DE2648829A1 - Nonapeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

PATENTANWALTS

PROF. OR. DR. J. ReiTSTOTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

D-8000 MÜNCHEN AO, BAUERSTRASSE 22 ■ FERNRUF <O89> 37 65 83 · TELEX S21S208 ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH 780. D-8OOO MÜNCHEN 43

München, 27. Oktober 1976 M/17256

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

685 Third Avenue, New York, N.Y. 10017 /USA

Nonapeptide, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Nonapeptide der Formel H

_C0 - NHCHCO - NHCHCO - NHCHCO - NHCHCO - NHCHCO CH_n

NHCHCO - NHCIICO -N

CH_r

CH, CH-

MI

N₂N NH

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worin R und R^ = Methyl oder R * Wasserstoff und R^ = Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Phenylethyl,

oder nicht toxische Säureadditionssalze davon. Diese- Verbindungen sind Antischwangerschafts- bzw. Antiträchtigkeitsmittel, die ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung darstellen. Ihre Verabreichung an ein weibliches Lebewesen (Gattung Säugetiere) nach der*Ovulation unterbricht den normalen physiologischen Prozeß, der zur Implantierung und/oder Erhaltung der Blastozyste notwendig ist.

Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antischwangerschaftsmittel verwendeten Zwischenprodukte stellen einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar. Diese Zwischenprodukte sind das voll geschützte Polypeptidharz und die voll geschützten Polypeptidamide der Formel p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R'¹)-Tyr(R²)-D-2-(i ,4-Cyclohexadienyl)Gly-Leu-Arg(R⁵ _>)-Pro-X, worin X den -OCEU/Polystyrolharz-Träger/ oder -N"" ,- darstellt, worin R-R-⁷ wie in der vor-

^ R^
liegenden Beschreibung definiert sind.

Die erfindungsgemäßen Antischwangerschaftsmittel verhindern bei postkoitaler Verabreichung an ein weibliches Lebewesen in einer täglichen Dosis von mindestens etwa 600 Mikrogramm pro kg Körpergewicht während eines Zeitraums von mehr als 3 Tagen, eine Schwangerschaft völlig.

Ohne sich an eine spezielle Aktivitätstheorie binden zu wollen, kann aufgrund von an einer Vielzahl von Tiermodellen vorgenommenen Untersuchungen angenommen werden, daß die erfindungs.gemässen Nonapeptide eine claudogene/interzeptive Wirkung über die Stimulierung der Eypophysen-Ovarium-Steroid-Achse ausüben.

Auf jeden Fall verhindern die erfindungsgemäßen Nonapeptide,unabhängig von den physiologischen Wege zum endgültigen Resultat, bei Verabreichung nach dem Koitus eine Schwangerschaft weiblicher

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Lebewesen wirksam.

Die erfindungsgemäßen Nonapeptide sind daher als "am Morgen danach"-Kontrazeptiva zur Verhinderung oder Beendigung einer Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit eines weiblichen Lebewesens geeignet. In diesem Zusammenhang können die Nonapeptide als die Vermehrung verhindernde Mittel zur Bekämpfung der Nagetiere verwendet werden, ohne daß es notwendig wäre, Nagetier- bzw. Mäuse- und Rattengifte mit ihren möglichen unerwünschten Auswirkungen auf andere Tiere des jeweiligen Lebensraums einzusetzen.

Am Tierversuch wurde eine Trächtigkeit durch tägliche Verabreichung des erfindungsgemäßen Nonapeptids während eines Zeitraums vom Tag 1 bis 7 nach dem Koitus, sowie bei täglicher Verabreichung während eines Zeitraums vom Tag 7 bis 12 nach dem Koitus verhindert. So wurde sowohl eine claudogene (Präimplantation) als auch eine interzeptive (Postimplantation) Art der Beeinträch-' tigung der Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit erzielt.

Zur Bewertung der Schwangerschaftsverhütenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Nonapeptide wurde folgendermaßen vorgegangen: geschlechtsreife, weibliche Ratten vom Stamm Sprague-Dawley (350 +3Og Körpergewicht) wurden mit fruchtbaren männlichen Ratten am Brunstabend (troöstrus) in Käfige gesperrt. Die Anwesenheit von vaginalen Sperma am nächsten Morgen wurde als Tag 1 der Trächtigkeit bewertet. Das für die gesamte Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen repräsentative Nonapeptid-äthylamid wurde subkutan in einen Maisölträger an den Tagen 1 bis 7 oder 7 bis der Trächtigkeit in einer Menge von 200 /ug/Ratte/Tag verabreicht. Eine Hälfte der täglichen Dosis wurde un 9 Uhr vormittags und die andere um 5 Uhr nachmittags täglich verabreicht. Die Empfänger der Tag 1-7-3ehsr.ilur:g wurden an 1^-. Tag einer Autopsie unterzogen, lie Z-pfär-srer der Tag 7-12-Behandlung wurden am 18. Tag

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der Trächtigkeit einer Autopsie unterzogen. Die Wirksamkeit des Äthylamids und seine wirksame Dosis wurden durch die Abwesenheit von uterinen Implantationsstellen und Föten bestimmt. Die Anwesenheit von mindestens einem normalen Fötus wurde als Kriterium für die Trächtigkeit angesehen. Die claudogene/interzeptive Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Nonapeptide zeigte sich hierdurch bei einer täglichen Dosis von etwa 600 /ug/kg Körpergewicht und die Behandlung war mit einer Dosis von 200yug/Ratte/Tag an einer Probe von 6 Ratten sowohl während der Tag 1-7- als auch während der Tag 7-12-Perioden 100 %ig wirksam.

Zur Definition der postkoitalen Stufen der Trächtigkeit der Ratte im Experimentiermodell wird das folgende Schema zur Definition der postkoitalen kontrazeptiven Wirksamkeit für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung angegeben; die kontrazeptive Wirksamkeit soll sowohl die kontrazeptive Wirksamkeit vor (claudogen) als auch nach (interzeptiv) der Implantation umfassen; Tag 1 vaginales Sperma; Tage 1-3 - Eitransport in den Eileitern, Be-■ fruchtung; Tage 3-5 - Blastozyste, frei im Uteruslumen; Tage 5-7 - Implantation in die Wand des Uterus; Tage > 7 - post-Implantation.

Zieht man in Betracht, daß die hormoneile Situation beim Vermehrungszyklus bis zur und einschließlich der Ovulation grundsätzlich bei allen weiblichen Wirbeltieren gleich ist, daß zum Beispiel der menschliche Vermehrungszyklus zu dem der Ratte analog ist, so läßt sich auf der Grundlage der gefundenen Aktivitäten bei der Verhinderung der Trächtigkeitsentwicklung am Rattenmodell schließen, daß die erfindungsgeziäßen Nonapeptide wirksam a-uf die Entwicklung der Blastozyste vor und nach der Implantation in den Uterus aller Lebewesen der C-attung der Säugetiere einschließlich des Menschen, einKir>t.

So wird gesä2 eine^i r.erkral der Erfindung eine Möglichkeit zur Verhütung der Trächtigkeit bzw. Schwangerschaft von weiblichen

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Lebewesen geschaffen, die darin besteht, L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-2-(i,4-cyclohexadienyl)-glycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-N ^ 5» worin R und R^ wie vorstehend definiert sind, an die weiblichen Lebewesen postkoital in einer täglichen Menge von mindestens etwa 600 /ug/kg Körpergewicht während einer zur Beendigung der Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit ausreichenden Periode zu verabreichen. In der Praxis wirkt die erfindungsgemäße schwangerschaftsverhütende Verbindung auf den Gestationsmechanismus ein, wobei diese Einwirkung zu einem frühen postkoitalen Zeitpunkt pra-Implantations-kontrazeptiv oder auch post-Iinplantations-interzejptiv sein kann. So beginnt die wirksame Folge der täglichen Verabreichung an den Menschen beim Tag 1 der Ovulation-Befruchtung und wird bis etwa zum Tag 6 fortgesetzt, um eine claudogene Reaktion hervorzurufen oder beginnt am Tag 6 und wird bis etwa zum Tag 14 nach der Ovulation-Befruchtung durchgeführt, um eine interzeptive Reaktion in der Schwangerschaftsperiode hervorzurufen. Die Dosis beim Menschen, basierend auf der Dosierung des experimentellen Modells, liegt bei etwa 28 mg pro Tag für eine Frau von 50 kg.

Die erfindungsgemäßen Nonäpeptide können in jeglicher geeigneten bzw. zweckmäßigen Form oral oder parenteral mit oder ohne übliche pharmazeutische Zusätze bzw. Hilfsmittel verabreicht werden. Zusätzlich können übliche Addukte der Nonapeptide verwenden werden, um ihre Wirksamkeit zu verlängern, wie die Protaminzink- oder -aluminiumaddukte, die nach üblichen Techniken hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Nonapeptide werden durch Festphasen-Methodologie nach zum Aufbau einer Aminosäurensequenz aus einer auf ' einem Trägerharz befindlichen Aminosäure als Ausgangsprodukt allgemein bekannten Techniken hergestellt. Eine derartige Technik wird von Kerrifield in J.A.C.S. 85, 2149 (1963) allgemein veranschaulicht .

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Als Harzträger kann jeglicher geeignete Träger verwendet werden, der üblicherweise bei der Herstellung von Polypeptiden in fester Phase verwendet wird, vorzugsweise Polystyrol, das mit 0,5 bis etwa 3 % Divinylbenzol quervernetzt wurde, welches chlormethyliert wurde, um Stellen für die Esterbildung mit der ursprünglich eingesetzten geschützten Aminosäure zu bilden. Das Amino-geschützte Prolin wird mit dem chlormethylierten Harz nach der Verfahrensweise von "isin, HeIv. Chim. Acta., 56, 1476 (1973) gekoppelt. Nach der Koppelung dee Amino-geschützten Prolins an den Harzträger wird die Aminoschutzgruppe nach Standardmethoden unter Anwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan entfernt. Die Entfernung der Schutzgruppe erfolgt bei einer Temperatur von etwa O⁰C bis Raumtemperatur. Niich der Entfernung der Aminoschutzgruppe werden die restlichen ^--Ajrino-geschützten und, falls notwendig, Seitenketten-ge stützten Aminosäuren der Reihe nach in der zur Erzielung des Pro-'.ult-ts gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Alternativ Können vor der Koppelung mit der auf dem Harzträger befindlichen 4minosf'vrcsequenz mehrere Aminosäuregruppen gemäß der Methode in I. ;7un£- . :ckoppelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Loppelungsmittels " ^rtgt im Bereich des fachmännischen Könnens. F.LI, Li-j.-zGcdcTs gee^i-otes Koppelungsmittel ist das H",N' -Diisopropylcc-.rbodij.miα. Ein w-iteres verwendbares Koppelungsmittel ist ", λ -LIC7C l.oh^r xylcarbooiinid.

J? de gesch.,tzv·- -::i:..o:-:=Lure oder Aminosäurenfolge wird in den Festt>h3sen""eaki'or irz einem zwei- bis sechsfachen Überschuß zugef·. _£;t "J:id die lic/7·.?" ..ng wird in einem Medium von Dimethylformamid: ^Metrrrlenchior:l·.: ·: t ■ τ. Disethylfc-"namid oder Methylenchlorid »IIein durch-:· ."'.: ;' , ..-. Fällen, wo -;ir.e unvollständige Koppelung abtritt, wirr: >;-, ίοppelungsvorcrar.g vor der Lntfernung der - - .ninorchutz---,:pe, ro? der Zintrirrgung der nächsten Aminosäure in den Festpha-enresktor wiederholt. Ler Erfolg der Koppelungsreaktion ir- jc.j.-:- cynthesestufe wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 3^, 595 (1970) be-

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SI

schrieben, überwacht.

Die für j ede in das Polypeptid eingeführte Aminosäure verwendete notwendige «χ—Aminoschutzgruppe ist vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, obwohl auch andere Schutzgruppen verwendet werden können, die nicht unter den Koppelungsbedingungen entfernt werden und die leicht* selektiv in Bezug auf die anderen Schutzgruppen, die in dem Molekül vorhanden sind, unter Bedingungen entfernt werden können, die das gebildete Molekül nicht schädigen. Weitere Beispiele für derartige^Aminoschutzgruppen, die im Hinblick auf den Rest des Polypeptidmoleküls gewählt werden können, sind Trityl, Phthalyl, Tosyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, o- oder p-Nitrobenzyloxycarbonyl usw..

Das voll geschützte, auf dem Harzträger befindliche Nonapeptid weist die folgende Aminosäuresequenz auf: p-Glu-His(R)-Trp-Ser-(R¹)-Tyr(R²)-D-2-(i,4-Cyclohexadienyl)Gly-Leu-Arg(R⁵)-Pro-0-CH₂-/Polystyrolharzträger/, worin die Gruppe -O-CKp-ZPolystyrolharzträger/ den Esterrest einer der vielen funktioneilen Gruppen darstellt, die in den Polystyrolharz vorhanden sind; worin R eine Schutzgruppe für den Iminostickstoff der Histidylgruppe darstellt

und R^ eine Schutzgruppe für die Guanylfunktion des Arginylrests bedeutet. In dieser Eigenschaft ist die Tosylschutzgruppe bevorzugt, jedoch umfassen andere anwendbare Schutzgruppen die Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonylgruppe und ähnliche Gruppen. Die Guanylfunktion des Arginylrests kann über die N^w- oder N -Stickstoffatome

durch die Nitro- oder Tosylsehutζgruppen und über das N -Stickte Cj^¹

stoffatom oder jedes der N - oder N "-Stickstoffatome durch Benzyloxycarbonyl-, Adamantylcxycarbonyl-, Tritylgruppen und ähnliche Gruppen geschützt werden.

In der vorstehenden Fomel für das auf dem Harz träger befindliche

1 2 voll geschützte ITonapeptid bedeuten R und R Schutzgruppen für

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die Hydroxylgruppen des Serins und Tyrosins. Die Hydroxyschutzgruppen, die man zweckmäßig hierzu verwendet, sind Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl und dergleichen, wobei Benzyl- und 2,6-Dichlorbenzylgruppen für diesel Zweck bevorzugt sind.

Das Kriterium für 'die Auswahl der Schutzgruppen für R-R^ liegt darin, daß (a) die Schutzgruppe stabil gegenüber dem Reagens und unter den Reaktionsbedingungen sein muß, die zur Entfernung der °t~ Amino schutz gruppe in jeder Stufe der Synthese verwendet werden, (b) die Schutzgruppe ihre Schutzeigenschaften beibehalten muß (d-h. nicht unter den Koppelungsbedingungen abgespalten werden darf), und (c) die Schutzgruppe bei Abschluß der Polypeptidsynthese leicht unter Bedingungen abgespalten werden können muß, die sonst keine Auswirkung auf die Polypeptidstruktur ausüben.

Das voll geschützte Fonapeptid wird von dem Harzträger durch Behandeln mit einem Amin entfernt, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Methylamin, Äthylamin, Propylamin, 2-Propylamin, Butylamin, 2-Butylamin, Pentylamin, 2-Pentylamin, 3-Pentylamin, Phenyläthylamin oder Dimethylamin, wobei man bei Raumtemperatur arbeitet, worauf jeglicher Überschuß des Amins entfernt wird und man das erfindungsgemäße Zwischenprodukt der Formel p-Gly-His(R)-Trp-Ser(R¹ )-Tyr(R²)-D-2-(1,4-CyclohexadienyDGly-

_R erhält, worin

R, R , R und R^ = unabhängig voneinander, Acetyl, Benzoyl, tert Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Tosyl oder Nitro;

R und r5 » Methyl oder R = Wasserstoff und

R⁵ = Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, 2-Butyl, Pentyl, 2-Pentyl, $-Pentyl oder Rienäthyl.

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Das im vorstehenden Absatz beschriebene voll geschützte Zwischenprodukt wird durch flüssigen Fluorwasserstoff in Anwesenheit von Anisol von seinen Schutzgruppen befreit, wobei man die erfindungsgemäßen claudogenen-interzeptiven Nonapeptide erhält.

Die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Nonapeptide erhält man durch übliche Techniken entweder mittels anorganischer oder mittels organischer Säuren, von denen bekannt ist, daß sie zu pharmazeutisch brauchbaren bzw. verträglichen nicht toxischen Additionsprodukten führen, wie Chlorvmsserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure usw..

Beispiel 1 Herstellung des tert.-Butyloxycarbonyl-prolinharzes

Nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) wurden 18,56 g (86,3 mMol) tert.-Butyloxycarbonylprolin in einer Mischung von 112 ml Äthanol und 48 ml Wasser mit konzentrierter wässriger Cäsiumhydrogencarbonatlösung behandelt, bis der pH der Lösung den Wert 7 erreichte. Die Reaktionsmischung wurde gestrippt und durch wiederholtes Strippen unter Anwendung von Äthanol, Äthanol-Benzol, Benzol (3 x) getrocknet. Der schaumartige Rückstand wurde über Phosphorpentoxid im Vakuum bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet.

Das Gesamtprodukt wurde in 880 ml Dimethylformamid über Nacht bei 50⁰C unter Stickstoff mit einem Harz mit chlormethylierter Kapazität von 0,89 mÄq/g (Bio-Beads S.X. 1 Resin) gerührt. Das fil- · trierte Harz wurde sorgfältig mit Dimethylformamid (2 x), Dimethyl fοrmamid-10 % wasser (2 x), Dimethylformamid (2 x), Methanol (2 x), Chloroform (3 x) gewaschen und über P₂ ⁰S getröckaet· ^Die Aminosäureanalyse zeigte eine Substitution von 0,64 mÄq/g auf dem Harz an.

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Beispiel 2

L-Pyroglutamyl-^^tosyl-Ir-histidyl-L-tryptophyl-O-benzyl-L-seryl-0-(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-2-(1,4-cyclohexadienyl)

glycyl-L-leucyl-I^-tosyl-L-arKinyl-L-prolyl-acyl-harz-ester

OBzi? osy .

p-Glu-IIis-.Trp-Ser-Tyr-D-Gly(2lIPh)-Leu-Arg-Pro-0-Re5in

66,17 g tert.-Butyloxycarbonyl-prolylacylharzester wurden in einem Merrifield-Cefäß folgendem Waschzyklus unterzogen: (a) Methylenchlorid-Trifluoressigsäurevorwäsche (5 Minuten), (b) Methylenchlorid-Trifluoressigsäure (2 χ 15 Minuten), (c) Methylen chlorid (2 x), (d) Dimethylformamid, (e) Dimethylformamid-12,5 % Triäthylamin (2 χ 10 Minuten), (f) Dimethylformamid, (g) Methylenchlorid (2 x), (h) Methanol (2 x), (i) Methylenchlorid (3 χ), wobei, falls nicht anders angegeben, eine Kontaktzeit von mindestens 3 Minuten eingehalten wurde.

Das so hergestellte Harz wurde sanft mit 75 mÄq. tert.-Butyloxycarbonyl-N^-tosylarginin in 1:1 Methylenchlorid-Dimethylfοrmamid während 5 Minuten geschüttelt, worauf 75 ml (75 mA'q) 1 m-Isopropylcarbodiimid in zwei Portionen in Abständen von 30 Minuten zugesetzt wurden. Es wurde weitere 18 Stunden geschüttelt. Das Peptidharz wurde nacheinander mit (j) Methanol, (k) Methylenchlorid, (1) Methanol (2 x), (m) Methylenchlorid (2 x) gewaschen. Gewöhnlich wurde zur Untersuchung der Vollständigkeit der Umsetzung das Peptidharz einer ITinhydrinuntersuchung nach der Methode von E. Kaiser et al., Analytical Biochemistry 3^, 595 (1970) unterzogen. Prolin Jedoch verhält sich beim vorstehenden Test anomal und ergibt eine schwache Farbreaktion, so daß die Koppelung unter Anwendung von 37»5 mKol tert.-Butyloxycarbonyl-N-tosyl-arginin und 37,5 mMol Dicyclohexylcarbodiimid wiederholt wurde.

Die folgenden Aminosäurereste wurden nacheinander auf das gewaschene (Stufen o'-m), von Schutzgruppen befreite und neutralisierte (Stufen a-i) Peptidharz aufgearbeitet: zuerst 75 v&Q. tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucinhydrat, anschließend wurde die Synthese mit einem aliquoten Teil'von 6,17 g des Peptidharzes unter Zugabe

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von 9,25 mÄq tert.-Butoxycarbonyl-D-2-(1,4-cycloliexacLienyl)-glycin weitergeführt, gefolgt von 9,25 mÄq tert.-Butyloxycarbonyl-0-(2,6-dichlor-benzyl)-L-tyrosin, 9,25 mÄq tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-serin, 9,25 mÄq tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophan, 9,25 mÄq tert.-Butyloxycarbonyl-N-tosyl-L-histidin und 9,25 mÄq L-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure. Nach. Zugabe von Tryptophan wurden 0,5 % Dithioerythrit zu der Trifluoressigsäurewäsche gefügt. Alle Kopplungsreaktionen wurden unter Anwendung von 10 mÄq 1 m-Isopropylcarbodiimid in Methylenchlorid, wie für die Zugabe von tert.-Butyloxycarbonyl-!T^s-tosyl-arginin beschrieben, vermittelt, mit Ausnahme des Falles von tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucin, wo das Diisopropylcarbodiimidreagens zuerst zugesetzt wurde, um die Möglichkeit des Peptidverlustes über die Bildung von Diketopiperazin zu verringern, vgl. 3.P. Gisin und R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 9A-, 3102 (1972). Das Harz wurde gewaschen, Stufen (j)-(m), und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung getrocknet.

• Beispiel 3

L-Pyroglutamyl-N^lm-tosyl-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L-seryl-0-2,6-dichlorbenzyl-L-tyrosyl-D-2-(i ,4—cyclohexadienyl)-glycyl-L-leucyl-N^-tosyl-L-arginyl-L-prolin-äthylamid

Etwa 6,5 g des geschützten Peptidharzes von Beispiel 2 und 120. ml Ä'thylamin wurden über Nacht in einer Glas-Druckflasche gerührt. Äthylamin wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde mit Methanol, Dimethylformamid (A- x), Methanol und Methylenchlorid gewaschen. Die vereinten Filtrate wurden im Vakuum unter 35°C verdampft, wobei man die Tit el verbindung, erhielt.

Durch die gleiche oder ähnliche Arbeitsweisen, wobei jedoch Äthylamin ersetzt wurde durch Diethylamin, Methylamin, Propylamin, i-Propylamin, Butylaziin, sec.-3utylamin, t.-Butylamin, Pentylamin oder Phenyl äthylamin, wurde ^.edes der den verwendeten Aminreaktionskoxponenten entsprechenden Aside hergestellt.

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Beispiel 4

L-Pyroglutamyl-L-Mstidyl-I^try^

(1,4-cyclohexadienyl)-glycyl-L-leucyl-Ir-arginyl-L-prolinäthylamid

Das Produkt von Beispiel 3 wurde im Vakuum mit 120 ml wasserfreiem flüssigem Fluorwasserstoff und 35 ml Anisol während 50 Minuten bei O⁰C behandelt. Fluorwasserstoff wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde zwischen Diäthyläther und 10 % wässriger Essigsäure aufgeteilt. Durch Lyophilisieren der sauren Schicht erhielt man 2,41 g der Titelverbindung.

Beispiel 5

Reinigung und Charakterisierung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-2-(i,4-cyclohexadienyl)-glycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid

2,41 g des rohen Peptids wurden in einem minimalen Volumen von 0,2 η-Essigsäure auf eine Sephadex G-25-fein-Kolonne aufgetragen, die vorher mit 0,2 η-Essigsäure equilibriert und anschließend mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert worden war. Es wurden Fraktionen von jeweils 9 ml gesammelt. Das Peptidmaterial wurde durch den Ehrlich-Spot-Test und durch UV-Analyse festgestellt. Es wurde eine Hauptfraktion (35-56) von 1,724 g erhalten. Dieses Material wurde erneut auf einer Trennsäule von Sephadex G-25-fein (2,5 x 100 cm) chromatographiert, die durch Equilibrieren mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des BAW-Systems (n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 4:":5) hergestellt wurde. Durch Eluieren mit der oberen Phase erhielt man Fraktionen A 26-41 (608 mg) und B 42-56 (528 mg). Die Fraktion A wurde zweimal unter Anwendung des gleichen Systems erneut chromatographiert, wobei man 188 mg des gewünschten Peptids erhielt.

Der R»-Wert des Pet>tids (30/ug Beschickung) im Dünnschichtsystem (Siliciumdioxidplatten-Brink^an) n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5, obere Fnase) betrug 0,11.

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Die optische Drehung, geinessen auf einem photoelektrischen Präzisionspolarimeter (Carl Zei
(c = 1,036, 1 % Essigsäure).

zisionspolarimeter (Carl Zeiss LEP A-2) betrug /°V§ = -57,66°

Hydrolyse des Peptids in Methansulfonsäure (0,2 ml/1 mg Peptid) während 20 Stunden bei 110 C in einem geschlossenen evakuierten System: Ser (0,89); GIu (0,95), Pro (0,99), Leu (1,00), Tyr (0,93), His (0,9*0, Trp (0,74), Ithylamin (0,99), Arg (1,13). Das 2-(i,4-Cyclohexadienyl)-glycin ist unter sauren Hydrolysebedingungen instabil und führt zur Bildung von vier Komponenten. In dem vorstehenden Hydrolysat konnte die Anwesenheit der gleichen vier Komponenten festgestellt werden.

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Claims (7)

1. PatentanSprüche
   Λ . Nonapeptid der Formel

   L-p-Glu-L-His-I-Trp-L-Ser-L-Tyr-D-a-Ci^-cyclohexadienyl)-Gly-L-Leu-L-Arg-L-Pro-Is ίφ

   4 5 4 5

   worin R und R"^ = Methyl oder R = Wasserstoff und R^ = Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Phenäthyl, oder ein nicht toxisches Säureadditionssalz davon.
2. 2. L-p-G-lu-L-His-L-Trp-L~ser-L-Tyr-D-2-(i,4-cyclohexadienyl)-GIy-L-Leu-L-Arg-L-PrO-NHCpH₁- oder ein nicht toxisches Säureadditionssalz davon.
3. J. L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-D-2-(i,4-cyclohexadienyl)-Gly-L-Leu-L-Arg-L-Pro-NHC₂Hc·
4. 4. L-p-Glu-L-His(R)-L-Trp-L-Ser(R'¹ )-L-Tyr(R²)-D-2-(i ,4-cyclohexadienyl)-Gly-L-Leu-L-Arg(R^)-L-Pro-X,

   -ι ρ ^x
   worin R, R , R und S^^- = unabhängig voneinander Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Tosyl oder Nitro; und

   X = -O-CH^/Polystyrolharzträger./ oder N^ ^5,

   worin R'. und R^ = Kethyl oder R = Wasserstoff und R^ = Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Phenäthyl;

   oder ein pharmazeutisch brauchbares Säureadditionssalz .davon.
5. 5· Verbindung gemäß Anspruch 4, worin R und R^ » Tosyl, R = ■Benzyl, 3" = .1,6-Dich.lorber.zyl und X = -O-CH^/Polystyrolharzträf-er/ oder -17 Γ_£~, >rorin R und R^ = Methyl oder R = Wasserstoff und ?P - Alkyl mit ". bis 5 Kohlenstoffatomen oder Phenäthyl.

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6. 6. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptide gemäß Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in fester Phase auf einen chlormethylierten Harzträger Prolin mit geschützter Aminogruppe koppelt, die Aminoschutzgruppe entfernt, der Reihe nach in der gewünschten Reihenfolge die restlichen Aminosäuren mit geschützten ^,-Aminogruppen und gegebenenfalls geschützten Seitenketten ankoppelt, das erhaltene voll geschützte Nonapeptid von dem Harzträger durch Behandlung mit einem Amin entfernt und die Schutzgruppen abspaltet.
7. 7. Pharmazeutisches Mittel enthaltend wenigstens eine Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff in einem üblichen pharmazeutischen Träger und gegebenenfalls übliche lOrmulierungsmittel und/oder übliche Arzneimittelzusätze.

   ORIGINAL !NSPEGTEÖ

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