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Es
wurde schon lange erkannt, dass es eine sehr schwierige Aufgabe
sein kann, einen Wirkstoff zu seiner therapeutischen Wirkstelle
im zentralen Nervensystem, d. h. dem Systema nervosum central (Gehirn
und Rückenmark)
zu bringen wegen der zahlreichen chemischen und physikalischen Schranken,
die überwunden
werden müssen,
damit ein solcher Transport erfolgreich ist. Es wurde eine Anzahl von
Methoden entwickelt, um einige dieser Barrieren oder Schranken für den Wirkstofftransport
in das zentrale Nervensystem zu überwinden,
z. B. die Verwendung von Liposomen, um die Bluthirnschranke zu überwinden.
Die Nachteile eines Liposomenabgabesystems, unter anderem geringe
Wirkstoffbeladungen, kurze Wirkungsdauer, begrenzte Wege, um die Wirkstofffreisetzungsrate
zu manipulieren, schlechte Lagerstabilität und Probleme mit dem Scale-up,
haben die Verwendung eines solchen Systems jedoch verhindert. Eine
weitere Methode, um einige der Barrieren des Wirkstofftransports
in das zentrale Nervensystem zu überwinden,
bestehen in einer chemischen Modifikation des aktiven Wirkstoffs
zu einer Form, so genannte Prodrug, die fähig ist, die Bluthirnschranke
zu überqueren,
wobei die Prodrug, sobald sie diese Schranke überquert hat, in ihre aktive
Form zurückkehrt.
Ein Beispiel eines solchen Prodrug-Transportsystems besteht aus
dem Neurotransmitter Dopamin gebunden an ein molekulares Maskierungsmittel,
das von dem fettlöslichen
Vitamin Niacin abgeleitet ist. Das modifizierte Dopamin wird in das
Hirn aufgenommen, wo es dann langsam von dem Prodrug-Maskierungsmittel
abgezogen wird, was freies Dopamin liefert.
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Die
häufigste
Methode, um einige der physikalischen Schranken zu überwinden,
die einen Wirkstofftransport in das zentrale Nervensystem verhindern,
war die Verwendung von Pumpen. Eine Vielzahl von Pumpen wurde entwickelt,
um Wirkstoffe aus einem externen Reservoir über einen kleinen Schlauch
in das zentrale Nervensystem zu bringen. Obwohl solche Pumpenabgabesysteme
in einem gewissen Ausmaß extern
kontrolliert werden können, ist
das Potenzial für
eine Infektion direkt in dem zentralen Nervensystem groß und die
genaue Wirkungsstelle des Wirkstoffs innerhalb des zentralen Nervensystems
ist größtenteils
außer
Kontrolle.
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Um
erfolgreich zu sein, genügt
es nicht, einfach den Wirkstoff in das zentrale Nervensystem zu bringen.
Der Wirkstoff muss an die vorgesehene Wirkungsstelle in der erforderlichen
Abgaberate und in der richtigen therapeutischen Dosis geliefert
werden. Kommerziell ist die osmotische Minipumpe von Alzet ein annehmbares,
sehr nützliches
und erfolgreiches Mittel zur Abgabe von Wirkstoffen in einer kontrollierten
Rate und Dosis über
längere
Zeiträume
in das zentrale Nervensystem geworden. Die Anpassung dieser Vorrichtung,
um den gewünschten
Wirkstoff an diskrete Hirnbereiche oder Hirnnuclei ab zugeben, bietet
jedoch zahlreiche Schwierigkeiten, wie das Implantieren von Kanülen direkt
in die vorgesehenen Hirnbereiche.
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Eine
andere Technik, die entwickelt wurde, um neuroaktive Mittel, wie
Neurotransmitter, in das zentrale Nervensystem zu bringen, erfolgt
durch Verwendung von Neuraltransplantaten bzw. Nerventransplantaten.
Lebensfähiges
Neuronalgewebe kann direkt in diskrete Hirnnuclei implantiert werden.
Die Dauer der Substanzabgabe aus dem transplantierten Gewebe bietet
kein Problem, da implantiertes Gewebe lange Zeit im zentralen Nervensystem
des Wirts überleben
kann. Diese Technik überwindet
eine Anzahl der oben zitierten Hindernisse, trotz der Angaben, dass
Neuronalimplantate aus fötalen
Dopaminzellen einige der autoregulatorischen Feedbackeigenschaften
aufweisen, die sich normalerweise in intakten Dopaminneuronensystemen
finden, kann die exakte Rate, mit der die Neurotransmitter aus Neuronentransplantaten
an ihre Wirkungsstelle abgegeben werden, nicht vorbestimmt werden.
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WO
9117772 beschreibt ein Wirkstoffabgabesystem zur Verabreichung eines
neuroaktiven Moleküls
in das zentrale Nervensystem, das ein neuroaktives Molekül verkapselt
in einem Mikrokügelchen aus
einem Copolymer von Poly(lactid-co-glycolid) oder einem Homopolymer
von Polylactid oder Polyglycolid, aufweist.
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1817
beschrieb James Parkinson eine Krankheit, die er "Schüttellähmung" nannte. Dieser Zustand
ist derzeit als Parkinson-Krankheit bekannt und tritt bei Menschen
mittleren Alters und alten Menschen auf. Während ihr Einsetzen schleichend
ist und oft mit einem Zittern in einer Hand beginnt gefolgt von
einer sich verstärkenden
Bradykinesie und Steifheit, ist sie langsam fortschreitend und kann
nach mehreren Jahren zur Arbeitsunfähigkeit führen. Bei idiopathischer Parkinson-Krankheit
gibt es gewöhnlich
einen Verlust von Zellen in der Substantia nigra, dem Locus ceruleus
und anderen pigmentierten Neuronen und eine Abnahme des Dopamingehalts
in Axonenden von Zellen, die sich aus der Substantia nigra in den
Nucleus caudatus und das Putamen erstrecken, was allgemein als nigrostriäre Bahn
bezeichnet wird.
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Einige
Symptome der Parkinson-Krankheit können durch Verabreichung von
L-3,4-Dihydroxyphenylalanin
(Levodopa oder L-Dopa) behandelt werden. L-Dopa, der metabolische
Vorläufer
von Dopamin, wird als Ersatztherapie verwendet, da Dopamin selbst
die Bluthirnschranke nicht überquert.
Es muss jedoch in großen
Dosen von 3 bis 15 g pro Tag gegeben werden, da viel von dem Wirkstoff
metabolisiert wird, bevor er die Wirkungsstelle im Hirn erreicht.
Alternativ wird es oft in Kombination mit einem Dopadecarboxylaseinhibitor,
wie Carbidopa, gegeben, der den Metabolismus von L-Dopa verhin dert, bis
dieses die Bluthirnschranke überquert
hat. Die größte Wirkung
erfolgt bei bradykinetischen Symptomen. Nach etwa 5 Jahren Behandlung
entwickeln sich Nebenwirkungen und die Behandlung wird weniger und
weniger wirksam, sogar mit zunehmenden Dosen des Wirkstoffs. Diese
Probleme haben zu der Frage geführt,
ob es möglich
wäre, verlorenes
Dopamin durch andere Mittel zu ersetzen, die den Wirkstoff an seiner
therapeutischen Wirkungsstelle innerhalb des zentralen Nervensystems
abgeben würden.
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Die
Erkenntnis, dass eine einseitige Läsion der nigrostriären Bahn
durch das Neurotoxin 6-Hydroxydopamin eine Asymmetrie von Bewegung
und Haltung bei der Ratte erzeugte, lieferte ein Tiermodell der
Parkinson-Krankheit. Diese Bewegungsasymmetrie wird angewendet in
dem Rotometermodell, das entwickelt wurde, um Drehverhalten, das
durch Wirkstoffe induziert wird, die die Dopaminneurotransmission
stören,
wie Apomorphin, zu messen. Das charakteristische durch Apomorphin
induzierte Drehverhalten wird nur bei Tieren mit einer 90 bis 95%igen Reduktion
des Dopaminpegels im Striatum beobachtet und ein Ersatz von Dopamin
in diesem Gewebe entweder durch Transplantate von fötalen Dopamin erzeugenden
Zellen oder Nebennierenmarkgewebe führt zu einer signifikanten
Abnahme des durch Apomorphin induzierten Drehverhaltens.
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Auch
wenn diese Ansätze
gut dokumentiert sind für
experimentelle Tiermodelle, bringt ihre Verwendung als Therapie
für neurodegenerative
Störungen,
wie Parkinson-Krankheit,
eine Anzahl praktischer und ethischer Überlegungen. Nicht nur die
Verwendung von Gewebe von menschlichen abgetriebenen Föten ist
ein kontrovers diskutierter Punkt, sondern diese Technik beinhaltet
auch komplizierte chirurgische Verfahren. Obwohl klinische Versuche
von Nebennieren- und Fötalgewebeimplantaten
bei Parkinson-Patienten
durchgeführt
wurden, bleibt weiterhin der Mechanismus und die Langzeitwirksamkeit von
Gewebetransplantaten im Nervensystem unklar und ist immer noch in
der medizinischen Debatte. Der beste theoretische Ansatz zur Behandlung
solcher Pathologien des zentralen Nervensystems ist weiterhin einer,
bei dem das biologisch aktive Mittel direkt in den geschädigten Bereich
des zentralen Nervensystems gebracht wird.
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Obwohl
eine Anzahl verschiedener Methoden vorgeschlagen wurde und derzeit
verwendet wird, um pharmazeutisch aktive Verbindungen in das zentrale
Nervensystem zu bringen (die Ausdrücke "Nervensystem" und "zentrales Nervensystem", wie sie hier verwendet
werden, werden allgemein austauschbar verwendet, was zeigt, dass
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung darin besteht, ein Mittel
zum Transport eines neuroaktiven Mittels direkt in das zentrale
Nervensystem bereitzustellen, während
ein weiterer Aspekt darin besteht, für eine Aufnahme der Mikrokügelchen
gemäß der vorliegenden
Erfindung durch Astrozyten zu sorgen, wo immer diese im Nervensystem
auftreten mögen),
gibt es ausreichend Nachteile für
jede Methode, dass die Notwendigkeit, biologisch aktive Substan zen
dem zentralen Nervensystem zuzuführen,
immer noch existiert. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit
diesem Bedürfnis
in einzigartiger Weise.
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Breit
definiert betrifft die vorliegende Erfindung teilweise Mikrokügelchen,
die als injizierbare Arzneimittelabgabesysteme entwickelt wurden,
in denen biologisch aktive Mittel in einem Polymer enthalten sind,
das mit Nervengewebe kompatibel ist. Der Ausdruck Mikrokügelchen,
wie er im Hinblick auf die vorliegende Erfindung verwendet wird,
schließt Mikrokapseln,
Nanokapseln, Mikroteilchen, Nanoteilchen und Nanokügelchen
ein.
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Mikrokapseln,
Mikrokügelchen
und Mikroteilchen sind üblicherweise
frei fließende
Pulver, die aus kugelförmigen
Teilchen mit 2 mm Durchmesser oder weniger, gewöhnlich 500 μm Durchmesser oder weniger bestehen.
Teilchen mit weniger als 1 μm
werden üblicherweise
als Nanokapseln, Nanopartikel oder Nanokügelchen bezeichnet. Der hauptsächliche Unterschied
zwischen einer Mikrokapsel und einer Nanokapsel, einem Mikrokügelchen
und einem Nanokügelchen
oder einem Mikroteilchen und einem Nanoteilchen ist die Größe; allgemein
gibt es wenig, falls überhaupt,
Unterschiede zwischen der inneren Struktur der beiden. Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist für die selektive Aufnahme von Mikrokapseln
in Astrozyten der mittlere durchschnittliche Durchmesser weniger
als etwa 45 μm,
bevorzugt weniger als 20 μm
und noch bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 10 μm.
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Bei
den Mikrokapseln oder Nanokapseln, wie sie erfindungsgemäß verwendet
werden, ist das verkapselte Material (in der vorliegenden Erfindung ist
dies ein biologisch aktives Mittel oder ein Wirkstoff) zentral innerhalb
einer einzigartigen Membran angeordnet. Diese Membran kann als Wand
bildendes polymeres Material bezeichnet werden. Wegen der inneren
Struktur setzen durchlässige
Mikrokapseln, die für
Anwendungen mit kontrollierter Abgabe vorgesehen sind, ihr Mittel
in einer konstanten Rate frei (als Abgaberate "nullter Ordnung" bezeichnet). Erfindungsgemäß schließen Mikrokapseln
allgemein Mikroteilchen ein, die einen Zentralkern umgeben von einer
polymeren Membran aufweisen.
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Außerdem beinhalten
Mikrokügelchen "monolithische" und ähnliche
Teilchen, in denen das biologisch aktive Mittel in dem Teilchen
dispergiert oder verteilt ist, d. h. die innere Struktur ist eine
Matrix aus biologisch aktivem Mittel und Polymerhilfsstoff. Gewöhnlich setzen
solche Teilchen ihre biologisch aktiven Mittel in einer abnehmenden
Rate (Abgaberate "erster
Ordnung") frei,
jedoch können
solche Teilchen so entwickelt werden, dass sie das innere Mittel
innerhalb der Matrix in einer Rate nahezu nullter Ordnung freisetzen.
Daher schließt
der Ausdruck Mikrokügelchen,
wie er erfindungsgemäß verwendet
wird, auch Mikroteilchen allgemein ein, die eine innere Struktur
aufweisen mit einer Matrix aus biologisch aktivem Mittel und Polymerhilfsstoff.
Bevorzugte Polymere gemäß der vorliegenden
Erfindung sind biokompatible Teilchen. Ein bevorzugteres Teilchen
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eines, das sowohl biologisch kompatibel als auch biologisch
abbaubar ist.
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Ein
bevorzugtes Polymer, das erfindungsgemäß angewendet wird, Poly(lactid-co-glycolid) hat eine
Anzahl von Vorteilen, die es für
das erfindungsgemäße Verfahren
einzigartig machen. Ein Vorteil dieses Polymers besteht darin, dass
es Materialien ähnlich
ist oder gleicht, die zur Herstellung von heutzutage verwendeten
resorbierbaren synthetischen Nahtmaterialien verwendet werden. Ein
weiterer Vorteil, den dieses Polymer mit annehmbaren erfindungsgemäßen Polymeren
teilt, ist es, dass dieses Material mit den Geweben des Nervensystems
biologisch kompatibel ist, einschließlich des zentralen Nervensystems.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass dieses Material in den
Geweben des zentralen Nervensystems biologisch abbaubar ist, ohne
irgendwelchen toxischen Nebenprodukte beim Abbau zu erzeugen. Noch
ein weiterer Vorteil dieses Materials ist die Fähigkeit, die Dauer der Wirkstoffabgabe
modifizieren zu können,
um indem die kinetischen Eigenschaften des Polymers manipuliert
werden, d. h. indem das Verhältnis
von Lactid zu Glycolid in dem Polymer modifiziert wird; dies ist
besonders wichtig, da die Fähigkeit,
neuroaktive Moleküle
an spezifische Bereiche des Hirns in einer kontrollierten Rate über einen
vorbestimmten Zeitraum abzugeben, eine wirksamere und wünschenswerte
Therapie gegenüber
derzeit bekannten Verabreichungsverfahren ist. Mikrokügelchen,
die mit diesem und ähnlichen
annehmbaren Polymeren hergestellt werden, dienen zwei Funktionen:
sie schützen
die Wirkstoffe vor einem Abbau und sie setzen Wirkstoffe in einer
kontrollierten Rate über
einen vorbestimmten Zeitraum frei. Obwohl bereits über Polymere
zur Verwendung in der Mikroverkapselung von Wirkstoffen berichtet
wurde, sind die physikalischen, chemischen und medizinischen Parameter
des mikroverkapselnden Polymers für neuroaktive Moleküle, die
zur Implantation im Nervensystem verwendet werden sollen (wie die
Implantation im zentralen Nervensystem) gemäß der vorliegenden Erfindung
eng begrenzt; es gibt keine allgemeine Äquivalenz unter Polymeren,
die es zulassen würde,
ein Polymer, das bisher zur Verkapselung von Wirkstoffen verwendet
wurde, frei gegen Polymere auszutauschen, die zum Einkapseln von
neuroaktiven Molekülen
zum Wirkstofftransport in das zentrale Nervensystem oder zur Zellaufnahme
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Dies trifft insbesondere zu, wenn die
Stelle der Verwendung das zentrale Nervensystem ist.
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Obwohl
die in den Beispielen, die in dieser Beschreibung enthalten sind,
beschriebenen spezifisch benannten Polymere die Kriterien erfüllen, die notwendig
sind für
eine Implantation im zentralen Nervensystem, können andere biologisch kompatible,
biologisch abbaubare Polymere und Copolymere mit Vorteilen und ähnlichen
Eigenschaften, wie Po ly(lactid-co-glycolid) dieses ersetzen. Beispiele
für bevorzugte
Polymere mit den Eigenschaften der biologischen Kompatibilität und biologischen
Abbaubarkeit schließen
Poly(lactid-co-glycolid)-Copolymer; Polylactidhomopolymer; Polyglycolidhomopolymer; Polycaprolacton;
Polyhydroxybutyrat-Polyhydroxyvalerat-Copolymer; Poly(lactid-co-caprolacton);
Polyesteramide; Polyorthoester; Poly-β-hydroxybuttersäure und
Polyanhydride ein. Zusätzlich
zu Polymeren, die sowohl biologische Kompatibilität als auch
biologische Abbaubarkeit aufweisen, die verwendet werden, um Mikrokügelchen
zur Abgabe bzw. zum Transport von neuroaktiven Mitteln in das zentrale Nervensystem
zu synthetisieren, können
nicht biologisch abbaubare aber biologisch kompatible Polymere verwendet
werden, um Mikrokügelchen
für den zweiten
Aspekt der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren, d. h. zur Aufnahme
von Mikrokügelchen durch
Astrozyten. Solche biologisch kompatiblen aber nicht biologisch
abbaubaren Polymeren schließen
Polydiene, wie Polybutadien; Polyalkene, wie Polyethylen oder Polypropylen;
Polymethacrylpolymere, wie Polymethylmethacrylat oder Polyhydroxyethylmethacrylat;
Polyvinylether; Polyvinylalkohole; Polyvinylchloride; Polyvinylester,
wie Polyvinylacetat; Polystyrol; Polycarbonate; Polyester; Celluloseether, wie
Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulose;
Celluloseester, wie Celluloseacetat oder Celluloseacetatbutyrat;
Polysaccharide und Stärken
ein.
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Ergebnisse,
die bei einer Anzahl von Untersuchungen erhalten wurden, deuten
darauf hin, dass die Implantation dieser ein neuroaktives Mittel
enthaltenden Mikrokügelchen
eine Methode liefert für
die längere
Freisetzung des Mittels in das zentrale Nervensystem.
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Außerdem deuten
die Daten, die bei Studien erhalten wurden, die Dopamin als eingekapseltes Mittel
beinhalteten, darauf hin, dass Dopaminmikrokügelchenpräparate das Potenzial haben,
als Quelle für
einen Transmitterersatz angewendet zu werden, was die Diffusion
des mikroverkapselten Dopamins direkt in das zentrale Nervensystem
in kontrollierter Rate über
vorbestimmte Zeiträume
zulässt,
was die funktionelle Bedeutung sicherstellt und gleichzeitig mit
dem Gewebe des zentralen Nervensystems kompatibel bleibt. Höchst überraschend
deuten die Daten jedoch darauf hin, dass mikroverkapseltes Dopamin, das
in spezifische Bereiche des Hirns injiziert wird, die bisher nicht
berichtete Fähigkeit
hat, das Wachstum von Nervenfasern zu verursachen. Somit hat die Methode,
mikroverkapselte neuroaktive Mittel, die gemäß einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurden, zu platzieren, das Potenzial, das Wachstum
von solchen Neuralelementen oder Nervenelementen zu fördern, die
für die
Erzeugung von endogenem Dopamin im zentralen Nervensystem verantwortlich
sind. Sobald Wachstum stattgefunden hat und die Nervenfaserelemente
gereift sind und sich innerhalb ihrer Umgebung stabilisiert haben, fahren
sie darin fort, Dopamin zu erzeugen und innerhalb des zentralen
Nerven systems freizusetzen, wodurch zum ersten Mal eine mögliche Heilung
für die Parkinson-Krankheit geschaffen
wird.
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Zu
den neuroaktiven Molekülen
oder Mitteln, die gemäß der vorliegenden
Erfindung mikroverkapselt und verabreicht werden können, gehören Neurotransmitter;
Neuropeptide und neurotrophe Faktoren, einschließlich solcher Mittel, wie Norepinephrin;
Epinephrin, Serotonin; Dopamin; Substanz P; Somatostatin; Nervenwachstumsfaktor;
Angiotensin II; Corticotropin freisetzender Faktor; Cholin; Acetylcholin; cholinerge
neuronotrophe Mittel; basischer Fibroblastenwachstumsfaktor; saurer
Fibroblastenwachstumsfaktor; aus dem Hirn stammender Wachstumsfaktor;
Nervenwachstumsfaktor; Insulinwachstumsfaktor; transformierender
Wachstumsfaktor β;
epidermaler Wachstumsfaktor; transformierender Wachstumsfaktor;
von Glia stammender Wachstumsfaktor; Östrogen; anorganische Verbindungen,
die zur Behandlung von Depressionen verwendet werden, wie Lithium; γ-Aminobuttersäure; γ-Aminobuttersäuremimetika;
Oxytocin; Phenylethylamin und Interleukin-1.
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Zu
den neurologischen Bedingungen, die mit mikroverkapselten neuroaktiven
Mitteln behandelt werden können,
die direkt in die Gewebe des zentralen Nervensystems gebracht werden,
gehören
Rückenmarksverletzungen;
amyotrophe Lateralsklerose; Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, Alzheimer-Krankheit,
Epilepsie und tardive Dyskinesie. Abhängig von der zu behandelnden
Krankheit kann es vorteilhaft sein, mehr als einen mikroverkapselten Neurotransmitter,
ein mikroverkapseltes Neuropeptid und einen mikroverkapselten neurotrophen
Faktor zum zentralen Nervensystem zu bringen. Da z. B. Dopamin,
Cholecystokinin und epidermaler und basischer Fibroblastenwachstumsfaktor
alle an der Parkinson-Krankheit beteiligt sind, kann es schließlich vorteilhaft
sein, wenn es sich um einen Patienten mit der Krankheit handelt,
eine Mischung von Mikrokapseln bereitzustellen, die zwei oder mehr
neural aktive Moleküle
für das
zentrale Nervensystem enthalten (siehe Beispiel 4). Außerdem besteht
eine alternative Methode zum Transport der neuroaktiven Mittel in das
zentrale Nervensystem darin, Astrozytenexplantate bereitzustellen,
d. h. Astrozyten, die in manuell hergestellter Gewebekulturumgebung
gesammelt und gezüchtet
wurden, die polymeren Mikrokügelchen
ausgesetzt wurden, die neuroaktive Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung
verkapselt enthalten, und nachdem die Astrozyten die Mikrokügelchen aufnehmen
gelassen wurden (d. h. um eine Kultur von Astrozyten zu erhalten,
die die polymeren Mikrokügelchen
in ihrer Zellmembran aufweisen) diese mikrokügelchenhaltigen Astrozyten
direkt in das zentralen Nervensystem zu transplantieren.
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Um
eine vollständigere
Beschreibung zu liefern und ein besseres Verständnis der verschiedenen Aspekte
der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen, wird auf die folgenden
Beispiele Bezug genommen.
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Beispiel 1
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Herstellung
von Dopaminmikrokügelchen
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Eine
1 gew.-%-ige Polymerlösung
wurde hergestellt, indem 2 g 50 : 50 Poly(DL-lactid-co-glycolid) ("DL-PLG") in 198 g Dichlormethan
gelöst
wurden (das DL-PLG hat eine innere Viskosität von 1,27 dl/g). 2 g Dopamin
(3-Hydroxytyraminhydrochlorid) wurden in der Polymerlösung durch
Homogenisierung suspendiert. Die Dopaminsuspension wurde dann in
einen 300-ml-Harzkessel gegossen und mit 3.500 U/min mit einem Teflonrührer mit
1,5 inch (3,81 cm) gerührt.
Siliconöl
mit 350 mm2/s (350 cs) wurde in den Harzkessel
mit einer Rate von 2 ml/min gepumpt. Nachdem ungefähr 50 ml Öl zugegeben
worden waren, wurde der Inhalt des Harzkessels in 3,5 l Heptan gegossen.
Das Heptan wurde mit 900 U/min mit einem Rührer aus rostfreiem Stahl mit
2,5 inch gerührt.
Nach 0,5-stündigem
Rühren
wurde die Dopaminmikrokügelchensuspension
durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit Öffnungen mit 45 μm gegossen, um
Mikrokügelchen
zu entfernen, die einen Durchmesser von mehr als 45 μm hatten.
Mikrokügelchen mit
einem Durchmesser von weniger als 45 μm wurden auf einem Glasfrittenfiltertrichter
gesammelt und bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen 48 Stunden
lang getrocknet. Die Dopaminmikrokügelchen wurden dann in tarierten
Glasszintillationsgläschen gesammelt
und mit einem Trocknungsmittel bei 4°C aufbewahrt.
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Dopamin
wurde in zwei Arten von Copolymerhilfsstoffen eingekapselt, die
gemäß Beispiel
1 hergestellt wurden. Ein Copolymer hatte ein Molverhältnis von
Lactid zu Glycolid von 50 : 50 und das andere Copolymer hatte ein
Molverhältnis
von 65 : 35. Im Hinblick auf den höheren Lactidgehalt des 65 : 35-Copolymers
wird es länger
dauern, dieses Copolymer biologisch abzubauen, als bei dem 50 :
50-Copolymer. Somit kann die Abgabezeit des 65 : 35-Copolymers länger sein
als die Abgabezeit des 50 : 50-Copolymers. Zusätzliche Variationen der tatsächlichen
Anteile von Lactid und Glycolid in dem Copolymer und der Copolymermorphologie
können
erzeugt werden, um die Rate und Menge des in das zentrale Nervensystem
freizusetzenden neuroaktiven Moleküls mehr oder weniger auf den
Verbraucher bzw. Patienten einzustellen.
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Die
fertigen Mikrokügelchen
sind frei fließende
Pulver, die aus kugelförmigen
Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 bis 45 μm bestehen. Diese
Mikrokügelchen
können leicht
in wässrigen Trägern suspendiert
werden und mit üblichen
Injektionsnadeln injiziert werden. Obwohl die Menge an Dopamin,
die in jedem Mikrokügelchen
enthalten ist, variieren kann, bestanden die im folgenden Beispiel hergestellten
und verwendeten Mikrokügelchen
aus etwa 40% (bezogen auf Gewicht) Dopamin und etwa 60% (bezogen
auf Gewicht) Poly(DL-lactid-co-glycolid). Wenn sie als therapeutisches
Mittel verwendet werden, können
die Mikrokügelchen
etwa 1 bis etwa 80% [bezogen auf Gewicht] Dopamin enthalten. In-vitro-Diffusionstests
dieser Mikrokügelchen
zeigten, dass das meiste Dopamin innerhalb von 30 Minuten in deionisiertes
Wasser freigesetzt wurde. Vor der Injektion wurden die Mikrokügelchen
bevorzugt mit Gammastrahlung sterilisiert.
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Beispiel 2
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Implantation von Mikrokügelchen
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Mikroverkapseltes
Dopamin wurde zur Implantation in vorbehandelte Rattenmodelle formuliert (15
mg 50 : 50 mikroverkapseltes Dopamin in 50 μl Kochsalzlösung oder 30 mg 65 : 35 mikroverkapseltes
Dopamin in 50 μl
Kochsalzlösung).
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Männliche
Sprague-Dawley-Ratten wurden einseitig im aufsteigenden mittleren
Vorderhirnbündel
von Monoaminneuronen geschädigt
unter Verwendung des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin. Zwei Wochen später wurden
die Tiere mit Apomorphin (0,1 mg/kg SC) beaufschlagt und das Drehverhalten
wurde in einem computerisierten Rotometeraufbau überwacht. Nur Ratten, bei denen
die Dopamindenervierung erfolgreich war, zeigen starke kontralaterale Drehung
nach Apomorphinbeaufschlagung. Tiere, die auf Apomorphin mit weniger
als 400 kontralateralen Drehungen pro 60 Minuten während der
ersten zwei Wochen des Tests ansprachen, wurden daher aus der Untersuchung
genommen. Das Testen von positiven Respondern wurde wöchentlich
fortgesetzt unter Verwendung von Apomorphin.
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Sobald
die Tiere einen stabilen Drehgrundlinienpegel gegenüber einer
Beaufschlagung bzw. einem Test mit dem Dopaminagonisten erreicht
hatten, wurde ihnen unter leichter Etheranästhesie eine Suspension von
Dopaminmikrokügelchen
stereotaxisch injiziert. Dopamin/50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen (15
mg Mikrokügelchen/50 μl Kochsalzlösung) wurden
in 3 μl
Implantaten in das Striatum injiziert. Dopamin/65 : 35-DL-PLG-Mikrokügelchen
wurden entsprechend in das Striatum implantiert (30 mg Mikrokügelchen/50 μl Kochsalzlösung). Aus
Erfahrung wurde erwartet, dass die 65 : 35-DL-PLG-Mikrokügelchen
sich in etwa 12 Wochen vollständig
biologisch abbauen würden
und die 50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen
dies in etwa 6 Wochen tun würden.
Um sicherzustellen, dass pro Zeit einheit gleiche Dosen an Dopamin
freigesetzt werden, war die Menge an Dopamin in den 50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen
die Hälfte
von der in den 65 : 35-DL-PLG-Mikrokügelchen. Kontrollratten erhielten
dopaminfreie Mikrokügelchen.
Standard-Hamilton-Spritzen (50 μl),
die über
Polyethylenschläuche
mit Injektionskanülen
aus rostfreiem Stahl verbunden waren, wurden für die Injektionen verwendet.
Nach Abschluss der Injektion wurde die Kanüle weitere 60 Sekunden lang
in situ belassen, bevor sie langsam herausgezogen wurde und die
Hautwunde verschlossen wurde. Beginnend 1 bis 3 Tage nach Implantation
der Dopaminmikrokügelchen
wurden die Tiere wiederholt auf durch Dopaminagonist induzierte
Drehung in verschiedenen Intervallen über einen Zeitraum von 8 Wochen
getestet.
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30
bis 40 Minuten nach der intrastriären Implantation des mikroverkapselten
Dopamins zeigten die Ratten, die Dopamin/50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchenimplantat
erhalten hatten, kontralaterale Drehungen mit einer Amplitude ähnlich der
einer vorherigen Testdosis von Apomorphin, aber mit längerer Dauer.
Die Ratten, die Dopamin/65 : 35-DL-PLG-Mikrokügelchenimplantat erhalten hatten,
zeigten eine etwas stärker
verzögerte
Antwort auf die Implantation, sobald diese Tiere jedoch begonnen
haben, haben sie eine Spitzendrehamplitude ähnlich der von den Tieren,
die Dopamin/50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen erhalten haben. Leere
Mikrokügelchen
wurden auch als Kontrolle verabreicht und diese modifizierten das
durch Apomorphin induzierte Drehverhalten bei der Ratte nicht. Histologische
Auswertungen, die an getöteten
Tieren vorgenommen wurden, deuten darauf hin, dass die Injektion
einer Suspension von Mikrokügelchen
der vorliegenden Erfindung in das Rattenhirn ein akzeptables Mittel
ist, um Dopamin in das zentrale Nervensystem abzugeben; nur eine
minimale Schädigung
des umgebenden Gewebes und eine minimale Reaktion der Glia wurde
nach Injektion festgestellt. Es bestehen daher wenig Bedenken, dass
eine morphologische Barriere existiert, die die Diffusion von Dopamin
in den Zielbereich verhindern könnte.
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Es
wurde somit die ursprüngliche
Annahme bestätigt,
dass die spezifischen erfindungsgemäßen polymeren Mikrokügelchen
ein einzigartiges und annehmbares Mittel liefern, um neuroaktive
Moleküle
in das zentrale Nervensystem zu bringen.
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Das
herausragendste Ergebnis des Transports von Dopamin in das zentrale
Nervensystem unter Verwendung der erfindungsgemäßen Methode und der erfindungsgemäßen Mikrokügelchen
ist die Erkenntnis, dass in Gegenwart von Dopamin immunoreaktive
Fasern zu den Dopaminmikrokügelchen wachsen.
Dies wurde bei den Kontroll-(Mikrokügelchen, die kein Dopamin enthalten)-Mikrokügelchenimplantaten
nicht beobachtet. Die Fähigkeit
von implantierten Dopaminmikrokügelchen,
die erfindungsgemäß hergestellt
und implantiert wurden, ein neuronales Sprießen hervorzurufen, kann nicht
nur eine Behandlung für
neurologisch schwächende
Krankheiten, wie Parkinson-Krankheit, sondern auch eine Heilung
bieten.
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Als
Teil der fortschreitenden Forschung in Bezug auf den direkten Transport
von neuroaktiven Molekülen
in das Gehirn wurde ein Antikörper
für Dopamin
entwickelt, der keine Kreuzreaktivität mit anderen Neurotransmittersystemen
(wie Norepinephrin, Serotonin oder γ-Aminobuttersäure) zeigt, wenn
er in ELISA-Testsystemen verwendet wird. Es wurde gezeigt, dass
dieser Antikörper
sowohl in ELISA- als auch in immunozytochemischen Testsystemen Dopamin
erkennt und ein zuverlässiges
Mittel ist, um ein Auswachsen von Fasern im Rattengehirn darzustellen,
wie im folgenden Beispiel dargestellt:
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Beispiel 3
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Faserbildung
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Der
Immunogenkomplex, um Antikörper
gegen Dopamin zu erhalten, wird hergestellt, indem das Hapten an
Glutaraldehyd (G) und Rinderserumalbumin (BSA) gekuppelt wird. Kaninchen
werden dann mit diesem Immunogen immunisiert. Antikörper, die gegen
Dopamin gerichtet sind, wurden 50 Tage nach dem Immunisierungsplan
von 4 Injektionen in Intervallen von 10 Tagen, nachgewiesen. Um
Antikörper zu
eliminieren, die gegen BSA-G
erzeugt wurden, wurde der Dopaminantikörper durch Affinitätschromatographie
adsorbiert. Um Dopamin im Hirngewebe sichtbar zu machen, wurde Ratten
Glutaraldehyd perfundiert, wodurch Dopamin und Gewebeproteine fixiert
wurden. Da der Antikörper
gegen Dopamin-Glutaraldehyd und ein Protein gerichtet ist, wird der
Antikörper
diesen Komplex im Gehirn erkennen. Die Ratten wurden tief anästhesiert
mit Natriumpentobarbital und durch die Aorta wurde eine Mischung perfundiert,
die aus 5% Glutaraldehyd und einem Antioxidans aufgebaut war, um
die schnelle Freisetzung von Dopamin aus dem Hirngewebe zu verhindern. Nachdem
den Ratten diese Mischung perfundiert worden war, wurden die Hirne
entfernt und über Nacht
in 10% Saccharoselösung
equilibrieren gelassen. Die Gehirne wurden dann eingefroren, seziert und
die Schnitte mit Antidopamin-Antiserum
24 Stunden lang inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Schnitte
mit Ziege-Antikaninchen-Biotin-IgG
umgesetzt, das das in dem Kaninchen erzeugte Antiserum erkennt.
Danach wurden die Schnitte mit Avidin-Biotin-Peroxidasekomplex inkubiert,
der fixierte Biotinmoleküle
erkennt. Die Peroxidase wurde dann mit einem klassischen Chromatogen
für diese
Art von Reaktion, 3,3-Diaminobenzidin, umgesetzt und die Reaktion
durch Zugabe von Ammoniumnickelsulfat verstärkt, was der Antikörperreaktion
eine Purpurfarbe gab. Daher wird die Gegenwart von Dopamin im Hirngewebe
als purpurfarbige Abscheidung im Gewebe sichtbar gemacht; wenn Dopamin
nicht im Gewebe vorhanden ist, bleiben die Gewebe ungefärbt.
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Zusätzlich zu
Dopamin wurde auch Noradrenalin in Mikrokügelchen gemäß der vorliegenden Erfindung
verkapselt und, wie oben beschrieben, getestet mit ähnlichen
Ergebnissen. Mit noradrenalinhaltigen Mikrokügelchen, die wie in Beispiel
2 beschrieben, implantiert wurden, war die Dauer der Abnahme des
durch Apomorphin induzierten Drehverhaltens länger mit Noradrenalin, das
in 50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen
verkapselt war, als mit Dopamin, das in 50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen verkapselt
war. In einer Vergleichsstudie wurde 15 Wochen nach Implantation
eine 35%ige Abnahme (65% der Grundlinie) bei Tieren beobachtet,
denen Noradrenalin/50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen implantiert worden
waren; eine 40%ige Abnahme (60% der Grundlinie) wurde bei Tieren
beobachtet, denen Dopamin/65 : 35-DL-PLG-Mikrokügelchen implantiert worden
waren und < 5%
(> 95% der Grundlinie) wurde
bei Tieren beobachtet, die leere DL-PLG-Mikrokügelchen erhalten hatten.
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Beispiel 4
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Wachstum von
Nervenfasern nach Implantation von noradrenalinhaltigen Mikrokügelchen
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Für die Sichtbarmachung
von Nervenfasern oder Neuralfasern nach Implantation der noradrenalinhaltigen
Mikrokügelchen,
wurde ein Antikörper, der
gegen Tyrosinhydroxylase gerichtet ist, ein Enzym, das sich in der
geschwindigkeitsbeschränkenden
Stufe sowohl für
Dopamin als auch Noradrenalin findet, verwendet. Für die Tyrosinhydroxylaseimmunchemie
erhielten die Ratten eine Überdosis
von Natriumpentobarbital und durch Perfusion fixiert mit 4% Paraformaldehyd,
wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Hirne wurden nach 4 Stunden in
der Paraformaldehydlösung
nachfixiert und dann über
Nacht in phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 10% Saccharose enthielt,
eingetaucht. Kryostatschnitte wurden dann über Nacht mit Antityrosinhydroxylaseantikörper (1/800)
inkubiert und weiterverarbeitet durch übliche Avidin-Biotin-Peroxidasemethodik.
Tyrosinhydroxylase, die in den Schnitten vorhanden ist, ist leicht
als purpurfarbige Abscheidung zu erkennen.
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Das
Faserwachstum nach Implantation von Noradrenalinmikrokügelchen
ist vergleichbar dem, das nach Implantation von Dopaminmikrokügelchen festgestellt
wird. Ultrastrukturergebnisse bestätigen die Gegenwart von Tyrosinhydroxylase-immunreaktiven
Fasern, die in das Striatum wachsen bis zu 4 Monate nach der Mikrokügelchenimplantation.
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In
einer ähnlichen
Studie wurde eine gleiche Mischung aus Dopamin verkapselt in 50
: 50-DL-PLG-Mikrokügelchen
und Noradrenalin verkapselt in 50 : 50-DL-PLG-Mikrokügelchen
implantiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das Implantieren dieser
Mischung aus Mikrokügelchen
erzeugte signifikante Reduktionen der Anzahl von durch Apomorphin
induzierten Drehungen bis zu 3 Monate lang; zwei Tiere in der Testgruppe
zeigten 4 Wochen lang eine 80%ige (% Grundlinie) Reduktion in der
Anzahl der durch Apomorphin induzierten Drehungen. Eine solche dramatische
Reduktion der Anzahl von durch Apomorphin induzierten Drehungen
wurde bei Versuchen mit der Implantation von Mikrokügelchen,
die nur Dopamin oder nur Noradrenalin enthielten, nicht beobachtet.
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Die
folgenden Beispiele sollen alternative polymere Mikrokügelchen
zeigen, die erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Beispiel 5
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Herstellung
von Dopaminmikrokügelchen
mit Polycaprolacton unter Verwendung eines Phasentrennverfahrens
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Eine
2 gew.-%-ige Polymerlösung
wurde hergestellt, indem 1 g Polycaprolacton in 49 g Dichlormethan
gelöst
wurde. (Das Polycaprolacton hatte eine innere Viskosität von 1,0
dl/g.) 1 g Dopamin (3-Hydroxytyraminhydrochlorid) war in der entstehenden
Polymerlösung
suspendiert. Die Dopamin/Polymermischung wurde dann in einen 100-ml-Harzkessel gegossen.
Während
der Inhalt des Harzkessels mit 3.500 U/min mit einem Teflonrührer mit
3,81 cm (1,5 inch) gerührt
wurde, wurde Siliconöl,
350 mm2/s (350 cs) in den Harzkessel gepumpt
in einer Rate von 0,6 ml/min. Nachdem ungefähr 8 ml Öl zugegeben worden waren, wurde
der Inhalt des Harzkessels in 3 l Heptan gegossen. Das Heptan wurde
mit 500 U/min mit einem Rührer
aus rostfreiem Stahl mit 6,35 cm (2,5 inch) gerührt. Nach 0,5 Stunden Rühren wurden
die Dopaminmikrokügelchen
auf einer Glasfrittennutsche bzw. einem Glasfrittentrichter gesammelt
und bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen 48 Stunden lang getrocknet.
Die Mikrokügelchen
wurden durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit Öffnungen mit 45 μm prozessiert,
um Mikrokügelchen
zu entfernen, deren Durchmesser größer als 45 μm war. Die Dopaminmikrokügelchen wurden
dann in tarierten Glasszintillationsgläschen gesammelt und unter einem
Trocknungsmittel bei 4°C
aufbewahrt.
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Beispiel 6
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Herstellung
von Dopaminmikrokügelchen
mit Polycaprolacton unter Verwendung eines Lösungsmittelextraktionsverfahrens
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Eine
20 gew.-%-ige Polymerlösung
wurde hergestellt, indem 1 g Polycaprolacton in 4 g Dichlormethan
gelöst
wurde. (Das Polycaprolacton hatte eine innere Viskosität von 1,0
dl/g.) Eine Dispersion wurde gebildet, indem 1 g Dopamin (3-Hydroxytyraminhydrochlorid)
in der Polymerlösung
suspendiert wurde. Es wurde eine Emulsion gebildet, als die Dopamin/Polymerdispersion
in einen 300-ml-Harzkessel überführt wurde,
der 188 g Prozessmedium enthielt, und mit 1200 U/min mit einem Teflonrührer mit 3,81
cm (1,5 inch) gerührt
wurde. Das Prozessmedium bestand aus 5 Gew.-% Poly(vinylalkohol)
und 16 Gew.-% Calciumchlorid, das mit 4,4 g Dichlormethan gesättigt war.
Nach 1 Minute Rühren
wurden die Dopaminmikrokügelchen
gehärtet,
indem das Dichlormethan aus den Mikrokügelchen extrahiert wurde. Diese
Extraktion erfolgte, indem der Inhalt des Harzkessels in ein Bad
gegeben wurde, das 1022 g einer 32 gew.-%-igen Calciumchloridlösung, die
mit 200 U/min gerührt
wurde, enthielt. 10 und 20 Minuten nach der Zugabe wurden 500 ml
Wasser langsam zu dem Extraktionsbad zugegeben. (Gesamtextraktionszeit
war 30 Minuten.) Der Inhalt des Extraktionsbades wurde dann mit
1800 × G
45 Minuten lang zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die
Mikrokügelchen
auf einem Glasfrittentrichter gesammelt und bei Raumtemperatur in
einem Vakuumofen 48 Stunden lang getrocknet. Die Mikrokügelchen
wurden durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit Öffnungen mit 45 μm prozessiert,
um Mikrokügelchen
zu entfernen, die einen Durchmesser von mehr als 45 μm hatten.
Die Dopaminmikrokügelchen
wurden dann in tarierten Glasszintillationsgläschen gesammelt und unter einem
Trocknungsmittel bei 4°C
aufbewahrt.
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Beispiel 7
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Herstellung
von Dopaminmikrokügelchen
mit Polyhydroxybutyrat/Polyhydroxyvalerat-Copolymer unter Verwendung eines Lösungsmittelextraktionsverfahrens
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Eine
15 gew.-%-ige Polymerlösung
wurde hergestellt, indem 0,75 g Polyhydroxybutyrat/Polyhydroxyvalerat-Copolymer
(PHBV) in 4,3 g Dichlormethan gelöst wurden. Eine Dispersion
wurde gebildet, indem 1 g Dopamin (3-Hydroxytyraminhydrochlorid) in
der Polymerlösung
suspendiert wurde. Eine wurde Emulsion gebildet, als die Dopamin/Polymerdispersion
in einen 300-ml-Harzkessel überführt wurde,
der 179 g Prozessmedium enthielt und mit 1400 U/min mit einem Teflonrührer mit
3,81 cm (1,5 inch) gerührt wurde.
Das Prozessmedium bestand aus 5 Gew.-% Poly(vinylalkohol), das mit
4,3 g Dichlormethan gesättigt
war. Nach 1 Minute Rühren
wurden die Dopaminmikrokügelchen gehärtet, indem
das Dichlormethan aus den Mikrokügelchen
extrahiert wurde. Diese Extraktion erfolgte, indem der Inhalt des
Harzkessels in ein Bad gegeben wurde, das 1021 g Wasser enthielt,
das mit 740 U/min gerührt
wurde. Nach 30-minütigem
Rühren
wurden die Mikrokügelchen
mit 1800 × G
45 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurden die Mikrokügelchen
auf einem Glasfrittentrichter gesammelt und bei Raumtemperatur in
einem Vakuumofen 48 Stunden lang getrocknet. Die Mikrokügelchen
wurden durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit Öffnungen mit 45 μm prozessiert,
um Mikrokügelchen
zu entfernen, deren Durchmesser größer als 45 μm war. Die Dopaminmikrokügelchen
wurden dann in tarierten Glasszintillationsgläschen gesammelt und unter einem
Trocknungsmittel bei 4°C
aufbewahrt.
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Beispiel 8
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Herstellung von Norepinephrinmikrokügelchen
mit 55 : 45 Poly(DL-lactid-co-glycolid) unter Verwendung eines Phasentrennverfahrens
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Eine
2 gew.-%-ige Polymerlösung
wurde hergestellt, indem 3 g 55 : 45 DL-PLG in 150 g Dichlormethan
gelöst
wurden (das DL-PLG hatte eine innere Viskosität von 1,0 dl/g). 3 g Norepinephrin wurden
in der entstehenden Polymerlösung
suspendiert. Die Norepinephrin/Polymermischung wurde dann in ein
250-ml-Becherglas gegossen und in einem Eisbad auf 20°C gehalten.
Während
der Inhalt des Becherglases mit 4.500 U/min mit einem Silverson-Emulgator
gerührt
wurde, wurde Siliconöl
(350 mm2/s, 350 cs) in das Becherglas in
einer Rate von 1,9 ml/min gepumpt. Nachdem ungefähr 47 ml Öl zugegeben worden waren, wurde
der Inhalt des Becherglases in 4,5 l Heptan gegossen. Die entstehende
Mischung wurde mit 1.000 U/min mit einem Rührer aus rostfreiem Stahl mit
6,35 cm (2,5 inch) gerührt.
Nach 30 Minuten wurden die Norepinephrinmikrokügelchen auf einem Glasfrittentrichter
gesammelt und bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen 48 Stunden
lang getrocknet. Die Mikrokügelchen wurden
durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl prozessiert mit Öffnungen
mit 45 μm,
um Mikrokügelchen
zu entfernen, deren Durchmesser größer als 45 μm war.
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Beispiel 9
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In-vitro-Freisetzungsmethode
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Etwa
10 mg Dopaminmikrokügelchen
wurden in ein Polystyrolkulturröhrchen
(17 mm × 100 mm)
eingewogen und dann 6 ml Aufnahmefluid (destilliertes Wasser) in
das Kulturröhrchen
zugegeben. Ein Serumfilter (16 mm × 4 mm) wurde in das Kulturröhrchen gelegt und
die untere Kante des Filters wurde direkt über der Oberfläche des
Aufnahmefluids positioniert. Die entstehende Anordnung wurde in
ein Teströhrchengestell
gestellt und dann in einen Inkubator gestellt, der auf 37°C gehalten
wurde.
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Eine
Aufnahmefluidprobe wurde gesammelt, indem der Filter zum Boden des
Kulturröhrchens
gedrückt
wurde, bis so viel Aufnahmefluid, wie möglich, über das Filter gedrückt wurde.
Dieses Aufnahmefluid wurde dann für die quantitative Auswertung
von Dopamin aufbewahrt. Dann wurden 6 ml frisches Aufnahmefluid
in das Kulturröhrchen überführt und
das Filter wieder über
dem Aufnahmefluid angeordnet.
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Die
Anordnung wurde wieder in den Inkubator gestellt, bis die nächste Probe
gesammelt wurde. In-vitro-Freisetzungsproben wurden nach 15, 30,
45, 60, 120, 240 und 1.440 Minuten gesammelt. Die Proben wurden
spektrophotometrisch auf Dopamin bei 292 nm quantitativ ausgewertet.
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Wie
in Beispiel 2 angegeben, modifizierte die Implantation von Kontrollmikrokügelchen
das durch Apomorphin induzierte Drehverhalten bei der Ratte nicht,
was auf eine mindestens 95%ige Abnahme von Dopamin im zentralen
Nervensystem hindeutet. Mikroskopische Untersuchungen der Gewebe
nach Anfärben
gemäß Beispiel
3 bestätigten,
dass Dopamin im Striatum der Ratten, die Kontrollmikrokügelchen erhielten,
nicht vorhanden war, d. h. das Gehirngewebe blieb ungefärbt. Bei
Tieren, die Dopaminmikrokügelchen
erhielten und eine kontinuierliche Abnahme des durch Apomorphin
induzierten Drehverhaltens zeigten, zeigten mikroskopische Untersuchungen
jedoch, dass Dopamin sowohl in den Mikrokügelchen als auch im Gewebe
vorhanden war. Wie vorher angegeben, wurden zahlreiche feine Faserextensionen gesehen,
die zu den implantierten Mikrokügelchen wuchsen
und Dopamin war in diesen Fasern vorhanden. Diese Erkenntnisse deuten
darauf hin, dass Dopaminnervenfasern im zentralen Nervensystem des Wirtstieres
wuchsen, ein bisher nicht berichtetes Phänomen. Die implantierten dopaminhaltigen
Mikrokügelchen
haben offensichtlich die Fähigkeit,
ein Wachstum der Nervenfasern aus dem ventralen Teil des Hirns hin
zu den Mikrokügelchen
hervorzurufen. Diese Fasern waren bei allen Tieren vorhanden, die eine
kontinuierliche Abnahme der Anzahl von durch Apomorphin induzierten
Drehungen zeigten, was auf einer Freisetzung von Dopamin aus den
Mikrokügelchen
zu beruhen scheint ebenso wie das Wachsen von Dopaminfasern im zentralen
Nervensystem des Wirts. Ähnliche
Beobachtungen wurden festgestellt sowohl für 50 : 50-DL-PLG- als auch
65 : 35-DL-PLG-Dopaminmikrokügelchen.
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Die
anatomische Anordnung der Dopaminmikrokügelchen scheint wichtig zu
sein sowohl für Faserwachstum
als auch funktionelle Rekonvaleszenz, wenn die Anordnung innerhalb des
Hirns erfolgt. Ein Rattenstriatum ist etwa 3 mm breit und 4 mm tief.
Dopaminfasern, die aus dem ventralen Teil des Hirns wachsen, sind
hauptsächlich
eher im mittleren ventralen Teil des Striatums als im extrem lateralen
Teil dieses Nucleus angeordnet. Das Anordnen von Dopaminmikrokügelchen
im ventralen Teil des Rattenhirns stimuliert das Wachstum dieser
speziellen Fasern. Es scheint so, dass die Diffusion von Dopamin
aus diesen Mikrokügelchen,
die an diesem Ort platziert wurden, diese Fasern erreicht und diese
zu den Mikrokügelchen
wachsen. Die extrem laterale Anordnung von dopaminhaltigen Mikrokügelchen scheint
daher zu weit entfernt zu sein, als dass aus den Mikrokügelchen
diffundiertes Dopamin diese Fasern beeinflussen könnte.
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Immunozytochemische
Untersuchungen mit einem Antikörper
auf Wachstum assoziiertes Protein, einem Protein, das mit Systemen,
die einem Faserwachstum unterliegen, assoziiert ist, zeigte, dass
die wachsenden Fasern mit diesem Protein reaktiv waren, ein Hinweis,
dass die Nervenfasern einem Faserwachstum unterliegen. Die Injektion
von Fluorgold in das entnervte Striatum 2 Wochen nach Implantation
von Dopaminmikrokügelchen
zeigt eine retrograde Markierung von Neuronen innerhalb der ventralen Tegmentumregion,
was darauf hindeutet, dass die Dopaminmikrokügelchen das Wachstum von Dopaminfasern
anschalten, die aus Nervenzellen in diesem Bereich entspringen.
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Eine
weitere Beobachtung des Wachstums von Fasern wurde gemacht, wenn
die Mikrokügelchen
in das Striatum eines genetischen Mausmodells implantiert wurden.
Der Weaver-Mausstamm trägt eine
autosomal rezessive Mutation und liefert Forschern ein Mittel, um
Faserwachstum nach Dopaminmikrokügelchenimplantation
in einen Hirnbereich, wo Dopamin "natürlicherweise" abgereichert ist,
zu untersuchen. Bei diesen genetisch abweichenden Mäusen ist
das Hirndopamin stark abgereichert. Die Anomalität ist besonders merklich im
Nigrostriatumdopamintrakt, während
die mesolimbischen Dopaminneuronen weniger beeinflusst erscheinen.
Das Implantieren von Dopaminmikrokügelchen innerhalb des Striatums
dieses Mausmodells stimuliert in gleicher Weise das Wachstum von
Dopaminfasern im Striatum, die wahrscheinlich aus dem genetisch
nicht beeinflussten Dopaminsystem entspringen.
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Mikroskopische
Beobachtungen von Rattenhirngewebe nach Verabreichung von erfindungsgemäßen Mikrokügelchen
bestätigten,
dass Dopamin im Striatum von Ratten, die leere Mikrokügelchen
erhielten, nicht vorhanden war. Bei Tieren, die Dopaminmikrokügelchen
erhielten und eine kontinuierliche Abnahme des durch Apomorphin
induzierten Drehverhaltens zeigten, zeigten mikroskopische Beobachtungen
jedoch, dass Dopamin sowohl in den Mikrokügelchen als auch im Gewebe
vorhanden war. Ähnliche
Ergebnisse wurden bei Tieren beobachtet, die Noradrenalinmikrokügelchen
erhielten. Zahlreiche fei ne Faserverlängerungen, die im zentralen Nervensystem
des Wirtstieres wuchsen, waren zu sehen.
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Während elektronenmikroskopische
Beobachtungen die Gegenwart von immunoreaktiven Neuriten zeigten,
die postsynaptische Kontakte mit immunonegativen Axonen herstellten,
zeigte diese Untersuchung auch ein höchst unerwartetes Ergebnis:
Die Mikrokügelchen
wurden von Astrozyten innerhalb des Nervengewebes des Wirtstieres
aufgenommen. Von Astrozyten stammende Faktoren regulieren das Überleben
von Neuronen, die biochemische Reifung und die morphologische Differenzierung
in vitro. Intrazelluläre
kontinuierliche Leckage der neuroaktiven Mittel aus den "aufgenommenen" Mikrokügelchen
können
sekundäre
Messenger-Systeme in den Astrozyten anschalten, die schließlich zu einer
Aktivierung von "schlafenden
Genen" im Nucleus
und einer Induktion oder einem Anstieg der Produktion von Wachstumsfaktoren
führen.
Diese Wachstumsfaktoren können
ein spezifischer Faktor oder ein Cocktail von Faktoren sein, die
durch Astrozyten in den extrazellulären Raum ausgeschieden werden
und in einem Abstand einen trophischen Einfluss ausüben. Es
wurde z. B. gezeigt, dass "Volumentransmission", d. h. die Diffusion
von Molekülen zu
entfernten Bereichen im Gehirngewebe, eine wichtige Rolle für die normale
Neuromodulation/Transmission spielen kann und wahrscheinlich am
Trophismus beteiligt ist. Die verschiedenen neuronotrophen Effekte
von Astrozyten deuten darauf hin, dass diese Zellen lösliche und/oder
membranassoziierte Moleküle
exprimieren können
mit einem Spektrum an biologischen Aktivitäten. Die Erkenntnis, dass neuroaktivhaltige
Mikrokügelchen
in Astrozyten vorhanden sind, kann daher die Nervenfasenrvachstum
fördernden
Wirkungen, die bei erfindungsgemäßen Mikrokügelchen
beobachtet werden, erklären.
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Im
Hinblick auf diese unerwarteten Ergebnisse wurde eine Studie in
vitro durchgeführt,
um zu bestätigen,
was in vivo beobachtet wurde.
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Beispiel 10
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Astrozytenuntersuchungen
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Astrozyten
wurden ursprünglich
aus dem Striatum einer 1 Tage alten Ratte erhalten. Die Astrozyten
wurden von den Neuronen und anderen Nervenzellen getrennt, indem
seziertes oder präpariertes Gewebe
durch ein steriles Nylonnetz geführt
wurde. Die Zellen wurden dann in einem Kulturkolben in Serum, das
mit Kulturmedium ergänzt
war, eine Woche lang gezüchtet
und dann in 35-mm-Kulturschalen überführt.
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Dopaminmikrokügelchen
(15 mg) wurden in 10 ml Kulturmedium über Nacht bei 37°C gegeben, um
sie zu equilibrieren. 1 ml gerührtes
Medium, das dispergierte Mikrokügelchen
enthielt, wurde dann den Kulturschalen zugegeben und eine Woche
lang in Kontakt mit der Astrozytengewebekultur gelassen.
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Rasterelektronenmikroskopaufnahmen
der Zellen nach diesem Kulturprotokoll bestätigten, dass Astrozyten die
Mikrokügelchen
mit mittleren Durchmessern von weniger als etwa 10 μm aufgenommen hatten.
Obwohl größere Mikrokügelchen
mit dieser Technik nicht beobachtet wurden, ist es möglich, dass
Mikrokügelchen
mit größerem Durchmesser aufgenommen
wurden und daher werden größere Mikrokügelchen
als potenzielle Modifikationen und Veränderungen der vorliegenden
Erfindung angesehen.
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Nach
einer Woche Inkubation wurde das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen
mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und 5 Minuten lang trypsinisiert.
Medien, die Kälberserum
enthielten, wurden den trypsinisierten Zellen zugegeben, um die Reaktion
zu stoppen. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang zentrifugiert
und wieder in 200 μl
Kulturmedium suspendiert.
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Ausgewachsene
Ratten wurden mit 6-OHDA einen Monat gemäß bekannten Protokollen denerviert.
Den Ratten wurde dann 2 × 3 μl der suspendierten
Astrozytenzellkultur in zwei verschiedene Stellen im Striatum implantiert.
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Zwölf Wochen
nach der Implantation zeigten diese Tiere, die mikrokügelchenhaltige
Astrozyten erhalten hatten, eine 45%ige Abnahme (% der Grundlinie)
der Drehungen (siehe Beispiel 2), während die Tiere, die Astrozyten
mit leeren Mikrokügelchen
erhalten hatten, eine ungefähr
15%ige Abnahme der Drehungen zeigten. Diese Ergebnisse können so
interpretiert werden, dass Mikrokügelchen, die von Astrozyten
aufgenommen wurden, im zentralen Nervensystem ein Mittel bilden
können,
um eine längere Freisetzung
von Dopamin sicherzustellen, da das Dopamin tatsächlich zweifach in einem solchen
System verkapselt ist: erstens in dem Polymer und zweitens in der
Astrozytenzelle. Die Verwendung von Astrozyten als Abgabesystem
kann das Faserwachstum verstärken,
da diese Zellen an der Produktion und Erhaltung zahlreicher Wachstumsfaktoren
beteiligt sind.
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Eine
neun Monate später
durchgeführte
Immunochemie zeigte Faserwachstum und die Lebensfähigkeit
der Astrozyten; das Faserwachstum wurde mit Antityrosinhydroxylase
sichtbar gemacht und die Astrozyten wurden mit Antigliafibrillenprotein
sichtbar gemacht.