DE69029993T2

DE69029993T2 - Copolymerproduktion

Info

Publication number: DE69029993T2
Application number: DE69029993T
Authority: DE
Inventors: David Byrom
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1989-12-08
Filing date: 1990-12-04
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2010-12-05
Also published as: ZA909816B; IN177461B; CA2031888A1; CA2031888C; EP0431883A2; GB8927794D0; EP0431883A3; KR100223341B1; GB9026238D0; US5364778A; JPH05236973A; DE69029993D1; BR9006231A; AU637657B2; ATE149204T1; NZ236394A; KR910012251A; EP0431883B1; AU6782790A; JP3036851B2

Description

Die Erfindung betrifit ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Copolymeren, umfassend 3-Hydroxybutyrat (HB)-Monomereinheiten und 3-Hydroxyvalerat (HV)- Monomereinheiten, und einen neuen Mikroorganismus, der für die Verwendung bei einem solchen mikrobiologischen Verfahren geeignet angepaßt ist.
Das aus HB-Monomereinheiten bestehende Homopolymer, welches als Polyhydroxybutyrat (PHB) bekannt ist, wird von verschiedenen Mikroorganismen, vornehmlich Bakterien, als ein Energiereservematerial als Körnchen innerhalb der mikrobiellen Zellen akkumuliert.
Aus solchen Zellen extrahiertes PHB ist ein thermoplastischer Polyester, der wiederkehrenden Struktur
-O.CH(CH&sub3;).CH&sub2;.CO-,
welche bis zu einem ziemlich hohen Grad, z.B. der Größenordnung von 70% oder mehr, kristallisiert. Dieses Kristallisationsverhalten ist häufig nachteilig, wenn das Polymer z.B. als Formungsmaterial zum Einsatz kommt.
Es ist bekannt, daß die Kristallisation von PHB durch den Einbau von Einheiten eines unähnlichen Monomers in die Polymerkette modifiziert und dadurch ein Copolymer geformt werden kann. Copolymere, welche HB-Monomereinheiten und einen geringen Anteil an unähnlichen Einheiten beinhalten, können durch die Kultivierung von bestimmten Mikroorganismen unter bestimmten Bedingungen in Gegenwart von bestimmten Säuren und Alkoholen hergestellt werden.
Polymere, welche eine ethylenische Ungesättigtheit anzeigende Infrarotbande aufweisen, wurden von Davis in "Applied Microbiology", 12, (1964), Seite 301 bis 304 beschrieben. Diese Polymere, von denen Davis behauptete, daß sie Copolymere sind, welche 3- Hydroxybutyrateinheiten und 3-Hydroxy-2-butenoateinheiten, d.h. Einheiten der Formel
-O.C(CH&sub3;)=CH.CO-,
enthalten, wurden durch die Kultivierung von Nocardia auf n-Butan hergestellt.
Wallen et al. beschreiben in "Environmental Science and Technology", 6, (1972), Seiten 161 bis 164, und 8 (1974), Seiten 576 bis 579, ein bei 97 bis 100ºC schmelzendes Polymer (nach wiederholtem Waschen), das von aktivierten Schlämmen isoliert wurde und 3-Hydroxybutyrateinheiten und 3-Hydroxyvalerateinheiten, d.h.
-O.CH(C&sub2;H&sub5;).CH&sub2;.CO-Einheiten
im Verhältnis von 1:5 enthielten.
Marchessault et al. berichteten in "IUPAC Macro Florence 1980 International Symposium on Macromolecules preprints", 2, (1980), Seite 272 bis 275, von einer Untersuchung dieses Polymers, und sie bestätigten, daß es hauptsächlich 3-Hydroxyvalerateinheiten enthielt.
Die US-Patentschrift 3275610 beschreibt die mikrobiologische Herstellung von Polyestern durch Kultivieren bestimmter Mikroorganismen, insbesondere Nokadia salmonicolor, auf vier Kohlenstoffatome enthaltenden Carbonsäuren.
Die Europäische Patenschrifi 0069497 beschreibt die mikrobielle Herstellung einer Vielzahl von Polyestern durch Kultivieren bestimmter Mikroorganismen, insbesondere der Alcaligenes eutrophus Mutante NCIB 11599 auf geeigneten Substraten.
Die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung 0204442 beschreibt die mikrobielle Herstellung von Copolymeren aus HB und HV durch Kultivierung der Alcaligenes eutrophus- Mutante NCIB 12080 auf primären Alkoholen mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen, jedoch Methanol ausschließend.
Um Copolymere herzustellen, ist es bekanntermaßen notwendig, ein Substrat, d.h. eine Quelle für Energie und Kohlenstoff bereitzustellen, welches eine Komponente umfaßt, die in der Lage ist, das sie zu den ungleichen Monomereinheiten während mindestens eines Teils der Zeitdauer, in der das Copolymer akkumuliert wird, führt. So müßten z.B., um ein Copolymer, das HB-Monomereinheiten und HV-Monomereinheiten umfaßt, herzustellen, Bakterien auf einem Substrat kultiviert werden, das eine Komponente umfaßt, aus der HV synthetisiert werden kann, z.B. Propionsäure.
Die Komponente, welche zu den HV-Monomereinheiten innerhalb des Copolymeren führt, wird hierin als HV-Komponente des Substrates bezeichnet.
Spezifische Kultivierungsbedingungen sind normalerweise erforderlich, um in bekannten Bakterien, die PHB-Herstellung und -akkumulation zu induzieren. Solche spezifischen Kultivierungsbedingungen sind ebenfalls erforderlich, um eine Copolymerherstellung und -akkumulierung zu induzieren.
Einige bekannte Bakterien stellen PHB konstitutiv her, d.h. daß sie nicht unter spezifischen Bedingungen kultiviert werden müssen, damit sie PHB herstellen und akkumulieren. Nichtsdestotrotz können, wenn nicht die vorgenannten spezifischen Kultivierungsbedingungen zur Anwendung kommen, selbst jene bekannten Stämme, welche PHB konstitutiv herstellen, eine HV-Komponente verstoffwechseln, so daß Copolymer nicht hergestellt und akkumuliert wird.
Selbst wenn spezifische Kultivierungsbedingungen angewandt werden, so daß eine Copolymerherstellung und -akkumulierung in bekannten Bakterien induziert werden, wird ferner nur ein geringer Anteil der HV-Komponente durch das Bakterium in HV-Monomereinheiten umgewandelt. So kann die HV-Komponente zu einem Nichtmonomermaterial führen, oder kann verwendet werden, um HB-Monomereinheiten zur Einbringung in das Copolymer zu synthetisieren, selbst wenn die HV-Komponente das einzige Substrat während des Polymerakkumulierungsschrittes ist. Der Stoffwechsel der HV-Komponente zur Synthese von HB-Monomereinheiten kann in dem Ausmaß erfolgen, daß beträchtlich weniger als die Hälfte der HV-Komponente zu den erforderlichen HV-Monomereinheiten umgewandelt wird und zur Herstellung von Copolymeren, welche einen geringen Prozentanteil von HV- Monomereinheiten aufweisen, führt.
Um sicherzustellen, daß wenigstens etwas der HV-Komponente in die erforderlichen HV- Monomereinheiten umgewandelt wird und der erforderliche Anteil von HV-Monomereinheiten in dem Copolymer vorliegen, muß das Bakterium mit einem großen Überschuß der HV-Komponente versehen werden.
Die niedrige Umwandlungseffizienz, gekoppelt mit den relativ hohen Kosten der HV- Komponente, führt zu einem Syntheseweg für ein HB/HV-Copolymer, der teuer ist.
Ferner ruft die notwendige Gegenwart eines solch großen Überschusses der HV-Komponente in dem Substrat drastische Probleme bei herkömmlichen mikrobiellen Routen zur Copolymersynthese insofern hervor, als daß eine potentiell toxische Umgebung erzeugt wird, innerhalb der das Bakterium kultiviert werden muß.
Es ist aus den Europäischen Patentschriften 52459, 69479, 204442 und 288908 bekannt, Copolymere aus Hydroxybuttersäure (HB) und Hydroxyvalerinsäure (HV) durch das Kultivieren von Mikroorganismen in Medien, welche Substrate für die HB- und HV-Einheiten im Polymer beinhalten, herzustellen. Die HV-Substrate werden im allgemeine für das Wachstum der Organismen verstoffwechselt und dadurch ist mehr erforderlich als für die Bildung der HV-Einheiten notwendig ist. Da sie im allgemeinen für die Organismen toxisch sind, ist die Gegenwart hoher Konzentrationen für das Verfahren schädlich.
Die Erfindung umfaßt ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung eines HB- und HV- Monomereinheiten umfassenden Copolymers zur Verbesserung der Umwandlungseffizienz einer HV-Komponente zu einem HB/HV-Copolymer, wobei das Verfahren umfaßt:
(i) Kultivieren eines PHB-akkumulierenden Bakteriums, aus dem ein bedeutender metabolischer Umwandlungspfad zur Umwandlung des HV-Bestandteils in HB-Monomereinheiten im wesentlichen eliminiert wurde und das zu signifikantem Wachstum nicht in der Lage ist, wenn es unter ansonsten nicht einschränkenden Wachstumsbedingungen auf einem Substrat kultiviert wird, das im wesentlichen aus einem HV-Bestandteil besteht, wobei das PHB-akkumulierende Bakterium bei einem gewünschten Trockengewicht der Zellen je Liter Medium unter für das PHB-akkumulierende Bakterium, das das Copolymer synthestisiert und akkumuliert, wachstumseinschränkenden Bedingungen in einem wäßrigen Medium kultiviert wird, in dem das Substrat einen wasserlöslichen assimilierbaren kohlenstoffhaltigen HV-Bestandteil und einen wasserlöslichen assimilierbaren kohlenstoffhaltigen HB-Bestandteil umfaßt, und
(ii) Ernten des copolymerhaltigen Bakteriums.
Die Verfahrensbedingungen, unter denen das Bakterium kultiviert wird, d.h. Temperatur, pH, Belüftung, essentielle Nährstoffe, können ähnlich zu denen sein, die üblicherweise beim PHB- Akkumulierungsverfahren zur Anwendung kommen.
Jene für das Wachstum des Bakteriums erforderlichen essentiellen Nährstoffe umfassen die folgenden Elemente, welche normalerweise in leicht assimilierbarer Form, normalerweise als wasserlösliche Salze vorliegen: Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium und Eisen zusammen mit Spuren an Mangan, Zink und Kupfer.
Zumindest ein Teil der Kultivierung wird unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen durchgeführt, d.h. unter Bedingungen, bei denen ein essentielles Anfordernis für das Wachstum - jedoch nicht für eine Copolymerakkumulation - beschränkt ist. Unter solchen wachstumsbeschränkenden Bedingungen wird die Tendenz des Bakteriums umgangen, PHB-Homopolymer herzustellen und zu akkumulieren, und wird die Herstellung und Akkumulierung von HV-haltigem Polymer induziert. Obgleich es möglich wäre, eine Copolymerakkumulierung zu induzieren, indem die Sauerstoffzuführ zum Bakterium beschränkt wird, ist es bevorzugt, die Zufuhr von einem oder mehreren der essentiellen Nährstoffe zu beschränken. Die am praktisch einfachsten zu beschränkenden Elemente sind Stickstoff, Phosphor oder weniger bevorzugt Magnesium, Schwefel oder Kalium. Der Stickstoff kann bequem in Form eines Ammoniumsalzes zugeführt werden, wohingegen der Phosphor bequem als ein Phosphat zugeführt werden kann.
Wenn eine Stickstoffbeschränkung zur Anwendung kommt, ist das Substrat vorzugsweise stickstoffrei, und so sind Amidderivate der HV-Komponente weniger bevorzugt. Die Menge an erforderlichem assimilerbarem Stickstoff beträgt etwa 10 bis 15 Gew.-% des gewünschten Zellgewichts weniger als das Gewicht des akkumulierten Copolymers.
Ähnliche Erwägungen sind anzuwenden, wenn eine Phosphorbeschränkung zum Einsatz kommt.
Die Kultivierung des Bakteriums wird bevorzugterweise so durchgeführt, daß das Trockengewicht der copolymerhaltigen Zellen mindestens 30g/l, vorzugsweise mindestens 80 g/l, und insbesondere mindestens 120 g/l beträgt. Das verwendete Bakterium ist in der Lage, die im Substrat vorkommende HV-Komponente effizient zu HV-Monomereinheiten umzuwandeln. Insbesondere kann das Bakterium die HV-Komponente zu HV-Monomereinheiten mit einer Effizienz auf molarer Basis von mehr als 45%, insbesondere von mindestens 60% und speziell zwischen 70 und 80% und noch stärker von Vorteil zwischen 80 und 90%, umwandeln.
Vorzugsweise sind die Bedingungen, unter denen ein spezifisches Bakterium kultiviert werden sollte, jene, welche die Effizienz der Umwandlung maximieren.
Die Kultivierung des Bakteriums umfaßt vorzugsweise ein 2-Stufen-Prozeß. In der ersten Stufe wird das Bakterium vorzugsweise auf ein bestimmtes Trockengewicht pro Liter unter nicht einschränkenden Wachstumsbedingungen auf einem leicht verstoffwechselbaren Substrat, wie einem Kohlenhydrat, z.B. Glukose, wachsen gelassen. In der zweiten Stufe ist das Substrat zumindest teilweise die HV-Komponente und ist mindestens ein für das Wachstum erforderlicher Nährstoff beschränkt, so daß wachstumsbeschränkende Bedingungen vorliegen.
Die Kultivierung kann als ein Batch-Prozeß durchgeführt werden, so daß eine Copolymerakkumulierung auftritt, wenn sich die Menge der für das Wachstum - und nicht für die Copolymerakkumulierung - erforderlichen Nährstoffe erschöpft.
In alternativer Weise kann die Kultivierung als ein kontinuierlicher Prozeß durchgeführt werden, wobei ein Kulturstrom aus dem Gefäß abgezogen wird, in dem das Bakterium kultiviert wird, und zwar auf kontinuierlicher oder semi-kontinuierlicher Basis. Der aus dem Gefäß entfernte Strom enthält Bakterienzellen in einem verbrauchten wäßrigen Medium. Das verbrauchte wäßrige Medium beinhaltet restliche Mengen an Nährstoffen und Substrat. Die Flußrate des das Gefäß verlassenden Stroms entspricht der Zugaberate von frischem wäßrigem Medium zum Gefäß. Das dem Gefäß zugeführte frische wäßrige Medium enthält Nährstoffe und Substrat in ausreichenden Mengen, um die Akkumulierung von Copolymer zu unterstützen. Vorzugsweise ist die Menge des Nährstoffes, welcher zur Beschränkung des Wachstums des Bakteriums verwendet und dem Gefäß zugeführt wird, dergestalt, daß wenig oder nichts des Nährstoffs in dem verbrauchten wäßrigen Medium, welches aus dem Gefäß genommen wird, vorliegt. Ferner ist es bevorzugt, daß das verbrauchte wäßrige Medium mindestens einer weiteren belüfteten Kultivierstufe im Batch- oder vorzugsweise kontinuierlichem oder semi-kontinuierlichem Betrieb zugeführt wird, wodurch eine zusätzliche Polymerakkumulierung durch die Zugabe von frischem, die HV-Komponente enthaltendem Substrat zum verbrauchten wäßrigen Medium stimuliert wird. Die Mengen an Nährstoffen und Substrat können so im verbrauchten wäßrigen Medium nach Verlassen der ersten Kultivierungsstufe eingestellt werden, daß ein optimaler Betrieb für den Gesamtprozeß aufrechterhalten wird.
In alternativer Weise kann die Kultivierung des Bakteriums als ein Ein-Stufen-Prozeß durchgeführt werden. In einem solchen Prozeß, wobei die Copolymerakkumulierung induziert wird, indem die Menge eines für das Wachstum aber nicht für die Copolymerakkumulierung erforderlichen Nährstoffs beschränkt wird, wird die Verweilzeit des wäßrigen Mediums im Gefäß ausreichend lang ausgedehnt, so daß eine Erschöpfung des beschränkten Nährstoffes ermöglicht wird und eine Copolymerakkumulierung auftritt.
Sowohl beim Ein-Stufen- oder Mehr-Stufen-Prozeß als auch beim Batch- oder semikontinuierlichen oder kontinuierlichen Prozeß kann die HV-Komponente als einzige im Substrat während der gesamten oder eines Teils der Copolymerakkumulierungsstufe vorliegende Kohlenstoffquelle vorhanden sein, oder sie kann in Vermischung mit anderen assimilierbaren Kohlenstoffquellen vorliegen.
Die Konzentration der HV-Komponente im wäßrigen Medium hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z.B. ob das Verfahren batchartig oder kontinuierlich ist, von dem gewünschten Copolymerprozentanteil, der Prozentzahl an HV-Monomereinheiten im gewünschten Copolymer. Da das verwendete Bakterium in der Lage ist, Copolymer mit hohen Umwndlungseffizienzen zu synthetisieren und akkumulieren, ist die Konzentration der HV-Komponente im Prozeß zugeführten Medium und somit auch im Medium aus dem Prozeß relativ niedrig. Im allgemeinen liegt die Konzentration der HV-Komponente zum Zeitpunkt des Erntens des Bakteriums vorzugsweise zwischen 0,1 und 25 und insbesondere zwischen 5 und 10 g/l.
Die HV-Komponente kann Propanol, Propionsäure oder ein Salz,, Ester, Anhydrid, Amid oder Halogenid davon sein.
Mischungen und Verbindungen, welche für die Verwendung als HV-Komponenten geeignet sind, können eingesetzt werden.
Es wird angenommen, daß die hohe Umwandlung der HV-Komponente zu HV-Monomereinheiten dadurch möglich gemacht wird, daß das kultivierte Bakterium nicht länger in der Lage ist, die HV-Komponente zu Acetyl-CoA im beträchtlichen Ausmaß zu verstoffwechseln.
Obwohl wir nicht durch die folgende Theorie gebunden sein möchten, nimmt man an, daß der zu den Copolymeren, welche HB-Monomereinheiten und HV-Monomereinheiten beinhalten, führende metabolische Umwandlungspfad wie folgt ist, in dem:
CoA.SH nicht verestertes Coenzym A ist,
CH&sub3;.CO.S.CoA der Acetylthioester von Coenzym A ist und üblicher als Acetyl-CoA bezeichnet wird,
NADP Nikotinamidadenindinukleotinphosphat im oxidierten Zustand ist, und
NADPH&sub2; reduziertes NADP ist.
Es wird angenommen, daß die Biosynthese von PHB mittels eines Mikroorganismus in der ersten Stufe die Synthese von Acetyl-CoA ist. Dieses kann z.B. gebildet werden aus CoA und Acetat oder durch die Decarboxylierung von Pyruvat, welches das Produkt der Glykolyse von Kohlenhydraten ist, oder welches durch die Decarboxylierung von Oxalacetat gebildet werden kann, wobei die letztere ein Element des Tricarbonsäure (TCA)-Zyklus ist, welcher auch als Krebbszyklus bekannt ist.
Somit wird mit Acetat als Quelle für Acetyl-CoA das PHB mittels eines metabolischen Umwandlungspfades erzeugt, welcher die folgenden Reaktionen beinhaltet:
1. CH&sub3;.CO.O&supmin; + CoA.SH -- Thiokinase T CH&sub3;.CO.S.CoA + OH&supmin;
2. 2CH&sub3;.CO.S.CoA -- B-Ketothiolase TCH&sub3;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA + CoA.SH
3. CH&sub3;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA + NADP&sub2; -- Reduktase TCH&sub3;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA + NADP
4. CH&sub3;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA -- Polymerase T -O.CH(CH&sub3;).CH&sub2;.CO- + CoA.SH
worin CH&sub3;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA Acetoacetyl CoA ist;
CH&sub3;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA 3-Hydroxybutyryl-CoA ist und
-O.CH(CH&sub3;).CH&sub2;.CO- eine wiederkehrende Einheit im Polymer ist.
Somit addiert die Reaktion 4 -O.CH(CH&sub3;).CH&sub2;.CO- zu einer wachsenden Polymerkette.
Aufgrund eines Spezifitätsmangels der involvierten Enzyme ist ein korrespondierender Umwandlungsweg mit z.B. Propionsäure angenommenermaßen wie folgt:
1a) CH&sub3;.CH&sub2;.CO.O&supmin; + CoA.SH -- Thiokinase T CH&sub3;.CH&sub2;.CO.S.CoA + OH&supmin;
2a) CH&sub3;.CH&sub2;.CO.S.CoA + CH&sub3;.CO.S.CoA -- B Ketothiolase T CH&sub3;.CH&sub2;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA + CoA.SH
3a) NADPH&sub2; + CH&sub3;.CH&sub2;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA -- Reduktase T NADP + CH&sub3;.CH&sub2;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA
4a) CH&sub3;.CH&sub2;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA -- Polymerase T -O.CH(C&sub2;H&sub5;).CH&sub2;.CO- + CoA.SH
worin
CH&sub3;.CH&sub2;.CO.S.CoA Propionyl-CoA ist,
CH&sub3;.CH&sub2;.CO.CH&sub2;.CO.S.CoA 3-Ketovaleryl-CoA ist,
CH&sub3;.CH&sub2;.CHOH.CH&sub2;.CO.S.CoA 3 Hydroxyvaleryl-CoA ist und
-O.CH(C&sub2;H&sub5;).CH&sub2;.CO- eine wiederkehrende Einheit im Polymer ist.
Somit wird in der Reaktion 4a -O.CH(C&sub2;H&sub5;).CH&sub2;.CO- zu einer wachsenden Polmerkette addiert.
Wie vorstehend postuliert, ist eines der Zwischenprodukte in der Synthese eine HB- Monomereinheit selbst ein Zwischenprodukt in der Synthese eines HV, wodurch bevorzugt ist, daß das Substrat nicht nur eine HV-Komponente, sondern auch eine Kohlenstoffquelle umfaßt, die zu dem erforderlichen HB-Monomer-Zwischenprodukt metabolisierbar ist, d.h. eine HB-Komponente. Somit ist es durch die Regulierung der relativen Mengen in dem Substrat aus Komponenten für die HB- und HV-Synthese möglich, Copolymere zu erhalten, welche verschiedentliche Anteile von HB- und HV-Monomereinheiten enthalten.
Ein in geeigneter Weise zur Verwendung beim Prozeß der vorliegenden Erfindung geeignet angepaßtes Bakterium kann hergestellt werden durch die Mutation eines PHB- akkumulierenden Stamms von Alcaligenes eutrophus und durch Screenen und Auswählen der resultierenden Mutanten.
Demzufolge stellen wir einen Stamm, insbesondere als eine Rohkultur von Alcaligenes eutrophus, bezeichnet als NCIMB 40124, und davon abgeleitete Mutanten und Varianten bereit.
Der Stamm Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 wurde bei der "National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB)" PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom am 24. März 1989 unter den Bestimmungen und Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Der Stamm Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 und davon abgeleitete Mutanten und Varianten können durch die folgende taxonomische Beschreibung gekennzeichnet werden. Der Stamm und davon abgeleitete Mutanten und Varianten sind in der Lage, PHB in ähnlicher Weise wie der Elternstamm NCIB 12080 herzustellen und zu akkumulieren, Copolymere, die HB- und HV-Monomereinheiten enthalten, mit hoher Effizienz der Umwandlung der HV- Komponente zum HV-Monomer herzustellen und zu akkumulieren, auf einem aus Acetat bestehenden Substrat zu wachsen, wobei kein Wachstum auf einem aus Propionat bestehenden Substrat vorliegt. Die Kombination dieser Eigenschaften bezüglich Wachstum, kein Wachstum und Polymerakkumulation unterscheidet den neuen Stamm von Alcaligenes eutrophus von den existierenden Stämmen von Alcaligenes eutrophus. Die Beurteilung der oben erwähnten Wachstum/kein Wachstum-Charakteristika wurden unter nicht beschränkenden Wachstumsbedingungen auf einem Substrat durchgeführt, welches einen Kohlenstoffgehalt aufwies, der vornehmlich aus dem im Test befindlichen Material bestand, d.h. Acetat oder Propionat.

Beschreibung von Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124.

Morphologie

Gram-negative bewegliche Stäbchen mit einer ungefähren Größe von 0,8 µm x 6,0 µm.
Hinweis auf intrazelluläre Körnchen.
Keine Sporenbildung.
Unter einem Phasenkontrastmikroskop sind gelegentlich subpolare Flagella festzustellen.
Morphologie der Kolonien (Lab 8 Nährstoff Agar) - der Organismus liegt in Form von runden, regulären, opaken, glatten, weißen, konvexen Kolonien vor. Nach drei Tagen betrug der Durchmesser etwa 2 mm.
Eine blaßbraune Pigmentierung entwickelte sich mit zunehmendem Alter.

Temperatur

Bei 5ºC kein Wachstum.
Bei 37ºC Wachstum.
Bei 45ºC kein Wachstum.

Charakteristika

Katalase +
Kovacs-Oxidase +
O-F Glukose sehr schwach oxidativ
Pyocyanin -
Fluoreszenz -
L-Arginin CSU -
Betanin CSU -
Glucose CSU +
Laktat CSU +
Acetat CSU +
CSU Arabinose -
Meso-Inositol -
Xylose -
Gas Glukose -
ONPG -
Arginin Moller -
Lysin Moller -
Ornithin Moller -
NO&sub3; zu NO&sub2; -
NO&sub3; zu N&sub2; + bei 37ºC
DNAase -
Gel stab. -
Gel Platte -
Kasein -
Stärke -
Lecithin (Ei) -
Lipase (Ei) -
NH&sub3; schwach positv
Indol -
H&sub2;S -
Tween 80 +
Urease +
Kein Wachstum auf Methanol nach 5 oder 14 Tagen festgestellt.
Kein Wachstum auf Propan-1-ol nach 5 oder 14 Tagen festgestellt.
Es zeigte sich ein Wachstum auf Acetat an 3 Tagen.
Resistenz gegenüber Penicillin G und Stretomycin.
Empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Tetracyclin, Polymyxin B und Novonbiocin (schwach).
Stämme von Alcaligenes eutrophus gemäß der vorliegenden Erfindung können auf eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden, z.B. durch die Transposonmutagenese, einschließlich der Excision von eingefügten Transposonen, welche zur Verursachung von Deletionen in der Lage sind, chemische Mutagenese unter Verwendung von Mutagenen wie Ethanmethansulphonat und in vitro-Manipulation verursachte Mutationen und anschließende Rekombination.
Der Stamm Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 wurde in folgender Weise hergestellt.
Die Mutterkultur war Alcaligenes eutrophus NCIMB 12080, verfügbar von dem "National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.", nach den Bestimmungen und Bedingungen des Budapester Vertrags.
Die Mutterkultur wurde im Mineralsalzmedium plus Glukose von 1% auf eine optische Dichte von 0,9, gemessen bei 600 nm, wachsen gelassen. Eine Probe (10 ml) der Kultur, so wie sie gewachsen war, wurde in eine 9-cm-Petrischale aus Glas überführt und dann mit UV- Licht mit einer Dosismenge bestrahlt, die ausreichte, um 99,9% zu töten.
Die bestrahlte Kultur wurde einem Kolben überführt, der Mineralsalzmedium plus Glukose von 1% enthielt, und sie wurde bei 30ºC in der Dunkelheit etwa 16 Stunden lang inkubiert.
10 ml der inkubierten Kultur wurde dann einem Kolben überführt, der Mineralsalzmedium plus Natriumpropionat von 0,075% und D-Cycloserin von 800 µg/ml enthielt. Der Inhalt des Kolbens wurde dann bei 30ºC etwa 16 Stunden lang inkubiert.
Die Kultur wurde zentrifugiert, und das resultierende Pellet wurde in sterilem destilliertem Wasser erneut suspendiert.
Reihenverdünnungen wurden aus der Suspension hergestellt, und 0,1-ml-Aliquots wurden aus den Verdünnungen auf Agar mit Mineralsalzen, der 1% Glukose enthielt, ausplattiert. Die Platten wurden dann inkubiert, und die resultierenden Kolonien wurden auf Mineralsalzagar, der 0,075% Propionat enthielt, zurückplattiert.
Es wurden die Kolonien nachgewiesen, die in der Lage waren, auf Glukoseagarplatten, jedoch nicht auf Propionatagarplatten zu wachsen. Diese Kolonien wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt.
Die ausgewählten Kolonien und mutmaßliche Mutanten wurden bezüglich ihres Vermögens gescreent unter Verwendung von Glukose oder Acetat als Kohlenstoffquelle zu wachsen; ihrer Unfähigkeit, auf Propionat zu wachsen; und ihrer Fähigkeit, Copolymer, das HB-Monomerund HV-Monomereinheiten enthält, herzustellen und zu akkumulieren, wenn eine Versorgung mit Glukose und Propionat unter Stickstoff beschränkenden Bedingungen vorlag.
Ein gemäß der vorstehend beschriebenen Vorschrift hergestellter Stamm ist Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein wäßriges Medium, daß folgendes - ausgedrtickt als (g/l) - enthielt und einen pH-Wert von 7 (eingestellt durch Ammoniakzugabe) aufwies, wurde hergestellt.
MGSO&sub4;.7H&sub2;O 2,2
K&sub2;SO&sub4; 3,0
Na&sub2;SO&sub4; 0,18
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,18
Glukose 13,0
Spurenelemente 3,0 (ml)
Phosphorsäure 6,5 (ml von 1,1 M)
Ein Fermenter, der 3 Liter des oben stehenden Mediums enthielt, wurde mit einer Starterkultur von Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 inokuliert. Das inokulierte Medium wurde bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert, bis der Phosphatgehalt des Mediums beschränkend wurde.
Glukose und Propionsäure wurden dann dem Fermenter mit Raten von 10 g/h bzw. 3,3 g/h während weiterer 48 Stunden zugeführt.
Die das Copolymer enthaltenden Zellen wurden geerntet, gefriergetrocknet und bezüglich des Polymergehalts und der -zusammensetzung untersucht.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß die Flußraten von Glukose und Propionsäure bei 6,4 g/h bzw. 0,7 g/h lagen.

Vergleichsbeispiel 3

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß der Stamm Alcaligenes eutrophus NCIMB 12080 anstelle des Stamms Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 verwendet wurde.

Vergleichsbeispiel 4

Das Beispiel 2 wurde wiederholt, außer daß der Stamm Alcaligenes eutrophus NCIMB 12080 anstelle des Stamms Alcaligenes eutrophus NCIMB 40124 verwendet wurde.
Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 4 waren wie folgt:
Somit ist ersichtlich, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei dem ein Bakterium gemäß der Erfindung zur Anwendung kommt, zu einer beträchtlichen Zunahme der Umwandlungseffizienz einer HV-Komponente zu HV-Monomereinheiten führen kann.

Claims

1. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung eines Copolymers mit HB- und HV-Monomereinheiten, um die Konversionseffizienz für den HV-Bestandteil in das HB/HV-Copolymer zu erhöhen, wobei das Verfahren umfaßt:

(i) Kultivieren eines PHB-akkumulierenden Bakteriums, aus dem ein bedeutenderer metabolischer Umwandlungspfad zur Umwandlung des HV-Bestandteils in HB-Monomereinheiten im wesentlichen eliminiert wurde und das zu signifikantem Wachstum nicht in der Lage ist, wenn es unter ansonsten nicht einschränkenden Wachstumsbedingungen auf einem Substrat kultiviert wird, das im wesentlichen aus einem HV-Bestandteil besteht,

wobei das PHB-akkumulierende Bakterium bei einem gewünschten Trockengewicht der Zellen je Liter Medium unter für das PHB- akkumulierende Bakterium, das das Copolymer synthetisiert und akkumuliert, wachstumseinschränkenden Bedingungen in einem wäßrigen Medium kultiviert wird, in dem das Substrat einen wasserlöslichen assimilierbaren kohlenstoffhaltigen HV-Bestandteil und einen wasserlöslichen assimilierbaren kohlenstoffhaltigen HB-Bestandteil umfaßt, und

(ii) Ernten des copolymerhaltigen Bakteriums.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium mehr als 45% des im Substrat vorhandenen HV-Bestandteils in HV-Monomereinheiten umzuwandeln in der Lage ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration des HV-Bestandteils in dem wäßrigen Medium so eingestellt ist, daß der gewünschte Prozentsatz an HV-Monomereinheiten in dem Copolymer erreicht wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des HV-Bestandteils in dem mit dem geernteten Bakterium assoziierten Medium zwischen 0,1 und 25 g x 1&supmin;¹ beträgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der HV-Bestandteil Propanol, Propionsäure oder ein assimilierbares Derivat davon ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kultivierung des Bakteriums so durchgeführt wird, daß das Trockengewicht der copolymerhaltigen Zellen wenigstens 30 g x 1&supmin;¹ beträgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kultivierung des Bakteriums einen Zwei-Stufen-Prozeß umfaßt, bei dem in einem ersten Schritt das Bakterium bis zu dem gewünschten Trockengewicht je Liter unter nicht wachstumseinschränkenden Bedingungen auf einem leicht metabolisierbaren Substrat wachsen gelassen wird und dann in einem zweiten Schritt das Substrat wenigstens zum Teil der HV- Bestandteil ist sowie wenigstens ein für das Wachstum erforderlicher Nährstoff beschränkt ist, so daß wachstumseinschränkende Bedingungen bestehen.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wachstumseinschränkenden Bedingungen dadurch erreicht werden, daß die Menge des verfügbaren assimilierbaren Stickstoffs und/oder Phosphors beschränkt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Menge des verfügbaren assimilierbaren Stickstoffs etwa 10 bis 15 Gewe-% des erwünschten Zellgewichts abzüglich des Gewichts des akkumulierten Copolymers beträgte

10. Alcaligenes eutrophus (Stamm NCIMB 40124) oder Mutanten oder Varianten desselben, wobei die Mutanten oder Varianten zu einem signifikanten Wachstum bei Kultur unter ansonsten nicht wachstumseinschränkenden Bedingungen auf einem Substrat mit einem Gehalt an wasserlöslichem Kohlenstoff nicht in der Lage sind und der Gehalt an wasserlöslichem Kohlenstoff im wesentlichen durch einen HV-Bestandteil bereitgestellt wird.