DE3485972T2

DE3485972T2 - Antigen aktive aminosaeuresequenzen.

Info

Publication number: DE3485972T2
Application number: DE8484900954T
Authority: DE
Inventors: Mario Geysen
Original assignee: Chiron Mimotopes Pty Ltd; Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut
Current assignee: Chiron Mimotopes Pty Ltd; Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut
Priority date: 1983-03-08
Filing date: 1984-03-08
Publication date: 1993-04-08
Anticipated expiration: 2004-03-09
Also published as: DE3485972D1

Description

Diese Erfindung betrifft die Identifizierung und chemische Synthese von Peptiden (oder Aminosäuresequenzen), welche die immunogene(n) Determinante(n) eines immunologisch wichtigen Hüllproteins VP1 des Maul- und Klauenseuche-Virus bilden und die Verwendung dieser Peptide beispielsweise bei der Herstellung von Impfstoffen und diagnostischen Reagenzien.
Bei der Suche nach wirksameren Mitteln zum Schutz gegen Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier wurden in den letzten 10 Jahren große Fortschritte gemacht. Es ist jetzt klar, daß Immunisierung möglich ist, wenn man eine isolierte Komponente des gesamten Erregers, wie etwa bei den Influenzavirus-Untereinheit-Impfstoffen verwendet.
Gegenwärtig sind Anstrengungen darauf gerichtet, die Größe der immunisierenden Komponente noch weiter zu verringern, zuerst auf das Polypeptid (Protein), welches den notwendigen Stimulator für das Immunsystem enthält und zweitens auf den Stimulator selbst. Durch rekombinante DNA-Technologie wurden Mittel bereitgestellt, zuverlässige Aminosäuresequenzen für biologisch wichtige Proteine einschließlich solcher Proteine, die aus natürlichen Quellen nicht einfach verfügbar waren, durch Translation aus den ermittelten Nukleotidsequenzen zu erhalten. Die Methoden zur Identifizierung der Bereiche eines Proteins, welche den oder die Stimulatoren oder die immunogene(n) Determinante(n) bilden, sind wenige und sehr zeitaufwendig und bilden den Engpaß für weiteren raschen Fortschritt.
Die Bestimmung der immunogenen Determinante(n) für biologisch wichtige Proteine, insbesondere Proteine, die aus Erregern von Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier stammen, wird als besonders wichtig betrachtet, da diese Determinanten, nachdem sie einmal identifiziert worden sind, einfach und ökonomisch synthetisiert werden können, um die erwünschten Peptidsequenzen zur Verwendung in Impfstoffen bereitzustellen, die einen hohen Grad an Spezifität aufweisen und die unerwünschte Wirkungen vermeiden, die aus nicht notwendigen Aminosäure- oder Peptidsequenzen stammen, die immer noch beispielsweise in Impfstoffen des Untereinheitstyps vorhanden sind.
Die Immunogenität eines Polypeptids kann als die Immunantwort definiert werden, die gegen eine begrenzte Anzahl immunogener Determinanten gerichtet ist, die auf wenige Stellen auf dem Polypeptidmolekül begrenzt sind (siehe Crumpton, M.J., in The Antigens (ed. Sela, M., Academic Press, New York, 1974); Benjamini, E. et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 58, 85-135 (1972); und Atassi, M.Z., Immunochemistry 12, 423-438 (1975)). Es wurde festgestellt, daß Antiseren, die gegen chemisch synthetisierte Peptide, die kurzen linearen Stücken der Polypeptidsequenz entsprechen, hergestellt worden sind, gut mit dem gesamten Polypeptid reagieren (siehe Green, N. et al., Cell 28, 477-487 (1982); Bittle, J.L. et al., Nature 298, 30-33 (1982); Dreesman et al., Nature 295, 158-160 (1982); Prince, A.M., Ikram, H., Hopp, T.P., Proc.Nat.Acad. Sci. USA 79, 579-582 (1982); Serner, R.A. et al., Proc.Nat. Acad.Sci. USA 78, 3403-3407 (1981); und Neurath, A.R., Kent, S.B.H., Strick, N., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 79, 7871-7875 (1982)). Es wurde jedoch festgestellt, daß Wechselwirkungen auftreten, sogar wenn der Ort der Wechselwirkung nicht mit den immunogenen Determinanten des nativen Proteins in Zusammenhang steht (siehe Green, N. et al., supra). Da Antikörper, die gegen das native Protein erzeugt werden, nach Definition gegen die immunogenen Determinanten gerichtet sind, folgt umgekehrt, daß ein Peptid, welches mit diesen Antikörpern wechselwirkt, mindestens einen Teil einer immunogenen Determinante enthalten muß.
Aus einer Untersuchung der wenigen Proteine, für welche die immunogenen Determinanten genau kartiert worden sind, ist klar, daß eine Determinante aus einer einzigen Sequenz (kontinuierlich) oder aus mehreren Sequenzen (diskontinuierlich) bestehen kann, die aus linear entfernten Regionen der Polypeptidkette durch Faltung dieser Kette, wie sie im nativen Zustand existiert, zusammengebracht werden können (siehe Atassi, M.Z., Immunochemistry 15, 909-936 (1978)). Wie im Falle von Lysozym bestehen mehrere der Elemente nur aus einer einzigen Aminosäure, demnach kann die Größe eines mitwirkenden Elements zwischen einer und der maximalen Zahl von Aminosäuren variieren, die mit den Ausmaßen der Antikörper-bindenden Stelle übereinstimmt und liegt wahrscheinlich in der Größenordnung von 5 bis 6 (siehe Atassi, M.Z., supra). Jede systematische Kartierung aller nachweisbarer antigener Elemente eines Polypeptids durch chemische Synthese von überlappenden Segmenten und Messung ihrer resultierenden Reaktivität mit Antiseren, die gegen das native Protein hergestellt worden sind, war bis jetzt stark durch das Ausmaß der erforderlichen Synthese- und Testkapazitäten behindert (siehe Atassi, M.Z., supra und Kazim, A.L., Atassi, M.Z., Biochem.J. 191, 261-264 (1980)).
Die genaue Lokalisierung von immunogenen Determinanten innerhalb der Aminosäuresequenz einiger weniger Proteine wurde durch eine oder mehrere der folgenden Prozeduren durchgeführt: (1) Antigenizitätsmessungen des gesamten Polypeptids oder davon isolierter Peptidfragmente vor und nach chemischer Modifizierung an spezifischen Resten, (2) Lokalisieren der Position in der Polypeptid-Aminosäuresequenz von Substitutionen, die durch Kultivierung des das Protein exprimierenden Virus in Gegenwart monoklonaler Antikörper selektioniert wurden und (3) Synthese und Test von Peptiden, die mit der Aminosäuresequenz von Regionen homolog sind, in denen man immunogene Aktivität vermutet. Diese letzte Methode gibt vermutlich die besten Möglichkeiten für eine umfassende Prozedur, die Synthese und Reinigung zahlreicher Peptide erfordert jedoch ein großes Maß an Fertigkeit und Zeit. Smith, J.A. et al., Immunochemistry 14, 565-568 (1977) umgingen die Entkopplungs- und Reinigungsschritte durch Kombination von Festphasen-Peptidsynthese und Festphasen-Radioimmuntest unter Verwendung desselben festen Trägers (siehe auch Hurrell, J.G.R., Smith, J.A., Leach, S.J., Immunochemistry 15, 297-302 (1978)). Mit dieser Prozedur waren sie in der Lage, die Orte der kontinuierlichen immunogenen Determinanten zweier Proteine zu bestätigen. Jedoch auch mit dieser vereinfachten Arbeitsweise würde jede systematische Suche nach Antikörperbindender Aktivität aller möglichen Hexapeptide sogar von einem relativ kleinen Protein wie dem Virusprotein 1 (VP1) des Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV), von dem bekannt ist, daß es 213 Aminosäuren hat, eine unakzeptabel lange Zeitdauer erfordern.
Der FMD-Virus, der zur Gattung Aphthovirus der Familie Picornaviridae gehört, besteht aus einer geordneten Aggregation von strukturell unabhängigen Untereinheiten, die ein Molekül infektiöser einzelsträngiger RNA umgeben. Unter relativ milden Bedingungen zerfällt der gesamte Partikel leicht, um die nackte RNA, 60 Kopien des VP4-Polypeptids und 12 Untereinheiten, bestehend aus einer geordneten Anordnung von jeweils 5 Kopien der Polypeptide VP1, VP2 und VP3 zu ergeben. Jede dieser strukturellen Untereinheiten kann weiter aufgespalten werden, um die isolierten Proteinkomponenten zu ergeben. Das VP1-Protein des FMD-Virus hat sich als immunologisch bedeutendes Hüllprotein des Virus erwiesen.
Nach Entwicklung neuer Techniken für die Festphasensynthese von Peptiden ist es jetzt möglich geworden, eine Methode für die gleichzeitige Synthese von Hunderten Peptiden auf festen Trägern zu entwickeln. Die Wechselwirkung von synthetisierten Peptiden mit Antikörpern wird dann auf einfache Weise nachgewiesen, ohne sie vom Träger zu entfernen. Eine bevorzugte Methode zur Festphasensynthese gemäß vorliegender Erfindung umfaßt die Verwendung eines polymeren Materials, wie etwa Polyethylen oder Polypropylen als Festphasenträger, auf den ein Vinylmonomer, welches mindestens eine funktionelle Gruppe zur Erzeugung polymerer Ketten auf dem Träger enthält, pfropfpolymerisiert wird. Die funktionellen Gruppen dieser polymeren Ketten werden dann umgesetzt, um primäre oder sekundäre Aminogruppen der Ketten bereitzustellen, und diese Aminogruppen werden schrittweise mit Aminosäureresten in geeigneter Reihenfolge umgesetzt, um ein erwünschtes synthetisches Peptid aufzubauen. Der Träger ist vorzugsweise in Form eines festen Polymerstabs mit einem Durchmesser von etwa 4 mm und einer Länge von etwa 50 mm. Eine Anzahl solcher Stäbe kann in einem geeigneten Halter in einem 12·8 Gitter gehalten werden, dessen Ausmaße denen der Standardmikrotiterplatte entsprechen, die für Enzym-gekoppelte Immuntests (ELISA) verwendet wird.
Als Ergebnis von unter Verwendung der obigen Technik jetzt durchgeführten Arbeiten wurden Peptide, die immunogene Determinante(n) des VP1 Hüllproteins einer Anzahl von wichtigen Serotypen des Maul- und Klauenseuche-Virus bilden, identifiziert und chemisch synthetisiert.

Anmerkung:

In dieser Beschreibung werden Aminosäurereste durch die 3- Buchstaben-Abkürzung oder durch den 1-Buchstaben-Code wie folgt bezeichnet: Aminosäure 3Buchstaben-Abkürzung 1-Buchstaben-Symbol Alanin Arginin Asparagin Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin
In weiterem Sinne stellt die vorliegende Erfindung ein synthetisches Peptid bereit, welches die Antigenizität des VP1- Proteins des Maul- und Klauenseuche-Virus aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil des Peptids aus der Gruppe, bestehend aus antigen aktiven 5, 6 oder 7 Aminosäuren langen Sequenzen des VP1-Proteins und antigen aktiven modifizierten Sequenzen (wie im folgenden definiert) davon ausgewählt ist.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptid bereitgestellt, das die Antigenizität des VP1-Proteins des Maul- und Klauenseuche-Virus Typ O&sub1; aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe, bestehend aus:
(i) G - D - L - Q - V - L - A;
(ii) G - D - L - Q - V - L;
(iii) D - L - Q - V - L - A;
(iv) D - L - Q - V - L und
(v) antigen aktiven modifizierten Sequenzen (wie im folgenden definiert) auf Basis einer der obigen Sequenzen (i) bis (iv) ausgewählt ist.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptid bereitgestellt, das die Antigenizität des VP1-Proteins des Maul- und Klauenseuche-Virus Typ A&sub1;&sub0; (A&sub6;&sub1;) aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe, bestehend aus:
(i) G - D - L - G - S - I - A;
(ii) G - D - L - G - S - I;
(iii) D - L - G - S - I - A;
(iv) D - L - G - S - I und
(v) antigen aktiven modifizierten Sequenzen (wie im folgenden definiert) auf Basis einer der obigen Sequenzen (i) bis (iv) ausgewählt ist.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Peptid bereitgestellt, das die Antigenizität des VP1-Proteins des Maul- und Klauenseuche-Virus Typ C1 aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe, bestehend aus:
(i) D - L - A - H - L - T - A;
(ii) D - L - A - H - L - T;
(iii) L - A - H - L - T - A;
(iv) L - A - H - L - T und
(v) antigen aktiven modifizierten Sequenzen (wie im folgenden definiert) auf Basis einer der obigen Sequenzen (i) bis (iv) ausgewählt ist.
Die hier verwendete Bezeichnung "antigen aktive modifizierte Sequenzen" wird zur Beschreibung von Aminosäuresequenzen benutzt, die auf einer der Sequenzen (i) bis (iv) des ersten, zweiten oder dritten Gesichtspunkts der Erfindung, wie oben beschrieben, basieren, aber in denen eine der Aminosäuren in der Sequenz durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, so daß eine modifizierte Sequenz bereitgestellt wird, die antigen aktiv ist.
Antigen aktive modifizierte Sequenzen gemäß dem ersten Gesichtspunkt dieser Erfindung beinhalten Hexapeptidsequenzen auf Basis der Formel:
worin
G an Position (1) durch A, H, I, K, M, N, P, Q, S oder T ersetzt ist, oder
D an Position (2) durch A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V oder Y ersetzt ist, oder
Q an Position (4) durch D, K, A, M, E, N, S oder R ersetzt ist, oder
V an Position (5) durch A, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, R, S, T oder Y ersetzt ist.
Antigen aktive modifizierte Sequenzen gemäß dem zweiten Gesichtspunkt dieser Erfindung beinhalten Hexapeptidsequenzen auf Basis der Formel:
worin:
G an Position 1 durch A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W oder Y ersetzt ist, oder
D an Position 2 durch L ersetzt ist, oder
G an Position 4 durch A ersetzt ist, oder
S an Position 5 durch T, G oder A ersetzt ist, oder
I an Position 6 durch A, C, D, E, F, K, L, M, Q, R, S, T, V, W oder Y ersetzt ist.
Antigen aktive modifizierte Sequenzen gemäß dem dritten Gesichtspunkt dieser Erfindung beinhalten Hexapeptidsequenzen auf Basis der Formel:
worin:
D an Position 1 durch H oder V ersetzt ist, oder
H an Position 4 durch A, C, D, E, F, K, L, M, N, Q, R, S, T, V oder Y ersetzt ist, oder
T an Position 6 durch S ersetzt ist.
Um zu dieser Erfindung zu gelangen, wurde die gleichzeitige chemische Synthese aller möglichen Hexapeptide, welche die Gesamtsequenzen der VP1-Hüllproteine des FMD-Virus der Typen O&sub1;, A&sub1;&sub0; (oder A&sub6;&sub1;) und C&sub1; darstellen, mit einer Überlappung von 5 Aminosäuren zwischen benachbarten Peptiden in der Sequenz unter Verwendung der oben beschriebenen Festphasen-Synthesetechnik vollendet. Die immer noch an den für ihre Synthese verwendeten Träger gebundenen synthetischen Peptide wurden auf Antikörperbindungsaktivität durch ELISA getestet, um eine vollständige Karte aller reaktiver Sequenzen der VP1- Proteine bei einer Auflösung von 6 Aminosäuren zu erzeugen. Eine Peptidlänge von 6 Aminosäuren wurde unter Berücksichtigung der folgenden Faktoren gewählt:
1. Es wurden bereits Antikörperwechselwirkungen mit Hexapeptiden gezeigt,
2. je länger das Peptid ist, desto größer ist die Möglichkeit, daß es sich in eine Sekundärstruktur faltet, wobei diese Faltung nicht notwendigerweise diejenige ist, die im nativen Protein auftritt,
3. bei der Synthese nimmt die Ausbeute des erwünschten Peptids ab, wenn die Zahl der Kopplungsreaktionen ansteigt, und
4. je kleiner die synthetisierte Sequenz ist, desto größer ist die Genauigkeit bei der Spezifizierung der Grenzen einer gefundenen aktiven Sequenz innerhalb der Gesamtsequenz.
Wie oben ausgeführt, sind die Peptide gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Peptids eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den oben beschriebenen Gruppen (i) bis (v), enthält. Die Durchführung von Tests, insbesondere unter Verwendung der ELISA-Technik, hat die Aktivität dieser Aminosäuresequenzen durch ihre Reaktivität mit Antiseren bestätigt. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß obwohl die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide Sequenzen enthalten können, die nur 5, 6 oder 7 Aminosäuren lang sind, sich die vorliegende Erfindung auch auf synthetische Peptide erstreckt, in denen eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren an einem oder beiden Enden der definierten Sequenz, d. h. entweder am Carboxyl (COOH)-Ende oder am Amino (-NH&sub2;)-Ende oder an beiden Enden enthalten sind. Obwohl solche zusätzlichen Aminosäuren keine direkte Rolle bei der Erhöhung der immunogenen Aktivität der definierten Aminosäuresequenz spielen müssen, können sie beispielsweise als Spacer-Aminosäuren wirken, so daß ein Abstand der antigen aktiven Aminosäuresequenz von den freien Carboxylund/oder freien Aminoenden der Sequenz gebildet wird.
Nach Identifizierung der antigen aktiven Aminosäuresequenzen der VP1-Proteine wurden die erfindungsgemäßen modifizierten Sequenzen auf ähnliche Weise synthetisiert und unter Verwendung der ELISA-Technik getestet. Wie zuvor beschrieben, wurde jede dieser modifizierten Sequenzen durch Ersetzen einer Aminosäure in der ursprünglichen Sequenz durch eine andere Aminosäure erhalten.
Die Peptide gemäß vorliegender Erfindung können chemisch aus ihren Aminosäurebestandteilen synthetisiert werden. Diese Synthese kann beispielsweise durch die Merrifield-Festphasenmethode durchgeführt werden, wie in J.A.C.S 85, 2149-2154 (1963) beschrieben ist. Bei der Merrifield-Festphasenmethode wird die C-terminale Aminosäure an Chlor-methylierte Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymerkügelchen gebunden. Jede nachfolgende Aminosäure wird, sofern notwendig mit einer geeigneten Schutzgruppe, schrittweise an die wachsende Kette angefügt. Wie in dem Merrifield-Artikel beschrieben, kann die Schutzgruppe beispielsweise eine t-Butyloxycarbonyl oder Carbobenzoxygruppe sein. Durch die Prozedur einer Kopplung, Schutzgruppenentfernung und Kopplung der nächsten Aminosäure kann die gewünschte Aminosäuresequenz und Kettenlänge erzeugt werden. Als Schlußschritt wird die Schutzgruppe von der N-terminalen Aminosäure entfernt und die C-terminale Aminosäure wird von den Trägerkügelchen abgespalten, wobei ein geeignetes Reagenz, wie etwa Trifluoressigsäure und Bromwasserstoff, verwendet wird. Andererseits kann die Synthese durch eine Festphasenmethode erfolgen, bei der die synthetische Peptidstruktur auf einem Festphasenträger aufgebaut wird, der ein polymeres Material enthält, beispielsweise einen Polyethylenstab oder -stift, an den ein Vinylmonomer, beispielsweise durch γ-Bestrahlung von Acrylsäure, Acrylnitril oder Acrylamidmonomeren pfropfpolymerisiert worden ist. Dann wird ein einfach geschütztes Diamin, wie etwa Lysin oder Lysin-Alanin, mit der auf dem Festphasenträger gebildeten polymeren Kette umgesetzt und das synthetische Peptid dann durch schrittweise Reaktion von Aminosäuren auf dieselbe Weise wie bei der oben beschriebenen Merrifield-Methode aufgebaut.
Obwohl der Schlußschritt bei beiden oben genannten Methoden die Entfernung des synthetischen Peptids vom Festphasenträger oder Unterstützungsmaterial durch eine Spaltungsreaktion unter Verwendung eines geeigneten Reagenz ist, sollte festgehalten werden, daß es für manche Anwendungsformen der Peptide gemäß vorliegender Erfindung gebräuchlich, wenn nicht sogar notwendig ist, daß die chemisch synthetisierten Peptide in Form eines Produkts verwendet werden, bei dem das Peptid mit einem Festphasenträger oder einem Unterstützungsmaterial gekoppelt oder verknüpft ist. Bei solchen Anwendungsformen wird natürlich der letzte Spaltungsschritt weggelassen. Derartige antigen aktive, chemisch synthetisierte Peptide, die auf einem Festphasenträger oder einem Unterstützungsmaterial immobilisiert sind, sind besonders bei Durchführung von immunchemischen Tests, wie etwa Enzymimmuntests (EIA) nützlich.
Die immunogenen synthetischen Peptide gemäß vorliegender Erfindung können die Basis liefern, auf der die Herstellung von synthetischen Impfstoffen gegen Maul- und Klauenseuche- Viren entwickelt werden kann. Solche synthetischen Impfstoffe würden insofern besondere Vorteile aufweisen, da sie frei von Aminosäuresequenzen, die den gesamten Aminosäuresequenzen des viralen Proteins entsprechen und auch frei von biologisch erzeugten Materialien und von aktiven oder inaktivierten viralen Rückständen hergestellt werden könnten. Die Verwendung synthetischer Peptide als Basis für Impfstoffe wird beispielsweise von Beale, J. in Nature 298, 14-15 (1982) und Sutcliffe, J.G. et al. in Science 219, 660-666 (1982) diskutiert. Bei der Herstellung eines synthetischen Impfstoffs könnten die synthetischem Peptide gemäß vorliegender Erfindung entweder alleine, in Kombination und/oder in Verbindung mit einem physiologisch verträglichen Träger und/oder Adjuvans verwendet werden. Die synthetischen Peptide gemäß vorliegender Erfindung haben auch die Möglichkeit zum Einsatz bei einer Reihe anderer Anwendungsformen auf dem Feld der Immunologie, einschließlich der Anwendung bei diagnostischen und anderen immunologischen Testprozeduren, insbesondere bei immunochemischen Tests, wie etwa Enzymimmuntests.
Weitere Einzelheiten der erfindungsgemäßen Peptidverbindungen, des Verfahrens zu ihrer Herstellung und ihrer antigenen Wirksamkeit werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

Beispiel 1

A. Herstellung von Hexapeptiden

Die 213 Aminosäuren lange Sequenz von VP1 (FMDV, Typ O&sub1;), wie durch Kurz, C. et al., Nucleic Acid Research 9, 1919-1931 (1981) translatiert, wurde in alle möglichen Hexapeptideinheiten unterteilt und jede Hexapeptideinheit wurde auf einem Polyethylenträger in derselben Orientierung und mit einem 2 Aminosäuren langen Spacer, wie in Fig. 1 veranschaulicht, synthetisiert.
In eine 6%ige (v/v) wäßrige Lösung von Acrylsäure eingetauchte Polyethylenstäbe wurden bei einer Dosis von 1 Mrad mit γ-Strahlen bestrahlt (siehe Müller-Schulte, D. Horster, F.A., Polymer Bulletin 7, 77-81 (1982)). Unter Verwendung gebräuchlicher Methoden der Festphasen-Peptidchemie (siehe Erickson, B.W., Merrifield, R.B. in "The Proteins", Vol. 2, 255-257, Academic Press, New York (1976), Meienhofer, J., in "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, 45-267, Academic Press, New York (1973)) wurde Nα-t-Buyloxycarbonyl-L-Lysinmethylester an die Polyethylenpolyacrylsäure (PPA) über die N- Aminogruppe der Seitenkette gekoppelt. Danach folgte die Kopplung von Boc-Alanin, um einen peptidartigen Spacer zu vervollständigen. Die Aminosubstitution des Trägers wurde durch Reaktion von NH&sub2;-Lysin-(OMe)-PPA mit C¹&sup4; markierter Buttersäure bestimmt und mit 8 bis 10 nmol/Stab ermittelt.
Durch gebräuchliche Festphasen-Peptidsynthese wurden schrittweise Aminosäuren angefügt, wie es durch die zu synthetisierende Sequenz erforderlich war. Bei Beendigung der letzten Kopplungsreaktion und nach Entfernung der t-Butyloxycarbonyl(Boc)-Schutzgruppe wurde die terminale Aminogruppe mit Essigsäureanhydrid in einem Dimethylformamid(DMF)/Triethylethylamin-Gemisch acetyliert. Alle Dicyclohexylcarbodiimid vermittelten Kopplungsreaktionen wurden in DMF in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol durchgeführt. Es wurden die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen verwendet: O-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Tyrosin, Carbobenzoxy für Lysin, Tosyl für Arginin, 4-Methylbenzyl für Cystein und 1-Benzyloxycarbonylamido-2,2,2-trifluorethyl für Histidin. Die Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen wurde durch Behandlung mit Bortris(trifluoracetat) in Trifluoressigsäure für 90 Minuten bei Raumtemperatur erreicht (siehe Pless, J., Bauer W., Angewandte Chemie 85, 142 (1973)). Nach Hydrolyse in HCl/Propionsäure bestätigte eine von in der Synthese als Kontrollen enthaltenen Sequenzen, daß in jeder Stufe Kopplung eingetreten war. Vor einem Test durch Elisa wurden Stab-gekoppelte Peptide mehrere Male in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen.

B. Test von Hexapeptiden

Die antigenen Profile für die wie oben in A. beschrieben hergestellten Hexapeptide sind in Fig. 2 als vertikale Linie, die proportional zu der gemessenen ELISA-Extinktion ist, über der Zahl gezeigt, welche die Lokalisierung der N-terminalen Aminosäure des Peptids innerhalb der VP1-Sequenz angibt. Zur Erzeugung der gezeigten unterschiedlichen Profile verwendete Antiseren waren wie folgt:
(a) und (b) zwei unterschiedliche, die gegen das intakte Viruspartikel Typ O&sub1; gerichtet waren,
(c) gegen das intakte Viruspartikel gerichtet, wie in (b) verwendet, nach Absorption mit vollständigem gereinigtem Virus Typ O&sub1;,
(d) gegen Virus Typ O&sub1;-Untereinheit gerichtet,
(e) gegen VP1 Typ O&sub1; gerichtet und
(f) gegen intaktes Viruspartikel Typ C&sub1; gerichtet.
Der enzymgekoppelte Immunosorbenstest wurde zum Test jedes stabgekoppelten Peptids (RCP) auf Reaktivität mit jedem der oben beschriebenen, definierten Antiseren verwendet. Die RCPs wurden mit 10% Pferdeserum, 10% Ovalbumin und 1% Tween-80 in PBS für 1 Stunde bei 37ºC zur Blockierung unspezifischer Absorption von Antikörpern vorbeschichtet. Einer Inkubation bei 4ºC über Nacht in Antiserum, das 1:40 in der Vorinkubationsmischung verdünnt worden war, folgten 3 Waschungen in 0,05% Tween-80/PBS. Einer einstündigen Reaktion bei 37ºC mit dem geeigneten Anti-Kaninchen-IgG-Immunoglobulin, gekoppelt an Meerrettichperoxidase, 1:50000 in der Vorinkubationsmischung verdünnt, folgte wiederum eine gründliche Waschung in PBS/Tween, um überschüssiges Konjugat zu entfernen. Das Vorhandensein von Antikörper wurde durch 45-minütige Reaktion mit einer Entwicklerlösung (40 mg Orthophenylendiamin, 20 ul Wasserstoffperoxid in 100 ml Phosphatpuffer, pH 5,0) bestimmt und die erzeugte Farbe in einem Titertek Multiscan bei 420 nm abgelesen. Nach den Tests wurden die Peptide 3 · in 8 M Harnstoff mit 0,1% 2-Mercaptoethanol und 0,1% Natriumdodecylsulfat bei 37ºC gewaschen, gefolgt von mehreren Waschgängen in PBS, um alle Spuren von gebundenem Antikörper zu entfernen. Anschließend waren die RCPs zu einem weiteren Test mit unterschiedlichen Antiseren bereit.
Antiseren gegen intakte Viruspartikel wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit 50 ug inaktiviertem, gereinigtem Virus in vollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt. Die Tiere wurden 3 bis 4 Wochen nach der einzigen Impfung ausgeblutet. Antiserum gegen Virusuntereinheiten (Kaninchen) wurde durch dreimalige Immunisierung in 3- bis 4-wöchigem Abstand mit 10 ug säurezerstörtem, gereinigtem Virus, anfänglich in vollständigem Freund'schem und nachfolgend in unvollständigem Freund'schem Adjuvans hergestellt. Das Polypeptid VP1 wurde aus dem Gemisch von Proteinen abgetrennt, das aus mit Harnstoff zerstörtem, gereinigtem Virus durch isoelektrische Fokussierung erhalten wurde (siehe Barteling, S.J., Wagenaar, F., Gielkens, A.L.J., J.Gen.Virol. 62, 357-361 (1982)). Nach Elution aus dem Gel mit 8 M Harnstoff und Dialyse gegen PBS wurde ein Antiserum, wie oben für 12S beschrieben, hergestellt. Antiserum für Test (c) war dasjenige, das für Test (b) verwendet wurde, aber nach Absorption mit gereinigtem Virus (1500 ug vollständiger Virus wurde mit 1 ml Serum für 72 Stunden bei 4ºC inkubiert), und alle virusgebundenen Antikörper wurden durch Zentrifugation entfernt.

C. Identifizierung des Viruspartikelassoziierten antigenen Peptids

Von den 4 getesteten, gegen intakte Viruspartikel gerichteten Antiseren zeigen die Tests (a) und (b) die Extreme in den gefundenen Reaktivitätsmustern. Es wurde bereits von großen quantitativen Unterschieden in der Antwort auf eine identische Antigenpräparation berichtet, diese Tests heben jedoch die mögliche Variabilität in der Antikörperzusammensetzung zwischen Seren hervor. Aus einer Untersuchung der Tests (a), (b) und (c) geht hervor, daß mit den Peptiden Nr. 146 und 147 reaktive Antikörper in den gesamten Seren gegen intakten Virus vorhanden sind, aber nach Absorption mit gereinigtem Virus fehlen. Diese gleichen Antikörper werden nicht bei den gegen Untereinheiten gerichteten Antiseren, Test (d), beobachtet und sie sind nur schwach in den Anti-VP1-Seren, Test (e), vorhanden. Daß eine gewisse Aktivität in den Anti-VP1- Seren gefunden wurde, weist möglicherweise auf die, wenn auch schwache Immunisierungskapazität des isolierten Proteins hin (siehe Kleid, D.G. et al., Science 214, 1125-1129 (1981)). Es sollte jedoch angemerkt werden, daß ein anderes ebenfalls getestetes Anti-VP1-Serum nichts an den Positionen Nr. 146 und 147 zeigte, obgleich es eine starke Aktivität an Position Nr. 148 behielt. Das Übereinanderlegen von Test (c) auf Test (b) (absorbiert im Vergleich zu nicht absorbiert) zeigt, daß zusätzlich zum Aktivitätsverlust gegen Peptide Nr. 146 und 147 eine Verringerung der Aktivität gegen Peptide Nr. 5, 6 und 206 ebenfalls eintrat. Davon wurde eine Aktivität gegen Nr. 5 und Nr. 6 in keinem der gegen intakten Virus gerichteten Antiseren gefunden, während Aktivität gegen Nr. 206 unveränderlich vorhanden war.
Aus diesen Ergebnissen kann man folgern, daß von den Sequenzen, bei denen man Reaktivität gefunden hat, das Paar an Nr. 146 und 147, d. h. die Hexapeptide Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu (G - D - L - Q - V - L) und Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala (D - L - Q - V - L - A) die Hauptstellen bilden, wobei ein geringer Beitrag von der Stelle an Nr. 206 stammt, was mit den Beobachtungen von anderen übereinstimmt. Hinsichtlich der Stellen an den Nummern 146 bis 7 unterscheiden wir jedoch nicht zwischen den beiden Möglichkeiten, erstens, daß das aktive Element 5 Aminosäuren lang ist, d. h. die beiden gemeinsame Sequenz Asp-Leu-Gln-Val-Leu (D - L - Q - V - L), oder zweitens, daß das aktive Element 7 Aminosäuren lang ist, d. h. die Kombination der beiden Hexapeptide Gly-Asp-Leu-Gln-Val-Leu-Ala (G - D - L - Q - V - L - A).

Beispiel 2

A. Herstellung von Hexapeptiden

Die 212 Aminosäuren lange Sequenz von VP1 (FMDV Typ A&sub1;&sub0; oder A&sub6;&sub1;) wurde in 207 Hexapeptide unterteilt. Diese Hexapeptide wurden, wie im obigen Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert, abgesehen davon, daß die Seitenkette von Arginin durch die p- Methoxybenzolsulfonylgruppe geschützt wurde.

B. Test von Hexapeptiden

Die antigenen Profile für die Hexapeptide sind in Fig. 3 gezeigt. Die zur Erzeugung der Profile verwendeten Antiseren waren:
(a) gegen intaktes Viruspartikel Typ A&sub1;&sub0; gerichtet,
(b) gegen intaktes Viruspartikel gerichtet, wie in (a) verwendet, nach Adsorption mit gereinigtem vollständigem FMDV Typ A&sub1;&sub0;.
Der Test der Hexapeptide und die Herstellung der Seren waren im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben.

C. Identifizierung des Viruspartikel-assoziierten aktiven Elements

Durch Überlegungen, die zu denen in Beispiel 1 verwendeten identisch waren, ist zu schließen, daß die Hexapeptide Gly- Asp-Leu-Gly-Ser-Ile (G - D - L - G - S - I) und Asp-Leu-Gly- Ser-Ile-Ala (D - L - G - S - I - A) die Hauptstellen für die antigene Determinante des FMDV Typ A sind.
Wie im falle des FMD-Virus Typ O&sub1;, beschrieben in Beispiel 1, unterschieden wir nicht zwischen diesen beiden Sequenzen und demgemäß kann man folgern, daß es möglich ist, daß die aktive Sequenz 5 Aminosäuren lang ist, d. h. Asp-Leu-Gly-Ser-Ile (D - L - G - S - I) oder daß sie 7 Aminosäuren lang ist, d. h. Gly- Asp-Leu-Gly-Ser-Ile-Ala (G - D - L - G - S - I - A).

Beispiel 3

A. Herstellung von Hexapeptiden

Die 210 Aminosäuren lange Sequenz von VP1 (FMDV Typ C&sub1;) wurde in 205 Hexapeptide unterteilt. Diese Hexapeptide wurden, wie im obigen Beispiel 2 beschrieben, synthetisiert.

B. Test von Hexapeptiden

Die antigenen Profile für die Hexapeptide sind in Fig. 4 gezeigt. Die zur Erzeugung der Profile verwendeten Antiseren waren:
(a) gegen intaktes Viruspartikel Typ C&sub1; gerichtet
(b) gegen intaktes Viruspartikel gerichtet, wie in (a) verwendet, nach Absorption mit gereinigtem vollständigem FMDV Typ C&sub1;.
Der Test der Hexapeptide und die Herstellung der Seren waren im wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

C. Identifizierung von Viruspartikelassoziierten aktiven Elementen

Durch gleiche Überlegungen wie in Beispiel 1 kann man folgern, daß das Hexapeptid Asp-Leu-Ala-His-Leu-Thr (D - L - A - H - U - T) die Hauptstelle für die antigene Determinante von FMDV Typ C ist.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Möglichkeit einer systematischen Musterung einer Polypeptidsequenz. Sie weisen auf die wahrscheinliche Stelle der aktiven Determinante hin, die sich innerhalb des Peptids befindet und mit der Bittle, J.L. et al., Nature 298, 30-33 (1982) einen erfolgreichen Schutz in Meerschweinchen gegenüber einer nachfolgenden Infektion durch FMDV erhielten.

Beispiel 4

A. Herstellung von Peptiden mit Ersatzaminosäuren

Die Synthesemethode von Beispiel 1 wurde zur Synthese von 120 Hexapeptiden verwendet, von denen jedes aus 5 ursprünglichen Aminosäuren des antigenen Hexapeptids G - D - L - Q - V - L (Typ O&sub1;) besteht, und die andere Aminosäure systematisch durch jede der 20 möglichen, natürlich vorkommenden, genetisch kodierten Aminosäuren ersetzt wird. Dieses Ersetzen wurde wiederum an jeder der 6 Positionen im Peptid durchgeführt. Somit enthielten die 120 Peptide 6 Kopien der ursprünglichen Sequenz und 114 Variationen der ursprünglichen Sequenz, wobei sich jede der 114 Variationen nur in einer Aminosäure von der ursprünglichen Sequenz unterschied. Diese Strategie ist schematisch in Fig. 5 dargestellt.

B. Test von Peptiden mit Ersatzaminosäuren

Es wurde der ELISA-Test von Beispiel 1 verwendet, um die 120 Peptide gegen ein Antiserum zu testen, von dem bekannt ist, daß es mit der ursprünglichen Sequenz reagiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 und Tabelle 1 gezeigt. In Fig. 6 ist die Antikörper-bindende Aktivität für jedes Peptid als vertikale Linie proportional zur erhaltenen ELISA-Extinktion gezeigt. Innerhalb einer Gruppe von 20 Linien entspricht die linke Linie der Substitution des ursprünglichen Rests durch Alanin (A), und die rechte Linie steht für die Substitution durch Tyrosin (Y). Die dazwischenliegenden Linien sind in alphabetischer Reihenfolge gemäß dem 1-Buchstaben-Code für jede Aminosäure. Jede Gruppe von 20 Linien entspricht dem vollständigen Satz des Ersetzens für eine der 6 Positionen des Nterminalen Rests im Hexapeptid G - D - L - Q - V - L. Man kann sehen, daß die Aminosäuren an bestimmten Positionen in der Sequenz einfach ohne Verlust der Antigenizität ersetzt werden können, während an anderen Positionen ein Ersetzen ohne teilweisen oder vollständigen Verlust der Antigenizität nicht möglich ist. Diejenigen, Ersetzungen enthaltenden Peptide, bei denen Antigenizität erhalten bleibt, sind Kandidaten zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen.
C. Die obigen Herstellungs- und Testmethoden von A. und B. wurden mit den antigenen Hexapeptiden G - D - L - G - S - I (Typ A&sub1;&sub0;) und D - L - A - H - L - T (Typ C&sub1;) wiederholt - siehe Fig. 5. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 5

Die ausgewählten antigenen Peptide von jedem der 3 FMDV-Typen wurden mit einer Reihe von Verbindungsaminosäuren am N-terminalen Ende und mit der Verbindungsaminosäure Lysin am C-terminalen Ende synthetisiert. Die Aminosäuren in den Verbindungen treten in den nativen Sequenzen in diesen Positionen nicht auf. Die synthetisierten Peptide wurden an einen Proteinträger gekoppelt und zum Zwecke der Immunisierung von Tieren mit einem Adjuvans gekoppelt. Der Träger war Keyhole- Limpet-Hämocyanin (KLH) und das Adjuvans war entweder ein Adjuvansöl oder Aluminiumhydroxidgel.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von serologischen Tests an immunisierten Kaninchen. Sie zeigt, daß das Kaninchen in jedem Fall eine erhebliche Menge an Antikörper erzeugte, der in der Lage war, mit FMDV zu reagieren und die Infektiosität von FMDV zu neutralisieren.

Beispiel 6

Es wurde ein Schutztest unter Verwendung von Meerschweinchen als Modell durchgeführt, da Meerschweinchen für eine Infektion mit FMDV empfänglich sind. Das zur Immunisierung verwendete Peptid war C - G - D - L - Q - V - L - A - K, das aus dem Heptapeptid G - D - L - Q - V - L - A von FMDV Typ O&sub1; (Reste 146-152), einem Cysteinlinker am N-terminalen Ende und einem Lysinlinker am C-terminalen Ende besteht. Zur Herstellung des Impfstoffs wurde das Peptid unter Verwendung von Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester an KLH gekoppelt, wodurch das Peptid über die Cysteinseitenkette mit dem KLH verknüpft wird.
Anschließend wurde das KLH-Peptidkonjugat auf einem Aluminiumhydroxidgel absorbiert und zur Impfung der Meerschweinchen mit einer Dosis von 100 ug Peptid pro Tier verwendet. Eine nicht geimpfte Gruppe von Meerschweinchen diente als Kontrolle. Die Tiere wurden 21 Tage nach der einzigen Impfung infiziert.
Die Ergebnisse der Infizierung waren wie folgt: geimpft nicht geimpft voll geschützt teilweise geschützt* nicht geschützt** Insgesamt *1 bis 6 Läsionswertungspunkte auf einer Skala von 0 bis 12. **mehr als 6 Läsionswertungspunkte auf einer Skala von 0 bis 12.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die verwendete kurze Peptidsequenz das Immunsystem eines empfänglichen Modelltiers stimulieren kann, um eine schützende Antwort gegen Infektion durch virulenten FMDV zu geben.

Beispiel 7

Ein Beispiel für die Anwendung der vorliegenden Erfindung zum diagnostischen Einsatz ist aus Fig. 2 entnommen. Dort wird gezeigt, daß ein ELISA-Test unter Verwendung trägergekoppelter Peptide (SCPs) ein extrem stammspezifisches Instrument zum Nachweis von FMDV-Antikörpern ist. Gesamte Antiseren gegen FMDV Typ O&sub1; reagierten mit Hexapeptiden 146, 147 und 206, die von der FMDV Typ O&sub1;-Sequenz stammten, während Antiserum gegen Typ C&sub1; überhaupt nicht reagierte. Ein Kontrolltest mit dem Antiserum gegen FMDV Typ C&sub1; zeigte, daß dementsprechend eine spezifische Reaktion nur mit Peptiden auftrat, die aus der C&sub1;-Sequenz stammten. Ein Test der SCPs mit anderen nicht-FMDV-spezifischen Kontrollseren und Hyperimmunseren gegen andere FMDV-Typen hat ebenfalls gezeigt, daß keine Reaktion auftritt.
Tierseren können daher mit ausgewählten FMDV SCPs getestet werden und eine positive Reaktion ist eine Diagnose einer vorherigen Exponierung des Tiers mit dem FMDV-Antigen. Tabelle 1 Stammsequenz Position in der Sequenz Substituierte Aminosäure GDLGSI Typ A&sub1;&sub0; GDLQVL Typ O&sub1; (48) GDLQVL Typ O&sub1; (31) DLAHLT Typ C&sub1;

Tabelle 1

Die Antikörperbindenden Aktivitäten sind für alle Peptide gezeigt, die eine signifikant oberhalb des Hintergrunds liegende Extinktion ergaben. Die Werte für jedes Peptid sind als %-Angabe der mittleren Aktivität der 6 Stammsequenzen angegeben, die als Teil jeder Ersetzungsgruppe synthetisiert wurden. Unterstrichene Aktivitäten entsprechen den Werten, die für die Stammsequenz erhalten wurden. Es wurde keine Aktivität gefunden, wenn das verwendete Antiserum gegen den heterologen FMDV-Typ hergestellt worden war. Tabelle 2 Zusammenfassung der Innumogenitätsdaten für ein Peptid aus jedem der 3 Serotypen von FMDV. Die Ergebnisse sind für Kaninchenseren nach 2 Impfungen von Peptid an Träger (100 ug Dosis) angegeben. Virusursprung aktives Peptid N-terminaler Linker C-terminaler Linker Anti-gesamter Virus ELISA-tiger (log&sub1;&sub0;) Mikroneutralisierung Titer (MNT) (log&sub1;&sub0;) FMDV Typ O&sub1; FMDV Typ A&sub1;&sub0; FMDV Typ C&sub1; 1. Die N-terminalen und C-terminalen Anfügungen wurden zur Erleichterung der Kopplung des aktiven Peptids an das Trägerprotein Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) verwendet. 2. Die ELISA-Titer wurden unter Verwendung von gereinigtem homologem Virus als Testantigen erhalten. 3. Die MNT-Tests wurden als gequantelte Tests unter Verwendung von Mikrotiterplatten durchgeführt. Verdünnungen von Serum wurden mit 100 mittel infektiösen Dosen von infektiösem homologem Virus vor Inokulation auf Monoschichten von BHK-Zellen inkubiert.
Es ist natürlich zu erkennen, daß viele Variationen und Modifikationen gegenüber der oben angegebenen ausführlichen Beschreibung der Methode gemäß vorliegenden Erfindung gemacht werden können, ohne von dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in weiterem Sinne abzuweichen.

Claims

1. Synthetisches Peptid, von einem Peptid verschieden, welches mit natürlich vorkommendem VP1 Protein identisch ist, das aber die Antigenität des VP1 Proteins von Maul- und Klauenseuche Virus Typ O&sub1;, A&sub1;&sub0; (A&sub6;&sub1;) oder C&sub1; aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Peptids aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus fünf, sechs oder sieben Aminosäuren langen antigen aktiven Sequenzen des jeweiligen VP1 Proteins und antigen aktiven modifizierten Sequenzen davon.

2. Synthetisches Peptid, von einem Peptid verschieden, welches mit natürlich vorkommendem VP1 Protein identisch ist, und das die Antigenität des VP1 Proteins von Maul- und Klauenseuche Virus Typ O&sub1; aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(i) G - D - L - Q - V - L - A;

(ii) G - D - L - Q - V - L;

(iii) D - L - Q - V - L - A;

(iv) D - L - Q - V - L; und

(v) antigen aktiven modifizierten Sequenzen (wie hier definiert) basierend auf einer der obigen Sequenzen (i) bis (iv), worin eine der Aminosäuren in dieser Sequenz (i) bis (iv) durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, um die antigen aktive modifizierte Sequenz bereitzustellen.

3. Synthetisches Peptid, von einem Peptid verschieden, welches mit natürlich vorkommendem VP1 Protein identisch ist, und das die Antigenität des VP1 Proteins von Maul- und Klauenseuche Virus Typ A&sub1;&sub0; (A&sub6;&sub1;) aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(i) G - D - L - G - S - I - A;

(ii) G - D - L - G - S - I;

(iii) D - L - G - S - I - A;

(iv) D - L - G - S - I; und

4. Synthetisches Peptid, von einem Peptid verschieden, welches mit natürlich vorkommendem VP1 Protein identisch ist, und das die Antigenität des VP1 Proteins von Maul- und Klauenseuche Virus Typ C&sub1; aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des Peptids aus Aminosäuresequenzen der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(i) D - L - A - H - L - T - A;

(ii) D - L - A - H - L - T;

(iii) L - A - H - L - T - A;

(iv) L - A - H - L - T; und

5. Synthetisches Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil davon aus Hexapeptidsequenzen ausgewählt ist, auf Basis der Formel:

worin:

G an Position (1) durch A, H, I, K, M, H, P, O, S oder T ersetzt ist; oder

D an Position (2) durch A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V oder Y ersetzt ist; oder

Q an Position (4) durch D, K, A, M, E, N, S oder R ersetzt ist; oder

V an Position (5) durch A, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, R, S, T oder Y ersetzt ist.

6. Synthetisches Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil davon aus Hexapeptidsequenzen ausgewählt ist, auf Basis der Formel:

worin:

G an Position (1) durch A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W oder Y ersetzt ist; oder

D an Position (2) durch L ersetzt ist; oder

G an Position (4) durch A ersetzt ist; oder

S an Position (5) durch T, G oder A ersetzt ist; oder

I an Position (6) durch A, C, D, E, F, K, L, M, Q, R, S, T, V, W oder Y ersetzt ist.

7. Synthetisches Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil davon aus Hexapeptidsequenzen ausgewählt ist, auf Basis der Formel:

worin:

D an Position (1) durch H oder V ersetzt ist; oder

H an Position (4) durch A, C, D, E, F, K, L, M, N, Q, R, S, T, V oder Y ersetzt ist; oder

T an Position (6) durch S ersetzt ist.

8. Impfstoff zur Behandlung von Tieren gegen Infektion durch Maul- und Klauenseuche Virus, enthaltend mindestens ein synthetisches Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Impfstoff nach Anspruch 8, weiterhin enthaltend einen physiologisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff.

10. Impfstoff nach Anspruch 8 oder 9, worin mindestens ein synthetisches Peptid an den physiologisch verträglichen Trägerstoff gebunden ist.

11. Verwendung eines synthetischen Peptids wie definiert in den Ansprüchen 1 bis 7 bei der Herstellung eines Impfstoffes gegen Infektion durch Maul- und Klauenseuche Virus.

12. Diagnostisches oder anderes immunologisches Testsystem zum Nachweis der Anwesenheit von Maul- und Klauenseuche Virus oder von Antikörpern gegen Maul- und Klauenseuche Virus in einem Tier, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein synthetisches Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7 als eine antigen aktive Komponente dieses Systems enthält.