DE69526448T2

DE69526448T2 - Lokale abgabe von faktoren die des überlebens von transplantierten zellen verhögen

Info

Publication number: DE69526448T2
Application number: DE69526448T
Authority: DE
Inventors: Robert S. Langer; David J. Mooney; Joseph P. Vacanti
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2015-12-15
Also published as: US6281015B1; EP0794790A1; DE69526448D1; ATE216255T1; CA2207286C; ES2176359T3; EP0794790B1; JP4361134B2; WO1996018411A1; PT794790E; JPH10510816A; CA2207286A1; DK0794790T3; JP2008011863A

Description

Beschreibung

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Zellkultur und der Transplantation, und insbesondere betrifft es Verfahren und Zusammensetzungen zur Verbes-Serung des Überlebens von Zellen.
Die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika hat aufgrund einer finanziellen Unterstützung von Robert S. Langer durch die National Science Foundation BSC9202311 Rechte an dieser Erfindung inne.
Die Lebertransplantation ist die etablierte Therapie für Lebererkrankungen im Endstadium, wie es von Starzl et al., N. Eng. J. Med. 321 : 1014-1022 (1989) beschrieben wurde, aber diese Therapie wird stark durch die Knappheit der Spenderorgane eingeschränkt. Ungefähr 30 000 Menschen sterben immer noch jedes Jahr in den Vereinigten Staaten von Amerika an Lebererkrankungen (American Liver Foundation, Vital Statistics of the United States, 1988; Band 2A), und 23% von denjenigen, die 1991 für eine Transplantation vorgemerkt waren, starben, während sie auf ein Organ warteten (Annual report of the U. S. scientific registry for organ transplantation and the organ procurement and transplant network, 1990, Richmond, Virginia, UNOS und Bethesda, Maryland, the Division of organ transplantation, Health Resources and Services Administration PE59, 19). Die Transplantation von Leberparenchym-Zellen, Hepatozyten, wurde als eine Alternative zur Verpflanzung des ganzen Organs bei Lebererkrankungen vorgeschlagen (Asonuma et al. J. Ped. Surg., 27 : 298-301 (1992)). Einzelne Stoffwechselerkrankungen können durch den Ersatz von 12% der Lebermasse geheilt werden (Asonuma et al.), und somit könnte eine einzige Leber für mehrere Patienten verwendet werden, oder eine teilweise Resektion der Leber eines lebenden Spenders könnte die zur Behandlung einer anderen Person erforderliche Lebermasse bereit stellen. Alternativ könnten die Zellen eines Patienten geerntet, genetisch verändert und der Person wieder zugeführt werden, um Defekte, die auf einem einzigen Gen beruhen, zu behandeln (Wilson J. M. et al., Grossman, M., Raper, S. E., Baker, J. R., Newton, R. S., Thoene, J. G. Ex vivo gene therapy of familial hypercholesteremia. Human Gene Therapy, 1992, 3 : 179-222). Hepatozyten wurden bereits in Suspension, verkapselt, an Mikrokügelchen haftend oder an abbaubaren oder nicht biologisch abbaubaren Polymerfasern haftend transplantiert (Hansen et al., Hepatocytes transplantation using artificial biodegradable polymers. In: Hoffman, M. A., Hrsg., Current controversies in biliary atresia. Austin, Texas, R. G. Landes, 1993 96-106).
Bei der Wiederherstellung der Leberfunktion über eine Hepatozyten-Transplantation ist es unabhängig vom Verfahren, mit dem die Zellen zugeführt werden, kritisch, das Überleben und das Wachstum der transplantierten Zellen zu gewährleisten. Frühere Studien zur Hepatozyten-Transplantation haben gezeigt, dass das Anlegen eines intrahepatischen portosystemischen Shunts ("portal caval shunt", "PCS") in Verbindung mit der Hepatozyten-Transplantation das Anwachsen der Hepatozyten verbessert (Uyama et al., Transplantation 55 : 932-935 (1993)). Allerdings befinden sich Patienten mit einem Leberversagen bereits in einem geschwächten Zustand, und die Belastung durch einen PCS kann für diese Gruppe u. U. nicht zumutbar sein.
Die Leber ist fähig, sich nach einer partiellen Hepatektomie wiederholt zu regenerieren, und es wurden verschiedene Faktoren identifiziert, die ein Hepatozytenwachstum hervorrufen. Zu diesen gehören der Epidermal Growth Factor (EGF), der alpha Fibroblastic Growth Factor, der Hepatocyte Growth Factor und der Transforming Growth Factor alpha (Fausto, Prog. Growth Factor Res., 3 : 219-234 (1991)). Die Wirkungen dieser Mitogene können zusammen mit Co-Mitogenen wie Insulin, Glucagon und Östrogen vermittelt werden. Viele dieser Faktoren, die für eine Leberregeneration wichtig sind, kommen offenbar im portalen Kreislauf vor (Jaffe et al., Int. Exp. Path., 72 : 289-299 (1991)), und wenn auch die Herkunft der Faktoren unklar ist, so verbessern trophische Faktoren von Inselzellen das Überleben von transplantierten Hepatozyten (Ricordi et al., Surgery, 105 : 218-223 (1989)). Allerdings ist es schwierig, diese Wirkungen der Anwesenheit spezifischer Faktoren zuzuschreiben, und diese Ansätze sind aufgrund der Knappheit des verfügbaren Inselgewebes limitiert. Falls Techniken zur reproduzierbaren Verabreichung gegebener Mengen spezifischer Faktoren entwickelt würden, wäre es möglich, die Wirkungen verschiedener Faktoren, allein und in Kombination, auf das Überleben und das Wachstums von Hepatozyten systematisch zu untersuchen, und es könnte möglicherweise dazu führen, dass die Hepatozyten-Transplantation sich mehr in Richtung auf eine klinisch relevante Therapie bewegen würde.
Systeme zur Zuführung von Makromolekülen, beispielsweise Proteinen, über ausgedehnte Zeiträume werden seit 20 Jahren aktiv entwickelt, wie es von Langer, Science, 249 : 1527-1533 (1990) zusammenfassend dargestellt wurde. Träger für die Zuführung, die aus biologisch abbaubaren Polymeren hergestellt werden, sind besonders attraktiv, da die Zufuhr des Arzneimittels über die Diffusion durch das Polymerrückgrat und/oder über die Erosion des Polymers gesteuert werden kann. Systeme für die Zufuhr von Faktoren, die für Hepatozyten relevant sind, beispielsweise von Insulin (Brown et al., Diabetes, 35 : 684-691 (1986)) und EGF (Murray et al., In Vitro, 1983; 10 : 743-748), wurden kürzlich entwickelt. Mit Hilfe dieser Systeme konnten zwar kleine Mengen biologisch aktiver Faktoren über ausgedehnte Zeiträume freigesetzt werden, aber die Form der Vorrichtungen (feste Platten aus Polymeren) waren für eine Co-Transplantation mit Zellen nicht geeignet.
Es wäre deshalb vorteilhaft, ein System für die Zufuhr von Faktoren zu haben, die das Überleben und die Proliferation von Zellen verbessern und die Zellen in einem differenzierten Zustand halten, das reproduzierbar ist, leicht in einer Form hergestellt werden kann, die für eine Implantation mit Zellen geeignet ist, und das sehr gut steuerbar ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Implantation in einen Patienten bereit, der eine solche benötigt, wobei die Zusammensetzung aufweist 1) Zellen, die implantiert Wert den sollen, und 2) biologisch aktive Faktoren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wachstumsfaktoren, angiogenen Faktoren, die keine Wachstumsfaktoren sind, Faktoren, die das Einwachsen von Fasergewebe verhindern, Hormonen und Chemotherapeutika besteht, wobei die Zellen auf einer Matrix oder in einer Matrix suspendiert bereit gestellt werden.
Die Erfindung stellt ferner eine erfindungsgemäße Zusammensetzung für den Einsatz in der Medizin bereit. Außerdem stellt die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten, der implantierte Zellen benötigt, bereit.
Faktoren wie EGF werden unter Verwendung von Mikrokügelchen aus Polymeren Zellen zugeführt, beispielsweise Hepatozyten, die in heterotope Stellen transplantiert wurden, um die Mikroumgebung der transplantierten Zellen zur Verbesserung des Anwachsens zu modulieren. Dieser Ansatz ist für Studien nützlich, die die Rolle verschiedener Faktoren, sowohl allein als auch in Kombination, bei der Hepatostimulation untersuchen sowie für die Behandlung von Patienten, die einen Ersatz der Zelifunktion oder deren Ergänzung benötigen.
Wie in den Beispielen beschrieben wird, wurde der Epidermal Growth Factor (EGF) in Mikrokügelchen (19 ± 12 um) inkorporiert (0,11%), die aus einem Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure unter Verwendung einer Doppelemulsionstechnik hergestellt wurden. Das inkorporierte EGF wurde in vitro gleichmäßig über einen Zeitraum von einem Monat freigesetzt, und es blieb biologisch aktiv, wie anhand seiner Fähigkeit zur Stimulation der DNA-Synthese, der Zellteilung und des langfristigen Überlebens kultivierter Hepatozyten bestimmt wurde. Die EGF-haltigen Mikrokügelchen wurden mit einer Hepatozyten-Suspension gemischt, auf poröse Schwämme ausgesät und in das Mesenterium zweier Gruppen von Lewis-Ratten implantiert, um die Wirksamkeit in vivo zu zeigen. Die erste Gruppe erhielt einen intrahepatischen portosystemischen Shunt (PCS), die zweite Gruppe nicht. Zwei Wochen nach der Implantation in Tiere mit PCS hatten die Vorrichtungen, die EGF-haltige Mikrokügelchen enthielten, im Vergleich zu Implantaten, die leere Mikrokügelchen erhalten hatten, zu einem Anstieg der Zahl der angewachsenen Hepatozyten auf das Zweifache geführt. Vorrichtungen, die in Tiere ohne einen PCS implantiert worden waren, wiesen weniger angewachsene Hepatozyten auf als die Vorrichtungen, die in Tiere mit einem PCS implantiert worden waren. In den Tieren ohne einen PCS wurden zwischen Implantaten mit leeren und solchen mit EGF-haltigen Mikrokügelchen keine Unterschiede bezüglich der Zahl der angewachsenen Hepatozyten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, Systeme zu konstruieren, die die Mikroumgebung von Hepatozyten, die in heterotope Stellen transplantiert wurden, verändern können, um ihr Anwachsen zu verbessern. Sie zeigen auch, dass die Kombination von EGF mit Faktoren aus dem Portalkreislauf kritisch für die Verbesserung des Überlebens der Hepatozyten ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des im Beispiel 1 eingesetzten Verfahrens zur Herstellung von Mikrokügelchen.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der prozentualen Gesamtmenge des kontinuierlich über 45 Tage freigesetzten EGF. Die Werte sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen, die aus Vierfachbestimmungen berechnet wurden.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die quantitativ die Zahl der Zellen mit markierten Kernen nach einer ³H-Thymidin-Autogradiographie und somit die Zahl der Zellen in der S- Phase des Zellzyklus angibt. Die Zellen wurden in Medium kultiviert, das verschiedene Konzentrationen an EGF enthielt, das nicht in Mikrokügelchen inkorporiert worden war (lösliches EGF), oder in Medium, das 10 ng/ml EGF enthielt, das aus Mikrokügelchen (Microspheres) freigesetzt wurde.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Veränderung der Zellzahl, die in Kulturschalen zwischen dem Tag 1 und dem Tag 4 vorhanden waren, und zwar in Medium, das verschiedene Konzentrationen an EGF enthielt, das nicht in Mikrokügelchen inkorporiert war (lösliches EGF) (ng/ml), oder in Medium, das 10 ng/ml EGF enthielt, das aus Mikrokügelchen (Microspheres) freigesetzt wurde. Die Werte sind die Mittelwerte und die Standardfehler des Mittelwertes, die aus den Ergebnissen von drei Experimenten berechnet wurden, die alle in Form von Vierfachbestimmungen durchgeführt wurden.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Veränderung der Zellzahl in den Kulturplatten zwischen dem Tag 1 und dem Tag 11 (ausgedrückt als prozentualer Anteil der Zahl am Tage 1), wenn die Zellen in Medium kultiviert wurden, das kein EGF enthielt (kein EGF), oder in Medium, das 10 ng/ml EGF enthielt, das aus den Mikrokügelchen (Microspheres) freigesetzt wurde. Die Werte sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen, die aus Vierfach- Bestimmungen berechnet wurden.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die quantitativ die Zahl der angewachsenen Hepatozyten in Schwämmen angibt, die 14 Tage nach der Implantation entfernt wurden, und zwar für Kontroll-Mikrokügelchen mit einem PCS (Kon/PCS), EGF-Mikrokügelchen ohne einen PCS (EGF), Kontroll-Mikrokügelchen ohne einen PCS (Kon) sowie EGF-enthaltende Mikrokügelchen mit einem PCS (EGF/PCS). Insgesamt wurden 24 implantierte Schwämme analysiert (6 pro Bedingung), und die Werte sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen. Der Unterschied zwischen EGF/PCS und allen anderen Bedingungen war statistisch signifikant (p > 0,05). Zwischen allen anderen Bedingungen waren die Unterschiede jeweils nicht statistisch signifikant.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zufuhrsysteme

Biologisch aktive Faktoren können auf steuerbare Weise unter Verwendung von Zufuhrsystemen mit Mikroteilchen bereit gestellt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden Mikrokügelchen eingesetzt, um eine gesteuerte Freisetzung von Faktoren, die das Überleben von Zellen, die Proliferation oder die Differenzierung verbessern, für transplantierte Zellen zu gewährleisten. Die Polymer-Mikrokügelchen, die die Faktoren enthalten, werden einem Menschen oder einem Tier verabreicht, so dass die Faktoren durch eine Diffusion aus den und/oder einen Abbau der Mikrokügelchen freigesetzt werden. Die Mikrokügelchen bestehen aus biologisch abbaubaren Polymeren, am bevorzugtesten synthetischen Polymeren oder natürlichen Polymeren wie Proteinen und Polysacchariden. Wie die Begriffe hier verwendet werden, bezieht sich "Polymer" sowohl auf synthetische Polymere als auch auf Proteine. Der Begriff "Mikrokügelchen", wie er hier verwendet wird und der ein kugelförmiges Teilchen anzeigt, das aus einem Polymer besteht und einen Polymerkern enthält, schließt Mikrokapseln und Mikroteilchen ein, es sei denn, es wird etwas anderes angegeben. Für eine Verwendung als Zufuhrsystem benötigen Mikrokapseln eine äußere Schicht mit einer selektiven Permeabilität. Ganz ähnlich müssen die biologisch aktiven Faktoren in den Mikroteilchen gleichmäßig verteilt werden, wenn die Mikroteilchen als Zufuhrsystem verwendet werden sollen.

Auswahl der synthetischen Polymermatrix

Der Begriff "biologisch zersetzbar" oder "biologisch abbaubar", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Materialien, die in vivo enzymatisch oder chemisch zu einfacheren chemischen Spezies abgebaut werden.
Wie oben festgestellt wurde, können entweder natürliche oder synthetische Polymere als Zufuhrmatrix verwendet werden, obwohl synthetische Polymere aus Gründen der Reproduzierbarkeit und der Steuerbarkeit der Freisetzungskinetik bevorzugt werden. Zu synthetischen Polymeren, die zur Herstellung der Mikrokügelchen verwendet werden können, gehören biologisch zersetzbare Polymere wie Polylactid (PLA), Poly(glycolsäure) (PGS), Poly(lactid-coglycolid) (PLGS), Polycaprolacton, Polycarbonate, Polyamide, Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polyorthoester, Polyacetale, Polycyanacrylate und abbaubare Polyurethane sowie nicht-zersetzbare Polymere wie Polyacrylate, Ethylen-Vinylacetat-Polymere und andere acylsubstituierte Celluloseacetate und Derivate von diesen, nicht-zersetzbare Polyurethane, Polystyrole, Polyvinylchlorid, Polyvinylfluorid, Poly(vinylimidazol), chlorsulfonierte Polyolefine und Polyethylenoxid.
Zu Beispielen für natürliche Polymere gehören Proteine wie Albumin, Collagen, synthetische Polyaminosäuren und Prolamine und Polysaccharide wie Alginat, Heparin sowie andere natürlich vorkommende biologisch abbaubare Polymere aus Zuckereinheiten.
PLA, PGS und PLA/PGS-Copolymere sind für die Herstellung von Mikrokügelchen besonders nützlich. PLA-Polymere werden üblicherweise aus den cyclischen Estern von Milchsäuren hergestellt. Sowohl die L(+)- als auch die D(-)-Form der Milchsäure kann zur Herstellung des PLA-Polymers verwendet werden, und auch die optisch inaktiven DL-Milchsäure-Mischungen aus D(-)- und L(+)-Milchsäure. Verfahren zur Herstellung von Polylactiden sind in der Patentliteratur gut dokumentiert. Die folgenden US-Patente, deren Inhalte hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen werden, beschreiben detailliert geeignete Polylactide, ihre Eigenschaften und ihre Herstellung: 1 995 970 an Dorough; 2 703 316 an Schneider; 2 758 987 an Salzberg; 2 951 828 an Zeile; 2 676 945 an Higgins; und 2 683 136 und 3 531 561 an Trehu.
PGS ist das Homopolymer der Glycolsäure (Hydroxyessigsäure). Bei der Umwandlung von Glycolsäure in Poly(glycolsäure) wird zunächst die Glycolsäure mit sich selbst unter Bildung des cyclischen Esters Glycolid umgesetzt, der in Gegenwart von Wärme und eines Katalysators zu einem geradkettigen Polymer mit hohem Molekulargewicht umgewandelt wird. PGS-Polymere und ihre Eigenschaften werden detaillierter in "Cyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture", Chemistry and Industry, 905 (1970) beschrieben.
Sowohl die Freisetzung der inkorporierten Verbindung als auch die biologische Zersetzung der Matrix stehen in Beziehung zu den Molekulargewichten von PLA, PGS oder PLAIPGS. Die höheren Molekulargewichte, d. h. Gewichtsmittel der Molekulargewichte von 90 000 oder höher, führen zu Polymermatrices, die ihre strukturelle Integrität über längere Zeiträume behalten, während niedrigere Molekulargewichte, d. h. Gewichtsmittel der Molekulargewichte von 30 000 oder darunter, sowohl zu einer schnelleren Freisetzung als auch zu kürzeren Lebenszeiten der Matrix führen.
Die Freisetzung der Faktoren aus diesen polymeren Systemen kann über zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen. Das Arzneimittel kann über eine Diffusion durch wassergefüllte Kanäle freigesetzt werden, die durch die Auflösung des Arzneimittels in der Darreichungsform erzeugt werden, oder über Hohlräume, die über die Entfernung des Polymerlösemittels während der ursprünglichen Mikroverkapselung erzeugt wurden. Der zweite Mechanismus stellt eine erhöhte Freisetzung aufgrund des Abbaus des Polymers dar. Das Polymer beginnt sich mit der Zeit zu ersetzen und führt zu einer erhöhten Porosität und einer Mikrostruktur im Inneren der Vorrichtung. Das erzeugt zusätzliche Pfade für eine Freisetzung des Arzneimittels.
Der Abbau des Polymers erfolgt über eine spontane Hydrolyse der Esterbindungen des Rückgrats. Somit kann die Geschwindigkeit über eine Veränderung der Polymereigenschaften, die die Wasseraufnahme beeinflussen, gesteuert werden. Zu diesen gehören das Verhältnis der Monomere (Lactid zu Glycolid), die Verwendung von L-Lactid im Gegensatz zu D/L-Lactid und das Molekulargewicht des Polymers. Diese Faktoren bestimmen die Hydrophilie und die Kristallinität, die letztlich die Geschwindigkeit des Wasserdurchtritts bestimmen. Es können auch hydrophile Hilfsstoffe wie Salze, Kohlenhydrate und Detergenzien inkorporiert werden, um den Eintritt von Wasser in die Vorrichtungen zu erhöhen und somit die Erosion des Polymers zu beschleunigen.
Über die Veränderung der Eigenschaften des Polymers und der Eigenschaften der Darreichungsform kann man den Beitrag dieser beiden Freisetzungsmechanismen steuern und die Freisetzungsgeschwindigkeit von Faktoren verändern. Polymere, die sich langsam zersetzen, wie Poly-L-lactid oder hochmolekulares Poly(lactid-co-glycolid) mit geringem Glycolid- Anteil, führen dazu, dass die Freisetzung stärker diffusionsgesteuert wird. Eine Erhöhung des Glycolid-Anteils und eine Erniedrigung des Molekulargewichtes erhöhen sowohl die Wasseraufnahme als auch die Hydrolyse des Polymers und fügen eine Erosionskomponente zur Freisetzungskinetik hinzu.
Die Freisetzungsgeschwindigkeit kann auch über eine Variation der Beladung der Mikrokügelchen mit Faktoren gesteuert werden. Eine Erhöhung der Beladung führt zu einer stärkeren Ausbildung eines Netzwerkes untereinander verbundener Kanäle, das sich beim Auflösen des Arzneimittels bildet, und verstärkt die Freisetzung des Arzneimittels aus den Mikrokügelchen.

Zusätze zur Veränderung der Freisefzungsgeschwindigkeit, der Zersetzungsgeschwindigkeit und der Stabilität von Faktoren

Die Hydrolyse von Polymeren wird bei sauren oder basischen pH-Werten beschleunigt, und somit kann die Einarbeitung saurer oder basischer Hilfsstoffe dazu verwendet werden, die Erosionsgeschwindigkeit des Polymers zu modulieren. Die Hilfsstoffe können in Form von Teilchen zugesetzt werden, sie können mit den eingearbeiteten Faktoren vermischt werden, oder sie können im Polymer gelöst werden.
Die Menge der Abbauverstärker basiert auf ihrem Gewicht bezüglich des Gewichtes des Polymers. Sie können der Proteinphase zugesetzt werden, sie können als getrennte Phase zugesetzt werden (d. h. als Teilchen), oder sie können in Abhängigkeit von der Verbindung zusammen mit der Polymerphase aufgelöst werden. In allen Fällen sollte ihre Menge zwischen 0,1 und 30% liegen (Gew./Gew. des Polymers). Zu typischen Abbauverstärkern gehören anorganische Säuren wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, organische Säuren wie Zitronensäure, Benzoesäuren, Heparin und Ascorbinsäure, anorganische Basen wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und Zinkhydroxid sowie organische Basen wie Protaminsulfat, Spermin, Cholin, Ethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin sowie Detergenzien wie TweenTM und PluronicTM.
Porenbildner versehen die Matrices mit einer Mikrostruktur (d. h. wasserlösliche Verbindungen wie anorganische Salze und Zucker). Sie werden in Form von Teilchen zugesetzt. Ihr Bereich sollte zwischen 1 und 30% liegen (Gew./Gew. des Polymers). Hilfsstoffe können auch den Faktoren zugesetzt werden, um in Abhängigkeit von der Freisetzungsdauer ihre Wirksamkeit aufrecht zu erhalten. Zu Stabilisatoren gehören Kohlenhydrate, Aminosäuren, Fettsäuren und Detergenzien, und sie sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Darüber hinaus können Hilfsstoffe, die die Löslichkeit von Faktoren modifizieren, wie Salze, Komplexbildner (Albumin, Protamin) zur Steuerung der Freisetzungsgeschwindigkeit des Proteins aus den Mikrokügelchen verwendet werden.
Die Menge der Stabilisatoren für die Faktoren basiert auf ihrem Verhältnis zum Protein auf Gewichtsbasis. Zu Beispielen gehören Kohlenhydrate wie Saccharose, Lactose, Mannit, Dextran und Heparin, Proteine wie Albumin und Protamin, Aminosäuren wie Arginin, Glycin und Threonin, Detergenzien wie TweenTM und PluronicTM, Salze wie Calciumchlorid und Natriumphosphat sowie Lipide wie Fettsäuren, Phospholipide und Salze von Gallensäuren.
Die Verhältnisse liegen allgemein bei 1 : 10 bis 4 : 1 für Kohlenhydrat zu Protein, Aminosäuren zu Protein, Proteinstabilisator zu Protein und Salze zu Protein; bei 1 : 1000 bis 1 : 20 für Detergens zu Protein; und bei 1 : 20 bis 4 : 1 für Lipide zu Protein.

Einarbeitung von Faktoren in die Mikrokügelchen

Mikrokügelchen werden hergestellt, indem die Faktoren in biokompatible polymere Mikrokügelchen eingearbeitet werden, wobei die die Faktoren enthaltenden Mikrokügelchen dadurch charakterisiert sind, dass sie die Faktoren verzögert und kontrolliert freisetzen, vorzugsweise über einen Zeitraum von wenigstens 24 Stunden bis zu einem Zeitraum von ein bis zwei Jahren. Im allgemeinen ist das Zufuhrsystem so konstruiert, dass die bioaktiven Faktoren über einen Zeitraum zwischen einem Monat und mehreren Monaten freigesetzt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer biologisch abbaubar, die Mikrokügelchen haben einen Durchmesser von unter 180 um, am bevorzugtesten von unter 70 um, und sie sind für eine subkutane oder intramuskuläre Verabreichung über eine Injektion geeignet (eine Größe, die für eine Injektion durch eine 23-Gauge-Nadel geeignet wäre, wurde bei unter 180 um im Durchmesser liegen), und die Mikrokügelchen enthalten 0,1 Gew.-% bis ungefähr 30 Gew.-% an Faktoren.
Wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht ich "Mikro" auf ein Teilchen mit einem Durchmesser im Bereich von Nanometern bis zu Mikrometern. Mikrokügelchen sind kugelförmige feste Teilchen; Mikroteilchen sind Teilchen von unregelmäßiger oder nicht- kugelförmiger Gestalt. Ein Mikrokügelchen kann einen äußeren Überzug haben, der eine andere Zusammensetzung als das Material aufweist, das ursprünglich zur Herstellung des Mikrokügelchens verwendet wurde. Der Begriff Mikrokügelchen kann, wenn nichts anderes festgestellt wird, so verwendet werden, dass Mikrokapseln mit eingeschlossen sind, und der Begriff Mikroteilchen kann so verwendet werden, dass Mikroteilchen, Mikrokügelchen und Mikrokapseln mit eingeschlossen sind. Auf Mikropartikel wird insbesondere dann Bezug genommen, wenn unregelmäßig geformte Teilchen aus dem Polymer oder dem Polymer und Arzneimitteln gemeint sind. Mikrokapseln sind kugelförmige Vorrichtungen aus einem Polymer, die einen Kern aufweisen, der nicht aus dem Polymer besteht, oder einen Kern, der aus einem anderen Polymer besteht als die äußere Schale. Ein "Komposit-Mikrokügelchen" ist ein Mikrokügelchen, das aus wenigstens zwei verschiedenen Materialien gebildet ist, entweder aus einem Protein und einem Polymer oder aus zwei Proteinen. Ein "Komposit" ist ein Aggregat aus Mikrokügelchen, die wie hier beschrieben hergestellt wurden und die durch Materialien verbunden sind, die einem Fachmann auf diesem Gebiet für diesen Zweck bekannt sind.
Wie die Begriffe hier verwendet werden, kann eine "verzögerte" oder "verlängerte" Freisetzung der Faktoren kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen, linear oder nicht-linear. Das kann erreicht werden, indem ein Typ oder mehrere Typen von Polymerzusammensetzungen, Beladungen mit Arzneimitteln, Zusammenstellungen von Hilfsstoffen oder Verstärkern des Abbaus oder anderer Modifikationen, die allein, in Kombination oder nacheinander zur Erzeugung des gewünschten Effektes verabreicht werden, eingesetzt werden.
Die Faktoren können eingearbeitet werden in 1) die Polymermatrix, die die Mikrokügelchen bildet, 2) Mikroteilchen, das bzw. die von dem Polymer, das die Mikrokügelchen bildet, umgeben ist bzw. sind, 3) einen Polymerkern im Inneren eines Protein-Mikrokügelchens, 4) eine Polymerbeschichtung um ein Polymermikrokügelchen herum, 5) sie können mit Mikrokügelchen, die zu einer größeren Form aggregiert sind, vermischt werden, oder sie können in eine Kombination von diesen eingearbeitet werden.
Die Faktoren können als Partikel eingearbeitet werden oder durch das Auflösen der Faktoren zusammen mit dem Polymer. Stabilisatoren können durch den Zusatz der Stabilisatoren zu der Lösung des Faktors vor der Bildung der Mikrokügelchen eingearbeitet werden.

Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen

Es sind verschiedene Techniken bekannt, durch die aktive Wirkstoffe in Mikrokügelchen aus synthetischen Polymeren eingearbeitet werden können.

Sprühtrocknen

Beim Sprühtrocknen werden das Polymer und die Faktoren in einem Lösemittel für das Polymer gemischt, und dann wird das Lösemittel durch Versprühen der Lösung verdampft, wobei Polymertröpfchen zurückbleiben, die den aktiven Wirkstoff enthalten. Das Sprühtrocknen wird detailliert bei K. Masters in "Spray Drying Handbook" (John Wiley & Sons, New York 1984) und bei Patrick B. Deasy in "Microencapsulation and Related Drug Processes" (Marcel Dekker Inc., New York 1984) beschrieben, und der Inhalt dieser Literaturstellen wird hier mit aufgenommen. Das Sprühtrocknen kann zu einem gewissen Aktivitätsverlust führen, und zwar aufgrund der Wärme, die beim Prozess erzeugt wird, als auch aufgrund eines Verlusts beträchtlicher Mengen des Materials als Folge des Anhaftens des Polymers an der großen Oberfläche der Wände der Kammer, so dass es nicht für labile Materialien bevorzugt wird, die nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen.

Lösemittelverdampfung

Techniken der Lösemittelverdampfung können zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden. Diese Techniken beinhalten das Auflösen des Polymers in einem organischen Lösemittel, das entweder aufgelöste oder dispergierte aktive Wirkstoffe enthält. Die Lösung des Polymers und des aktiven Wirkstoffes wird dann zu einer gerührten kontinuierlichen Phase gegeben, die normalerweise wässrig ist. Emulgatoren werden der wässrigen Phase zugesetzt, um die Öl-in-Wasser-Emulsion zu stabilisieren. Das organische Lösemittel wird dann über einen Zeitraum von mehreren Stunden oder länger abgezogen, wodurch das Polymer um das Kernmaterial herum abgelagert wird. Das Lösemittel kann von den Mikrokügelchen in einem einzigen Schritt entfernt werden, wie es im US-Patent Nr. 3 737 337 und im US-Patent Nr. 3 523 906 oder im US-Patent Nr. 3 691 090 (unter vermindertem Druck) beschrieben ist, oder durch die Anwendung von Wärme, wie es im US-Patent Nr. 3 891 570 gezeigt ist. Eine Zweischritt-Technik wird im US-Patent Nr. 4 389 330 beschrieben. Eine Gefriertrocknung wurde ebenfalls zur Entfernung des Lösemittels von den Mikroteilchen verwendet, wie es von Sato et al. in "Porous Biodegradable Microspheres for Controlled Drug Delivery. I. Assessment of Processing Conditions and Solvent Removal Techniques", Pharmaceutical Research 5, 21-30 (1988) berichtet wurde.
Die Lösemittelverdampfung funktioniert einigermaßen gut, aber sie wird nicht bevorzugt, da die Menge des inkorporierten Materials üblicherweise unter den theoretischen Werten liegt, was auf einem Übertritt des Arzneimittels in die wässrige Phase beruht, wie es von Benita et al., in "Characterization of Drug Loaded Poly(d,l-lactide) Microspheres", J. Pharm. Sci. 73, 1721- 1724 (1984) beschrieben wurde.

Phasenabscheidung

Es können auch Techniken der Phasenabscheidung zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden. Diese Techniken beinhalten die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Das Polymer wird aus der kontinuierlichen Phase auf den aktiven Wirkstoff ausgefällt, und zwar über eine Veränderung der Temperatur, des pH, der Ionenstärke oder durch den Zusatz von Fällungsmitteln. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 4 675 800 die Bildung von Mikrokügelchen aus Poly(milchsäure-co-glycolsäure), die aktive Proteine enthalten. Das Protein wird zuerst in der wässrigen Phase einer Wasser-in-Öl-Emulsion gelöst oder als Feststoff in der Polymerphase dispergiert. Das Polymer wird dann durch den Zusatz eines Stoffes, in dem sich das Polymer nicht löst, beispielsweise Siliconöl, um die wässrigen Tröpfchen oder die Arzneimittelteilchen herum ausgefällt. Das fertige Produkt liegt, wie bei den meisten Techniken einer Phasenabscheidung, in Form einer Mikrokapsel vor. Mikrokapseln enthalten ein Kernmaterial, das von einer Kapsel aus einer Polymermembran umgeben ist. Mikrokapseln stellen jedoch nicht die bevorzugte Ausführungsform für die Zufuhr von Faktoren dar, das die Freisetzungskinetik aktiver Wirkstoffe aus diesen Vorrichtungen u. U. schwer zu steuern ist.
Obwohl diese Techniken einer Phasenabscheidung zur Bildung von Mikrokügelchen führen, die aktive Wirkstoffe enthalten, wird der aktive Wirkstoff während des Prozesses der Lösemittelextraktion oft verloren. Außerdem können, wie beim Sprühtrocknen, biologisch aktive Proteine während des Prozesses denaturiert werden.

Schnellgefrieren, Lösemiffelexfrakfion

Ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die Faktoren enthalten, die zugeführt werden sollen und die die gewünschten Charakteristika aufweisen, wird im US-Patent Nr. 5 019 400 an Gombotz et al. beschrieben.
Es gibt zwei prinzipielle Ausführungsformen des Systems zur Herstellung von Mikrokügelchen: ein System aus einer Kombination aus einem verflüssigten Gas und einem Nicht-Lösemittel, und ein System aus einem gefrorenen Nicht-Lösemittel.
Das Polymere und das Mittel, das verkapselt werden soll, werden unter Verwendung einer Ultraschallvorrichtung in ein verflüssigtes Gas versprüht. Die versprühten Teilchen gefrieren, wenn sie mit dem verflüssigten Gas (flüssigem Stickstoff) in Kontakt kommen, wobei sie gefrorene Kügelchen bilden. Diese sinken auf die Oberfläche des gefrorenen Nicht-Lösemittels (Ethanol). Das flüssige Gas wird abgedampft, und die Kugeln beginnen in das Nicht-Lösemittel zu sinken, wenn das Nicht-Lösemittel taut. Das Lösemittel in den Kugeln wird unter Bildung von Mikrokügelchen, die das Mittel enthalten, das verkapselt werden soll, in das Nicht-Lösemittel extrahiert. Andere Nicht-Lösemittel wie Hexan werden zu dem Nicht-Lösemittel (Ethanol) gegeben, um die Geschwindigkeit der Lösemittelextraktion aus bestimmten Polymeren, wenn es angebracht ist, zu erhöhen, beispielsweise wenn die Kugeln aus Poly(lactid-co-glycolid)-Polymeren bestehen.
Alternativ kann ein kaltes Nicht-Lösemittel für das Polymer die Kombination aus verflüssigtem Gas und gefrorenem Nicht-Lösemittel ersetzen, vorausgesetzt dass die Temperatur des Nicht-Lösemittels unter der Gefriertemperatur der Lösung aus Polymer und aktivem Wirkstoff liegt. Es ist wichtig, ein Lösemittel für das Polymer auszuwählen, das einen höheren Schmelzpunkt als das Nicht-Lösemittel des Polymers besitzt, so dass das Nicht-Lösemittel zuerst schmilzt, was es den gefrorenen Mikrokügelchen ermöglicht, in die Flüssigkeit abzusinken, wenn sie später auftauen. Wenn ein System aus kaltem flüssigem Nicht-Lösemittel zur Herstellung der Polymer-Mikrokügelchen verwendet wird, sinken die Mikrokügelchen sofort in das Nicht-Lösemittel hinein. Beim Tauen des Lösemittels in den Mikrokügelchen wird es in das Nicht-Lösemittel extrahiert. Das Lösemittel für das Polymer und das Nicht-Lösemittel für das Polymer müssen mischbar sein, um eine Extraktion des Lösemittels aus den Mikrokügelchen zu ermöglichen.

Biologisch aktive Faktoren. die zugeführt werden sollen

Es können verschiedene biologisch aktive Moleküle mittels der hier beschriebenen Mikrokügelchen zugeführt werden. Es wird auf sie hier unter dem Oberbegriff "Faktoren" oder "biologisch aktive Faktoren" Bezug genommen.
Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die biologisch aktiven Faktoren Wachstumsfaktoren, angiogene Faktoren, Verbindungen, die selektiv das Einwachsen von Gewebe aus Fibroblasten hemmen, wie Entzündungshemmer, sowie Verbindungen, die selektiv das Wachstum und die Proliferation transformierter Zellen (Krebszellen) hemmen.
Zu Beispielen für Wachstumsfaktoren gehören der Heparin Binding Growth Factor (hbgf), der Transforming Growth Factor alpha oder beta (TGFß), der alpha Fibroblastic Growth Factor (FGF), der Epidermal Growth Factor (EGF) und der Vascular Endothelium Growth Factor (VEGF), von denen auch einige angiogene Faktoren sind. Zu anderen Faktoren gehören Hormone wie Insulin, Glucagon und Östrogen.
Steroidale Entzündungshemmer können verwendet werden, um eine entzündliche Reaktion auf die implantierte Matrix zu hemmen und dadurch die Menge an Fibroblasten-Gewebe zu verringern, das in die Matrix einwächst.
Wenn selektive Chemotherapeutika zur Verfügung stehen, die das Wachstum normaler Zellen nicht hemmen, beispielsweise Chemotherapeutika, die über Antikörper ihr Ziel finden, dann können diese in die Mikrokügelchen eingearbeitet und vor der Zelltransplantation zur Unterdrückung von Krebszellen verwendet werden, die nach einer Mastektomie oder einer anderen chirurgischen Entfernung von Krebsgewebe möglicherweise noch vorhanden sind.
Diese Faktoren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt, und sie sind im Handel erhältlich oder werden in der Literatur beschrieben. In-vivo-Dosierungen werden basierend auf In-vitro-Studien zur Freisetzung in Zellkulturen berechnet. Eine wirksame Dosis ist eine, die die Zellproliferation oder das Überleben von Zellen im Vergleich zu Kontrollen erhöht, wie es genauer in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Vorzugsweise werden die biologisch aktiven Faktoren in einer Menge von 1 bis 30 Gew.-% eingearbeitet, obwohl die Faktoren in Gewichtsanteilen von 0,01 bis 95 Gew.-% eingearbeitet werden können.

Zellmatrices

Das Zufuhrsystem kann mit einer Zellmatrix für die Implantation dissoziierter Zellen zugeführt werden, oder es kann in einer Zellsuspension dispergiert sein, die für einen Zellersatz implantiert wird. Beim bevorzugten System werden die Zellen in einer Matrix suspendiert oder ein dieser fixiert und dann implantiert. Die Mikrokügelchen werden an oder in der Matrix befestigt implantiert.

Zellen

Es können verschiedene dissoziierte Zellen unter Verwendung von Standardtechniken zur Isolierung und Transplantation von Gewebe oder Organen, beispielsweise der Leber, implantiert werden, mit dem Unterschied, dass die Zellen zuerst dissoziiert werden, im allgemeinen durch die Behandlung mit einer Collagenase-Lösung, wie es unten beschrieben wird. Autologe Zellen werden bevorzugt, obwohl auch nicht-autologe Zellen bei einer geeigneten Anpassung des Zelltyps und der Verwendung von Immunsuppressiva wie Cyclosporin verwendet werden können. Bei der typischen Ausführungsform sind die Zellen humane Zellen, die einem Menschen implantiert werden. Die Zellen sind typischerweise Parenchymzellen, d. h. Organzellen, die eine Funktion ausüben und nicht nur primär eine Struktur bereit stellen. Zu Beispielen für Organe gehören die Leber, die Pankreas, der Dünndarm, uroendotheliale Zellen, einschließlich reproduktiver und urothelialer Strukturen, Zellen, die Brustgewebe oder anderes Weichteilgewebe bilden, sowie endokrine Gewebe. Zellen können auch von Geweben abstammen oder Gewebe bilden, die in erster Linie strukturelle Funktionen ausüben, wie Knorpel (Chondrozyten, Fibroblasten), Bänder (Tenozyten) und Knochen (Osteozyten). Zellen können normal oder genetisch verändert sein, um zusätzliche Funktionen oder die normale Funktion bereit zu stellen.

Matrices

In der Literatur werden zwei prinzipielle Typen von Matrices zur Schaffung neuer Gewebe oder zur Unterstützung von Geweben beschrieben.

Hydroael-Polymerlösungen

Bei einer hier beschriebenen Ausführungsform werden Calciumalginat und bestimmte andere Polymere, die ionische Hydrogele bilden können, die geschmeidig sind, zur Verkapselung von Zellen verwendet. Das Hydrogel wird durch das Vernetzen des anionischen Salzes von Alginsäure, einem Kohlenhydrat-Polymer, das aus Seetang isoliert wird, mit Calcium- Kationen gebildet, wobei die Stabilität der Vernetzung entweder mit der Erhöhung der Konzentration der Calciumionen oder des Alginats ansteigt. Die Alginat-Lösung wird mit den Zellen, die implantiert werden sollen, unter Bildung einer Alginat-Suspension vermischt. Dann wird die Suspension, bevor sie ausgehärtet ist, direkt einem Patienten injiziert. Die Suspension härtet dann aufgrund der Anwesenheit physiologischer Konzentrationen von Calciumionen in vivo innerhalb eines kurzen Zeitraumes aus.
Das Polymer-Material, das für eine Implantation in den Körper mit den Zellen vermischt wird, sollte ein Hydrogel bilden. Ein Hydrogel ist als eine Substanz definiert, die sich bildet, wenn ein organisches Polymer (ein natürliches oder synthetisches) über kovalente oder ionische Bindungen oder über Wasserstoffbindungen unter Erzeugung einer dreidimensionalen Struktur eines offenen Gerüsts vernetzt wird, die unter Ausbildung eines Gels Wassermoleküle einschließt. Zu Beispielen für Materialien, die zur Bildung eines Hydrogels verwendet werden können, gehören Polysaccharide wie Alginat, Polyphosphazine und Polyacrylate, die ionisch vernetzt werden, oder Block-Copolymere wie Pluronicsml oder TetronicsTM, Block-Copolymere aus Polyethylenoxid und Polypropylenglycol, die über die Temperatur bzw. den pH vernetzt werden. Zu weiteren Materialien gehören Proteine wie Fibrin, Polymere wie Polyvinylpyrrolidon, Hyaluronsäure und Collagen.
Im allgemeinen sind diese Polymere wenigstens teilweise in wässrigen Lösungen löslich, wie Wasser, gepufferten Salzlösungen, oder wässrigen Lösungen von Alkoholen mit geladenen Seitengruppen, oder in Lösungen eines monovalenten ionischen Salzes von diesen. Beispiele für Polymere mit sauren Seitengruppen, die mit Kationen umgesetzt werden können, sind Polyphosphazene, Polyacrylsäuren, Polymethacrylsäuren, Copolymere von Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyvinylacetat und sulfonierte Polymere, wie sulfoniertes Polystyrol. Es können auch Copolymere verwendet werden, die saure Seitengruppen aufweisen, die durch die Reaktion von Acrylsäure oder Methacrylsäure und Vinylether-Monomeren oder -Polymeren hergestellt werden. Beispiele für saure Gruppen sind Carbonsäure-Gruppen, Sulfonsäure-Gruppen, halogenierte (vorzugsweise fluorierte) Alkohol-Gruppen, phenolische OH-Gruppen und saure OH- Gruppen.
Beispiele für Polymere mit basischen Seitengruppen, die mit Anionen umgesetzt werden können, sind Poly(vinylamine), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylimidazol) sowie einige Imino-substituierte Polyphosphazene. Das Ammoniumsalz oder ein quaternäres Salz der Polymere kann ebenfalls aus den Stickstoffen des Rückgrats oder den anhängenden Imino-Gruppen gebildet werden. Beispiele für basische Seitengruppen sind Amino- und Imino-Gruppen.
Alginat kann ionisch in Wasser bei Raumtemperatur unter Bildung einer Hydrogel-Matrix mit divalenten Kationen vernetzt werden. Aufgrund dieser milden Bedingungen ist Alginat das am häufigsten verwendete Polymer für die Verkapselung von Hybridomzellen, wie es beispielsweise im US-Patent Nr. 4 352 883 an Lim beschrieben wurde. Im Prozess von Lim wird eine wässrige Lösung, die die biologischen Materialien enthält, die verkapselt werden sollen, in einer Lösung eines wasserlöslichen Polymers suspendiert, die Suspension wird zu Tröpfchen geformt, die durch den Kontakt mit multivalenten Kationen zu einzelnen Mikrokapseln konfiguriert werden, und dann wird die Oberfläche der Mikrokapseln mit Polyaminosäuren unter Bildung einer semipermeablen Membran um die verkapselten Materialien herum vernetzt.
Polyphosphazene sind Polymere mit einem Rückgrat, das aus Stickstoff- und Phosphoratomen besteht, die durch alternierende Einzel- und Doppelbindungen getrennt sind. Jedes Phosphoratom ist kovalent an zwei Seitenketten ("R") gebunden. Die sich wiederholende Einheit in Polyphosphazenen hat die folgende allgemeine Struktur:
wobei n eine ganze Zahl ist.
Bei den Polyphosphazenen, die für eine Vernetzung geeignet sind, sind die meisten Seitengruppen sauer und imstande, Salzbrücken mit di- oder trivalenten Kationen auszubilden. Beispiele für bevorzugte saure Seitengruppen sind Carbonsäure-Gruppen und Sulfonsäure- Gruppen. Hydrolytisch stabile Polyphosphazene werden aus Monomeren gebildet, die Carbonsäure-Seitengruppen aufweisen, die mit divalenten oder trivalenten Kationen, wie Ca2+ oder AI3+, vernetzt werden. Es können Polymere synthetisiert werden, die durch eine Hydrolyse abgebaut werden, indem Monomere eingearbeitet werden, die Imidazol-, Aminosäureester- oder Glycerin-Seitengruppen aufweisen. Beispielsweise kann ein polyanionisches Poly[bis(carboxylatphenoxy)]phosphazen (PCPP) synthetisiert werden, das in wässrigem Medium bei Raumtemperatur oder darunter mit gelösten multivalenten Kationen unter Bildung von Hydrogel- Matrices vernetzt wird.
Biologisch zersetzbare Polyphosphazene weisen wenigstens zwei unterschiedliche Typen von Seitengruppen auf, und zwar saure Seitengruppen, die imstande sind, Salzbrücken mit multivalenten Kationen zu bilden, und Seitengruppen, die unter In-vivo-Bedingungen hydrolysieren, beispielsweise Imidazol-Gruppen, Aminosäureester-, Glycerin- und Glucosyl-Gruppen.
Die Begriffe "biologisch zersetzbar" oder "biologisch abbaubar", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf ein Polymer, das sich innerhalb eines Zeitraumes auflöst oder zersetzt, der für die gewünschte Anwendung (üblicherweise die In-vivo-Therapie) annehmbar ist, und zwar innerhalb von weniger als ungefähr fünf Jahren oder, am stärksten bevorzugt, innerhalb von weniger als einem Jahr, nachdem es einer physiologischen Lösung mit einem pH-Wert von 6-8 und einer Temperatur zwischen ungefähr 25ºC und 38ºC ausgesetzt wurde. Die Hydrolyse der Seitenkette führt zur Zersetzung des Polymers. Beispiele für hydrolysierende Seitengruppen sind unsubstituierte und substituierte Imidazole und Aminosäureester, bei denen die Gruppe über eine Amino-Verknüpfung an das Phosphoratom gebunden ist (Polyphosphazen-Polymere, bei denen beide R-Gruppen auf diese Weise befestigt sind, nennt man Polyaminophosphazene). Bei Polyimidazolphosphazenen sind einige der "R"-Gruppen des Polyphosphazen-Rückgrats Imidazolringe, die über ein Ringstickstoffatom am Phosphor des Rückgrats befestigt sind. Andere "R"-Gruppen können organische Reste sein, die nicht an der Hydrolyse teilnehmen, wie Methylphenoxy-Gruppen oder andere Gruppen, die in der wissenschaftlichen Veröffentlichung von Allcock et al., Macromolecule 10 : 824-830 (1977), dargestellt werden.
Verfahren für die Synthese und die Analyse von verschiedenen Typen von Polyphosphazenen werden beschrieben bei Allcock, H. R. et al., Inorg. Chem. 11, 2584 (1972); Allcock et al., Macromelcules 16, 715 (1983); Allcock et al., Macromolecules 19, 1508 (1986); Allcock et al., Biomaterials 19, 500 (1988); Allcock et al., Macromolecules 21, 1980 (1988); Allcock et al., Inorg. Chem. 21 (2), 515-521 (1982); Allcock et al., Macromolecules 22, 75 (1989); in den U. S. - Patenten Nr. 4 440 921, 4 495 174 und 4 880 622 an Allcock et al.; dem US-Patent Nr. 4 946 938 an Magill et al.; und bei Grollemann et al., J. Controlled Release 3, 143 (1986).
Verfahren für die Synthese der anderen oben beschriebenen Polymere sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Siehe z. B. Concise Encyclopedia of Polymer Science und Polymeric Amines and Ammonium Salts, E. Goethals, Herausgeber (Pergamon Press, Elmsford, New York 1980). Viele Polymere, wie Polyacrylsäure, sind im Handel erhältlich.
Das wasserlösliche Polymer mit geladenen Seitengruppen wird vernetzt, indem das Polymer mit einer wässrigen Lösung umgesetzt wird, die multivalente Ionen der entgegensetzten Ladung enthält, d. h. entweder multivalente Kationen, wenn das Polymer saure Seitengruppen aufweist, oder multivalente Anionen, wenn das Polymer basische Seitengruppen aufweist. Die bevorzugten Kationen für eine Vernetzung des Polymers mit sauren Seitengruppen unter Bildung eines Hydrogels sind divalente oder trivalente Kationen wie Kupfer, Calcium, Aluminium, Magnesium, Strontium, Barium und Zinn, obwohl auch di-, tri- oder tetrafunktionelle organische Kationen, wie Alkylammoniumsalze, beispielsweise RgN+-VW-+NR3, verwendet werden können. Wässrige Lösungen der Salze dieser Kationen werden zu den Polymeren gegeben, wobei sich weiche, stark geschwollene Hydrogele und Membranen bilden. Je höher die Konzentration des Kations ist, oder je höher dessen Valenz ist, um so größer ist das Ausmaß der Vernetzung des Polymers. Für Konzentration ab 0,005 M wurde gezeigt, dass sie das Polymer vernetzen. Höhere Konzentrationen werden durch die Löslichkeit des Salzes limitiert.
Die bevorzugten Anionen für eine Vernetzung des Polymers unter Bildung eines Hydrogels sind divalente oder trivalente Anionen, wie Dicarbonsäuren niedrigen Molekulargewichts, beispielsweise Terephthalsäure, Sulfationen und Carbonationen. Wässrige Lösungen der Salze dieser Anionen werden zu den Polymeren gegeben, wobei sich weiche, stark geschwollene Hydrogele und Membranen bilden, wie es bezüglich der Kationen beschrieben wurde.
Es können verschiedene Polykationen verwendet werden, um das Polymer-Hydrogel zu komplexieren und dadurch zu einer semipermeablen Oberflächenmembran zu stabilisieren. Zu Beispielen für Materialien, die verwendet werden können, gehören Polymere mit basischen reaktiven Gruppen wie Amino- oder Imino-Gruppen, die ein bevorzugtes Molekulargewicht zwischen 3 000 und 100 000 aufweisen, beispielsweise Polyethylenimin und Polylysin. Diese sind im Handel erhältlich. Ein Polykation ist Poly(L-lysin). Beispiele für synthetische Polyamine sind Polyethylenimin, Poly(vinylamin) und Poly(allylamin). Es gibt auch natürliche Polykationen, beispielsweise das Polysaccharid Chitosan.
Zu Polyanionen, die verwendet werden können, um durch die Reaktion mit basischen Oberflächengruppen auf dem Polymer-Hydrogel eine semipermeable Membran zu bilden, gehören Polymere und Copolymere von Acrylsäure, Methacrylsäure und andere Derivate von Acrylsäure, Polymere mit anhängenden SO&sub3;H-Gruppen, wie sulfoniertes Polystyrol, sowie Polystyrol mit Carbonsäure-Gruppen.

Zellsuspensionen

Vorzugsweise wird das Polymer in einer wässrigen Lösung von physiologischem pH gelöst, vorzugsweise einer 0,1 M Lösung von Kaliumphosphat, und zwar in einer solchen Konzentration, dass ein polymeres Hydrogel gebildet wird, beispielsweise für Alginat zwischen 0,5 und 2,0 Gew.-%, vorzugsweise 1%. Die isolierten Zellen werden in der Polymerlösung in einer Konzentration zwischen 1 und 50 Millionen Zellen/ml suspendiert, am bevorzugtesten zwischen 10 und 20 Millionen Zellen/ml.

Polymermatrix

Matrices für eine Implantation können ebenfalls aus den gleichen Polymeren gebildet werden, die für die Bildung von Mikrokügelchen, die für die Zufuhr biologisch aktiver Faktoren eingesetzt werden, verwendet werden. Die Polymere werden vorzugsweise als eine faserige Struktur bereit gestellt, deren Fasern ausreichende Abstände aufweisen, um eine freie Diffusion von Nährstoffen und Gasen zu den Zellen zu ermöglichen, die an der Oberfläche der Matrix haften. Diese Abstände liegen typischerweise im Bereich von 100 bis 300 um, obwohl geringere Abstände eingesetzt werden können, wenn man die Matrix implantiert, Blutgefäße die Matrix infiltrieren lässt und dann die Zellen in die Matrix sät.
Damit ein Organ konstruiert, erfolgreich implantiert werden und funktionsfähig sein kann, müssen die Matrices eine ausreichende Oberfläche aufweisen und einen ausreichenden Zutritt von Nährstoffen ermöglichen, so dass nach der Implantation und vor dem Einwachsen von Blutgefäßen ein Zellwachstum und eine Zelldifferenzierung erfolgen können. Die Zeit, die für eine erfolgreiche Implantation und ein Wachstum von Zellen in der Matrix benötigt wird, wird stark vermindert, wenn das Gebiet, in das die Matrix implantiert wird, bereits mit Gefäßen versorgt ist. Nach der Implantation muss die Konfiguration eine Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten ermöglichen sowie eine fortgesetzte Einwanderung von Blutgefäßen, wenn die Zellproliferation erfolgt.
Zellen können entweder implantiert werden, nachdem sie auf eine Matrix ausgesät wurden, oder sie können in eine Matrix injiziert werden, die bereits in die gewünschte Stelle implantiert wurde. Der letztere Ansatz hat den Vorteil, dass die Matrix dazu verwendet werden kann, die Stelle vorher mit Gefäßen zu versorgen. In diesem Falle sind die Konstruktion und die Ausführung des Gerüstes von großer Bedeutung. Die Matrix sollte eine biegsame, nicht-toxische, injizierbare poröse Schablone für ein Einwachsen von Gefäßen sein. Die Poren sollten ein Einwachsen von Gefäßen und die Injektion von Zellen, wie Hepatozyten, ermöglichen, ohne dass die Zellen oder der Patient geschädigt werden. Es handelt sich dabei im allgemeinen um untereinander verbundene Poren von ungefähr 100 bis 300 um. Die Matrix sollte so geformt sein, dass die Oberfläche maximal ist, damit eine adäquate Diffusion von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren zu den Zellen möglich ist und das Einwachsen neuer Blutgefäße und von Bindegewebeermöglicht wird. Derzeit wird eine poröse Struktur, die beständig gegen ein Zusammendrücken ist, für eine Implantation und eine Prävaskularisierung, an die sich das Aussäen der Zellen anschließt, bevorzugt.
Bei der bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix aus einem biologisch absorbierbaren oder biologisch abbaubaren, synthetischen Polymer, wie einem Polyanhydrid, einem Polyorthoester, einer Polymilchsäure, einer Polyglycolsäure und Copolymeren oder Mischungen von diesen gebildet. Nicht-abbaubare Materialien können ebenfalls zur Bildung der Matrix verwendet werden. Zu Beispielen für geeignete Materialien gehören Ethylenvinylacetat, Derivate von Polyvinylalkohol, Teflon und Nylon. Die bevorzugten nicht-abbaubaren Materialien sind ein Schwamm aus Polyvinylalkohol oder alkylierten und acylierten Derivaten von diesem, einschließlich von Estern. Ein nicht-absorbierbarer Schwamm aus Polyvinylalkohol ist im Handel als IvalonTM bei Unipoint Industries erhältlich. Verfahren zur Herstellung dieses Materials werden in den US-Patenten Nr. 2 609 347 an Wilson, 2 653 917 an Hammon, 2 659 935 an Hammon, 2 664 366 an Wilson, 2 664 367 an Wilson und 2 846 407 an Wilson beschrieben. Collagen kann ebenfalls verwendet werden, aber es ist nicht so gut kontrollierbar, und es wird nicht bevorzugt. Diese Materialien sind alle im Handel erhältlich. Es können, in Abhängigkeit von der letztendlichen Lokalisation der wachsenden Zellen, nicht biologisch abbaubare Polymermaterialien verwendet werden, einschließlich von Polymethacrylat und Silicon-Polymeren.
Bei einigen Ausführungsformen wird das Anhaften der Zellen an das Polymer durch das Beschichten der Polymere mit Verbindungen verbessert, beispielsweise mit Komponenten der Basalmembran, Agar, Agarose, Gelatine, Akariengummi, Collagen vom Typ I, II, III, IV und V, Fibronectin, Laminin, Glycosaminoglycanen, Mischungen von diesen sowie anderen Materialien, die Fachleuten auf dem Gebiet der Zellkultur bekannt sind.
Alle Polymere, die in der Matrix eingesetzt werden sollen, müssen die mechanischen und biochemischen Ansprüche erfüllen, die erforderlich sind, damit die Zellen entsprechend unterstützt werden und anschließend wachsen und proliferieren können. Die Polymere können hinsichtlich ihrer mechanischen Eigenschaften charakterisiert werden, beispielsweise bezüglich der Zugfestigkeit mittels eines Instron-Testgeräts, bezüglich des Molekulargewichts des Polymers mittels Gel-Permeationschromatographie (GPC), bezüglich der Glasübergangstemperatur mittels differenzieller Scanning-Kalorimetrie (DSC) und bezüglich der Bindungsstruktur mittels Infrarotspektroskopie (IR), bezüglich der Toxikologie mittels anfänglicher Screening-Tests, zu denen Ames-Tests und In-vitro-Tests auf Teratogenität gehören, und bezüglich einer Immunogenität und Entzündungsauslösung und der Freisetzung und des Abbaus mittels Implantationsstudien an Tieren.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden, nichteinschränkenden Beispiele besser verstanden werden. Die Methodologie und die Zusammensetzungen werden zwar unter Bezugnahme auf die Stimulation von Hepatozyten in vitro oder nach Implantation in vivo beschrieben, aber sie sind auch auf eine Transplantation anderer Zelltypen anwendbar.
Es wurde ein System entwickelt, um hepatotrophe Faktoren am Ort einer Hepatozyten- Transplantation freizusetzen. EFG, das in polymere Mikrokügelchen inkorporiert und aus diesen freigesetzt wurde, behielt seine biologische Aktivität in vitro bei, und es war imstande, das Anwachsen von Hepatozyten, die an heterotope Stellen implantiert wurden, positiv zu beeinflussen. Bemerkenswerterweise war das Anwachsen dieser Zellen, die auf biologisch abbaubaren Polymergerüsten transplantiert worden waren, von der Anwesenheit sowohl von EGF als auch von Faktoren aus dem Portalkreislauf abhängig, und die Zufuhr von EGF allein hatte nur einen geringen oder keinen Effekt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Überleben von Zellen, die auf synthetischen Gerüsten transplantiert werden, durch die Modulierung der lokalen Umgebung gesteuert werden kann, und dass dieses System auch ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Biologie der Leberzelle in vivo sein könnte.
Die Zufuhr hepatotropher Faktoren über eine verzögerte Freisetzung aus Mikrokügelchen ist eine flexible Technik zur Steuerung der lokalen Umgebung transplantierter Zellen. Mit diesem Ansatz kann eine bekannte Dosis eines Faktors zugeführt werden, und die Dosis, die zur Erzielung einer biologischen Wirkung erforderlich ist, kann recht klein sein (ungefähr 10 ug/Tier in dieser Studie), und zwar als Folge der direkten Zufuhr zum gewünschten Wirkort. Der Zeitraum, über den ein Arzneimittel aus einer Polymermatrix freigesetzt wird, kann typischerweise über die Beladung mit dem Arzneimittel, den Typ des eingesetzten Polymers und die genauen Verarbeitungsbedingungen reguliert werden, wie oben diskutiert wurde. Die Freisetzung von Proteinen aus Copolymeren aus Milchsäure und Glycolsäure, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, wird im allgemeinen durch die Erosion des Polymers gesteuert, wenn das Verhältnis von Protein zu Polymer niedrig liegt (Cohen et al., Pharm. Res. 8 : 713-720 (1991)). Das freigesetzte Protein muss allerdings auch seine biologische Aktivität behalten, wenn dieser Ansatz nützlich sein soll. Die biologische Aktivität des EGF, das in die Mikrokügelchen inkorporiert und aus diesen freigesetzt wurde, schien in dieser Studie nicht negativ beeinflusst zu werden.
Zusammenfassend wurde ein System zur Untersuchung der Rolle spezifischer Faktoren bei der Regulation des Überlebens von Zellen und des Wachstums von Zellen entwickelt, das von großer Bedeutung für die Fähigkeit zur Förderung des Anwachsens transplantierter Zellen sein kann. Weiterhin könnte die Kombination dieses Ansatzes mit der Konstruktion synthetischer extrazellulärer Matrices (Barrera et al., J. Am. Chem. Soc. 115 : 11010-11011 (1993)) für eine Zelltransplantation es möglich machen, die Gen-Expression transplantierter Zellen, wenn sie auf lösliche Wachstumsfaktoren reagieren, auf mehreren Ebenen zu modulieren (Mooney et al., 1992)).

Beispiel 1: Herstellung von Mikrokügelchen

Materialien und Methoden

Präparation der Mikrokügelchen und deren Charakterisierung

EGF-haltige Mikrokügelchen wurden mittels einer Modifikation einer kürzlich beschriebenen Doppel-Emulsionstechnik hergestellt (Cohen et al., 1991). Es wurde, kurz zusammengefasst, ein 75 : 25 Copolymer aus Poly-(D,L-milchsäure-co-glycolsäure) (Resomer RG 75R, spezifische Viskosität 0,2, Henley Chem. Inc., Montvale, New Jersey) in Ethylacetat (Fisher Scientific) aufgelöst, so dass eine 5%-ige Lösung (Gew.Nol.) erhalten wurde. Mäuse-EGF (Collaborative Research, Bedford, Massachusetts) wurde so in Wasser aufgelöst, dass eine Lösung von 2 mg/ml erhalten wurde, und 50 ul der EGF-Lösung wurden zu 1 ml der Polymerlösung gegeben. Die Lösung aus Polymer und EGF wurde kontinuierlich 15 s lang bei 10 Watt sonifiziert (Vibracell, Sonics and Materials, Danbury, Connecticut), so dass eine einfache Emulsion erhalten wurde. Es wurde das gleiche Volumen einer wässrigen Lösung, die 1% Polyvinylalkohol (MG 25 000, 88% hydrolysiert; Polysciences Inc., Warrington, Pennsylvania) und 7% Ethylacetat enthielt, zu der einfachen Emulsion gegeben, und die resultierende Lösung wurde 15 s lang mit hoher Geschwindigkeit gemischt (Vortex Mixer; VWR) um die Doppel-Emulsion zu erhalten. Diese Doppel-Emulsion wurde in einen schnell gerührten Becher von 250 ml gegeben, der 150 ml einer wässrigen Lösung von 0,3% Polyvinylalkohol/7% Ethylacetat enthielt. Man ließ das Ethylacetat während der folgenden drei Stunden verdampfen, wobei Polymer-Mikrokügelchen erhalten wurden, die eingeschlossenes EGF enthielten. Die Mikrokügelchen wurden dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen, und Kügelchen mit einer Größe zwischen 32 und 0,4 um wurden gesammelt. Die Mikrokügelchen wurden lyophilisiert (Labconco Freeze Dryer, Kansas City, Missouri) und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert. Kontrollkügelchen wurden mittels der gleichen Prozedur hergestellt, aber die wässrige Lösung, die zur Bildung der ersten, einfachen Emulsion (Wasser in organischem Lösemittel) verwendet wurde, enthielt kein EGF.
Um die Wirksamkeit der EGF-Inkorporation und die Kinetik der Freisetzung von EGF aus den Mikrokügelchen zu bestimmen, wurde 125I-markiertes Mäuse-EGF (260 mCi/mg; Biomedical Techn. Inc., Stoughton, Massachusetts) als Tracer verwendet. Es wurde ungefähr 1 uCl des markierten EGF der wässrigen EGF-Lösung vor der Bildung der einfachen Emulsion zugesetzt, und die Kügelchen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach der Herstellung der Kügelchen wurde eine bekannte Masse der Kügelchen in einem LKB CliniGamma 1272 (Wallac, Gaithersburg, Maryland) gezählt, und die inkorporierten cpm wurden mit denjenigen der wässrigen EGF-Ausgangslösung verglichen, um den prozentualen Anteil des gesamten EGFs zu berechnen, der in die Kügelchen eingearbeitet worden war. Zur Bestimmung der Freisetzung von EGF aus den Mikrokügelchen wurde eine bekannte Masse der mit dem markierten EGF hergestellten Kügelchen (ungefähr 10 mg) in ein bekanntes Volumen (2 ml) einer Lösung von Phosphat-gepufferter Saline (PBS), die 0,1% Tween 20 (Sigma Chem. Co.) enthielt, gegeben und in einen Inkubator von 37ºC verbracht. Zu bestimmten Zeiten wurde die Lösung zentrifugiert, um die Kügelchen auf dem Boden des Gefäßes zu konzentrieren, und es wurden Proben (0,1 ml) der PBS/Tween-20-Lösung entnommen. Das Probenvolumen wurde durch frische PBS/Tween- 20-Lösung ersetzt. Die Menge des aus den Mikrokügelchen freigesetzten ¹²&sup5;I-EGF wurde für jeden Zeitpunkt durch das Zählen der entnommenen Probe in einem Gamma-Zähler bestimmt und mit dem in die Mikrokügelchen geladenen ¹²&sup5;I-EGF verglichen. Die maximale EGF-Konzentration im Freisetzungsmedium (ungefähr 5 ug/ml) lag deutlich unterhalb der maximalen Löslichkeit des EGF, wodurch korrekte Bedingungen für die Freisetzungsstudie vorlagen.
Mikroskopische Aufnahmen wurden mit Hilfe eines Polaroid-55-Films aufgenommen. Die Teilchengrößenverteilung der Mikrokügelchen wurde mittels eines Coulter Multisizer II (Coulter Electronics, Luton, GB) bestimmt. Der zur Herstellung der Mikrokügelchen eingesetzte Prozess ist diagrammartig in der Fig. 1 gezeigt.

ERGEBNISSE

Es wurde eine EGF-Lösung in Wasser einer Lösung zugesetzt, die 5% Polymer in Ethylacetat enthielt, und zur Erzeugung der einfachen Emulsion der wässrigen EGF-Lösung in der organischen Phase wurde sonifiziert. Diese Emulsion wurde zu einem größeren Volumen einer wässrigen Lösung gegeben, die ein Detergens enthielt, und zur Bildung der Doppel-Emulsion wurde gemischt. Die Kügelchen wurden schnell gemischt, während das Ethylacetat abdampfte, um eine Koaleszenz der Mikrokügelchen zu verhindern. Die Mikrokügelchen wurden anschließend gesiebt, um diejenigen zu sammeln, die eine Größe zwischen 0,4 und 30 um hatten, lyophilisiert und vor der Verwendung gelagert.
Die Größe der Mikrokügelchen wurde auf ungefähr 20 um eingestellt, was in etwa der Größer suspendierter Hepatozyten entspricht, indem die Konzentration der Ausgangspolymerlösung variiert wurde. Je höher die Konzentration des Polymers war, desto größer waren die Mikrokügelchen. Eine Polymerlösung von 5% (Gew./Vol.) führte zu einem Sortiment von Kügelchen, bei dem sich die Mehrzahl im gewünschten Größenbereich von 10 bis 30 um befand. Eine Quantifizierung der Größe der Mikrokügelchen zeigte, dass die durchschnittliche Größe der Mikrokügelchen 19 ± 12 um betrug. Die mit diesem Prozess erhaltene Ausbeute an Mikrokügelchen betrug 92 ± 5%.
Um die Wirksamkeit der Inkorporation von EGF in die Mikrokügelchen und das Freisetzungsprofil aus den Mikrokügelchen zu bestimmen, wurde ¹²&sup5;I-markiertes EGF als Tracer eingesetzt. Es wurde ungefähr die Hälfte des anfänglichen EGF (53 ± 11%) in die Mikrokügelchen inkorporiert. Wenn EGF-haltige Mikrokügelchen in ein wässriges Medium gebracht wurden, wurde eine anfängliche schnelle Freisetzung des EGF festgestellt, wie es in der Fig. 2 gezeigt ist. Nach dieser Zeit wurde das EGF gleichmäßig über die restliche Zeit des 30-tägigen Experimentes freigesetzt, wie ebenfalls in der Fig. 2 gezeigt ist.

Beispiel 2: In-vitro-Analyse der Wirksamkeit des freigesetzten EGF

MATERIALIEN UND METHODEN

Es wurden kultivierte Hepatozyten eingesetzt um zu bestimmen, ob das in die Mikrokügelchen inkorporierte und aus diesen freigesetzte EGF seine biologische Wirksamkeit beibehalten hatte. Hepatozyten wurden unter Verwendung einer Zweischritt-Collagenase-Perfusion aus Lewis-Ratten isoliert und mittels eines Percoll-Gradienten gereinigt, wie es kürzlich in der Arbeit von Mooney et al. (1992), die hier aufgenommen wird, beschrieben wurde. Die Hepatozyten wurden in einer Dichte von 10 000 Zellen/cm² in 24-Well-Gewebekulturschalen, die mit 1 ug/cm² Typ-I-Collagen beschichtet waren (Collagen Corp., Palo Alto, Kalifornien) unter Verwendung einer Carbonatpuffer-Beschichtungstechnik ausplattiert. In allen Experimenten wurde serumfreies William's Medium E (Gibco, Grand Island, New York) verwendet, das Insulin (20 mU/ml; Sigma), Dexamethason (5 nM; Sigma), Natriumpyruvat (20 mM, Gibco), eine Mischung aus Penicillin und Streptomycin (100 U/ml; Irvine Scientific, Santa Ana, Kalifornien) und Ascorbinsäure (50 ug/ml, täglich frisch; Gibco) enthielt. In bestimmten Experimenten wurden unterschiedliche Mengen an löslichem EGF (Collaborative Research, Bedford, Massachusetts) dem Medium zugesetzt. Für Bedingungen, in denen aus Mikrokügelchen freigesetztes EGF eingesetzt wurde, wurde Medium ohne EGF mit EGF-haltigen Mikrokügelchen 24 bis 96 Stunden lang inkubiert, um die Freisetzung bekannter Mengen an EGF zu ermöglichen, die Lösung wurde zentrifugiert, und das Medium, das das freigesetzte EGF enthielt, wurde entfernt und in anschließenden Experimenten verwendet. Um den Eintritt der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus zu analysieren wurde eine Autoradiographie unter Verwendung von tritiiertem Thymidin eingesetzt. Die kultivierten Hepatozyten wurden 48 h nach dem Ausplattieren mit frischem Medium versehen, das 1 uCl/ml 3H-Thymidin (NEN; Boston, Massachusetts) enthielt. Nach 72 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um das gesamte nicht-eingebaute 3H-Thymidin auszuwaschen, mit Glutaraldehyd fixiert und mit 100% Methanol dehydriert. Die Wells der Kulturschalen wurden mit NTB-2-Emulsion überschichtet (Kodak; Rochester, New York), und die Kulturschalen wurden 7 Tage lang in vollständiger Dunkelheit exponiert. Die Kulturschalen wurden mit D-19-Entwickler (Kodak) entwickelt, und mikroskopische Aufnahmen der Zellen wurden unter Verwendung eines TMAX-100-Films (Kodak) mit einem Nikon Diaphot-Mikroskop mittels Hoffman-Optik aufgenommen. In separaten Experimenten zur Bestimmung der Zeitabhängigkeit des Überlebens und der Zellteilung der kultivierten Hepatozyten wurde die Zahl der Hepatozyten, die sich nach 1, 4, 6, 8 und 11 Kulturtagen in den Wells der Kulturschalen befanden, über das Ablösen der Zellen mit einer Lösung aus 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA (Gibco) und das Zählen mittels eines Coulter-Counters bestimmt.

ERGEBNISSE

Die Wirksamkeit des aus den Mikrokügelchen freigesetzten EGF wurde mit kultivierten Hepatozyten bestimmt. EGF-haltige Mikrokügelchen wurden für festgelegte Zeiten mit Medium inkubiert, das kein EGF enthielt, um die Freisetzung einer bekannten Menge an EGF (berechnet unter Verwendung der Freisetzungskinetik) in das Medium zu ermöglichen. Dieses Medium wurden in Experimenten eingesetzt, bei denen die Zahl der Hepatozyten, die in die S-Phase des Zellzyklus eintraten und sich danach teilten, und der Zahl der überlebenden Hepatozyten quantifiziert wurden. EGF, das nicht in Mikrokügelchen inkorporiert war, stimulierte den Eintritt von Hepatozyten in die S-Phase auf dosisabhängige Weise, und die gleiche, sättigende Dosis dieses EGF oder des aus den Mikrokügelchen freigesetzten EGF führte zu einer ähnlichen Stimulation, wie durch die Fig. 4 gezeigt ist. Das freigesetzte EGF stimulierte auch die Zellteilung ähnlich wie Kontroll-EGF, da die Zahl der kultivierten Hepatozyten zwischen dem Tag 1 und dem Tag 4 ganz ähnlich anstieg, wenn entweder freigesetztes EGF oder Kontroll-EGF eingesetzt wurde, wie durch die Fig. 3 gezeigt wird.
Bemerkenswerterweise proliferieren Hepatozyten nicht nur nicht in Medium, das kein EGF oder eine niedrige Konzentration an löslichem EGF (1 ng/ml) enthält, sondern es kam unter diesen Bedingungen sogar zu einer Abnahme der Zellzahl zwischen dem Tag 1 und dem Tag 4 (Fig. 4), was mit der Abhängigkeit kultivierter Hepatozyten von Wachstumsfaktoren konsistent ist. Sogar noch mehr Hepatozyten starben über einen längeren Zeitraum in der Kultur unter diesen Bedingungen, aber aus den Mikrokügelchen freigesetztes EGF konnte diesen Zellverlust größtenteils verhindern, wie durch die Fig. 5 gezeigt wird.

Beispiel 3: In-vivo-Analyse der Co-Transplantation von EGF-Mikrokügelchen mit Hepatozyten

MATERIALIEN UND METHODEN

Isolierte und gereinigte Hepatozyten wurden mit EGF-haltigen Mikrokügelchen oder Kontroll-Mikrokügelchen (0,4 m) · 50 · 106 Hepatozyten/ml + 10 mg Mikrokügelchen) gemischt und auf zu 95% poröse zylindrische Schwämme (Durchmesser = 2,15 cm, Dicke = 1 mm) ausgesät, die aus Poly-L-milchsäure (Medisorb; Cincinnati, Ohio) hergestellt und mit Polyvinylalkohol beschichtet worden waren, einer kürzlich beschriebenen Technik (17). Vorrichtungen aus Zellen und Polymer wurden in das Mesenterium von Laborratten wie kürzlich beschrieben (18) implantiert, und die Hälfte der Tiere erhielt einen intrahepatischen, portosystemischen Shunt (vom Ende zur Seite) eine Woche vor der Zelltransplantation (18), um systemische stimulierende Faktoren zu erzeugen. Die Implantate wurden nach 14 Tagen entnommen, in Formalin fixiert und für das Schneiden verarbeitet. Schnitte der Implantate wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, und angewachsene Hepatozyten wurden anhand ihrer großen Größe, ihrer großen und runden Zellkerne und ihrer deutlichen cytoplasmatischen Färbung identifiziert. Eine Computerunterstützte Bildanalyse (Image Technologies Corp.) wurde zur Quantifizierung der Fläche jedes Schnittes, die von Hepatozyten besetzt war, eingesetzt. Die Zahl der Hepatozyten pro Vorrichtung wurde berechnet, indem die durchschnittliche Fläche eines Hepatozyten für die Bestimmung der Zahl der Hepatozyten pro Schnitt bestimmt wurde, und indem das Gesamtvolumen des Implantats damit multipliziert und durch das Volumen jedes Schnittes geteilt wurde. Alle Tiere wurden im Tierhaus des Children's Hospital gehalten, und es wurden die Richtlinien des NIH für die Behandlung und den Einsatz von Labortieren (NIH Publication Nr. 85-23 Rev. 1985) befolgt.

ERGEBNISSE

EGF-haltige Mikrokügelchen (40 mg) wurden in 0,4 ml PBS suspendiert, auf die porösen, biologisch abbaubare Schwämme aus Poly-L-milchsäure für die Transplantation von Zellen ausgesät und eine Woche lang in das Mesenterium von Lewis-Ratten implantiert um zu bestätigen, dass sich die Mikrokügelchen gleichmäßig über die Vorrichtungen verteilten. Eine Untersuchung von Schnitten der nach einer Woche entnommenen Vorrichtungen zeigte die relativ gleichmäßige Verteilung der Mikrokügelchen über das fibrovaskuläre Gewebe, das in diesem Zeitraum in die Vorrichtung einwandert.
Um zu bestimmen, ob das aus den Mikrokügelchen freigesetzte EGF das Anwachsen der in eine heterotope Stelle transplantierten Hepatozyten positiv beeinflusst, wurden Hepatozyten (0,4 ml · 5 · 10~ Zellen/ml) und Mikrokügelchen (10 mg) vermischt und auf poröse, biologisch abbaubare Schwämme aus Poly-L-milchsäure ausgesät. Die Vorrichtungen mit den Zellen und den Mikrokügelchen wurden in das Mesenterium von Laborratten implantiert, von denen die Hälfte zuvor einen PCS erhalten hatte. Die Wiedergewinnung der Implantate nach zwei Wochen, an die sich die histologische Präparation und Untersuchung anschloss, zeigte, dass die Tiere mit einem PCS, die EGF-haltige Mikrokügelchen erhalten hatten, offenbar die größte Zahl angewachsener Hepatozyten aufwiesen. Tiere mit einem PCS, die Kontrollmikrokügelchen erhalten hatten, wiesen weniger angewachsene Hepatozyten auf, und Tiere ohne einen PCS hatten noch weniger. Ein dünner Schnitt durch einen porösen Schwamm, der mit Mikrokügelchen besät und in vivo implantiert worden war, zeigte, dass fibrovaskuläres Gewebe zu diesem Zeitpunkt in der gesamten Polymervorrichtung vorhanden war, und Mikrokügelchen (runde Teilchen, ungefärbt, 1-30 um) waren in praktisch allen Bereichen des Schwammes sichtbar.
Die Quantifizierung dieser Ergebnisse bestätigte, dass Tiere mit einem PCS und EGF- Mikrokügelchen zweimal mehr Zellen enthielten als Tiere mit einem PCS und Kontrollkügelchen, wie durch die Fig. 6 gezeigt wird. Tiere ohne einen PCS wiesen sowohl mit EGF- als auch mit Kontroll-Mikrokügelchen ungefähr ein Drittel der Zahl der angewachsenen Hepatozyten auf, die Tiere mit einem PCS und EGF-Mikrokügelchen enthielten, und es wurde bei diesen Gruppen kein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich Kontroll- und EGF-Mikrokügelchen gefunden.
Angewachsene Hepatozyten waren unter allen Bedingungen sichtbar, zusammen mit Mesenterialgewebe des Wirts, Mikrokügelchen (runde Teilchen, ungefärbt, 1-30 um) und Teilen des Polymerschwamms.

Claims

1. Zusammensetzung zur Implantation in einen Patienten, der eine solche benötigt, wobei die Zusammensetzung aufweist 1) Zellen, die implantiert werden sollen, und 2) biologisch aktive Faktoren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wachstumsfaktoren, angiogenen Faktoren, die keine Wachstumsfaktoren sind, Faktoren, die das Einwachsen von fibrösem Gewebe verhindern, Hormonen und Chemotherapeutika besteht, wobei die Zellen auf einer Matrix oder suspendiert in einer Matrix bereit gestellt werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Faktoren aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dem Heparin Binding Growth Factor, dem Transforming Growth Factor alpha oder beta, dem alpha Fibroblastic Growth Factor, dem Epidermal Growth Factor, dem Vascular Endothelium Growth Factor, Insulin, Glucagon und Östrogen besteht.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Zellen Hepatozyten sind und der Faktor der Epidermal Growth Factor ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Parenchym- und Strukturzellen besteht.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen in einem Hydrogel suspendiert implantiert werden.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen auf einer fibrösen, biokompatiblen polymeren Matrix haften, deren Fasern Abstände von 100 bis 300 um aufweisen.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die biologisch aktiven Faktoren den Zellen in Mikrokügelchen zugeführt werden sollen, die eine verzögerte Freisetzung der biologisch aktiven Faktoren mit der Zeit bereit stellen.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die biologisch aktiven Faktoren über einen Zeitraum von einem Monat bis zu mehreren Jahren frei gesetzt werden.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die biologisch aktiven Faktoren den Zellen in Mikrokügelchen zugeführt werden sollen, die eine verzögerte Freisetzung der biologisch aktiven Faktoren mit der Zeit bereit stellen, und die Mikrokügelchen an der Matrix befestigt oder in diese eingearbeitet sind.

10. Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 für eine Verwendung in der Medizin.

11. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der implantierte Zellen benötigt.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Medikament zur Behandlung eines Patienten dient, bei dem zum Zeitpunkt der Verabreichung des Medikaments oder kurz vorher ein portaler kavaler Shunt angelegt wurde.