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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft kosmetische Zusammensetzungen, die
Anis-Extrakt in Kombination mit Retinoiden enthalten, und Verfahren
zum Konditionieren der Haut durch die Auftragung von solchen Zusammensetzungen
auf die Haut.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Retinol
(Vitamin A) ist eine endogene Verbindung, die natürlich im
menschlichen Körper
auftritt und für normale
Epithelialzellendifferenzierung wesentlich ist. Natürliche und
synthetische Vitamin-A-Derivate wurden ausgiebig bei der Behandlung
einer Vielzahl von Hautstörungen
und als Hautreparatur- und -erneuerungsmittel eingesetzt. Retinsäure wurde
verwendet, um eine Vielzahl von Hautzuständen, wie Akne, Falten, Psoriasis, Altersflecken
und Hautverfärbung,
zu behandeln.
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Innerhalb
der Zellen werden Retinol und Retinsäure an spezielle zelluläre Bindungsproteine
gebunden, wobei zwei der Hauptproteine CRABP-1 und -2 darstellen
(Roos et al., Pharmacological reviews: 50, 315-333, 1998). Diese
Proteine wirken beim Regulieren der intrazellulären Konzentration von Retinoiden
durch Wirken als sowohl Lagerungs- als auch Transportproteine im
Retinoidmetabolismus. Die Anteile von diesem Protein werden durch
die Menge an Retinsäure
innerhalb der Zellen reguliert. Höhere zelluläre Anteile von Retinoiden erhöhen die
Expression von CRABP-2. Deshalb ist die Menge von diesem Protein
in den Zellen ein Maß der
Retinoidaktivität
der Zellen. Hautzellen enthalten CRABP-2 sowohl in der Epidermis
als auch der Dermis. CRABP-2-Reaktion auf die Retinoidverabreichung
in Fibroblasten in vitro wird als ein reproduzierbares Maß von der
Retinoid bioaktivität
verwendet, das die menschlichen Hautreaktionen vorhersagt (Elder
et al., J. Invest. Dermatol., 106: 517-521, 1996). Deshalb ist die
CRABP-2-Expression der Fibroblasten ein Maß von Retinoidaktivität, was zu
verschiedenen kosmetischen Hautvorteilen führt (Antialterung, Antifaltenbildung, Hautkonditionierung
usw.).
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Anis-(auch
bekannt als "Süßer Kreuzkümmel" oder durch den wissenschaftlichen
Namen Pimpinella anisum)-Samenöl
enthält
verschiedene flüchtige
Duftkomponenten. Eine der Hauptkomponenten von Anissamenöl ist trans-Anethol
(bis zu 75% des Samens) (Embong M.B., Hadziyev D., Molnar S., Can.
J. Plant Sci, 57: 681-8, 1977). Die anderen Bestandteile des Öls, die
in Mengen von 1-5% vorliegen, sind cis-Anethol, Carvon, β-Caryophyllen,
Dihydcarvylacetat, Östragol
und Limonen. Die Agricultural Research Service Database schließt, hinsichtlich
der Zusammensetzung von Anis, auch Dianethol und Photoanethol als
weitere geringfügige
Komponenten ein. Anethol, Dianethol, Photoanethol und Östragol
sind dafür
bekannt, dass sie östrogene Aktivität aufweisen. Ätherische Öle, einschließlich jene
von Anis, wurden als nützliche
Insekten abweisende Mittel (Shukla H.S., Upadhay P.D., Tripathi
S.C., Pesticides, 23: 33-5, 1989); Insektizide (Eli S., Uzi R. et
al., J. Chem. Ecol 17: 499-504, 1991; Craig M. und Lichtenstein
EP., J. Agric. Food Chem. 30: 563-8, 1982); Konvulsantien (Okuyama
E., Nakamura T. und Mikio Y., Chem. Pharm. Bull 41: 1670-1, 1993)
und als ein toxisches Mittel gegen Schnecken (Maini P., Morallo-Rejesus
B., Phillipp, J. Sci., 121: 391-7, 1992) beschrieben.
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WO9112792 beschreibt die
Verwendung von Anethol zum Fördern
des Haarwachstums, Verhindern bzw. Vorbeugen oder Minimieren von
Haarverlust und Verstärken
der Haarfarbe. Verschiedene US-Patente beschreiben die Verwendung
von Cyclodextrin zum Komplexieren von ätherischen Ölen, einschließlich Anisöl oder Anethol,
als Komponenten für
Duftstoffe, Parfüms,
orale Hygienezusammensetzungen, Hautpflegezusammensetzungen oder
Wäschewaschmittelzusammensetzungen
(z.B.
US-Pat.-Nr. 5 543 157 ).
JP 6048934 offenbart Hautpflegezusammensetzungen,
die Extrakte von Pflanzen enthalten, ausgewählt aus Dill, Estragon, Savi,
Anis, usw., in Kombination mit Hautweißungsmitteln oder in Kombination
mit mindestens einer Art Collagenbildungspromotor, wie Retinsäure.
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Die
vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf dem Befund, dass der
organische Lösungsmittelextrakt von
Anissamen, in Kombination mit Retinol oder Retinylester, CRABP-2-Expression in Fibroblasten
verstärkt.
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft kosmetische Hautpflegezusammensetzungen,
umfassend:
- (i) einen organischen Lösungsmittelextrakt
von Anissamen in einer Menge von 0,00001 bis 10 Gewichtsprozent,
- (ii) 0,001 bis 10 Gewichtsprozent eines Retinols, ausgewählt aus
Retinol, Retinylester und Gemischen davon; und
- (iii) einen kosmetisch verträglichen
Träger.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
auch ein Verfahren zum Verbessern oder Verhindern des Zustands von
faltiger, mit Linien durchzogener, trockener, schuppiger, gealterter
oder lichtgeschädigter
Haut und Verbessern der Hautdicke, Elastizität, Biegsamkeit, Strahlen, Glanz
und Prallheit ein, wobei das Verfahren Auftragen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
auf die Haut einschließt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
sind zur örtlichen
Auftragung auf menschliche Haut, die bereits trocken, schuppig,
mit Linien durchzogen, faltig, gealtert, lichtgeschädigt ist,
vorgesehen, sie können
prophylaktisch aufgetragen werden, um die verschlechternden Veränderungen
zu vermindern.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
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Mit
Ausnahme in den Beispielen oder wo anders explizit angezeigt, sind
alle Zahlen in dieser Beschreibung, einschließlich Mengen von Material oder
Reaktionsbedingungen, physikalische Eigenschaften der Materialien
und/oder Anwendung, als durch das Wort "etwa" modifiziert
zu verstehen. Alle Mengen sind auf das Gewicht der Zusammensetzung
bezogen, sofern nicht anders ausgewiesen.
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Anissamen
ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Form
eines organischen Extrakts geeignet. Der Anissamenextrakt zur Verwendung
in der vorliegenden Erfindung wird aus getrocknetem Anissamen hergestellt,
der z.B. von Arrowhead Mills, von Reformhäusern oder Supermärkten erhalten
werden kann.
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Die
organischen Extrakte des Anissamens werden durch Extrahieren der
getrockneten Anissamen mit einem Lösungsmittel durch Rühren von
1 Teil des getrockneten Anissamens mit 2 bis 5 Teilen des Lösungsmittels
für 4 bis
24 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Geeignete Lösungsmittel
werden nachstehend beschrieben. Die Extrakte werden durch Filtration
und/oder Zentrifugierung gereinigt, dann durch Verdampfung (gegebenenfalls
unter Vakuum) getrocknet, um den organischen Extrakt von Anissamen
zu erhalten.
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Zur
Herstellung von Anissamenextrakt zur Verwendung hierin geeignete
Lösungsmittel
schließen
ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Ethanol, Methanol, Hexan,
Chloroform, Dichlormethan und Essigsäureethylester. Die bevorzugten
Lösungsmittel
sind Dichlormethan, Methanol oder Ethanol, um die Wirksamkeit zu
optimieren. Der Extrakt kann weiter aufkonzentriert, fraktioniert,
erneut extrahiert oder gereinigt werden, z.B. durch organische Lösungsmittelextraktion
oder durch Chromatographie.
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Im
Allgemeinen liegt die Menge des Anissamenextrakts in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
im Bereich von 0,00001% bis 10 Gewichtsprozent der Zusammensetzung.
Um die Kosten zu senken und die Wirkung zu maximieren, liegt vorzugsweise
die Menge des Anissamenextrakts im Bereich von 0,01 bis 10% und
besonders bevorzugt im Bereich von 0,1% bis 5 Gewichtsprozent der
Zusammensetzung.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen weiterhin ein Retinoid, ausgewählt aus Retinol oder Retinylester.
Der Begriff "Retinol" schließt die nachstehenden
Isomeren von Retinol ein: all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol, 11-cis-Retinol,
9-cis-Retinol, 3,4-Didehydroretinol. Bevorzugte Isomeren sind all-trans-Retinol,
13-cis-Retinol, 3,4-Didehydroretinol, 9-cis-Retinol. Besonders bevorzugt ist all-trans-Retinol,
aufgrund seiner breiten kommerziellen Verfügbarkeit.
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Retinylester
ist ein Ester von Retinol. Der Begriff "Retinol" wurde vorstehend definiert. Zur Verwendung in
der vorliegenden Erfindung geeignete Retinylester sind C1-C30-Ester von Retinol,
vorzugsweise C2-C20-Ester und
besonders bevorzugt C2-, C3-
und C16-Ester, weil sie besser verfügbar sind.
Beispiele für
Retinylester schließen
ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Palmitinsäureretinylester,
Ameisensäureretinylester,
Essigsäureretinylester,
Propionsäureretinylester,
Buttersäureretinylester,
Valeriansäureretinylester,
Isovaleriansäureretinylester,
Hexansäureretinylester,
Heptansäureretinylester,
Octansäureretinylester,
Nonansäureretinylester,
Decansäureretinylester,
Undecansäureretinylester,
Laurinsäureretinylester,
Tridecansäureretinylester,
Myristinsäureretinylester,
Pentadecansäureretinylester,
Heptadecansäureretinylester,
Stearinsäureretinylester, Isostearinsäureretinylester,
Nonadecansäureretinylester,
Arachidonsäureretinylester,
Behensäureretinylester, Linolensäureretinylester, Ölsäureretinylester.
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Der
bevorzugte Ester zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist
ausgewählt
aus Palmitinsäureretinylester,
Essigsäureretinylester
und Propionsäureretinylester,
weil diese die am besten kommerziell verfügbaren sind und deshalb die
kostengünstigsten
sind. Linolensäureretinylester
ist auch aufgrund seiner Wirksamkeit bevorzugt.
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Retinol
oder Retinylester wird in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einer
Menge von etwa 0,001% bis etwa 10%, vorzugsweise in einer Menge
von etwa 0,01% bis etwa 1% be sonders bevorzugt in einer Menge von
etwa 0,01% bis etwa 0,5 Gewichtsprozent der Zusammensetzung, angewendet.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfassen auch ein kosmetisch verträgliches Vehikel, um als ein
Verdünnungsmittel,
Dispersionsmittel oder Träger
für den
Anissamenextrakt und das Retinoid in der Zusammensetzung zu wirken,
sodass deren Verteilung erleichtert ist, wenn die Zusammensetzung
auf die Haut aufgetragen wird.
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Vehikel,
verschieden von oder zusätzlich
zu Wasser, können
flüssige
oder feste Erweichungsmittel, Lösungsmittel,
Feuchthaltemittel, Verdickungsmittel und Pulver einschließen. Ein
besonders bevorzugter, nichtwässriger
Träger
ist ein Polydimethylsiloxan und/oder ein Polydimethylphenylsiloxan.
Die erfindungsgemäßen Silikone
können
jene mit Viskositäten
im Bereich von irgendwo von etwa 10 bis 10000000 mm2/s
(Centistokes) bei 25°C
sein. Besonders erwünscht
sind Gemische von Silikonen mit niederer und hoher Viskosität. Diese
Silikone sind von der General Electric Company unter den Handelsmarken
Vicasil, SE und SF, und von der Dow Corning Company unter den 200er-
und 550er-Reihen verfügbar.
Die Mengen an Silikon, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen angewendet
werden können,
liegen im Bereich von irgendwo von 5% bis 95% vorzugsweise 25% bis
90 Gewichtsprozent der Zusammensetzung.
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Das
kosmetisch verträgliche
Vehikel wird gewöhnlich
5% bis 99,9% vorzugsweise 25% bis 80 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung
umfassen, und kann in Abwesenheit von anderen kosmetischen Hilfsmitteln
den Ausgleich der Zusammensetzung bilden. Vorzugsweise ist das Vehikel
mindestens 80 Gewichtsprozent Wasser, auf das Gewicht des Vehikels.
Vorzugsweise umfasst Wasser mindestens 50 Gewichtsprozent der erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
besonders bevorzugt 60 bis 80 Gewichtsprozent, auf das Gewicht der
Zusammensetzung.
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Wahlweise Hautvorteilsmaterialien
und kosmetische Hilfsmittel
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Ein Öl oder öliges Material
kann zusammen mit einem Emulgator vorliegen, um in Abhängigkeit
von der Größe des mittleren
hydrophilen-lipophilen Ausgleichs (HLB) von dem angewendeten Emulgator,
entweder eine Wasser-in-Öl-Emulsion
oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion
bereitzustellen.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
schließen
vorzugsweise Sonnenschutzmittel ein. Sonnenschutzmittel schließen jene
Materialien ein, die üblicherweise
zum Blockieren von Ultraviolettlicht angewendet werden. Erläuternde
Verbindungen sind die Derivate von PABA, Zimtsäureester und Salicylsäureester.
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Zum
Beispiel können
Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon
(auch bekannt als Oxybenzone) verwendet werden. Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon sind unter den Handelsmarken
Parsol MCX bzw. Benzophenon-3 kommerziell erhältlich. Die exakte Menge an
in den Emulsionen angewendetem Sonnenschutzmittel kann in Abhängigkeit
von dem vor der UV-Sonnenstrahlung erwünschten Schutzgrad variieren.
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Erweichungsmittel
werden häufig
in die erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen eingearbeitet. Anteile von solchen Erweichungsmitteln
können
im Bereich von 0,5% bis 50%, vorzugsweise zwischen 5% und 30 Gewichtsprozent,
der Gesamtzusammensetzung liegen. Erweichungsmittel können unter solche
allgemeinen chemischen Kategorien, wie Ester, Fettsäuren und
Alkohole, Polyole und Kohlenwasserstoffe eingeteilt werden.
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Ester
können
Mono- oder Diester sein. Annehmbare Beispiele für Fettsäurediester schließen Adipinsäuredibutylester,
Sebacinsäurediethylester,
Dimersäurediisopropylester
und Bernsteinsäuredioctylester
ein. Annehmbare verzweigtkettige Fettsäureester schließen Myristinsäure-2-ethyl-hexylester,
Stearinsäureisopropylester
und Palmitinsäureisostearylester
ein. Annehmbare dreibasige Säureester
schießen
Trilinolensäuretri isopropylester
und Zitronensäuretrilaurylester
ein. Annehmbare geradkettige Fettsäureester schließen Palmitinsäurelaurylester,
Milchsäuremyristylester
und Ölsäurestearylester
ein. Bevorzugte Ester schließen
Cococaprylat/-caprat (ein Gemisch von Cococaprylat und Cococaprat),
Propylenglycolmyristyletheracetat, Diisopropyladipat und Cetyloctanoat
ein.
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Geeignete
Fettalkohole und -säuren
schließen
jene Verbindungen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Besonders
bevorzugt sind Verbindungen, wie Cetyl-, Myristyl-, Palmitin- und
Stearylalkohole und -säuren.
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Unter
den Polyolen, die als Erweichungsmittel dienen können, sind lineare und verzweigtkettige
Alkylpolyhydroxylverbindungen. Zum Beispiel sind Propylenglycol,
Sorbit und Glycerin bevorzugt. Auch verwendbar sein können polymere
Polyole, wie Polypropylenglycol und Polyethylenglycol. Butylen-
und Propylenglycol sind auch als Eindringverstärker besonders bevorzugt.
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Beispielhafte
Kohlenwasserstoffe, die als Erweichungsmittel dienen können, sind
jene mit Kohlenwasserstoffketten irgendwo von 12 bis 30 Kohlenstoffatomen.
Spezielle Beispiele schließen
Mineralöl,
Vaseline, Squalen und Isoparaffine ein.
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Eine
weitere Kategorie von funktionellen Bestandteilen innerhalb der
erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen sind Verdickungsmittel. Ein Verdickungsmittel
wird gewöhnlich
in Mengen im Bereich irgendwo von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise
von etwa 0,5% bis 10 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung vorliegen.
Beispielhafte Verdickungsmittel sind vernetzte Polyacrylatmaterialien,
die unter der Handelsmarke Carbopol von der B.F. Goodrich Company
erhältlich
sind. Gummis können
angewendet werden, wie Xanthan-, Carrageenan-, Gelatine-, Karaya-,
Pektin- und Johannisbrotbaumgummi. Unter bestimmten Umständen kann
die verdickende Funktion durch ein Material ausgeführt werden,
das auch als ein Silikon oder Erweichungsmittel dient. Zum Beispiel
haben Silikongummis oberhalb 10 Centistokes und Ester, wie Stearinsäureglycerylester,
duale Funktionalität.
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Pulver
können
in die erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen eingearbeitet werden. Diese Pulver schließen Kreide,
Talkum, Kaolin, Stärke,
Smectittone, chemisch modifiziertes Magnesiumaluminiumsilikat, organisch
modifizierten Montmorillonitton, hydriertes Aluminiumsilikat, pyrogenes
Siliziumdioxid, Aluminiumstärkeoctenylsuccinat
und Gemische davon ein.
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Andere
geringe Hilfskomponenten können
auch in die kosmetischen Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Diese Bestandteile können
färbende
Mittel, Opazitätsmittel
und Parfüms
einschließen.
Die Mengen von diesen anderen geringen Hilfskomponenten können im
Bereich irgendwo von 0,001% bis zu 20 Gewichtsprozent der Zusammensetzung
liegen.
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Verwendung der Zusammensetzung
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
ist primär
als ein Produkt zur örtlichen
kosmetischen Auftragung auf menschliche Haut, insbesondere als ein
Mittel zum Konditionieren, Befeuchten und Glätten der Haut, und Verhindern
oder Vermindern des Aussehens von mit Linien durchzogener, faltiger
oder gealterter Haut, beabsichtigt.
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Bei
der Verwendung wird eine kleine Menge der Zusammensetzung, z.B.
1 bis 100 ml, auf exponierte Flächen
der Haut aus einem geeigneten Behälter oder Applikator aufgetragen,
und, falls erforderlich, wird sie dann unter Verwendung von der
Hand oder den Fingern oder einer geeigneten Vorrichtung über die
Haut verbreitet und/oder in sie eingerieben.
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Produktform und Verpackung
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Die
erfindungsgemäßen örtlichen
Hautbehandlungszusammensetzungen können als eine Lotion, eine Creme
oder ein Gel formuliert werden. Die Zusammensetzung kann in einen
geeigneten Behälter
zum Anpassen seiner Viskosität
und beabsichtigten Verwendung durch den Verbraucher verpackt werden.
Zum Beispiel kann eine Lotion oder Creme in eine Flasche oder einen
Rollballapplikator oder eine mit Treibmittel betriebene Aerosolvorrichtung
oder einen Behälter,
der mit einer zur Fingerbetätigung
geeigneten Pumpe ausgestattet ist, verpackt sein. Wenn die Zusammensetzung
eine Creme ist, kann sie einfach in einer nichtverformbaren Flasche
oder einem Quetschbehälter,
wie einer Tube oder mit Deckel versehener Dose, gelagert werden.
Die Zusammensetzung kann auch in Kapseln eingeschlossen sein, wie
jene, die in
US-Pat.-Nr. 5 063
507 beschrieben sind, welche hierin durch Hinweis einbezogen
sind. Die Erfindung stellt folglich auch einen verschlossenen Behälter bereit,
der eine wie hierin definierte kosmetisch verträgliche Zusammensetzung enthält.
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Die
nachstehenden speziellen Beispiele erläutern die Erfindung weiterhin,
jedoch ist die Erfindung nicht darauf begrenzt. In allen Beispielen
wurde Anissamen aus örtlichen
Reformhäusern
erhalten. Retinoide wurden von Sigma erhalten. Der Student-T-Test
wurde verwendet, um alle p-Werte zu berechnen.
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BEISPIELE
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Die
nachstehenden Verfahren wurden angewendet:
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Verfahren:
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1. Herstellung von Anis-Extrakten:
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Getrocknete
Sternanissamen (Pimpinella anisum) wurden von örtlichen Märkten bezogen und in einem
Trockenvermahler gepulvert. Der alkoholische Extrakt von Anissamen
wurde durch Rühren
von 1 g des trockenen Anissamenpulvers in 10 ml Lösungsmittel,
ausgewählt
aus der Liste von vorstehend angegebenen Lösungsmitteln (z.B. Ethanol),
für 4 bis
24 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Die Extrakte wurden durch Filtration
und Zentrifugierung gereinigt, um 10% Extrakt von Anissamen in dem
jeweiligen Lösungsmittel
zu erhalten.
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2. Zellkulturverfahren:
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Humane
erwachsene Fibroblasten, die vom sonnengeschützten Innenarm von 25-30 Jahre
alten, weiblichen Probanden erhalten wurden, wurden verwendet. Die
Zellen wurden in 1:1 DMEM/Hams F12 Medien, enthaltend 10% FBS, gehalten
bei 37°C
in einer 5%igen CO2-Atmosphäre unter
Normalatmosphären-Sauerstoffspannung
wachsen lassen. Die dritte Passage von erwachsenen Fibroblasten
wurde in DMEM-Medien mit 10% FBS in 12-Vertiefungsplatten bei einer Samendichte
von 40000 Zellen/ml/Vertiefung wachsen lassen. Die Zellen wurden
bei 80% Zusammenfluss in serumfreien und Phenolrot-freien (PRF)
DMEM-Medien zweimal gespült.
Die Vorbehandlung mit Anissamenextrakt für 4 Stunden wurde durchgeführt und
dann mit Retinoiden dosiert und für 48 Stunden inkubiert. Nach
Inkubation wurden die Vertiefungen zweimal mit 1 × PBS gewaschen
und die Zellmonoschicht wurde in 100 μl Zelllysepuffer (enthält 1 × PBS, 1%
Triton X, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS-enthaltenden Proteaseinhibitor
(10 mg/ml PMSF in Isopropanol, 10 μl/ml)) geerntet. Die Suspension
wurde bei 14000 U/min für
10 Minuten zentrifugiert, der Überstand
gesammelt und eine aliquote Menge des Überstands zur Proteinquantifizierung
verwendet. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines
Pierce-Protein-Kits bestimmt. Der Rest des 100 μl Überstands (Zelllysat) wurde
in einem Gemisch von 40 μl
Probenpuffer (NOVEX) und 0,5%igem β-Mercaptoethanol (BME) durch
Sieden der Probe für
5 Minuten denaturiert. Gleiche Mengen Protein wurden dann auf 16%
Trisglycin-Gele zur Proteinanalyse durch SDS PAGE und Western-Immuno-Blotting
für CRABP-2
Proteinexpression beladen.
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3. Nachweis von zellulärem Retinsäure-Bindungs-Protein 2 (CRABP-2)
in Fibroblasten:
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Um
die Anteile von CRABP-2 in den wie vorstehend beschrieben hergestellten
Fibroblasten zu messen, wurde der Zellüberstand in 4 × Probenpuffer
und 0,5% BME resuspendiert und für
5 Minuten gekocht und zum Western-Blotting verwendet. Gleiche Mengen
Protein wurden auf 16% Trisglycin-Gele zur CRABP-2 Proteinanalyse
durch SDS Page und Western-Immuno-Blotting beladen. Die Gele wurden in
Nitrocelluloseblots überführt und
Western-Blotting wurde unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern auf
CRABP-2 gemäß Standardverfahren
ausgeführt.
Die CRABP-2 Proteinbande wurde in den Western-Blots unter Verwendung des
Chemilumineszenzsystems, erhalten von Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz,
CA), visualisiert. Die Banden in dem Film wurden durch densitometrisches
Scanning quantifiziert, wobei die Daten auf dreifachen Proben als
% der Kontrolle berechnet und in den nachstehenden Tabellen als
% Erhöhung
gegenüber
der Kontrolle (mit Kontrolle als 100%) ± Standardabweichung von dreifachen
Ausführungen
ausgedrückt
wurden.
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BEISPIELE 1-4
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Die
nachstehenden Beispiele untersuchten die Wirkung auf CRABP-2 Expression
von Fibroblasten von Kombinationen von verschiedenen Konzentrationen
von Anissamenextrakt und Retinoiden. BEISPIEL 1: 100 nM Retinoide und 0,1 μl von einem
10%igen Anissamenextrakt
| Gruppen | CRABP-2 Anteile | Als
% Kontrolle | p-Wert
gegen Kontrolle | p-Wert
gegen Retinoid | p-Wert
gegen Anis | Synergie |
| Kontrolle | 0,43 ± 0,16 | 100 ± 38 | 1 | | | |
| Retinol | 1,36 ± 0,17 | 317 ± 39 | 0,0002 | 1 | | |
| Palmitinsäureretinylester | 1,12 ± 0,15 | 262 ± 37 | 0,0064 | 1 | | |
| Linolsäureretinylester | 1,23 ± 0,28 | 286 ± 65 | 0,0012 | 1 | | |
| Essigsäureretinylester | 2,38 ± 0,81 | 553 ± 190 | 0,0154 | 1 | | |
| Anisextrakt | 1,27 ± 0,18 | 295 ± 43 | 0,0043 | | 1 | |
| Anis
+ Retinol | 2,77 ± 0,43 | 644 ± 101 | 0,000 | 0,0064 | 0,00053 | Ja |
| Anis
+ Palmitinsäureretinylester | 2,48 ± 0,2 | 576 ± 48 | 0,00001 | 0,00085 | 0,0016 | Ja |
| Anis
+ Linolsäureretinylester | 3,75 ± 0,24 | 872 ± 57 | 0,000004 | 0,0003 | 0,00015 | Ja |
| Anis
+ Essigsäureretinylester | 4,7 ± 0,1 | 1094 ± 24 | 0,000007 | 0,0032 | 0,00018 | Ja |
BEISPIEL 2: 100 nM Retinoide und 0,1 μl eines 10%igen
Anissamenextrakts
| Gruppen | CRABP-2 Anteile | Als
% Kontrolle | p-Wert
gegen Kontrolle | p-Wert
gegen Retinoid | p-Wert
gegen Anis | Synergie |
| Kontrolle | 0,43 ± 0,16 | 100 ± 38 | 1 | | | |
| Retinol | 1,36 ± 0,17 | 317 ± 39 | 0,00024 | 1 | | |
| Palmitinsäureretinylester | 1,12 ± 0,15 | 262 ± 37 | 0,0064 | 1 | | |
| Linolsäureretinylester | 1,23 ± 0,28 | 286 ± 65 | 0,00129 | 1 | | |
| Essigsäureretinylester | 2,38 ± 0,81 | 553 ± 190 | 0,0154 | 1 | | |
| Anisextrakt | 1,06 ± 0,44 | 247 ± 103 | 0,082 | | 1 | |
| Anis
+ Retinol | 2,87 ± 0,32 | 667 ± 75 | 0,000032 | 0,002 | 0,00047 | Ja |
| Anis
+ Palmitinsäureretinylester | 2,61 ± 0,31 | 606 ± 72 | 0,000043 | 0,0018 | 0,0078 | Ja |
| Anis
+ Linolsäureretinylester | 2,89 ± 0,25 | 673 ± 59 | 0,000015 | 0,0015 | 0,0035 | Ja |
| Anis
+ Essigsäureretinylester | 5,6 ± 0,86 | 1303 ± 200 | 0,000052 | 0,009 | 0,0012 | Ja |
BEISPIEL 3: 500 nM Retinoide und 0,1 μl von einem
10%igen Anissamenextrakt
| Gruppen | CRABP-2 Anteile | Als
% Kontrolle | p-Wert
gegen Kontrolle | p-Wert
gegen Retinoid | p-Wert
gegen Anis | Synergie |
| Kontrolle | 0,43 ± 0,16 | 100 ± 38 | 1 | | | |
| Retinol | 0,66 ± 0,19 | 154 ± 44 | 0,187 | 1 | | |
| Palmitinsäureretinylester | 0,83 ± 0,5 | 193 ± 124 | 0,281 | 1 | | |
| Linolsäureretinylester | 0,99 ± 0,13 | 231 ± 30 | 0,01 | 1 | | |
| Essigsäureretinylester | 1,02 ± 0,56 | 237 ± 131 | 0,157 | 1 | | |
| Anisextrakt | 1,27 ± 0,18 | 295 ± 43 | 0,00435 | | 1 | |
| Anis
+ Retinol | 3,38 ± 0,17 | 787 ± 41 | 0,000031 | 0,000054 | 0,0011 | Ja |
| Anis
+ Palmitinsäureretinylester | 3,56 ± 0,5 | 829 ± 118 | 0,000053 | 0,003 | 0,0018 | Ja |
| Anis
+ Linolsäureretinylester | 3,7 ± 0,53 | 861 ± 123 | 0,000052 | 0,0011 | 0,0017 | Ja |
| Anis
+ Essigsäureretinylester | 3,21 ± 0,69 | 746 ± 162 | 0,00025 | 0,0135 | 0,0096 | Ja |
BEISPIEL 4: 500 nM Retinoide und 1,0 μl eines 10%igen
Anissamenextrakts:
| Gruppen | CRABP-2 Anteile | Als
% Kontrolle | p-Wert
gegen Kontrolle | p-Wert
gegen Retinoid | p-Wert
gegen Anis | Synergie |
| Kontrolle | 0,43 ± 0,16 | 100 ± 38 | 1 | | | |
| Retinol | 0,66 ± 0,19 | 154 ± 44 | 0,187 | 1 | | |
| Palmitinsäureretinylester | 0,83 ± 0,5 | 193 ± 124 | 0,281 | 1 | | |
| Linolsäureretinylester | 0,99 ± 0,13 | 231 ± 30 | 0,01 | 1 | | |
| Essigsäureretinylester | 1,02 ± 0,56 | 237 ± 131 | 0,157 | 1 | | |
| Anisextrakt | 1,06 ± 0,44 | 247 ± 103 | 0,082 | | 1 | |
| Anis
+ Retinol | 2,35 ± 0,13 | 546 ± 30 | 0,0000097 | 0,000023 | 0,0086 | Ja |
| Anis
+ Palmitinsäureretinylester | 2,84 ± 1,45 | 662 ± 338 | 0,0046 | 0,0145 | 0,112 | Nein |
| Anis
+ Linolsäureretinylester | 3,0 ± 0,5 | 697 ± 117 | 0,00011 | 0,087 | 0,0076 | Nein |
| Anis
+ Essigsäureretinylester | 2,64 ± 0,37 | 613 ± 86 | 0,000072 | 0,496 | 0,0093 | Nein |
-
Die
in Beispielen 1-4 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass Anisextrakt
Synergie mit allen den Retinoiden zeigt, mit der Ausnahme der höchsten Konzentration
von Retinoiden (500 nM) in Kombination mit der höchsten Konzentration des getesteten
Anisextrakts (1 μl).
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass die speziellen Formen der hierin erläuterten Erfindung nur als repräsentativ
vorgesehen sind. Veränderungen,
einschließlich
jener, die in dieser Beschreibung vorgeschlagen werden, jedoch nicht
darauf begrenzt, können
in den erläuterten
Ausführungsformen,
ohne von den klaren Lehren der Offenbarung abzuweichen, ausgeführt werden.
Folglich sollte beim Bestimmen des vollen Umfangs der Erfindung
Bezug auf die nachstehend beigefügten
Ansprüche
erfolgen.