DE3485994T2

DE3485994T2 - PRODUCTION AND LABELING OF HYBRIDOMA ANTI-CORE PERSPECTIVELY TARGETED AGAINST COMMON DETERMINANTS BETWEEN CLOSE-ABOVE BUT DIFFERENT PROTEINS.

Info

Publication number: DE3485994T2
Application number: DE8484901131T
Authority: DE
Inventors: Frimann Berg
Original assignee: Cytoclonal Pharmaceutics Inc
Current assignee: Exegenics Inc
Priority date: 1983-02-04
Filing date: 1984-02-03
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2004-02-04
Also published as: DE3485994D1

Description

Technical area

Die Erfindung betrifft die Beschreibung, Herstellung und Charakterisierung neuer spezifischer hybridomaler/monoklonaler Antikörper, die gemeinsame antigene Determinanten unter den nahe verwandten Proteinen erkennen, die dem HuIFN-α-System angehören, unabhängig davon, ob sie nativ (in vivo oder in vitro) oder mittels rekombinanter DNA-Techniken (Gentechnik) oder mittels Peptidsynthese hergestellt sind.The invention relates to the description, production and characterization of new specific hybridoma/monoclonal antibodies that recognize common antigenic determinants among the closely related proteins belonging to the HuIFN-α system, whether they are produced natively (in vivo or in vitro) or by recombinant DNA techniques (genetic engineering) or by peptide synthesis.

State of the art

Interferone sind heute allgemein als eine wichtige Gruppe biologischer Proteine bekannt, die Zellen oder ganze Organismen gegenüber einem Angriff von Viren Resistenz verleihen (die sogenannte antivirale Aktivität, vgl. Stewart (1980)). Ferner spielen Interferone eine bedeutsame Rolle bei der Regulation des Immunsystems in vivo und in vitro, zusammen mit zahlreichen anderen sogenannten nicht-viralen Aktivitäten, wie Retransformation transformierter Zellen, Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen, etc., vgl. beispielsweise Vilceck et al. (1980). Aus diesen Gründen ist das Interferonsystem während des letzten Jahrzehnts intensiv untersucht und zahlreiche Befunde berichtet worden (vgl. Stewart (1980), Berg (1982)).Interferons are now generally recognized as an important group of biological proteins that confer resistance to viruses in cells or entire organisms (so-called antiviral activity, see Stewart (1980)). Furthermore, interferons play an important role in the regulation of the immune system in vivo and in vitro, together with numerous other so-called non-viral activities, such as retransformation of transformed cells, inhibition of tumor cell growth, etc., see for example Vilceck et al. (1980). For these reasons, the interferon system has been intensively studied during the last decade and numerous findings have been reported (see Stewart (1980), Berg (1982)).

Einige der größten, während des Beginns der Interferonforschung beobachteten Schwierigkeiten waren die bei der Aufreinigung und Charakterisierung der Interferonproteine aufgetauchten Schwierigkeiten. Es wurde davon ausgegangen, daß in dem humanen System lediglich eine Proteinspezies existiert, es wurde jedoch später von verschiedenen Forschern, z. B. Berg et al. (1975), Stewart (1980), Berg (1982), gezeigt, daß in dem humanen System tatsächlich drei Haupttypen des Interferons existieren: humanes Leukozyten-Interferon (HuIFN-α), humanes Fibroblasten-Interferon (HuIFN-β) und humanes Immun-Interferon (HuIFN-γ).Some of the greatest difficulties observed during the early days of interferon research were the difficulties encountered in the purification and characterization of interferon proteins. It was assumed that only one protein species existed in the human system, but it was later shown by various investigators, e.g. Berg et al. (1975), Stewart (1980), Berg (1982), that in fact three major types of interferon exist in the human system: human leukocyte interferon (HuIFN-α), human fibroblast interferon (HuIFN-β) and human immune interferon (HuIFN-γ).

HuIFN-α ist nunmehr vollständig gereinigt worden. Ursprünglich ging man davon aus, daß es lediglich aus einer einzigen Einheit besteht, aber im Zuge der fortschreitenden Aufreinigung hat sich später gezeigt, daß HuIFN-α aus mindestens 6-7 verschiedenen Interferon-Proteinspezies besteht, und es wurde letztlich gezeigt, daß mindestens 13 Spezies existieren (Berg et al. (1980), (1982a, b). Diese Spezies wurden gleichzeitig gereinigt, indem traditionelle Techniken (wie Gelfiltration und dergleichen) mit Antikörper-Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern aus Kaninchen kombiniert wurden. Die reine Spezies wurde anschließend wiederum als Immunogen eingesetzt, wobei "monospezifische" Kaninchen-Antikörper gegen die Interferonproteine durch Einsatz lediglich einer einzigen Interferonspezies (z. B. 20 000 Spezies) als Immunogen produziert wurden. Damit waren die monospezifischen, polyklonalen Kaninchen-Antikörper in der Lage, sämtliche Spezies des huIFN-α gleichzeitig zu reinigen, wenn sie in einer Antikörper-Affinitätssäule eingesetzt wurden. Diesem Ansatz wurde von anderen gefolgt, die Immunglobuline einsetzten, welche von Hybridomzellen produziert worden waren (z. B. Secher et al. (1980)). Dieses Verfahren wies jedoch einen schwerwiegen den Nachteil auf: lediglich ein Teil der Interferonproteine wurde an die Hybridomsäule gebunden (vgl. Berg et al (1982, b)). Gewöhnlich wurde eine Hälfte der Interferon-Aktivität in der Waschlösung gefunden, während die andere Hälfte an die Säule gebunden war (und in spezifischer Weise eluiert werden konnte). Es bestand daher - zumindest was die Messungen mit Hilfe des Maus-Hybridom-Systems betrifft - im allgemeinen die Vorstellung, daß HuIFN-α keine gemeinsame antigene Determinante enthalten könnte.HuIFN-α has now been completely purified. Originally it was thought to consist of only a single unit, but as purification progressed it was later shown that HuIFN-α consists of at least 6-7 different interferon protein species, and it was ultimately shown that at least 13 species exist (Berg et al. (1980), (1982a, b). These species were simultaneously purified by combining traditional techniques (such as gel filtration and the like) with antibody affinity chromatography using rabbit antibodies. The pure species was then used again as an immunogen, with "monospecific" rabbit antibodies against the interferon proteins being produced by using only a single interferon species (e.g., 20,000 species) as an immunogen. Thus, the monospecific, polyclonal rabbit antibodies were able to simultaneously purify all species of huIFN-α when used in an antibody affinity column. This approach was followed by others using immunoglobulins produced by hybridoma cells. (e.g. Secher et al. (1980)). However, this method had a serious disadvantage: only a portion of the interferon proteins were bound to the hybridoma column (cf. Berg et al (1982, b)). Usually, half of the interferon activity was found in the wash solution, while the other half was bound to the column (and could be eluted in a specific manner). It was therefore generally believed - at least as far as measurements using the mouse hybridoma system were concerned - that HuIFN-α could not contain a common antigenic determinant.

Summary of the invention

Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem Problem zu. Es wird im folgenden dargelegt, daß es nunmehr tatsächlich möglich ist, von Hybridomzellen produzierte Antikörper (Immunglobuline) zu gewinnen, die für mindestens eine antigene Determinante spezifisch sind, welche den 12 Spezies des humanen Interferon-α gemeinsam sind, welche in dem humanen System Aktivität zeigen und Molekulargewichte von mindestens 16 000 im SDS-PAGE besitzen, wobei eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 16 600 ausgenommen ist, die von Berg et al. beschrieben ist (1982a und 1982b). Die Erfindung ist neu und im Vergleich mit dem früheren Erkenntnisstand überraschend. Die Folgerungen aus den vorliegen den Erfindungen sind immanent:The present invention addresses this problem. It is explained below that it is now actually possible to obtain antibodies (immunoglobulins) produced by hybridoma cells that are specific for at least one antigenic determinant. which are common to the 12 species of human interferon-α which show activity in the human system and have molecular weights of at least 16,000 in SDS-PAGE, excluding one species with a molecular weight of 16,600 described by Berg et al. (1982a and 1982b). The invention is new and surprising in comparison with the previous state of knowledge. The consequences of the present inventions are inherent:

sämtliche Proteine, die zu HuIFN-α gehören und sämtliche aus Bakterien abgeleitete, mittels gentechnischer Verfahren erhaltene HuIFN-α-Spezies werden dieses Immunglobulin binden (welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es, wie mit einer Antikörpern Affinitätschromatographie gezeigt wurde, sämtliche Spezies von HuIFN-α bindet), wodurch ein universeller Ansatz zur Aufreinigung sämtlicher Spezies von HuIFN-α, seien sie nativ oder bakteriell (Plasmid) abgeleitet, erstmalig erfunden worden ist. Es liegt ferner im Rahmen der Erfindung, andere Hybridomsysteme (vom Murinsystem abgesehen) zu verwenden, die Hybridomantikörper (oder die wesentlichen Teile davon) der oben definierten Spezifität liefern. Beispielsweise wird vorhersehbar, daß das Rattensystem in der Zukunft ebenfalls eingesetzt werden wird.all proteins belonging to HuIFN-α and all HuIFN-α species derived from bacteria and obtained by genetic engineering will bind this immunoglobulin (which is characterized by the fact that it binds all species of HuIFN-α, as shown by antibody affinity chromatography), whereby a universal approach for the purification of all species of HuIFN-α, whether native or bacterial (plasmid) derived, has been invented for the first time. It is also within the scope of the invention to use other hybridoma systems (apart from the murine system) which provide hybridoma antibodies (or the essential parts thereof) of the specificity defined above. For example, it is foreseeable that the rat system will also be used in the future.

Die besagten Immunglobuline könnten ebenso durch die nunmehr gut bekannten gentechnischen Verfahren produziert werden, beispielsweise mittels Hybridomzellen, die die besagten Immunglobuline produzieren, indem zunächst die richtige mRNA isoliert wird (deren Spezifität mittels sehr gut bekannter Standardverfahren untersucht/gemessen/isoliert werden kann, wie beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 68 (1981), Recombinant Techniques, dargestellt ist). Die gereinigte mRNA, welche auf ihre richtige Spezifität in Oozyten (mit Hilfe einer semi-festen Bindungsanalyse des translatierten Produkts - siehe Materialien und Methoden der vorliegenden Anmeldung) untersucht werden kann, kann anschließend mittels reverser RNA-Transkriptase in cDNA transformiert werden, und nach Erstellung einer Plasmid-Bibliothek durch Einbau der besagten cDNA in relevante Plasmide, kann die korrekt klonierte durch Screening unter der Voraussetzung gefunden werden, daß aus der korrekten mRNA (identifizert/isoliert/beschrieben wie oben dargelegt) eine Sonde hergestellt werden kann, vgl. Weissmann (1982). Es liegt ferner im Rahmen der vorliegenden Erfindung, lediglich Teile der Immunglobuline herzustellen, welche die gewünschte Spezifität aufweisen.Said immunoglobulins could also be produced by the now well-known genetic engineering techniques, for example by means of hybridoma cells producing said immunoglobulins by first isolating the correct mRNA (the specificity of which can be assayed/measured/isolated by very well-known standard techniques, as described for example in Methods in Enzymology, Volume 68 (1981), Recombinant Techniques). The purified mRNA, which can be assayed for its correct specificity in oocytes (by means of a semi-tight binding analysis of the translated product - see Materials and Methods of the present application), can then be transformed into cDNA by means of reverse RNA transcriptase and, after preparation of a plasmid library by incorporating said cDNA into relevant plasmids, the correctly cloned one can be found by screening provided that a probe can be produced from the correct mRNA (identified/isolated/described as set out above), cf. Weissmann (1982). It is also within the scope of the present invention to produce only parts of the immunoglobulins which have the desired specificity.

Die besagten Immunglobuline werden sehr nützlich sein bei verschiedenen immunologischen Analysen, bei denen beispielsweise ELISA-(Enzym-Immun-)- oder RIA-(Radioimmun-)-Techniken oder dergleichen eingesetzt werden, bei denen die Anwesenheit eines monoklonalen Antikörpermoleküls (oder Teile davon) mit der oben genannten Spezifität wesentlich ist. Die besagten Immunglobuline können daher bei Immunassays zum Nachweis von Interferonproteinen (oder Teilen derselben) mittels herkömmlicher Techniken (vgl. beispielsweise Methods in Enzymology, Band 70, Teil A, 1980) sehr nützlich sein.Said immunoglobulins will be very useful in various immunological analyses employing, for example, ELISA (enzyme immuno) or RIA (radioimmuno) techniques or the like, in which the presence of a monoclonal antibody molecule (or parts thereof) having the above-mentioned specificity is essential. Said immunoglobulins may therefore be very useful in immunoassays for the detection of interferon proteins (or parts thereof) by conventional techniques (see, for example, Methods in Enzymology, Volume 70, Part A, 1980).

Es wird ferner möglich sein, die Anwesenheit von Interferonrezeptoren (welche zuvor Interferonproteine oder Teile derselben erhalten haben) oder dergleichen nachzuweisen, da diese Einheiten durch die oben genannten Antikörper ebenfalls erkannt werden können.It will also be possible to detect the presence of interferon receptors (which have previously received interferon proteins or parts thereof) or the like, since these entities can also be recognized by the above-mentioned antibodies.

Best modes for carrying out the invention

Es wird davon ausgegangen, daß eine der Gründe für den Erfolg bei der Gewinnung der besagten Hybridomzellen-Antikörper mit den bemerkenswerten Bindungseigenschaften in dem Verfahren zur Herstellung der Antigenpräparationen gesehen werden kann, die aus mit SDS stabilisierten, hochaufgereinigten Interferonproteinen bestehen (vgl. Berg et al. (1980), (1982a)). In der Anwesenheit von SDS wird ein wichtiger Faktor bei der Präsentation der Proteine für die immunkompetenten Zellen gesehen, da die fraglichen Proteine (z. B. Interferonspezies) sämtliche ihrer antigenen Determinanten in Gegenwart von SDS (die Proteine können ebenfalls mit SDS behandelt werden, bevor sie mit den immunkompetenten Zellen konfrontiert werden) aufgrund der denaturierenden Eigenschaft von SDS exponieren, wodurch andernfalls verborgene Determinanten vollständig exponiert werden. Es liegt ferner im Rahmen der Erfindung, die Proteine im allgemeinen mit SDS vor (oder gleichzeitig) der Durchführung der Immunisierung zu behandeln, wobei der Zweck dieses Vorgehens darin liegt, mehr verborgene antigene Determinanten zu erhalten, die andernfalls nicht erkannt werden. Durch Einsatz dieses "SDS-Ansatzes" während der Immunisierung ist zu erwarten, daß die Hybridomzellen- Antikörper gegen die häufigsten Determinanten (d. h. diejenige oder solche, die unter sämtlichen Proteinen am häufigsten vorkommen, die zu einer Proteinmischung gehören, welche aus verwandten, aber dennoch unterschiedlichen Proteinen zusammengesetzt ist) häufiger gefunden werden, wenn ein derartiger denaturierender Ansatz im Verlauf der Herstellung des relevanten Immunogens (umfassend Proteine, z. B. reine Spezies von HuIFN-α) eingesetzt wird. Dieses allgemeine Prinzip ist - bis auf das Murinsystem - ebenfalls auf andere Hybridomzellensysteme anwendbar.It is assumed that one of the reasons for the success in obtaining the said hybridoma cell antibodies with the remarkable binding properties can be seen in the process for producing the antigen preparations, which consist of highly purified interferon proteins stabilized with SDS (cf. Berg et al. (1980), (1982a)). The presence of SDS is seen as an important factor in the presentation of the proteins to the immunocompetent cells, since the proteins in question (e.g. interferon species) have all their antigenic determinants in the presence of SDS (the proteins may also be treated with SDS before confronting them with the immunocompetent cells) due to the denaturing property of SDS, thereby fully exposing otherwise hidden determinants. It is further within the scope of the invention to treat the proteins in general with SDS before (or simultaneously with) performing the immunization, the purpose of this procedure being to obtain more hidden antigenic determinants that would otherwise not be recognized. By using this "SDS approach" during immunization, it is expected that hybridoma cell antibodies against the most common determinants (i.e. the one or those that are most common among all proteins belonging to a protein mixture composed of related but nevertheless different proteins) will be found more frequently if such a denaturing approach is used in the course of preparing the relevant immunogen (comprising proteins, e.g. pure species of HuIFN-α). This general principle is also applicable to other hybridoma cell systems, except for the murine system.

Die oben genannten Befunde korrelieren sehr gut mit der gut bekannten, auf der Genebene existierenden Homologie der für HuIFN-α kodierenden Gene, vgl. Weissmann et al. (1982). Da einige Bereiche als konstant bekannt sind (vgl. Weissmann et al. (1982)), wird davon ausgegangen, daß diese Hybridomzelle, welche durch die bloße Fähigkeit definiert ist, sämtliche Spezies von HuIFN-α zu erkennen, wahrscheinlich eine spezifische Determinante erkennt, die in einem solchen Bereich lokalisiert ist, der sämtlichen zu den HuIFN-α Spezies gehörenden Interferonspezies gemeinsam ist. Es wird ferner davon ausgegangen, daß der besagte Antikörper ebenfalls MuIFN-α mit derselben Determinante erkennen könnte, welche zu der besagten Spezifität der besagten Antikörper geführt hat. Es ist derzeit nicht bekannt, wie weiträumig diese Determinante innerhalb des Interteronsystems verteilt sein könnte (Arbeiten schreiten fort).The above findings correlate very well with the well-known homology of the genes coding for HuIFN-α, which exists at the gene level, cf. Weissmann et al. (1982). Since some regions are known to be constant (cf. Weissmann et al. (1982)), it is assumed that this hybridoma cell, which is defined by the mere ability to recognize all species of HuIFN-α, probably recognizes a specific determinant located in such a region that is common to all interferon species belonging to the HuIFN-α species. It is further assumed that the said antibody could also recognize MuIFN-α with the same determinant that led to the said specificity of the said antibodies. It is currently unknown how wide this determinant could be distributed within the interteron system (work in progress).

Hinsichtlich der Immunisierung, der Isolierung einer Milzlymphozytenmischung, der Fusion und Hybridisierung, der Kultivierung von Hybriden und der Auswahl und der Subklonierung von Hybriden, die den gewünschten Antikörper produzieren, und der Isolierung dieser Hybride oder der entsprechenden Antikörper wird der Leser auf zahlreiche, zuvor veröffentlichte Beschreibungen, wie beispielsweise Kohler et al. (1975), (1976), Lovborg (1982), Methods in Enzymology, Band 70, (1980), Secher et al. (1980), Cellular Immunology, Bände 1-3 (1978), Kennett, McKern & Bechtol (1980), verwiesen.For immunization, isolation of a spleen lymphocyte mixture, fusion and hybridization, cultivation of hybrids, and selection and subcloning of hybrids producing the desired antibody and isolation of these hybrids or the corresponding antibodies, the reader is referred to numerous previously published descriptions such as Kohler et al. (1975), (1976), Lovborg (1982), Methods in Enzymology, Volume 70, (1980), Secher et al. (1980), Cellular Immunology, Volumes 1-3 (1978), Kennett, McKern & Bechtol (1980).

Die meisten der Plasmazytom-Zelllinien, die zur Herstellung von Hybridomzellen verwendet werden, und einige Antikörper produzierende Hybridomzellen sind von öffentlichen Zellhinterlegungszentren, wie beispielsweise dem Salk Institute, Gell Distribution Center, P.O. Box 1809, San Diego, Ca. 921912, USA, oder anderen vergleichbaren Stellen erhältlich. Die vorliegende, in dieser Erfindung verwendete Zelllinie wurde erhalten von Human Genetic Mutant Gell Repository in New Jersey, siehe Abschnitt: Zellen. Die Zellen werden im allgemeinen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit einem hohen Anteil Glukose (4, 5 g pro Liter) oder in RPMI 1640 kultiviert. Die Zugabe von Glukose zu RPMI 1640 bis zu 4, 5 g pro Liter verbessert das Wachstum bei höheren Dichten. Die Zellen werden in einer stationären Suspensionskultur bei einer Konzentration von 10&sup5;-10&sup6; Zellen pro ml gehalten. Der optimale Zustand einer für die Fusion zu verwendenden Kultur ist eine hohe Lebensfähigkeit (d. h. größer als 90%) mit 3-8·10&sup5;-Zellen pro ml. Für eine genauere Beschreibung der experimentellen Details wird der Leser beispielsweise auf Lovborg (1982) und Kennett et al. (1980) verwiesen.Most of the plasmacytoma cell lines used to make hybridoma cells and some antibody-producing hybridoma cells are available from public cell deposit centers such as the Salk Institute, Gell Distribution Center, P.O. Box 1809, San Diego, Ca. 921912, USA, or other equivalent locations. The present cell line used in this invention was obtained from the Human Genetic Mutant Gell Repository in New Jersey, see Section: Cells. The cells are generally cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g per liter) or in RPMI 1640. Addition of glucose to RPMI 1640 up to 4.5 g per liter improves growth at higher densities. The cells are maintained in a stationary suspension culture at a concentration of 105-106 cells per ml. The optimal state of a culture to be used for fusion is a high viability (i.e., greater than 90%) with 3-8 105 cells per ml. For a more detailed description of the experimental details, the reader is referred to, for example, Lovborg (1982) and Kennett et al. (1980).

Ein Test auf Mykoplasmen wurde stets durchgeführt, da von anderen gezeigt worden war, daß die Anwesenheit von Mykoplasmen eine erfolgreiche Hybridisierung leicht verhindern kann. Sämtliche Myelomzellen wurden stets 1-3 Tage vor ihrem Einsatz untersucht. Die Zellen wurden lediglich dann für die Fusion vorgesehen, wenn der Test sich als absolut negativ erwies.A test for mycoplasma was always carried out, as it had been shown by others that the presence of mycoplasma successful hybridization can easily be prevented. All myeloma cells were always examined 1-3 days before use. The cells were only selected for fusion if the test was absolutely negative.

Der Einbau des Mycoplasmentests in die Hybridisierungsexperimente führte zu einer deutlichen Verbesserung der Anzahl positiver Hybridomzellen, die in den Fusionsexperimenten erhalten wurden, und bestätigt daher ähnliche Beobachtungen einiger anderer Gruppen (vgl. Lovborg (1982)).The incorporation of the mycoplasma test into the hybridization experiments resulted in a significant improvement in the number of positive hybridoma cells obtained in the fusion experiments, thus confirming similar observations by some other groups (cf. Lovborg (1982)).

Experimental part Interferon titrations

Sie wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben unter Einsatz von beispielsweise VERO-Zellen und VSV als Challenge-Viren (vgl. z. B. Berg et al. (1980)). Sämtliche Einheiten sind in Form internationaler Einheiten dargestellt (69/19 B, MRC, UK). Sofern sehr geringe Mengen an Interferon nachzuweisen waren, wurde das sogenannte bovine System, umfassend BMDK-Zellen und VSV, verwendet, da es sich als extrem zuverlässig und sehr empfindlich herausstellte. Es konnte eine so niedrige Interferonaktivität wie 0,1 Einheiten leicht nachgewiesen werden. Daher wurde dieses System bei der semi-Neutralisierung der Hybridom-Überstände weitgehend eingesetzt.They were carried out as previously described using, for example, VERO cells and VSV as challenge viruses (see, for example, Berg et al. (1980)). All units are expressed in the form of international units (69/19 B, MRC, UK). When very small amounts of interferon were to be detected, the so-called bovine system, comprising BMDK cells and VSV, was used, as it proved to be extremely reliable and very sensitive. Interferon activity as low as 0.1 units could be easily detected. Therefore, this system was widely used in the semi-neutralization of hybridoma supernatants.

Production of the immunogen

Rohes humanes Leukozyten-Interferon wurde gereinigt mittels Gelfiltration, gefolgt durch eine Antikörper-Affinitätschromatographie, die beinahe reine Interferonproteine mit einer spezifischen Aktivität von 108 Einheiten pro mg Protein lieferte. Die Rückgewinnung betrug etwa 75%. Das gesamte Eluat aus einem typischen Experiment enthielt 5·10&sup6; Einheiten, die in Aliquots von jeweils 100 000 Einheiten unterteilt (in 0,1 ml Elutionspuffer enthaltend 0,1% SDS) und bis zur Verwendung bei -20ºC gehalten wurden (stabil für mindestens S Monate), vgl. Berg et al. (1980).Crude human leukocyte interferon was purified by gel filtration followed by antibody affinity chromatography, which yielded nearly pure interferon proteins with a specific activity of 108 units per mg protein. Recovery was approximately 75%. The total eluate from a typical experiment contained 5 x 106 units, which were divided into aliquots of 100,000 units each (in 0.1 ml elution buffer containing 0.1% SDS) and stored at -20°C until use. were maintained (stable for at least S months), cf. Berg et al. (1980).

Manchmal wurden auch weniger gut gereinigte Präparationen von Leukozyten-Interferon verwendet (einschl. SDS).Sometimes less well purified preparations of leukocyte interferon were used (including SDS).

immunization

Die Balb/c-Mäuse - vorzugsweise weibliche Mäuse - wurden wie folgt immunisiert: Die erste Injektion (100 000 Einheiten) wurde mit Freund's Adjuvans (F.A.) gemischt und intraperitoneal (I.P.) verabreicht. Die folgenden 5-8 Injektionen wurden als wöchentliche Injektionen gegeben, aber bestanden lediglich aus 30 000 Einheiten, wobei kein F.A. eingeschlossen wurde. Nach 5-8 Injektionen entwickelten die Mäuse Antikörper gegen HuIFN-α (nachgewiesen durch den "traditionellen" Neutralisationstest (vgl. Neutralisationstests) im Bereich von 200-2000 neutralisierenden Einheiten/ml, vgl. Berg (1982)). Diese Form der Schätzung führte im Vergleich mit dem semi-festen Neutralisationsverfahren (siehe unten), welches sich als sehr viel empfindlicher erwies, sehr häufig zu bedeutend niedrigeren Werten. Zwei bis fünf Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse als Boosterdosis insgesamt 100 000 Einheiten, wobei die eine Hälfte I.P. und die andere Hälfte in Form subkutaner (S.C.) Injektionen ohne F.A. verabreicht wurden.The Balb/c mice - preferably female mice - were immunized as follows: The first injection (100,000 units) was mixed with Freund's adjuvant (F.A.) and administered intraperitoneally (I.P.). The following 5-8 injections were given as weekly injections but consisted of only 30,000 units, with no F.A. included. After 5-8 injections, the mice developed antibodies to HuIFN-α (detected by the "traditional" neutralization test (see Neutralization Tests) in the range of 200-2000 neutralizing units/ml, see Berg (1982)). This form of estimation very often resulted in significantly lower values compared with the semi-solid neutralization procedure (see below), which proved to be much more sensitive. Two to five days before fusion, mice received a total booster dose of 100,000 units, half administered IP and half administered via subcutaneous (SC) injections without F.A.

Neutralization of antibodies against HuIFN-α

Das einfache ("traditionelle") Verfahren zur Neutralisierung von Interferon besteht aus dem Mischen gleicher Volumina von Interferonproteinen, die eine vorher bestimmte Menge an Interferoneinheiten enthalten, mit der fraglichen Antikörperprobe unter Anwendung mehrerer Verdünnungsstufen, vgl. z. B. Berg (1982). Mit Hilfe dieses Verfahrens werden jedoch lediglich solche Antikörper erkannt, die mit den antigenen Determinanten reagieren, die sich nahe den biologischen Determinanten des Interferonmoleküls befinden. Daher ist es, wie von Berg (1982) ausgeführt, durchaus möglich, daß sich ein großer Teil der Antikörper bei einer ausschließlichen Anwendung des "traditionellen" Neutralisierungsverfahrens der Identifizierung entziehen wird.The simple ("traditional") method for neutralizing interferon consists of mixing equal volumes of interferon proteins containing a predetermined amount of interferon units with the antibody sample in question using several dilution steps, cf. e.g. Berg (1982). However, this method only detects antibodies that react with antigenic determinants that are close to the biological determinants of the interferon molecule. Therefore, as stated by Berg (1982), it is quite possible that a large proportion of the antibodies will evade identification if the "traditional" neutralization procedure is used exclusively.

Um diese Probleme zu überwinden, wurden verschiedene ELISA-Tests unter Berücksichtigung dessen angewendet, daß beispielsweise Antikörper von Schafen gegen HuIFN-α (hergestellt aus teilweise gereinigtem HuIFN-α durch Ethanolfällung, vgl. Stewart (1980)) sämtliche Spezies von HuIFN-α bindet. Daher wurden Immunplatten (NUNC-Dänemark) zunächst mit IgG-Lösungen aus einem Antiinterferon-Schafsserum und dann mit reinen Interferonproteinen überzogen, und nach einer geeigneten Inkubation wurden die Proben aus den Hybridomzellen und schließlich Antimaus-IgG-Galaktosidase-Konjugate von Kaninchen zugegeben, wie im einzelnen beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 70, Teil A (1980), beschrieben. Es stellte sich jedoch heraus, daß durch dieses Verfahren zu viele falsch-positive Ergebnisse in dem Sinne erhalten wurden, daß ELISA-positive fiberstände sich in dem semifesten Neutralisierungstest (siehe unten) nicht als positiv darstellten.To overcome these problems, various ELISA tests have been used, taking into account that, for example, sheep antibodies against HuIFN-α (prepared from partially purified HuIFN-α by ethanol precipitation, see Stewart (1980)) binds all species of HuIFN-α. Therefore, immune plates (NUNC-Denmark) were first coated with IgG solutions from an anti-interferon sheep serum and then with pure interferon proteins, and after appropriate incubation, the samples from the hybridoma cells and finally rabbit anti-mouse IgG-galactosidase conjugates were added, as described in detail, for example, in Methods in Enzymology, Volume 70, Part A (1980). However, it turned out that this procedure produced too many false-positive results in the sense that ELISA-positive supernatants did not show up as positive in the semi-solid neutralization test (see below).

Semi-solid neutralization test

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um ELISA-positive Proben zu untersuchen. Der Test nutzt den Vorteil der einfachen Tatsache, daß ein gegen HuIFN-α gerichtetes "mögliches" Antikörpermolekül an das Interferonmolekül binden wird. Daher kann, wenn man den "möglichen" Antikörper vor der Zugabe einer exakten, aber kleinen Menge Interferon, vorzugsweise insgesamt so wenig wie 0,1 Einheiten (siehe den Abschnitt der Titration von Interferon), zunächst immobilisiert (was durch einen anderen Antikörper erfolgen kann, welcher gegen den "möglichen" Antikörper gerichtet ist), ein sehr kleiner Tropfen in dem Interferontiter (Gehalt) leicht unter Einsatz des "bovinen" Systems nachgewiesen werden.This method was developed to test ELISA-positive samples. The test takes advantage of the simple fact that a "potential" antibody molecule directed against HuIFN-α will bind to the interferon molecule. Therefore, if one first immobilizes the "potential" antibody (which can be done by another antibody directed against the "potential" antibody) before adding an exact but small amount of interferon, preferably as little as 0.1 units in total (see the section on titration of interferon), a very small drop in the interferon titer (level) can be easily detected using the "bovine" system.

Dieses System erwies sich gegenüber dem ELISA-System als überlegen. Das folgende Verfahren wurde angewendet:This system proved to be superior to the ELISA system. The following procedure was used:

1. Beschichtung mit Antimaus-Immunglobulin von Kaninchen (DAKO-PATT, Dänemark) unter Verwendung von 300 ug/ml in PBS, einschließlich 0,05% Natriumazid (N.A.), 1 Stunde lang bei 37ºC. Umstellung auf 4ºC für mindestens 24 Stunden (oder mehrere Wochen).1. Coat with rabbit anti-mouse immunoglobulin (DAKO-PATT, Denmark) using 300 ug/ml in PBS, including 0.05% sodium azide (N.A.), for 1 hour at 37ºC. Shift to 4ºC for at least 24 hours (or several weeks).

2. Dreimaliges Waschen mit PBS einschl. 0,05% Natriumazid einschließlich Tween 80 (0,05%), dem sogenannten Waschpuffer.2. Wash three times with PBS including 0.05% sodium azide including Tween 80 (0.05%), the so-called wash buffer.

3. Absättigen der ungebundenen Stellen der Immunplatten mit 2% Ovalalbumin in PBS (Sigma) bei Raumtemperatur für 2 Stunden.3. Saturate the unbound areas of the immunoplates with 2% ovalalbumin in PBS (Sigma) at room temperature for 2 hours.

4. Dreimaliges Waschen mit Waschpuffer.4. Wash three times with wash buffer.

5. Zugabe von 100 ul Überstand der zu untersuchenden Hybridomkultur zu der Vertiefung. Inkubieren für 24 Stunden bei Raumtemperatur (einschl. 0,05% Natriumazid).5. Add 100 μl of supernatant from the hybridoma culture to be tested to the well. Incubate for 24 hours at room temperature (including 0.05% sodium azide).

6. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer.6. Wash twice with wash buffer.

7. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer (ohne jegliches Natriumazid).7. Wash twice with wash buffer (without any sodium azide).

8. Zugabe von 100 ul Interferonlösung (z. B. als native Interferone), enthaltend insgesamt 0,1 Einheit (siehe Abschnitt bezüglich Interferontitration) für 2 Stunden bei Raumtemperatur.8. Add 100 μl of interferon solution (e.g. as native interferons) containing a total of 0.1 unit (see section regarding interferon titration) for 2 hours at room temperature.

9. Übertragen der Mischung (100 ul) auf MDBK-Zellen in Mikrovertiefungen, welche zuvor unter Anwendung derselben Mikrotiterplatten zur Konfluenz kultiviert wurden, wie sie für die Interferontitrationen verwendet wurden (NUNC, Dänemark) und 20 Stunden langes Inkubieren bei 37ºC (5% CO&sub2;).9. Transfer the mixture (100 μl) to MDBK cells in microwells that have been previously cultured to confluence using the same microtiter plates as used for interferon titrations were used (NUNC, Denmark) and incubation for 20 hours at 37ºC (5% CO₂).

10. Zugabe von VSV in einer vorher bestimmten Konzentration, was nach 24 Stunden zu einem unterschiedlichen CPE-Wert in kultivierten Kontrollzellen führte, die kein Interferon erhielten.10. Addition of VSV at a predetermined concentration, which resulted in a different CPE value after 24 hours in cultured control cells that did not receive interferon.

11. Gewöhnliches Auswerten der Mikrotiterplatten (siehe Abschnitt: Interferontitration und die darin genannten Referenzen) unter Berücksichtigung dessen, daß dann, wenn die Zellen in einer Vertiefung zerstört sind, der Überstand des ursprünglichen Hybridomklons (Kultur) Antikörper enthielt, welche in der Lage waren, HuIFN-α zu binden (Entfernen). Dieses Ergebnis kennzeichnet daher einen positiven Klon.11. Read the microtiter plates in the usual way (see section: Interferon titration and the references therein) taking into account that when the cells in a well are destroyed, the supernatant of the original hybridoma clone (culture) contained antibodies capable of binding (removal) HuIFN-α. This result therefore indicates a positive clone.

Cloning and further cultivation of positive hybridoma cells

Positive Klone, die wie oben beschrieben identifiziert wurden, wurden in mehrere Subklone unter Anwendung der "limitierten Verdünnungstechnik" unter Einsatz von konditioniertem Medium und Nährschichten (peritoneale Makrophagen von Balb/c-Mäusen), wie von Lovborg (1982) detailliert beschrieben, unterteilt. Sämtliche subklonierten Hybridomzellen wurden regelmäßig auf ihre Bindungsaktivität untersucht und die Zellen wurden bei anhaltend positivem Befund weiter kultiviert, bevor sie Balb/c-Mäusen (I.P.) injiziert wurden, welche zuvor eine immunstimulierende Substanz (z. B. Pristan, 4-6 Tage vorher) erhalten hatten. Nach 5-15 Tagen (abhängig von der Menge injizierter klonierter Zellen) können neue Hybridomazellen der korrekten Spezifität zusammen mit großen Volumina Ascitesflüssigkeit, die den gewünschten Antikörper in einer extrem hohen Konzentration (etwa mehr als 95% aller vorhandenen Immunglobuline weisen die gewünschte Spezifität auf) geerntet werden. Die Hybridomzellen werden im Anschluß an eine Zentrifugation von der Ascitesflüssigkeit abgetrennt und können nun für eine weitere Injektion von neuen Mäusen (Balb/c-Mäuse) eingesetzt werden, wodurch mehr Ascitesflüssigkeit zusammen mit mehr Hybridomzellen erhalten werden kann, usw., wobei zu berücksichtigen ist, daß die aus einer Maus geernteten Hybridomzellen zur Produktion von 20 neuen Mäusen verwendet werden können, die jeweils ungefähr dieselbe Anzahl Hybridomzellen liefern, wie die erste. Die Hybridomzellen können auch in vitro in Rollflaschen unter Anwendung der relevanten Bedingungen, wie sie bereits detailliert von Lovborg (1982) beschrieben sind, kultiviert werden, wobei prinzipiell dieselben Zellen und Antikörper erhalten werden, wie sie oben unter Anwendung des Maussystems (in vivo) beschrieben wurden.Positive clones identified as described above were divided into several subclones using the "limited dilution technique" using conditioned medium and feeder layers (peritoneal macrophages from Balb/c mice) as detailed by Lovborg (1982). All subcloned hybridoma cells were periodically checked for binding activity and, if positive, cells were further cultured before being injected (IP) into Balb/c mice that had previously received an immunostimulatory substance (e.g., pristane, 4-6 days previously). After 5-15 days (depending on the amount of cloned cells injected), new hybridoma cells of the correct specificity can be harvested together with large volumes of ascites fluid containing the desired antibody at an extremely high concentration (approximately more than 95% of all immunoglobulins present have the desired specificity). The hybridoma cells are separated from the ascites fluid after centrifugation and can now be used for further injection into new mice (Balb/c mice) whereby more ascites fluid can be obtained together with more hybridoma cells, etc., taking into account that the hybridoma cells harvested from one mouse can be used to produce 20 new mice, each yielding approximately the same number of hybridoma cells as the first. The hybridoma cells can also be cultured in vitro in roller bottles using the relevant conditions already described in detail by Lovborg (1982), yielding in principle the same cells and antibodies as described above using the mouse system (in vivo).

Isolation of anti-IFN immunoglobulin

Da es bekannt ist, daß die in Ascitesflüssigkeiten gebildeten Antikörper in hohem Maße empfänglich für einen proteolytischen Abbau durch die in der Ascitesflüssigkeit vorhandenen proteolytischen Enzyme sind, wurden die geernteten Ascitesflüssigkeiten zunächst auf +4ºC gekühlt und zentrifugiert (um Hybridomzellen und andere Zelltrümmer zu entfernen), bevor sie mit Ammoniumsulfat behandelt werden, wodurch die Immunglobuline gefällt wurden. Diese Isolierung wurde unmittelbar nach Ernte der Ascitesflüssigkeiten durchgeführt. Die mittels Ammoniumsulfat gefällten Immunglobuline wurden bei -20ºC aufbewahrt. Vor der Titration wurde ein kleines Aliquot in z. B. 5 ml Medium gelöst und gegen 1 Liter PBS dialysiert, bevor es mit dem semi-festen Neutralisierungstest untersucht wurde. Die Immunglobuline wurden weiter gereinigt durch traditionelle Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie und dergleichen.Since it is known that the antibodies produced in ascites fluids are highly susceptible to proteolytic degradation by the proteolytic enzymes present in the ascites fluid, the harvested ascites fluids were first cooled to +4ºC and centrifuged (to remove hybridoma cells and other cellular debris) before being treated with ammonium sulfate, which precipitated the immunoglobulins. This isolation was carried out immediately after harvesting the ascites fluids. The ammonium sulfate precipitated immunoglobulins were stored at -20ºC. Before titration, a small aliquot was dissolved in, for example, 5 ml of medium and dialyzed against 1 liter of PBS before being tested with the semi-solid neutralization test. The immunoglobulins were further purified by traditional methods such as gel filtration, ion exchange chromatography and the like.

Cells

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Maus-Myelomzellinie wird wie folgt charakterisiert: Maus-Myelom, Linie P3 x 63 NS1, HPRT-Mangel, produziert Kappa, nicht Immonuglobulin-sekretierend. Das Medium enthält 4500 mg Glukose pro Liter.The mouse myeloma cell line used in the present invention is characterized as follows: mouse myeloma, line P3 x 63 NS1, HPRT deficient, producing kappa, non-immunoglobulin secreting. The medium contains 4500 mg glucose per liter.

Die obige Linie wurde von The Human Genetic Mutant Cell Repository (unter der Katalognummer GM3573), Copewood and Davies Street, Camden, New Jersey, 08103, USA, erhalten. (NIH Publication Nr. 81-20011, überarbeitet im Oktober 1981).The above line was obtained from The Human Genetic Mutant Cell Repository (under catalog number GM3573), Copewood and Davies Street, Camden, New Jersey, 08103, USA. (NIH Publication No. 81-20011, revised October 1981).

medium

Die Myelomzellen wurden in einem Medium kultiviert, welches dieselbe Zusammensetzung aufweist, wie sie von zahlreichen anderen Forschern, z. B. Lovborg (1982), beschrieben wurde, unter Einsatz von RPMI 1640, 10% Kälberserum (neugeboren), enthaltend Penicillin, Streptomycin, Gentamycin zusammen mit Na-Pyruvat usw., wie beispielsweise von Lovborg (1982) beschrieben.The myeloma cells were cultured in a medium having the same composition as described by numerous other researchers, e.g. Lovborg (1982), using RPMI 1640, 10% calf serum (newborn) containing penicillin, streptomycin, gentamycin together with Na pyruvate, etc., as described for example by Lovborg (1982).

Storage of hybridoma cells

Die Ascitesflüssigkeiten, die die Hybridomzellen der gewünschten Spezifität enthalten, werden aus mehreren Mäusen (siehe Abschnitt: Klonieren und Kultivieren von Zellen) mittels Zentrifugation geerntet und einmal mit RPMI 1640 gewaschen und zentrifugiert. (Der verbleibende Rest der Ascitesflüssigkeit wird behandelt wie anderswo beschrieben, siehe Abschnitt: Isolierung von Immunglobulinen). Etwa 40·106 Zellen werden in 5 ml frischem Eagle's Medium (einschl. 20% Kälberserum) resuspendiert, wobei dem Ansatz ein gleicher Teil 19-20% DMSC in RPMI 1640 (Dimethylsulfoxid, Merck & Co.) tröpfenweise (10 Tropfen pro Minute) der Suspension unter Mischen zugegeben werden, um einer lokalen Erwärmung (welche für die Hybridomzellen schädigend sein könnte) vorzubeugen. Nach dem Mischen wird die die Hybridomzellen umfassende Suspension in 1 ml Ampullen, welche verschlossen und 24 Stunden lang bei 4ºC aufbewahrt werden, abgefüllt, wonach sie in einen N&sub2;-Behälter überführt werden, wodurch die Ampullen mit 1ºC pro Minute abgekühlt werden (gemäß den Anweisungen des Herstellers, welcher den sogenannten "Linde-Behälter" herstellt). Die Zellen in den Ampullen werden schließlich in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, vgl. Lovborg (1982).The ascites fluids containing the hybridoma cells of the desired specificity are harvested from several mice (see section: Cloning and Culturing Cells) by centrifugation and washed once with RPMI 1640 and centrifuged. (The remaining ascites fluid is treated as described elsewhere, see section: Isolation of Immunoglobulins). Approximately 40·106 cells are resuspended in 5 ml of fresh Eagle's medium (including 20% calf serum) with an equal portion of 19-20% DMSC in RPMI 1640 (dimethyl sulfoxide, Merck & Co.) added dropwise (10 drops per minute) of the suspension with mixing to prevent local heating (which could be damaging to the hybridoma cells). After mixing, the suspension containing the hybridoma cells is filled into 1 ml vials, which are sealed and stored at 4ºC for 24 hours, after which they are transferred to a N2 container, cooling the vials at 1ºC per minute (according to the instructions of the manufacturer, who produces the so-called "Linde container"). The cells in the vials are finally stored in liquid nitrogen, cf. Lovborg (1982).

Thawing the cells

Eine Ampulle wird durch Eintauchen in ein 37ºC warmes Wasserbad aufgetaut. Die Zellen werden nach Zentrifugation in neuem Medium resuspendiert und gezählt und auf einen Titer von 10&sup4;-10&sup5; Zellen pro ml eingestellt. Das Medium wird nach 24 Stunden oder möglicherweise früher gewechselt, wenn die Zellen sich bereits angeheftet haben. Das weitere Kultivieren ist detailliert von Lovborg (1982) beschrieben. Alternativ werden die aufgetauten Zellen (aus der Ampulle) direkt einer Balb/c-Maus injiziert (I.P.), wodurch neue Zellen und Ascitesflüssigkeit (enthaltend den gewünschten Antikörper) innerhalb von 3-7 Tagen (in Abhängigkeit der Menge injizierter Zellen) geerntet werden können.A vial is thawed by immersion in a 37ºC water bath. The cells are resuspended in new medium after centrifugation and counted and adjusted to a titer of 10⁴-10⁵ cells per ml. The medium is changed after 24 hours or possibly sooner if the cells have already attached. Further cultivation is described in detail by Lovborg (1982). Alternatively, the thawed cells (from the vial) are directly injected (I.P.) into a Balb/c mouse, allowing new cells and ascites fluid (containing the desired antibody) to be harvested within 3-7 days (depending on the amount of cells injected).

Mycoplasma test

Primäre humane Amnionzellen (erhalten von der gynäkologischen Abteilung) werden auf kleine Abdeckplatten (aus Glas) ausgesät, wobei die Abdeckplatten nach Anheftung fertig zum Gebrauch sind (die Zellen sollten sich nicht gegenseitig berühren, da eine Konfluenz die Empfindlichkeit zu verringern neigt). Die aus den Myelomzellen bestehende Probe wird auf die Oberfläche der Abdeckplatte aufgebracht (etwa 10 bis 15 Tropfen der Probe) mittels einer Pasteurpipette, und die (die Probe enthaltende) Abdeckplatte wird sorgfältig in eine Plastikfolie eingewickelt, um eine Verdampfung zu vermeiden. Sofern die ursprüngliche aus Myelomzellen bestehende Probe mit Mykoplasmen infiziert gewesen wäre, würden dieselben Mykoplasmen auch die Amnionzellen infizieren. Normalerweise weisen die letztgenannten keine Infektionen mit Mykoplasmen auf, sofern sie frisch verwendet werden. (Vgl. Kontrollkulturen). Am darauffolgenden Tag werden die Kulturen 2 Stunden lang mit "Hoechst Stain" gemäß den Färbevorschriften des Herstellers (Hoechst, BR Deutschland) gefärbt: 1-2 Körnchen des Farbstoffes werden in 5 ml Puffer bei pH 5,5 gelöst. Lediglich ein paar Tropfen sollten für die Färbung eingesetzt werden, da sich der pH-Wert (5,5) unterhalb des physiologischen Bereichs (7,2) bewegt. Das Färbemittel wird 2 Stunden lang mit den Zellen inkubiert, wonach die Zellen mit Methanol fixiert und getrocknet werden. Sofern die Amnionzellen mit den Mykoplasmen (von der ursprünglichen Probe stammend) infiziert worden sind, werden kleine fluoreszierende Partikel mit einem Fluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar und zeigen eine Infektion mit Mykoplasmen an. Wenn keine fluoreszierenden Partikel gefunden werden, ist es zu keiner Infektion gekommen. Eine Kontrollkultur (d. h. lediglich Amnionzellen) läuft ebenfalls mit. (Die letztere sollte negativ sein). Wenn in den Myelomzellen Mykoplasmen gefunden wurden, wurden sie verworfen und frische, von Mykoplasmen freie Myelomzellen wurden dem Zell-Gefrierschrank (Flüssigstickstoffbehälter) entnommen.Primary human amniotic cells (obtained from the gynecological department) are seeded onto small cover plates (made of glass), the cover plates being ready for use after attachment (the cells should not touch each other, as confluence tends to reduce sensitivity). The sample consisting of myeloma cells is applied to the surface of the cover plate (about 10 to 15 drops of sample) using a Pasteur pipette, and the cover plate (containing the sample) is carefully wrapped in plastic wrap to avoid evaporation. If the original sample consisting of myeloma cells had been infected with mycoplasma, the same mycoplasma would also infect the amniotic cells. Normally, the latter do not show any mycoplasma infections when used fresh. (See control cultures). The following day, the cultures are stained for 2 hours with "Hoechst Stain" according to the manufacturer's instructions (Hoechst, Germany): 1-2 grains of the dye are dissolved in 5 ml of buffer at pH 5.5. Only a few drops should be used for staining, as the pH value (5.5) is below the physiological area (7,2). The stain is incubated with the cells for 2 hours, after which the cells are fixed with methanol and dried. If the amniotic cells have been infected with the mycoplasma (from the original sample), small fluorescent particles will be clearly visible with a fluorescence microscope, indicating mycoplasma infection. If no fluorescent particles are found, no infection has occurred. A control culture (ie, amniotic cells only) is also run. (The latter should be negative). If mycoplasma was found in the myeloma cells, they were discarded and fresh myeloma cells, free of mycoplasma, were taken from the cell freezer (liquid nitrogen tank).

example 1

Eine weibliche Balb/c-Maus wurde immunisiert, wie im Abschnitt: Immunisierung (siehe ebenfalls Abschnitt: Herstellung von Immunogenen) beschrieben unter Einsatz von 100 000 Einheiten HuIFN-α (stabilisiert mit SDS) einschl. F.A., gefolgt von den üblichen wöchentlichen, 30-40 000 Einheiten umfassenden Zugaben (I.P.), und 3 Tage vor der Fusion erhielt die Maus schließlich eine Boosterdosis von 100 000 Einheiten wie zuvor beschrieben. Während der Dauer der Immunisierung wurden die "traditionellen" Neutralisationstiter (siehe Abschnitt: Neutralisierung) erhalten: Tabelle 1 Neutralisationstiter der immunisierten Mäuse Woche Neutralisationseinheiten/ml SerumA female Balb/c mouse was immunized as described in the Immunization section (see also the Preparation of Immunogens section) using 100,000 units of HuIFN-α (stabilized with SDS) including FA, followed by the usual weekly 30-40,000 unit booster doses (IP), and finally 3 days before fusion the mouse received a booster dose of 100,000 units as previously described. During the period of immunization the "traditional" neutralization titers (see the Neutralization section) were maintained: Table 1 Neutralization titer of immunized mice Week Neutralization units/ml serum

Nachdem die Fusion der Milzzellen aus dem immunisierten Tier mit den NS1-Zellen (siehe Abschnitt: Zellen) durchgeführt worden war, wurde die Anwesenheit von 62 lebenden Klonen durch mikroskopische Untersuchungen festgestellt (in Costar-Trägern, NUNC, Dänemark; vgl. Lovborg (1982)). Sämtliche Überstände (62) wurden durch das semi-feste Neutralisierungsverfahren (siehe besagter Abschnitt) untersucht und lediglich zwei (teilweise) positive Klone wurden gefunden. Die zwei Klone wurden weiter kultiviert und subkloniert, wobei während dieses Vorgehens (siehe Abschnitt: Klonieren und weiteres Kultivieren positiver Hybridomzellen) ein positiver Klon aufgrund eines Fehlers während des Klonierens verloren ging, der andere (LO-22) wurde weiter in Balb-c-Mäusen, wie zuvor beschrieben, propagiert, wodurch 5,5 ml Acsitesflüssigkeit zusammen mit einer großen Anzahl Hybridomzellen (nach 4 Wochen im Anschluß an die Injektion (I.P.) der primären subklonierten Hybridomzellen, die insgesamt auf 1000 geschätzt wurden, erhalten wurden. Nach der Isolierung wurden die suspendierten Zellen wie zuvor beschrieben 10 neuen Balb/c-Mäusen injiziert, und nach 7 Tagen wurde 65 ml Ascitesflüssigkeit zusammen mit einer großen Anzahl Hybridomzellen geerntet. Einige von ihnen waren gefroren und dienen als Stammkultur, andere wurden in neue Mäuse transplantiert. Sämtliche zellfreien Ascitesflüssigkeiten wurden gefällt und isoliert, wie im Abschnitt: Isolierung von Anti-HuIFN-α-Immunglobulinen beschrieben. (Mehrere Gramm wurden in dieser Stufe isoliert).After fusion of the spleen cells from the immunized animal with the NS1 cells (see section: Cells) was performed, the presence of 62 living clones was confirmed by microscopic examination (in Costar carriers, NUNC, Denmark; cf. Lovborg (1982)). All supernatants (62) were examined by the semi-solid neutralization procedure (see said section) and only two (partially) positive clones were found. The two clones were further cultured and subcloned, during which procedure (see section: Cloning and further culture of positive hybridoma cells) one positive clone was lost due to an error during cloning, the other (LO-22) was further propagated in Balb-c mice as described previously, yielding 5.5 ml of ascites fluid together with a large number of hybridoma cells (after 4 weeks following injection (I.P.) of the primary subcloned hybridoma cells, estimated at 1000 in total). After isolation, the suspended cells were injected into 10 new Balb/c mice as described previously, and after 7 days 65 ml of ascites fluid together with a large number of hybridoma cells were harvested. Some of them were frozen and serve as stock culture, others were transplanted into new mice. All cell-free ascites fluids were precipitated and isolated as described in the section: Isolation of anti-HuIFN-α immunoglobulins. (Several grams were isolated at this stage).

Während der obigen Experimente wurden semi-feste Neutralisierungsassays simultan durchgeführt. Die ersten beiden positiven Klone neutralisierten das native humane Leukozyten-Interferon (aus Virus-induzierten "buffy coats") lediglich teilweise, obgleich die Überstände der primären Hybridomkulturen mehr als 100-fach verdünnt werden konnten, ohne einen Endpunkt zu erreichen. Dieselbe Tendenz, auf einem sehr viel höheren Niveau, wurde festgestellt, wenn der LO-22 als Ascitestumor kultiviert wurde: bei einer Verdünnung von mehr als 10&sup7; wurde immer noch eine partielle Neutralisierung/Bindung beobachtet. (Siehe das semi-feste Neutralisierungsverfahren). Zu einem frühen Zeitpunkt dieser Experimente führten die mit dem semi-festen Bindungsassay erhaltenen oben genannten Bindungsergebnisse zu der Vorstellung, daß die Zellen des LO-22 lediglich einen Teil der Spezies von HuIFN-α erkennen können, was den Ergebnissen anderer Gruppen (vgl. Secher et al. (1980), Allan et al. (1980), Berg (1982)) entspricht und allgemein als wissenschaftlicher Konsenz anerkannt wurde.During the above experiments, semi-solid neutralization assays were performed simultaneously. The first two positive clones only partially neutralized native human leukocyte interferon (from virus-induced buffy coats), although the supernatants of the primary hybridoma cultures could be diluted more than 100-fold without reaching an endpoint. The same tendency, at a much higher level, was observed when the LO-22 was cultured as an ascites tumor: at a dilution of more than 10⁷, partial neutralization/binding was still observed. (See the At an early stage of these experiments, the above binding results obtained with the semi-tight binding assay led to the idea that the LO-22 cells can only recognize a subset of the HuIFN-α species, which is in line with the results of other groups (cf. Secher et al. (1980), Allan et al. (1980), Berg (1982)) and was generally accepted as scientific consensus.

Um mehr detaillierte und präzise Informationen über die Bindungsfähigkeiten des LO-22-Hybridom-Antikörpers zu erhalten, wurde entschieden, eine Antikörper-Affinitätschromatographie unter der Berücksichtigung durchzuführen, daß man lediglich von der Hälfte oder weniger des aufgetragenen Leukozyten-Interferons erwartet, das sie binden (vgl. die auf Seite 15 beobachtete partielle Neutralisierung).In order to obtain more detailed and precise information on the binding capabilities of the LO-22 hybridoma antibody, it was decided to perform antibody affinity chromatography, taking into account that only half or less of the applied leukocyte interferon would be expected to bind (cf. the partial neutralization observed on page 15).

Die Immunglobuline aus 3 ml Ascitesflüssigkeit der ursprünglichen Maus (welche lediglich etwa 1000 Zellen I.P. erhalten hatte) wurden isoliert (siehe Abschnitt: Isolierung von Anti-IFN-α-Immunglobulinen) und an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt (vgl. Berg (1977), Berg et al. (1980)), wie zuvor beschrieben. Die equilibrierte Säule wurde mit 90 ml rohem, nativem humanen Leukozyten-Interferon beladen und nach einem gründlichen Waschen wurde die Säule mittels eines niedrigen pH-Wertes eluiert. Die folgenden überraschenden und unerwarteten Ergebnisse wurden erhalten, siehe Tabelle 2: 96% des Interferons wurde aus der ursprünglichen Interferonpräparation (Input) entfernt. Basierend auf den mit den semi-festen Neutralisierungstests (siehe Tabelle 1) erhaltenen Ergebnissen hätte man das beinahe gegenteilige Ergebnis erwartet (d. h. von lediglich einer Portion wurde erwartet, daß sie durch die LO-22-Säule gefangen wird (z. B. 30%)). Tabelle 2 Antikörper-Affinitätschromatographie mit LO-22 Säule Volumen ml IFN-Einheiten humanes Syst. IFN-Einheiten bovines Syst. Wiedergewinnung % Input Waschflüssigkeit EluatImmunoglobulins from 3 ml of ascites fluid from the original mouse (which had received only about 1000 cells IP) were isolated (see section: Isolation of anti-IFN-α immunoglobulins) and coupled to CNBr-activated Sepharose (cf. Berg (1977), Berg et al. (1980)) as previously described. The equilibrated column was loaded with 90 ml of crude native human leukocyte interferon and after a thorough wash, the column was eluted using a low pH. The following surprising and unexpected results were obtained, see Table 2: 96% of the interferon was removed from the original interferon preparation (input). Based on the results obtained with the semi-solid neutralization assays (see Table 1), one would have expected almost the opposite result (ie, only one portion was expected to be captured by the LO-22 column (e.g., 30%)). Table 2 Antibody affinity chromatography with LO-22 column Volume ml IFN units human system IFN units bovine system Recovery % Input Wash liquid Eluate

Um die Bindungseigenschaften der LO-22-Säule weiter zu analysieren, wurde die Waschflüssigkeit (bestehend aus 2,0·10&sup5; humanen Interferoneinheiten, vgl. Tabelle 2) auf etwa 4 ml konzentriert (mittels Sucrose und Dialyse, vgl. Berg et al (1980)), bevor sie wieder auf die LO-22-Säule geladen wurde. Die zweite Waschflüssigkeit wurde sowohl im humanen als auch bovinen System titriert und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: weniger als 100 Einheiten (bovin) wurden nachgewiesen, wohingegen etwa 50 000 Einheiten (human) nachgewiesen wurden. Darüber hinaus war die zweite Waschflüssigkeit (bestehend aus etwa 50 000 humanen Einheiten) in der Lage, Anti-HuIFN-β im Rahmen des traditionellen Neutralisierungstests (siehe Abschnitt: Neutralisierung) vollständig zu neutralisieren. Das gereinigte Eluat der Tabelle 2 (bestehend aus 2,8·10&sup6; Einheiten (human)), war nicht in der Lage, das besagte Anti-HuIFN-β in einem analogen Neutralisierungstest überhaupt zu neutralisieren. Damit bestehen die in der zweiten Waschflüssigkeit gefundenen 50 000 Einheiten (human) aus einer anderen Spezies, nämlich HuIFN-β. Die obigen Resultate stimmen vollkommen überein mit beispielsweise Vilcek et al. (1977) und Berg (1982).To further analyze the binding properties of the LO-22 column, the wash (consisting of 2.0 105 human interferon units, see Table 2) was concentrated to approximately 4 ml (using sucrose and dialysis, see Berg et al (1980)) before being reloaded onto the LO-22 column. The second wash was titrated in both the human and bovine systems and the following results were obtained: less than 100 units (bovine) were detected, whereas approximately 50,000 units (human) were detected. In addition, the second wash (consisting of approximately 50,000 human units) was able to completely neutralize anti-HuIFN-β in the traditional neutralization test (see section: Neutralization). The purified eluate of Table 2 (consisting of 2.8·10⁶ units (human)) was not able to neutralize the anti-HuIFN-β in question in an analogous neutralization test. Thus, the 50,000 units (human) found in the second wash consist of a different species, namely HuIFN-β. The above results are in complete agreement with, for example, Vilcek et al. (1977) and Berg (1982).

Das Eluat aus der LO-22-Säule (Tabelle 2) wurde auf einem analytischen Dünnschicht SDS-PAGE (unter Einsatz von Gradientengelen, 12%-24%, 25 cm lang, vgl. Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)) analysiert, und es wurde ein im Vergleich mit den zuvor veröffentlichten Berichten identisches Muster der HuIFN-α-Spezies beobachtet. Somit wurden sämtliche Spezies von HuIFN-α gesehen (es war in der besonderen, in diesem Experiment verwendeten Charge keine "bovine" Spezies anwesend (vgl. Berg et al. (1982a), (1982b)). Das SDS-PAGE wurde gefärbt und die individuellen Banden herausgeschnitten und titriert und eluiert, wie zuvor von Berg et al. (1980), (1982a), (1982b) beschrieben, und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (Tabelle 3): Tabelle 3 Biologisches Profil eines mittels SDS-PAGE erhaltenen LO-22-Eluats Streifen Nr. Interferoeinheiten (WISH-Zellen) humane Einheiten Interferoeinheiten (BDVK-Zellen) bovine EinheitenThe eluate from the LO-22 column (Table 2) was analyzed on an analytical thin layer SDS-PAGE (using gradient gels, 12%-24%, 25 cm long, cf. Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)) and an identical pattern of HuIFN-α species was observed compared to previously published reports. Thus, all species of HuIFN-α were seen (no "bovine" species was present in the particular batch used in this experiment (cf. Berg et al. (1982a), (1982b)). The SDS-PAGE was stained and the individual bands excised and titrated and eluted as previously described by Berg et al. (1980), (1982a), (1982b) and the following results were obtained (Table 3): Table 3 Biological profile of LO-22 eluate obtained by SDS-PAGE Strip No. Interfero units (WISH cells) human units Interfero units (BDVK cells) bovine units

Es wurde bei allen 12 Spezies gefunden, daß sie sich in dem üblichen Molekulargewichtsbereich von 16.000-25.000 bewegen, was den zuvor beschriebenen Berichten betreffend die Lokalisierung und Anzahl der in einer HuIFN-α-Präparation anwesenden Spezies (Berg et al. (1982a), (1982b)) vollkommen entspricht. Wahrscheinlich ist die LO-22-Säule ebenfalls in der Lage, nicht zuvor nachgewiesene Spezies von HuIFN-α mit einem höheren Molekulargewicht zu erkennen, da Interferonaktivität enthaltende Fraktionen ebenfalls um 30.000 herum gefunden wurden (Fraktion 14, 15 und 16 lieferten 600 humane Einheiten/1000 bovine Einheiten, 1400/1800 bzw. 60/180). Diese Fraktionen werden derzeit eingehender untersucht.All 12 species were found to be in the usual molecular weight range of 16,000-25,000, which is in full agreement with previously described reports on the location and number of species present in a HuIFN-α preparation (Berg et al. (1982a), (1982b)). It is likely that the LO-22 column is also able to detect previously undetected species of HuIFN-α with a higher molecular weight, since Fractions were also found to be around 30,000 (fractions 14, 15 and 16 yielded 600 human units/1000 bovine units, 1400/1800 and 60/180 respectively). These fractions are currently being investigated in more detail.

Die obigen Ergebnisse (aus der Antikörper-Affinitätschromatographie) stehen irgendwie im Widerspruch zu den Ergebnissen, die mit dem semi-festen Neutralisierungsverfahren (Tabelle 1) erhalten wurden, die lediglich ein partielles Binden der Spezies von HuIFN-α an LO-22-Immunglobulin anzeigen. Momentan wird davon ausgegangen, daß der Grund für diesen Widerspruch auf der Qualität des beim Beschichten der Immunplatten verwendeten Antimaus- Immunglobulins von Kaninchen basiert (siehe Abschnitt: semifestes Neutralisierungsverfahren).The above results (from antibody affinity chromatography) are somewhat inconsistent with the results obtained using the semi-solid neutralization procedure (Table 1), which indicate only partial binding of the HuIFN-α species to LO-22 immunoglobulin. It is currently believed that the reason for this inconsistency is based on the quality of the rabbit anti-mouse immunoglobulin used in coating the immunoplates (see section: semi-solid neutralization procedure).

Die von den LO-232-Hybridomzellen produzierten Immunglobuline wurden als zur IgG-Klasse gehörend charakterisiert durch Ouchterloni-Tests, bei denen mehrere Fraktionen der Ascitesflüssigkeiten (und Überstände aus kultivierten LO-22-Zellen) gegen Antimaus-Immunglobuline aus Kaninchen (DAKO-PATT, Dänemark; Behring Werke, BR Deutschland) oder Antimaus-IgG F(ab)&sub2; aus Ziegen (Cappel) oder Anti-IgM (schwere Kette) der Ziege (Cappel) untersucht wurden. Mehrere Kontrollen wurden eingeschlossen (die NS1-Zellen lieferten erwartungsgemäß alleine keine positive Reaktion gegen beispielsweise IgG). Ein schweres Präzipitat wurde insbesondere zwischen den Hybridoma-Antikörpern LO-22 und dem Antimaus-IgG F(ab)&sub2;-Antiserum der Ziege (Cappel) gesehen.The immunoglobulins produced by the LO-232 hybridoma cells were characterized as belonging to the IgG class by Ouchterloni tests in which several fractions of the ascites fluids (and supernatants from cultured LO-22 cells) were tested against rabbit antimouse immunoglobulins (DAKO-PATT, Denmark; Behring Werke, BR Germany) or goat antimouse IgG F(ab)2 (Cappel) or goat anti-IgM (heavy chain) (Cappel). Several controls were included (the NS1 cells alone did not give a positive reaction against, for example, IgG, as expected). A heavy precipitate was seen in particular between the LO-22 hybridoma antibodies and the goat antimouse IgG F(ab)2 antiserum (Cappel).

Notes on Example 1

Die obigen, detailliert beschriebenen Experimente haben das Folgende bestätigt:The experiments described in detail above have confirmed the following:

1. Die LO-22-Hybridom-Antikörper-Säule erkennt (bindet) sämtliche Spezies von HuIFN-α mit den spezifischen Charakterisierungen, die dem HuIFN-α-System angehören. (Vgl. Berg (1982), Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)).1. The LO-22 hybridoma antibody column recognizes (binds) all species of HuIFN-α with the specific characterizations, which belong to the HuIFN-α system. (See Berg (1982), Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)).

2. Das humane Fibroblasten-Interferon HuIFN-β, von dem bekannt ist, daß es in geringen Mengen in einer rohen Aufbereitung von humanem Leukozyten-Interferon vorhanden ist (es ist gezeigt worden, daß etwa 1-2% der gesamten Interferonaktivität der Spezies HuIFN-β angehört; vgl. Bert et al. (1975)), wird nicht erkannt von der LO-22-Hybridom-Antikörper-Säule.2. The human fibroblast interferon HuIFN-β, which is known to be present in small amounts in a crude preparation of human leukocyte interferon (about 1-2% of the total interferon activity has been shown to belong to the HuIFN-β species; see Bert et al. (1975)), is not recognized by the LO-22 hybridoma antibody column.

Industrial applicability

Die monoklonalen Antikörper/Hybridomzellen (und die entsprechenden Hybridomzellen einschließlich abgeleiteter Hybridzellen), die in der Lage sind, Proteine (oder Teile derselben) zu erkennen, die antigenisch dem humanen Leukozyten-Interferon-System (HuIFN-α) angehören, können als "universelle" Antikörper zur Aufreinigung und Charakterisierung von sämtlichen oben genannten Proteinen, die dem HuIFN-α-System angehören, eingesetzt werden.The monoclonal antibodies/hybridoma cells (and the corresponding hybridoma cells including derived hybrid cells) that are able to recognize proteins (or parts thereof) that antigenically belong to the human leukocyte interferon system (HuIFN-α) can be used as "universal" antibodies for the purification and characterization of all of the above-mentioned proteins that belong to the HuIFN-α system.

Claims

1. A continuous cell line comprising hybridoma cells capable of producing monoclonal antibodies specific for at least one antigenic determinant common to the 12 human α-interferon species which exhibit activity in the human system and which have molecular weights of at least 16,000 by SDS-PAGE, excluding one species having a molecular weight of 16,600 described by Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, N.Y. 1982, pp. 397-416, available from:

a) immunizing an animal with a primary immunogen comprising human α-interferon proteins mixed with an effective amount of sodium dodecyl sulfate to denature said proteins, and

(b) subsequently removing at least one antibody-producing cell from that animal and fusing the genetic material from that antibody-producing cell with an immortal cell to form the hybridoma cell.

2. A monoclonal antibody specific for at least one of the antigenic determinants common to the 12 human α-interferon species which exhibit activity in the human system and have molecular weights of at least 16,000 by SDS-PAGE, excluding one species having a molecular weight of 16,600 described by Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, N.Y. 1982, pp. 397-416.

3. A process for the preparation of a hybridoma cell capable of producing monoclonal antibodies specific for at least one of the antigenic determinants common to the 12 human α-interferon species which Activity in the human system and have molecular weights of at least 16,000 in SDS-PAGE, excluding a species with a molecular weight of 16,600 described by Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, NY 1982, pp. 397-416, which comprises the steps

(b) subsequently removing at least one antibody-producing cell from said animal and fusing the genetic material from said antibody-producing cell with an immortal cell to form the hybridoma cell.

4. The method of claim 3, wherein the effective amount of sodium dodecyl sulfate is between about 0.01% and about 5% by volume of the immunogen.

5. Use of the hybridoma cells according to claim 1 for detecting human α-interferon in a human body fluid, which comprises the steps:

a) stimulating the hybridoma cells to produce the monoclonal antibodies;

b) contacting the monoclonal antibodies with the human body fluid suspected of containing the human α-interferon; and

c) Determine whether binding occurs between the monoclonal antibodies and the human body fluid,

6. Use of the monoclonal antibodies according to claim 2 for detecting human α-interferon in a human body fluid.