DE19617202A1

DE19617202A1 - Prozessierte Polypeptide mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19617202A1
Application number: DE19617202A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Prof Dr Kurth; Michael Dr Baier; Norbert Bannert; Albrecht Dr Werner; Kurt Dr Lang
Original assignee: Bundesministerium fuer Gesundheit; Boehringer Mannheim GmbH; Federal Government of Germany
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland Vertreten Durch Das Bun
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1997-11-06
Also published as: ZA973688B

Description

Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel lung und ihre Verwendung. Die Erfindung beschreibt korrekt prozessiertes IL-16.

IL-16 (Interleukin-16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 sowie von Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer mo lekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsiebchromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11 177 186), wird die "chemoattractant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattractant activity" und die von Baier beschrie bene Aktivität von rekombinantem humanem IL-16 sind jedoch sehr gering.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von IL-16 zu verbessern und IL-16-For men bereitzustellen, die geringe Immunogenität zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti sche Anwendung geeignet sind.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure

a) der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang entspricht,
b) mit der DNA der Sequenz SEQ ID NO: 1 unter stringenten Bedingungen hybridi siert,
c) oder eine Nukleinsäuresequenz ist, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den durch a) oder b) definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringen ten Bedingungen hybridisieren würde
d) und am 5′ Ende für eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3 bis 7 codiert.

Eine solche Nukleinsäure codiert ein korrekt prozessiertes Polypeptid mit IL-16-Aktivität, besonders bevorzugt natürliches IL-16 von Primaten, wie humanes IL-16 oder IL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z. B. Maus.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Fig. 2 der WO 94/28134 nicht das korrekt prozessierte IL-16 beschreibt. Das Startcodon "ATG" der precursor-Form des Proteins beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54 oder 174. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Die Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich allerdings nur um Nukleotidaustausche (313 G in A, 717 C in A). Bei der Expression in eukaryontischen Zellen wird IL-16 prozessiert. Dabei entsteht ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2. Die Kenntnis des korrekt prozessierten IL-16 erlaubt die Herstellung von IL-16 und Derivaten mit hoher Aktivität und geringer Immunogenität.

IL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Amino säureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz von IL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Varianten von Teilen der Amino- und Nuklein säuresequenz SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 sind beispielsweise in der europäischen Patent anmeldung Nr. 95 113 013.7 und den deutschen Patentanmeldungen Nr. 195 48 295.6 und 195 47 933.5 beschrieben. Wesentlich ist jedoch, daß die Polypeptide einen korrekten N-Terminus besitzen. IL-16 wird vermutlich in vivo von Interleukin Converting Enzymes (ICE) gespalten (Black, R.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9437-9442, Fanchen, C. et al., EMBO J. 14 (1995) 1914-1922, Singer, J.I., J. Exp. Med. 182 (1995) 1447-1459).

Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nukleinsäu rederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsäure-Analoga sind solche Verbin dungen, bei denen das Zuckerphosphatgerüst durch andere Einheiten, wie z. B. Aminosäuren, ersetzt ist. Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben. Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA-Bindungen sind, sind die nachstehend beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybridisierung nicht anwendbar. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschrieben.

Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-16 zu verstehen. Vorzugsweise zeigt IL-16 in dem in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zell teilung gemäß WO 94/28134.

IL-16 bindet an CD4⁺ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren. Die Funktion von IL-16 ist nicht durch seine Präsenta tion im MHC-Komplex limitiert.

Insbesondere zeigt IL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:

- Bindung an T-Zellen über den CD4-Rezeptor,
- Stimulierung der Expression von IL-2-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4⁺-Lymphozyten,
- Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von IL-2,
- Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3-Antikörpern stimulierten T-Helferzellen,
- Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HIV-1, HIV-2 oder SIV.

Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäu refragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 × SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 × SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 × SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 × SSC bei 50°C für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Stringenz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.

IL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7, die auch hierfür Gegenstand der Offen barung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnah men ergriffen werden.

Die Herstellung von rekombinantem IL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho den erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von IL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur IL-16-Sequenz Regulator-Elemente, die zur Expression der DNA-Se quenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die IL-16-Sequenz und die Regulator-Elemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von IL-16 zu exprimie ren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und IL-16 gewonnen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es IL-16-Eigenschaften zeigt.

Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein die exakte IL-16-Aminosäurese quenz aus SEQ ID NO: 1 enthält. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschaften zeigen. Insbesondere geeignet sind Proteine, die N-terminal mit SEQ ID NO: 3 bis 7 beginnen.

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:

- Veränderung der Nukleinsäure, um verschiedene Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen zur Erleichterung der Schritte der Ligation, Klonierung und Mutagenese einzuführen
- Veränderung der Nukleinsäure zum Einbau von bevorzugten Codons für die Wirtszelle
- Ergänzung der Nukleinsäure um zusätzliche Operator-Elemente, um die Expres sion in der Wirtszelle zu optimieren.

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro karyonten, und dort in E. coli. Die Expression in Prokaryonten führt zu einem unglycosylier ten Polypeptid.

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ_PL Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981)128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433). Ebenso geeignet sind ge koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusätzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5′-Ende der für IL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z. B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Weitere Beispiele für die Spaltstellen die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398) und die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698).

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für IL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw. T)-Resten. Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).

Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Ebenso geeignete selektier bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not wendigen Stoffen wie z. B. Histidin, Tryptophan und Leucin.

Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056).

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto ren sind in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. beschrieben.

Eine Expression von rekombinanter IL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YI_P (yeast integra ting plasmids)-Vektoren, replizierende YR_P (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YE_P (yeast episomal plasmids)-Vektoren erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryontische Wirts zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemäßes IL-16-Polypeptid codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert. Eine solche Wirtszelle enthält üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsäurevektor, vorzugsweise einen DNA-Vektor, eine Plasmid-DNA, welche diese Nukleinsäure enthält.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist humanes Interleukin-16 oder Interleukin-16 aus Primaten, vorzugsweise humanes IL-16, wie es als Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhältlich ist. IL-16 ist ein Protein, welches monomer oder als Multimer bestehend aus monomerem IL-16 (im weiteren auch als Untereinheiten bezeichnet) vorkommt. Ein solches IL-16 beginnt N-terminal mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 3 bis 7. Das Molekulargewicht einer mono meren IL-16-Untereinheit beträgt vorzugsweise 12420,90 Da (berechnet, ohne Glycosylierung). Weiter bevorzugt ist ein monomeres IL-16-Polypeptid, welches nicht in weitere Untereinheiten aufspaltbar ist.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein säure und Proteinsequenz von IL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein IL-16-Fragment. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterscheidet und mindestens vergleichbare Aktivität und Immunogenität zeigt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß natürliches IL-16 entgegen der bisherigen Annahme ein kleineres Protein mit einem Moleku largewicht von ca. 12,4 Da ist. Seine Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 beschrieben.

Die Nukleinsäuresequenz von IL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Die monomere Form von IL-16 kann in einer bevorzugten Ausfüh rungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche multimeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen.

In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Kalzium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwer tig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr(NO₃)₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.

Solche multimeren Formen und metallionenhaltige Formen von IL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird. Falls die Herstellung des Poly peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly peptid natürlich nicht aus der Zelle isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel enthält.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo gischen Zuständen, die durch virale Replikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschrieben. Hierin sind ebenfalls auch diagnostische Testverfahren beschrieben.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk tion der TH₀ und/oder TH₁ und TH₂ Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dem nach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulatori sche Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunität. Als IL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispiels weise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Transplantatab stoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumatischen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Polypeptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantatabstoßungen verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nuklein säuren im Rahmen der Gentherapie. Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale Vektorsysteme.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-IL-16-Anti körper oder ein immunoaktives Fragment davon, welcher an SEQ ID NO: 3 bindet, sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von IL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Säugerzellmaterial. Mit IL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid. Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt.

Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.

Beispiel 1 Klonierung, Expression und Reinigung von IL-16 1.1 RNA Isolierung

5 × 10⁷PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 U/ml IL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 : 1) wurde das Lysat 15 min. auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufällen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.

1.2 cDNA Synthese

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl "bulk first strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 µl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert.

Amplifikation, Klonierung von IL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschrie ben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen.

Beispiel 2 10 l Fermentation eines E. coli Expressionsklons für IL-16 und Hochdruckaufschluß

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden. Das Überimpfvolumen in die nächst höhere Dimension beträgt jeweils 1-10 Vol.-%. Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt.

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C-Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt. Die Fermentations temperatur beträgt 25-37°C. Über Belüftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosagege schwindigkeit wird der gelöste Sauerstoffpartialdruck (pO₂) < 20% gehalten.

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt. Mittels IPTG wird die Expression des IL-16 induziert. Nach einer Fermentationsdauer von ca. 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.

Beispiel 3 Reinigung von rekombinantem humanem IL-16

550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und an schließend 30 min. bei 20 000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel-Che lat-Sepharose-Säule (V = 60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 µMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquillibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das IL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imida zol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2 _* 0,5 l Gradientenvolumen) eluiert. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt.

300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 l 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20 000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün nung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquillibriert worden war. Die Elution von IL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von IL-16 wurde durch Massenanalyse (Molekulargewicht 13 566 ± 3 D) und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die UV-Absorption von IL-16 bei 280 nm und ein berechneter molarer Extinktionskoeffizient von 5540 M^-1cm^-1 bei dieser Wellenlänge (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) verwendet.

Das so erhaltene IL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 µl betrug 1,5 bis 15 µg Protein. Die Detention erfolgte bei 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4 × 180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H₂O) inner halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

Beispiel 4 Spaltung von rekombinantem IL-16 mit Zellysat 4.1 Trennung von CD8⁺ und CD4⁺-Lymphozyten über MACS

Die mittels Ficoll-Gradienten aus einem "buffy coat" isolierten Lymphozyten werden in 500 µl PBS-azid/1 × 10⁸ Zellen ("Phosphat Buffered Saline" ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, 0.01% Natriumazid, 5 mM EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Nach Zugabe von 20 ml CD8-Microbeads/1 × 10⁸ zu erwartende Zellen (Maus anti-human CD8-Antikörper, konjugiert mit magnetischen Partikeln, Miltenyi Biotec GmbH), erfolgt eine Inkubation bei 4°C über 15 min. Für weitere 5 min bei 4°C wird 2 mg DTAF/1 × 10⁷ zu erwartende Zellen (anti-Maus-IgG FITC konjugiert, Firma Dianova) hinzugegeben. Nach Verdünnung mit 25 ml PBS-azid/1% BSA erfolgt eine erneute Zentrifugation (10 min, 1200 rpm, 4°C). Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 2 ml PBS/1% BSA resuspendiert und die Zellsuspension auf eine Säule, die sich in einem Magnetseparator (Miltenyi Biotec GmbH) befindet, aufgetragen. Die CD8⁺-Zellen, an die die CD8-Micro beads gekoppelt sind, werden in der Säule zurückgehalten, die Durchflußfraktion enthält dementsprechend alle Lymphozyten (ca. 80%-CD4⁺-Zellen) mit Ausnahme der CD8⁺-Zellen. Nach Waschung wird die Säule aus der Halterung genommen und die CD8⁺-Zellfraktion mit PBS-azid/1% BSA eluiert. Die Durchfluß- und die CD8⁺-Zell fraktion werden zentrifugiert, in Zellkulturmedium (RPMI 1640, 20% FKS, 2 mM Glutamin, 180 U/ml IL-2) resuspendiert, die Zellzahl auf 3 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und die Zellen mit PHA stimuliert (9 mg/ml). Die Qualität der Lymphozytensubpopula tionstrennung wird mittels FACS überprüft.

4.2 Herstellung des Zellysats und Verdauung von IL-16

Es werden 1 × 10⁸ CD8⁺-Lymphozyten, die drei Tage mit PHA stimuliert wurden, in 2 ml PBS, das mit 1% Triton X100 versetzt ist, für 10 min auf Eis lysiert. Sodann werden Zelldebris und Zellkerne durch Zentrifugation entfernt. 45 µl des so gewonnenen Zellysats werden mit 10 µg rekombinantem IL-16, das entweder am amino- oder carboxyterminalen Ende in Fusion mit einem Histamin-tag (HIS-tag) exprimiert wurde, 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann werden die HIS-tag tragenden Fragmente mit Hilfe einer Nickel-Agarosematrix gereinigt. Nach weiterer Reinigung der entstandenen Fragmente in der HPLC werden die Massen der Fragmente massenspek trographisch bestimmt.

Referenzliste

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte Nukleinsäure

a) der DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 oder ihrem komplementären Strang entspricht,
b) mit der DNA der Sequenz SEQ ID NO: 1 unter stringenten Bedingungen hybridi siert,
c) oder eine Nukleinsäuresequenz ist, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den durch a) und b) definierten Nukleinsäuresequenzen unter stringen ten Bedingungen hybridisieren würde
d) und am 5′ Ende für eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3 bis 7 codiert.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, die Interleukin-16 von Primaten codiert.

3. Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, welche mit einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 1 oder 2 so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert.

4. Biologisch funktioneller Nukleinsäurevektor, der eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.

5. Interleukin-16 aus Primaten, wie es als Produkt einer eukaryontischen Expression nach Prozessierung im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhältlich ist.

6. Humanes Interleukin-16, wie es als Produkt einer eukaryontischen Expression nach Prozessierung im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhältlich ist.

7. Polypeptid mit Interleukin-16-Aktivität, welches codiert wird von einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 1 oder 2.

8. Polypeptid mit Interleukin-16-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Multimeres aus einer definierten Anzahl von Untereinheiten darstellt, wobei das Polypeptid von An spruch 7 eine Untereinheit ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 4 bis 32 Untereinhei ten besteht.

10. Polypeptid nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen definier ten Gehalt an Metallionen enthält, wobei die Anzahl der Metallionen pro Untereinheit (Polypeptid nach Anspruch 7) 0,5 bis 2 beträgt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gege benenfalls isoliert wird.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach den Ansprüchen 5 bis 10 sowie ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermit tel enthält.

13. Antikörper, welcher an den Teil eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität bindet, welches von der Sequenz SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Interleukin-16 von Primaten erhältlich nach eukaryontischer Expression und Preozessierung in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge.