DE2347782A1

DE2347782A1 - Aminozuckerderivate, verfahren zu ihrer herstellung, sowie ihre verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE2347782A1
Application number: DE19732347782
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Frommer; Bodo Dr Junge; Uwe Dr Keup; Lutz Dr Mueller; Walter Dr Puls; Delf Dr Schmidt
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1973-09-22
Filing date: 1973-09-22
Publication date: 1975-04-10
Also published as: NO142755B; PH12530A; DK497374A; ATA757974A; NL930036I2; CA1044164A; BE820147A; FI56698C; ZA745972B; YU254574A; ES430283A1; IE39856L; RO84246A; SE432111B; DK139979C; IE39856B1; CH596312A5; IL45685A0; DE2347782C3; IL45685A

Description

509 Leverkusen. Bayerwerk

21. SEP. 1973

Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel

Die vorliegende Erfindung "betrifft neue Aminozuckerderivate, mehrere Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere als Mittel gegen Diabetes und Adipositas.

Es ist bereits bekannt geworden, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibitoren, aber nur mittelstarke oder schwache Saccharaseinhibitoren (siehe Deutsche Offenlegungsschrift 2 064 092),

Es wurde nun gefunden, daß man neue Aminozuckerderivate der allgemeinen Formel

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* 5L-

oh oh πη, 23A7782

HOCH OH IH "OH OH

in der R eine Oligosaccharidkette mit η = 1-7 Hexoseeinheiten bedeutet, erhält, wenn man Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae, insbesondere von Stämmen der Gattung Actinoplanes, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und anschließend die Aminozuckerderivate isoliert. Es wurde außerdem gefunden, daß man die höheren Glieder der durch die vorstehende Formel gekennzeichneten homologen Reihe durch mikrobiologischen enzymatischen und. und chemischen Ab- bzw. Umbau in die niederen Glieder dieser Reihe umwandeln kann.

Weiterhin wurde gefunden, daß die neuen Aminozuckerderivate starke Inhibitoren für Glykosidhydrolasen des Verdauungstraktes sind. Dabei zeigen die niederen Glieder, in den R eine Oligosaccharidkette mit 1 oder 2 Hexoseeinheiten ist,vorwiegend starke Hemmung von Saccharase, die höheren Glieder vorwiegend starke Hemmung von Amylase.

Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate eine höhere spezifische Hemmaktivität gegenüber Saccharase bzw. Amylase als die bereits bekannten Inhibitoren. Dabei fällt als besonders merkwürdig auf, daß einige der neuen Aminozuckerderivate in vivo eine um ein Vielfaches höhere Hemmwirkung besitzen als ihrer in vitro-Hemmwirkung entspricht.

Als besonders überraschend ist außerdem anzusehen, daß die niederen Glieder der erfindungsgemäßen homologen Reihe die Glukoseresorption in vivo inhibieren. Auf Grund dieser überraschenden Eigenschaften stellen die neuen Aminozuckerderivate eine Bereicherung des Arzneimittelschatzes dar. Le A 15 177 - 2 -

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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Mikroorganismen der zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Familie Actinoplanaceae, insbesondere Stämme der Gattung Actinoplanes verwendet. Als Beispiele seien genannt die Stämme Actinoplanes spec. SE 50 (OBS 961.70), SB 18 (CBS 957. 70 und SE 82 (CBS 615.71). Diese Mikroorganismen sind bereits im südafrikanischen Patent ITr. 71/8677 beschrieben und sind unter den in Klammern aufgeführten Nummern im Centralbureau vor Schimmelcultures in Baarn/Holland hinterlegt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können weiterhin - wie auch schon im südafrikanischen Patent Nr. 71/8677 beschrieben - Mutanten oder Varianten aus diesen Stämmen verwendet werden. Besonders geeignet erwiesen sich im Hinblick auf die G-esamtausbeute an den erfindungsgemäßen Aminozuckerderivaten und/oder im Hinblick auf die Größe des Restes R im Gemisch der bei der Fermentation gebildeten Aminozuckerderivate die Stämme SE 5O/13 (CBS 614. 71), und SE SO/110 (CBS 674.73 ). Beide Stämme entsprechen in ihrer Beschreibung weitgehend dem Elternstamm SE 50. Diese Stämme sind ohne Anwendung von Mutagenen durch natürliche Auslese aus Stamm SE 50 gewonnen worden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man feste und flüssige, insbesondere flüssige, wässrige Nährböden, die neben Kohlenstoffquellen Stickstoffquellen, Salze und Antischaummittel in den üblichen Konzentrationen enthalten. Die Konzentrationen können in weiten Grenzen schwanken.

Als Kohlenstoffquellen dienen vorwiegend Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose und Gemische von zweien ^öder dreien_7 dieser Stoffe, aber auch komplexe Gemische wie z.B. Malzextrakt.

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Als S ticks toff quellen können die in der Mikrobiologie iiblichen komplexen Geiaisehe wie z.B. Xasexnhydrolysa'fc,, Hefe— extrakt, Pepton, Fischmehl, Pishsolubles, Maisquellwässer» Fleischextrakt und auch I-lisehungen ebenso wie Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze verwendet werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im allgemeinen aerob in belüfteten S chüttelkul tieren ©der in Behälterkulturen gearbeitet. Die Art und die iKöäzentration der Kohlenstoff quelle beeinflußt in Kombination axt des Jeweiligen zur fermentation verwendeten Stama die Art des Endproduktes im Hinblick auf die .Sröße deä fiestes H soweit, daß man einzelne Glieder der homologem fiexhe ©der zumindest einen sehr engen Bereich von Homologen nahezu selektiv herstellen kann. Es hat sich dabei gezeigt» daß In Sährlösungen, die Stärke über 2*ß> enthalten, vor allem Aainozuekerderivate mit 4-7 Hexoseeinheiten gebildet werden, und daß fur-diese Produktion insbesondere der Stamm SE 5O/13 {OBS 614-71} geeignet ist. Es genügt aber unter Umständen schon, zu Mahr lösungen, die a. B. 3,5$ Glucose als Grundkohlenstoff quelle enthalten, 0,1 — 3/·, vorzugsweise 0,5 — 2^», Stärke zuzugeben, um Cremische von Aminozuelcerderivateii axt 4-7 Hexoseeinhexteii zu erhalten. Des weiteren hat es sieh gezeigt, äafi ia stärke— freien Nährlösungen und insbesondere bei Zugabe von Maltose zur Mährlösung, insbesondere mit dem Stamm SE 5© {€3SS 961.TO) vorwiegend Ämxnozuekerderivate m±t 2-3 Hexoseeiialieiten gewonnen werden können. Besonders geeignet zur Herstellung des erf indungsgemaSen Aminozuekerderivats sail; B = Glucose haben sich Nährlösungen erwiesen, die allein Crlucose als Kohlenstoff quelle entiaalten. Sithält die Nährlösung Slucoseüberschuss, so yesräea bei längerer Feraentationsdauer auch die längerkettigen Asd.3aozuekerderivate gebildet. Man kann das in gewissen Grenzen unterbinden, daS bei der fermentation die Erschöpfung der Stickstoffquellen zeitlieh m±% der Erschöpfung der Glucose zusasaaeiifällt. ¥erzichtet man bei des Hährlösuagen

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ganz auf Glucose und gilbt als^.Kolilenstoffquelle Maltose, so erhält man überwiegend das. Aminozuekerderivat mit 2 Hexoseeinheiten. Dabei kann mari auch die reine Maltose durch billigere Gemische ersetzen, wie z.B. Maltzin, ein natürlicher Malzextrakt' der Biamalt AG, München. Dem Gehalt an Maltotriose entsprechend wird dann auch das nächst höhere Homologe mitgebildet. Besonders geeignet für die Herstellung der niederen Homologen erwies sich der Stamm S.E 50/110, der in optimalen Nährlösungen etwa die doppelte Ausbeute an niederen Homologen ergibt als der Stamm SE 50/13·

Bei den Fermentationen kann die Zusammensetzung der übrigen Nährlösung, insbesondere die Konzentration der Stickstoffquellen und die Salzzusammensetzung in weiten Bereichen schwanken.

Die Nährmedien werden in der üblichen Weise sterilisiert. Die pH-Werte der Nährlösung liegen zwischen 5,0 - 8,5»' vorzugsweise zwischen 6,0 - 7,8. Die Bebrütungstemperatüren liegen zwischen 15 und 45°C, vorzugsweise zwischen 24-32 0. Für die Herstellung von höheren Homologen mit den Stämmen SE 50 und SE 5O/13 ist eine höhere Temperatur z.B. 28⁰C, für die Herstellung der niederen Homologen mit den Stämmen SE 50 und SE 50/110 eine niedere z. B. 24°C günstiger. Die Kulturdauer beträgt 1 - 8 Tage, vorzugsweise 2-6 Tage. Längere Kulturdauer besonders bei Kohlenhydratüberschuß begünstigt die Bildung der höheren Homologen. Der Endpunkt der Fermentation wird durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität im enzymatischen Hemmtest und durch dünnschichtchromatografische Bestimmung der Zusammensetzung bestimmt.

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Die niederen Homologen der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate lassen sich auch durch Abspaltung von Hexoseeicbheiten aus den höheren Homologen gewinnen. Die Abspaltung geschieht entweder mit wässrigen Säuren, insbesondere näit 1-5-normalen Mineralsäuren bei Temperaturen von 50-100 C„ insbesondere bei Temperaturen von 90 - 100C, in 10 -' 18© Hinuten, oder durch Inkubation mit Enzymen (Hydrolasen), insbesondere mit ß-Arny las en öder nicht heimbaren ^-Amylasee oder Amyloglucosidasen mikrobiellen Ursprungs, wie z.B. Λ-Anlasen aus B. subtilis, oder durch Inkubation mit Mikroorgani« die in Nährlösungen, welche die höheren Homologen der findungsgemäßen Aminozuckerderivate in Gehalten von 1 vorzugsweise 2 - 5°/° inkorporiert vorzugsweise als alleinige Kohlenstoff quelle enthalten, zu wachsen vermögen, wie ζ Ji. Aspergillus niger (ATCC 11.394).

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Amira·— zuckerderivate geht aus entweder von mikrobiologischen Kulturbrühen oder von sauren Hydrolysaten oder von Inkufeabtionsgemischen, in denen der enzymatische und/oder mikrobiologische Umbau oder Abbau der höheren Homologen der Aminozuckerderivate durchgeführt wurde.

Je nach dem Molekulargewichtsbereich, dem die zu iso Hersenden Substanzen zuzuordnen sind, werden verschiedene Methoden der Aufarbeitung erforderlich. Die Isolierung geschieht bei äften höheren Homologen durch direkte Fällung nach vorheriger Entfärbung und Einengung der Lösungen.

Die niedermolekularen Honologen gewinnt man dagegen vorzugsweise durch Adsorption an Aktivkohle bei neutralem pH «crt anschließender Desorption mit wässrigen Alkoholen oder Aceton* vorzugsweise 50-80?£igem Aceton. Besonders vollständig gelingt die Desorption bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1„,5 - 4, vorzugsweise pH 2 - 3.

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ORIGINAL INSPECTED

Wenn die Ausgangslösungen sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der Adsorption der erfindungsgemäßen Substanzen mittels Aktivkohle bei sauren pH-Werten CpH t — 3Ϊ oder mit Lewapol Ca 9221/0,35 mm Körnung (Bayer AG) im Bereich von pll 2 - 7, vorzugsweise bei pH 2 - 3, entfärbt. Die Aktivkohle bindet nur im sauren Bereich bevorzugt Farbstoffe, während Lewapol die inhibitoriseh aktiven erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate weder im Neutralen noch im Sauren adsorbiert.

Zur Abtrennung der hemmaktiven Aminozuckerderivate von inaktiven Sacchariden und anderen hemmaktiven Verbindungen nutzt man den schwach basischen Charakter dieser Komponenten aus. Unter geeigneten Bedingungen (pH 1 - Q, vorzugsweise pH 2 — 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit **=· 10 mS, vorzugsweise <2mS) werden die homologen Aminozuckerderivate von stark sauren Kationenaustauschern wie z.B. Dowex 50 W (Pa. Dow Chemicals), in der Η⁺-ϊοϊϊβ, gebunden. Besonders gut lassen sieh die hemmaktiven Amino— zuckerderivate — wie wir fanden - aus acetonischer lösung (50-80$ Aceton, pH 1 - 5, vorzugsweise pH 2 - 4Ϊ an Sationenaustauscher binden, die unter diesen Bedingungen eine wesentlich höhere Kapazität für die Substanzen zeigen. Unter der Toraussetzung, daß die Lösung mehr als 50$ Aceton enthält, gelingt die Bindung auch an schwach saure Austauscher, wie z.B. Amberlite IRC-50 (H⁺-Porm), recht gut.

Zur Desorption der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate von den Kationenaustauschern verwendet man am besten wässrige Ammoniaklösungen. Aus den Desorbaten zieht man den Ammoniak im Vakuum ab und gewinnt die inhibitoriseh aktiven Aminozuckerderivate nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise mit 10-20 Volumina Aceton.

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Weiterhin gelingt es, - niedermolekulare- -UeMa^kif-ve :>jp-in9Zjqte-■■

kerderivate-von inerten Saechariden durch.

an Austauscher*!-auf-Gellulose-lasis, .vorzugsweise' Cellulose (Ea, Serva, Heidelberg), abzutrenaen^ Als

mittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Bhospisatpuffer* von - geringer --Xonenstärke, vorzugsweise\2 — 100. w$&_t. - inside-; sondere-.5 - 1® eK» i» fK-Eereich. τοη 2,5 - -8.» .vorzugsweise, bei pH" 5 — 6» · verwendet. ,;¥iöraussetZiUug-ffir 'eine Fraktionierung sind aöglicligt ,geringe- Saligenait« -i#t."< jzu fraktionierenden Präparationen, während- Maanmi®££& ..weniger Stören- ....

Zur Seindarstellung der einzelnen Slieder aus' &&τ erf in— d.imgsgeaäßen fcoeologen Meine inliibltorisch aktiver J&aaino— ziuckerderivate chroiiatographiert Juan die vorgereinigten^: Präparate über ein geeignetes fiolekularslelb» z.B. BJo-Gel J—2 (Pa, Bio-Had, München) und untersucht die Fraktionen dtes Eluates dtiniaseliiciiitciaroisiatograjphiseh» Fraktionen, welche die Aiainozuckerderivate rein enthalten, werden vereinigt, reehroeatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer lösungsmiirteX, wie oben gefällt.

3>ie erfindiaiäigsgeiiiäßen SwIjstanzen gehören Ihrer IJatür nach zuar Sulsstanzklasae der E©hlenhydrate- Sie toil den h<QS©loge Heiliin» als ■ deren ©rundkorper das folgende zuckerderivat /G.-Ji-,,Ο^ JI f anzusehen ist« {R = Hexode)

oh

ILe A 15'177 - 8 -

5093 1 S/ 1 2.0-8 ORiGJNAL INSPECTED

-—,

nachgereioht)

Die höheren Glieder leiten sich nur» vom Ürunckcrper in der Weise ab, daß sie jeweils eine Einheit eines Monosaccharides, vorzugsweise einer Hexose, insbesondere von Glucose, zusätzlich enthalten. ^; ■■■- - " : ' ;

Alle Glieder solcher homologer Reihen sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie bei saurer Tötälhydrolyse "Kompo- ., nente I" ^"C₁ JH ^qO ^N _J sowie das entsprechende ,Monosaccharid liefern. Für "Komponente I",wurde nachstehende Strukturformel hergeleitet: ·

"Komponente I"

Als Beispiel für das Strukturprinzip einer homologen Reihe sei der Fall genannt, in dem die Oligosaccharidkette aus 1-7 Glueoseeinheiten besteht. (Tn der Formel bedeutet R hier eine. Oligosaccharidkette mit η = 1-7 'Glueoseeinheiten):

OH OH

Der Grundkörper der Reihe liegt vor, wenn R = Glucose ist und wirdals "Komponente II" bezeichnet. Jedes Glied der Reihe unterscheidet sich vom nächst niederen bzw. nächst höheren durch eine fehlende bzw. zusätzliche Glucose-Einheit.

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Die im Vergleich zu "Komponente II" um .eine Glucose—Einheit größere Verbindung wird dabei als "Komponente III" bezeichnet, die um 2 Glucose-Einheiten größere Verbindung als "Komponente IV" usw. .

Alle diese Verbindungen sind dadurch gekennzeichnet, dal! sie bei sauerer Totalhydrolyse "Komponente I" und Glucose liefern.

"Komponente II" läßt sich in ihren physiko-ehemischen Efigenschaften, ihrer Struktur und Reaktivität folgendermaßen charakterisieren:

Komponente II ist eine farblose, amorphe Pestsubstanz guter Löslichkeit in H₃O, DMF, DMSO und MeOH. In der ist sie auch in Äthanol löslich.

a) DünnschichtChromatographie:

Fließmittel: Essigester / MeOH / H₃O 10 : 6 :

I. DC-Fertigfolien F 1500 Kieselgel der Firma Schleicher + Sehüll

Rf-Werte: II 0,46 Maltose: 0,50 Glucose: 0,65

II. DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel der Firma Merck Rf-Werte: II 0,47 -

Maltose: 0,54 Glucose: 0,66

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ORIGINAL INSPECTEQ 509815/1208 —

Sichtbarmachen iroa
man am besten :äas
schwarze Änfärbung; erfolgt nach geringfügigem ÜSrwärnen

II wird für die gaschroEtatogiapiiisclie IJuterswiliiing

mit <λ- und B-B-Glueose oder oMch Sacciiarose als internem Standard in einep.Semiscli .aus. ^yridin. C.t)"· ,frimetiiylcfclor silan. (0,5) .und ,.l'-Hethjl'-trieetB.jl-silyl.-'tjrif luoracetainid

silyliert.

Säule: . .. - _{: ;} ._; 6. ft..€r]Las» gefüllt mit 3 7*JS$ 30 auf

WAV , ....

f eaaperaturen : Einspritabloek 300 C

Detektor 300°C

Ofen 22Ö°e isotherm Ms zur Elutien der Peaks von df- und B- B-Slucose; anschlies-

send f emperatiirprograiaaa 15^Öd/aiii Ms

Betektor: F I I)

Gase: Trägergas:- 2L· 4O

Brenngas : luft 80

Eetentionszeiten: ©Γ—H-^Grlucose 3 iff τι»

S-B-€rluaose -.:" 4 |5in, -

Saccharose 12-^13 Hin·

II 16-17 XiJU

lie A 15 1?? - 11 -

ORIGINAL INSPECTED

gelöst; wbA die sfiexiffisclie Jirai&iiiDig zaa ££/-** — +"^3^·,^ teesfeieBt;.

stiWktMriearteäs

IJTtUÜIL US.

bei 220

	. ppm	Italslett;	J=6,5	Lisälfc	IJaifceiBsitai;
1	.3	"ffripleitit¹", J	λι TuLeJiTn	jHz	31 .
2	»3	^mfjripleifcifc'*¹; J	^t ^i* J	8—1© Hz	im
3	,15	^₁Ti]I'jr.iunrairviS wrm»w	md Trau i J	7-9 Hz	1 M' .
3,3	- 3		J=12		. 12.fi
4	,13	) 3B)ml3le1bifc;	J= I	Hz	2 H
4	,48 ;	, ÄalOL©tt\|		Hz )	; 1.E \ ''■ .■'■■; ] -.-■".
ii. 5			»Hz I

5,0
5,8

ÄalOLetts J=2-3 Hz

J=3-4 Hz

ffl

3Le A 15 117

ORIGINAL INSPECTED

f) Ace ty 1i e rung von II:

vf 2».

II wird in einem T; 1-G-eraisch aus Acetanhydrid und Pyridin bei Kaum temperatur zu--einem. Dekaacety !derivat umgesetzt (Molgewicht: 903)* Wird die Reaktion in Eisessig/Acetanhydrid 1:1 mit katalytischen Mengen H^O₄ durchgeführt, so läU.t. sich neben dem Dekaacety!derivat auch die Eildung eines Undekaacetylderivats (Molgewicht: 945) massenspektroskopisch nachweisen.

NMR-Spektrum des Dekaacetvlderivats: (Figur 2)

MS-opektruin des Dekaacetylderivats: V

Molekelpeak : 903 (2,5 Yo rel. Intensität) Basepeak ί 843 — ;/; .■·■".

Wichtige Fragment peaks im oberen ifesaenbereich.:

844 (55 % r. iw)

783 (34 $ r,; I.)

759 ί35 # r. I.)

556 (56 St. I.)

496 (57 $ζ r. I.) :

456 (29 $ r.I.)

g) Methylierung von II

Die Methylierung von II mit CH,J / NaII in Dimethylsulfoxid nach Hakomori ergibt als Hauptprodukt das Dekamethylderivat von II in geringer Menge auch das Undekamethy!derivat.

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509815/1208 original inspected

Massenspektrum;

Molekelpeak : 623 (6,1 $ relative Intensität) Basepeak : 535 2.Molekelpeak: 637 (0,2 $S r.I.)

Spektroskopische Daten und chemische Eigenschaften ergeben die folgende Struktur für II:

OH OH CH, CH„0H HO-/N—n-/~~ V- qJ~ \- _0H

CH₂OH H OH OH OS OH

II liegt als Gemisch einer ^- und ß-Form vor, wie insbesondere die NMR-Spektren zeigen.

Das nächste Glied der homologen Reihe, "Komponente III' ^25^4-3^ 18^—7* läßt sich in seinen physiko-chemischen Eigenschaften, seiner Struktur und Reaktivität folgend maßen charakterisieren:

III ist ein gut wasserlösliches amorphes Pestprodukt.

a) Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel! Essigester/MeOH/Ry) 10:6:4

I. DC-Fertigfolien 5¹ 1500 Kieselgel (Schleicher + Seänill): Rf-Werte: III: 0,35 Maltose: 0,50

II. DC-Fertigplatten F 254 Kieselgel (Merck): Rf-Werte: III: 0,33 Maltose: 0,54

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ORlGiN¹AL INSPECTED

III gibt aiit de» ig.MOy^aOH-^präbreE^eiis· sciion !bei Bannt-" temperatur oder leiefeieim Anwärmen der Platte» eise teaam— schwarze

Wenig aiassageta?äLf1fciges_# schleebt aufgelöstes IR-Spektaräam in £ Br. Haaptabsojrptiomsbandea im Bereich der €)-H wmä. C-O

gg
(3700-3100 en"¹ bzw. 1180-950 ca"¹}

c) Brehwinkel:

+ 147,2°

d) NHR-Spelctruffli.iraaa III in D₂O bei 220 MBz; - (Figur. 3)

e) MethylieruB^ mach Haäcomoris -

Die Metallierung von EDE aiit CE₅J und -BaB'In-BISG liefert

als Hauptproduükt das 13-fach E&et&ylierte III, Im gerfiragex Menge auch.das 14—fach Methylierte Produkt.

f) Massenspektnam des Methqrlieraa^sprodiilctes;

Der Molekelpeak bei 821 (i»5 ?ί r.I.) -ents^ricldb eimer Smaraenforjmel C^^gg^ö^Q- (Mit-0,1 5& r.I. ist bei 841 eim zweiter Molekelpeak vorixaioden).

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	Fragmentpeaks sind:	I. )
Die wichtigesten	( 27 5	I. )
739	( 3,7 5	I. )
592	( 30 ?	I. )
535'	( 9 -5	I. )
388	C 13 ?	I. )
386	( 13 5	I. )
284	-( 12 7	I. )
187	( 40 ?	I. )
171	( 34 7	I.)
101	( 25 f
88	Ό r.
75	h r.
	6 r.
	6 r.
	¹O r.
'o r.
^fo r.
br.
£ r.
¹o r.
Base peak

Die folgende Struktur für III ist mit allen chemischen und spektroskopischen Eigenschaften in Einklang:

CH₂OH H »oflH

Komponente IV ist das nächst höhere Glied der homologen Reihe. Die Verbindung läßt sich bei saurer Partialhydrolyse in Komponente II und Glucose im Holverhältnis 1:2 spalten.

Dünnschichtchromatographie:

Fließmittel: n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50:30:20

DC-Fertigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher + Schüll):

^RGlucose-^{Werte: IV:} °.41-0,46 Le A 15 177 - 16 -

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Die höheren Homologen, insbesondere Komponente V - VIII, vermögen Saccharase sehr viel weniger..und o(-Amylase aus Pankreas sehr viel stärker zu hemmen.als die niederen Glieder der Reihe (Komponente II -.IV).

Bei der sauren Hydrolyse höherer Komponenten lassen sich die jeweils niederen als Zwischenprodukte nachweisen; daneben treten als Spaltprodukte Glucose und Maltose auf.

Dünnschichtchromatographie:.

Fließmittel: n-Butanol/lthanol/Wasser = 50:30:20

DG-Fertigplatten F 1500 Kieselgel (Schleicher + Schiill):

^HGlucose-^{Werte: V:} ..,0.30-0,34 .

VI: 0,21-0,23 VII: 0,14-0,16 VIII:- 0,09-0,11.

Die spezifischen Hemmaktivitäten der inhibitorisch wirksamen Aminozuckerderivate werden mittels in vitro Enzymhemmtests ermittelt.

Amylasetest _: ,

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50 i< > inhibiert. Eine Amyläseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /U Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als /uVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als /uVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 - 22 AE/ml) mit 0 - 10 /Ug Inhibitor

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oder Q *· 20 ,ul der^j zu testenden Lösung in 0,4'ml 0,02m Natriumgrycerophosphatpuffeif/OiOOIm CaCl₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10 - 20 Minuten in einem Wasserbad von 35 C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer "auf 35 ö vorgewärmten 1 $ Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35⁰C inkubiert und anschließend mit T ml Dinitrosalicylsäure-Reagehs (nach P. Bernfeld in Cdlowick-Kapian, Meth/ EnzymoT., Band f, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz"5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 ώα wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenenAmylaseeichfcurve die' nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivitat abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. D%e prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

/ug Inhibitor +

=■""■■ "■■ AE ++ ' ' '■'■"■'

+ bezogen auf Trockensubstanz

++ AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie

aufgetragen^ der 50 fo Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccharasetest . . " .

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die.zwei Saccharaseeinheiten zu 50 ^ inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym,die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 /uMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die yuMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion

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quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharοsespaltung durch die Saccharate nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung ¹^ mit 0 - 20 /ug Inhibitor oder 0-20 /ul der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 55°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe

2)
von 1 ml Glucoseoxidasereagens ' ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35⁰C Danach wird 1 ml 50 fo ^H2^S°4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50 $ Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

' Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12« (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

2)
' Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von2 mg GIucoseoxidase (Fa. Boehringer Nr. 15423) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95 ί« Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin . 2 HCl in 20 ml H₃O) und 0,5 ml 0,1$iger wäßriger Peroxidaselösung (Pa. Boehringer Nr. 15302) hergestellt.

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Maltaset es it

Eine Mältase-lnhibltor-EIÄaelt (MIE> ^Ist -üef iniert · als die "■■ ;.." Menge InfeiMtcr, die -stiel Mal tase einheit eis eh 50 ^ inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME). ist die Menge an-Enzym, die in eimer Minute unter den Tinten angegebenen I¹ est bedingungen 1

Maltose in 2 /uMol Glucose spaltet» Die /laMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der 51iicoseoxldasejreakti©ii quantitativ -, ; bestimmt- unter Bedingungen;, bei denen eine weitere Maltose— spaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet» Zur 'Dureia-:

führung des Testes werden 0,05 al einer auf 0,050 - 0.070 eingestellten Maltas elö sung ¹' mit 0 - 20 /Hg Inhibitor oder 0 - 20 /iil der zu testenden irösung versetzt und mit 0,1 m U umnialeinatpuffer.pH 6,0.auf 0,1 aal aufgefüllt. Es wird TO Hinuten bei 35 C äquilllDriert und dann mit 0.1 ml einer auf 35 C vorgewärmten 0.05 m Haitoselösung In 0.1 η ITatrliaismalelnatpiiffer pH 6.0 versetzt. Äan Inkublert 20 Minuten bei 35⁰C und stoppt^:

die Maltasereaktion durch Zugabe iron 1 ml Glucoseoxldase-

2) ο

reagens ^J ab und Inkubiert weitere 30 Minuten bei 35 C

Danach wird 1 ml 50 $ H₂SD. zugesetzt und bei 545 um gegen einen entsprechenden leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50 i° Hemmpunkt mit Hilfe einer Glueoseelchkurye auf MIE/g bzw, MIE/Liter "umgerechnet.

Solubilisierte Maltase aus Sehweinedünndarmmucosa nacla B. Borgström, A.Dahlquist, Acta Chem.Seand.J^,, (1958), Seite 1997. Mit 0.1 m Hatrlummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.

2) * Bereitung des Glueoseoxidasereagensi wie beim Saeehare.se-

test,, S. 19» Fußnote 2)., besehrieben.
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Λ 4.

Die Ergebnisse der in vitro Emiymnemmtests für einzelne individuelle Homologe und diskrete Bereiche von Homologen der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt:

η = Zahl der Hexose- einheiten	AIE/g	SlE/g	MIE/g
Aminozuckerderivat mit η = 1	300.000	30.000	5
η =	300.000	68.000	15.
η =	1.400.000	21.000	5.
η =	17.500.000	8.500
η =	30.000.000	2.500
¹ 2	.000
= 3	.000
= 4-6	.000
■' 5-7	—
—

Wie aus der Tabelle ersichtlich, steigt die spez.Hemmaktivität gegenüber Pankreas-,^- Amy läse mit zunehmendem Molekulargewicht der homologen Reihe stark an; so zeigt der Bereich von η = 5-7 eine 100-fach stärkere Enzymhemmung in vitro als das Aminozuckerderivat mit η = 1 oder η = 2. Andererseits ist die Saccharaseinhibition bei dem Derivat mit η = 2 am stärksten ausgeprägt, das Derivat mit η = 1 hemmt nur noch halb so stark, und die höheren Derivate zeigen eine weiter abfallende spez. Aktivität der Saccharasehemmung.

In vivo läuft die Wirksamkeit im Saccharose-Belastungstest der in vitro gefundenen spez. Hemmaktivität in etwa parallel. Dagegen fanden wir beim Stärkebelastungstest in vivo für die Aminozuckerderivate mit η = 1, 2 und 3 .eine im Vergleich zur Amylasehemmung in vitro 10-40-fach gesteigerte Wirksamkeit (vgl. Beispiel 18, Tabelle 1 mit den Tabellen 3, 4 und 5).

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- 21 -

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2347182 -ti. .

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungs- und Genußmitteln (z.SL Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Sctokolade) Hyperglykäinien atif treten, die infolge eines raselweaa Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B„ Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) aiach folgendem Schema

Amylase Maltase Stärke bzw. Glykogen > Maltose * Gluicoase

Saccharase
Saccharose > Glucose + Fruktose

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besomäsers starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermeiairtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im AnschlmS an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesundem and adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien. als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oo-fler begünstigt.

Es wurde nun gefunden, daß erfindungsgemäße, nach obigen Methoden gewonnene und isolierte Inhibitoren der Glykosiä— hydrolasen die alimentäre Hyperglykämie, Hyperinsulinämi-e, Hypoglykämie nach Belastung von Ratte und/oder Mensch mit Weizenstärke oder Saccharose oder Maltose erheblich vermindern und die Magenpassage dieser genannten Kohlenhydrate beschleunigen. Darüber hinaus hemmen sie die Resorption iwa Glucose aus dem Darm. Ferner wird die Konversion von Koftlezi-

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1347782

hydraten in lipide des Fettgewebes und der Einbau von alimentäreia Fett In die FettgäweibedWpots verzögert, "'""' " ^! ■

Ferner ist bekannt, 3ai Ie isr äIMsMM EsMi@]ifiral#j be sonders .Saccharose, durch' Mikreorganisaeai gespalten werden und dadurch die EarlesMMnMg gefSMeri

Inhibitoren der Therapeutlcvm für folgeaade

Adipositas, Hjperlipaaiediabetes, Sastritis, Karies. ·. . ' ... .

eigiaen -s|.©fe deslall) als

«,' Biaisetes

daaodeni nand

dosierung '.:...■.. - ■ . -

30 - 300.000 ME/kg qdejp 1 - lO.OOfi SJl/^ ein- -fltler anehrmals täglich vor land/oder wahrend laati/oder aaa-ela- .den Mahlzeiten bzw. Getränfeen p.o.s» ..,-.. ;

Zubereitungsforfflen ■....-■■ ν

Tablette, pragee, Kapsel,, JLösiang, Sias$.eaaai©n, Sranula1;_f. Kaugummi, Zahnpasta und als lusatz zu kotoleBhjdrathaltigen Lebens- und/oder SenuSmititeln.» . . .

Die foxizität dieser Inhibitoren der Sljkosidhydr^laasn imä {JlucoseresorptionsheEiBer ist extrem gering» Der Wirkstoff aus dem Beispiel 9 (löhinhibitcr mit Si.OÖO Sll/gl Mira in Analogie zu den'Wirkstoffen anderer Beispiele in einer Dosierung von 340,000 SIE/kg Maus land Satte p,©"s sjimptöml©s vertragen. Auch bei intravenöser Im^ektiön tölerierem 10,000 Sl^kg symptomlos»

Torteilhaft siaad auch Köabiaaationsn #sr IjjJaiiiitoren alt den bekannten oralen trope SuIfonjlharnst off derivate land/od«!· " Biguanide). ■

A 15 177 - 23 -

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 1

©images. Beisjpjele» wäjRt als AissgaisigsaniadkesdLal. eine

Mas Ibeiepffifc eimern' SlasfeiaaeiELteir eilt; 8 liter JSaJteloäsiHBig der

setsnqg 5»© iß> Starke, Ί,Ο Jt Meffeextralct, 0,2 jC ait eiiGieM 3 iage alteM ScMittelkullseii des

imä. BeXüfitTUifag 3 Tage !sei. 28°€ umä eacinalifc eime

miEid 3je^!rffl.tet (uusiter fitmoEig 3 Sage 1
ait 105·<

6 Üitsr. dieser Fe3nBieata1tioffi5l33rffilie weiräen aach dem auf 20⁰C nit kalÄoinz^Eitriertejr ffli®^ auf pH' 2_S5 eingestellt, aalt 30 g €aar1b©raf£im—AktiwtaMie veirsetxt; n&Qid 10 3fSinaatea ge^- 2-taurt- ÄffiiselslielEeJid wJjnä 15 Mlyrotem !sei 1O.OOO Wpm 2ze3ai;3rif-«tdes* Hare, Saeügellbe tflbearsfeaaai macla. ®ewt3Palisa1fciou.

mit 1H™ aiaff 5®0 ml eiiogeeiiigt· Hie 5>€>© ml

I © G

45 ffijBnatenL mit 2©0 g A*berl3-1te IBi 41© Gl~ gearSilart;, and mit 4/5 ¥©1» = 400 al' Metliam©! Tre^raetsit, um €ie

der MÄeaaioielaalaareü StärkeatateampitiötDikte C nocia "yoriasuiMleiaeni. Äfcitxvfcolaleiresifceia} amszMfälLleja.. Es 5 Mimateii isei 5-OGO ¥pa seatarifjagieart» Uie S5© muL H werden amter iaatemsiTeaa Elkrem iaa 4 Itr· Tröckeiöüspirii; eingetropft. Die weile, fl©elige glällmnag

3imal «it Trodceaasparitiz nainä 2mal naii; Äther 'gewaacheis. Tand »it 10 χ 1©

im ¥ataffiim l»ei 5© SJ ^etapGiciimet, !.iiaslenates 36 g eines weiSea'

JLe A 15 117 - 24 -

ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 2

Zur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen und der ^: Zusammensetzung von Präparaten mittels Dünnschichtchromatographie trägt man 1 /ul der Fermentationsbrühen oder 1 /Ug der Präparate auf Kieseigelfertigfolien (Fa.Schleicher u. Schüll, Dassel, Typ F 1500) auf und entwickelt 2mal in n-Butanol/Äthanol/Wasser = 50/30/20.

Zur Saccharaseinhibitionsfärbung besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20 χ 20 cm Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5¹ in einer feuchten Kammer bei Räumtenperatur vorinkubiert und anschliessend satt nit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40⁰C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60 - 90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele;

Enzymgel: 1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Francais) wird in 100 ml 0.2 m Na-Maleinatpuffer pH 6.0 suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50⁰C abgekühlt und mit 250 /ul Triton X - 100 Lösung (2 g Triton Z-100 + 8g Äthanol p.a.) und 0.5 ml Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1ml GOD/POD-Reagens (12.5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa.Boehringer, Best.ITr. 15423 und 2.5 mg Peroxidase,Reinheitsgrad II, Fa.Boehringer, Best.Nr. 15302, gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm · zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen auf 50⁰C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt.

1) Enzympräparation wie auf S. 19, Fußnote 1) beschrieben. Le A 15 177 - 25 -

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23^7782

Substratgel: 0.5 g Α,-rarose wird in 100 ml Na-MaleinatpuEffer pH 6.0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend auf 50°C ab, versetzt mit 100 /ul Triton (2 g Triton X-100 + 8 g. Äthanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35579) zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Zur Amylaseinhibitionsfärbung besprüht man die entwickelte und getrocknete DC-Platte mit einem-Amylasegel (20 ml/ 2O χ cm Platte) und läßt erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gelschicht in eine 0.5/^ige Stärkelösung (1 g Stärke, Merck Kr. 1252, in 200 ml 0.2 m Glycerophosphatpuffer 0.0/mCaCl₂ pH 6.9 unter Kochen gelöst) ein und beläßt sie dort für 2' bei 40 C unter Umschwenken der Lösung. Danach wird die Platte mit dest.Wasser gut abgespült und zur Anfärbung der nicht abgebauten Stärke in eine verdünnte J_?-Lösung (4 ml Jp-Stamolösung auf 500 ml HpO; Jp-Stammlösung: 2.2 g J_? + 4· 4 g X*T in 100 ml HpO gelöst) eingetaucht. Nach ca. 1 Minute ist die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.

Bereitung des Amylasegels:

1 g Agarose wird in 100 ml 0.2 m Natriumglycerophosphat/ 0.01 m CaOl₂-PUffer pH 6.9 bei 100⁰C gelöst, nach dem Abkühlen auf 50⁰C werden 100 /ul Triton X-100 (2 g Triton

X-100 + 8g Äthanol p.a.)zugesetzt. Direkt vor dem Bespracyen setzt man 100 /ul einer Amylasekristallsulspension (10 mg Schv/einepakreasamylase/ml ges.KH.-Sulfatlösung, Fa.BoehiäLnger, Nr. 15017) zu.

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5098 15/1208 ORIGiNAL INSPECTED

■ Beispiel 3 ■ ■

Beiiapft man 1'ltr jErleiwieyerkoXfeeÄ ait 120 äI eimer lösung bestehend aus .4 1» Stärke, 2,4' iß> Qiiaeose, Ö,S lysat und 0,9 $ Hefeextrakt," JÜ mit BaOH auf' 7»6" ©iiagesteilt, rait 0,4 ^ GaCO- versetzt und 3© miü« bei' 121°C steidisiert, mit 3 ml einer Toj^kultur des ^:äStäffl»es 'SE" 82, " as^ewaefeseiit' im einer Nährlösung bestehend aus 2 ¹^ Stärke, t $»-Gltoucose, 0,5 Kaseiniayürolysat und 1 £ Hefeextraltt, pH mit HaOH ws£ I₉Z eingestellt, eit 0»4~/^: CaGO₃'Vexsetsst fflnd 30^: mjjel bei 121®C

•5 - - ο ■ ■ - · ..·-■■--·

sterilisiert, und bebrüifcet *5 fage bei 28 C" auf schütteliaaschine, so erlaälifc man. eiae'Kult;lariSsii 122.000 ÄlE/ial. Ztut Amfarlieitioaag treiojit iiaa. das den vereinigten KTnlturlÖsmiigea diartila Ceatrifu^.1tl.©ia bei

12.000 iJpm ab, bringt 300 ml des KmLtTiirfiltrates uäi; halbeomc HMO₅ auf pH 2,5 und rührt" für 10 ^:mini""äit 2,5 g 1-isiile ρ·Α·'

Kaeh. Abtrennung der Kohle bei 12.000'¥pn .wird, die 10 M KOH auf pH 6 neutralisierte Dösuang mit 3CMi m

versetzt, kurz stellen gelassen land'bei 12-000 Wpm w€m Mieder

schlag befreit. Tropft «am msm. den üfberstand · im 3 iitr Ä HC)I, isoliert die fällung nacla kurzeis Stehenlasset

Gentrifugatioii-bei 12.GOO Wpn,' wascb-t" dea BiedersclLiag zweiaaal mit abs. Äthanol und eiamal sit -Äther Tooad trocfcsaet i« Wmkmam,,

so erhält man 2,23 g eines Produktes Mit 7,45 x das zvL über 95 $ nöiaere MomoXoge der mit n> 4 enthält.

Le A 15 177 - 27 -

509815/1208 ORiGiNÄL INSPECTED

"lt.

Beispiel 4 , , _;

Beimpft man-1 L Erlenmeyerkolben, 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3.5 i° Glucose, 2 # Stärke, 0,5 Kaseinhydrolysat, 1,3 $ Hefeextrakt, 0.3 % CaGO und 0.3 $>

₂ vor Sterilisation auf 7.8 eingestellt, Sterilisation 30'/121°C» mit 6 ml einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 in einer nährlösung bestehend aus 3 i° Sojamehl, 3 f° Glycerin und 0.2 -Ti-GaCO, und bebrütet 3-4 Tage auf einer Rundschüttelmachine bei 24 C, so erhält man eine Kulturlösung, die 153 000 AlE/ml und 12 200 SIE/ltr enthält.

1 Ltr. Kulturlösung wurde mit HNO, auf pH 2.5 eingestellt, mit 5 g Aktivkohle 10' gerührt und anschließend 30' bei 5000 üpm zentrifugiert. Anschließend wurde durch Zusatz von 25 g Amberlite IRA 410 (OH" Form) neutralisiert. Per neutrale Überstand wurde auf 100.ml einrotiert, mit 100 ml . Methanol versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde in 2 ltr. Trockensprit eingerührt, der ausfallende Niederschlag abgenutscht und nach 3 x Waschen mit Aceton und Äther im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 14 g eines weißen Pulvers mit 5 x 10 AIE/g, das überwiegend Homologen mit n;>4 enthält.

Beispiel 5

Arbeitet man nach Beispiel 4, jedoch mit 0.5 ^ Stärke, so erhält man nach 4-tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 40 000 AIE und 184 SIE/ml. Me Kulturbrühe enthält Homologe von η = 1 an.

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Beispiel 6

23A7782

Beimpft man 1 ltr. 3rlenmeyerkolben, die 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 3 f« Glucose, 0,6 $ Kaseinhydrolysät, 1,6 io Hefeextrakt, 0,3 '£ CaGO-, 0,3 1« K₂HPO., pH vor der Sterilisation mit KOH auf pH 7,8 eingestellt, mit einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 nach Beispiel 4 und bebrütet

4 Tage bei 24 G auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturbrühe mit 10.800 SIE/ltr. die überwiegend das Aminozuckerderivat mit η = 1 enthält.

5 ltr Kulturfiltrat, bei 13.000 UPM vom Mycel abgetrennt, wurden mit hälbconc. HNO-, auf pH 2,5 gestellt und für 15 min mit 55 g Aktiv-Kohle ("Merck") und 200 g Clarcel gerührt. Nach dem Entfernen der Feststoffe durch Absaugen neutralisierte man mit cone. Ammoniak auf pH 7, engte die Lösung auf 1,5 ltr ein und fällte.mit der fünffachen Menge Äthanol. Der resultierende flockige Niederschlag wurde mittels eines Durchlaufrotors bei 12.000 Upm abgetrennt und der gelbliche Überstand auf 150 ml eingeengt und zur Abtrennung geringer Anteile ungelösten Materials niedertourig centrifugiert. 50 ml dieser Lösung wurden auf eine mit Amberlite IR-12Ö (H⁺-FoMi) gefüllte Säule (30x300 mm; 30 ml H_?0 pro Stunde) gegeben. Nachdem man insgesamt 300 ml Eluat aufgefangen hatte, welches inerte Saccharide sowie einen Anteil nicht adsorbierter hemmaktiver Komponenten enthält, überführte man den Austauscher mit ca. 400 ml HpO in ein Becherglas und fügte.unter Rühren so lange cone. Ammoniak zu, bis der pH einen Wert von 11,5 erreicht hatte. Nach 30 min weiterem Rühren trennte man vom Austauscher ab, engte auf i/20 des Volumens ein, filtrierte über eine Säule (20x150 mm) mit Amberlite IRA-410 (HCO-¹-Form) und fing bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/std ca. 500 ml Eluat auf, welches eingeengt wurde und nach Lyophilisation 1,3 g Rohprodukt ergab.

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. 3o.

Zur weiteren Reinigung wurde das rohe Präparat an Bio-Gel P-2, 100-200 mesh (Fa..Bio-Rad, München) fraktioniert. Dazu diente eine Säule von -50 mm 0 und 450 mm Länge, die mit H^O bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml std betrieben wurde, wobei man Fraktionen von je 10 ml sammelte. Alle Fraktionen wurden mittels des Anthrontestes auf Kohlenhydrate sowie mittels des Saccharase-Hemmtestes auf inhibitorisch aktive Komponenten geprüft. Die Saccharase-Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden weiterhin dünnschichtchromatographiscn nach Beispiel 2 auf ihren· Gehalt an individuellen Komponenten untersucht. Diejenigen Fraktionen, welche das Aminozuckerderivat mit η = 1 enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 35 mg des Aminozuckerderivats mit η = 1 mit 0,3 x 10⁶ AIE/g und 30.000 SIE/g.

Beispiel 7 ■ ■

Beimpft man 1 L Erlenmeyerkolben mit je 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 5 °/° Stärke, 1 °/o Hefeextrakt,

0.2 $ K_pHPO. mit je 2 ml einer Vorkultur nach Beispiel 4,

so erhält man nach 3-tägiger Bebrütung bei 28 C Kulturlösungen mit folgender Ausbeute an Amylase-Inhibitor:

Stamm AIE/ml

SE	50	37	000
SE	50/13	109	000
SE	50/110	53	500

die vorwiegend aus Aminozuckerderivaten mit n> 4 bestehen.

Beispiel 8

Beimpft man 1 L Erlenmeyerkolben mit je 120 ml Nährlösung der Zusammensetzung 1.3 ^cß> Maltose, 3.5 ^a/° Glucose, 0.5 % Kasein-

hydrolysat, 1.3 °/> Hefeextrakt, 0.3 ^ OaCO₃, 0.3 $ K₂HPO₄ Le A 15 177 - 30 -

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- ί>£ -ZA-

mit je 2 ml einer .Vorkultur nach Beispiel* 4*^; so erhält man ^; •nach ,4-tägiger. Bebrütung auf Rundschüttelmaschinen bei 24 G mit verschiedenen Stämmen.folgende Ausbeuten;

Stamm SIE/ml AIE/ml . .

SE	50 · -:	..- 25	8 .■ .-.	, 580
SE	50/13 .	14.	9	..-"... 1460
SE	50/110	57.	, 755

die vorwiegend ,aus Aminozuckerderivaten mit n< 4 bestehen. -

Beispiel 9 ·

Beimpft man einen Ferment er mit .1.00 L Nährlösung der Zusammensetzung 3.5 i° Glucose, 2.5 ^c/° Maltzin, 0..5 ^ Kaseinhydrolysat, 1.3 Io Hefeextrakt, 0.3 $> CaCO , 0.3 ^ K₂HPO und 0.1^ Antischaummittel mit 5 L einer Vorkultur nach Beispiel 4 und bebrütet unter Rührung und Belüftung -5 Tage bei 24⁰C;,- so ; ^; erhält man eine Kulturlösung mit 73 000 SIE/L, -die vorwiegend das Aminozuckerderivat mit η = 2 enthält. ·

90 Ltr. Fermentationsansatz wurden-mit Hycel am pH-Meter mit konz. HUTO, auf pH 2,5 eingestellt und unter Rühren mit 900 g (= 1 fo) Aktivkohle (Merck) zur Adsorption der Häuptmenge der gebildeten Farbstoffe versetzt. Man rührte für 1.5 Min., trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg Clarcel über eine Drucknutsche. Man erhielt 65 Ltr. gelbbraunen, klären Filtrats mit einem SIE-Gehalt von 60 000 SIE/Ltr.

Le A 15 177 - 31 -

509815/120 8

Bas FiItrat wsiaräe mit lEoaz. IM, auf¹ pH 7 eiäHgesrtelXifc - usual· »ear Adsorption des WirfcsifceiT» ami* 130© .g f^} ÄÜ^SraMbe fSeXisk| flr 3©" seiffitart. Ham Ciltarieirt; iObear slme Jttm£kaas!tatclm wad. «Ms-ell das AktirkiiMlesedifflieiit 3 χ mit; 1© itar*. destlllierifc«» Wassei·- JjascWLieieuti. wiaunäe die K©MLe gmt itrockeffli gedbräckf wtäM. im. 3x4' !»iiteinai 5® # Asetaa !»ei ^ 2,5 Hör Jeweils 15* geröhrt,, se Aem Wirkstoff "y©n der Xa^IuLe zaa. iiesorliieareiBu Bie acetemisctoea Itesarljat;« -*maniem — jaadi Äläitjoeiamem wem flejp !»lale <imrcäi Filtraiticsm — v-earieinigt;.' Maat ®^t;e aias ■weaneimlgt;« JSesojr— bat aa Motati©nsv«3öä^»ff©r asaf 250 al ©im, veinsetsBt© «it eiaen gl«ic!laeH WOlLemeiii {25® anöL) MetisajwiJL uaai f"il1tari®iibe ein Haltemfiltea-- Bas FiI1tara.1fc CfÄD mL} wwonäe im. 5-TutEiteir klüftig«» Äiftorea .®iMgetir®iDfft;· Bei·

wiariie aljgenuunltsdbit vmS. - 3 x iniit

gewasekem. AmseSalieBemi. WGünäe im Takaisim bei 35 23® g Mit

25 ig; des ©feigen rollen ütidiakts wurden in 1 Iiifcir.

und icit 3©0 g jßowea: 5OSiX 4 if^CSOO—4<0O xatesb.) 3Ö* gerSnart. Man.

filtrierte das Έ&χζ a© tgumI wiasek 3 x-ait 2 IAt.

κ HCl lach. 3as gewascfcene Jtowex wuunäe anscml 500 Eil SLQ sus]pendie:rt nand die Suspension as jfi-Meter SBgatoe von 25 1» 1H_ auf p 9.0 eingestellt. 1 wurde noch 2 χ milt Je 500"ml 0.6 $ UH^ desertiert, die Bescrliate irereinigt nand am fflotations^erdanipfer auf 100 3ml eingeengt. Znar Sntfärlssjng dieses Eonzentrats wurde ea »it 2 g SEÄE-ZelliJlose ila.SclaleisAer land Sc&SlJL ITr. Ö2O35, 0,6 a¥al/g) für 5 Min. geräütart, äaaan aentrifiagiert. Der Baelljgelfce Üllbesrstanä wwcas -oit eiaea glLeiclaeui ~¥©l»ien (1CM3 aal) Hettanol Tersetzt nand dann in 2 3üitr. Aceton lan— ter intensiirea fiSiiren eiaageibropft» üßer ITiederscialag albgenatseiit, aait Aceton ιαηΐ Ittoer ^ewascnen «aaä im

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bei 35^OC getrocknet. Ausbeute 4.2_;g sit .26 000 SlE/g. Zur weiteren Peinreinigung wurden ^äiel· 4*0 _g- Inhibitor in 0.5 g Portionen über Biogel P-2 gelfiltriert. Dazu wurden 0.5 g des Präparats in 10 ml H^O-gelöst und auf eine Biogel P-2-Säule (200-400 mesh, Fa. Bio Rad) vom Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fließrate von 80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt (in Form des Anthrontest als Extinktion bei Ε_ίο^) sowie der Gehalt an Saccharase-Inhibitor und Amylase-Inhibitor ermittelt. Außerdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographysch (Enzym—Inhibitionsfärbung) geprüft.

Die Fraktionen, in denen die Aminozuckerderivate mit η = 4-6 nachgewiesen wurden, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 ml eingeengt und durch Eintropfen in 200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abcentrifugiert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet ; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,2 g Aminozuckerderivat mit η = 4-6 mit 17,5 x 10 AIE/g und 8.500 SIE/g. Die das Aminozuckerderivat mit η = 3 enthaltenden Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte; Ausbeute aus 4,0 g Rohinhibitor: 0,1 g Aminozucker— derivat mit η = 3 mit 1,4 χ 10⁶ AlE/g und 21.000 SIE/g. Aus den das Aminozuckerderivat mit η = 2 enthaltenden Fraktionen (Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g Aminozuckerderivat mit η = 2 mit 0,3 x 10 AlE/g und 68.000 SIE/g isoliert.

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Beispiel 10

Beimpft man 3 Kleinfermenter mit je 8 L der Nährlösung 7.5 i° Maltzin, 0.3 1° Kaseinhydrolysat, 0.7 fi Hefeextrakt. 0.3 > CaCO , 0.3 i> K HPO mit 5 i> einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (gewonnen nach Beispiel 4), so erhält man nadh 5-tätiger Bebrütung bei 24°C eine Kulturbrühe mit 73 SIS/ml, die vorwiegend Aminozuckerderivate von η = 2 enthalten. Nach Zentrifugation (30' , 3000 Upm) zur Abtrennung des Ejycels erhielt man 20,5 Ltr. einer tiefbraunen Kulturlösung mi* 67 000 SIE/L. Man stellte mit HNO₃ auf pH 3,5 ein und setzte zur Entfärbung 60 g Lewapol (Ca 9221, 0.35 mm Körnung, Fa. Bay er)/L = 1.23 kg Lewapolzu. Nach 20' Rühren wurde ä"ber ein K 3-Filter abgenutscht. Die entfärbte Kulturlösung wurde mit KH neutralisiert (18.5 L, 67 000 SIE/L). Man rührte anschließend zur Adsorption des Wirkstoffs 20 g JÜc— tiv-Kphle/L = 370 g ein und ließ 30' rühren. Anschließenil wurde über ein K 3-Filter, das mit einer Schicht aus de» Filterhilfsmittel Clarcel beschickt war, abfiltriert. Has Filtrat (17.5 1, 3600 SlE/l) wurde verworfen. Der Kohle-, rückstand wurde 3 x mit 2 1 dest. HpO gewaschen. Zur Desorption des Wirkstoffs von der Kohle wurde diese 3 x nacheinander mit jeweils 1 L 80$ig. Aceton für 15' gerührt, wobei das pH mit konz. HGl auf pH 2.5 eingestellt wurde· Die Desorbate wurden vereinigt (2,4 L. , 371.000 SIE/L)- In dieses Desorbat wurden 20 g Dowex H⁺/L (Dowex 50Vi X A₉ H⁺- Form, Fa.Serva,Heidelbei^ = 46 g Dowex eingetragen und 20' gerührt. Anschließend wurde das Harz abfiltriert (Dowex— fraktion I) und mit etwas 75 %igem Aceton nachgewaschen- Das Filtrat und Waschflüssigkeit (3 L = 215 000 SIE/L) wurden mit 60 g Amberlite IRA 410 (0Η~ϊΌπη) (Firma Serva Heideübei^/L gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschließend wurde abfüLtriert und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/L) mit 72 g Dowex H* versetzt und 20' gerührt. Das pH wurde dabei durch Einhängen

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_eines mit Araberlite IMA 410 OEf" gefiillten/porpsem beutels auf 3.0 gehalten. Änschließenä wurde vom abfiltriert (Dowexfraktiom II), das Filtrat t2»& 1<, 2? SIE/!) wurde verworfen. .

Bowexf raktion I and II wurden Jede fair* sieh 3 x Mlit- 15 # Aceton bei pH 3,5 gewaschen und anschließend Je 3 ac wLt, Je 100 ml (Bowexfraktion I) bzw. 150\al ■ CBowexfrairffci^a 0.6 5^ BH^ desorbiert. Bei der Ί. Desorption, !sei äea Israoniakmenge zur. Seutralisation des Dowex-Harzes si.cüit; ausreichte, wurde diircli Zugabe von konz. SIL, am auf pH 9 eingestellt. Die -3 JBesorbate von Bowex und II .wurden für sick vereinigt, am fast zur Trockne eingeengt, in 50 büL HpO aufge3M»meini, am pH-Meter ait HGl auf pH 3 — 4 eingestellt und mat 5® mi Methanol versetzt. Die lösungen wurden in 1.5 Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende abgenutscht und 3 x nit Aceton sowie 1 χ sit Ät&eir gewascfeem. ISan trocknete in Takuniia-

Ausbeute: fraktion Γ 6.5 g 25 000 Sis/g Fraktion II12.3 g 36 000 SIE/g

Fraktion I und II enthalten als hemaaktive Bestaiai1teil.e hauptsächlich das !minozuekerderivat Mit η = Anteilen des nächst höheren Homologen (n = 3).

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Ausbeute	■2O.5- "	1Ö.5
	2}na.ch Lewapol 19-5	0» 7
	3)3n.ack Aktiv— kolilead- sorprtiom	0,9
1 DKiiltnjurlö—	4)1.Besoribat	0.8
5)2, »
6)3. . ^M

SIE gjeseuat SIE

313

142000

519 4

296 100

68 000

37.1

21-J

- 5J

2,4

8)nach 1 _Λ Dowex— 3-0 adsorption

9)nach Neutra- 2,8 llsat»mit
LRA- OH"

10)iiaeh 2.Dowex- 2,5 adsorption

)vereinigte IiH₅ .Q.29 Desortate von Dowexfraktion I

12) " von

Do wexf rakt I on 0.45 II

13)Fällung

Fraktion I 6.5g Fällung

Fraktion II 12.3g

3710OD

215OOO 219ΟΟΟ

.27OOO 682000

1 419000

25000/g 36000/g

890 400 645 000 613 200

67 500 197 780

638 550

162 500 442 800

64.8

(4.9 verworfen)

14.4

46.5)

11.8)

)44-

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 11

200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden in 940 ml destilliertem Wasser und 60 ml konz. HpSO. gelöst und 4 Stunden unter Rückfluss erwärmt (Innentemperatur: 98-100⁰C; Ölbadtemperatur: 140°C). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde mit 10 g Aktivkohle (Merck Art. 2186) versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 η KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 2 1 Wasser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 30$»igem Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsverdampfer ein. Rückstand: 6,2 g. Dieses Rohprodukt (6,2 g) wurde in 500 ml Wasser gelöst und mit 30 g Amberlite IR 120 (H -Form) 1 Stunde vorsichtig gerührt. Man saugte den Austauscher ab und wusch mit destilliertem Wasser, bis das Filtrat neutral und frei von Glucose war. Der Austauscher wurde dann mit 15 ml 25^lAgem NH in 1000 ml HpO über Nacht ausgerührt, abgetrennt und verworfen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Rückstand: 3,7 g.

Zur weiteren Reinigung wurde eine Chromatographie an Cellulose durchgeführt. 4,5 g des vom Austauscher desorbierten Materials wurden auf eine 1 m lange und 2,5 cm weite mit Cellulose gefüllte Säule aufgetragen. Als Fliessmittel wurde zunächst Äthanol/H-0 5:1, zum Eluieren des Aminozuckerderivats mit n=1 wurde zunächst Äthanol/HpO 3:1, verwendet. Bei einer Tropfgeschwindigkeit von 20 Tropfen pro Minute wurden Fraktionen von jeweils 14 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen 47-85 lieferten nach dem Einengen 1,6 g schwach bräunlich verfärbtes Aminozuckerderivat mit η = 1. Die färbenden Verunreinigungen spielen mengenmäßig keine Rolle. Als farb-Le A 15 177 - 37 -

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loses Harz erhält man das Aminozuckerderivat mit η = 1, wenn man den Reinigungsschritt mit stark saurem Ionenaias— tauscher nicht im batch-Verfahren, sondern auf einer Saale durchführt.

Beispiel 12

200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wnarden in 940 ml destillieren! V/asser und 60 ml konz. HpSO. gel©s*t und i/4 Stunde unter Rückfluß erwärmt (Innentemperatur: 98-10O⁰C; ■ ölbad temperatur: 140°C). Die abgekühlte, schwaisz— braune lösung wurde iait 10 g Aktivkohle (Merck, Art.2186$ versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Akt i vkolü.« abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 η KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Me Lösung wurde 1 Stunde mit 50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 2 1 V/asser gewaschen und das Filtrat verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht mit 2 1 30$igesB Alkohol digeriert. Schließlich saugte man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am Rotationsdampfer elm. Rückstand: 8,0 g.

Der Rückstand wurde in 15 ml H„0 aufgenommen und auf ei tob mit 50 g Amberlite IR 120 (H⁺-Form) gefüllte Säule (Holies 20 cm, 0 2,4 cm) aufgetragen. Man ließ mit 3 Tropfen/ Minute einziehen und wusch mit Wasser nach (12 Tropfen/EBL— nute), bis alle nicht basischen Bestandteile entfernt waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5$igem KH, von der Säule eluiert (12 Tropfen/Minute) und die wäßrige Mfcstmg am Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1 g.

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2-g dieses Suekstansies wurden ia weiaig «fässer gelSst iaad auf eine, mit Sepkadex S-15 gefüllte Säiale (Holies "200 ©»ι JZf: 3,0 cm) aufgetragen. Es wsreie mit Wasser eluiert. Bei einer Fließgesebarlndigkeit' vom S al/stufflfle von Jeweils 2 ml abgenosoneii· Me einzelnen diinnschiehtefaromatograplilseii geprSft. Bie Fasalctlioneii 85 — S4 lieferten 280 sag des lalno&wekeröerivats mit m = 2) alt" einer spez» Aktivität ?o&"50 0Ö0* SIIBj/g· ■- - „

Beispiel 15

Inkiibiert man 2 g einer liübereltiaaag wie ii

beschrieben In 60 »Γ 20 Jh
pH 6,9 land 1 laM an GaGl-, iait Ig 4-iiiflase 'aias JüspergäÜüs" spec.' (SSE7A Ιο»' 13418) nanter stetigee RWarem. £ü? 12© atd. bei 37°C, erhitzt sefalieSlida fir 5 ain auf 100⁰C mfi.S^: zentrifugiert bei 4000 TGTpn -vom ¥ngel©sten ate, a©' esrlaalt iaan nacia Lyophilisation äer I©suing 1,9 g eimes yrsfliaktes mit 3500 SIE/s und 2 χ 10* AlS/g» Prüft Jaan dieses irsäaiidt iflittsls OunnschlehtchroiiiatograpMe ianfl' Sacelaarase—Intüibiti©nsf ärlbang wie in Beispiel 2 besehrlelsen» s© zeigt sieh₉ säaB an attiven TerMndungen Im wesentlichen öle Äm mit η = 1 j .2 und 3 vorliegen.

Beispiel 14

Infaabiert man 2 g einer ETibereitiaaag wie in Belsiplel 1 beschrieben in 30 ml 20 ml5 Aeetatpiaffer v©m pH 4,8 mit 1,25 mg ß-Amylase aus sweet potato (BOEHSI3JSS1 15471) imter stetigem Eühren für 120 std bei 37°G» -erlaitat senlleiBlieh für 5 min auf 100°ö und zentrifugiert bei 4O00 Bpm vom Ungelösten ab, so erhält man nach lyophilisation der !lösung 1,5 g eines Produktes mit 1800 SIE/g und 3·,8 χ 10 AIE/g.Prüft man dieses Produkt mittels Dünnschichtehromatö-graphie und Saeeharase— Inhibitionsfärbung wie in Beispiel 2 Ibes ehr leiben,, so zeigt sich, daß an hemmaktlven Terbindupgen im wesentlichen. d±e • Aminozuckerderlvate mit η = 2 unä 3 vorliegen» le A 15 177 - 39 -

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-.; .;■ ORiGINAL INSPECTED

Beispiel 15

Beimpft san einen 200 ml Erlemaeyerkolben, der 25 ml' einer Nährlösung der Zusammensetzung 0.1 Ji K₃HPO, 0.2 $ (ML)₂SO₄, O.O5 i° MgSO₄, 0.05 i°"TSSSl₉ 0.01 jji FeSO., 2 φ einer Zubereitung wie in Beispiel 1 .feeseinrieben mit einer Sporensuspension des. Stammes Asp.niger ATCC 11394 und bebrütet bei 28 C auf einer. Rundschilttelaascliine, so sinkt nach 6 Tagen der AIE-fiter yon 210 000' AlS/al auf' 53000 AlE/ml und nach 10 fagen auf 21300 AIE/ieI. Gleichzeitig mimnt der SXE/ml Gehalt von 7-0 auf 72 SIE/ffll zu.

20 ml einer- 10 Tage mit der Sporensusjpenision inkubierten Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels 30' bei 30OO TTpBi zentrifugiert- Sie'15 ml Überstand (72 000 SIS/l) wurden dureia 30-miniitiges Rühren alt 2 g Amberlite ISG 50 H⁺ und 1 g Amberlite ISA 410 ÖH~ entsalzt (leitfähigkeit kleiner als 2 m Sieaens), Man filtrierte ab und lieS das Eiltrat mit 5 ml/h durch eine mit Dowex H⁺In 0,001 η HCl äquilibrierte Säule C0 1 cm χ 10 em) laufen, AnselH±eJ3end wurde lait 200 aal 0.001 η HCl naeliigewasciien. Zur Desorption wurde 0.6 ^ JfflL— lösung durch die Säule gepumpt {10 ml/h) und 5 ml Fraktionen aufgefangen- J3ie die saecharaseinhibitorische Aktivität enthaltenden Eraktiünen wurden vereinigt, auf'2 ml am Höta— tionsverdampfer einrotiert und mit 2 al Methanol versetzt. tlasi stellte diese IiOsiang auf pH 3—4 ein und brachte sie durch Eintropfen in 100 ml Aceton zur fällung. Der niederschlag wurde atgenutseht, mit Aceton und Äther gewaschen und im Yakuum getrocknet» Ausbeute: 26 mg mit 28 OQO SIE/g₉ bestehend aus Aminozuekeräerivaten mit η = 2 und 3. !Die reinen Aminozuckerderivats mit η = 2 aus- diesea Produkt erfolgt wie in Beispiel 9 beschrieben durch Beifiltration über eine Säule mit Bio-Gel P-2. 23an erhält T mg eines Aminozuekerderivats mit η = 2 von 60.000 SIE/g.

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Beispiel 16

2 ltr KuIturfiltrat, welches man aus einem Fermentationsansatz wie in Beispiel 6 beschrieben durch Abschleudern des Mycels bei 13.000 UPK gewinnt und welches eine Aktivität von 13.000 SIE/g aufweist, wurden zur Reduktion des Salzgehaltes (Leitfähigkeit des Kulturfiltrates: ca. 10 mS) mit 500 g eines Gemisches aus 2,5 Teilen Amberlite IRC-50 (H⁺-Form) und 1 Teil Amberlite IRA-41C (OH¹-Form) für 1 std gerührt. Der Austauscher wurde abgetrennt, die Lösung auf etwas unter 100 ml eingeengt und zur Entfernung ungelöster Bestandteile bei 20.000 UPK für 15 min centrifugiert. Der Überstand wurde auf 100 ml aufgefüllt; er wies nunmehr eine Leitfähigkeit von 3,5 mS auf und wurde zur weiteren Reinigung auf eine Säule (55 x 400 mm) mit P-Cellulose (SERVA Kr. 45130; nach bekannten Methoden vorbereitet und in 5mM Ammoniumphosphat-Puffer; pH 5,5; äquilibriert) aufgetragen. Als Laufmittel diente genannter Phosphatpuffer; die Fließgeschwindigkeit betrug 90 ml/std, und Fraktionen von 18 ml Volumen wurden gesammelt.

Nachdem nan die Fraktionen des Eluates auf ihren Gehalt an Kohlenhydraten (mittels Anthrontest) und an Saccharase-inhibierenden Komponenten (mittels Saccharase-Inhibitionstest) geprüft hatte, vereinigte man diejenigen Fraktionen, welche sich im Anthrontest als nahezu frei von Kohlenhydraten und im Saccharase-Hemmtest als besonders wirksam erwiesen hatten (Fraktionen 60-170), engte auf 150 ml ein und filtrierte über eine Säule (50 χ 300 mm) mit Amberlite IRA-410 (HCO'-Form). Zur besseren Kontrolle der Entionisierung wurde das Eluat in Fraktionen aufgefangen (10 ml pro fraktion in 20 min) und auf Kohlenhydrat (mittels Anthrontest: durchweg nahezu negativ), auf Phosphat (mittels Ascorbinsäure-Molybdat-Reagenz: durchweg negativ) und auf Saccharase-Inhibition

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(mittels Enzymhenimtest) geprüft. Die hemmekti^en Fraktimasn (3-30) wurden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert, enueut aufgelöst und lyophilisiert, um 280 mg Rohinhibitor zu erhalten.

Zur weiteren Reinigung wurde der Rohinhibitor an Bio-Gel 3?-2 fraktioniert wie in Beispiel 6 beschrieben. Aus den Fraktionen, welche reines Aminozuckerderivat mit η = 1 enthielten, worden nach Lyophilisation 30 mg eines Produktes isoliert mit ©.,3 x 10⁶ AIE/g und 35.000 SIE/g.

Beispiel 17

Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit η = 5-7 geht w&m. z.B. von einer Zubereitung, wie sie in Beispiel 1 besclirieben wurde, aus.

Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel 1 in 250 unl HpO gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 10 das pH 5.5. Zur Entsalzung wurde die Lösung mit 60 g lite IRC 50 H⁺ (schwach saurer Kationenaustauscher, der lie Aminozuckerderivate aus wässriger Lösung nur spurenweis* bindet) und 20 g Amberlite IRA 410 OH" versetzt und 20' gerührt. Das Filtrat (Leitfähigkeit 0.5 mS, pH 3.5) wurste mit 1 η HCl auf pH 3.0 eingestellt (Leitfähigkeit 0.6 mS). 2fiL«se Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit Dowex 50 W(H⁺) gefüllte Säule (0 2.5 cm, Höhe 40 cm, äquilibriert in 0.00Ί η HCl) gepumpt und anschließend mit 2 L 0.001 η HCl nachge— waschen. Nach dem Waschen der Säule eluierte man mit 1.2 ^ wässrigem Ammoniak und sammelte 10 ml Fraktionen. Die iaahibitorisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, das im Vakuum abgezogen und die Lösung anschließend im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch Eintropfen in Trockensprit, nutsehte den Niederschlag ab und trocknete im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4.4 g mit 26,5 x 10⁶ AIE/g.
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Jeweils ü„5 g wurden sw Feinreinigung auF eine . präparat! ve-

Γ-2 SiIuIe, wie in Beispiel. .9 beschriebet!, aufge- . " und entwickelt. Jßie Mach IiC (.Am^laseinhibitions-^. färbung) Aminozuckerderivate aait η = 5-7—haltigen Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit Trockensprit gefällt. Augbeute aus. 0.5 g Rohprodukt: 0.2 g Aininoiiuckerderivate mit η = 5-7 mit 30 χ 10 ΑΐΕ/g und 2.500 SIE/g.

Beispiel 18

Versuchsanordnunj^en zum Maehweis der Wirlfunp: von Gljykosid— faydrolaseninfaibitoren und der GlucoseresorptionshenmianE .

an Ratte und Mensch.

Zur Erzeugung einer alimentären Hjpergljkäiaie und Hjper— insulinäfflie erfcalten nüchterne Matten (n = 6) bzw. nüchterne Versuchspersonen entweder 2,5 g Saccharose oder 2,5 g Maltose oder 1 g gekochte Stärke oder 2,5 g Gliacose/kg p.os bzw. 5ög Saccharose oder 50 g Maltose oder 50 g gekochte Stärke ©der 50 g Glucose/Person, p.os Jja. wässriger lösung oder als Sus- . pension appliziert-. Andere Batten, (η = 6) erhalten, die. ge— . nannten Kohlenhydrate In. der gleiciaeaa Menge, und zusätzlich einen der Kohlenhydrate In der gleichen Menge .und. zusätz-. lieh einen der. in den Beispielen genannten Wirkstoffe in der angegebenen Dosierung. Sesiinden ¥ersuchspersonen wird alternierend eines der genannten KoiileHhyärate im Abstand von 2 fagen oder, mehr einmal axt einem, der. genannten Wirkstoffe bzw, ohne diesen --yerabreieht« Die- Blutgliaeose ianä das Seriiwi nsulin werüen vor .sowie la /kwczen aeitliclaen Abständen von fünf Miaauteaa bis zu iärei Stunden nach Koh— lenhydratbelastiang +Wirkstoff im B-Lut.-aos üem retroorbita— len Yenenplexus von Satten bzw. im erafeitalvenen- oder Kapillarblut der Yersuehspersonen gemessen. Die Blut—-

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glucosetoestimmungen wetzen im Auto-Analyzer (Technic 02*^3/, nach HOPi¹MAIi: J.biol.Chem. 120, 51 (1937) oder enzymatisch mit {Jlucoseoxydase und o-ManisidinhydrochlGrid) _f; die SeruminsulinbestiMiungen nach der Methode von HAiES und SAIiDlE: Bioefeeia,if.^:*88, 137 C1963)) ausgefünrt. : ;'

II "yeraucfesanortteuang zim ITachweis einer Hemmung der gonver- --.· slon ύθώ. Kohlenhydraten in FettgeWebsIipid'e. | ■·■

'■<-' Hatten (n = 6j erhalten eines der in I genannten Kohlenhydrate in. i&afctiver Farm ztisaffliHen.mit ,eißer ge.eigneteii. Dosis -desselljen, Kohlenhydrats, das ater radioaktiv ( -C) markiert igt, + Wirkstoff aus den genannten Beispielen per Schlundsonde äppliziert« In kurzen zeitlichen Intervallen nach ¥ersuehsbeginn werden die Tiere getötet und epi-' didymales und/oder perirenales Fettgewebe gewonnen, die Mpide mit geeigneten EettlösungsBiitteln, z.B. Ghloro- " form/iletiiaiiol (2:1) extrahiert und die nicht lipidhaltigen Stoffwechselmetaboliten ausgewaschen; Gemessen wird die Hadioaktivität der auf diese Weise isolierten Lipide im. Liquid Scintillation Counter. Die Aktivität wird in dpm/i g fettgewebe angegeben.

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TaIa. 1 zu Beispiel 18

Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 17, Aminozuckerderivate mit η = 5-7

min. nach

10 15 20 30 45 Appl.

Kontrolle ohne Stärke 55 + 4,8 63 +5,9 67 + 5,8 72 + 4,7 66 + 5,0 Kontrolle mit Stärke 103 + 11 117 + 8,6 118 + 8,5 128 + 8,9 109+11 12 000 AIE + " 95+4,3 107+3,3 102+5,5 111+3,0 102+6,7

OI ' ————— , ι —

^ 24 000 AIE + " 87 + 8,6 94 +8,8 89 + 8,5 98 + 8,3 91 + 4,3

m, 48 000 AIE + » 74 + 8,9 84 + 7,2 84 + 6,9 85 + 6,5 85 + 4,9 '.'■

S _ —- —- -_r—-

ο Tab. 2 zu Beispiel 18 . ; ..: '

Sex Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler " Gabe von Stärke + Wirkstoff aus'Beispiel 9, Aminozuckerderivate mit η = 4-6 ^_1n _nacn■· ■

10 15 20 30 45. Appl. ;

Kontrolle ohne Stärke 55 + 4,8 63 + 5,9 67 + 5,8 72 + 4,7 66 +5,0 ; ? ;, / Kontrolle mit Stärke 103 + 11 117 + 8,6 118 + 8,5 128 + 8,9 109+11 ; 6 000 AIE + Stärke 99 + 4,5 118 + 5,8 104 + 8,1 123 +11 107 + 7,3

12 000 AIE + " 90 + 5,2 98 + 8,2 _99_+_4·^ 117 + 6,7 104 + 8,2

24 000 AIE + " 74 + 5,5 82 + 2,9 83 + 3,7 96 + 6,6 85 + 6,4

— — , — _»_"__ *** ■ ■ ■

P<0,05 P<0,01 ====== P<0,001 gegen Kontrolle mit Stärke

Le A 15 177 - 45 -

Tab. 3 zu Beispiel 18

Blutglucose in mgfj (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 9, Aminozuckerderivat mit η = 3. _{min nach}

5 10 15 20 30 45 Appl.

Kontrolle ohne Stärke 52 + 2,3 75 + 7,9 57 + 3,7 78 + 9,6 82 + 6,5 70 + 6,9

Kontrolle mit Stärke 93 + 7,3 133 + 12 127 + 9,3 152 + 15 156 + 9,2 124 + 7,7 750 AIE + Stärke 86 + 8,5 107 + 5,0 117 + 8,7 121 + 12 126 + 11 114 + 3,6

1500 AIE + » 77 + H 92 + 9,6 94 + 9,5 113 + 9,7 112 + 8,8 111 + 4,2

£ 3000 AIE + " 65 + 5,6 101 + 3,3 82 + 11 112 + 4,5 109 + 6,4 104 + 2,5

Tn Tab. 4 zu Beispiel 18

-^ Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

-» oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 9, Aminozuckerderivat mit η = 2

isj - min nach

ο 5 10 15 20 30 45 Appl.

Kontrolle ohne Stärke 61 + 3,7 68 + 3,9 83 + 5,3 75 + 8,7 91 + 5,2 84+1,5 Kontrolle mit Stärke 85 + 7,9 120 + 7,7 132 + 11 140 + 12 135 + 5,0 128 + 150 AIE + Stärke 82 + 7,5 105 + 4,2 120 + 6,0 124 + 7,0 134 + 6,1 125 + 5,2

300 AIE + " 79 + 8,2 97 + 2,7 105 + 10 118 + 6,7 119 + 9,9 130 + 5,9 600 AIE + " 70 + 4,6 80 + 8,8 94 + 6,9 91 + 16 103 + 9,2 102 + 4,2

1200 AIE + " 70 + 7,0 84 + 7,7 88 + 7,4 97 + 5,2 97 + 5,0 100 + 4,3 -^

P<0,05 P<0,01 ===== P<0,001 gegen Kontrolle mit Stärke ^

Le A 15 177 - 46 -

Tab. 5 zu Beispiel 18

Blutglucose in mg^ (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

oraler Gabe von Stärke + Wirkstoff aus Beispiel 6 min nach

"5 10 15 20 JO 45 Appl.

Kontrolle ohne Stärke 74 + 6,2 74 + 3,0 82 + 9,4 71 + 11 76 + 5,4 90 f 9,2

Kontrolle mit Stärke 101 + 8,8 135 + 13 146 + 4,8 151 + 9,5 148 +18 . 156+19

75 AIE + Stärke 102 + 2,9 130 + 6,9 128 + 5,4 143 £ 11 ' ,125 + 11 132 + 18

150 AIE + » 98+8,7 116+9,0 128+5,8 127+4,8115+5,2 137+5,2

£ 300 AIE + " 87 + 13 106 + 1,8 110 + 8,9 111 + 2,1 108 + 5,3 121 +7,2

^ Tab. 6 zu Beispiel 18 . .

cn Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Hatten zu verschiedenen Zeiten nach

-^ oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beispiel 17, Aminozuckerderivate mit η * 5*7 -» " min nach

n> 15 30 45 60 Appl.

Kontrolle ohne Saccharose 58 + 2,9 49 + 3,3 54 + 4,8 63 + 5,0 Kontrolle mit Saccharose 107+11 121+6,0 132+16 132+6,7 25 SIE + Saccharose 102+11 108+9,6 109+7,5 101 + 7,9

50 SIE +■■ " 92 + 7,0 100 + 8,3 109 + 3,7 102 + 6,3

100 SIE + » 95+8,1 84 + 8,7 93 + 9,0 91 + 4,5 ^J

_____—-.— Ä=as=tss:=:a! 5=as=ssa sisaass—s . j^

P<0,05 P<0,01 ===== P< 0,001 gegen Kontrolle mit Stärke bzw. Saccharose ^.

Le A 15 177 - 47 -

Tab. 7 zu Beispiel 18

Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beispiel 9» Aminozuckerderivate mit η = 4-6

~ min. nach

15 30 45 60 Appl.

Kontrolle ohne Saccharose 58 + 2,9 49 + 3,3 54 + 4,8 63 + 5,0

Kontrolle mit Saccharose 107 + 11 121 + 6,0 132 + 16 132 + 6,7

25 SIE + Saccharose 109 + 6,4 105 + 10 112 ± 9,1 108 + 8,1

*~ ."*. "" "~ ——"*—·-—— stresses=:=:»»

50 SIE + " 103 + 4,1 107 + 15 102 + 7,7 101 + 9,2

100 SIE + " 85 + 8,1 94 + 9,9 95 + 8,5 85 + 6,4

Tab. 8 zu Beispiel 18

Blutglucose in mg# (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach

oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beispiel 9, Aminozuckerderivat mit η =

min nach

15 30 60 Appl.

Kontrolle ohne Saccharose 15 + 4,5 92 + 8,5 95 + 6.4

Kontrolle mit Saccharose 113 + 9,9 126+20 127+14

25 SIE + " 71 + 3,7 100 + 7,3 107 + 2,4

100 SIE + » 58 + 5,9 92 + 4,0 98 + 5,0

P<0,05

P< 0,01 =.==£== P<0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose

Le A 15 177

Tab. 9 zu Beispiel 18

Blutglucose in mg$ und Seruminsulin in /uE/ml von 2 nüchternen Versuchspersonen nach oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beifepiel 9, Rohinhibitor (26.000 SIS/g)

Versuchsperson A im Kontrollversuch mit Saccharose

0 15 30 45 60 90 120 130 min n.Appl.

Blutglucose 120 178 190 176 140 94 100 104 Seruminsulin 14 33 45 37 27 17 9 13

_o Versuchsperson A im Versuch mit Saccharose + 1000 SIE

^ Blutglucose 122 146 148 132 116 120 112 110 -» Seruminsulin 10 20 18 18 13 14 12 10 cn

^ Versuchsperson B im Kontrollversuch mit Saccharose

^> Blutglucose 108 122 160 158 140 100 96 104 oo Seruminsulin 7 14 31 21 19 10 7 13

Versuchsperson B im Versuch mit Saccharose + 1000 SIE
Blutglucose 102 122 134 128 120 112 110 106 Seruminsulin 6 13 15 13 7 8 8 10

Le A 15 177 - 49 - CO

Tab. 10 zu Beispiel 18

Blutglucose in mgyo (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff aus Beispiel 6

15 30 45 min n.Appl.

Kontrolle ohne Saccharose 69+5,2 84 + 3,9 91 + 5,9

Kontrolle mit Saccharose 117+11 135+8,1 152+18

50 SIE + " 105+11 123+5,2 128+11

cn

100 SIE + » 89 + 6,5 111 + 4,1 116 + 3,9

QQ,

öi 200 SIE + ■· 72 + 4,6 95+9,1 104 + 9,6

S Tab. 11 zu Beispiel 18 q II Blutglucose in mg% (Mittelwert + Is) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler

Gabe von Maltose + Wirkstoff auS Beispiel 9, Rohinhibitor (26.000 SIS/g; 6.000 MIE/g) '

5 10 20 30 60 Appl. (min.nach)

Kontrolle ohne Maltose 69 + 1,6 71 + 4,6 91 + 3,0 90 + 9,6 101 + 13 72 + 5,3

Kontrolle mit Maltose 101 + 5,8 138 + 11 179 + 10 174 + 7,5 186 + 17 148+

100 MIE + " 104 + 5,1 108 + 4,1 139 + 7,6 135 + 13 150 + 13 132+5,3

200 MIE + " 92 + 6,6 101 + 9,6 128 + 8,5 128 + 11 136 +6,6 126+3,6 to

P< 0,05 P<0,01 ===== P< 0,001 gegen Kontrolle mit Saccharose bzw. Maltose Q₀

^Le A 15 177 - 50 -

Tab, 12 zu Beispiel

oraler Gabe von Glucose + Wirkstoff aus Beispiel 9» Acinozuckerderivat .mit η = 2

Kontrolle ohne Glucose Kontrolle mit Glucose

30 mg 60 mg

-f +

Il Il

15

30

45 r.in n.Appl,

T2± 4,6 78+ \^y 87 ■+. 6,8

142 + 12 142 + 12 · 158 +19

135 i 13 128 + 5,5 132 +7,3

125 + 13 118 + 2,9 130 + 9,0

p<ro,O5

P<0,01 gegen Kontrolle mit Glucose

Le A ig

- 51 -

Claims

Pat en tans priäcfae ζ

±n der H eine Oligosaccliaridkeitte anlit m. = 1-7 Hexose eliifeeitem
2) Änlnozuckerderivat; nacM Aiasprucm 1) der Fonael ,

—OH *

vorstehend als "Komiponesite

Il
3) Ä2aInoziickejräe.riTat nach Ansprach 1) der Forael,

vorstehend, als ^Koaponeirte IIl^w bezeichnet
4) Verfahren zw Herstellxmg von Aminoznckerderivaten

nach Anspruch 1)„ dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Familien Actinoplanaeeae in einem wässrigen Hährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und anschließend die Aminozuckerderivate isoliert und gegebenenfalls höhere Glieder der homologen Eeihe durch mikrobiologischem, enzymatischen oder chemisch-en Ab- bzw. in niedere Glieder umwandelt.

Le A 15 177

- 52 -

50981 S/120 8

ORIGINAL INSPECTED
5) Verfahren nach Anspruch 4)_t dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen der Familie Actinoplanaceae solche der Gattung Actinoplanes züchtet.
6) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß man Aminozuckerderivate der Formel

herstellt.
7) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß man Aminozucker der Formel

OHOH n_H CH₂OH CHgOH

CHJOH ^H H ₀>~^_E

herstellt.
8) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Actinoplanes-Stamm SE 50/110 (CBS ) verwendet.
9) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß man zur Abtrennung inerter Saccharide von den erfindungsgemäßen Inhibitoren Kationenaustauscher verwendet.

Le A 15 177 - 53 -

509815/1208
10) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Jtminozuckerderivaten aus Actinoplanaceae gemäß Anspruch i).
11) Verfahren zur Herstellung eines antidiabetischen mal/oder antiadipösen Kittels, dadurch gekennzeichnet, daß mn Aminozuckerderivate aus Actinoplanaceae gemäß Anspruch 1) mit inerten nichttoxischen, pharmazeutisch geeignetan Trägerstoffen vermischt.

,e A 15 177 - - 54 -

ORiGiMAL (NSPZCTED

5 0*9 8 1 5 / 1 2 0 8 -— -——