DE69114844T2 - Enzymatisches amplifizierungsverfahren in vitro. - Google Patents

Description

• Gegenstand der Erfindung ist eine Verbesserung des Verfahrens zur enzymatischen in vitro-Amplifikation, allgemein als PCR-Verfahren bezeichnet.
• Die Grundlagen dieses Verfahrens wurden bereits ausführlich beschrieben und seine Anwendung ist Gegenstand von Patentanmeldungen. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die europäischen Patentpublikationen EP-A- 201 184 und EP-A-200 362 verwiesen.
• Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend die Grundelemente, die das PCR-Verfahren charakterisieren, sowie die verschiedenen Anwendungen, die durchgeführt werden können, erläutert.
• Das PCR-Verfahren erlaubt es, eine spezifische DNA- Sequenz, als DNA-Ziel-sequenz bezeichnet, im Innern einer heterogenen DNA-Mischung beträchtlich zu verstärken.
• Es beruht auf dem Prinzip der Replikation der DNA- durch enzymatische Verdoppelung und der Verwendung spezifischer Initiatoren, welche die zu amplifizierende DNA- Sequenz einrahmen, wobei die 3'-Enden dieser Initiatoren als Ausgangspunkt für die DNA-Replikations-Enzyme, als DNA-Polymerasen bezeichnet, verwendet werden.
• Das Grundschema dieses Verfahrens ist in der Fig. 1 dargestellt. Die Amplifikation der Sequenz läuft ab über aufeinanderfolgende Cyclen. Jeder Cyclus umfaßt drei Stufen: eine erste Stufe zur thermischen Denaturierung der DNA, die den DNA-Doppelstrang in zwei Einzelstränge auftrennt, eine zweite Stufe zur Hybridisierung der Initiatoren auf den Sequenzen der Einzelstränge, die zu ihnen komplementär sind, und schließlich eine letzte Stufe zur Verlängerung mit Hilfe einer DNA-Polymerase, wobei man von Initiatoren (Startern) ausgeht.
• Um eine Amplifikation durch PCR durchzuführen, stellt man ein Reaktionsmedium her, das die zu analysierende heterologe DNA, die Initiatoren (Starter) und die DNA- Polymerase enthält. Dieses Medium kann auch weitere Elemente, z.B. einen Puffer, Salze, Triphosphat-Desoxynucleotide, enthalten.
• Einer der Vorteile dieses Verfahrens besteht darin, daß es nicht immer erforderlich ist, die zu analysierende DNA zu reinigen; das Verfahren kann direkt durchgeführt werden, wobei man beispielsweise von einem Zellysat ausgeht. In der Praxis können die DNA-Proben auf sehr vielfältige Weise hergestellt werden.
• Es können genannt werden, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, Reinigungsverfahren, die beispielsweise umfassen Extraktionen mit Phenol oder mit irgendeinem anderen Lösungsmittel oder auch Passagen (Durchgänge) durch Affinitätssysteme. Für den Fall, daß die Herstellung nur Stufen zur Lysis der Probe umfaßt, kann die Lysis vor der Amplifikation direkt durchgeführt werden. Unabhängig von den angewendeten Verfahren führen sie zu DNA-Molekülen, deren Längen etwa 0,5 bis 20 kb betragen, während die Länge der als Ziele der Amplifikation ausgewählten Sequenzen im allgemeinen in der Größenordnung von einigen Hundert Nucleotiden, beispielsweise etwa 0,1 kb bis 0,5 Kb, beträgt. Im allgemeinen beschränkt man sich auf diese Größenordnung aus Gründen der Wirksamkeit des Verfahrens. In bestimmten Fällen kann man jedoch auch versuchen, DNA-Segmente zu amplifizieren, deren Länge mehrere Hunderte von Nucleotiden übersteigt.
• Zur Herstellung von Initiatoren (Startern), die sich mit jedem Einfachstrang nach der Stufe der Denaturierung der DNA hybridisieren, kann man auf verschiedene Weise vorgehen. Im allgemeinen kennt man einige DNA-Sequenzen, die an das zu amplifizierende DNA-Fragment angrenzen, dann führt man eine Synthese der diesen Sequenzen entsprechenden Initiator-oligonucleotide durch. Diese Oligonucleotide können vor ihrer Verwendung modifiziert werden, ohne jedoch ihre Fähigkeit, sich auf den Ziel-Sequenzen zu hybridisieren, und ohne ihre Fähigkeit, als Ausgangspunkt für die Verlängerung zu dienen, zu eliminieren. Man kann beispielsweise an ihre 5'-Enden eine enzymatische Restriktions-Stelle bzw. -Sequenz anfügen, wodurch es anschließend möglich ist, das amplifizierte DNA-Fragment nach dem Schneiden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen zu klonieren. Man kann auch im Bereich der 5'-Enden einen Promotor einführen, der es erlaubt, anschließend die Transkriptions-Produkte zu untersuchen.
• Wenn das Medium so vorbereitet ist, kann der Reaktionszyklus beginnen. Die Arbeitsbedingungen der verschiedenen Stufen unterscheiden sich voneinander im wesentlichen durch die Temperatur, bei denen sie durchgeführt werden. Die Denaturierungsbedingungen entsprechen im allgemeinen einer Erhöhung der Temperatur des Reaktionsmediums auf einen Wert über 90ºC, die Hybridisierung findet im allgemeinen zwischen 50 und 60ºC statt und die Verlängerung durch DNA-Polymerase kann bei verhältnismäßig hohen Temperaturen in der Größenordnung von 70ºC durchgeführt werden, wenn man eine wärmebeständige DNA-Polymerase verwendet. In diesem Fall kann die Gesamtheit der Arbeitscyclen ablaufen, ohne daß es erforderlich ist, während des cyclus Enzyme zuzugeben.
• Nach einem ersten cyclus wird eine Ziel-Sequenz, die in x Examplaren in der zu testenden Probe vorliegt, verdoppelt, d.h. es liegen 2.x Exemplare vor. Nach n Amplifikations-Cyclen wird die Anzahl der Ziel-Sequenzen mit 2n multipliziert, d.h. daß eine Ziel-Sequenz, die am Anfang in x Exemplaren vorliegt, in x.2n Exemplaren vorhanden ist (vgl. Fig. 1). Selbst wenn die experimentellen Wirkungsgrade nicht in jedem Cyclus 100 % betragen, stellt dieses theoretische exponentielle Wachstum des Amplifikations-Faktors der Ziel-Sequenz eine gute Erläuterung der Wirksamkeit dieses Verfahrens dar. Die häufig angewendeten PCR-Verfahrensmaßnahmen umfassen 20, 30 sogar 40 Amplifikationszyklen, was theoretischen Multiplikationsfaktoren von 2²&sup0;, 2³&sup0; oder 2&sup4;&sup0; der anfänglichen Probemenge entspricht.
• Das Leistungsvermögen dieses Verfahrens macht es zu einem extrem wertvollen Werkzeug bei der Grundlagenforschung oder klinischen Forschung. Es findet unmittelbare praktische Anwendungen für prognostische oder diagnostische Zwecke, beispielsweise um die Anwesenheit von medizinisch interessanten DNA-sequenzen nachzuweisen, die infektiösen Mikroorganismen entsprechen, oder auch um Zell-Gene nachzuweisen, die an verschiedenen Pathologien beteiligt sind.
• Das Leistungsvermögen dieses Verfahrens macht es jedoch extrem empfindlich für Kontaminations-Gefahren der zu analysierenden Proben. Eine der unmittelbarsten Konsequenzen einer eventuellen Kontamination ist die Erzielung falscher Positiv-Ergebnisse.
• Insbesondere ist die Haupt-Kontaminante einer negativen Probe, die sich in einem Labor leicht ausbreiten kann, in dem dieses Verfahren praktisch angewendet wird, das Amplifikationsprodukt selbst, wie es vorher im Verlaufe der Analyse einer anderen Probe unter Verwendung der gleichen Initiatoren (Starter) erhalten worden ist.
• Auf diese Weise wird eine Fraktion, so klein sie auch sei, eines vorher erhaltenen Amplifikationsprodukts in einem späteren Verfahren zur Analyse einer anderen Ziel- Sequenz, das in einer ursprünglich negativen Probe für die Ziel-Sequenz des vorhergehenden Verfahrens vorhanden ist, zum Gegenstand einer beträchtlichen Amplifikation und kann somit zu einem positiven Ergebnis für die frühere Ziel- Sequenz anstatt zu einem negativen Ergebnis führen.
• Die Definition eines Amplifikationsprodukts im Sinne der vorliegenden Erfindung ist besser verständlich in Verbindung mit der Fig. 1.
• Es ist daraus zu ersehen, daß die mit der DNA- Polymerase durchgeführten spezifischen Verlängerungen zur Bildung von Produkten führen, die verschiedene Molekülstrukturen aufweisen. Die mit den ursprünglichen Ziel- Molekülen der Probe durchgeführten Verlängerungen führen zu DNA-Strängen, die im Bereich eines Initiators beginnen und deren Länge statistisch ist und in verschiedenen Abständen von ihrem Ausgangspunkt endet. Ausgehend von einem auf diese Weise polymerisierten DNA-strang, dessen Sequenz genau bei dem spezifischen Initiator beginnt, entsteht bei einem zweiten Amplifikationscyclus ein komplementäres DNA- Molekül, das im Bereich des zweiten Initiators beginnt und spätestens nach der Verdoppelung des Initiators, der auf der 5'-Seite des auf diese Weise verdoppelten Stranges angeordnet ist, endet. Dieser neue DNA-Strang hat eine Länge, die genau gleich dem Abstand ist, der die 5'-Enden der beiden Initiatoren auf der Ziel-DNA voneinander trennt. Ein solcher DNA-Strang mit endlicher Länge, der an jedem seiner Enden die direkte oder komplementäre Sequenz der Initiator-Oligonucleotide umfaßt, die für die Amplifikation ausgewählt worden sind, wird schließlich selbst amplifiziert, wobei man bei jedem Cyclus ein mit ihm identisches Produkt erhält. Man kann errechnen, daß man, ausgehend von x DNA-Strängen, die n Amplifikationscyclen unterworfen werden, x.2n Stränge erhält, von denen x(n+1) Stränge eine variable Länge haben und von denen x.2n- x.(n+1) Stränge die diskrete Länge des durch die Amplifikations-Initiatoren begrenzten Fragments haben.
• Das Verhältnis nach n Amplifikationscyclen zwischen der Menge von Molekülen mit variabler Länge und mit diskreter Länge beträgt somit
• was einen beträchtlichen Überschuß an Molekülen mit einer begrenzten Länge, bezogen auf die Moleküle mit variabler Länge, darstellt. Diese DNA-Moleküle mit begrenzter Länge, die aus der zu analysierenden Ziel-DNA-Sequenz bestehen, diean jedem Ende durch die beiden Initiator-Oligonucleotide begrenzt ist, werden als Amplifikationsprodukte bezeichnet. Sie enthalten nämlich alle für eine spätere Reamplifikat ion notwendigen Elemente.
• Dagegen haben die amplifizierten Moleküle mit variabler Länge die gemeinsame Eigenschaft, daß sie auf der 5'- Seite beginnen mit einem der Initiator-Oligonucleotide, die für die Amplifikation verwendet werden.
• Aus den vorstehenden Erwägungen resultiert, daß dann, wenn man eine neue PCR-Reaktion initiiert, wobei man von einer heterologen DNA-Probe ausgeht, es unerläßlich ist, daß das Medium frei von jeglicher Kontamination ist, die entweder aus den verwendeten Materialien oder aus den verwendeten Instrumenten stammt, und die insbesondere auf Amplifikations-Produkte zurückzuführen ist, die aus einem früheren PCR-Cyclus stammen, bei dem identische Initiator(Starter)-Oligonucleotide verwendet worden sind.
• Im Idealfall enthält ein Reaktionsmedium, das durch Produkte einer vorhergehenden Amplifikation nicht kontaminiert ist, nur die zu amplifizierende Ziel-DNA-Sequenz im Innern von DNA-Molekülen mit variabler Länge in der Größenordnung von 0,5 bis 20 kb, wie weiter oben angegeben, mit einer statistischen Repräsentation der Lokalisierung der Ziel-Sequenz auf einem zentralen Abschnitt oder auf einem distalen Abschnitt der DNA-Moleküle. Die zu amplifizierende DNA-Sequenz ist somit in einem längeren Molekül enthalten, das beiderseits von seinen Enden umgeben ist, die als die Hybridisierungsregionen der Initiatoren (Starter) definiert worden sind, von angrenzenden DNA- Sequenzen mit einer Länge, die von etwa 0 bis etwa 10 kb variiert, wenn die gesamten Moleküle eine Länge haben, die von 0,5 bis 20 kb variiert. Auf diese Weise enthalten die durch Amplifikation zu analysierenden DNA-Moleküle nur Ziel-Sequenzen in distaler Position in einem geringen Mengenanteil. Dagegen führt eine Kontamination durch ein Produkt einer vorhergehenden Amplifikation ausschließlich zu einem Ziel-DNA-Strang, der an seinen Enden durch Sequenzen begrenzt ist, die den spezifischen Initiator(Starter)-Oligonucleotiden und ihren komplementären Sequenzen entsprechen. Diese Produkte einer vorhergehenden Amplifikation haben aufgrund ihrer Struktur eine noch stärkere Tendenz, als Substrate bei der späteren Reaktion verwendet zu werden.
• In WO 89/11548 ist ein Verfahren zur Fixierung von Sonden an festen Trägern und zur Verwendung dieser Sonden zum Nachweis von durch PCR amplifizierten Produkten beschrieben. Darin ist ein Verfahren zur nicht-spezifischen Sterilisierung von DNA mit Hilfe von Dnasen vor der Einführung von Initiatoren (Startern) in die zu amplifizierende DNA beschrieben.
• In EP 407 291, die zum Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) und (4) gehört, ist ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren beschrieben, das die Behandlung der zu amplifizierenden Probe mit einem 5'-Exonuclease-Enzym umfaßt.
• Ziel der Erfindung ist es vor allem, dieses Problem der Kontamination durch Produkte einer vorhergehenden Amplifikation in einem Reaktionsmedium, das aus der Durchführung eines PCR-Verfahrens stammt, zu lösen.
• Ziel der Erfindung ist es außerdem, die Bedingungen der Anwendung des PCR-Verfahrens zu optimieren, indem man dieses Verfahren ebenso zuverlässig macht wie es wirksam sein kann.
• Die Anmelderin hat nun festgestellt, daß das angestrebte Ziel erreicht wird, wenn man am Ende einer vorhergehenden PCR-Reaktion die erhaltenen Amplifikations- Produkte ungeeignet macht für eine spätere Reamplifikation in einer späteren PCR-Reaktion, bei der die gleichen Initiator (Starter) -Oligonucleotide verwendet werden, und/oder wenn man vor einer späteren PCR-Reaktion, die auf eine vorhergehende PCR-Reaktion folgt, in der die gleichen Initiator(Starter)-Oligonucleotide verwendet werden, eine Vorbehandlung durchführt, die selektiv die Reamplifikation der Produkte der vorhergehenden Amplifikation verhindert, die aus der vorhergehenden PCR-Reaktion stammen, in der die gleichen Initiator (Starter) -Oligonucleotide verwendet worden sind.
• Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur enzymatischen in vitro-Amplifikation (PCR-Verfahren) einer Ziel-DNA-Sequenz, die im Innern einer heterologen DNA in einem Medium vorliegt, das eine DNA-Polymerase und Initiator(Starter)-Oligonucleotide enthält, wobei das genannte Verfahren umfaßt eine Stufe zur thermischen Denaturierung der DNA, eine Stufe zur Hybridisierung der Initiator(Starter)-Oligonucleotide auf der DNA und eine Stufe zur enzymatischen Polymerisation der genannten Initiator(Starter)-Oligonucleotide durch die DNA-Polymerase, wobei die genannten Stufen cyclisch wiederholt werden und die Stufen der enzymatischen Polymerisation insbesondere Amplifikations-Produkte mit einer begrenzten Länge ergeben, die bestehen aus der genannten DNA-Sequenz, die an jedem Ende durch ein Initiator(Starter)-oligonucleotid oder sein Komplement begrenzt ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man im gewünschten Augenblick nach Beendigung der Amplifikations-cyclen die genannten Amplifikations-Produkte ungeeignet macht für eine spätere Reamplifikation und/oder vor Beginn der PCR-Reaktion eine Vorbehandlung durchführt, welche die Reamplifikation der Produkte einer vorhergehenden Amplifikation, die aus einer PCR-Reaktion resultieren, in der die gleichen Initiator(Starter)-Oligonucleotide verwendet worden sind, selektiv verhindert durch Behandlung der Produkte einer vorhergehenden Amplifikation mit einer geeigneten Menge mindestens einer 3'-Exonuclease. Die Erfindung umfaßt somit zwei Aspekte, die kumulativ oder alternativ angewendet werden können. Wenn die PCR-Reaktion mit den angegebenen Intitiator(Starter)- Oligonucleotiden zum ersten Mal durchgeführt wird, ist es selbstverständlich nicht erforderlich, die Vorbehandlung anzuwenden, welche die selektive Reamplifikation der Produkte einer vorhergehenden Amplifikation verhindert.
• Um am Ende einer PCR-Reaktion die Amplifikationsprodukte unfähig für eine spätere Reamplifikation zumachen, kann man auf unterschiedliche Weise vorgehen, indem man mehr oder minder zerstörende Mittel für die genannten Amplifikationsprodukte verwendet.
• Erfindungsgemäß führt man eine irreversible Zerstörung der Amplifikationsprodukte durch. Es kann sich dabei um eine partielle Zerstörung bestimmter Teile des Produkts handeln, die ausreicht, um jede spätere Reamplifikation zu verhindern
• Wenn die Initiator(Starter)-Oligonucleotid-Sequenzen selbst zerstört werden, bleiben in dem Medium nur noch Moleküle zurück, welche die zu den Initiator- Oligonucleotiden komplementären Sequenzen enthalten. Solche Moleküle können zum Gegenstand einer arithmetischen Multiplikation vom Typ x . (n+1) gemacht werden, nicht jedoch zum Gegenstand einer geometrischen Multiplikation vom Typ x.2n, wie weiter oben angegeben. Eine solche Replikation stellt keine bemerkenswerte Konkurrenz zu der vollständigen Amplifikations-Reaktion dar und diese partielle Zerstörung ist gut geeignet, das Problem der Erfindung zu lösen.
• Für die selektive Verhinderung der Reamplifikation der Produkte einer vorhergehenden Amplifikation, die gegebenenfalls in dem Reaktionsmedium vorhanden sind, besteht die Erfindung darin, die genannten Produkte einer vorhergehenden Amplifikation mit einer geeigneten Menge mindestens einer 3'- Exonuclease zu behandeln.
• Bei den Exonucleasen handelt es sich um Enzyme, welche die DNA auf sequenzielle Weise abbauen können, wobei man entweder von dem 5'-Ende oder von dem 3'-Ende ausgeht.
• Die vorliegende Erfindung beruht auf der bereits erwähnten Beobachtung des Vorliegens einer unterschiedlichen Struktur und unterschiedlichen Länge zwischen den in diesem Stadium unerwünschten Amplifikationsprodukten und den zu änalysierenden DNA-Molekülen. Die Produkte von vorhergehenden Amplifikationen sind dadurch charakterisiert, daß sich an ihren Enden Starter-Sequenzen befinden, welche die Inituerung der Amplifikation erlaubt haben. Dagegen enthalten die zu analysierenden DNA-Moleküle die Ziel- Sequenzen und somit die Sequenzen, die sich mit den Starter-Sequenzen hybridisieren - die statistisch entlang der Länge der Moleküle verteilt sind, deren Größe zwischen etwa 0,5 und 20 Kb variiert. Ein Exonuclease-Angriff von etwa 100 oder einigen Hundert Basen hat zur Folge, daß ein kontaminierendes Amplifikationsprodukt vollständig zerstört wird unter Beibehaltung der großen Mehrzahl der Ziel-Sequenzen, die sich in der zu analysierenden Probe befinden können.
• Es können verschiedene Exonuclease-Typen verwendet werden. Im Falle der Exonucleasen, welche die DNA, ausgehend von ihren 5'-Enden, angreifen (5'-Exonucleasen), unterdrückt die Behandlung die Starter-Sequenzen und hält ihre komplementären Sequenzen aufrecht, die nur Gegenstand von linearen Multiplikationen sein können. Erfindungsgemäß unterdrücken die 3'-Exonucleasen die zu den Starter(Initiator)-Sequenzen komplementären Sequenzen, wobei sie so auf vorteilhafte Weise jede Möglichkeit der Amplifikation unterdrücken.
• Je nach dem verwendeten Exonuclease-Typ sind die Bedingungen ihrer Einführung in die Reaktionsmischung mehr oder mindergegeben. Bestimmte Exonucleasen sind nämlich nicht spezifisch für die Doppelstrang-DNA oder digerieren gleichzeitig die beiden DNA-Stränge, ausgehend von ihren Enden. In diesem Falle ist es bevorzugt, die Exonuclease- Digestion genau zu kontrollieren (zu steuern) und ihre Parameter für jedes neue Verfahren neu einzustellen. Dies bedeutet, daß diese Parameter jedesmal an die Art der zu analysierenden Probe, an die Art, wie die DNA extrahiert wurde, an ihre Konzentration, an die Reaktionsbeddingungen und dgl. angepaßt werden müssen.
• Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung verwendet man für die Doppelstrang-DNA spezifische Exonucleasen. Dieser Typ von Exonucleasen digeriert die Enden der DNA-Moleküle, was keinen Einfluß auf die Ziel- Moleküle hat. Einer der Stränge des Ziels kann nämlich zerstört werden, wobei jedoch der komplementäre Strang, der per Definition die gleiche Ziel-Sequenz trägt, beibe halten wird. Darüber hinaus hört nämlich selbst dann, wenn die Exonuclease-Behandlung übermäßig stark fortgesetzt wird oder in Gegenwart von großen Mengen Enzymen durchgeführt wird, der Abbau auf, wenn das Medium keine Doppelstrang-DNA-Moleküle mehr enthält. In diesem Augenblick ist per Definition die Hälfte der Sequenzen digeriert, was zur Folge hat, daß sich die Anzahl der Ziel-Sequenzen einfach halbiert. Infolgedessen wird selbst dann, wenn eine Exonuclease-Behandlung sehr lang fortgesetzt wird über den Punkt hinaus, der erforderlich ist, um die Amplifikations Produkte zu neutralisieren, die Möglichkeit des Nachweises derziel-Sequenz keineswegs beeinträchtigt, da das Ziel nach der Digestion mindestens in einer Anzahl von der Hälfte der Exemplare der in der Ausgangs-Probe enthaltenen Anzahl immer noch vorhanden ist.
• Die Verwendung dieses Typs von Exonucleasen ist somit besonders vorteilhaft, weil sie die Vermeidung einer strengen Kontrolle der Exonuclease-Digestion erlaubt. Darüber hinaus erlaubt sie die Durchführung einer Exonuclease-Behandlung mit der Gesamtheit der Reaktionsmischung, die bereits die Initiator-Oligonucleotide enthält.
• Als Exonucleasen dieses Typs kann man, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt ist, die Exonuclease III nennen, welche die Freisetzung von 5'-Mononucleotiden, beginnend mit den 3'-OH-Enden, katalysiert und die gegenüber der Einzelstrang-DNA nicht aktiv ist.
• In der Praxis genügt es, die Bedingungen der Exonuclease-Digestion festzulegen, um eine Digestion von etwa 20 Nucleotiden zu erhalten. Unter diesen Bedingungen vermeidet man nämlich jedes Risiko der Zerstörung des Ziels der Amplifikation, selbst wenn es nicht immer möglich ist, eine genau synchrone Digestion aller Moleküle zu erzielen, und selbst wenn bestimmte von ihnen einem stärkeren Abbau unterliegen in der Größenordnung von einigen Hundert Basen, was keinen bemerkenswerten Einfluß auf die Amplifikations-Kapazität der Ziel-Moleküle hat.
• Die Behandlung durch Exonucleasen umfaßt zweckmäßig insbesondere die folgenden Stufen:
• a) Mischen der Komponenten der PCR-Reaktion miteinander,
• b) Zugabe der Exonuclease in einer geeigneten Menge,
• c) Inkubation bei 37ºC während einer für den Abbau ausreichenden Zeitspanne und
• d) Übergang zu einer erhöhten Temperatur während mindestens 5 min.
• Anschließend werden die Amplifikations-Cyclen unter den üblichen Bedingungen durchgeführt. Die Stufe (d) wird vorzugsweise bei einer Temperatur oberhalb 90ºC durchgeführt; sie erlaubt gleichzeitig die Denaturierung der DNA, um die Amplifikations-Cyclen zu initiieren, und den irreversiblen Abbau der Exonuclease-Aktivität.
• Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Set für die Durchführung eines PCR-Verfahrens, das eine Stufe zur Vorbehandlung der zu analysierenden Proben mit einer Exonuclease umfaßt, das eine geeignete Menge mindestens einer Exonuclease enthält.
• Selbstverständlich ist es auch möglich, die Exonuclease-Digestion unter sehr milden (schonenden) Bedingungen anzuwenden als Schlußbehandlung am Ende einer PCR- Reaktion. Diese schonende Behandlung hat zur Folge, daß die Erkennungs-Sequenzen der Initiatoren zerstört werden unter Beibehaltung der amplifizierten Sequenzen. In diesem Stadium ist jedoch eine viel feinere Kontrolle (Steuerung) der Bedingungen der Exonuclease-Digestion erforderlich, um die Integrität der inneren Sequenzen der Amplifikations- Produkte zu erhalten.
• Allgemein können alle denkbaren Varianten der Erfindung getrennt oder kombiniert durchgeführt werden, sowohl in bezug auf die verschiedenen Varianten des Verfahrens als auch in bezug auf die verschiedenen Typen von Initiator-Oligonucleotiden, die man herstellen kann.
• Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiel 1 Untersuchung der Einflüsse der Digestion mit Exonuclease III auf Amplifikationsprodukt-Kontaminanten
• In einem ersten Versuch führt man eine Digestions- Kinetik durch Exonuclease III mit einer Mischung von zwei langen DNA-Fragmenten mit 5000 und 300 Basenpaaren durch und man verfolgt die Wirkungen der Digestion durch Analyse auf einem Gel und durch Färben mit Ethidiumbromid. Die Digestion wird in dem üblicherweise für die Durchführung von Amplifikationen verwendeten Puffer durchgeführt.
• Man sieht, daß das Fragment mit 300 bp nach 5- minütiger Digestion verschwindet, daß jedoch das Fragment mit 5000 bp in seiner Größe abnimmt zwischen einer 5- minütigen und einer 10- minütigen Digestion, um anschließend nach 20 min auf stabile Weise in eine Einzelstrang-DNA umgewandelt zu werden. Das in diesem Augenblick erhaltene Digestions-Produkt wird durch eine längere Inkubation mit dem Enzym nicht modifiziert.
• Dieser Versuch zeigt, daß eine lange Inkubation der DNA in Gegenwart von Exonuclease III in dem Amplifikations-Puffer diese DNA-Moleküle nicht abbaut, sondern zu einem Gleichgewicht führt, in dem die Einzelstrang-DNA selbst während langer Inkubationen stabil ist. Er bestätigt auch, daß diese Digestion die kurzen Moleküle (wie sie die Amplifikations-Produkte darstellen) sich schneller destabilisieren als die langen Moleküle (wie sie die Ziel-DNA-Moleküle darstellen).
• In einem zweiten Versuch führt man eine Amplifikation mit der Human-Genom-DNA durch unter Verwendung der Initiatoren bzw. Starter PCO2, "Nature" (1986) 324,5. 163-166, und PCO4, "Science" (1985), 280, S. 1350-1354, welche die Amplifikation eines Fragments des Globin-Gens erlauben, und man isoliert die so erzeugte Bande, die als künstliches Kontaminationsmittel verwendet wird.
• Man bereitet dann zwei Reihen von Rohren vor, von denen eines 1 µg Human-DNA und das andere 1 µg lineare Plasmid-DNA, die keine durch die verwendeten Starter (Initiatoren) amplifizierbaren Sequenzen enthält, plus 0,01 pg Kontaminenten-DNA enthält. Diese beiden Reihen werden mit 10 u Exonuclease III 0, 5, 10, 20, 40 und 60 min lang behandelt, dann werden sie unter den üblichen Bedingungen amplifiziert.
• Der Nachweis der Amplifikations-Produkte erfolgt durch direkte Elektrophorese auf 1,4 % Agarosegel und durch Färbung mit Ethidiumbromid. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind die folgenden: Anwesenheit des amplifizierten Produkts Digestion mit Exonuclease III Genom-DNA Kontaminanten-DNA
• Diese Ergebnisse zeigen, (1) daß selbst eine verstärkte Digestion der Genom-DNA durch die Exonuclease III das amplifizierbare Potential eines gegebenen neuartigen Ziels im Innern dieser DNA nicht verändert, daß jedoch (2) die gleiche Behandlung, angewendet auf ein amplifiziertes Produkt, das gereinigt worden ist (und somit äquivalent zu einer potentiellen Kontaminanten ist) und als künstliche Kontaminante in das Medium eingeführt worden ist, seine Fähigkeit zerstört, nach den ersten Minuten der Digestion amplifiziert zu werden.

Claims (5)

1. Verfahren zur enzymatischen in vitro-Amplifikation einer DNA-Ziel-Sequenz, die im Innern einer heterologen DNA in einem Medium vorliegt, das eine DNA-Polymerase und Starter-Oligonucleotide aufweist, wobei das genannte Verfahren umfaßt eine Stufe zur thermischen Denaturierung der DNA, eine Stufe zur Hybridisierung der Starter-Oligonucleotide auf der DNA und eine Stufe zur enzymatischen Polymerisation der genannten Starter-Oligonucleotide durch die DNA-Polymerase, wobei die genannten Stufen cyclisch wiederholt werden und die Stufe der enzymatischen Polymerisation insbesondere Amplifikations-Produkte mit einer begrenzten Länge ergibt, die bestehen aus der genannten DNA-Sequenz, die an jedem Ende durch ein Starter-Oligonucleotid oder sein Komplement begrenzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man im gewünschten Augenblick nach Beendigung der Amplifikations-Cyclen die genannten Amplifikations-Produkte unfähig macht für eine Schluß-Reamplifikation und/oder vor Beginn der PCR-Reaktion eine Vorbehandlung durchführt, welche die Reamplifikation der vorhergehenden Amplifikations-Produkte, die aus einer PCR-Reaktion resultieren, selektiv verhindert durch Verwendung der gleichen Starter-Oligonucleotide zur Behandlung der genannten vorhergehenden Amplifikations-Produkte mit einer geeigneten Menge mindestens einer 3'-Exonuclease.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine für die Doppelstrang-DNA spezifische Exonuclease verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Exonuclease III verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es vor Beginn der PCR-Reaktion die folgenden Stufen umfaßt:

a) Mischen der Komponenten der PCR-Reaktion,

b) Zugabe der 3'-Exonuclease in einer geeigneten Menge,

c) Inkubation bei 37ºC für eine für den Abbau ausreichende Zeitspanne und

d) Erhitzen auf eine erhöhte Temperatur während mindestens 5 min.

5. Set für die Durchführung eines PCR-Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine geeignete Menge mindestens einer 3'-Exonuclease umfaßt.