DE69708420T2

DE69708420T2 - Herstellung von gereinigten (Poly)Peptiden

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Publication number: DE69708420T2
Application number: DE69708420T
Authority: DE
Inventors: Giampietro Corradin; Nicolas Fasel; Christophe Reymond; Mario Roggero
Original assignee: RMF Dictagene SA
Current assignee: RMF Dictagene SA
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2002-07-18
Anticipated expiration: 2017-05-03
Also published as: US6075127A; IL128857A; CA2265249A1; JP2001500489A; EP0827966A1; DK0827966T3; CU22900A3; CN1166681C; HUP0000588A3; RU2182155C2; WO1998009983A3; IL128857A0; EP0827966B1; HU223997B1; ES2164297T3; CN1233255A; AU4701697A; DE69708420D1; AU719029B2; PL188670B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Modifikationsverfahren zum Erleichtern der Herstellung gereinigter (Poly-)Peptide und betrifft ein Reinigungsverfahren unter Verwendung dieses Modifikationsverfahrens.
Während der letzten Jahre wurde die Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung von entweder t-Boc- oder F-moc-Strategien in großem Rahmen verbessert. Verfeinerte Vorschriften der Synthese ermöglichten die Herstellung von Polypeptiden von ungefähr 100 Resten oder mehr¹&supmin;&sup4;. Nichtsdestotrotz führt eine unvollständige Kopplung und Kettenabbruch, der bei irgendeinem Umlauf bzw. Zyklus des Peptid-Zusammenbaus auftritt, zur Bildung von Sequenzen mit Deletionen und trunkierten bzw. verkürzten Sequenzen.
Dies und das mögliche Auftreten von Nebenreaktionen, die hauptsächlich während der endgültigen Abspaltung vom Harz zu beobachten sind, stören die einfache Isolierung des erwünschten Peptids von anderen Verunreinigungen. Die Reinigung langer synthetischer Polypeptide ist ein Hauptproblem bei der Herstellung von Produkten, die für biologische Studien und zur Verwendung beim Menschen und Tier von Nutzen sind, und bei denen ein hohes Niveau an Reinheit obligat ist.
Insbesondere, wenn Sequenzen, die 30 oder mehr Reste enthalten, synthetisiert werden, können die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften, wie beispielsweise der Größe, Ladung oder Hydrophobie zwischen dem erwünschten Produkt und zwischen deletierten, trunkierten und modifizierten Peptid-Unreinheiten, zu klein sein, um eine geeignete Reinigung zu ermöglichen. Zusätzlich sind die kraftvollen modernen Trenn-Techniken, das heißt Umkehrphasen-HPLC, oftmals durch niedrige Ausbeuten und kleine Proben-Beladbarkeit beschränkt, was einen hohen Zeitverbrauch mit sich bringt und teuer ist.
Unterschiedliche Ansätze wurden bereits getestet, um diese Beschränkung zu umgehen. Eine Biotinylierung eines synthetischen IL-1 Proteins mit 153 Resten&sup5; und eines synthetischen SIV-Protease-Proteins mit 99 Resten&sup6; wurden durchgeführt und die biotinylierten Ketten wurden auf einer Avidin-Agarose-Säule isoliert.
Ball et al.&sup7; haben kürzlich ein Reinigungsverfahren auf Grundlage des Zusatzes einer reversiblen Schutzgruppe vorgeschlagen, die entweder lipophile, saure oder basische Funktionen an den letzten Rest der Peptidkette trägt.
Speziellere chromatographische Verfahren wurden optimiert, die die Gegenwart bestimmter Reste in den synthetisierten Sequenzen ausnutzen. Beispielsweise wurden Cystein-haltige Peptide durch Reaktion mit immobilisierten Quecksilberderivaten&sup8; oder aktivierten Thiolen&sup9; gereinigt und die immobilisierte Metallionen- Affinitäts-Chromatographie (IMAC)¹&sup0; wurde erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, die Histidin oder Tryptophan¹¹ enthielten, angewendet.
In rekombinanten Proteinen wurde ein Histidin-Ende, ein B-Zell- Epitop oder GST-Komponenten absichtlich hinzugefügt. Diese Enden konnten anschließend in der Affinitäts-Chromatographie verwendet werden.
Im allgemeinen muß eine Reinigungs-Vorschrift, die auf den physiko-chemischen Eigenschaften des synthetisierten Peptids basiert, für jede einzelne Probe optimiert werden, was eine zeitaufwendige und kostenintensive Praxis darstellt. Aus diesen Gründen wurde eine Anzahl von Techniken entwickelt, um die Reinigungsverfahren einer allgemeinen Anwendbarkeit zugänglich zu machen¹&sup5;. Jedoch sind die bis jetzt beschriebenen Verfahren nicht voll zufriedenstellend, weil sie nach wie vor zeitaufwendig sind und/oder kovalent derivatisierte Peptide in den gereinigten Endprodukten zurücklassen, die einige Bedenken bezüglich ihrer biologischen und physiko-chemischen Eigenschaften und ihrer Endverwendung bei Tieren und Menschen stellen.
Es ist deswegen die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verbesserung der bekannten Verfahren bereitzustellen, indem ein Verfahren zur Modifikation von (Poly-)Peptiden zur Erleichterung von deren Reinigung bereitgestellt wird, und indem ein Reinigungsverfahren für (Poly-)Peptide bereitgestellt wird, wobei diese Verfahren universell anwendbar sind, eine hohe Ausbeute zur Folge haben und leicht durchzuführen sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Modifikationsverfahren gelöst, das die Einfügung zumindest einer spezifisch spaltbaren Aminosäure am Ende der (Poly-)Peptidkette während deren Synthese und ein Schützen derselben Aminosäure(n) innerhalb des (Poly-)Peptids, falls vorhanden, gegen ein Spalten, einschließt, um die spezifische Spaltung genau an der (den) spezifisch spaltbaren Aminosäure(n) zu ermöglichen.
Ein Reinigungsverfahren unter Verwendung dieses Modifikationsverfahrens umfaßt die folgenden Schritte:
a) Synthetisieren des erwünschten (Poly-)Peptids;
b) Zusetzen zumindest einer spezifisch spaltbaren Aminosäure am Ende des (Poly-)Peptids, während dieselbe Aminosäure(n) innerhalb des (Poly-)Peptids, falls vorhanden, gegen Spaltung geschützt wird;
b) Verlängerung des (Poly-)Peptids und der Aminosäure(n), die hierzu zugesetzt sind, mit einer tag-Sequenz, um ein verlängertes Polypeptid zu gewinnen;
c) Reinigen des verlängerten (Poly-)Peptids mittels eines tag-spezifischen Reinigungsverfahrens und
d) Entfernen der tag-Sequenz und der zusätzlichen Aminosäure n) von dem verlängerten (Poly-)Peptids mittels eines Spaltverfahrens, das für die zusätzliche Aminosäure(n) spezifisch ist, um das gereinigte Polypeptid zu gewinnen.
Das spezifische Spaltverfahren ist vorzugsweise ein chemisches Spaltverfahren, wie es hierin nachstehend ausführlicher dargestellt wird.
Die Verfahren der Erfindung sind auf jedes (Poly-)Peptid anwendbar, weil sie nicht von deren Aminosäure-Zusammensetzung abhängen. Weiterhin sind in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen die Verfahren preiswert und hoch effizient.
Eine derartige Ausführungsform ist die Verwendung eines Methionin-Restes als zusätzliche Aminosäure, vor Zusetzen des Affinitäts-tag (beispielsweise eine Erstreckung von Sechs-Histidin-Resten oder anderen die Reinigung erleichternden Verbindungen). Nach geeigneten Reinigungsschritten, wie beispielsweise einer tag-spezifischen Affinitäts- Chromatographie, kann der Histidintag durch CNBr-Aufschluß gespalten werden, ein preiswertes und sehr effizientes Verfahren, das spezifisch am Methionin-Rest spaltet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der tag somit zumindest eine Erstreckung von Histidin-Resten, vorzugsweise sechs oder mehr, und einen Methionin-Rest. Wahlweise können eine oder mehrere weitere Aminosäuren eingebaut werden.
Wenn die Sequenz des gewünschten Polypeptids Methionin-Reste enthält, würden sie durch Cyanbromid einer Spaltung unterworfen werden, wenn der tag entfernt wird. Dies kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung durch Verwendung von modifizierten Methionin-Resten in der Synthese des (Poly-)Peptids vermieden werden. Ein derartiger modifizierter Methionin-Rest ist beispielsweise Methionin-Sulfoxid.
Bei einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens und des Prozesses der vorliegenden Erfindung ist der tag ein großes Molekül, wie beispielsweise Polyethylenglykol. In diesem Fall ist das tag-spezifische Reinigungsverfahren eine Gel-Filtrations-Chromatogtaphie.
Das Verfahren und der Prozeß der Erfindung sind gleichermaßen gut auf Polypeptide anwendbar, die durch DNA-Rekombinations- Techniken hergestellt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die ursprünglich innerhalb des gewünschten Polypeptids vorhandenen Methionin-Reste, doch nicht die in dem tag, vor einer Spaltung geschützt, beispielsweise indem sie durch eine weitere Aminosäure, wie beispielsweise Valin, Glycin, substituiert sind oder deletiert sind.
In dieser Anmeldung soll "tag" ein entfernbares Molekül bedeuten, das dem erwünschten Polypeptid während oder nach dessen Synthese zugesetzt wird. Ein "tag" kann eine Aminosäuresequenz sein, die während der Synthese des Polypeptids zugesetzt wird, kann jedoch auch ein anderes Molekül sein, das aus einem Gemisch von Bestandteilen leicht gereinigt werden kann. Ein Beispiel des letzteren ist Polyethylenglykol (PEG).
In dieser Anmeldung sind die Begriffe "Peptid", "Polypeptid" und "(Poly-)Peptid" in austauschbarer Weise verwendet worden.
Das nächste Beispiel wird zur Veranschaulichung der Erfindung dargelegt. Es ist klar, daß dieses Beispiel für den Fachmann eine ausreichende Anleitung zur Entwicklung weiterer Verfahren sein wird, die in den Schutzbereich der Erfindung fallen. In einem Beispiel wird ein Reinigungsverfahren von allgemeiner Anwendbarkeit offenbart, auf Grundlage der Kombination von 1.) einer Capping Vorschrift, 2.) der Verwendung von Methioninsulfoxid als geschütztem Methionin-Rest während des Zusammensetzens der nativen Sequenz und 3.) der Verlängerung des erwünschten Peptids mit einem Methionin- und 2 Glycin-Resten und einer Enderstreckung von 6 Histidinen, die zur Affinitäts- Chromatographie verwendet werden. Nach geeigneten Reinigungsschritten, wurde eine Cyanbromid-Spaltung des Histidin-tag gefolgt von einer endgültigen Reduktion von Methioninsulfoxid zu Methionin durchgeführt. Diese einfache, unkomplizierte Strategie ermöglichte die Reinigung des Polypeptids "PbCS 242-310" mit 69 Resten, das den C-terminalen Bereich des CS-Proteins von Plasmodium berghei abdeckt, bis zur Homogenität, in hoher Ausbeute und in kurzer Zeit, unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Verfahren.

BEISPIEL,

1. Materialien und Methoden

1.1. Reagenzien und Lösungsmittel

Chemikalien und Lösungsmittel, die zur Peptid-Synthese verwendet wurden, wurden von der Calbiochem-Novabiochem AG (Läufelfingen, Schweiz) und Fluka (Buchs, Schweiz) bezogen.

1.2. Peptid-Synthese und -Analyse

Um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, wurde ein Polypeptid, das als "PbCS 242-310" bezeichnet wird, und das den C-terminalen Bereich des Plasmodium berghei CS-Proteins¹² abdeckt, chemisch unter Verwendung einer Festphasen F-Moc- Chemie in einem Applied Biosystems 431A Peptide Synthesiser synthesiert. Das Polypeptid wurde auf einem F-moc-Ser(t-butyl)- p-alkoxybenzylalkoholharz (Wäng-Harz) mit einem Substitutionsgrad von 0,43 mmol/g auf der 0,1 mmol Skala hergestellt. Die Synthese wurde unter Verwendung eines fünffachen Überschusses an F-moc-Aminosäure-Derivaten, DCCI und HOBt als Aktivierungsmitteln, einer 60-minütigen Kopplungs- bzw. Verbindungszeit für die ersten 34 Aminosäuren und einer doppelten Kopplung für die folgenden Reste durchgeführt. Ein Capping bzw. Abdecken mit Essigsäureanhydrid wurde am Ende jedes Umlaufs durchgeführt. Nebenketten-Schutzgruppen schlossen das folgende ein: Pentamethylchromansulfonyl-Gruppe für Arg; -S-t-Butyl für Cys; Triphenylmethyl-Gruppe für Asn, Gln und His; t-Butoxycarbonyl- Gruppe für Lys und Trp; t-Butyl-Gruppe für Asp, Glu, Ser, Thr und Tyr. Met 306 wurde als Fmoc-Met-sulfoxid eingefügt, um es gegen die spätere Cyanbromid-Spaltung zu schützen.
Das Peptid wurde dann N-terminal mit der Sequenz His-His-His- His-His-His-Gly-Gly-Met unter Verwendung derselben Bedingungen wie oben beschrieben, verlängert, jedoch wurde das Capping nach Kuppeln des zweiten Gly unterlassen. Das somit gewonnene Polypeptid wird als "His tag PbCS 242-310" bezeichnet.
Roh-Peptid wurde durch Behandlung des Peptid-Harzes mit 2,5% H&sub2;O, 5% Triethylsilan in TFA für 2 Stunden bei Raumtemperatur gewonnen. Das synthetische Peptid wurde durch Größenausschluß-Flüssig-Chromatographie (Sephadex® G50 Säule 70 · 2,5 cm unter Verwendung von 50%-iger Essigsäure/H&sub2;O als mobiler Phase) gereinigt. Die Reinheit des Peptids wurde durch RP-HPLC unter Verwendung einer C&sub4; W-Porex® 250 · 4,6 mm Säule und einem 10-90% CH&sub3;CN-Gradienten in 0,1% TFA/H&sub2;O in 60 Minuten mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. untersucht. Die Aminosäure-Zusammensetzung wurde nach Knecht und Chang¹³ bestimmt.

1.3. Immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) und CNBr-Spaltung

Das Polypeptid wurde zuerst durch Affinitäts-Chromatographie auf Grundlage des Histidin-täg gereinigt. Danach wurde der tag durch Cyanbromid entfernt.
Eine Ni-Säule wurde mit N1-NTA-Agarose-Harz (Qiagen Inc., Chatsworth, USA) hergestellt und mit Puffer A (8 M Urea, 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,01 M Tris, pH eingestellt auf 8,0 mit H&sub3;PO&sub4;) äquilibriert. Das durch Größenausschluß gereinigte "His-tag PbCS 242-310" Polypeptid wurde in Puffer A gelöst und in einer Durchfluß-Geschwindigkeit von 15 ml/h auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit Puffer A (Durchflußgeschwindigkeit 15 ml/h) und Puffer B (8 M Urea, 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,01 M Tris, pH eingestellt auf 6,3 mit H&sub3;PO&sub4;) gewaschen, der 50 mM Imidazol enthielt, in einer Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/h. Das "His tag PbCS 242-310" Polypeptid wurde dann (Durchflußgeschwindigkeit 30 ml/h) mit Puffer B eluiert, der 250 mM Imidazol enthielt.
Das eluierte Material wurde durch eine Sephadex G 25 Säule (50 · 2,5 cm, unter Verwendung von 50% Essigsäure/H&sub2;O als mobiler Phase) entsalzt und lyophilisiert. Zur Entfernung des Histidin-tag wurde das somit gewonnene Material 8 Stunden lang bei RT in einer Konzentration von 20 mg/ml in 70% TFA unter Verwendung eines 100-fachen molaren Überschusses an CNBr behandelt.
Das somit aufgeschlossene Material wurde lyophilisiert, in Puffer A solubilisiert und wiederum auf die Ni-NTA-Agarose- Säule geladen. Der Histidin-tag wurde auf der Ni-Säule zurückgehalten und der Durchfluß durch die Säule enthielt das "PbCS 242-310"-Polypeptid. Der Durchfluß wurde durch eine Sephadex G 25 Säule (50 · 2,5 cm unter Verwendung von 50% Essigsäure/H&sub2;O als mobiler Phase) entsalzt und lyophilisiert.

1.4. Met-sulfoxid-Reduktion

Das CNBr-behandelte und IMAC gereinigte Material wurde mit 10% Mercaptoethanol bei pH 8,0 behandelt, um Methioninsulfoxid in Methionin und Cys-S-t-Butyl zu Cys umzuwandeln und wurde dann weiter durch Gel-Filtration gereinigt (Sephadex G 25 Säule 250 · 4,4 mm).

1.5. Massen-Spektrometrie

Eine Massen-Spektrometrie-Analyse wurde unter Verwendung eines Flugzeitmassenspektrometers LDI 1700 Mass Monitor (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA) durchgeführt. Fünf ul einer Lösung von 1 mg/ml Polypeptide wurden mit 5 ul trans- 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure) (20 mg/ml in Acetonitril (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA)) gemischt und 1,0 ul dieser Lösung wurden auf der Massen-Spektrometer-Probenspitze angeordnet und mit einem sanften Vakuum getrocknet. Die Probe wurde mit 3-ns Laser-Impulsen (Wellenlänge 337 nm) aus einem N2-Laser bestrahlt. Die Flugzeit bzw. Laufzeit wurde mit einem Digital-Oszilloskop (Serie 9304; Le Croy Research Systems, Corp., Spring Valley, NY) gemessen, was unter Verwendung des Peptide MALDI-TOFMS Calibration Standard (Linear Scientific Inc., Reno, 1 W, USA) in ein Massenspektrum umgewandelt wurde.

2. Ergebnisse

Das Polypeptid "PbCS 242-310" mit 69 Resten entspricht dem C-terminalen Bereich des P. berghei C5 Proteins¹². Die Synthese von "His tag PbCS 242-310" wurde unter Verwendung einer automatisierten Vorschrift durchgeführt, in die ein Capping Schritt nach jedem Koppeln, wie in dem Abschnitt "Materialien und Methoden" beschrieben, eingeschlossen war.
Mehr als 150 mg Roh-Polypeptid wurden durch Behandlung von 600 mg des entsprechenden Peptid-Harzes mit H&sub2;O/Triethylsilan/- TFA gewonnen.
Die Massen-Spektralanalyse des Roh-Polypeptids zeigte das Vorhandensein der interessierenden Spezies mit einem Molekular- Gewicht (Molecular Weight = MW) von 9301 unter anderen Bestandteilen mit niedrigem Molekular-Gewicht (Fig. 1) an.
Neunzig mg Roh-Polypeptid wurden durch immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) auf einer 25 ml Volumen N1-NTA-Agarose-Säule (Fig. 2) gereinigt. Nach Entsalzen durch Größenausschluß-Flüssigkeits-Chromatographie wurden 35 mg "His tag PbCS 242-310" gewonnen. Die Extinktions-Messung bei 280 nm des eluierten Materials (35 mg) und der Durchfluß (55 mg) zeigten an, daß der Ertrag der Reinigungs-Vorschrift 100% war.
Das N1-Säulen-gereinigte Material wurde dann mit CNBr gespalten, um die 6 · His tag zu eliminieren.
Das aufgeschlossene Material wurde erneut auf die N1-Säule aufgebracht, um das ungespaltene Peptid zu eliminieren und mit 10% Mercaptoethanol bei pH 8,0 behandelt, um das während der Synthese eingeführte Methioninsulfoxid zu reduzieren und um die Cys-Rest-Schutzgruppen zu reduzieren. Eine vollständige Reduktion des Methioninsulfoxids wurde durch erneute Behandlung des Materials mit CNBr und durch Überprüfen der Effizienz der Spaltung durch Massenspektrometrie bestätigt.
Eine weitere Reinigung durch Größenausschluß-Chromatographie hatte 19 mg gereinigtes "PbCS 242-310" zur Folge.
In Fig. 3 ist das Massenspektrum des gewonnenen Materials dargestellt und in Fig. 4 werden die analytischen chromatographischen Profile von rohem und gereinigten Peptid verglichen. Die Differenz der Rückhaltezeiten zwischen den beiden Durchläufen ist auf das Fehlen der in hohem Maß geladenen His tag im gereinigten Material zurückzuführen. Das gereinigte "PbCS 242- 310" stellte sich auf Grundlage der Integration von Peak- Flächen als ungefähr 95%rein heraus, wenn es bei 214 nm untersucht wurde. Die Aminosäure-Zusammensetzung des C5-Polypeptids war mit derjenigen, die für dieses Peptid erwartet würde, konsistent (Tabelle 1). Tabelle 1. Aminosäure-Analyse
a sowohl Cys als auch Trp wurden nicht bestimmt
b Durchschnitts-Wert von fünf Bestimmungen
c Standard-Abweichung

3. Diskussion

Die chemische Synthese von bioaktiven Peptiden ist eine weitverbreitete und schnellwachsende Technik geworden, was auf die Automatisierung und effiziente Vorschriften zum Ketten- Zusammenbau zurückzuführen ist. Für die meisten Anwendungen muß das Synthese-Rohprodukt zur Entfernung von Rest-Reaktanten, Fehler-Sequenzen und chemisch-modifizierten Peptid-Spezies gereinigt werden. Dies wird üblicherweise durch Umkehrphasen- HPLC unter Verwendung von wäßrigen mobilen Phasen aus Trifluoressigsäure/Acetonitril erreicht. Obwohl die Peptid- Synthese in hohem Maß automatisiert wurde, ist die Reinigung noch in großem Rahmen ein manuelles Verfahren, deswegen zeitaufwendig, teuer und nicht sehr effizient.
Dieses Beispiel hat dargelegt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zu einer hohen Reinheit führt, wie es aus Fig. 3 folgt, und leicht und universell anwendbar durchzuführen ist.
Das Problem einer spezifischen Spaltung, das auf das Vorhandensein von Met-Resten in der erwünschten Sequenz zurückzuführen ist, wie im hierin beschriebenen Fall, wird erfindungsgemäß durch Verwendung von Met-Sulfoxid-Resten umgangen, die gegenüber einer CNBr-Behandlung resistent und quantitativ mit Mercaptoessigsäure¹&sup4; reduzierbar sind.
Aus dem vorhergehenden folgt, daß das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich auf die Reinigung des Polypeptids "PbCS 242- 310", einer 69 Reste-Kette, die der C-terminalen Region von P. berghei CS-Protein¹² entspricht, angewendet wurde. Obwohl viele Peptid-Verunreinigungen im Roh-Material nach Spaltung aus dem Harz vorlagen, wie durch Massen-Spektralanalyse, dargelegt in Fig. 1, dargestellt wurde, waren die Erfinder dazu in der Lage das Ziel-Peptid bis zur Homogenität in hoher Ausbeute und in relativ kurzer Zeit zu reinigen. Die vollständige Reinigungs-Vorschrift ergab einen Ertrag von 19 mg gereinigtem "PbCS 242-310", was ungefähr 20% des Rohmaterials entspricht.
Es wurde als Schlußfolgerung hierin demonstriert, daß die CNBr- Spaltung und der Schutz relevanter Met-Reste wie Sulfoxide, gekoppelt mit einem effizienten Affinitäts-tag ein effizientes und allgemeines Werkzeug für die Reinigung von chemisch-synthetisierten langkettigen Peptiden darstellen kann.

4. Figuren-Beschreibung

Fig. 1: Massen-Spektrum von Roh-Peptid
Fig. 2: Chromatographisches Profil der IMAC-Reinigung
Fig. 3: Massen-Spektrum eines gereinigten Peptids
Fig. 4: Chromatographische Profile von rohem und gereinigtem Peptid.

LITERATUR

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Claims

1. Verfahren zur Modifikation von (Poly-)Peptiden, zur Erleichterung deren Reinigung, wobei das Modifikationsverfahren die Einfügung zumindest eines spezifisch spaltbaren Methionins und eines tag am Ende der (Poly-)Peptid-Kette, während deren Synthese und ein Schützen der Methionin-Reste innerhalb des (Poly-)Peptids, falls vorhanden, gegen eine Spaltung, durch Schützen von diesen mit einer Sulfoxid-Gruppe umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der tag ein his-tag oder ein großes Molekül, wie beispielsweise Polyethylenglykol, ist.

2. Verfahren zur Herstellung von gereinigten (Poly-)Peptiden, unter Verwendung des Modifikations-Verfahrens von Anspruch 1, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Synthetisieren des erwünschten (Poly-)Peptids;

b) Zusetzen zumindest eines spezifisch spaltbaren Methionins am Ende des (Poly-)Peptids, während Methionin(e) innerhalb des (Poly-)Peptids, falls vorhanden, gegen Spaltung durch Schutz mit einer Sulfoxid-Gruppe geschützt werden;

c) Verlängerung des (Poly-)Peptids und des/der Methionin(e), die hierzu zugesetzt werden, mit einem tag, um ein verlängertes Polypeptid zu gewinnen;

d) Reinigen des verlängerten (Poly-)Peptids mittels eines tag-spezifischen Reinigungsverfahrens und

e) Entfernen des tags und des/der zusätzlichen Methionins(e) von dem verlängerten (Poly-)Peptid mittels eines Spaltverfahrens auf Grundlage von Cyanbromid, um ein gereinigtes (Poly-)Peptid zu gewinnen, dadurch gekennzeichnet, daß der tag eine his-tag-Sequenz oder ein großes Molekül, wie beispielsweise Polyethylenglykol ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die his-tag-Sequenz aus His-His-His-His-His-His-Gly- Gly- besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem das tag-spezifische Reinigungs-Verfahren eine Chromatographie auf Grundlage der Affinität für die tag-Sequenz ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das tag ein großes Molekül, wie beispielsweise Polyethylenglykol ist, und bei dem das tag-spezifische Reinigungs- Verfahren eine Gel-Filtrations-Chromatographie ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, bei dem das erwünschte (Poly-)Peptid durch DNA-Rekombinations- Techniken in einem lebenden Wirt erzeugt wird und anstatt des Schutzes mit einer Sulfoxid-Gruppe, Methionine innerhalb des (Poly-)Peptids deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert werden, wie beispielsweise Valin, Glycin oder durch ein modifiziertes Methionin.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der lebende Wirt ein eukaryotischer Wirt oder ein prokaryotischer Wirt, wie beispielsweise Escherichia coli. ist.