DE69525177T2

DE69525177T2 - Neurotrophe peptide des aktivitätsabhängigen neurotrophen faktors

Info

Publication number: DE69525177T2
Application number: DE69525177T
Authority: DE
Inventors: Douglas E. Brenneman; Ramat Hasharon Gozes Iiiana
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; National Institutes of Health NIH
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd; National Institutes of Health NIH
Priority date: 1994-10-17
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2015-10-17
Also published as: JPH10509428A; EP0797590B1; EP0797590A1; DE69525177D1; AU707838B2; US6174862B1; AU3764195A; ATE212359T1; WO1996011948A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktor (ADNF). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Familie von Polypeptiden, die sich vom ADNF ableiten, der neuroschützende/neurotrophe Wirkung an Neuronen zeigt, die ihren Ursprung im Zentralnervensystem haben, sowie deren Verwendungen zur Behandlung neurologischer Krankheiten und zur Verhinderung des Zelltods, der verbunden ist mit (1) gp120, dem Hüllprotein von HIV, (2) N-Methyl- D-asparaginsäure (Excito-Toxizität), (3) Tetrodotoxin (Blockierung der elektrischen Aktivität) und (4) β-Amyloidpeptid, einem Stoff, der mit neuronaler Degeneration bei der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang gebracht wird.

Hintergrund der Erfindung

Neuronaler Zelltod ist charakteristisch für die meisten sich entwickelnden Neuronensysteme in Wirbeltieren. Das Ausmass (30-80%) des Neuronentodes, der während der Entwicklung stattfindet, zeigt an, dass die Regulation dieses Prozesses für die Bestimmung der Struktur des Nervensystems von grundlegender Bedeutung ist. Obwohl über sehr viele beschreibende Daten hinsichtlich des Ausmasses und der Allgegenwart dieses neuronalen Zellverlustes berichtet worden ist, ist über den Mechanismus, der diesen Prozess während der Entwicklung reguliert, wenig bekannt.
Es ist jedoch klar, dass elektrische Aktivität beim Bestimmen neuronalen Überlebens während dieser regressiven Phase der Entwicklung eine wichtige Rolle spielt. Es ist zum Beispiel festgestellt worden, dass Blockierung der elektrischen Aktivität mit α-Bungarotoxin den natürlichen Zelltod in Rückenmarksmotoneuronen (Pittman und Oppenheim, Nature (Lond.), 271, 364-366 (1987)) und in trochlear nucleic in vivo (Creazzo und Sohal, Exp. Neurol., 66, 135-145 (1979)) vermindert.
Untersuchungen mit kultivierten dorsalen Rückenmarkswurzelganglion- (SC-DRG-) Neuronen haben gezeigt, dass neuronaler Zelltod während der Entwicklung in vitro auch in einer vorhersagbaren und aktivitätsabhängigen Art und Weise stattfindet (Brenneman et al., Peptides, 6, 35-39 (1985)). Eine Analyse der Wirkungen von Aktivitätsblockierung auf neuronales Überleben in Kultur hat eine Wechselwirkung zwischen konditionierenden Stoffen und elektrischer Aktivität angezeigt. Wenn endogene konditionierende Stoffe vor der elektrischen Blockierung entfernt wurden, wurde der neuronale Zelltod beschleunigt (Brenneman et al., Dev. Brain Res., 9, 13-27 (1983)). Wenn die konditionierenden Stoffe aus SC-DRG-Kulturen im Gegensatz dazu während der Blockierung elektrischer Aktivität zugeführt wurden, wurde der neuronale Zelltod verhindert (Brenneman et al., Dev. Brain Res., 15, 211-217 (1984)).
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass Teil der molekularen Grundlage dieser Aktivitätsabhängigkeit die Wirkung des vasoaktiven Intestinalpeptids (VIP) ist, eines Neuropeptids, das während der elektrischen Aktivität freigesetzt wird (Brenneman, D. E. und Eiden, L. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 1159-1162 (1986); Brenneman et al., Peptides, 6, 35-39 (1985)). Ausserdem haben Untersuchungen gezeigt, dass das VIP das Überleben von aktivitätsabhängigen Rückenmarksneuronen durch Freisetzen von Proteinwachstumsfaktoren aus nichtneuronalen Rückenmarkszellen erhöht (Brenneman et al., J. Cell Biology, 104, 1603-1610 (1987)). Insbesondere ist festgestellt worden, dass eine Wechselwirkung zwischen dem VIP und seinen Rezeptoren an Gliazellen stattfindet (Gozes et al., Soc. Neurosci. Abs 15, 216 (1989)), um die Sekretion von neuronalem/n Überlebensfaktor(en) zu induzieren (Brenneman et al., J. Neurosci. Res 25, 386-394 (1990); Gozes, I. und Brenneman, D. E., Molecular Neurobiology, 3, 201-236 (1989)).
Unter den Wachstumsfaktoren, die aus nichtneuronalen Rückenmarkszellen durch VIP freigesetzt werden, befindet sich der Aktivitätsabhängige Neurotrophe Faktor (ADNF). Dieser Glia-abgeleitete, VIP-freigesetzte Wachstumsfaktor ist aus konditioniertem Medium vom Astroglia des Zerebralkortex der Ratte, stimuliert durch VIP, isoliert worden (Gozes, I. und Brenneman, D. E., Molecular Neurobiology, 3, 1-36 (1989); Brenneman, D. E. und Eiden, L. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 1159-1162 (1986)). Nachfolgende chromatographische Trennungen durch Ionenaustausch, Gelpermeation und hydrophobe Wechselwirkung sind eingesetzt worden, um eine etwa 1650-fache Reinigung eines einzelnen, 14.000 Dalton Proteins (scheinbarer pl: 8,3 ± 0,25) zu erhalten, das das Überleben (EC50, 0,075 pg/ml) elektrisch blockierter Rückenmarksneuronen erhöht. Folglich ist dieser Glia-abgeleitete, VIP- freigesetzte Wachstumsfaktor Aktivitätsabhängiger Neurotropher Faktor genannt worden. Es ist gezeigt worden, dass ADNF neuronale Zellen gegen Tod schützt. Insbesondere ist gezeigt worden, dass ADNF das Wachstum und das Überleben von sich entwickelnden Rückenmarksneuronen, Hippocampusneuronen und Zerebralkortexneuronen erhöht. Ausserdem ist festgestellt worden, dass ADNF die Lebensfähigkeit neuronaler Zellen dadurch schützt, dass der neuronale Zelltod verhindert wird, der durch das Aussenhüllprotein des HIV-Virus hervorgerufen wird.
Obwohl ADNF gegen neuronalen Zelltod wirksam schützt, wäre es vorteilhaft, über Polypeptide zu verfügen, die kürzer sind als die Aminosäuresequenz von ADNF in vollständiger Länge, die aber dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung des intakten ADNF-Wachstumsfaktors zeigen. In ziemlich überraschender Weise können mit der vorliegenden Erfindung solche Polypeptide zur Verfügung gestellt werden.

Kurzdarstellung der Erfindung

Eine aktive Stelle für den Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktor (ADNF) ist nun entdeckt worden. Es ist ziemlich überraschend, dass diese aktive Stelle, die eine Länge von nur neun Aminosäuren hat, potenter ist als intakter ADNF und über einen grösseren Bereich von Konzentrationen (d. h. von 0,01 fM bis etwa 1 pM) wirksamer ist. Dies ist das erste Mal, dass ein Polypeptid identifiziert worden ist, das die vollständige biologische Aktivität eines intakten Wachstumsfaktors nachahmt. Es ist ferner entdeckt worden, dass andere ADNF-Polypeptide, die diese aktive Stelle enthalten, auch die neuroschützende/neurotrophe Wirkung von intaktem ADNF besitzen. Als solches betrifft die vorliegende Erfindung eine Familie von ADNF-Polypeptiden, die im wesentlichen aus dieser aktiven Stelle von ADNF besteht, die die neuroschützende/neurotrophe Aktivität von intaktem ADNF aufweist. Diese kleineren ADNF-Polypeptide sind dadurch von Vorteil, dass sie die Hirnschranke leicht überqueren. Ausserdem weisen sie wegen ihrer Länge keine Löslichkeitsprobleme auf, die mit dem intakten ADNF-Wachstumsfaktor verbunden sind.
In ziemlich überraschender Weise ist ferner entdeckt worden, dass ein solches ADNF-Polypeptid zur Behandlung neurologischer Mängel und zur Verhinderung des neuronalen Zelltods verwendet werden kann. Solche ADNF-Polypeptide können zum Beispiel eingesetzt werden, um den Tod von Neuronenzellen zu verhindern, einschliesslich des Todes von Rückenmarksneuronen, Hippocampusneuronen, Zerebralkortexneuronen und cholinergen Neuronen, wobei diese Aufzählung nicht abschliessend ist. Insbesondere können die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eingesetzt werden, um den Zelltod zu verhindern, der im Zusammenhang steht mit (1) gp120, dem Hüllprotein von HIV, (2) N-Methyl-D-asparaginsäure (Excito- Toxizität), (3) Tetrodotoxin (Blockierung der elektrischen Aktivität) und (4) β-Amyloidpeptid, einem Stoff, der mit neuronaler Degeneration bei der Alzheimer- Krankheit in Zusammenhang gebracht wird.
Als solches betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods. Insbesondere betrifft die Erfindung unter einem Aspekt Verfahren zur Verwendung der ADNF-Polypeptide, um gp120-induzierten neuronalen Zelltod bei einem mit HIV infizierten Patienten zu verhindern. Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemässen ADNF- Polypeptide, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, der mit durch N-Methyl- D-aspartat-Stimulation induzierter Excito-Toxizität verbunden ist. Gemäss noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, der durch das β-Amyloidpeptid in einem Patienten induziert wird, der an der Alzheimer- Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird. Gemäss noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung der ADNF-Polypeptide, um Lernbeeinträchtigung zu lindern, die durch cholinerge Blockierung in einem Patienten hervorgerufen wird, der an der Alzheimer-Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird. Die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide können wirksam eingesetzt werden, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, der mit mehreren anderen neurologischen Krankheiten und Mängeln im Zusammenhang steht.
Andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung und ihre bevorzugten Ausführungsformen sind aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich.
Gemäss einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF), wobei das Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y
wobei
R¹ eine Aminosäuresequenz ist, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, bei der jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure-Nachahmern,
R² eine Aminosäuresequenz ist, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, bei der jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure-Nachahmern, und
x und y unabhängig voneinander ausgewählt sind und gleich Null oder Eins sind, unter der Voraussetzung, dass
das ADNF-Polypeptid eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz hat und
das ADNF-Polypeptid eine von der Aminosäuresequenz des 14-mers, das durch V-8-Proteaseverdau der vollständigen Länge des ADNF erzeugt wird, verschiedene Aminosäuresequenz hat.
Gemäss einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Polypeptid- Antagonist des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF), wobei der Antagonist im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile,
unter der Voraussetzung, dass
der ADNF-Polypeptid-Antagonist eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz eines Hitzeschockproteins (hsp 60) verschiedene Aminosäuresequenz hat.
Gemäss einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods von neuronalen Zellen in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern.
Gemäss einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie eines pharmazeutisch verträglichen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods in einem mit dem Menschlichen Immunschwäche Virus (Human Immunodeficiency Virus) infizierten Patienten.
Gemäss einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, der mit durch N-Methyl-D-aspartat-Stimulation induzierter Excito-Toxizität im Zusammenhang steht, in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie eines pharmazeutisch verträglichen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, der durch das β-Amyloidpeptid bei einem an der Alzheimer-Krankheit leidenden Patienten induziert wird.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie eines pharmazeutisch verträglichen Trägers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der durch cholinerge Blockierung hervorgerufenen Lernbeeinträchtigung bei einem an der Alzheimer-Krankheit leidenden Patienten.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptid-Antagonisten des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung des neuronalen Zelltods in einer Menge, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu induzieren, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der neuronalen Zellen mit dem ADNF-Polypeptid-Antagonisten umfasst, der im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, das einen pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträger und ein erfindungsgemässes Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) umfasst.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

In Fig. 1 ist die Dosis-Wirkungs-Beziehung der überlebensfördernden Aktivität von ADNF veranschaulicht, die durch Wirkungen an Rückenmarksneuronen bestimmt wurde: Vergleich zwischen konditioniertem Medium und gereinigtem ADNF.
In den Fig. 2A-C sind die Reinigungsschritte von ADNF veranschaulicht, die durch Wirkungen an Rückenmarksneuronen bestimmt wurden.
In den Fig. 3A-C sind die biochemischen Eigenschaften von gereinigtem ADNF veranschaulicht.
In Fig. 4 ist ein Vergleich der neuronalen überlebensfördernden Aktivität von intaktem ADNF, ADNF-14 und einem hsp60-Peptid in Tetrodotoxin behandelten Zerebralkortexkulturen dargestellt.
In Fig. 5 sind die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von ADNF-verwandten Peptiden hinsichtlich ihrer Fähigkeit gezeigt, neuronales Überleben in TTX-behandelten Zerebralkortexkulturen zu erhöhen.
In Fig. 6 ist ein Vergleich von gereinigtem ADNF mit ADNF-verwandten Peptiden hinsichtlich ihrer Wirkung auf neuronales Überleben in TTX-behandelten Zerebralkortexkulturen gezeigt.
In Fig. 7 ist die Wirkung von konservativen Substitutionen und von Peptidverlängerung auf die überlebensfördernde Aktivität von ADNF-Peptid, d. h. SALLRSIPA, veranschaulicht.
In Fig. 8 sind die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von ADNF-verwandten Peptiden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, neuronales Überleben in TTX-behandelten Zerebralkortexkulturen zu erhöhen, dargestellt.
In Fig. 9 sind die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von ADNF-verwandten Peptiden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, neuronales Überleben in TTX-behandelten Zerebralkortexkulturen zu erhöhen, gezeigt.
In Fig. 10 ist veranschaulicht, dass der ADNF/hsp60-Antagonist neuronalen Zelltod in dissoziierten Zerebralkortexkulturen hervorruft.
In Fig. 11 ist die Fähigkeit eines ADNF-verwandten Peptids veranschaulicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, der mit dem HIV-Hüllprotein gp120 im Zusammenhang steht.
In Fig. 12 ist die Fähigkeit eines ADNF-verwandten Peptids veranschaulicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, der mit NMDA-Toxizität in dissoziierten Zerebralkortexkulturen im Zusammenhang steht.
In Fig. 13 ist die Fähigkeit des β-Amyloidpeptids veranschaulicht, den neuronalen Zelltod in dissoziierten Zerebralkortexkulturen zu induzieren.
In Fig. 14A ist veranschaulicht, dass ADNF-14 den Zelltod verhindern kann, der mit dem β-Amyloidpeptid, einem die Alzheimer-Krankheit verursachenden Mittel, im Zusammenhang steht.
In Fig. 14B ist veranschaulicht, dass ADNF-9 den Zelltod verhindern kann, der mit dem β-Amyloidpeptid, einem die Alzheimer-Krankheit verursachenden Mittel, im Zusammenhang steht.
In Fig. 15A ist veranschaulicht, dass ADNF-14 im Anschluss an eine tägliche nasale Verabreichung von 1 ug/Tag Lernbeeinträchtigung lindern kann, die durch cholinerge Blockierung hervorgerufen wird.
In Fig. 15B ist veranschaulicht, dass ADNF-9 im Anschluss an eine tägliche nasale Verabreichung von 1 ug/Tag Lernbeeinträchtigung lindern kann, die durch cholinerge Blockierung hervorgerufen wird.
In Fig. 16 ist veranschaulicht, dass ADNF-9 den Thymidineinbau in die DNA des Neuroblastoms des Menschen erhöht.

Definitionen

"Peptide", "Polypeptide" und "Oligopeptide" sind Aminosäureketten (typischerweise L-Aminosäuren), deren α-Kohlenstoffatome durch Peptidbindungen verbunden sind, die durch eine Kondensationsreaktion zwischen dem Carboxylrest des α-Kohlenstoffatoms einer Aminosäure und dem Aminorest des α-Kohlenstoffatoms einer anderen Aminosäure erzeugt wird. Die endständige Aminosäure an einem Ende der Kette (d. h. der Amino-Terminus) weist einen freien Aminorest auf, während die endständige Aminosäure am anderen Ende der Kette (d. h. der Carboxy-Terminus) einen freien Carboxylrest aufweist. Als solches bezieht sich der Begriff "Amino-Terminus" (abgekürzt N-Terminus) auf den freien α-Aminorest an der Aminosäure am Amino- Terminus des Peptids oder auf den α-Aminorest (Iminorest, wenn er an einer Peptidbindung beteiligt ist) einer Aminosäure an irgendeiner anderen Stelle im Peptid. In gleicher Weise bezieht sich der Begriff "Carboxy-Terminus" (abgekürzt C-Terminus) auf den freien Carboxylrest an der Aminosäure am Carboxy-Terminus eines Peptids oder auf den Carboxylrest einer Aminosäure an irgendeiner anderen Stelle im Peptid.
Typischerweise sind die ein Polypeptid bildenden Aminosäuren der Reihenfolge nach nummeriert, wobei am Amino-Terminus begonnen wird und die Nummerierung zum Carboxy-Terminus des Polypeptids hin ansteigt. Wenn daher angegeben wird, dass eine Aminosäure einer anderen "folgt", bedeutet dies, dass diese Aminosäure dichter am Carboxy-Terminus des Polypeptids positioniert ist als die "vorhergehende" Aminosäure.
Der Begriff "Rest" wird hier verwendet, um sich auf eine Aminosäure oder einen Aminosäure-Nachahmer zu beziehen, die/der durch eine Amidbindung oder die Nachahmung einer Amidbindung in ein Polypeptid eingebaut ist. Als solches kann die Aminosäure eine natürlich vorkommende Aminosäure sein oder, wenn nicht anderweitig beschränkt, bekannte Analoga natürlicher Aminosäuren einschliessen, die auf eine den natürlich vorkommenden Aminosäuren ähnliche Art und Weise wirken (d. h. Aminosäure-Nachahmer). Ausserdem schliesst die Nachahmung einer Amidbindung Modifikationen des Peptidgrundgerüstes ein, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Der Begriff "biologisch aktiv" bezieht sich auf eine Peptidsequenz, die mit natürlich vorkommenden Biomolekülen in Wechselwirkung treten, entweder um die Wirkung solcher Moleküle in vitro oder in vivo zu aktivieren oder um zu inhibieren. Der Begriff "biologisch aktiv" wird hier am häufigsten verwendet, um sich auf Polypeptide des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors zu beziehen, die sowohl in vitro als auch in vivo die neuroschützende/neurotrophe Wirkung an Neuronen zeigen, die ihren Ursprung im Zentralnervensystem haben.
Der Begriff "im wesentlichen bestehend aus" wird hier verwendet, um irgendwelche Elemente auszuschliessen, die die wesentlichen Eigenschaften der ADNF-Polypeptide oder Polypeptid-Antagonisten, auf die sich der Begriff bezieht, im wesentlichen verändern würden. Daher schliesst die Beschreibung eines Polypeptids "im wesentlichen bestehend aus..." irgendwelche Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, oder -Deletionen aus, die die biologische Aktivität dieses Polypeptids im wesentlichen verändern würden.
Der Begriff "In-Kontakt-Bringen" wird hier austauschbar mit den folgenden Begriffen verwendet: verbunden mit, zugegeben zu, gemischt mit, überführt über, inkubiert mit, hinübergeströmt über usw. Ausserdem können die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide durch jedes herkömmliche Verfahren, wie zum Beispiel parenteral, oral, topisch und durch Inhalation, "verabreicht" werden. In gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen wird parenterale und nasale Inhalation angewendet.
"Eine ausreichende Menge" oder "eine wirksame Menge" ist die Menge eines gegebenen ADNF-Polypeptids, die die interessierende neuroschützende/neurotrophe Aktivität zeigt, oder die entweder zu subjektiver Erleichterung eines Symptoms/von Symptomen oder zu einer objektiv feststellbaren Verbesserung führt, die durch die Kliniker oder andere qualifizierte Beobachter festgestellt wird. Der Dosierungsbereich variiert mit dem verwendeten ADNF-Polypeptid, dem Verabreichungsweg und der Potenz des jeweiligen ADNF-Polypeptids.
Der Begriff "spezifisch binden" bezieht sich auf die Bindung eines ADNF-Polypeptids an ein bestimmtes Molekül und an kein anderes Molekül, dem das Polypeptid während des Verlaufs seiner Aktivität normalerweise ausgesetzt ist.
Die hier genannten Aminosäuren werden durch die Kurzschriftbezeichnungen wie nachfolgend beschrieben angegeben: Tabelle I: Aminosäure-Nomenklatur

Ausführliche Beschreibung der Erfindung und bevorzugter Ausführungsformen

A. Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von ADNF

Die Suche nach dem Glia-abgeleiteten, VIP-freigesetzten Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktor beruhte auf zwei früheren Beobachtungen: 1) dass gliales konditioniertes Medium neuronalen Zelltod in elektrisch blockierten Rückenmarkstestkulturen verhinderte (Brenneman, D. E. et al., J. Cell Biology, 104, 1603-1610 (1987)) und 2) dass das Neuronen-abgeleitete vasoaktive Intestinalpeptid (VIP) die Freisetzung überlebensfördernder Aktivität vom Astroglia erhöhte (Brenneman, D. E. et al., J. Neurosci. Res 25, 386-394 (1990)). Abgesonderte Proteine (> 3500 Dalton, was VIP ausschloss) wurden aus Astrogliakulturen gesammelt, die drei Stunden lang mit 0,1 nM VIP behandelt wurden (Fig. 1). Die abgesonderten Proteine zeigten unterschiedliche elektrophoretische Muster, die klar von zellulären Gesamtproteinen sowie von Proteinen unterschieden wurden, die aus Astrogliazellen abgesondert worden waren, die nicht durch VIP stimuliert wurden (Brenneman, D. E. et al., wie vorstehend (1990); Brenneman, D. E., Soc. for Neurosci. Absts., 26, 146 (1989)). Überlebensfördernde Aktivität wurde an Neuronen aus dissoziierten Rückenmarkskulturen getestet, einem gut charakterisierten System, in dem 50% der Neuronen innerhalb eines kritischen Entwicklungszeitraumes sterben (Brenneman, D. E. et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 233, 402-408 (1985)). Die Testkulturen (Brenneman, D. E. et al., Dev. Brain Res 15, 211-217 (1984)) wurden zusammen mit 1 uM Tetrodotoxin behandelt, um die elektrische Aktivität zu blockieren, wodurch die Synthese und Freisetzung von VIP inhibiert wurde (Agoston, D. V. et al., Mol. Brain Res 10, 235-240 (1991); Brenneman, D. E. et al., Peptides, 6(2), 35-39 (1985)). Der für die Überlebensaktivität im konditionierten Medium verantwortliche Faktor, d. h. ADNF, war Trypsin-empfindlich und wurde mit Hitze inaktiviert. In Fig. 1 ist die Potenz von unfraktioniertem konditioniertem Medium (Dreiecke, EC50: 125 pg/ml) mit der des gereinigten Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (Kreise, EC50: 0.075 pg/ml) verglichen, woraus sich eine 1650-fache Reinigung ergab (siehe nachstehend).
Der anfängliche Proteinreinigungsschritt durch DEAE-Sephacel-Ionenaustausch- Chromatographie ergab maximale biologische Aktivität in der Fraktion, die mit 2 M NaCl eluierte (Fig. 2A). Eine 10-fache Reinigung des überlebensfördernden Stoffs aus dem unfraktionierten konditionierten Medium wurde nach Anionenaustausch beobachtet (siehe Tabelle 1, nachstehend). Wie in Fig. 2B gezeigt ist, wurde das 2 M NaCl DEAE-Sephacel-Eluat unter Verwendung einer Schnelle-Protein-Flüssigkeits-Chromatographie (Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)) durch Gelfiltration (Superose 12) weiter aufgereinigt. Zwei Peaks überlebensfördernder Aktivität wurden entdeckt, einer mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 150.000 Dalton und der andere mit einem geschätzten Molekulargewicht von 16.000 Dalton. Die Fraktion mit dem niedrigeren Molekulargewicht aus der Gelfiltrationssäule wurde unter Verwendung einer hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographie weiter aufgereinigt. In Fig. 2C ist gezeigt, dass der für die neuronale überlebensfördernde Aktivität verantwortliche Faktor auf einen Einzelpeak beschränkt ist, der in der Mitte des entsalzenden Gradienten eluierte. Eine Zusammenfassung des Reinigungsschemas ist in nachfolgender Tabelle 1 angegeben. Das isolierte Protein wurde unter Verwendung der MinipHorTM-Vorrichtung isoelektrischer Fokussierung unterworfen. Die eluierten Fraktionen wurden pH- sowie biologischen Aktivitätsassays unterworfen, was einen Einzelpeak der überlebensfördernden Aktivität zeigte, die bei pH 8,1 eluierte (Fig. 3A). Die isoelektrische Fokussierung durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestätigte eine Einzelproteinbande mit einem Pl von 8,3 ± 0,25.
Um die Reinheit des durch das in nachstehender Tabelle 1 skizzierte Reinigungsschema erhaltenen ADNF zu erhärten, wurden Reversephase-Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese eingesetzt. Die HPLC-Analyse zeigte einen einzelnen Hauptpeak an, der mit einem Acetonitrilgradienten eluierte (Fig. 3B). Das aus der HPLC wiedergewonnene Material wurde anschliessend SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Es wurde gezeigt, dass es zu 99% rein war und ein Molekulargewicht von etwa 14.000 Dalton aufwies (Fig. 3C). Die aus diesem SDS-Gel eluierte Proteinbande behielt eine spezifische Aktivität im Überlebensassay, die ähnlich ist zu der, die nach der hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographie beobachtet wurde (Tabelle 1, nachstehend).
Um die Bedeutung von ADNF in einem Neuronensystem nachzuweisen, das homolog zu Kortexastrozytenkulturen der Ratte ist, wurde gereinigter ADNF in gemischten Neuronen/Gliazell-Kulturen getestet, die aus dem Zerebralkortex der Termratte (term rat) erhalten wurden (Hill, J. M., et al., Brain Res., 603, 222-233 (1993)). Wie in Fig. 4 gezeigt ist, wies der gereinigte ADNF bei zunehmendem neuronalem Überleben während eines fünftägigen Testzeitraums ausserordentliche Potenz auf (EC50: 0,3 fM). Der Zelltod, der mit Tetrodotoxin verbunden ist, sowie der, der in diesen Kulturen natürlich vorkommt, wurde durch ADNF-Behandlung verhindert. Ausserdem erhöhte auch die Zugabe von ADNF bei ähnlichen Konzentrationen in Zerebralkortexkulturen in Abwesenheit von Tetrodotoxin das neuronale Überleben (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen ein breites Spektrum an biologischer Aktivität für ADNF, insofern als Aktivität sowohl in Rückenmarkskulturen der Maus als auch in Zerebralkortexkulturen der Ratte festgestellt wurde. Tabelle 1: Zusammenfassung der Reinigung des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors. Das konditionierte Medium (300 ml) stammte aus Astrogliakulturen der Ratte, die mit 0,1 nM VIP stimuliert wurden.
* Eine Einheit wurde durch die Proteinmenge bestimmt, die eine halbmaximale Wirkung im Überlebensassay hervorruft. Beobachtete Abnahmen in der Aktivität nach dem Sieben und hydrophober Wechselwirkung können dem Dialyseverfahren und dem Vorhandensein von multiplen neurotrophen Stoffen zugeschrieben werden (siehe Fig. 2B).
Ausbeute: 0,005%
Reinigung: 1650-fach
Sobald er gereinigt war, war die Bestimmung der Aminosäuresequenz von ADNF das grundlegende Problem. Als gereinigter ADNF durch Edman-Abbau analysiert wurde, wurde N-Terminus-Blockierung beobachtet. ADNF nach HPLC-Reversephase-Chromatographie (Fig. 3B) wurde dann mit V8-Protease verdaut und die so erhaltenen Peptide durch HPLC getrennt (wie in Fig. 3B). Vier überlappende Peptide wurden sequenziert, von denen alle Sequenzhomologie zum Hitzeschockprotein (hsp) 60 der Ratte zeigten, entsprechend den Positionen 448-467 (einschliesslich der 26 Aminosäuren der Leitsequenzen (Venner, T. J. et al., Nucleic Acid Res., 18, 5309 (1990); Peralta, D. et al., Nucleic Acid Res., 18, 7162 (1990)). Die Siebanalyse der im konditionierten Medium vorhandenen neurotrophen Aktivität lieferte keinen Hinweis auf überlebensfördernde Aktivität im 40-70 kDalton-Bereich (siehe Fig. 2B). Diese Daten legten nahe, dass ein mit hsp60 verwandtes Protein für die überlebensfördernde Aktivität verantwortlich ist und dass dieses Protein durch VIP-stimuliertes Astroglia abgesondert wurde.

B. Neurotrophe Polypeptide von ADNF

Auf der Grundlage der Sequenzanalysen nach Proteaseverdau von ADNF und der erkannten Homologie zu hsp60 wurde eine grosse Anzahl an ADNF-Polypeptiden, die kürzer waren als intakter ADNF, synthetisiert und auf neuroschützende Aktivität in mit Tetrodotoxin behandelten Zerebralkortexkulturen getestet. Die synthetisierten Peptide wurden so gewählt, dass sie Regionen beobachteten Sequenzunterschieds zwischen hsp60 und ADNF einschlossen, wobei das Grundprinzip war, dass ADNF Funktionen haben würde, die von denen von hsp60 verschieden sind. Aus einer Analyse solcher ADNF-Polypeptide ist nun die molekulare Identität einer aktiven Stelle für ADNF entdeckt worden. Auf der Grundlage dieser neu entdeckten aktiven Stelle können nun ADNF-Polypeptide hergestellt werden, die weniger als die Aminosäuresequenz von ADNF in vollständiger Länge aufweisen, die aber dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung des intakten ADNF-Wachstumsfaktors zeigen.
Insbesondere wurde auf Grundlage der Sequenzanalysen nach Proteaseverdau von ADNF und der erkannten Homologie zu hsp60, ADNF-14, d. h. Val-Leu-Gly-Gly-Gly- Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, identifiziert. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, erhöht ADNF-14 neuronales Überleben mit einer EC50 von 0,3 fM, einer Potenz, die mit der Aktivität von intaktem ADNF in diesem Kultursystem identisch ist. Ausserdem ist ADNF-14 über einen grösseren Bereich von Konzentrationen aktiv als über den, der für intakten ADNF beobachtet wurde. Bedeutenderweise wurde auch das homologe Polypeptid von hsp60, d. h. Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro- Ala, getestet. Es wurde gezeigt, dass es 100.000-mal weniger potent ist und etwa 50% weniger wirksam ist als sowohl ADNF-14 als auch intakter ADNF (siehe Fig. 4). Diese Daten zeigen an, dass die beiden Aminosäurereste, die zwischen ADNF-14 und dem hsp60 Polypeptid verschieden sind (d. h. die beiden Serinreste), für die überlebensfördernde Aktivität für ZNS-Neuronen kritisch sind. ADNF-14 stellt die erste Demonstration eines ADNF-Polypeptids dar, das weniger als die Aminosäuresequenz von ADNF in vollständiger Länge aufweist, das aber dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung des intakten ADNF-Wachstumsfaktors zeigt. Ausserdem ist dies das erste Mal, dass die molekulare Identität einer aktiven Stelle für ADNF identifiziert worden ist, was die Struktur und ausserordentliche Potenz des ADNF- Moleküls bestätigt.
Unter Verwendung von ADNF-14 als Modell wurden Additionen, Deletionen, Substitutionen, usw. an ADNF-14 vorgenommen, um die aktive Stelle für ADNF weiter zu definieren. Hierzu wurden ADNF-Polypeptide, die kürzer waren als ADNF-14, synthetisiert und auf neuroschützende Aktivität getestet, um das kürzeste ADNF-verwandte Polypeptid zu bestimmen, das die volie Wirksamkeit von intaktem oder nativem ADNF zeigt. Hierzu wurde ADNF-9, d. h. Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, synthetisiert. Wie in den Fig. 5 und 6 gezeigt ist, ist ADNF-9 potenter als ADNF-14 und über einen grösseren Bereich von Konzentrationen wirksamer (d. h. von 0,01 fM bis etwa 1 pM). Daraus kann geschlossen werden, dass der Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Teil von ADNF-14 für die überlebensfördernde Aktivität von ADNF nicht wesentlich ist. Ausserdem ist festgestellt worden, dass Entfernen des Ile-Pro-Ala-Teils von ADNF-9 zu einem 100.000-fachen Verlust der Potenz führt. Ausserdem erweist sich das N-terminale Serin in ADNF-9 offensichtlich insofern als wichtig, als das Polypeptid Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala ohne merkliche Aktivität ist (siehe Fig. 6). Diese Daten belegen die Wichtigkeit des Ile-Pro-Ala-Teils sowie der beiden Serinreste in der überlebensfördernden Aktivität von ADNF-9 und wiederum von intaktem ADNF.
Um das kleinste ADNF-Polypeptid zu bestimmen, welches dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung wie der intakte ADNF-Wachstumsfaktor zeigt, wurden weitere Additionen und Deletionen an ADNF-9 und ADNF-14 vorgenommen. Demgemäss wurde gefunden, dass Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala- Leu, Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg und Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala- Leu-Leu sämtlich verminderte überlebensfördernde Aktivität oder auch keine überlebensfördernde Aktivität zeigten (siehe Fig. 8 und 9). Diese Daten zeigen an, dass Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, d. h. ADNF-9, das kleinste ADNF-Polypeptid ist, das dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung wie der intakte ADNF- Wachstumsfaktor zeigt. Ausserdem bestätigen diese Daten die Wichtigkeit des Ile- Pro-Ala-Teils sowie der beiden Serinreste in der überlebensfördernden Aktivität von ADNF-9. Es sollte festgestellt werden, dass ohne Aktivitätsverlust zusätzliche Aminosäuren zum ADNF-9 zugefügt werden können. Zum Beispiel können zusätzliche Aminosäuren, die mit hsp60 verwandt sind, ohne Aktivitätsverlust zum ADNF-9 zugefügt werden (siehe Fig. 7). Ausserdem können konservative Substitutionen am ADNF-9 vorgenommen werden, wenn auch mit einigem Verlust der biologischen Aktivität. Zum Beispiel führt konservative Substitution von Serin durch Threonin in Ser- Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala zu einem anderen biologisch aktiven ADNF-Polypeptid, nämlich Thr-Ala-Leu-Leu-Arg-Thr-Ile-Pro-Ala (siehe Fig. 7).
Aus den vorhergehenden Ausführungen ist leicht ersichtlich, dass ADNF-9, d. h. Ser- Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, eine aktive Stelle für ADNF ist. ADNF-9 kann der Wirksamkeit von gereinigtem, intaktem ADNF-Wachstumsfaktor entsprechen. Ausserdem zeigt es diese Wirksamkeit über vier Grössenordnungen, d. h. von 1016 bis 10&supmin;¹³ M. ADNF-9 ist das kleinste mit ADNF verwandte Polypeptid, das die volle Wirksamkeit von ADNF zeigt. Damit die ADNF-Polypeptide folglich im wesentlichen dieselbe neuroschützende/neurotrophe Wirkung des intakten ADNF-Wachstumsfaktors zeigen, müssen sie diese neu entdeckte aktive Stelle enthalten. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass konservative Substitutionen (z. B. die Substitution von Serin durch Threonin) an dieser aktiven Stelle mit einigem Verlust der biologischen Aktivität vorgenommen werden können. Ausserdem können sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus von ADNF-9 zusätzliche Aminosäuren zugefügt werden, um andere ADNF-Polypeptide herzustellen, die dieselbe Schutzwirkung wie der intakte Wachstumsfaktor aufweisen. Daher werden ADNF-Polypeptide, die die aktive Stelle Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala entweder alleine oder in Kombination mit anderen Aminosäuren enthalten, im wesentlichen dieselbe neuroschützende/neurotrophe Aktivität wie der intakte ADNF-Wachstumsfaktor zeigen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem Aspekt ein Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) als solches, wobei das ADNF- Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y
In der vorstehenden Formel ist R¹ eine Aminosäuresequenz, die aus 1 bis etwa 40 Aminosäuren besteht, wobei jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure-Nachahmern. Der Begriff "unabhängig voneinander ausgewählt" wird hier verwendet, um anzuzeigen, dass die Aminosäuren, aus denen die Aminosäuresequenz R' besteht, identisch oder verschieden sein können (z. B. können alle Aminosäuren in der Aminosäuresequenz Threonin usw. sein). Wie ausserdem zuvor erklärt, können die Aminosäuren, aus denen die Aminosäuresequenz R¹ besteht, entweder natürlich vorkommende Aminosäuren oder bekannte Analoga von natürlichen Aminosäuren sein, die auf eine den natürlich vorkommenden Aminosäuren ähnliche Art und Weise wirken (d. h. Aminosäure-Nachahmer). Geeignete Aminosäuren, die verwendet werden können, um die Aminosäuresequenz R¹ zu erzeugen, schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf solche, die vorstehend in Tabelle I aufgeführt sind.
Wie bei R ist R² in der vorstehenden Formel eine Aminosäuresequenz, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, wobei jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure-Nachahmern. Wie bei R¹ können die Aminosäuren, aus denen die Aminosäuresequenz R² besteht, ausserdem identisch oder verschieden sein, und können entweder natürlich vorkommende Aminosäuren oder bekannte Analoga von natürlichen Aminosäuren sein, die auf eine den natürlich vorkommenden Aminosäuren ähnliche Art und Weise wirken (d. h. Aminosäure-Nachahmer). Geeignete Aminosäuren, die verwendet werden können, um R² zu erzeugen, schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf solche, die vorstehend in Tabelle I aufgeführt sind.
In der vorstehenden Formel sind x und y unabhängig voneinander ausgewählt und sind gleich Null oder Eins. Der Begriff "unabhängig voneinander ausgewählt" wird hier verwendet, um anzuzeigen, dass x und y identisch oder verschieden sein können. Zum Beispiel können sowohl x als auch y Null sein, oder sie können beide auch Eins sein. Ausserdem kann x Null sein, und y kann Eins sein, oder x kann auch Eins sein und y Null. Wenn sowohl x als auch y Eins sind, können die Aminosäuresequenzen R' und R² ausserdem gleich oder verschieden sein. Daher sind die Aminosäuresequenzen R und R² unabhängig voneinander ausgewählt. Wenn R und R² gleich sind, sind sie sowohl hinsichtlich der Kettenlänge als auch hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung identisch. Zum Beispiel können sowohl R¹ als auch R² Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein. Wenn R¹ und R² verschieden sind, können sie sich hinsichtlich der Kettenlänge und/oder der Aminosäurezusammensetzung und/oder der Reihenfolge der Aminosäuren in den Aminosäurensequenzen voneinander unterscheiden. Zum Beispiel kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Val-Leu-Gly- Gly sein kann. In einer anderen Ausführungsform kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Val-Leu-Gly-Gly-Val sein kann. In einer weiteren Ausführungsform kann R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly sein, während R² Gly-Val-Leu-Gly-Gly sein kann.
Im Bereich der vorstehenden Formel sind bestimmte ADNF-Polypeptide bevorzugt, nämlich solche, in denen sowohl x als auch y Null ist (d. h. ADNF-9). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, in denen x Eins, R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist (d. h. ADNF-14). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, in denen x Eins, R¹ Val- Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist. Zusätzliche Aminosäuren können sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der neu entdeckten aktiven Stelle ohne Verlust der biologischen Aktivität hinzugefügt werden, was durch die Tatsache bewiesen wird, dass der intakte ADNF-Wachstumsfaktor ausserordentliche biologische Aktivität zeigt. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass R¹, R², x und y in allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung so ausgewählt werden, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des intakten Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz aufweisen.
Ausserdem ist es für den Fachmann auf dem Fachgebiet selbstverständlich, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide in verschiedener Weise verändert werden können, wie durch Insertionen, Deletionen und Substitutionen, entweder konservativ oder nicht-konservativ, wobei solche Veränderungen zu bestimmten Vorteilen bei ihrer Verwendung, d. h. zur Erhöhung der biologischen Aktivität, führen können. Mit konservativen Substitutionen ist der Ersatz eines Aminosäurerestes gegen einen anderen gemeint, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, z. B. der Ersatz eines hydrophoben Restes gegen einen anderen oder eines polaren Restes gegen einen anderen. Die Substitutionen schliessen Kombinationen ein, wie zum Beispiel Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. In der Tat ist, wie zuvor erklärt ist, festgestellt worden, dass konservative Substitutionen von Serin gegen Threonin in Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala zu einem biologisch aktiven ADNF-Polypeptid führen, nämlich zu Thr-Ala-Leu-Leu-Arg-Thr-Ile-Pro-Ala (siehe Fig. 7). Andere Reste, die ohne Verlust der biologischen Aktivität der ADNF-Polypeptide modifiziert werden können, können durch Einzelaminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen unter Anwendung herkömmlicher, dem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren identifiziert werden, was insbesondere für die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide gilt, die eine relativ kurze Länge haben. Ausserdem können die Beiträge, die von den Seitenketten der Reste geliefert werden, über eine systematische, genaue Prüfung mit einer spezifischen Aminosäure (z. B. Ala) erforscht werden.
Ausserdem ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide unter Verwendung des folgenden ZNS-Assays leicht auf neuroschützende/neurotrophe Aktivität gescreent werden können. Zerebralkortexzellkulturen wurden nach dem von I. Forsythe und G. Westbrook, J. Physiol. Lond., 396 : 515 (1988) beschriebenen Verfahren mit den folgenden Änderungen hergestellt. Zerebralkortex wurde anstelle von Hippocampus verwendet, und neugeborene Ratten wurden anstelle von E16-Mäusen verwendet. Nach neuntägigem Wachstum in vitro wurde den Kulturen ein vollständiger Wechsel des Mediums gegeben. Sie wurden fünf zusätzliche Tage lang mit dem interessierenden ADNF-Polypeptid behandelt (gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Ethanol). Zum Beenden wurden die Zellen für Immunozytochemie fixiert, und Neuronen mit Antikörpern gegen NSE (d. h. Neuronenspezifische Enolase, einem Neuronen spezifischen Marker) identifiziert. Zellzählungen wurden auf 30 Feldern mit einer Gesamtfläche von etwa 15 mm² durchgeführt. Die Neuronen wurden ohne Wissen um die vorgenommene Behandlung gezählt. Kontrollzählungen, die nicht mit irgendwelchen Medikamenten behandelt wurden, sollten für Vergleichszwecke laufen.
Unter Verwendung dieses Assays kann der Fachmann leicht eine grosse Anzahl von ADNF-Polypeptiden gemäss den vorstehenden Anweisungen herstellen und diese wiederum unter Verwendung des vorstehend angegebenen Assays screenen, um ADNF-Polypeptide, die die neuroschützende/neurotrophe Aktivität des intakten ADNF-Wachstumsfaktors besitzen, zusätzlich zu den hier aufgezeigten zu finden. Beispielsweise kann man bei Verwendung von ADNF-9 als Ausgangspunkt systematisch zum Beispiel 6ly-, Gly-Gly-, Gly-Gly-Gly-, Leu-Gly-Gly-Gly-, Val-Leu-Gly-Gly- Gly am N-Terminus von ADNF-9 hinzufügen und wiederum jedes dieser ADNF-Polypeptide im vorhergehenden Assay screenen, um zu bestimmen, ob sie neuroschützende/neurotrophe Aktivität besitzen. Dadurch konnte ermittelt werden, dass zusätzliche Aminosäuren sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus der neu entdeckten aktiven Stelle, d. h. Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, ohne Verlust der biologischen Aktivität hinzugefügt werden können, was durch die Tatsache bewiesen wird, dass der intakte ADNF-Wachstumsfaktor ausserordentliche biologische Aktivität zeigt.
Weil die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine relativ kurze Länge haben, können sie unter Anwendung eines von mehreren dem Fachmann bekannten chemischen Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, wobei sowohl Lösungsverfahren als auch Festphasenverfahren eingeschlossen sind und die Festphasensynthese gegenwärtig bevorzugt ist.
Insbesondere ist die Festphasensynthese, bei der die C-terminale Aminosäure der Peptidsequenz an einem unlöslichen Träger befestigt wird, gefolgt von aufeinanderfolgendem Hinzufügen der verbleibenden Aminosäuren in der Sequenz, das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide. Verfahren zur Festphasensynthese sind von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (Gross und Meienhofer (Hrgb.), Academic Press, N. Y., Bd. 2, S. 3-284 (1980)); Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptid Synthesis (2. Aufl., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)) beschrieben.
Festphasensynthese wird am Carboxy-terminalen Ende (d. h. am C-Terminus) des Peptids durch Kuppeln einer geschützten Aminosäure über ihren Carboxylrest an einen geeigneten festen Träger gestartet. Der verwendete feste Träger ist kein kritisches Merkmal der vorliegenden Erfindung, vorausgesetzt, dass er in der Lage ist, den Carboxylrest zu binden, während er im wesentlichen inert gegenüber den beim Peptidsyntheseverfahren verwendeten Reagentien bleibt. Zum Beispiel kann ein Ausgangsmaterial durch Befestigen einer aminogeschützten Aminosäure über eine Benzylesterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz oder über eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin- (BHA-) Harz oder p-Methylbenzhydrylamin- (MBHA-) Harz hergestellt werden. Materialien, die für die Verwendung als feste Träger geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: Halogenmethylharze, wie Chlormethylharz oder Brommethylharz; Hydroxymethylharze; Phenolharze, wie 4-(α-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxyharz; tert-Alkyloxycarbonylhydrazidharze und dergleichen. Solche Harze sind im Handel erhältlich. Ihre Herstellungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Die Säureform der erfindungsgemässen Peptide kann durch das Festphasen-Peptidsyntheseverfahren unter Verwendung eines Benzylesterharzes als fester Träger hergestellt werden. Die entsprechenden Amide können durch Verwendung von Benzhydrylamin- oder Methylbenzhydrylaminharz als festem Träger hergestellt werden. Wenn das BHA- oder das MBHA-Harz verwendet wird, ist es für den Fachmann leicht erkennbar, dass die Behandlung mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure, um das Polypeptid vom festen Träger zu spalten, zur Herstellung eines Polypeptids mit einem terminalen Amidrest führt.
Der α-Aminorest jeder bei der Synthese verwendeten Aminosäure sollte während der Kupplungsreaktion geschützt sein, um Nebenreaktionen zu verhindern, die die reaktive α-Aminofunktion betreffen. Bestimmte Aminosäuren enthalten auch reaktive funktionelle Seitenkettenreste (z. B. Sulfhydryl, Amino, Carboxyl, Hydroxyl usw.), die auch mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden müssen, um zu verhindern, dass chemische Reaktionen während der Polypeptidsynthese an diesen Stellen stattfinden. Schutzgruppen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe zum Beispiel: The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Gross und Meienhofer (Hrgb.), Academic Press, N. Y. (1981)).
Eine in geeigneter Weise ausgewählte α-Amino-Schutzgruppe macht die α-Aminofunktion während der Kupplungsreaktion inert, ist nach dem Kuppeln unter Bedingungen leicht entfernbar, entfernt die Seitenketten-Schutzgruppe, verändert die Struktur des Peptidfragments nicht und verhindert die Razemisierung bei Aktivierung unmittelbar vor der Kupplung. In entsprechender Weise müssen Seitenketten- Schutzgruppen so gewählt werden, dass sie den funktionellen Seitenkettenrest während der Synthese inert machen. Sie müssen unter den Bedingungen, die zum Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe verwendet werden, stabil sein und müssen nach Abschluss der Polypeptidsynthese unter Bedingungen entfernbar sein, die die Struktur des Polypeptids nicht verändern.
Anschauliche Beispiele von Schutzgruppen für einen α-Aminorest schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: aromatische Urethanreste, wie zum Beispiel Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Carbobenzoxy (Cbz) und substituierte Benzyloxycarbonyle, einschliesslich p-Chlorbenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl usw.; aliphatische Urethanreste, wie zum Beispiel Butyloxycarbonyl (Boc), t-Amyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl usw.; sowie Cycloalkylurethanreste, wie zum Beispiel Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl (Adoc) usw. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) die verwendete α-Amino-Schutzgruppe.
Für den in Lysin (Lys) vorhandenen Seitenketten-Aminorest ist eine der vorstehend für den Schutz des α-Aminorestes beschriebenen Schutzgruppen geeignet. Ausserdem schliessen andere geeignete Schutzgruppen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: Butyloxycarbonyl (Boc), p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl usw. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist die Seitenketten-Aminoschutzgruppe für Lys Butyloxycarbonyl (Boc).
Zum Schutz der Guanidingruppe von Arginin (Arg) schliessen Beispiele von geeigneten Schutzgruppen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: Nitro, Tosyl (Tos), Carbobenzoxy (Cbz), Adamantyloxycarbonyl (Adoc), Butyloxycarbonyl (Boc), 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr) und 2,2,5,7,8-Pentamethylchloroman- 6-sulfonyl (PMC). In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform sind 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl und 2,2,5,7,8-Pentamethylchloroman-6-sulfonyl die für Arg verwendeten Schutzgruppen.
Der Hydroxylrest der Seitenketten von Serin (Ser), Threonin (Thr) oder Tyrosin (Tyr) kann durch einen C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl und t-Butyl, oder durch einen substituierten Benzylrest, wie zum Beispiel p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl, o-Chlorbenzyl und 2,6-Dichlorbenzyl, geschützt werden. Die bevorzugte aliphatische Hydroxyl-Schutzgruppe für Ser, Thr und Tyr ist t-Butyl.
Die Carboxylgruppe von Asparginsäure (Asp) kann zum Beispiel durch Veresterung unter Verwendung von Resten, wie Benzyl, t-Butyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und dergleichen, geschützt werden. Für Asp ist t-Butyl die gegenwärtig bevorzugte Schutzgruppe.
Der basische Imidazolring in Histidin (His) kann zum Beispiel durch t-Butoxymethyl (Bom), Butyloxycarbonyl (Boc) und Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist t-Butoxymethyl (Bom) die verwendete Schutzgruppe.
Das Kuppeln der Aminosäuren kann durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Chemikalien erreicht werden. Typische Möglichkeiten schliessen entweder die Umwandlung der Aminosäure zu einem Derivat, das die Carboxylgruppe für die Umsetzung mit dem freien N-terminalen Aminorest des Polypeptidfragments zugänglicher macht, oder die Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels ein, wie zum Beispiel N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI). Häufig wird Hydroxybenzotriazol (HOBt) als Katalysator in diesen Kupplungsreaktionen verwendet. Geeignete Synthesechemikalien sind in: The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Bd. 1: Methods of Peptide Bond Formation (Gross und Meienhofer (Hrgb.), Academic Press, N. Y. (1979)); Izumiya et al., Synthesis of Peptides (Maruzen Publishing Co., Ltd., (1975)) offenbart.
Im allgemeinen wird die Synthese des Polypeptids zuerst durch Kuppeln der C-terminalen Aminosäure, die an der Nα-Aminoposition durch eine Schutzgruppe, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), geschützt ist, an einen festen Träger gestartet. Vor dem Kuppeln von Fmoc-Asn muss der Fmoc-Rest vom Polymer entfernt werden. Fmoc-Asn kann zum Beispiel unter Verwendung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 2 Stunden langem Rühren bei etwa 25ºC an 4-(α-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxyharz gekuppelt werden. Im Anschluss an die Kupplung der Fmoc-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Aminoschutzgruppe bei Raumtemperatur unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF entfernt.
Nach dem Entfernen der α-Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden Fmoc-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt. Geeignet geschützte Aminosäuren sind im Handel von mehreren Lieferanten (z. B. Nova (Schweiz) oder Bachem (Kalifornien)) erhältlich. Als Alternative zum schrittweise Hinzufügen von einzelnen Aminosäuren können auch geeignet geschützte aus mehr als einer Aminosäure bestehende Peptidfragmente an das "wachsende" Polypeptid gekuppelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kupplungsreagenzes ist dem Fachmann, wie vorstehend erklärt, bekannt. Da die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine relativ kurze Länge haben, sollte berücksichtigt werden, dass diese letztere Möglichkeit (d. h. das Segmentkondensationsverfahren) nicht das wirksamste Verfahren der Peptidsynthese ist.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird im Überschuss in den Festphasenreaktor eingebracht und die Kupplung in einem Medium von Dimethylformamid (DMF), Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder deren Gemischen durchgeführt. Wenn die Kupplung unvollständig ist, kann die Kupplungsreaktion vor der Abspaltung der Schutzgruppe vom Nα-Aminorest und vor dem Hinzufügen der nächsten Aminosäure wiederholt werden. Die Kupplungswirksamkeit kann durch mehrere, dem Fachmann bekannte Verfahren überwacht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Überwachung der Kupplungswirksamkeit ist die Ninhydrinreaktion. Die Polypeptidsynthesereaktionen können unter Verwendung mehrerer im Handel erhältlicher Peptidsynthesizer (z. B. Biosearch 9500, Biosearch, San Raphael, CA) automatisch durchgeführt werden.
Das Peptid kann gespalten werden und die Schutzgruppen durch etwa 20 bis 90 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, langes Rühren des unlöslichen Trägers oder festen Trägers in wasserfreiem, flüssigem Fluorwasserstoff (HF) in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid bei etwa 0ºC, ferner durch 60 bis 360 Minuten langes, kontinuierliches Hindurchperlen von Bromwasserstoff (HBr) durch eine 1 mg/10 ml- Suspension des Harzes in Trifluoressigsäure (TFA) etwa bei Raumtemperatur in Abhängigkeit von der ausgewählten Schutzgruppe oder auch durch etwa 30 bis 60 Minuten lange Inkubation des festen Trägers im Innern der für die Festphasensynthese verwendeten Reaktionssäule mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Wasser und 5% Triethylsilan entfernt werden. Andere, dem Fachmann bekannte Verfahren zur Abspaltung der Schutzgruppe können ebenfalls angewendet werden.
Die erfindungsgemässen Polypeptide, d. h. ADNF-Polypeptide, können durch dem Fachmann bekannte Verfahren zur Peptidreinigung aus dem Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden. Zum Beispiel können die Polypeptide unter Anwendung bekannter Chromatographieverfahren, wie Reversephase-HPLC, Gelpermeation, Ionenaustausch, Grössenausschluss, Affinität, Verteilungschromatographie oder Gegenstromverteilung, gereinigt werden, siehe hierzu den nachstehenden Beispielabschnitt für eine ausführliche Beschreibung der Verfahren und verwendeten Protokolle, um die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide zu synthetisieren und zu reinigen.
Obwohl die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide vorzugsweise unter Anwendung chemischer Peptidsyntheseverfahren, wie vorstehend beschrieben, erzeugt oder hergestellt werden, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass sie auch durch andere Verfahren hergestellt werden können, einschliesslich zum Beispiel rekombinanter Techniken. Zwei Lehrbücher, in denen geeignete rekombinante Techniken sehr ausführlich beschrieben sind, sind Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N. Y., 2.Aufl. (1989)), Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berger und Kimmel (Hrgb.), San Diego: Academic Press, Inc. (1987)) und Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman, N. Y. (1990)).
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen ADNF-Polypeptiden, die neuroschützende/neurotrophe Aktivität zeigen, betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Polypeptid-Antagonisten des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF), wobei der ADNF-Antagonist im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile.
Wie in Fig. 10 gezeigt ist, ruft dieser ADNF-Polypeptid-Antagonist neuronalen Zelltod in Zerebralkortexkulturen hervor (in diesem Experiment wurde den Testkulturen kein Tetrodotoxin zugegeben). Als solches kann dieser ADNF-Polypeptid-Antagonist verwendet werden, um die Aktivität von ADNF zu inhibieren, wodurch neuronaler Zelltod bewirkt wird. Solche ADNF-Antagonisten sind vorzugsweise als Kontrollsubstanzen brauchbar, um sicherzustellen, dass die in einem bestimmten Assay erhaltenen Ergebnisse aus der Aktivität des zu testenden ADNF-Polypeptids stammen und nicht von einem im Assaysystem selbst vorhandenen Artefakt. In einer anderen Ausführungsform können solche ADNF-Antagonisten eingesetzt werden, um neuronale Zellen abzutöten, wenn gewünscht wird, spezifisch nicht-neuronale Zellen auszuwählen, wie bei der Isolierung von ADNF. Es sollte berücksichtigt werden, dass Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, oder -Deletionen an der vorstehend aufgezeigten Sequenz des ADNF-Polypeptid-Antagonisten vorgenommen werden können, vorausgesetzt sie verändern die biologische Aktivität dieses ADNF- Polypeptid-Antagonisten nicht wesentlich. Ausserdem sind die Ausführungen bezüglich der vorstehend beschriebenen Synthese und Aufreinigung der ADNF- Polypeptide auf die Synthese und Aufreinigung dieser ADNF-Polypeptid- Antagonisten vollständig anwendbar.

C. Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods unter Verwendung der neurotrophen Polypeptide von ADNF

Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der neuronalen Zellen mit einem Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um neuronalen Zelltod zu verhindern, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y
Hinsichtlich des vorstehend beschriebenen ADNF-Polypeptids haben R¹, R², x und y dieselben Bedeutungen wie R¹, R², x und y für die vorher beschriebenen ADNF-Polypeptide (siehe vorstehender Abschnitt B). Zur Vermeidung von Wiederholungen wird daher bezüglich der Beschreibung jedes Substituenten auf den vorstehenden Abschnitt Bezug genommen. R¹ und R² sind unabhängig voneinander ausgewählt und stellen Aminosäuresequenzen dar, die aus 1 bis etwa 40 Aminosäuren bestehen, wobei jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure- Nachahmern. Ausserdem sind x und y unabhängig voneinander ausgewählt und sind gleich Null oder Eins. Ferner sind R¹, R², x und y so ausgewählt, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz haben.
Wie zuvor dargestellt, können die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide bei der Behandlung neurologischer Mängel und zur Verhinderung des neuronalen Zelltods verwendet werden. Zum Beispiel können solche ADNF-Polypeptide verwendet werden, um den Tod neuronaler Zellen zu verhindern, beispielsweise den Tod von Rückenmarksneuronen, Hippocampusneuronen, Zerebralkortexneuronen und cholinerger Neuronen; diese Aufzählung beschränkt die Art der Neuronen aber nicht. Insbesondere können die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide zur Verhinderung des Zelltods verwendet werden, der im Zusammenhang steht mit (1) gp120, dem Hüllprotein von HIV, (2) N-Methyl-D-asparaginsäure (Excito-Toxizität), (3) Tetrodotoxin (Blockierung der elektrischen Aktivität) und (4) β-Amyloidpeptid, einem Stoff, der mit neuronaler Degeneration bei der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang gebracht wird. Jede der verschiedenen Verfahren bei der Verwendung der erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide, die zur Verhinderung des neuronalen Zelltods oder der Zellschädigung eingesetzt werden, wird nachfolgend sehr ausführlich erklärt. Aus diesen Beispielen ist für den Fachmann leicht erkennbar, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide auf ähnliche Art und Weise eingesetzt werden können, um neuronalen Zelltod zu verhindern, der mit mehreren anderen neurologischen Krankheiten und Mängeln in Zusammenhang steht.
Vorherige Untersuchungen, die mit sich entwickelnden, in Zellkultur gewachsenen Hippocampusneuronen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass ADNF den neuronalen Zelltod verhindern kann, der mit dem Aussenhüllprotein des HIV-Virus in Zusammenhang steht, d. h. mit gp120, dem AIDS verursachenden Mittel (siehe z. B. Brenneman et al., Nature 335, 636 (1988), deren inhaltliche Offenbarung hier in ihrer Gesamtheit einbezogen wird). Es ist nun entdeckt worden, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide auch verwendet werden können, um gp120-induzierten neuronalen Zelltod zu verhindern. Wie in Fig. 11 gezeigt ist, verhindert ADNF-14, d. h. Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, den neuronalen Zelltod, der auf 1 pM des gp120-Hüllproteins des HIV-Virus zurückzuführen ist. Folglich kann der durch gp120 induzierte neuronale Zelltod durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemässen ADNF-Polypeptids an einen mit dem HIV-1-Virus infizierten Patienten verhindert werden.
Als solches betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem Aspekt ein Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods in einem mit dem Menschliche Immunschwäche Virus (Human Immunodeficiency Virus (HIV-1)) infizierten Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) an einen Patienten in einer Menge umfasst, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y.
Die vorstehenden Ausführungen, die R, R², x und y betreffen, sind auf die ADNF- Polypeptide vollständig anwendbar, die in diesem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, und werden daher hinsichtlich dieses bestimmten Verfahrens nicht wiederholt. Innerhalb des Bereichs der vorstehenden Formel sind bestimmte ADNF-Polypeptide bevorzugt, nämlich solche, bei denen x und y beide Null sind (d. h. ADNF-9). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, bei denen x Eins, R¹ Val-Leu- Gly-Gly-Gly und y Null ist (d. h. ADNF-14). Ausserdem sind ebenso ADNF-Polypeptide bevorzugt, bei denen x Eins, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass R¹, R², x und y so ausgewählt werden, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz haben.
Ausserdem ist es leicht nachvollziehbar, dass der Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Ausführungen hinsichtlich des Designs und der Synthese der ADNF- Polypeptide und des Assays von Brenneman et al., Nature, 335, 636 (1988), deren inhaltliche Offenbarung hier in ihrer Gesamtheit einbezogen sind, andere ADNF-Polypeptide identifizieren kann, die verwendet werden können, um den mit gp120 in Zusammenhang stehenden Zelltod zu verhindern.
Zusätzlich zu den vorstehenden Ausführungen ist auch entdeckt worden, dass ADNF-Polypeptide verwendet werden können, um den mit NMDA-Toxizität in dissozüerten Zerebralkortexkulturen in Zusammenhang stehenden neuronalen Zelltod zu verhindern (siehe Fig. 12). Als solches betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, der im Zusammenhang mit der Excito-Toxizität steht, die durch N-Methyl-D-aspartat-Stimulation induziert wird, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen dieser neuronalen Zellen mit einem Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer Menge umfasst, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern. Das ADNF-Polypeptid besteht hier im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ife-Pro-Ala-(R²)y.
Die vorstehenden Ausführungen, die R¹, R², x und y betreffen, sind auf die ADNF- Polypeptide vollständig anwendbar, die in diesem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, und werden daher hinsichtlich dieses bestimmten Verfahrens nicht wiederholt. Innerhalb des Bereichs der vorstehenden Formel sind bestimmte ADNF-Polypeptide bevorzugt, nämlich solche, bei denen x und y beide Null sind (d. h. ADNF-9). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, bei denen x Eins, R¹ Val-Leu- Gly-Gly-Gly und y Null ist (d. h. ADNF-14). Ausserdem sind ebenso ADNF-Polypeptide bevorzugt, bei denen x Eins, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass R¹, R², x und y so ausgewählt sind, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz haben.
Ausserdem ist es leicht nachvollziehbar, dass der Fachmann unter Anwendung der vorstehenden Ausführungen hinsichtlich des Designs und der Synthese der ADNF- Polypeptide und des Assays von Brenneman et al., Dev. Brain Res., 51 : 63 (1990), deren inhaltliche Offenbarung in ihrer Gesamtheit hier einbezogen wird, andere ADNF-Polypeptide identifizieren kann, die verwendet werden können, um den Zelltod zu verhindern, der mit der durch N-Methyl-D-aspartat-Stimulation induzierten Excito- Toxizität verbunden ist.
Zusätzlich zu den vorstehenden Ausführungen ist auch entdeckt worden, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide den mit der Alzheimer-Krankheit im Zusammenhang stehenden Zelltod verhindern können (siehe Fig. 13, 14A und 14B). Ein in vitro-Modell für die Alzheimer-Krankheit ist durch β-Amyloid-Neurotoxizität gegeben. Es ist festgestellt worden, dass das β-Amyloidpeptid in Alzheimer-Plaques abgelagert wird (Kowall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7247 (1991)), und es wurde vermutet, dass es neurotoxische Aktivität hat (Yankner, et at., Science, 250, 279 (1990); Pike et al., J. Neurosci 13, 1676 (1993)). In entsprechender Weise wurden Zerebralkortexzellkulturen der Ratte (wie vorstehend beschrieben) mit zunehmenden Konzentrationen eines Fragments des β-Amyloidpeptids behandelt (Aminosäuren 25-35, wie beschrieben synthetisiert, Gozes et al., J. Clin. Invest 90, 810 (1992); Gozes et al., Peptide Chemistry, 1992, N. Yanalhara, Hrgb., 442445 (1993) (ESCOM-Leiden); Gozes et al., Endocrinology, 134, 2121 (1994)). Ein Zeitraum von fünf Tagen zur Inkubation mit dem Fragment des β-Amyloidpeptids führte zu einem 70,5 ± 0,5% neuronalen Zelltod im Vergleich zur Kontrolle (Fig. 13).
Um die neuroschützenden Wirkungen von ADNF-14 gegen mit β-Amyloid in Zusammenhang stehendem Tod zu bewerten, wurden 25 uM des β-Amyloidpeptidfragments zu ADNF-14 (anfänglich in 20 ul Acetonitril und 180 ul Wasser zu einer Endkonzentration von 103M gelöst) zugegeben (wie in Fig. 13). Die Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung des ADNF-14-Peptids, d. h. von Val-Leu-Gly-Gly-Gly- Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (in Fig. 14A mit "Das Peptid" bezeichnet), in fM-Konzentrationen und weniger den neuronalen Zelltod in der Gewebekulturschale verhindert, der mit β-Amyloid in Zusammenhang gebracht wird (siehe Fig. 14A). In entsprechender Weise zeigen die Ergebnisse, dass die Verabreichung des ADNF-9 Peptids, d. h. von Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala, in fM-Konzentrationen und weniger den neuronalen Zelltod in der Gewebekulturschale verhindert, der mit β-Amyloid in Zusammenhang gebracht wird (siehe Fig. 14B).
Als solches betrifft die vorliegende Erfindung gemäss einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, der durch das β-Amyloidpeptid in einem Patienten induziert wird, der an der Alzheimer-Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) an einen Patienten in einer Menge umfasst, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y.
Die vorstehenden Ausführungen, die R, R², x und y betreffen, sind auf die ADNF- Polypeptide, die in diesem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, vollständig anwendbar und werden daher hinsichtlich dieses bestimmten Verfahrens nicht wiederholt. Innerhalb des Bereichs der vorstehend angegebenen Formel sind bestimmte ADNF-Polypeptide bevorzugt, nämlich solche, bei denen x und y beide Null sind (d. h. ADNF-9). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, bei denen x Eins, R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist (d. h. ADNF-14). Ausserdem sind ebenso ADNF-Polypeptide bevorzugt, bei denen x Eins, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly- Gly-Gly und y Null ist. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass R¹, R², x und y so ausgewählt sind, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz haben.
Ausserdem ist es leicht nachvollziehbar, dass der Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Ausführungen hinsichtlich des Designs und der Synthese der ADNF- Polypeptide und des Assays, wie vorstehend aufgezeigt, andere ADNF-Polypeptide identifizieren kann, die verwendet werden können, den Zelltod zu verhindern, der durch das β-Amyloidpeptid in einem Patienten induziert wird, der an der Alzheimer- Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird.
Zusätzlich zu den vorstehenden Erkenntnissen ist auch entdeckt worden, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide die Lernbeeinträchtigung lindern können, die durch cholinerge Blockierung hervorgerufen wird. Insbesondere ist, wie in Fig. 15A gezeigt wird, nun entdeckt worden, dass ADNF-14 die durch cholinerge Blockierung hervorgerufene Lernbeeinträchtigung im Anschluss an eine tägliche nasale Verabreichung von 1 ug/Tag lindern kann. In entsprechender Weise ist, wie in Fig. 15B gezeigt ist, nun entdeckt worden, dass ADNF-9 die durch cholinerge Blockierung hervorgerufene Lernbeeinträchtigung im Anschluss an eine tägliche nasale Verabreichung von 1 ug/Tag lindern kann. Ein System zur in vivo-Bewertung von Lern- und Erinnerungsmängeln in Ratten, die mit der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang gebracht werden, wurde ausgestaltet. In Menschen, die an der Alzheimer- Krankheit leiden, gibt es einen ungeklärten Tod von cholinergen Neuronen im Zerebralkortex und den Hippocampusbereichen, die mit kognitiven Funktionen des Lernens und des Sich-Erinnerns verbunden sind. Der cholinerge Blocker AF64A ruft Lern- und Erinnerungsmängel hervor, die für die Alzheimer-Krankheit typisch sind (Fisher et al., Neurosci. Lett., 102, 325 (1989)).
Zur Bewertung der Lern- und Erinnerungsfähigkeiten wurden Ratten in einem Morris- Wasserlabyrinth wie zuvor getestet (Morris et al., Nature, 297, 681 (1982); Morris et al., Nature, 319, 774 (1986); Glowa et al., Brain Res., 570, 49 (1992); Gozes et al., J. Mol. Neurosci., 4, 185 (1993)). Die Wartezeit (Latenz) bis zum Erreichen der Plattform unter Wasser in einem runden Wasserbecken wurde für jede Ratte aufgenommen (in Sekunden), und die Änderungen wurden in einer graphischen Darstellung über die Trainingstage aufgezeichnet, was das Lernen und Erinnern wiederspiegelt. Ratten wurde AF64A (i. c. v) unter Verwendung eines an einer 25 G Nadel befestigten Kunststoffschlauches (PE-20) mit einer Geschwindigkeit von 0,21 ul/min injiziert, wobei Kontrolltiere eine Injektion von Kochsalzlösung erhielten (2 ul/Seite). Versuchstiere, die eine Injektion von AF64A (3 nmol/2 ul/Seite) erhielten, führte in Ratten dazu, dass diese selbst nach 6 Tagen Training nicht lernten (ausgefüllte Kreise in Fig. 15A). Scheinbehandelte Kontrollen (Dreiecke in Fig. 15A) lernten nach 3 Tagen Training. Für die Peptidanwendung wurde der nasale Weg gewählt. Zehn Tage nach der AF64A-Verabreichung erhielten die Tiere eine tägliche nasale Verabreichung des ADNF-14, das in 10% Sefsol (1-Monocaproloyl-rac-glycerin) und 40% Isopropanol in einer Konzentration von 1 ug/40 ul gelöst war (jeweils 20 ul der 40 ul wurden durch jedes Nasenloch verabreicht). Vor der nasalen Verabreichung wurden die Tiere mit Diethylether teilweise anästhesiert. Das Peptid wurde 1 Stunde vor dem Testen durch nasale Verabreichung angewendet (ADNF- 14, offene Kreise in Fig. 15A). Wie in den Fig. 15A und 15B gezeigt ist, zeigen ADNF-14 bzw. ADNF-9 neuroschützende Aktivität, die in der Lage ist, mit cholinerger Funktionsstörung verbundene Lernmängel zu verbessern.
Als solches betrifft die vorliegende Erfindung gemäss noch einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Verbessern von Lernbeeinträchtigung, die durch cholinerge Blockierung in einem Patienten hervorgerufen wird, der an der Alzheimer-Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) an einen Patienten in einer Menge umfasst, die ausreicht, den neuronalen Zelltod zu verhindern, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:
(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)Y.
Die vorstehenden Ausführungen, die R¹, R², x und y betreffen, sind auf die ADNF- Polypeptide, die in diesem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, vollständig anwendbar und werden daher hinsichtlich dieses bestimmten Verfahrens nicht wiederholt. Innerhalb des Bereichs der vorstehenden Formel sind bestimmte ADNF-Polypeptide bevorzugt, nämlich solche, bei denen x und y beide Null sind (d. h. ADNF-9). Ebenso bevorzugt sind ADNF-Polypeptide, bei denen x Eins, R¹ Val-Leu- Gly-Gly-Gly und y Null ist (d. h. ADNF-14). Ausserdem sind ebenso ADNF-Polypeptide bevorzugt, bei denen x Eins, R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly und y Null ist. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass R¹, R², x und y so ausgewählt sind, dass die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz haben.
Ausserdem ist es leicht nachvollziehbar, dass der Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Ausführungen hinsichtlich des Designs und der Synthese der ADNF- Polypeptide und des Assays, wie vorstehend aufgezeigt, andere ADNF-Polypeptide identifizieren kann, die verwendet werden können, die Lernbeeinträchtigung zu verbessern, die durch cholinerge Blockierung in einem Patienten hervorgerufen wird, der an der Alzheimer-Krankheit leidet oder von ihr beeinträchtigt wird.
Gemäss einem noch anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel, die eines der vorstehend beschriebenen ADNF-Polypeptide in einer Menge enthalten, die ausreicht, neuroschützende/neurotrophe Aktivität zu zeigen, sowie ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Arzneistoffträger. Die erfindungsgemässen Arzneimittel sind für die Verwendung in verschiedenen Arzneimittelverabreichungssystemen geeignet. Geeignete Formulierungen zur erfindungsgemässen Verwendung sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985)) aufgeführt, das hier durch Inbezugnahme eingeführt wird. Ausserdem wird in Bezug auf eine kurze Übersicht der Verfahren zur Arzneimittelverabreichung auf Langer, Science, 249 : 1527-1533 (1990) verwiesen.
Wegen ihrer Fähigkeit, Wachstum und Überleben von Neuronen zu erhöhen, sind ADNF und deren ADNF-Polypeptide in umfangreicher Weise zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen Mängeln geeignet, die sich zum Beispiel aus neuronaler Entwicklung, Alterung, neurodegenerativen Krankheiten oder Rückenmarksverletzung ergeben. Als solches betrifft die vorliegende Erfindung Therapiemittel oder Medikamente, die ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen ADNF-Polypeptide in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträger enthalten, wobei die Menge des ADNF-Polypeptids in einer Menge enthalten ist, die ausreicht, eine therapeutische Wirkung zu erreichen.
In einer therapeutischen Anwendung sind die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide in Arzneimitteln aufgenommen, die zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung bestimmt sind. Vorzugsweise werden die Arzneimittel parenteral, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär, oder intranasal verabreicht. Daher betrifft die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung, die eine Lösung eines, wie vorstehend beschrieben, ADNF-Polypeptids enthalten, das in einem verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert ist. Verschiedene wässrige Träger können verwendet werden, einschliesslich zum Beispiel Wasser, wässrige Puffer, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden, oder sie können steril filtriert werden. Die so erhaltenen wässrigen Lösungen können für die Verwendung, wie sie ist, verpackt oder lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Herstellung vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, um physiologischen Bedingungen nahezukommen, einschliesslich pH- Einstell- und Puffermittel, Tonizitätseinstellmittel, Benetzungsmittel und dergleichen, wie zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Träger verwendet werden, die zum Beispiel pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glucose, Sucrose, Magnesiumcarbonat und dergleichen einschliessen. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch verträgliche nicht-toxische Zusammensetzung durch Einfügen eines der normalerweise verwendeten Arzneistoffträger hergestellt, beispielsweise solcher Arzneistoffträger, die vorher aufgeführt wurden, und allgemein 10-95% Wirkstoff und insbesondere bevorzugt in einer Konzentration von 25%-75% enthalten.
Für Aerosolverabreichung werden die ADNF-Polypeptide vorzugsweise in fein verteilter Form zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel und Treibmittel bereitgestellt. Das oberflächenaktive Mittel muss natürlich nicht-toxisch und vorzugsweise im Treibmittel löslich sein. Typisch für solche Mittel sind die Ester oder Halbester von Fettsäuren, die 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Olesterin- und Oleinsäuren, mit einem aliphatischen Polyalkohol oder dessen cyclischem Anhydrid. Gemischte Ester, wie gemischte oder natürliche Glyceride können verwendet werden. Ein Träger kann, falls gewünscht, ebenfalls enthalten sein, beispielsweise Lecithin für intranasale Verabreichung.
In therapeutischen Anwendungen werden die erfindungsgemässen ADNF-Polypeptide einem Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, neuronalen Zelltod zu verhindern. Eine ausreichende Menge, um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Für diese Verwendung wirksame Mengen werden zum Beispiel von dem bestimmten verwendeten ADNF-Polypeptid, der Art des zu verhindernden neuronalen Zelltods oder des Zelischadens, der Art und Weise der Verabreichung, dem Gewicht und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil des verschreibenden Arztes abhängen. Zur Verhinderung des neuronalen Zelltods würde zum Beispiel eine Menge an ADNF-Polypeptid eine therapeutisch wirksame Menge darstellen, die in den Bereich einer 100 ng- bis 10 mg-Dosis fällt, die einmal am Tag intranasal (z. B. am Abend) gegeben wird.
Die Erfindung wird durch spezielle Beispiele ausführlicher beschrieben. Die nachfolgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung angegeben und sollen die Erfindung in keinerlei Weise beschränken oder definieren.

Beispiele

A. Isolierung und Bestimmung von ADNF

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung der überlebensfördernden Aktivität von ADNF wird durch die Wirkungen an Rückenmarksneuronen bestimmt: Vergleich zwischen konditioniertem Medium und gereinigtem ADNF. Um Aktivitätsabhängige Faktoren zu isolieren, wurden zwei verschiedene Zellkulturen verwendet. Die Quelle der neurotrophen Faktoren waren Kortexastrozyten der Ratte, eine hervorragende Quelle für Astroglia wegen schneller Wachstumseigenschaften und bestehender Kulturzusammensetzung (McCarthy, K. D. & Partlow, L. M., Brain Res., 114, 391414 (1976)). Zwei Wochen alte Kulturen (konfluente 75 cm² Flaschen) wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Konditioniertes Medium wurde während einer 3 Stunden langen Inkubation mit 0,1 nM VIP (eine Menge, von der zuvor gezeigt worden war, dass sie optimal für die Freisetzung neurotropher Aktivität von Astrogliazellen ist, siehe Brenneman et al., J. Neurosci. Res., 25, 386-394 (1990)) gesammelt (10 ml PBS/Flasche). Das Medium wurde zentrifugiert (10 min lang bei 3000 · g) und gegen 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 4ºC dialysiert (3,5 kDalton Ausschluss).
Die zweite Art der Zellkultur, Rückenmarkskulturen der Maus, wurde eingesetzt, um auf biologische Aktivität des konditionierten Mediums zu testen. Dissoziierte Rückenmarkskulturen der Maus (erhalten aus 12 Tage alten Embryonen) wurden in einem Medium, das aus 10% fötalem Kälberserum und 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum in minimalem essentiellen Medium (minimal essential medium (MEM) bestand) ausplattiert (0,5 Millionen Zellen/35 mm-Schale). Nach 24 Stunden wurde das Medium zu 5% Pferdeserum in MEM gewechselt, das mit den benannten Mediumkomponenten ergänzt war (Romijn et al., Dev. Brain Res 2, 583-589 (1982)). Testkulturen wurden fünf Tage lang mit verschiedenen Mengen an konditioniertem Medium in Gegenwart von 1 uM Tetrodotoxin behandelt. Zählungen neuronaler Zellen wurden nach immunozytochemischer Identifizierung mit Antiserum gegen Neuronenspezifische Enolase durchgeführt (Schmechel et al., Science, 199, 313-315 (1978)). Die Zählungen wurden in 30 Feldern von vorbestimmten Koordinatenstellen ohne Wissen der Behandlungsgruppe durchgeführt. Jeder Wert stellte den Mittelwert von sechs Bestimmungen aus drei Versuchen dar (die Fehlerbalken sind die Standardfehler der Mittelwerte (SEM)). Die überlebensfördernde Aktivität in unfraktioniertem konditioniertem Medium aus Astrogliakulturen ist durch Dreiecke und die überlebensfördernde Aktivität von gereinigtem ADNF durch Kreise in Fig. 1 dargestellt. Einzelheiten der Reinigung von ADNF sind nachstehend beschrieben.

B. Reinigung of ADNF

Reinigungsschritte von ADNF, bestimmt durch Wirkungen an Rückenmarksneuronen, sind in Fig. 2 aufgezeigt. Wie vorstehend beschrieben, wurden Rückenmarkstestkulturen behandelt.

1. DEAE-Sephacel-Chromatographie von konditioniertem Medium von VIP-stimuliertem Astroglia (siehe Fig. 2A):

Dialysiertes (50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0) konditioniertes Medium (300 ml, 6-8 mg Protein) wurde auf eine mit 50 mM Natriumpyrophosphat-Puffer, pH 7,0 vorequilibrierte DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia AB Biotechnology Uppsala, Schweden; 0,75 cm Durchmesser und 3 cm Länge) geladen. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit jeweils 40 ml 50 mM Natriumpyrophosphat-Puffer (pH 7,0) und dann mit demselben Puffer, der mit zunehmenden Konzentrationen NaCl (0,1 M, 0,26 M, 0,5 M, 1,0 M, 2 M und 3 M) ergänzt war, gewaschen. Die Säulenfraktionen nach Dialyse gegen Wasser (1 : 10.000) wurden zusammen mit 1 uM Tetrodotoxin zu den Rückenmarkstestkulturen zugegeben. Merkliche Zunahmen bei der Zählung neuronaler Zellen wurden im 2 M NaCl-Eluat beobachtet. Die Ergebnisse der Zählungen neuronaler Zellen (ausgefüllte Kreise in Fig. 2A) wurden durch einen Mittelwert von vier Bestimmungen (die Fehlerbalken geben die Standardfehler der Mittelwerte (SEM) an) erhalten. Die Absorption bei 280 nm wurde nach ausgiebiger Dialyse gegen Wasser bei 4ºC, gefolgt von Lyophilisierung und Lösen in 1 ml Wasser, bestimmt (offene Kreise).

2. Grössentrennung der Aktivitätsabhängigen neurotrophen-DEAE-Fraktion (2 M NaCl-Eluat) auf der FPLC (siehe Fig. 2B):

Die 2 M NaCl-Fraktion (entsprechend 300 ml ursprüngliche Herstellung konditionierten Mediums) wurde gegen Wasser dialysiert, lyophilisiert und in 0,5 ml 50 mM Natriumphosphat (pH 7,3) resuspendiert, das 0,15 M NaCl enthielt. 0,25 ml Aliquots wurden auf die Superose 12-Säule (vorgepackte HR 10/30), Schnelle-Protein-Flüssigkeits-Chromatographie (Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)) (FPLC- System, Pharmacia) geladen. Fraktionen (0,5 ml, 0,4 ml/min) wurden von der Säule gesammelt, mit PBS verdünnt (1 : 10.000) und im neuronalen Überlebensassay getestet. Merkliche Zunahmen bei der Zählung neuronaler Zellen wurden in den Säulenfraktionen 22 und 31 beobachtet. Die Absorption bei 280 nm wurde, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

3. Reinigung der niedrigmolekularen neurotrophen Aktivität durch hydrophobe Wechselwirkungs-FPLC (siehe Fig. 2C):

AlkylsuperoseTM-Säule (HR5/5, Pharmacia) wurde mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) gewaschen und dann mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0) equilibriert, der 2,0 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; enthielt. Die Probe (0,5 ml der eluierten Fraktion 31 von der Grössenfraktionierungs-FPLC) wurde ausgiebig gegen deionisiertes Wasser dialysiert, lyophilisiert und in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 resuspendiert, der 1,43 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; enthielt. Die Elution (1 ml-Fraktionen, 0,5 ml/min) wurde mit einem abnehmenden linearen Gradienten aus Salz (2,0-0 M, dargestellt als gestrichelte Linie) durchgeführt, der 10 min nach Injektion gestartet und 60 min lang gefahren wurde. Proteinproben wurden ausgiebig gegen deionisiertes Wasser dialysiert und auf Proteinkonzentrationen (Gozes et al., Endocrinol., 134, 2121-2125 (1994)) unter Verwendung entweder von Immunoglobulinen oder Rinderserumalbumin als Standard analysiert. Nach hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie wurde die Proteinmenge in der aktiven Fraktion durch Aminosäure-Gesamtanalyse an einem Beckman Instrument Model 7300 nach einer Hydrolyse (24 Stunden/110ºC) in 6 N HCl bestimmt, die 0,2% Phenol enthielt. Proben, die von der hydrophoben Wechselwirkungs-Säule durch Salzabnahme eluiert wurden, wurden nach Dialyse gegen Wasser auf biologische Aktivität und die Absorption bei 280 nm getestet. Die Ergebnisse zeigten an, dass Fraktion 20 (0,94 bis 1,04 M Salz) die neurotrophe Aktivität enthielt.

C. Biochemische Eigenschaften von gereinigtem ADNF

Gereinigter ADNF (0,4 ug) wurde durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung der MinipHorTM-Vorrichtung analysiert (siehe Fig. 3A). Eluierte Fraktionen wurden nach Verdünnung von 1 : 1000 mit PBS auf überlebensfördernde Aktivität getestet. Jeder Wert stellte einen Mittelwert von zwei gut übereinstimmenden Proben (< 10%) dar. Die Elutionseigenschaften von ADNF zeigten insofern anomales Verhalten, als die isoelektrischen Fokussierungsverfahren anzeigten, dass das Molekül basisch war, während das Elutionsprofil nach DEAE-Sephacel ein saures Molekül nahelegte; d. h. das Molekül eluierte bei neutralem pH bei sehr hoher Salzkonzentration. Obwohl die Bedeutung dieser Beobachtungen noch nicht klar ist, legen isoelektrische Trennverfahren nahe, dass ADNF basisch ist und dass das Elutionsmuster der Ionenaustauschersäule eine andere Eigenschaft des Moleküls wiederspiegelt, wie Hydrophobizität oder hoch geladene Mikroumgebungen, die sich möglicherweise aus dem Proteinaufbau in makromolekulare Strukturen ergeben.
Im Anschluss an die hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie wurde der ADNF durch HPLC unter Verwendung einer LiChroCART 125-4, Lichrospher RP8, 5 um (Merck, Deutschland) analysiert (siehe Fig. 3B). ADNF wurde in 2 ml 50% Acetonitril gelöst, das 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, und eluierte mit einem Gradienten von 0-100% Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt. ADNF wurde mit einem Applied Biosystems/AB 757 Absorptionsdetektor bei einer Wellenlänge von 220 nm mit Korrekturen nachgewiesen, die für die mit dem Gradienten verbundene Basislinienverschiebung gemacht wurden. Der Proteinpeak zeigte auch biologische Aktivität an, wenn er in einem neuronalen Überlebensassay analysiert wurde.
Gereinigter ADNF (nach Reversephase-HPLC, beschrieben in Teil 3B) wurde SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese mit einem 12% Polyacrylamid-SDS-Gel unterworfen, das 0,1% SDS gemäss Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)) enthielt (siehe Fig. 3C). Die Gele wurden mit Silberfärbung gefärbt (BioRad, Richmond, Kalifornien). Die Extraktion der 14.000 Dalton-Proteinbande aus dem Polyacrylamidgel (McManaman et al., J. Biol. Chem 12, 5890-5897 (1988)) führte zu einem eluierten Protein, das biologische Aktivität beibehielt. Die Molekulargewichtsbestimmung wurde durch parallele Analyse der Molekulargewichtsmarker erhalten.

D. Vergleich von ADNF, ADNF-14 und einem hsp60-Peptid auf überlebensfördernde Aktivität

ADNF, ADNF-14 und ein hsp60-Peptid wurden hinsichtlich ihrer überlebensfördernden Aktivität in Tetrodotoxin behandelten Zerebralkortexkulturen verglichen (siehe Fig. 4). ADNF ist ein überlebensförderndes Protein, das Sequenzhomologie zum Hitzeschockprotein 60 zeigt. Gereinigter ADNF (offene Kreise in Fig. 4) erhöhte neuronales Überleben bei Konzentrationen von 10 bis 10 M (P < 0,001) im Vergleich zu Kulturen, die mit Tetrodotoxin alleine behandelt wurden. Es wurde gefunden, dass ADNF-14 (d. h. VLGGGSALLRSIPA, offene Dreiecke in Fig. 4), ein Peptid, das sowohl von der Sequenzanalyse von V8-Proteaseverdauen von ADNF als auch von homologen Sequenzen von hsp60 abgeleitet ist, identische Potenz und Wirksamkeit im Vergleich zu intaktem ADNF zeigt. Im Gegensatz dazu war das hsp 60-Peptidhomologe zu ADNF-14 (VLGGGCALLRCIPA, ausgefüllte Kreise in Fig. 4) weniger aktiv und zeigte bei Konzentrationen von 1011 bis 108 M (P < 0,01) merkliche Zunahmen beim Überleben in TTX-behandelten Kulturen (siehe Venner, T. J. & Gupta, R. S., Nucleic Acid Res., 18, 5309 (1990); Peralta et al., Nucleic Acid Res., 18, 7162 (1990)).
Für die Peptidsequenzierung wurde der HPLC-eluierte ANDF (3-5 ug) V8-Proteaseverdau (Boehringer Mannheim) unterworfen. Die Reaktion wurde 16 Stunden lang bei 37ºC in 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat, pH 7, 8 mit einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von 1 : 50 durchgeführt. Die so erhaltenen Peptide wurden durch HPLC-Chromatographie analysiert (wie vorstehend beschrieben). Die Peptide wurden auf einem Model 470 und 477 Applied Biosystems Inc. sequenziert. Die Peptide wurden auf Biobren-beschichteten Patronenfiltern (Applied Biosystems, Inc.) getrocknet. Das Röhrchen, das das Peptid enthielt, wurde mit 30 ul Trifluoressigsäure gespült, die auch an der Oberseite des Filters getrocknet wurde.
Die Peptide wurden gemäss der Festphasenstrategie unter Verwendung optimalen Seitenkettenschutzes synthetisiert (Gozes et al., Endocrinol., 134, 2121-2125 (1994)). Die Produkte wurden auf Sephadex G-25 und Reversephase-HPLC gereinigt. Die Peptide zeigten die gewünschten molaren Verhältnisse von Aminosäuren, die in den synthetisierten Peptiden logischerweise vorhanden waren. Überlebensassays wurden, wie beschrieben, in Testkulturen durchgeführt (Hill et al., Brain Res., 603, 222-233 (1993)). Sieben Tage nach neuronalem Aussäen wurden die Kulturen für einen Testzeitraum von fünf Tagen behandelt. Die Neuronen wurden, wie zuvor beschrieben, ohne Wissen der Behandlungsgruppe gezählt (Brenneman, et al. Dev. Brain Res., 15, 211-217 (1984)).

E. Fähigkeit von ADNF, Thymidin in DNA einzubauen

Es ist nun gefunden worden, dass ADNF-9 den Einbau von Thymidin in die DNA von Neuroblastomzellen des Menschen stimuliert (siehe Fig. 16). Die Fähigkeit, Thymidin in DNA einzubauen, wird als biologisches Mass für die Zellproliferation verwendet. Die für diese Versuche verwendete Zelllinie war eine Neuroblastomzelllinie, die aus menschlichem Gewebe stammte. Die menschliche Neuroblastomzelllinie NMB wurde 24 Stunden lang wachsen gelassen und dann mit verschiedenen Konzentrationen ADNF-9 behandelt. Mit Tritium markiertes Thymidin wurde zum Zeitpunkt der ADNF- 9-Behandlung zugegeben. Die Behandlungsdauer betrug 24 Stunden. Die Assay- und Zellkulturkonzentrationen wurden vorher eingestellt, wie in Wollman et al., Brain Res., 624, 339 (1993) beschrieben ist. Jeder in Fig. 17 aufgeführte Punkt stellt einen Mittelwert ± des Standardfehlers von 4-5 Bestimmungen dar. Aus diesen Daten ist leicht erkennbar, dass ADNF-9 die Fähigkeit hat, den Einbau von Thymidin in DNA zu stimulieren.
Die vorstehenden Ausführungen sind zu Veranschaulichungszwecken angegeben worden. Für den Fachmann ist leicht ersichtlich, dass die Betriebsbedingungen, Materialien, Verfahrensschritte und anderen Parameter der hier beschriebenen Verfahren und Testvorrichtungen weiter abgeändert oder ersetzt werden können, ohne vom Schutzbereich der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF), wobei das Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

R¹ eine Aminosäuresequenz ist, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, bei der jede Aminosäure unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure- Nachahmern,

R² eine Aminosäuresequenz ist, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, bei der jede Aminosäure voneinander unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure- Nachahmern, und

x und y voneinander unabhängig ausgewählt sind und gleich Null oder Eins sind;

unter der Voraussetzung, dass

das ADNF-Polypeptid eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz hat und

das ADNF-Polypeptid eine von der Aminosäuresequenz des 14-mers, das durch V-8-Proteaseverdau der vollständigen Länge des ADNF erzeugt wird, verschiedene Aminosäuresequenz hat.

2. Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors nach Anspruch 1, bei dem x und y beide Null sind.

3. Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors nach Anspruch 1, bei dem

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

4. Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors nach Anspruch 1, bei dem

x Eins ist;

R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

5. Polypeptid-Antagonist des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF), wobei der Antagonist im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Lys-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile;

unter der Voraussetzung, dass der ADNF-Polypeptid-Antagonist eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz eines Hitzeschockproteins (hsp 60) verschiedene Aminosäuresequenz hat.

6. Verwendung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung des neuronalen Zelltods von neuronalen Zellen, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

R¹ eine Aminosäuresequenz ist, die 1 bis etwa 40 Aminosäuren umfasst, bei der jede Aminosäure voneinander unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminosäure- Nachahmern,

unter der Voraussetzung, dass

das Polypeptid eine von der vollständigen Länge der Aminosäuresequenz des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors verschiedene Aminosäuresequenz hat und

7. Verwendung nach Anspruch 6, bei der die neuronalen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Rückenmarksneuronen, Hippocampusneuronen, Zerebralkortexneuronen und cholinergen Neuronen.

8. Verwendung nach Anspruch 6, bei der x und y beide Null sind.

9. Verwendung nach Anspruch 6, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

10. Verwendung nach Anspruch 6, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

11. Verwendung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods bei einem mit dem Menschlichen Immunschwäche Virus (Human Immunodeficiency Virus) infizierten Patienten, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

unter der Voraussetzung, dass

12. Verwendung nach Anspruch 11, bei der x und y beide Null sind.

13. Verwendung nach Anspruch 11, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

14. Verwendung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, verbunden mit Excito-Toxizität, die durch N-Methyl-D-aspartat-Stimulation induziert wird, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

unter der Voraussetzung, das

15. Verwendung nach Anspruch 14, bei der x und y beide Null sind.

16. Verwendung nach Anspruch 14, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

17. Verwendung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des neuronalen Zelltods, der durch das β-amyloide Peptid bei einem an der Alzheimer-Krankheit leidenden Patienten induziert wird, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

unter der Voraussetzung, dass

18. Verwendung nach Anspruch 17, bei der x und y beide Null sind.

19. Verwendung nach Anspruch 17, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

20. Verwendung eines Polypeptids des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu verhindern, und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der durch cholinerge Blockierung hervorgerufenen Lernbeeinträchtigung bei einem an der Alzheimer-Krankheit leidenden Patienten, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

unter der Voraussetzung, dass

21. Verwendung nach Anspruch 20, bei der x und y beide Null sind.

22. Verwendung nach Anspruch 20, bei der

x Eins ist;

R¹ Val-Leu-Gly-Gly-Gly ist; und

y Null ist.

23. Verwendung eines Polypeptid-Antagonisten des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors in einer ausreichenden Menge, um den neuronalen Zelltod zu induzieren, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung des neuronalen Zelltods, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der neuronalen Zellen mit dem ADNF-Polypeptid-Antagonisten umfasst, der im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

24. Arzneimittel, das einen pharmazeutisch verträglichen Arzneistoffträger und ein Polypeptid des Aktivitätsabhängigen Neurotrophen Faktors (ADNF) umfasst, wobei das ADNF-Polypeptid im wesentlichen aus der folgenden Aminosäuresequenz besteht:

(R¹)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R²)y

wobei

unter der Voraussetzung, dass