DE4440200A1 - DNA-Sequenzen und ihre Verwendung - Google Patents
DNA-Sequenzen und ihre VerwendungInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz und ihre Verwendung
zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeu
gung von neuen Pflanzen, die männlich steril sind und eine veränderte Blütenfarbe
aufweisen.
Männlich sterile Pflanzen spielen in der Pflanzenzüchtung, insbesondere in der
Hybridzüchtung, eine bedeutende Rolle. Verschiedene Verfahren zur Erzeugung
von männlich sterilen Pflanzen sind bereits bekanntgeworden, gemäß welchen
beispielsweise gezielt Zellschäden z. B. in den Antheren hervorgerufen werden,
Eingriffe in mitochondriale Funktionen erfolgen, mit Hilfe von Antisense-DNA
sterilisierende Einwirkungsmöglichkeiten von Chemikalien geschaffen werden
oder die Chalkonsynthese inhibiert wird (vgl. WO 90/08830, WO 90/08831, WO
89/10396, EP-A-0 329 308 und EP-A-0 335 451). Die bisher zur Erzeugung von
männlich sterilen Pflanzen zur Verfügung stehenden Verfahren führen jedoch in
vielen Fällen nicht zu voll befriedigenden Ergebnissen. Darüberhinaus werden
häufig Pflanzen mit einer erheblich gesteigerten Empfindlichkeit gegenüber pilz
lichen Schädlingen erhalten, was ihre praktische Handhabung in einem hohen
Maße erschwert.
Es besteht somit ein starkes Bedürfnis nach weiteren Verfahren
zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen, welche diese Nachteile nicht
aufweisen.
Die Erzeugung von Pflanzen mit einer geänderten Blütenfarbe ist vor allem für die
Zierpflanzenzüchtung von Interesse, so daß auch hier ein erhebliches Interesse an
neuen Verfahren besteht.
Es wurde nun die neue DNA-Sequenz, welche im folgenden DNA-Sequenz I
genannt wird, gefunden, die aus den folgenden Bestandteilen besteht, die in der 5′-
3′-Reihenfolge aneinandergereiht sind:
- a) ein zum Bestandteil b) heterologer Promotor, der in Pflanzen stark wirksam ist und/oder der antheren- oder tapetum-spezifisch ist und dem gegebenen falls ein verstärkendes Element ("Enhancer") vorgesetzt ist;
- b) eine für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenz; und
- c) eine 3′-Polyadenylierungssequenz;
wobei der Begriff DNA-Sequenz I auch die abgeleiteten DNA-Sequenzen ein
schließt, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merk
male aufweisen.
Weiterhin wurde gefunden, daß Pflanzen, die die DNA-Sequenz I in ihrem Genom
enthalten, in überraschender Weise männlich steril sind und darüberhinaus eine,
gegenüber den entsprechenden Pflanzen, die die DNA-Sequenz I nicht enthalten,
veränderte Blütenfarbe aufweisen.
Diese neuen Pflanzen besitzen zusätzlich eine erhöhte Resistenz gegenüber mikro
biellen Pflanzenschädlingen, insbesondere gegenüber phytopathogenen Pilzen. Die
geänderte Blütenfarbe erleichtert es in vielen Fällen, die männlich sterilen Pflanzen
in einer gemischten Population leicht zu erkennen, was von einer erheblichen
praktischen Relevanz sein kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch neue Pflanzen (einschließlich Teile
dieser Pflanzen sowie deren Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzen
zellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die
DNA-Sequenz I enthalten und die männlich steril sind und/oder eine gegenüber
den entsprechenden Pflanzen, welche die DNA-Sequenz I nicht enthalten,
geänderte Blütenfarbe aufweisen.
Erfindungsgemäß als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I verwendbare Promotoren,
die in Pflanzen stark wirksam sind, sind bekannt. Als Beispiel kann der Promotor
des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase (rbcS)
genannt werden (vgl. z. B. EMBO Journal, Vol. 5 Nr. 9, 2063-2071 (1986)). Wei
terhin können auch in Pflanzen stark wirksame Promotoren von Pflanzenviren
eingesetzt werden. Solche Promotoren sind bekannt, wobei der CaMV 35S Promo
tor (vgl. z. B. Science 250: 959-960 (1990 ) beispielhaft genannt sei.
Als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I können auch antherenspezifische und/oder
tapetumspezifische Promotoren verwendet werden. Solche Promotoren, die ihre
Wirksamkeit besonders stark in den Antheren bzw. im Tapetum genannten
Antherenort entfalten, sind bekannt. Als Beispiel soll der TA29-Promotor genannt
werden (vgl. z. B. Nature 347, 737-741 (1990)). Auch die bekannten, aus Tabak
isolierten, antherenspezifischen Promotoren der TA26 und TA13 Gene kommen
für eine erfindungsgemäße Verwendung in Frage.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird der CaMV 35S Promotor als Bestandteil a) der
DNA-Sequenz I eingesetzt.
Es kann vorteilhaft sein, dem Promotor ein geeignetes Verstärkungselement
(Enhancer) voranzustellen, um die erwünschte Wirkung des Promotors zu ver
stärken. Solche Enhancer-Promotor-Konstrukte sind bekannt. Als Enhancer kann
beispielweise der bekannte CaMV 35S Enhancer besonders vorteilhaft eingesetzt
werden.
Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß als Bestandteil a) der DNA-Sequenz I
der CaMV 35S Promotor verwendet. Ganz besonders bevorzugt wird ein Konstrukt
eingesetzt, welches aus dem CaMV 35S Enhancer und dem sich in 5′-3′-Reihen
folge anschließenden CaMV 35S Promotor besteht.
Der erfindungsgemäß zu verwendende Promotor ist zum Bestandteil b) heterolog,
d. h. von Promotoren, die in natürlichen Stilbensynthase-Genen vorkommen, ver
schieden.
Die Isolierung geeigneter Promotoren und Enhancer ist bekannt oder kann nach
bekannten Verfahren und Methoden, die dem Fachmann geläufig sind, erfolgen.
Als Bestandteil b) in der DNA-Sequenz I kann jede DNA verwendet werden, die
für das Enzym Stilbensynthase kodiert. Unter Stilbensynthase soll jedes Enzym
verstanden werden, welches (in einer geeigneten Umgebung, vor allem in Pflan
zenzellen) Stilbene erzeugen kann. Der Begriff Stilbene beschreibt eine Gruppe
von chemischen Substanzen, welche in Pflanzen vorkommen und als gemeinsame
Grundstruktur das Stilbengerüst (trans-1,2-Diphenylethylen) enthalten. Dieses
Grundgerüst kann auch durch die Addition weiterer Gruppen ergänzt werden. Zwei
wichtige und bevorzugte Stilbene sind das 3,5-Dihydroxy-stilben (Pinosylvin) und
das 3,4′,5-Trihydroxy-stilben (Resveratrol).
Für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenzen sind beispielsweise aus den
Europäischen Patentanmeldungen EP-A-0 309 862, EP-A-0 464 461 und EP-A-
0 533 010 bekannt. In diesen Patentanmeldungen wird die Isolierung von Stil
bensynthase-Genen und ihre Verwendung zur Erzeugung von transgenen Pflanzen,
die eine erhöhte Schädlingsresistenz aufweisen, beschrieben. Die für Stilben
synthase kodierenden DNA-Sequenzen, die in diesen Patentanmeldungen be
schrieben werden, werden bevorzugt erfindungsgemäß eingesetzt, wobei die für
Resveratrolsynthase kodierenden Sequenzen besonders bevorzugt werden. Weiter
hin werden bevorzugt die in den genannten Europäischen Patentanmeldungen be
schriebenen, für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenzen aus Erdnußpflanzen
(Arachis hypogaea und aus Wein (Vitis vinifera)) eingesetzt. Die DNA-Sequenzen,
die für Stilbensynthase kodieren, können in der Form vorliegen, wie sie in den
entsprechenden natürlichen Pflanzengenen enthalten sind ("genomische Form"),
einschließlich der gegebenenfalls vorhandenen nicht kodierenden Regionen (wie
Introns) oder in einer Form, welche der cDNA ("copy DNA") entspricht, die über
mRNA mit Hilfe von Reverse-Transkriptase/Polymerase erhältlich ist und keine
Introns mehr enthält. Sie können auch in teilweise oder vollständig synthetisierter
Form vorliegen oder aus Teilen verschiedener Herkunft zusammengesetzt vor
liegen.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden die für Stilbensynthase kodierenden
DNA-Sequenzen, welche in dem Plasmid pGS828.1 (EP-A-0 309 862), dem
Plasmid pin5-49 (EP-A-0 533 010) und ganz besonders bevorzugt den Plasmiden
pVst1, pVst2 und pVst12t3 (EP-A-0 464 461) enthalten sind sowie die mit Hilfe
dieser DNA-Sequenzen (Verwendung als Sonden) aus Pflanzen isolierbaren wei
teren für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenzen eingesetzt. Besonders her
vorgehoben wird die für Stilbensynthase kodierende Sequenz, welche in dem
Plasmid pVst1 (EP-A-0 464 461) enthalten ist.
Die Isolierung der als Bestandteil b) der DNA-Sequenz I verwendbaren DNA-
Sequenzen ist bekannt und/oder kann nach den bekannten und dem Fachmann
geläufigen Verfahren und Methoden erfolgen. Die kodierende Region für Stilben
synthase kann z. B. mit Hilfe der Polymerasekettenreaktions-Technik (PCR-Tech
nik) aus den Plasmiden pVst1, pVst2, pVst12t3 oder pGS828.1 isoliert werden.
Die Amplifizierung kann mittels PCR, z. B. über folgende Programme erfolgen:
Die Amplifizierung der Stilbensynthase-Gene Vst1 und Vst2 aus Vitis vinifera
(var. optima) sowie des Stilbensynthase-Gens aus Arachis hypogea (A. hyp.) kann
mit den folgenden Primern durchgeführt werden:
Primer 1 Vst1: siehe SEQ ID NO: 1
Primer 1 Vst2: siehe SEQ ID NO: 2
Primer 1 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 3
Primer 1 Vst2: siehe SEQ ID NO: 2
Primer 1 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 3
Primer 2 Vst1: siehe SEQ ID NO: 4
Primer 2 Vst2: siehe SEQ ID NO: 5
Primer 2 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 6.
Primer 2 Vst2: siehe SEQ ID NO: 5
Primer 2 A. hyp.: siehe SEQ ID NO: 6.
Alle so amplifizierten codierenden Regionen der einzelnen Gene können in die
entsprechenden Restriktionsschnittstellen üblicher Vektoren einligiert werden.
Weiterhin können die kodierende und die terminierende Sequenz auch gemeinsam
durch die Enzyme EcoRI und PstI sowie EcoRI und SphI aus pSSVst1 (vgl.
unten) isoliert werden.
Die als Bestandteil c) in der DNA-Sequenz I enthaltene 3′-Polyadenylierungs
sequenz kann weitgehend variiert werden, so daß alle entsprechenden Sequenzen
verwendet werden können, welche die Exprimierung der Stilbensynthase in Pflan
zen nicht nachteilig beeinflussen. Es kann auch zweckmäßig sein, mehrere (z. B.
zwei) Polyadenylierungssequenzen, gegebenenfalls verschiedenen Ursprungs,
hintereinander gefügt einzusetzen, insbesondere, wenn sich dies durch die jeweils
verwendeten Techniken ergibt (vgl. Teil c) in SEQ ID NO: 7). Der Einfachheit
halber wird vorzugsweise die in den natürlichen Stibensynthase-Genen enthaltene
3′-Polyadenylierungssequenz verwendet, wobei zweckmäßigerweise diese Sequenz
zusammen mit der für Stilbensynthase kodierenden Sequenz aus den Stilben
synthase-Genen isoliert wird. Erfindungsgemäß können also als Bestandteile b)
und c) auch Stilbensynthase-Gene eingesetzt werden, bei denen lediglich der
natürliche Promotor entfernt wurde. In diesem Fall ist es nur erforderlich, den
Bestandteil a) der DNA-Sequenz I, also den heterologen Promotor und gegebe
nenfalls den Enhancer, vorzuschalten.
Die Isolierung geeigneter 3′-Polyadenylierungssequenzen kann nach allgemein üb
lichen Verfahren und Methoden erfolgen, die dem Fachmann geläufig sind.
Ganz besonders bevorzugt werden als Komponenten a) bis c) der DNA-Sequenz I
einzeln oder in der vorliegender Kombination die DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID
NO: 7 verwendet. In Seq ID NO: 7 stellen die Nukleotide 1 bis 720 den Doppel
35S CaMV RNA-Promotor dar, der aus dem CaMV 35S Enhancer und dem
CaMV 35S Promotor besteht (Komponente a)). Die Nukleotide 721 bis 730 sind
eine synthetische Linkersequenz. Die Nukleotide 731 bis 2265 der SEQ ID NO: 7
repräsentieren den kodierenden Teil für Stilbensynthase (Komponente b)) und die
Nukleotide 2266 bis 2485 stellen den polyA-Teil (Komponente c)) des
Stilbensynthase-Gens dar. Die Nukleotide von 2486 bis 2728 stellen den Anteil
der Komponente c) aus CaMV 359 RNA dar, wobei am Ende Polylinkersequenzen
vorliegen.
Der Begriff DNA-Sequenz I schließt auch alle abgeleiteten DNA-Sequenzen ein,
welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale auf
weisen, welche also in Pflanzen männliche Sterilität und gegebenenfalls eine Änderung
der Blütenfarbe hervorrufen. In solchen abgeleiteten Sequenzen können
einzelne DNAs, Kodons und/oder Teilsequenzen fehlen (z. B. durch die Verwen
dung von Restriktionsenzymen) und/oder durch andere DNAs, Kodons und/oder
Teilsequenzen ersetzt sein. Solche Modifikationen können auf Grund der Degene
ration des genetischen Kodes vorliegen, oder sich bei der Manipulation der DNA-
Sequenzen ergeben. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und/oder ihre Be
standteile a) bis c) können auch DNAs und/oder DNA-Sequenzen enthalten, wel
che ihre Handhabung erleichtern, z. B. sogen. Linker oder welche von solchen Lin
kern nach Manipulationen (z. B. nach Schnitten mit Restriktionsenzymen) übrig
bleiben. Die Bestandteile a) bis c) der DNA-Sequenz I können natürlichen Ur
sprungs sein oder teilweise oder vollständig in synthetisierter Form vorliegen.
Die Bestandteile a) bis c) können nach den allgemein üblichen und dem Fachmann
geläufigen Verfahren und Methoden zu der DNA-Sequenz I, welche auch als ein
"chimäres Gen" betrachtet werden kann, zusammengefügt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht die DNA-Sequenz I
aus (a) dem sogenannten CaMV 35S-Doppelpromotor, der aus dem CaMV 35S
Promotor und dem zugehörigen CaMV 35S Enhancer zusammengesetzt ist, und
(b) der für Stilbensynthase (Resveratrolsynthase) kodierenden Sequenz mit der sich
anschließenden 3′-Polyadenylierungssequenz, wie sie im Plasmid pVst1 (vgl. EP-
A-0 464 461) vorliegt.
Diese DNA-Sequenz ist in dem neuen Plasmid pSSVst1 enthalten, dessen Kon
struktion aus Fig. 1 ersichtlich ist. Die kodierende Region des Stilbensynthase-
Gens Vst1 kann demgemäß als 2,1 kB-MunI-Fragment aus dem Plasmid pVst1
isoliert werden, das das vollständige Stilbensynthase-Gen (Vst1-Gen ) als 4,9 kB-
EcoRI-Fragment enthält. Allerdings fehlen diesem MunI-Fragment die ersten 4
Kodons am 5′-Ende des codierenden Bereichs. Das gereinigte MunI-Fragment wird
zweckmäßigerweise mit dem Restriktionsenzym NruI nachverdaut und das ent
standene 1,7 kB große NruI/MunI-Fragment mit einem Oligonukleotidlinker fusio
niert, welcher für die ersten vier Aminosäuren kodiert. Da die überstehenden
Enden der EcoRI- und MunI-Restriktionsschnittstellen identisch sind und eine
MunI/EcoRI-Fusion verhindert werden soll, ist der Oligonukleotidlinker so konzi
piert, daß die EcoRI-Schnittstelle erst durch einen nachträglichen Restriktions
verdau entsteht. Das entstandene NruI/EcoRI-Fragment wird zwischen die SmaI-
und EcoRI-Schnittstellen des binären Vektors pSS ligiert, so daß die vollständige
codierende Region des Stilbensynthase-Gens Vst1 unter der Kontrolle des
doppelten 35S Promotors steht. Entsprechende andere Konstruktionen können
durch den Fachmann anhand seines Fachwissens und der im vorliegenden Text
enthaltenen Informationen mit Hilfe der üblichen Methoden hergestellt und ver
wendet werden.
Der Escherichia coli Stamm RH pSSVst1 enthält das Plasmid pSSVst1.
Dieser E. coli Stamm RH pSSVst1 wurde bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig,
Bundesrepublik Deutschland, in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des
Budapester Vertrages über die internationale Hinterlegung von Mikroorganismen
für die Zwecke von Patentverfahren am 18. Oktober 1994 hinterlegt und erhielt
die Hinterlegungsnummer DSM 9501.
Das Plasmid pSSVst1 sowie der E. coli Stamm RH pSSVst1 und seine Mutanten,
die noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen Merkmale des hin
terlegten Stammes aufweisen, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Der E. coli Stamm RH pSSVst1 kann nach den allgemein üblichen Methoden ver
mehrt werden. Das Plasmid pSSVst1 kann ebenfalls nach den allgemein üblichen
Methoden aus diesem E. coli Stamm gewonnen werden. Ebenso ist es dem
Fachmann leicht möglich, die in dem Plasmid pSSVst1 enthaltene DNA-Sequenz
I zu isolieren. So kann z. B. die im Plasmid pSSVst1 enthaltene DNA-Sequenz I,
aus diesem Plasmid mit Hilfe der Restriktionsenzyme SphI und PstI in Form eines
etwa 2700 bp (Basenpaare) großen DNA-Fragments isoliert werden.
Mit Hilfe der üblichen und dem Fachmann geläufigen Methoden ist es möglich,
die DNA-Sequenz I ein oder mehrfach (z. B. Tandemanordnung), vorzugsweise
einfach, in beliebige prokaryontische (vorzugsweise bakterielle) oder eukaryon
tische (vorzugsweise pflanzliche) DNA als "fremde" DNA einzubauen. Die so
"modifizierte" rekombinante DNA, welche z. B. zur Transformation von Pflanzen
bzw. Pflanzenzellen verwendet werden kann und nach der Transformation in
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen enthalten ist, ist Bestandteil der vorliegenden Erfin
dung.
Die DNA-Sequenz I sowie die rekombinante DNA können als "fremde" DNA in
Vektoren (insbesondere Plasmiden, Cosmiden oder Phagen), in transformierten
Mikroorganismen (vorzugsweise Bakterien, insbesondere Gram-negativen Bakte
rien, wie E. coli) sowie in transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen bzw. in
deren DNA enthalten sein. Solche Vektoren, transformierte Mikroorganismen (die
auch diese Vektoren enthalten können) sowie die transformierten Pflanzenzellen
und Pflanzen und deren DNA stellen Bestandteile der vorliegenden Erfindung dar.
Wie bereits angedeutet, werden erfindungsgemäß die DNA-Sequenz I ein- oder
mehrfach (an gleichen oder verschiedenen Stellen des Genoms) in das natürliche
pflanzliche Genom eingebaut.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung
transgener Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich
Pflanzenteile und Samen), wobei diese Pflanzen männlich steril sind und gege
benenfalls eine geänderte Blütenfarbe aufweisen, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
- (a) ein oder mehrfach die DNA-Sequenz I und/oder erfindungsgemäße rekom binante DNA in das Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Proto plasten) einsetzt und gegebenenfalls
- (b) aus den transformierten Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
- (c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflanzenteile (einschließlich Samen) gewinnt.
Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) können nach bekannten Verfahren und
Methoden in üblicher Weise durchgeführt werden.
Transgene Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich
Pflanzenteile und Samen), welche ein oder mehrfach die DNA-Sequenz I als
"fremde" DNA enthalten und deren Nachkommen sowie solche transformierte
Pflanzenzellen und Pflanzen, welche nach den obigen Verfahren erhältlich sind
und deren Nachkommen, gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung.
Teile der vorliegenden Erfindung sind auch die:
- (a) Verwendung der DNA-Sequenz I und/oder der erfindungsgemäßen rekom binanten DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren und/oder der erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan zen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen), die
- (b) Verwendung der erfindungsgemaßen transgenen Pflanzenzellen (einschließ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflan zen und deren Vermehrungsmaterial, die
- (c) Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz I und/oder der erfin dungsgemäßen rekombinanten DNA zur Erzeugung von männlicher Steri lität und gegebenenfalls einer geänderten Blütenfarbe in Pflanzen, die
- d) Verwendung der auf dem Plasmid pSSVst1 enthaltenen DNA-Sequenz I zum Nachweis der Anwesenheit der DNA-Sequenz I in Pflanzen sowie (allgemein) bei der Erzeugung von transgenen Pflanzenzellen (einschließ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) sowie die
- e) Verwendung der für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenz zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche männlich steril sind und/oder gegenüber entsprechenden Pflanzen, die diese DNA in ihrem Genom nicht enthalten, eine geänderte Blütenfarbe aufweisen.
Eine Anzahl verschiedener Methoden steht zur Verfügung, die DNA-Sequenz I als
"fremde" DNA in das genetische Material von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einzu
setzen. Der Gentransfer kann nach den allgemein üblichen bekannten Methoden
erfolgen, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierig
keiten ermitteln kann.
Das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens steht als besonders günstiger und
breit einsetzbarer Vektor zur Übertragung von fremder DNA in Genome dikotyler
und monokotyler Pflanzen zur Verfügung. Hierzu wird die DNA-Sequenz I in
geeigneter Weise in die T-DNA von geeigneten Ti-Plasmiden eingesetzt (z. B.
Zambryski et al., 1983) und durch Infektion der Pflanze, Infektion von Pflan
zenteilen oder Pflanzengeweben, wie z. B. von Blattscheiben, Stengeln, Hypo
kotylen, Kotyledonen, Meristemen und davon ableitenden Geweben, wie z. B.
sekundären Embryonen und Kalli oder durch Kokultur von Protoplasten mit
Agrobacterium tumefaciens übertragen.
Eine Alternative ist die Inkubation der DNA-Sequenz I oder von rekombinanter
DNA mit Pflanzenprotoplasten (z. B. Hain et al., 1985; Krens et al., 1982;
Paszkowski et al., 1984) in Gegenwart von Polykationen oder Calziumsalzen und
Polyethylenglykol.
Die DNA-Aufnahme kann auch zusätzlich durch ein elektrisches Feld (Elektro
poration) begünstigt werden (z. B. Fromm et al., 1986).
Die DNA kann in bekannter Weise auch über Pflanzenpollen eingeführt werden,
z. B. indem Pollen oder Pflanzengewebe mit physikalisch beschleunigten Partikeln
"beschossen" werden, welche die DNA tragen (vgl. EP-A 0 270 356).
Die Regeneration der Pflanzen erfolgt in bekannter Weise mit Hilfe geeigneter
Nährmedien (z. B. Nagy und Maliga 1976).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens (gemäß
der Methode aus EP-A 116 718) wird die DNA-Sequenz I, wie sie auf dem
Plasmid pSSVst1 enthalten ist, in einen geeigneten intermediaeren E.coli Vektor
z. B. pGV700 oder pGV710, (vergl. EP-A-116 718) bzw. vorzugsweise Derivaten
davon, die zusätzlich ein Reportergen wie z. B. nptII (Herrera-Estrella et al. 1983)
oder hpt (Van den Elzen et al. 1986) enthalten, kloniert.
Das so konstruierte Plasmid wird auf Agrobacterium tumefaciens, das z. B.
pGV 3850 bzw. Derivate davon enthält (Zambryski et al. 1983), mit üblichen
Methoden (z. B. Van Haute et al. 1983) übertragen. Alternativ dazu kann die DNA-
Sequenz I in einem binären Vektor, z. B. PCV001 oder PCV002 (z. B. Koncz und
Schell 1986) kloniert und wie oben beschrieben in einen geeigneten
Agrobakterium Stamm (Koncz und Schell 1986) transferiert werden. Der
resultierende Agrobakterium Stamm, der die DNA-Sequenz I in einer auf Pflanzen
transferierbaren Form enthält, wird im weiteren zur Pflanzentransformation
verwendet. Das Plasmid pSSVst1 kann auch direkt in einen geeigneten A.
tumefaciens Stamm (vgl. z. B. Koncz und Schell (1986)) eingebracht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Plasmid pSSVst1, das
ein Reportergen für Pflanzenzellen für Kanamycin-Resistenz (z. B. Herrera-Estrella
et al. 1983) enthält, in üblicher Weise durch direkten Gentransfer auf Pflanzen
protoplasten übertragen (z. B. Hain et al. 1985). Dabei kann das Plasmid pSSVst1
in zirkulärer, vorzugsweise jedoch in linearer Form, vorliegen. Bei der Verwen
dung von pSSVst1 mit Reportergen werden kanamycinresistente Protoplasten dann
auf Expression von Stilbensynthasen überprüft.
Transformierte (transgene) Pflanzen bzw. Pflanzenzellen werden nach den
bekannten Methoden, z. B. durch Blattscheiben Transformation (z. B. Horsch et al.
1985) durch Cokultur regenerierender Pflanzenprotoplasten oder Zellkulturen mit
Agrobacterium tumefaciens (z. B. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) oder durch
direkte DNA Transfektion erzeugt. Resultierende transformierte Pflanzen werden
entweder durch Selektion auf die Expression des Reportergens, z. B. durch die
Phosphorylierung von Kanamycin-Sulfat in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al.
1985) oder durch die Expression der Nopalinsynthase (nach Aerts et al. 1983) oder
Stilbensynthase durch Northern-Blot-Analyse und Western Blot-Analyse
nachgewiesen. Die Stilbensynthase und die Stilbene können auch in bekannter
Weise mit Hilfe spezifischer Antikörper in transformierten Pflanzen nachgewiesen
werden. Stilbensynthase kann auch durch Enzymaktivitätstest nachgewiesen
werden (Rolfs et al., Plant Cell Reports 1, 83-85, 1981).
Die Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen sowie die Regeneration zu
vollständigen Pflanzen erfolgt nach den allgemein üblichen Methoden mit Hilfe
der jeweils geeigneten Nährmedien.
Sowohl die transformierten Pflanzenzellen als auch die transformierten Pflanzen,
welche die erfindungsgemäße DNA-Sequenz I enthalten und welche Bestandteile
der vorliegenden Erfindung sind, zeigen eine erheblich höhere Resistenz gegen
Schädlinge, insbesondere pflanzenpathogene Pilze.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck
"Pflanzen" sowohl vollständige Pflanzen als auch Pflanzenteile, wie Blätter,
Stengel oder Wurzeln sowie Vermehrungsmaterial, wie Samen, Knollen, Steck
linge usw. "Pflanzenzellen" schließen Protoplasten, Zellinien, Pflanzenkalli usw.
ein.
Wie bereits dargelegt wurde, weisen Pflanzen, welche die erfindungsgemäße
DNA-Sequenz I in ihrem Genom enthalten, eine männliche Sterilität und
gegebenenfalls eine, im Vergleich zu den entsprechenden Pflanzen, welche die DNA-
Sequenz I nicht enthalten, geänderte Blütenfarbe auf.
Bei Zierpflanzen und Schnittblumen, z. B. Rosen, Nelken, Freesien, Gerbera usw.,
ist die Blütenfarbe von einer erheblichen kommerziellen Bedeutung. Häufig ist die
gezielte Beeinflussung der Blütenfarben und die Erzielung stabiler Blütenfarben
schwierig und aufwendig. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auf relativ
einfache Weise die Blütenfarbe aller bunt blühenden Pflanzen, die Blütenfarben,
insbesondere Anthocyane, aufweisen, zu ändern. In der Regel werden durch den
Einbau der DNA-Sequenz I die Blüten heller und häufig ganz weiß. Bei Pflanzen
ohne bunte Blüten, ist im allgemeinen eine Veränderung nicht oder nur schwer zu
erkennen.
Die männliche Sterilität von Pflanzen spielt in der Pflanzenzucht bei der Erzeu
gung von Hybridlinien und Hybridsamen eine sehr große Rolle. Leider sind viele
Hybridlinien sehr empfindlich gegenüber pflanzenpathogenen Pilzen, so daß hier
durch ihre Verwendbarkeit sehr stark eingeschränkt ist. Mit Hilfe der vorliegenden
Erfindung ist es auf relativ einfache Weise möglich, männlich sterile Pflanzen zu
erzeugen. Diese Pflanzen weisen zudem eine erhöhte Resistenz gegenüber
mikrobiellen Pflanzenschädlingen, wie phytopathogenen Pilzen, Bakterien und/oder
Viren, insbesondere gegenüber phytopathogenen Pilzen auf und sind somit nach
anderen Verfahren gewonnenen männlich sterilen Pflanzen überlegen.
Zu den Pflanzen, welchen durch den Einbau (Transformation) der erfindungs
gemäßen DNA-Sequenz I eine männliche Sterilität verliehen werden kann, gehören
praktisch alle Pflanzen. Ein besonderes diesbezüglichen Bedürfnis besteht
naturgemäß bei den Kulturpflanzen, wie Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernden
Pflanzen, z. B. Getreide (insbesondere Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Hirse, Reis
und Mais), Kartoffel, Leguminosen (wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa,
Sojabohnen), Gemüse (insbesondere Kohlarten und Tomaten), Obst (insbesondere
Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen,
Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal und Baumwolle sowie bei Heil
pflanzen wie Rauwolfia und Digitalis. Besonders bevorzugt seien Reis, Weizen,
Gerste, Roggen, Mais, Zuckerrübe, Raps und Soja genannt.
Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden beispielhaften Ausführungen
näher erläutert werden:
Die Konstruktion des Plasmids pSSVst1 wurde bereits oben näher erläutert
und ist in Fig. 1 dargestellt, so daß sie ohne weiteres durch den Fachmann
nachvollzogen werden kann.
Das Plasmid pSSVst1 ist ein Derivat von pSS. pSS stellt ein Derivat von
PCV001 (Koncz und Schell, 1986) dar, welches eine Expressionskassette,
basierend auf dem Plasmid pRT101 (Töpfer et al., 1987) enthält, in der
eine Verdoppelung des CaMV 35S RNA Enhancers durch Einklonierung
des Ddel/EcoRV-Fragmentes in die Hincll Schnittstelle durchgeführt wurde.
pSSVst1 enthält die kodierende Sequenz sowie die polyA-Sequenz von
Stilbensynthase aus pVst1 (vgl. Fig. 1). pSSVst1 enthält eine Kanamy
cinresistenz für Pflanzen und eine bakterielle Ampicillinresistenz. Weiterhin
enthält pSSVst1 Bordersequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobakterium
tumefaciens sowie einen Replikationsstart für A. tumefaciens und E. coli
(Koncz und Schell, 1986). Das Plasmid pSSVst1 kann mit Hilfe des
Stammes E. coli RH pSSVst1 direkt in einen geeigneten Agrobakterium
tumefaciens Stamm (z. B. Koncz und Schell, 1986) mobilisiert werden.
Nicotiana tabacum (Petit Havana SR1) wird als sterile Sproßkultur
auf hormonfreiem LS Medium (Linsmaier und Skoog 1965) ver
mehrt. In Abständen von ca. 6-8 Wochen werden Sproßabschnitte
auf frisches LS-Medium umgesetzt. Die Sproßkulturen werden bei
12 h Licht (1000-3000 Lux) in einem Kulturraum bei 24-26°C ge
halten.
Für die Isolierung von Blattprotoplasten werden ca. 2 g Blätter (ca.
3-5 cm lang) mit einer frischen Rasierklinge in kleine Stücke
(0,5 cm × 1 cm) geschnitten. Das Blattmaterial wird in 20 ml En
zymlösung, bestehend aus K3 Medium (Nagy und Maliga 1976),
0,4 m Saccharose, pH 5,6, 2% Zellulase R10 (Serva), 0,5%
Macerozym R10 (Serva) für 14-16 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach werden die Protoplasten durch Filtration über 0,30 mm und
0,1 mm Stahlsiebe von Zellresten getrennt. Das Filtrat wird 10 Mi
nuten lang bei 100 × g zentrifugiert. Während dieser Zentrifugation
flotieren intakte Protoplasten und sammeln sich in einer Bande am
oberen Rand der Enzymlösung. Das Pellet aus Zellresten und die
Enzymlösung werden mit einer Glaskapillare abgesaugt. Die vor
gereinigten Protoplasten werden mit frischem K3 Medium (0,4 M
Saccharose als Osmotikum) auf 10 ml aufgefüllt und erneut flotiert.
Das Waschmedium wird abgesaugt und die Protoplasten werden für
Kultur oder folgende Infektion mit Agrobakterien (Kokultur) auf 1-
2 × 10⁵/ml verdünnt. Die Protoplastenkonzentration wird in einer
Zählkammer bestimmt.
Es wird im folgenden die Methode von Marton et al. 1979 mit
kleinen Veränderungen benutzt. Die Protoplasten werden wie be
schrieben isoliert und in einer Dichte von 1-2 × 10⁵/ml in K3
Medium (0,4 m Saccharose, 0,1 mg/l NAA, 0,2 ml in K3 Medium
(0,4 m Saccharose, 0,1 mg/l NAA, 0,2 mg Kinetin) 2 Tage im
Dunkeln und ein bis zwei Tage lang unter Schwachlicht (500 lux)
bei 26°C inkubiert. Sobald die ersten Teilungen der Protoplasten
auftreten, werden 30 µl einer Agrobakteriumsuspension, die die
Sequenz I in ihrer T-DNA enthalten oder die das Plasmid pSSVst1
enthalten, in minimal A (Am) Medium (Dichte ca. 10⁹ Agrobakte
rien/ml) zu 3 ml regenerierenden Protoplasten gegeben. Die Kokul
turdauer beträgt 3-4 Tage bei 20°C im Dunkeln. Danach werden die
Tabakzellen in 12 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit Seewasser
(600 mOsm/kg) auf 10 ml verdünnt und bei 60×g 10 Minuten lang
pelletiert. Dieser Waschvorgang wird noch 1-2× wiederholt um den
größten Teil der Agrobakterien zu entfernen. Die Zellsuspension
wird in einer Dichte von 5 × 10⁴/ml in K3 Medium (0,3 m Saccha
rose) mit 1 mg/l NAA (Naphthyl-1-essigsäure), 0,2 mg/l Kinetin
und 500 mg/l des Cephalosporin-Antibiotikums Cefotaxim kulti
viert. Die Zellsuspension wird jede Woche mit frischem K3
Medium verdünnt und der osmotische Wert des Mediums graduell
um 0,05 m Saccharose (ca. 60 mOsm/kg) pro Woche reduziert. Die
Selektion mit Kanamycin (100 mg/l Kanamycinsulfat (Sigma),
660 mg/g aktives Km) wird 2-3 Wochen nach der Kokultur in
Agarose "bead type culture" (Shillito et al. 1983) gestartet.
Kanamycinresistente Kolonien können 3-4 Wochen nach Beginn der
Selektion vom Hintergrund zurückgebliebener Kolonien unterschie
den werden.
In einer Petrischale werden ca. 10⁶ Protoplasten in 180 µl K3
Medium mit 20 µl wäßriger DNA Lösung welche 0,5 µg/µl Plasmid
pSSVst1 oder die isolierte DNA-Sequenz I aus pSSVst1 als DNA-
Fragment und 0,5 µl/µl pLGVneo2103 (Hain et al. 1985) enthält,
vorsichtig gemischt. Anschließend werden 200 µl Fusionslösung
(0,1 m Calciumnitrat, 0,45 M Mannit, 25% Polyethylenglykol
(PEG 6000), pH 9) vorsichtig zugegeben. Nach 15 Minuten werden
5 ml Waschlösung (0,275 M Calciumnitrat pH 6) addiert und nach
weiteren 5 Minuten werden die Protoplasten in ein Zentrifugen
röhrchen transferiert und bei 60 × g pelliert. Das Pellet wird in einer
kleinen Menge K3 Medium aufgenommen und wie im nächsten
Abschnitt beschrieben kultiviert. Alternativ können die Protoplasten
nach Hain et al. 1985 tranformiert werden.
Die Transformation mit der DNA-Sequenz I aus pSSVst1 kann auch
ohne den Zusatz der 0,5 µg/µl pLGV neo 2103 durchgeführt
werden. Da in diesem Fall kein Reportergen eingesetzt wird, werden
die resultierenden Kalli auf das Vorhandensein der DNA-Sequenz-I-
Gen-Einheit mit Hilfe einer Dot-Blot-Hybridisierung überprüft. Als
Hybridisierung-Probe ist die kodierende Sequenz aus pSSVst1
verwendbar. Selbstverständlich können auch andere Nachweis
methoden, wie Test mit Antikörpern oder ein Enzymtest für
Stilbensynthase eingesetzt werden.
Für die im folgenden beschriebene Kultur und Selektion Kanamycin
resistenter Kolonien wird eine modifizierte "Bead Type culture"-
Technik (Shillito et al. 1983) verwendet. Eine Woche nach Behand
lung der Protoplasten mit DNA (vgl. c) werden 3 ml der Zell
suspension mit 3 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose + Hormone;
1,2% (Seaplaque) LMT Agarose (low melting agarose, Marine
Colloids) in 5 cm Petrischalen gemischt. Für diesen Zweck wird
Agarose trocken autoklaviert und nach Zugabe von K3 Medium im
Mikrowellenherd kurz aufgekocht. Nach Erstarren der Agarose
werden die Agarosescheiben ("beads") mit den eingebetteten Tabak
mikrokalli für weitere Kultur und Selektion in 10 cm Petrischalen
transferiert und je 10 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose, 1 mg/l
NAA, 0,2 mg/l Kinetin) und 100 mg/l Kanamycinsulfat (Sigma)
addiert. Das Flüssigmedium wird jede Woche gewechselt. Dabei
wird der osmotische Wert des Mediums stufenweise herabgesetzt.
Pro Woche wird das Austauschmedium (K3 + Km) um 0,05 m an
Saccharose (ca. 60 mOsm) reduziert.
Sobald die kanamycinrestistenten Kolonien einen Durchmesser von
ca. 0,5 cm erreicht haben, wird die Hälfte auf Regenerationsmedium
(LS-Medium, 2% Saccharose, 0,5 mg/l Benzylaminopurin BAP)
gesetzt und bei 12 h Licht (3000-5000 lux) und 24°C im Kultur
raum gehalten. Die andere Hälfte wird als Kalluskultur auf LS
Medium mit 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l BAP und 100
mg/l Kanamycinsulfat propagiert. Wenn die regenerierten Sproße ca.
1 cm groß sind, werden sie abgeschnitten und auf 1/2 LS Medium
(1% Saccharose, 0,8% Agar) ohne Wachstumsregulatoren zur
Bewurzelung gesetzt. Die Sproße werden auf 1/2 MS-Medium mit
100 mg/l Kanamycinsulfat bewurzelt und später in Erde umgesetzt.
Für die Transformation von Blattscheiben (Horsch et al. 1985)
werden ca. 2-3 cm lange Blätter von sterilen Sproßkulturen in
Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension
entsprechender Agrobacterien, die das Plasmid pSSVst1 oder die
DNA-Sequenz I aus diesem Plasmid in ihrer T-DNA enthalten, (ca.
10⁹/ml) (vgl. b), in Am-Medium, (siehe unten) für ca. 5 Minuten in
kubiert. Die infizierten Blattstücke werden auf MS-Medium (siehe
unten) ohne Hormone für 3-4 Tage bei ca. 24°C gehalten. Während
dieser Zeit überwächst Agrobakterium die Blattstücke. Die
Blattstücke werden anschließend in MS-Medium (0,5 mg/ml BAP,
0,1 mg/ml NAA) gewaschen und auf das gleiche Medium (0,8%
Agar) mit 500 g/ml Cefotaxim und 100 g/ml Kanamycinsulfat
(Sigma) gelegt. Nach zwei Wochen sollte das Medium erneuert
werden. Transformierte Sproße werden nach weiteren 2-3 Wochen
sichtbar.
NPT II Aktivität in Pflanzengewebe wird durch in situ Phosphorylierung
von Kanamycin, wie bei Reiß et al. (1984) beschrieben und von Schreier et
al. (1985) modifiziert, wie folgt, nachgewiesen. 50 mg Pflanzengewebe
werden in 50 µl Extraktionspuffer (10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol,
0,1% SDS, 0,025% Bromphenolblau, 62,5 mM Tris pH 6,8) unter Zusatz
von Glaspulver auf Eis homogenisiert und 10 Minuten lang in einer
Eppendorfzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. 50 µl des Überstandes werden
auf ein natives Polyacrylamidgel (145 × 110 × 1,2 mm; Trenngel: 10%
Acrylamid, 0,33% Bisacrylamid, 0,375 M Tris pH 8,8, Sammelgel: 5%
Acrylamid, 0,165% Bisacrylamid, 0,125 M Tris pH 6,8) aufgetragen und
über Nacht bei 4°C und 60 V elektrophoretisiert. Sobald der Brom
phenolblau-Marker aus dem Gel herausläuft, wird das Gel zweimal mit
destilliertem Wasser 10 Min. lang und einmal 30 Min. mit Reaktionspuffer
gewaschen (67 mM Tris-Maleat, pH 7,1, 42 mM MgCl₂, 400 mM
Ammoniumchlorid). Das Gel wird auf eine gleichgroße Glasplatte gelegt
und mit 40 ml 1%iger Agarose in Reaktionspuffer, der die Substrate
Kanamycinsulfat (20 g/ml) und 20-200 Ci ³²P ATP (Amersham) enthält,
überschichtet. Das Sandwichgel wird 30 Min. bei Zimmertemperatur
inkubiert und dann wird ein Blatt Phosphozellulosepapier P81 (Whatman)
auf die Agarose gelegt. Darüber werden vier Filtrierpapierlagen 3 MM,
(Whatman) und einige Papierhandtücher gestapelt. Der Transfer von in situ
phosphoryliertem radioaktiven Kanamycinphosphat auf das P81 Papier wird
nach 3-4 h gestoppt. Das P81 Papier wird für 30 min. in einer Lösung von
Proteinase K und 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 60°C inkubiert und
dann 3-4 mal in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 bei 80°C
gewaschen, getrocknet und für 1-12 h lang bei -70°C autoradiografiert
(XAR5 Film Kodak).
In den gemäß den obigen Beispielen erhaltenen Pflanzenzellen und
Pflanzen (Tabak) wurde die Anwesenheit der für Stilbensynthase
kodierenden DNA-Sequenz durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die
Expression der für Stilbensynthase kodierenden Sequenz wurde durch
Northern Blot Analyse, Stilbensynthase und Resveratrol mit Hilfe von
spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Transformierte und nicht
transformierte Pflanzen (zum Vergleich) wurden im Gewächshaus bis zur
Blüte kultiviert. Die transformierten Pflanzen zeigten (gegenüber den nicht
transformierten Vergleichspflanzen) eine veränderte Blütenfarbe und waren
männlich steril.
Die bei der Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzte
Medien werden u. a. in der EP-A 0 309 862 beschrieben:
Alle Prozentangaben in den obigen sowie in den nachfolgenden Beispielen
beziehen sich auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.
Die gemäß den obigen Beispielen erhaltenen transgenen Tabakpflanzen werden in
Gewebekultur vorgezogen und anschließend im Gewächshaus bei 23°C und 70-
80% relat. Luftfeuchte bis zur Blüte herangezogen. Die Versorgung mit Dünger
und Wasser erfolgt nach Bedarf.
Alle gemäß Beispiel I) transformierten Pflanzen zeigten eine weiße oder weiß-rosa
Blütenfarbe die auch nach Rückkreuzung mit dem Wildtyp in der F1-Generation
erhalten blieb, während die nicht transformierten entsprechenden Kontrollpflanzen
eine kräftig rote, dunkelrosa oder purpurfarbene Blütenfarbe aufwiesen.
Ebenso waren alle transformierten Pflanzen männlich steril, wobei diese Sterilität
auch in der F1-Generation erhalten blieb.
Zur Transformation von Pflanzen können die folgenden Veröffentlichungen
herangezogen werden:
Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi G.R., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807
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Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) A simple and general method for transferring genes into plants. Science 277: 1229- 1231
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Van den Elzen PJM, Townsend J, Lee KY, Bedbrook JR (1985) A chimaeric resistance gen as a selectable marker in plant cells. Plant Mol. Biol. 5, 299-302
Velten J, Velten L, Hain R, Schell J (1984) Isolation of a dual plant promotor fragment from the Ti Plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J 12: 2723- 2730
Van Haute E, Joos H, Maes M, Warren G, Van Montagu M, Schell J (1983) Intergenic transfer and excharge recombination of restriction fragments clones in pBR 322: a novel strategy for the reversed genetics of Ti plasmids of /Agrobacterium tumefacines. EMBO J 2: 411-418
Zambryski P, Joos H, Genetello C, van Montagu M, Schell J (1983) Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without altering their normal regeneration capacity, EMBO J 12: 2143-2150
Reiss, B., Sprengel, Will H., and Schaller H(1984) A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycin phosphotransferase in crude cell tracts, GENE 1081: 211-217
Schreier P.H., Seftor E.A., Schell J. and Bohnert H.J. (1985) The use of nuclear encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreingn protein into plant chloroplasts, EMBO J Vol. 4, No. 1: 25-32.
Weiterhin können die folgenden veröffentlichten Patentanmeldungen aufgeführt
werden:
EP-A 116 718 EP-A-126 546
EP-A 159 418 EP-A-164 597
EP-A 120 515 EP-A-175 966
EP-A-120 516 WO 84/02913
EP-A-172 112 WO 84/02919
EP-A-140 556 WO 84/02920
EP-A-174 166 WO 83/01176
EP-A-122 791
EP-A-0 309 862
EP-A-0 464 461
EP-A-0 533 010
EP-A 159 418 EP-A-164 597
EP-A 120 515 EP-A-175 966
EP-A-120 516 WO 84/02913
EP-A-172 112 WO 84/02919
EP-A-140 556 WO 84/02920
EP-A-174 166 WO 83/01176
EP-A-122 791
EP-A-0 309 862
EP-A-0 464 461
EP-A-0 533 010
Claims (32)
1. DNA-Sequenz I, die aus den folgenden Bestandteilen besteht, die in der
5′-3′-Reihenfolge aneinandergereiht sind:
- a) ein zum Bestandteil b) heterologer Promotor, der in Pflanzen stark wirksam ist und/oder der antheren- oder tapetum-spezifisch ist und dem gegebenenfalls ein verstärkendes Element ("Enhancer") vorge setzt ist;
- b) eine für Stilbensynthase kodierende DNA-Sequenz; und
- c) eine 3′-Polyadenylierungssequenz;
sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequenzen.
2. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) ein Pflanzen
virus-Promotor und gegebenenfalls ein Enhancer verwendet wird.
3. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) ein antheren-
oder tapetumspezifischer Promotor verwendet wird.
4. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) der CaMV
35S Promotor verwendet wird.
5. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) der CaMV
35S Promotor verwendet wird, dem der CaMV 35S Enhancer vorgeschaltet
ist.
6. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) das Konstrukt
aus dem CaMV 35S Promotor und dem CaMV 35S Enhancer verwendet
wird, welches auf dem Plasmid pSSVst1 enthalten ist.
7. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei als Bestandteil a) das Konstrukt
aus dem CaMV 35S Promotor und dem CaMV 35S Enhancer verwendet
wird, welches aus den Nukleotiden 1 bis 720 gemäß SEQ ID NO: 7 oder
einer davon abgeleiteten Sequenz besteht.
8. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für
Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz verwendet wird.
9. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für
Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz aus Arachis hypogea oder
aus vitis vinifera oder deren cDNA verwendet wird.
10. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) eine für
Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz aus vitis vinifera oder deren
cDNA verwendet wird.
11. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) die für
Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz, die auf dem Plasmid
pSSVst1 enthalten ist oder eine davon abgeleitete Sequenz, verwendet
wird.
12. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil b) die für
Resveratrolsynthase kodierende DNA-Sequenz verwendet wird, welche aus
den Nukleotiden 731 bis 2265 gemäß SEQ ID NO: 7 oder einer daraus
abgeleiteten Sequenz besteht.
13. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3′-
Polyadenylierungssequenz, welche in den jeweiligen natürlichen Stilben
synthase-Genen enthalten ist, verwendet wird.
14. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3′-
Polyadenylierungssequenz, welche im Plasmid pSSVst1 enthalten ist, ver
wendet wird.
15. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, in welcher als Bestandteil c) die 3′-
Polyadenylierungssequenz, verwendet wird, welche aus den Nukleotiden
2266 bis 2485 oder 2266 bis 2728 gemäß SEQ NO: 7 oder einer davon
abgeleiteten Sequenz besteht.
16. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, welche aus einer Kombination der
Bestandteile a) bis c), welche auf dem Plasmid pSSVst1 enthalten ist oder
eine davon abgeleitete Sequenz besteht.
17. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, welche aus den Nukleotiden 1 bis
2728 gemäß SEQ NO: 7 oder einer davon abgeleiteten Sequenz besteht.
18. Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 enthält.
19. Rekombinante DNA, die in Pflanzen oder Pflanzenzellen enthalten ist und
die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 enthält.
20. Vektoren, welche die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder die
rekombinante DNA gemäß Anspruch 18 enthalten.
21. Vektor-Plasmid pSSVst1.
22. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA-Sequenz I oder die
rekombinante DNA gemäß Anspruch 18 enthalten.
23. Escherichia coli Stamm RH pSSVst1 (gemäß DSM 9501) sowie seine
Mutanten, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesentlichen
Merkmale aufweisen.
24. Transgene Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren
Vermehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen,
Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA-Sequenz I
enthalten und die männlich steril sind und/oder eine gegenüber den
entsprechenden Pflanzen, welche die DNA-Sequenz I nicht enthalten,
geänderte Blütenfarbe aufweisen sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.
25. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 24, welche als DNA-Sequenz I die
DNA-Sequenz I enthalten, welche sich auf dem Plasmid pSSVst1 befindet
oder welche davon abgeleitet ist.
26. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 24, welche als DNA-Sequenz I die
DNA-Sequenz I enthalten, welche aus den Nukleotiden 1 bis 2728 gemäß
SEQ ID NO: 1 besteht oder welche davon abgeleitet ist.
27. Verwendung der DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1 und/oder der
rekombinanten DNA gemäß Anspruch 18 und/oder der Vektoren gemäß
Anspruch 20 und/oder der transformierten Mikroorganismen gemäß An
spruch 22 zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Proto
plasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen).
28. Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 24,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- (a) die DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1 und/oder die rekombinante DNA gemäß den Anspruch 4 in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
- (b) aus den transgenen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) vollständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
- (c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflan zenteile (einschließlich Vermehrungsmaterial) gewinnt.
29. Verwendung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 24 zur Erzeugung
von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflanzen, die die
DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß
Anspruch 18 enthalten und deren Vermehrungsmaterial.
30. Verwendung von DNA-Sequenzen, welche ganz oder teilweise der DNA
entsprechen, die als DNA-Sequenz I auf dem Plasmid pSSVst1 enthalten
ist, als Sonde zum Nachweis des Gehaltes der DNA-Sequenz I oder ihrer
Bestandteile in DNA, welche auf diesen Gehalt untersucht werden soll.
31. Verwendung der für Stilbensynthase kodierenden DNA-Sequenz zur
Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche männlich steril sind und/oder
gegenüber entsprechenden Pflanzen, die diese DNA nicht in ihrem Genom
enthalten, eine geänderte Blütenfarbe aufweisen.
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4440200A DE4440200A1 (de) | 1994-11-10 | 1994-11-10 | DNA-Sequenzen und ihre Verwendung |
| EP95938377A EP0787196A1 (de) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Dna-sequenzen und ihre verwendung |
| HU9701937A HU222268B1 (hu) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Hímsteril és megváltozott virágszínű transzgenikus növények és az előállításukra alkalmas DNS-konstrukciók |
| CA 2204744 CA2204744A1 (en) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Dna sequence and its use |
| PCT/EP1995/004256 WO1996015251A1 (de) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Dna-sequenzen und ihre verwendung |
| NZ296081A NZ296081A (en) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Dna sequence encoding stilbene synthase gene and its use for producing plants which are male sterile and exhibit an altered flower colour |
| JP8515676A JPH10508495A (ja) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Ｄｎａ配列およびそれらの使用 |
| AU39793/95A AU700022B2 (en) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | DNA sequences and their use |
| CN95196187.XA CN1117867C (zh) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Dna序列及其用途 |
| BR9509641A BR9509641A (pt) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | Sequências de dna e seu uso |
| US08/836,402 US6063988A (en) | 1994-11-10 | 1995-10-30 | DNA sequences encoding stilbene synthases and their use |
| MXPA/A/1997/003431A MXPA97003431A (es) | 1994-11-10 | 1997-05-09 | Secuencia de dna que codifica para una sintetasa de estilbeno y sus usos |
Applications Claiming Priority (1)
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| DE4440200A DE4440200A1 (de) | 1994-11-10 | 1994-11-10 | DNA-Sequenzen und ihre Verwendung |
Publications (1)
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ID=6532995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| EP (1) | EP0787196A1 (de) |
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