DE1205546B

DE1205546B - Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide

Info

Publication number: DE1205546B
Application number: DEC24191A
Authority: DE
Inventors: Dr Robert Schwyzer; Dr Heini Kappeler; Dr Beat Iselin
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1960-06-03
Filing date: 1961-05-24
Publication date: 1965-11-25
Also published as: BE644128A; NL130980C; DE1212981B; CH497384A; SE332991B; GB992957A; GB1030803A; NL6401588A; US3256526A; SE307794B

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND Int. Cl.:

C07c

DEUTSCHES

PATENTAMT Deutsche Kl.: 12 q-6/01

AUSLEGESCHRIFT

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

1 205 546
C24191IVb/12q

24. Mai 1961

25. November 1965

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung eines neuen Dekapeptides der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminrestes den Rest der Glutaminsäure aufweist, und ihrer Salze.

Die neuen Verbindungen haben die Wirkung des natürlichen melanocytenstimulierenden Hypophysenhormons (MSH-Wirkung). Vor allem aber weisen sie eine die Abscheidung des adrenocorticotropen Hormons (ACTH) aus der Antehypophyse stimulierende Wirkung (Corticotropin Releasing Factor — CRF-Wirkung) auf und sollen dementsprechend als Heilmittel verwendet werden. Ferner können sie als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren aufweisen, wie des melanocytenstimulierenden Hormons und des ACTH, verwendet werden.

Die neuen Peptide werden nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden. So kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptid-.molekül. das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids, oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids verknüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z. B. ein Säurehalogenid, -azid. -anhydrid. -imidazolid, oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester oder Carboxymethylthiolester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe).

Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt,

München 2, Theafirrerstr. 33/34

Als Erfinder benannt:
Dr. Robert Schwyzer, Riehen;
Dr. Heini Kappeier, Birsfelden;
Dr. Beat Iselin, Riehen (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 3. Juni 1960 (6400)

z. B. einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden. Alle genannten Methoden sind für jede erfindungsgemäß in Betracht kommende Bildung von Peptidbindungen anwendbar, jedoch sind die im Beispiel angewandten Verfahren besonders vorteilhaft.

Wie bereits erwähnt, bestehen verschiedene Möglichkeiten bezüglich des Aufbaus des Dekapeptids aus den Aminosäuren bzw. kleineren Peptideinheiten. Ein Verfahren besteht z. B. darin, daß man das Heptapeptid L-Methionyl-L-glutaminyl- oder -glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin mit dem Tripeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin kondensiert, beispielsweise nach dem Schema

NH₂

ι

A. H4Ser-fOR H-f-Tyr Ser-f-QR H-fMet GIu His Phe Arg Try Gly-fOH

B. BOC-fSer-t-OR

C. BOC-fSer-(-NH—NH₂ (N₃)

D. BOC-fSer

Tyr

E. BOC-

-Ser

Tyr Ser--NH-NH₂ (N₃)

509 739/407

NH₂

F. BOC-Ser Tyr Ser Met GIu His Phe Arg Try GIy- -OH

NH₂

G. Η—Ser Tyr Ser Met GIu His Phe Arg Try GIy-OH

BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe. OR eine Estergruppe. Das als Ausgangsstoff verwendete Heptapeptid bzw. dessen Methylester kann durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin mit L-GIutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester, der durch Hydrierung aus dem entsprechenden, in der deutschen Patentschrift 1 108 232 beschriebenen Carbobenzoxyderivat erhalten wird, hergestellt werden.

Die Methylestergruppe kann mit 0.5 n-Natronlauge in Dioxan, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Die Dekapeptide werden ferner erhalten, wenn man ein Hexapeptid der Formel L-Glutaminyl- oder L- Glutamyl - L - histidyl - L - phenylalanyl -L- arginyl-L-tryptophyl-L-glycin mit dem Tetrapeptid der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin beispielsweise nach dem Schema

OC₄H₉

A. BOC-f-Ser Tyr Ser-j-NH—NH₂(N₃) H-fMet-fOR H-f-Glu His Phe Arg Try GJy]-OH

B. BOC--Ser Tyr Ser

Met--OR

C. BOC--Ser Tyr Ser

Met—NH-NH₂(N₃)

OC₄H₉

D. BOC- Ser Tyr Ser

Met GIu His Phe Arg Try GIy-OH

OH

E. H--SerTyrSer

kondensiert.

Met GIu His Phe Arg Try GIy-OH

Das als Ausgangsstoff verwendete Hexapeptid kann nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1 108 232 hergestellt werden.

An der Reaktion nicht beteiligte freie funktioneile Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ), oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes, die Merkaptogruppe durch die Benzylgruppe. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginine muß aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten SH- oder NHg-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlauf des Verfahrens zur Herstellung der Dekapeptide und Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzoloder Toluolsulfonsäure.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Dekapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Für die Papierchromatographie wurden folgende Systeme benutzt:
System 43

tert.-Amylalkohol zu Isopropanol zu Wasser
= 100 : 40 : 55;

System 45

sek.-Butanol zu 3% Ammoniak = 100 : 44;

System 50

tert.-Amylalkohol zu Isopropanol zu Triäthylamin zu Veronal zu Wasser
= 100 : 40 : 0,8 : 1,8 g : 50;

System 54

sek.-Butanol zu Isopropanol zu Monochloressigsäure zu Wasser = 70 : 10 : 3 g : 40.

Beispiel 1

Stufe 1
tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-methylester _t

Eine Lösung von 19 g (0,16 Mol) L-Serin-methylester (frisch hergestellt aus 25 g Esterhydrochlorid) in 75 cm³ trockenem Pyridin wird mit 42,8 g (0,3 Mol) tert.-Butyloxycarbonylazid versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die schwachgelbgefarbte Reaktionslösung wird im Vakuum bei 30° auf ein kleines Volumen eingeengt, mit Essigester versetzt und die Essigesterlösung unter Eiskühlung mehrmals mit 1 n-Salzsäure, 1 n-Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Sirup liefert nach mehrmaliger Extraktion mit Petroläther (Entfernung von überschüssigem tert.-Butyloxycarbonylazid) 27 g (77%) tert.-Butyloxycarbonyl-L-serinmethylester als öl, das direkt weiter umgesetzt wird.

Stufe 2
tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-hydrazid

27 g roher tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-methylester werden in 200 cm³ Methanol gelöst und mit 20 cm³ Hydrazinhydrat versetzt. Nach 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum bei maximal 30° eingedampft und der erhaltene Sirup zur Entfernung von überschüssigem Hydrazin über Nacht im Hochvakuum über konzentrierter Schwefelsäure gehalten. Der feste Rückstand wird mit Essigester verrieben, das isolierte kristalline Material bei 0,01 mm über Schwefelsäure von Spuren Hydrazin befreit und aus Essigester umkristallisiert: 23,3 g (86%); F. 112 bis 114°; [a]¥ = -9,4±1° (c = 4,06 in Methanol).

Stufe 3

tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-

L-serin-methylester

a) ausgehend von tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-hydrazid

11 g (5OmMoI) tert.-Butyloxycarbonyl-L-serin-hydrazid werden rasch in 100 cm³ auf —10° vorgekühlte 1 η-Salzsäure (enthaltend 10 g Natriumchlorid zur Gefrierpunktserniedrigung) gelöst und mit einer auf — 10° gekühlten Lösung von 4,2 g (6OmMoI) Natriumnitrit in 15 cm³ Wasser versetzt. Nach 5 Minuten wird das als öl ausgeschiedene terL-Butyloxycarbonyl-L-serin-azid zweimal mit je 150 cm³ Essigester (auf —10° vorgekühlt) extrahiert, die Essigesterlösung mit kalter 1 n-Natriumhydrogencarbonatlösung und Eiswasser gewaschen, kurz über Magnesiumsulfat bei 0° getrocknet und im Vakuum bei maximal 20° auf etwa 50 cm³ eingeengt.

Die Lösung des Azids wird bei 0° mit 14 g (50 mMol) frisch hergestelltem L-Tyrosyl-L-serinmethylester (vgl. Boissonnas, HeIv., 41, S. 1852 [1958]; S keggs; J. Exp. Med., 108, S. 283 [1958]) in 50 cm³ trockenem Tetrahydrofuran versetzt und 48 Stunden bei +5° stehengelassen. Anschließend wird die Reaktionslösung zur Entfernung von Tetrahydrofuran im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, mit Essigester verdünnt und bei 0° mit wenig 1 η-Salzsäure, Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen (in einigen Ansätzen schied sich ein Teil des Reaktionsprodukts während des Waschens aus und wurde abfiltriert), getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand liefert beim Verreiben mit Äther 14,7 g (63%) amorphe Substanz, welche für die folgende überführung in das Hydrazid genügend rein ist.

Zweimaliges Umkristallisieren aus wenig Aceton ergibt den reinen kristallinen tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester; F. 124 bis 127°; [a\o = —23,6±1° (c = 1,95 in Methanol); schwer löslich in Äther, Benzol, Chloroform; löslich in heißem Essigester und heißem Wasser (beim Kühlen Nadeln, F. 97 bis 105°, Hydrat).

Die Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mittels Salzsäure in Essigester oder Trifluoressigsäure ergibt papierchromatographisch reinen L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester.

Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Tyrosyl-L-serin-methylester wird wie folgt hergestellt: 16 g (50 mMol) L-Tyrosyl-L-serin-methylester-hydrochlorid (St. Guttmann und R. A. Boissonnas, HeIv. Chim. Acta., 41, S. 1852 [1958]) werden in 50 cm³ Essigester suspendiert und bei 0° mit 12 cm³ einer 5 η-Lösung von Ammoniak in Methanol während 15 Minuten verrührt; nach Zugabe von weiteren 50 cm³ Essigester wird das ausgeschiedene Ammoniumchlorid abfiltriert und das Filtrat im Vakuum vorsichtig eingedampft. Der ölige Rückstand ergibt nach mehrmaligem Verreiben mit Äther 14 g freien Ester, der direkt in den oben beschriebenen Ansatz eingesetzt wird; amorphes Pulver, schwer löslich in Essigester (löslich in Gegenwart von 10% Methanol), leicht löslich in Tetrahydrofuran und Acetonitril.

b) ausgehend von
L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester

2,0 g (4 mMol) Carbobenzoxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester (K. H ο fm a η η und andere, J. Am. Chem. Soc., 79, S. 1636 [1957]; St. Guttmann und R.A. Boisson η as, HeIv. Chim. Acta, 41, S. 1892 [1958]) werden in 40 cm³ Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-Kohle (10%ig) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert, wobei das gebildete Kohlendioxyd in Natronlauge absorbiert wird. Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff (20 Minuten) ist die Hydrierung beendigt, und die vom Katalysator abfiltrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft. Beim Verreiben des Rückstandes mit Acetonitril kristallisiert der L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester in Form von feinen Nadeln; 1,21 g (82%); F. 155 bis 158°; nach Umkristallisieren aus Wasser oder wenig Alkohol: F. 158 bis 160°; [a]_D = +4,6±1° (c = 3,91 in Methanol), + 11,5±1° (c = 2,00 in 0,1 n-Salzsäure in Methanol); Literaturwert für Hydrochlorid: + 10,2° (c = 2,6 in Methanol). Die Substanz ist papierchromatographisch einheitlich.

Eine Lösung von 369 mg (1 mMol) L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester in 2 cm³ trockenem Pyridin

wird mit 239 mg (1 mMol) tert.-Butyloxycarbonylp-nitrophenol versetzt und über Nacht bei 20° stehengelassen. Die Reaktionslösung wird im Vakuum vorsichtig eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und wie unter a) weiter aufgearbeitet; Rohprodukt nach Verreiben mitÄther: 295mg (63%); nach Umkristallisieren aus Aceton: 233 mg (50%); F. 123 bis 126°; [a]_a = -23,1±1° (c = 2,04 in Methanol).

Bei Verwendung von 0,36 g (2,5 mMol) tert.~Butyloxycarbonylazid an Stelle von tert.-Butyloxycarbonylp-nitrophenol werden 305 mg (69%) Rohprodukt bzw. 245 mg (52%) reine Substanz erhalten.

Stufe 4

tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serinhydrazid

Eine Lösung von 14 g (30 mMol) rohem tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester in 100 cm³ Methanol wird mit 5 cm³ Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach kurzer Zeit beginnt die Abscheidung von amorphem Hydrazid, das nach 6 Stunden abfiltriert, mit Methanol gewaschen und zur Entfernung von Spuren Hydrazin über Nacht bei 0,01 mm über konzentrierte Schwefelsäure getrocknet wird: 11,8 g; F. 173 bis 176°. Durch Umkristallisieren aus Wasser wird das Hydrazidmonohydrat in Form von filzigen Nadeln vom F. 184 bis 187° (nach Sintern bei 150°) erhalten; [a]_D = —3,4±1° (c = 1,76 in Dimethylformamid), —24.9±1° (c = 2,18 in Eisessig—Wasser [1 : I]). -9±1° (c = 2,01 in Pyridin).

Bei Verwendung von reinem Ausgangsmaterial beträgt die Ausbeute an umkristallisiertem Hydrazid 75%.

Stufe 5

tert.-Butyl-oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-

L-methionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat

487 mg (1 mMol) BOC-Seryl-tyrosyl-serin-hydrazid mit 1 ml Kristallwasser werden rasch in 3 cm³ auf —10° vorgekühlter 1 η-Salzsäure (enthaltend 10% Natriumchlorid zur Gefrierpunktserniedrigung) gelöst und tropfenweise mit 0,24 cm³ (1,2 Äquivalente) einer ebenfalls vorgekühlten 5 normalen wäßrigen Natriumnitritlösung versetzt. Das gebildete Azid scheidet sich sofort als dichter käsiger Niederschlag aus. Man überschichtet die Reaktionslösung mit 5 cm³ auf 10° gekühltem Essigester und läßt 5 Minuten bei —10° reagieren. Dann extrahiert man zweimal mit 10 cm³ Essigester. Die vereinigten Essigesterphasen werden mit 1 cm³ gesättigter Natriumbicarbonatlösung geschüttelt, dreimal mit 1 cm³ Eiswasser gewaschen und kurz bei 0° über Magnesiumsulfat getrocknet. Den Essigester dampft man im Vakuum bei Zimmertemperatur auf ein kleines Volumen (2 cm³) ein und nimmt den sirupösen Rückstand in 4 cm³ auf —10° gekühltem Dimethylformamid auf. Nach vollständigem Einengen des Essigesters kristallisiert das Azid bei 0°; F. = (50°) 135 bis 150°; aus Äther unter teilweiser Zersetzung.

Gleichzeitig löst man unter leichtem Erwärmen 520 mg (0,5 mMol) L-Methionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinacetat in 7,5 cm³ Dimethylformamid, kühlt auf Zimmertemperatur ab, gibt 0,76 cm³ einer 10%igen Lösung von Triethylamin in Dimethylformamid (0.55 mMol) dazu und versetzt die auf —10° gekühlte Lösung mit der frisch bereiteten Azidlösung. Man läßt 2 Tage bei 0° reagieren, kühlt wiederum auf —10° ab und neutralisiert mit 0.275 cm³ 1 η-Salzsäure. Das rohe Reaktionsprodukt wird durch Zugabe von viel Essigester ausgefällt, filtriert und im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute ist 720 mg rohes Butyloxycarbonyldekapeptidacetat, das im Papierchromatogramm nur noch ungefähr 5% einer langsamer wandernden paulipositiven Substanz anzeigt.

Das Analysenpräparat schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus Methanol bei 202° unter Zer-Setzung. Die Acetylbestimmung zeigt nur noch ¹I-Z Mol Essigsäure als Acetat, auf Arginin bezogen. Die Rf-Werte in den Systemen 43, 45 und 54 sind 0,69, 0,60 und 0,72.

Stufe 6

L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat

125 mg BOC-Dekapeptid werden mit 1,5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure während einer Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Trifluoressigsäure dampft man im Vakuum bei 40° ab und verreibt den sirupösen Rückstand wiederholt mit viel absolutem Äther. Das Trifluoracetat des Dekapeptides erhält man dabei als leicht rosagefarbtes Pulver.

Die getrocknete Verbindung wird in 1 ml Wasser gelöst und mit weiteren 30 ml Wasser durch eine Ionenaustauschersäule IR-4 B (Acetatform; Handelsname) gewaschen.

Nach dem Verdampfen des Wassers nimmt man den glasigen Rückstand in wenig Methanol auf und fällt das Dekapeptid mit Aceton aus. Man erhält 100 mg Seryl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutaminylhistidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin-acetat. F. 192 bis 194°.

Im Papierchromatogramm zeigt das Dekapeptid in den Systemen 45,50 und 54 die folgenden Rf-Werte: 0.51. 0.47 bzw. 0,58. Im Test nach S a ff r a η und S c h a 11 y zeigt es eine starke CRF-Aktivität.

Beispiel 2

Stufe 1

tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester

Eine Lösung von tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin-azid, frisch hergestellt aus 2.44 g (5 mMol) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin-hydrazid-monohydrat gemäß Beispiel 1, Stufe 4, in 30 cm³ Essigester, wird mit 1,53 g (10 ml) frisch destilliertem L-Methioninmethylester versetzt und 48 Stunden bei 0° stehengelassen. Das als Gallerte ausgeschiedene Reaktionsprodukt wird abfiltriert und mit Essigester und Äther gewaschen: 1,89 g; aus dem Filtrat werden nach üblicher Aufarbeitung weitere 0,25 g Substanz gewonnen (total 2.14 g = 21%). Umfallen aus Essigester ergibt 1,57 g (52%) amorphen tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester mit unscharfem Schmelzpunkt bei etwa 115 bis 125°; [a]₀ = -29,8 ±1° (c = 2,12 in Methanol).

Stufe 2

tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid

0,90 g (1.5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester werden in 10 cm³ Methanol gelöst und mit 0,25 cm³ Hydrazinhydrat versetzt. Nach 18 Stunden wird das ausgeschiedene amorphe Hydrazid abfiltriert und mit Methanol gewaschen; 0.81 g (90%); F. 185 bis 188° (Sintern bei 178°). Das Rohprodukt wird zur Entfernung von Spuren Hydrazin mit Wasser verrieben und darauf aus Methanol umgefällt: 0,75 g (83%); F. 191 bis 193°; [a]i⁵ = -36,7±1° (c = 2,02 in Wasser—Methanol [1 : I]).

Stufe 3

y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

975 mg (0,9 mMol) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, hergestellt z. B. durch Kondensation von Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-azid mit L-Phenylalanyl-nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester und Abspaltung der Estergruppe mit 1 η-Natronlauge, werden in 100 cm³ 90%iger Essigsäure in Gegenwart von 400 mg 10% Pd-Kohle-Katalysator während 17 Stunden bei Normaldruck und Zimmertemperatur in einer Wasserstoffatmosphäre geschüttelt. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 40° zur Trockene ein und fällt den Verdampfungsrückstand einmal aus Methanol—Äther um. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 845 mg Hexapeptidy-tert.-butylester.

Im UV-Spektrum zeigt es

W* 290 ΐημ (f = 4800),

Wx 290 ΙΠμ (ε= 5800).

Wx 274 πΐμ (f = 5700).

In der Hochspannungselektrophorese wandert das Peptidderivat bei 3000 Volt und pH = 1.9 während einer Stunde 14,5 cm. und gibt mit Pauly-, Ehrlich- und Sakaguchi-Reagens sowie mit Ninhydrin eine positive Reaktion.

Stufe 4

tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-

L-methionyl-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-

L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

330 mg (0.55 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid werden in 3,5 cm³ auf —10° gekühltem Dimethylformamid gelöst und bei dieser Temperatur 1,5 cm³ 1 n-Salzsäure zugetropft. Nach 2 bis 3 Minuten trägt man langsam 0.6 cm³ auf 0° gekühlte 1 n-Natriumnitritlösung ein fio und läßt 3 Minuten bei —5 bis —10° reagieren. Hierauf versetzt man die Reaktionslösung mit 25 cm³ Eiswasser. Das Azid fällt dabei nicht aus. Durch intensives Kratzen mit einem Glasstab an der Gefäßwand scheidet sich das Azid als feiner kristalliner Niederschlag aus. Die Kristallisation ist etwa nach 20- bis 30minütigem Stehen bei 0° beendet. Man filtriert durch eine Glasfilternutsche, wäscht den Filterrückstand zuerst mit eiskalter 0.5 n-Natriumbicarbonatlösung bis zur alkalischen Reaktion und zum Schluß mit Eiswasser neutral. Das Azid wird im Exsikkator während 2¹^ Stunden lyophyl getrocknet. Ausbeute: 275 mg (82% der Theorie); F. = 98 bis 102° (Zersetzung).

Die 275 mg (0,45 mMol) Azid trägt man sofort unter Rühren in die auf —10° gekühlte Lösung von 400 mg (0,45 mMol) y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin in 15 cm³ Dimethylformamid, enthaltend 0,50 mMol Triäthylamin, ein.

Man läßt 20 Stunden bei 0° reagieren, versetzt

anschließend die Reaktionslösung mit 0,2 cm³ Eisessig und fällt hierauf mit viel Essigester das rohe BOC-Dekapeptid aus. Ausbeute: 580mg (89%);

F. = 192 bis 193° (Zersetzung).

Das rohe Peptidderivat, aus 30 cm³ 90%igem Methanol umkristallisiert, ergibt 450 mg reines BOC-Dekapeptid, F. = 203° (Zersetzung).

Im Papierchromatogramm in den Systemen 43 und 45 zeigt das BOC-Dekapeptid die folgenden Rf-Werte 43/0,74 und 45/0,70.

Stufe 5

L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

100 mg tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L - seryl - L - methionyl - (y - tert. - butyl) - L - glutamylhistidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin werden, wie für L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L - glutaminyl - L - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl-L-tryptophyl-glycin im Beispiel 1. Stufe 6, beschrieben, mit Trifluoressigsäure behandelt und in die Acetatform übergeführt. Das freie Dekapeptid wird aus wäßrigem Methanol umkristallisiert; F. 210° (Zersetzung). Die Verbindung wandert in der Hochspannungselektrophorese bei 3000 Volt und pH=1.9 in einer Stunde 12.5 cm.

45

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines neuen Dekapeptides der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin sowie der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutaminrestes den Rest der Glutaminsäure enthält, und ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) tert. - Butyloxycarbonyl - L - seryl -L- tyrosyl-L-serin-azid mit dem Heptapeptid L-Methionyl - L - glutaminyl - L - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl - L - tryptophyl - glycin oder dem entsprechenden Glutamylpeptid, dessen /-Carboxylgruppe durch die tert.-Butylgruppe geschützt ist, kondensiert und die geschützten Gruppen in Freiheit setzt oder

b) tert. - Butyloxycarbonyl - L - seryl - L - tyrosyl-L-seryl-L-methionin-azid mit dem Hexapeptid

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L - Glutaminyl - L - histidyl - L - phenylalanyl- wünscht, erhaltene basische Verbindungen

L-arginyl-L-tryptophyl-glycin oder dem ent- in ihre Salze überführt.

sprechenden Glutamylpeptid, dessen y-Carb-

oxylgruppe durch die tert.-Butylgruppe ge- In Betracht gezogene Druckschriften:

schützt ist, kondensiert und die geschützten 5 Deutsche Patentschrift Nr. 1030 835;

Gruppen in Freiheit setzt und, wenn er- HeIv. chim. acta, 44 (1961), S. 213, 231.

509 739/407 11.65 θ Bundesdruckerei Berlin