DE1130817B - Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Oktapeptide - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND KL.12q 6/01

ESTERNAT.KL. C 07 C

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT 1130 817

C19324IVb/12q

ANMELDETAG: 1. JULI 1959

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UNDAUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT: 7. JUNI 1962

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung neuer Oktapeptide mit Hypertensinwirkung.

Bekannt sind das im Pferdeserum vorkommende Dekapeptid Hypertensin I mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Arginin, L-VaHn, L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin, als Ileu^B-Hypertensin I bezeichnet, und das im Rinderserum vorkommende Val⁵-Hypertensin I, ebenfalls ein Dekapeptid, das sich von dem vorher genannten nur durch die fünfte Aminosäure, L-Valin, unterscheidet. Aus Pferdeserum wurde ferner ein Oktapeptid, Ileu^s-Hypertensin II, isoliert, das sich vom entsprechenden Hypertensin I durch Fehlen der neunten und zehnten Aminosäure unterscheidet und mittels eines im Serum vorhandenen Enzyms aus dem Dekapeptid gebildet wird. Offensichtlich wäre es für die Synthese von hypertensinwirk» samen Verbindungen ein großer Vorteil, wenn gewisse Aminosäuren durch einfachere und verfahrensmäßig günstigere Aminosäuren ersetzt werden könnten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun die Herstellung von Oktapeptiden der Formel Glycyl-L-«-(amino-niederalkyl)-«-amino-acetyl-L-«-niederalkyl - tx - amino - acetyl - L - tyrosyl - l - α - niederalkyl-α-amino-acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin und ihren Salzen.

Der Rest einer L-«-(Amino-niederalkyl)-«-aminoessigsäure ist ein L-Arginyl-, L-Ornithyl- oder ein

,NH Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Oktapeptide

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 8. JuU 1958 (Nr. 61 490)

Dr. Robert Schwyzer, Riehen,

und Dr. Bernhard Riniker, Birsfelden (Schweiz), sind als Erfinder genannt worden

L-Lysylrest. Reste einer L-<x-Niederalkyl-a-aminoessigsäure sind L-Valyl, L-Leucyl und L-Isoleucyl, ferner L-Norvalyl, L-Norleucyl sowie L-Alanyl.

Überraschenderweise zeigen die neuen Oktapeptide eine gute Hypertensinwirkung, insbesondere das Glycyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin der Formel

OH

NH

NH₂

(CH₂)₃

CH₃ CH₃

CH₃

CH₂

CH

H-HN-CH2	— CO —NH-CH-CO —NH-CH-CO —NH-	VaI	Y	-CH- CO —	NH-CH-CO-
GIy	Arg		CH2	Tyr	VaI
	CH-N^	— CO —NH-CH-
	C-NH
	CH, /\
	I I NH-CH-CO —N	COOH

His

Pro Phe

209 608/350

Die neuen Oktapeptide bieten insofern bedeutende technische Vorteile gegenüber den bekannten Hypertensinen, als sie sehr viel leichter und billiger herstellbar sind.

Die neuen Peptide werden nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden. Ein vorteilhaftes Verfahren besteht darin, daß man einen L-a-Niederalkyl-a-amino-acetyl-L-tyrosyl-L-öi-niederalkyl-oi-amino-acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester mit einer Glycyl-L-a-(amino-niederalkyl)-a-amino-essigsäure, in der die «-Aminogruppe und gegebenenfalls auch die a-Aminoniederalkyl-Gruppe geschützt sind, kondensiert, beispielsweise nach dem Schema I:

NO₂

Z —

GIy

— OH H —

Arg |— O CH₃ H —j' VaI Tyr VaI

His Pro Phe!—OCH,

NO₂

Z —

GIy

Arg

OCH,

NO₂

GIy

Arg—OH

NO₂

Z -I GIy

Arg

VaI Tyr VaI His Pro Phe — OCH₃

H—GIy

Arg

VaI Tyr VaI His Pro Phe

-OCH₃

H— GIy

Arg

VaI Tyr VaI His Pro Phe—OH

Fig. I

Der als Ausgangsmaterial genannte Hexapeptidester H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCHg kann nach den Verfahren der Patentanmeldung C 15418 IVb/12q (deutsche Auslegeschrift 1125 942) hergestellt werden. Statt dieses Esters können auch die ebenfalls in der genannten Patentanmeldung beschriebenen Hexapeptidester H-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-O CH₃ oder H-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe- O C H₃mitGlycyI-arginin kondensiert werden.

An der Reaktion nicht beteiligte freie funktioneile Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Aminogruppe beispielsweise durch den Tosyl- oder Tritylrest und insbesondere die Carbobenzoxygruppe oder farbige Schutzgruppen, wie die p-Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und die p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe. Die Hydroxylgruppe des Tyrosinrestes muß bei der Reaktion nicht notwendigerweise geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Oktapeptide und Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulf onsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulf onsäure, Benzol- oder Toluolsulf onsäure.

Die verfahrensgemäß erhaltenen'Oktapeptide können als blutdrucksteigernde Mittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.

In den nachstehenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

H-Arg-OH
H-GIy-OH
H-VaI-OH
H-Tyr-OH
H-Phe-OH
H-His-OH
H-Pro-OH
Z

L-Arginin.

Glycin.

L-Valin.

L-Tyrosin.

L-Phenylalanin.

L-Histidin.

L-Prolin.

Carbobenzoxy.

Beispiel (vgl. Fig. I)
a) Z-Gly-Arg(NOü)-OH

1,35 g (0,005MoI) feinpulverisiertes H-Arg(NO₂> OCH₃ · HCl wird in 7 ml Dimethylformamid suspendiert und nach Zugabe von 1,21 ml (0,0051 Mol) Tributylamin bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Sodann gibt man auf einmal 1,85 g (0,009 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid und 1,46 g (0,007 Mol) Z-GIy-OH in fester Form zu und läßt bei Zimmertemperatur über Nacht stehen. Nach Zugabe von 0,5 ml Eisessig wird nochmals 1 Stunde stehengelassen, dann vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff (1,6 g) abfiltriert, im Hochvakuum nahezu zur Trockne eingedampft und in Essigester aufgenommen. Es wird nun nacheinander mit 2n-Salzsäure, 2n-Natriumcarbonat (eiskalt) und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält 2,8 g rohen Z-GIy-A^(NOa)-OCH₃, der direkt verseift wird.

2,8 g Methylester werden in 10 ml Methanol gelöst und im Laufe von 1 Stunde bei 20° 10 ml lnormale wäßrige Natronlauge zugetropft. Nach beendigtem Zutropfen wird noch V2 Stunde weitergerührt, dann von ein wenig ungelöstem Material (= Dicyclohexylharnstoff) abfiltriert und das Filtrat durch Zugabe von 10,5 ml 1 η-Salzsäure angesäuert. Die dabei ausfallende ölige Substanz wird mit n-Butanol extrahiert, die Butanolphase mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Beim Zerreiben mit Essigester tritt Kristallisation ein. Man erhält 1,3 g N-Carbobenzyloxy-glycyl-nitro-L-arginin vom F. 135 bis 138°. Beim einmaligen Umkristallisieren aus heißem Methanol erhält man 1,22 g Substanz vom F. 142 bis 144°.

OS

b) Z-Gly-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃

775 mg (0,001 Mol) H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃, hergestellt nach dem Verfahren der Patentanmeldung C 15418 IVb/ 12q (deutsche Auslegeschrift 1125942), und 474 mg (0,0023 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril gelöst und dazu 820 mg (0,002 Mol) Z-Gly-Arg(NOa)-OH, gelöst in 2 ml Dimethylformamid, gegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei 20° stehengelassen. Nach Zugabe von 0,2 ml Eisessig wird nochmals eine Weile stehengelassen und dann vom auskristallisierten Dicyclohexyl-harnstoff (450 mg) abfiltriert. Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 40° so weit wie möglich eingedampft, dann in n-Butanol aufgenommen und die organische Schicht nacheinander mit Natriumcarbonatlösung (eiskalt) und Wasser gewaschen und, ohne zu trocknen, bei 50° Badtemperatur im Vakuum auf ungefähr die Hälfte eingeengt. Dabei fällt ein feinkörniger Niederschlag aus, der abfiltriert, mit Essigester gewaschen und bei 50° getrocknet wird. Man erhält so 828 mg Z-GIy-Arg(N O₂) - Val-Tyr - VaI - His - Pro - Phe-0 C H₃ vom F. etwa 160° (Zersetzung), der zur Weiterverarbeitung genügend rein ist. Das Butanolfiltrat liefert beim weiteren Einengen nur noch wenig und unreines Material.

c) H-Gly-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃

828 mg Z-Gly-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O CH₃ werden in 10 ml Methanol und 4,2 ml 1 n-Salzsäure (in Methanol) gelöst und nach Zugabe von 300 mg Katalysator (Palladiumkohle 10 %) unter Wasserstoffabsorption hydriert. Nach Aufnahme von 5,1 Mol Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand (Dauer 12 Stunden), und es wird vom Katalysator abfiltriert, im Vakuum eingedampft und im Hochvakuum bei 40° getrocknet. Man erhält 763 mg eines amorphen Pulvers (Gemisch von Oktapeptid-methylester-trihydrochlorid und Ammoniumchlorid), das direkt zur Hydrolyse verwendet wird.

d) H-Gly-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O H

760 mg roher Methylester werden in 5 ml konzentrierter, wäßriger Salzsäure gelöst und 1 Stunde bei 40° gehalten. Nach Eindampfen zur Trockne im Hochvakuum erhält man 750 mg eines pulverigen Hydrochlorids, das in wenig Wasser gelöst und durch einen schwach basischen Ionenaustauscher filtriert wird. (Handelsname Merck II als Acetat; Säule mit Durchmesser = 12,5 mm, / = 12 cm). Das Filtrat ergibt beim LyophUisieren 675 mg Rohprodukt, das in einer Craig-Verteilung (System n-Butanol—Wasser—Methanol 5:5:1; Phasenvolumen je 10 ml) über 60 Stufen gereinigt wird. Aus Röhrchen 6 bis 19 (Maximum bei Nr. 12; G = 0,26) werden 562 mg reines H-Gly-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH · CH₃COOH isoliert. Die Verbindung ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol, schwer löslich in Äthanol. Sie wird aus der wäßrigen Lösung durch Zugabe von gesättigter Natriumchloridlösung ausgefällt. F. etwa 220° (Zersetzung). Im Papierchromatogramm (absteigend auf Whatman Nr. 3) werden einheitliche Flecken erhalten, die positiv auf Pauly-Reagens und Ninhydrin sind. Im System tert.-Amylakohol—Triäthylamin—Veronal— Wasser—Isopropanol (100: 0,8 : 1,8 : 50: 40) erhält man Rf = 0,48, in sek.-Butanol—Monochloressigsäure—Wasser—Isopropanol (70: 3:40:10) R_{ = 0,44.

Claims (2)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinaktiver Oktapeptide der allgemeinen Formel Glycyl - L - « - (amino - niederalkyl) - «- amino - acetyl-L-a-mederalkyl-amino-acetyl-L-tyrosyl-L-Ä-niederalkyl-amino-acetyl-L-bistidyl-L-prolyl-L-phenylalanin, worin der L-«-(Amino-niederalkyl)-«-aminoacetylrest für L-Arginyl, L-Ornithyl oder L-Lysyl und der L-a-Niederalkyl-a-amino-acetylrest für L-Valyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Norvalyl, L-Norleucyl oder L-Alanyl steht, und ihrer Salze, dadurch gekenn zeichnet, daß man einen L~#-Niederalkyl-«-aminoacetyl - l - tyr osyl - l - α - niederalkyl - <x - amino-acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester mit einer Glycyl-L-«-(amino-niederalkyl)-«-amino-essigsäure, in der die a-Aminogruppe des Glycinrestes und gegebenenfalls auch die «-(Amino-niederalkyl)-Gruppe des Argininrestes geschützt sind, in Gegenwart eines Carbodiimide kondensiert, die Schutzgruppen abspaltet und die Estergruppe verseift und, wenn erwünscht, erhaltene basische Verbindungen in ihre Salze oder erhaltene Salze in Basen überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glycyl-nitro-L-arginin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Carbodiimids kondensiert, auf reduktivem Wege die Amino-Schutzgruppe des Glycinrestes und die Nitrogruppe des Argininrestes entfernt und die Estergruppe verseift.

© 209 60&/350 5.62