreideblattzellen untersucht;
sie erfolgt auf Grund des Unvermögens,
das Schlüssel-Zellteilungsprotein p34cdc2 zu induzieren. Obwohl Gewebe von der
aktiven Teilungs (Meristem)-Region genommen wurde, wenn sie axenisch
auf Medium kultiviert wurde, das 2,4-D enthielt, bewahren Zellen
p34cdc2-ähnliches Protein
in Spiegeln, die in der Lage waren, eine Teilung zu unterstützen (siehe 9), während
Gewebe, das von irgendeiner anderen Stelle im Blatt, die reife Zellen
mit niedrigen Spiegeln an p34cdc2-ähnlichem
Protein enthielt, genommen wurde, nicht in der Lage war, die Spiegel
von p34cdc2 zu erhöhen (siehe 8),
und nicht in der Lage war, die Zellteilung zu initiieren. Das Meristemgewebe,
das die Zellteilung leicht fortführt,
ist als eine Quelle für
Transformierung ungeeignet, weil es Protoplasten hervorbringt, die eine
Zellwand nicht regenerieren und so nicht in der Lage sind, die Zellteilung
nach Einbringen von genetischem Material fortzuführen. Reife Zellen können eine
Zellwand regenerieren, aber ein Haupthemmnis der Teilung in reifen
Zellen, wenn sie nicht einer verlängerten Suspensionskultur unterzogen
worden sind, ist ihre Beibehaltung von niedrigen Spiegeln an p34cdc2-Protein.
-
REFERENZEN:
-
- 1. Nurse, P. und Bisset, Y. Nature 292: 558–560, 1981.
- 2. Nurse, P. und Fantes, P. The Cell Cycle pp85–98, 1981.
- 3. Russell, P. und Nurse, P. Cell. 44: 569–576, 1987.
- 4. Moreno, S., Nurse, P. und Russell, P. Nature 344: 549–552, 1990.
- 5. Wernicke, W und Milkovits, L. Physiologia Pl. 69 23–28, 1987b.
- 6. John, P.C.L., Sek, F.J. und Lee, G.M. Plant Cell 1: 1185–1193, 1989.
- 7. Lee, M.G. und Nurse, P. Nature 327: 31–35, 1987.
- 8. Snyder, M., Elledge, S., Sweetser, D., Young, R.A. und Davis,
R.W. Meth. Enzym. 154: 101–128,
1987.
- 9. Toh-E,A., Tanaka, K., Uesona, Y. und Wickner, R.B. Saccharomyces
Cerevisiae. Molec. Gen. Genet. 214: 162–164, 1988.
- 10. Wernicke, W. und Milkovits, L. Physiologia Pl. 69: 16–22, 1987.
- 11. John, P.C.L., Sek, F.J. und Hayles, J. Protoplasma 161 70–74, 1991.
- 12. Gorst, J.R., Sek, F.J. und John, P.C.L. Planta 185 304–310, 1991.