DE10227111A1

DE10227111A1 - Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop

Info

Publication number: DE10227111A1
Application number: DE10227111A
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-06-17
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2022-06-18
Also published as: US7257289B2; US20030231825A1; DE10227111B4

Abstract

Es ist ein Spektralscanmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop offenbart. Es ist ein Rechnersystem (23) vorgesehen, das einen Speicher und eine Datenbank umfasst. In Verbindung mit dem Rechnersystem (23) und/oder der Datenbank kann mit dem spektralen Selektionsmittel (5) aus einem kontinuierlichen Wellenlängenbereich ein kontinuierlicher Teilwellenbereich ausgewählt werden, der zur Beleuchtung des Objekts dient. Ebenso kann in Verbindung mit dem Rechnersystem (23) zusammen mit dem spektralen Selektionsmittel aus dem Detektionslichtstrahl (17) ein Detektionsband ausgewählt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Spektralmikroskop. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop.
Die Patentschrift US 6,097,870 offenbart eine Anordnung zur Generierung eines Breitbandspektrums im sichtbaren und infraroten Spektralbereich. Die Anordnung basiert auf einer mikrostrukturierten Faser, in die das Licht eines Pumplasers eingekoppelt wird. Das Pumplicht wird in der mikrostrukturierten Faser durch nichtlineare Effekte verbreitert. Als mikrostrukturierte Faser findet auch sog. Photonic-Band-Gap-Material oder "photon crystal fibres", "holey fibers" oder "microstructured fibers" Verwendung. Es sind auch Ausgestaltungen als sog. "Hollow fiber" bekannt.
Bogenlampen sind als breitbandige Lichtquellen bekannt und werden in vielen Bereichen verwendet. Exemplarisch sei hier die US-Patentschrift 3,720,822 "XENON PHOTOGRAPHY LIGHT" genannt, die eine Xenon-Bogenlampe zur Beleuchtung in der Photografie offenbart.
Die deutsche Patentanmeldung DE 100 06 800.6 offenbart eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls (SP-Modul). Im aufgefächerten Lichtstrahl sind Selektionsmittel vorgesehen, die als Schieber ausgebildet sind, um somit Teile des aufgefächerten Lichtstrahls auf verschiedene Detektoren zu lenken. Die Signale der Detektoren werden dann zu Bilderzeugung verwendet. Die DE 100 06 800.6 offenbart nicht die Betätigung der Schieber in der Art und Weise, dass eine schnelle und zuverlässige Detektion eines speziellen Spektrums möglich ist.
Aus der US-Patenschrift 5,791,024 ist ein Verfahren zur Klassifizierung von Chromosomen bekannt. Bei der Detektion von Chromosomdefekten werden die Chromosomen mit fünf verschiedenen, fluoreszierenden Farbstoffen versehen. Aus der Anlagerung der Farbstoffe an die Chromosomen können diese eindeutig klassifiziert werden. Aus dem Vergleich mit einer Referenz kann auf die vorhandenen Gendefekte geschlossen werden. Da durch die am Chromosom angelagerten Farbstoffe, dieses Chromosom ein charakteristisches Spektrum aussendet, ist somit eine eindeutige Bestimmung möglich. Das hier vorgestellte Verfahren ist besonders für die Bestimmung der Spektren der einzelnen Chromosomen geeignet, ist in seiner Anwendung aber nicht für die Fluoreszenzmessungen mit einen spektralen Scanmikroskop ausgelegt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Erfassung maximaler Information eines fluoreszierenden mikroskopischen Objekts zu schaffen. Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.
Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde ein Mikroskopsystem zur Erfassung maximaler Information eines fluoreszierenden mikroskopischen Objekts zu schaffen, das geeignet ist eng benachbarte Fluoreszenzspektren aufzulösen. Die objektive Aufgabe wird durch ein Spektralscanmikroskop gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 6 aufweist.
Der Vorteil der Erfindung ist, dass mit dem Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop ein Beleuchtungslichtstrahl erzeugt wird, wobei das erzeugte Beleuchtungslicht einen kontinuierlichen Wellenbereich im Spektrum umfasst. Ein kontinuierlicher Teilwellenbereich wird aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts selektiert und zur Beleuchtung der Probe verwendet. Ebenso gilt es die Detektionseinheit auf einen ausgewählten Teilwellenbereich für das Detektionslicht einzustellen. Bild- oder Volumenaufnahmeprozesses werden durchgeführt und die aufgenommenen Bilddaten durch einen Algorithmus zur Datenanalyse verarbeitet. Gegebenenfalls kann und graphische Darstellung der analysierten Daten erfolgen. Die Selektion eines kontinuierlichen Teilwellenbereichs aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts und das Einstellen der Detektionseinheit auf den ausgewählten Teilwellenbereich des Detektionslichts kann durch den Benutzer erfolgen. Ebenso kann die Selektion eines kontinuierlichen Teilwellenbereichs aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts durch einen Computeralgorithmus erfolgen. Parallel dazu wird das Einstellen der Detektionseinheit auf ein ausgewähltes Teilwellenbereich ebenfalls durch einen Computeralgorithmus ausgeführt. Um bestimmte Konfigurationen des Emissionsspektrums zu vermessen, wird eine systematische Veränderung der zur Beleuchtung herangezogenen Teilwellenbereiche vorgenommen. Es wird einen Punkt, Linien, Bild, oder Volumenaufnahmeprozesses durchgeführt und eine pixelweise Rekonstruktion der Anregungs-/Emissionscharacteristik χ(λ^ex, λ^em). Die kann dann visualisiert werden.
Das Spektralscanmikroskop ist in vorteilhafter Weise mit einem Beleuchtungssystem ausgestattet, das einen Beleuchtungslichtstrahl aussendet. Ein Mittel zur spektralen Selektion des Beleuchtungslichtstrahls ist vorgesehen und mindestens ein spektral konfigurierbar Detektor. Mit dem Spektralscanmikroskop ist ein Rechnersystem verbunden, das einen Speicher und eine Datenbank umfasst. In Verbindung mit dem Rechnersystem und/oder der Datenbank wird mit dem spektralen Selektionsmittel aus einem kontinuierlichen Wellenlängenbereich ein kontinuierlicher Teilwellenbereich auswählt. Dieser dient dazu ein Objekt zu beleuchten. Ebenso erfolgt in Verbindung mit dem Rechnersystem und/oder der Datenbank, dass mit dem spektralen Selektionsmittel aus dem Detektionslichtstrahl ein Detektionsband auswählbar ist. Das Beleuchtungssystem des Spektralscanmikroskops ist eine Weißlichtquelle. Das Mittel zur spektralen Selektion ist ein AOTF. Der mindestens eine spektral konfigurierbare Detektor ist ein SP-Modul.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops, wobei dem Detektor ein SP Modul vorgeschaltet ist;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des SP-Moduls im Detail,
Fig. 3 ein spezielles Weisslicht-Beleuchtungssystem für eine Scanmikroskop gemäß der gegenwärtigen Erfindung;
Fig. 4 ein Ausführungsform eines optischen Elements, das zur Lenkung des Beleuchtungslichtstrahls und des Detektionslichtstrahls vorgesehen ist;
Fig. 5a verdeutlicht die zweier eng benachbarter Farbstoffe;
Fig. 5b verdeutlicht die Emissionsspektren zweier eng benachbarter Farbstoffe;
Fig. 6a Beleuchten von spektral nah benachbarten Absorptionsspektren zweier Farbstoffe;
Fig. 6b Aufnahme von spektral nah benachbarten Emissionsspektren zweier Farbstoffe;
Fig. 7a Beleuchtung der Probe mit einer ersten Wellenlänge und einer zweiten Wellenlänge;
Fig. 7b das Ergebnis einer Abtastung eines des ersten und des zweiten Emissionsspektrums; und
Fig. 8 die unterschiedlichen Beleuchtungs- und Detektionsbänder für zwei verschiedene Farbstoffe innerhalb der Emissions- und Absorptionsebene.
In Fig. 1 ist das Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops 100 schematisch gezeigt. Dies soll jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden. Der von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Der Strahlteiler 5 ist vorteilhafterweise als acoustooptisches Bauteil (AOBS) realisiert, da dies die optische Gesamtperformance dramatisch verbessert. Bevor der Beleuchtungslichtstrahl 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft, passiert dieser ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 durch eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch ein Objekt 15 führt. Das Beleuchtungssystem 1 kann derart ausgestaltet sein, dass es aus dem Licht eines Lasers, Weißlicht erzeugt. Hierzu ist ein mikrostrukturiertes Element 8 oder eine tapered Glasfaser vorgesehen. Der Aufbau zur Erzeugung von Weislicht ist in Fig. 3 genauer beschrieben. Beleuchtungslichtstrahl 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann der Beleuchtungslichtstrahl 3 auch durch das Objekt 15 geführt werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem geeigneten Farbstoff präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe werden durch den Beleuchtungslichtstrahl 3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Dieses vom Objekt 15 ausgehende Licht definiert einen Detektionslichtstrahl 17. Dieser gelangt durch die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole 18 auf eine Detektionseinheit. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Detektionseinheit mindestens einen Detektor 36, 37, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z. B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Die Detektoren 36 und 37 sind spektral konfigurierbar, um somit verschiedene, auswählbare Wellenlängenbereiche des Detektionslichtstrahls 17 bestimmen zu können. Der vom Objekt 15 ausgehende bzw. definierte Detektionslichtstrahl 17 ist in Fig. 1 als gestrichelte Linie dargestellt. In den Detektoren 36, 37 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt 15 Licht nicht nur einer Wellenlänge ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 36, 37 ein SP-Modul 20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor 36, 37 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät kann z. B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops 100 erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z. B. aus einer Tastatur, einer elektronischen Einstellvorrichtung für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus besteht. Das SP Modul 20 (Fig. 2) ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d. h., das alle vom Objekt 15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Die Daten werden an das Rechnersystem 23 übertragen und können dann in einer von Benutzer bestimmbaren Weise auf dem Display (nicht dargestellt) angezeigt werden. Der Detektionslichtstrahl 17 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, kann mittels der Spiegelblendenanordnung 34, 35 ein gewünschter Teil des Spektrums ausgewählt bzw. systematisch selektiert werden. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Spaltblendenanordnung 34, 35 mit einem ersten und einem zweiten Schieber 40 und 41 ausgestattet. Es ist selbstverständlich, dass für die Selektion von mehr als zwei spektralen Bereichen eine entsprechende Anzahl von Schiebern vorgesehen sein muss. Dem ersten Schieber 40 ist ein erster Motor 44 und dem zweiten Schieber 41 ist ein zweiter Motor 45 zugeordnet. Die Motore 44 und 45 veranlassen eine gemäß den nachstehenden Verfahren beschriebene Verstellung der Schieber 40 und 41. Durch die Verstellung der Schieber 40 und 41 passiert nur ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 des Detektionslichtstrahls 17, der nur Licht des vorgewählten Spektralbereichs umfasst, die Spiegelblendenanordnung 34, 35 und wird von dem Detektor 36, der als Photomultiplier ausgeführt ist, detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 wird an der Spiegelblendenanordnung 35reflektiert und gelangt zu Detektor 37, der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist.
Fig. 3 zeigt das Beleuchtungssystem 1, das einen Laser 10 beinhaltet, der als diodenlasergepumpter, modengekoppelter Ti:Saphir-Laser ausgeführt ist und der einen gepulsten Lichtstrahl 50 (entspricht dem Beleuchtungslichtstrahl 3 aus Fig. 1), der gestrichelt gezeichnet ist, emittiert. Die Dauer der Lichtpulse beträgt ca. 100 fs bei einer Repetitionsrate von ca. 80 MHz. Der Lichtstrahl 50 wird mit der Fokussieroptik 51, die als Zoomoptik ausgestaltet und entlang der Fortpflanzungsrichtung des Lichtstrahles 50 verschiebbar angeordnet ist, auf ein mikrostrukturiertes optisches Element 8, das aus einem Kristall aus Photonic-band-Gap-Material besteht, fokussiert. In dem mikrostrukturierten optischen Element 8 wird das Licht des Lasers 10 spektral verbreitert. Alle Komponenten befinden sich in einem Gehäuse 54 mit einer Lichtaustrittsöffnung 55, durch die das spektral verbreiterte Licht 56, als divergent verlaufender Strahl, das Gehäuse verlässt. Das Spektrum des spektral verbreiterten Lichts 56 reicht von ca. 300 nm bis 1600 nm, wobei die Lichtleistung über das gesamte Spektrum weitgehend konstant ist. Das mikrostrukturierte optische Element 8 kann in einem Ausführungsbeispiel ebenfalls aus einem Lichtleiter bestehen, der mit einer Querschnittsverjüngung versehen. In dem Lichtleiter wird das Emissionslicht des Lasers 10 spektral verbreitert. Der Beleuchtungslichtstrahl 3 (siehe Fig. 1) gelangt zu dem Umlenkmittel 5, das aus einem akustooptischen Element ausgebildet ist. Das akustooptische Element ist als AOTF (Acustooptical Tunable Filter) ausgeführt, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 gemäß eines vom Benutzer ausgewählten Bandes, das von λ - Δλ/2 bis λ + Δλ/2 reicht, begrenzt.
Fig. 4 zeigt das optische Umlenkmittel 5 im Detail, das dem SP-Modul 20 vorgeschaltet ist. Das optische Umlenkmittel 5 weist einen ersten Port 60, einen zweiten Port 61, und einen dritten Port 62 auf, wobei in den ersten Port 60 der Beleuchtungslichtstrahl 4 einkoppelt ist. An dem zweiten Port 61 wird der Beleuchtungslichtstrahl 4 auskoppelt und ein Detektionslichtstrahl 17 einkoppelt. An dem dritten Port 62 wird der Detektionslichtstrahl 17 auskoppelt und dem SP-Modul 20 zugeführt. Das optische Umlenkmittel 5 beinhaltet ein erstes akustooptisches Bauteil 63 und ist als austauschbares Modul mit einem Gehäuse 64 ausgestaltet. Der einfallende Beleuchtungslichtstrahl 4 wird von einem Umlenkspiegel 65 auf das erste akustooptische Bauteil 63 gelenkt. Das akustooptische Bauteil 63 ist als AOTF ausgestaltet, der von einer akustischen Welle durchlaufen ist. Die akustische Welle wird von einem der elektrisch angesteuerten Piezo-Schallerzeuger generiert. Die Frequenz der akustischen Welle ist so gewählt, dass nur die Anteile der gewünschten Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls 4 in Richtung des zweiten Ports 61 gelenkt werden. Die übrigen, von der akustischen Anregung nicht beeinflussten Anteile des Beleuchtungslichtstrahls 4 werden in eine Strahlfalle 66 gelenkt. Durch Variation der Amplitude der akustischen Welle ist die Leistung des aus dem zweiten Port 61 austretenden Beleuchtungslichtstrahls 4 auswählbar, was insbesondere bei reflexionsmikroskopischen Anwendungen von besonderem Vorteil ist. Kristallschnitt und Orientierung des akustooptischen Bauteils 63 sind dabei so gewählt, dass bei gleicher Einkoppelrichtung verschiedene Wellenlängen in die gleiche Richtung abgelenkt werden.
Mit dem optischen Element 5 ist die Variierung der Leistung des Beleuchtungslichtstrahls 4, die Variierung der Leistung mindestens einer auswählbaren Wellenlänge oder mindestens eines auswählbaren Wellenlängenbandes des Beleuchtungslichtstrahls 4 und auch die vollständige Ausblendung auswählbarer Wellenlängen oder auswählbarer Wellenlängenbänder ermöglicht. Der Detektionslichtstrahl 17, der in Fig. 2 und in Fig. 4 gestrichelt dargestellt ist, trifft mit entgegengesetzter Ausbreitungsrichtung zum Beleuchtungslichtstrahls 4 auf das erste akustooptische Bauteil 63. Die Anteile des Detektionslichtstrahl 17 mit gleicher Wellenlänge und Polarisation wie die des Beleuchtungslichtstrahls 4 werden je nach Amplitude der akustischen Welle vollständig oder teilweise auf den Umlenkspiegel 65 und anschließend zum ersten Port 60 gelenkt; bei verminderter Amplitude gelangt der unbeeinflusste Anteil an dem Umlenkspiegel 65 vorbei. Handelt es sich bei dem Detektionslichtstrahl 17 beispielsweise um Reflexionslicht, so wirkt das optische Element 5 wie ein variabler Neutralstrahlteiler, dessen Teilungsverhältnis durch die Amplitude der akustischen Welle bestimmt ist. Handelt es sich bei dem Detektionslichtstrahl 11 um Fluoreszenzlicht, das z. B. aufgrund der Stokes- oder Ramanverschiebung in der Wellenlänge verändert ist, wird dieses von der akustischen Welle nicht beeinflusst und gelangt am Umlenkspiegel 17 vorbei. Aufgrund der Doppelbrechung des ersten akustooptischen Bauteils 63 ist der Detektionslichtstrahl 17 in einen ordentlich und einen außerordentlich polarisierten Strahl aufgespalten. Außerdem sind jeweils der ordentlich und der außerordentlich polarisierte Strahl aufgrund der Prismenwirkung des akustooptischen Bauteils 63 auch spektral aufgefächert. Zur Kompensation ist ein optisches Kompensationselement 67, das aus einem weiteren akustooptischen Bauteil 68 besteht, vorgesehen. Das weitere akustooptische Bauteil 68 entspricht im Aufbau dem ersten akustooptischen Bauteil 63. Es ist um 180 Grad um die Strahlachse bezüglich dem ersten akustooptischen Bauteils 63 gedreht angeordnet. Dadurch werden die aufgefächerten Teilstrahlen unterschiedlicher Polarisationsrichtung wieder vereinigt. Gleichzeitig wird die spektrale Auffächerung des ersten akustooptischen Bauteils 63 rückgängig gemacht. Es verbleibt allenfalls ein geringer Parallelversatz für Detektionslicht unterschiedlicher Wellenlängen. Nach Durchlaufen des weiteren akustooptischen Bauteils 67 trifft der Detektionslichtstrahl 17 auf ein Spiegelpaar, das aus einem ersten Spiegel 69 und einem zweiten Spiegel 70 aufgebaut ist. Das Spiegelpaar dient dazu, den Detektionslichtstrahl 17 auf die gewünschte Strahlachse, nämlich die Strahlachse, die der durch den zweiten Port 61 eintretende Detektionslichtstrahls 17 aufweist, zu bringen. Dies vereinfacht die Austauschbarkeit des optischen Umlenkmittels 5 gegen ein Element mit einem konventionellen Strahlteiler. Ebenso, wie der Beleuchtungslichtstrahl 4 kann der Detektionslichtstrahl 17 mit dem ersten akustooptischen Bauteil 63 oder auch mit dem weiteren akustooptischen Bauteil 68 spektral selektiv in der Leistung variiert werden.
Auf der bisher beschriebenen Mikroskoparchitektur und der hierzu äquivalenten Architektur (z. B. Wießlichtquelle, die als Bogenlampe ausgebildet ist, spektrale Zerlegung des Anregungslicht über Prismen und Spiegelschieber und Zoomoptiken) kann die Fluoreszenzeigenschaft der in die Probe oder das Objekt 15 eingebrachten Farbstoffe optimal detektiert werden.
Die Problematik lässt sich anhand der Fig. 5a und Fig. 5b erklären. Die Farbstoffe sind im wesentlichen durch eine graphische Darstellung 1000 mindesten eines Absorptionsspektrums charakterisiert. Bei der graphischen Darstellung 1000 des Absorptionsspektrum ist auf der Abszisse die Wellenlänge λ und auf der Ordinate der Absorptionskoeffizient α aufgetragen. Ein erstes und ein zweites Absorptionsspektrum 1001 und 1002 ist mit der Formel α_i(λ^ex) charakterisiert, wobei der Index i den i'ten in die Probe eingebrachten Farbstoff bezeichnet. Fig. 5b stellt eine graphische Darstellung 1100 eines Emissionsspektrums dar. Bei der graphischen Darstellung 1100 des Emissionsspektrums ist auf der Abszisse die Wellenlänge λ und auf der Ordinate der Emissionskoeffizient ε aufgetragen. Ein erstes und ein zweites Emissionsspektrum 1101 und 1102 ist mit der Formel ε_i(λ^em) charakterisiert, wobei der Index i den i'ten in die Probe eingebrachten Farbstoff referenziert. Die Unterscheidung der Wellenlängen λ^ex und λ^em ist notwendig, da es sich bei λ^ex um Licht im Beleuchtungsstrahlengang und bei λ^ex um Licht im Detektionsstrahlengang handelt. Beide Typen von Spektren modellieren die Wahrscheinlichkeit, dass eine Photonenaktivität im Farbstoff auftritt und ist statistischer Natur. Das Absorbtionsspektrum beschreibt die Wahrscheinlichkeit das ein Photon vom Farbstoff eingefangen wird, ein interner Elektronenzustand verändert und die Energie des Moleküls erhöht wird. Das Emissionsspektrum beschreibt die Wahrscheinlichkeit, dass ein interner Energiezustand zu einer Lichtemission führt. Bei realen Farbstoffen sind diese Spektren relativ ähnlich, wobei in der Regel eine Spiegelung des einen Spektrum um einen ausgezeichneten Punkt ungefähr das andere Spektrum ergibt. Diese Spiegelung ist aber nicht als mathematisch exakt aufzufassen sondern nur eine Pseudoregel, die als Heuristik bei der Anwendung von Farbstoffen gute Dienste leistet. Es werden zusätzlich Veränderungen der Spektren beobachtet, die in Abhängigkeit der biochemischen Umgebung der Probe (z. B. lokale pH Werte) zu betrachten sind.
Ein komplettes Spektrum (Absorptions- und Emissionsspektrum) lässt sich dann über die Funktion:

χ_i(λ^ex λ^em)

definieren, die im folgenden als Anregungs-Emissions-Übertragungs- Spektrum bezeichnet ist. Diese Funktion beschreibt das Fluoreszenzlicht eines Farbstoffes bei Anregung bei λ^ex und Detektion bei λ^em. Bei Nutzung der beherrschenden annähernden Modellbildung ergibt sich als erste Näherung dieser Funktion

χ_i(λ^ex, λ^em) ≍ α_i(λ^ex)ε_i(λ^em)

die in den meisten Fällen hinreichend ist, aber oft auch nicht.
Der wesentliche Nachteil des Stands der Technik ist, das Unterschiede in den Absorptionsspektren nicht ausgenutzt werden, sondern dass der Rückschluss auf die mikroskopische Struktur nur auf Basis der Emissionsspektren ε_i(λ^em) durchgeführt wird. Dies ist in Fig. 6a und Fig. 6b dargestellt. Bei spektral nah benachbarten erstem und zweitem Absorptionsspektren 1001 und 1002 sowie spektral nah benachbarten erstem und zweitem Emissionsspektren 1101 und 1102 wird in der Regel Laserlicht zur Beleuchtung eingesetzt. Die Beleuchtung durch das Laserlicht ist in den folgenden Figuren als Blitz 1003 dargestellt. Das zur Beleuchtung verwendete Laserlicht besitz eine bestimmte Wellenlänge, dessen Lage durch die gestrichelte Linie 1004 in der graphischen Darstellung 1000 des Absorptionsspektrum in Fig. 6a repräsentiert ist. In Fig. 6b ist die Aufnahme des Emissionsspektrums dargestellt. In den unterschiedlichen Abtastintervallen 1103 des Emissionsspektrums wird die Mischung aller Farben aufgenommen. Diese Messung kann sowohl als spektraler Scan (mehr als 4 Abtastintervalle) oder als Mehrfarbbild (z. B. pro Farbstoff ein Bild) durchgeführt werden. Die spezifischen Abtastintervalle 1105, 1106 und 1107 sind als grau hinterlegte Flächen dargestellt. In Fig. 6b sind die Signalanteile, die zur Diskriminierung des ersten und des zweiten Emissionsspektrums 1101 und 1102 herangezogen werden schraffiert gezeichnet. Liegen das erste und das zweite Emissionsspektrum 1101 und 1102 weiter auseinander, kommen eventuell mehr Laserlinien für die Beleuchtung zum Einsatz, wobei der Rest des Verfahrens unberührt bleibt. Hier wird die Wellenlänge des Beleuchtungslichts im wesentlichen nur verändert, um das Absorptionsspektrum überhaupt zu treffen.
Der Kerngedanke der Erfindung geht auf die direkte Erfassung von Bildern auf der Basis von χ_i(λ^ex, λ^em) zurück. Hierzu wird gezielt die Wellenlänge λ^ex der Beleuchtung und die Wellenlängenbereiche λ^em der Detektionsbänder variiert, um eine optimale Diskrimination der in die Probe eingebrachten Farbstoffe zu erhalten. Durch die Nutzung einer Weißlichtquelle mit einem Mechanismus zur spektralen Selektion des breitbandigen Beleuchtungssystems 1 wird die volle Erfassung der Funktion χ_i(λ^ex, λ^em) möglich, die exakte Vorhersagen über die Farbstoffkombinationen ermöglicht. In Fig. 7a ist die Beleuchtung der Probe mit einer ersten Wellenlänge, die durch die gestrichelte Linie 1004 in der graphischen Darstellung 1000 des Absorptionsspektrums in Fig. 7a dargestellt ist. Ferner ist die Beleuchtung der Probe mit einer zweiten Wellenlänge, die durch die gestrichelte Linie 1006 im Absorptionsspektrum dargestellt ist. Die Beleuchtung mit der ersten Wellenlänge erzeugt eine ganz andere spektrale Antwort als die Beleuchtung mit der zweiten Wellenlänge. Es ist selbstverständlich, dass die Beleuchtung nicht auf zwei unterschiedliche Wellenlängen beschränkt sein muss. In Fig. 7b ist das Ergebnis einer Abtastung eines des ersten und des zweiten Emissionsspektrums 1101 und 1102 dargestellt. Durch Anregung der Probe mit dem Laserlicht, das durch den Blitz 1005 (siehe Fig. 7a) dargestellt ist, erhält man das in Fig. 7b erste Emissionsspektrum 1101, das in der gleichen Schraffur gekennzeichnet ist wie der Blitz 1005. Ebenso erhält man durch Anregung der Probe mit dem Laserlicht, das durch den Blitz 1003 (siehe Fig. 7a) dargestellt ist, das in Fig. 7b zweite Emissionsspektrum 1102, das in der gleichen Schraffur gekennzeichnet ist, wie der Blitz 1003. Durch sequentielle Ausführung kann man durch systematische Scans (reguläre Abtastpunkte und konstante Breiten der Abtastintervalle sowohl auf der Anregung als auf der Emissionsseite) bei gleichzeitiger Verstellung der Beleuchtungswellenlänge für jeden einzelnen Pixel eine Funktion I(λ^ex, λ^em) abtasten, die alle Eigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs beinhaltet und direkt proportional zu χ_i(λ^ex, λ^em) ist.
In Fig. 8 sind die unterschiedlichen Beleuchtungs- und Detektionsbänder für zwei verschiedene Farbstoffe dargestellt. Auf der Ordinate ist die Wellenlänge λ^ex der Beleuchtung und auf der Abszisse ist die Wellenlänge λ^em der Emission aufgetragen. Die notwendige Genauigkeit mit der diese Funktion abgetastet wird, hängt hierbei vom Experiment ab und bewirkt eine Variation der Beleuchtungs- und Detektionsbänder 1203 und 1204, wobei der Kerngedanke der Erfindung unbeeinflusst bleibt. Da es sich bei der Wellenlänge λ^ex der Beleuchtung und der Wellenlänge λ^em der Emission um Wellenlängenbereiche handelt, sind die Beleuchtungs- und Detektionsbänder 1203 und 1204 als Flächen in Fig. 8 repräsentiert. Bei Kenntnis von χ_i(λ^ex, λ^em) kann man die Beleuchtungs- und Detektionsbänder 1203 und 1204 so wählen, dass die Unterscheidung von Farbstoffen optimiert ist. Hierzu wird - in Abhängigkeit des realen Mikroskopaufbaus (Anzahl Detektoren. . .) - ein Satz Flächen auf der (λ^ex, λ^em) Ebene bestimmt deren Kanten die Beleuchtungs- und Detektionsbänder 1203 und 1204 definiert. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist einen erster Farbstoff in der Probe, der ein erstes Übertragungsspektrum 1201 und ein zweiter Farbstoff in der Probe, der ein zweites Übertragungsspektrum 1202 aufweist, dargestellt. In Abhängigkeit von der a priori bekannten Farbstoffinformation (erstes und zweites Übertragungsspektrum 1201 und 1202) kann man in Abhängigkeit von den Farbstoffen ein irreguläres Muster von Abtastrechtecken innerhalb der Emissions-Absorptions-Ebene angeben, die bereits genügend Information bereitstellen, um die Proben und Farbstoffe auseinander zu halten. Als erste Heuristik zur Allokation dieser Detektionskonfigurationen für Zweifach Färbungen kann man Differenzen der Emissions- und Absorptionsspektren bestimmen und dieser einer Schwellwertprüfung unterziehen. Auf diese Weise lassen sich zusammenhängende Spektralbereiche auf der Emissions- und Absorptionsachse bestimmen, die ein Maximum an Informationsausbeute zur Diskriminierung der Farbstoffe ermöglichen. Bei Mehrfachfärbungen lassen sich ähnliche Algorithmen auf der Basis der linearen Algebra und der statistischen Diskriminanzanalyse herleiten, die gleichzeitig das Mischverhalten auf der Emissions- und Anregungsseite modellieren und ideale Einstellungen liefern. Das Prinzip ist gleich, nur der mathematisch zugrunde liegende Formalismus etwas komplizierter und umfangreicher.
Eine besondere Art der Systemkonfiguration erhält man, wenn man den interessierenden Gegenstand vollständig scannt, d. h. die Funktion χ_i(λ^ex, λ^em) komplett mit hinreichender Genauigkeit scannt. Dann kann man auf der Basis eines numerischen Algorithmus die Beleuchtungs- und Detektionsbänder so setzen, dass sie optimal sind. Ansätze hierzu sind Entropiebasierte oder Diskriminanzanalyse Verfahren, welche die Fläche unter den Rechtecken bewerten, wobei die Flächen bezüglich dieser so definierten Güte optimiert werden.
Auch spezielle Datendarstellungen als Bild oder als 2S D Plot (wie er in Materialstudien üblich ist) sind sinnvoll, um den Experimentator die aufgenommene Information χ_i(λ^ex, λ^em) darzustellen.
Die so gewonnen Daten sind für eine Weiterverarbeitung mit Dekorrelationsalgorithmen - wie in US- 5,791,024 offenbart - stark geeignet, da diese die zusätzliche Information optimal herausfiltern und redundante Information unterdrücken.
Die Erfindung wurde in bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Des Weiteren wurde die Erfindung für den vereinfachten Fall zweier Spektren beschrieben, wobei dem Fachmann hinreichend klar ist, dass der wahre Wert der Erfindung für mehr Farbstoffe erreicht wird. Bezugszeichenliste 1 Beleuchtungssystem
3 Beleuchtungslichtstrahl
5 Umlenkmittel
6 Beleuchtungspinhole
7 Scanmodul
8 mikrostrukturiertes Element
9 Scanspiegel
10 Laser
12 Scanoptik
13 Mikroskopoptik
15 Objekt
17 Detektionslichtstrahl
18 Detektionspinhole
20 SP-Modul
23 Rechnersystem
31 Prisma
32 aufgespaltener Lichtfächer
33 Fokussieroptik
34 Spiegelblendenanordnung
35 Spiegelblendenanordnung
36 Detektor
37 Detektor
40 erster Schieber
41 zweiter Schieber
44 erster Motor
45 zweiter Motor
50 gepulster Lichtstrahl
51 Fokussieroptik
52 Zoomoptik
54 Gehäuse
55 Lichtaustrittsöffnung
56 spektral verbreitertes Licht
60 erster Port
61 zweiter Port
62 dritter Port
63 erstes akustooptisches Bauteil
64 Gehäuse
65 Umlenkspiegel
66 Strahlfalle
67 optisches Kompensationselement
68 weiteres akustooptisches Bauteil
69 erster Spiegel
70 zweiter Spiegel
100 Scanmikroskop
1000 graphische Darstellung
1001 erstes Absorptionsspektrum
1002 zweites Absorptionsspektrum
1003 Blitz (Beleuchtung durch Laserlicht)
1004 gestrichelte Linie (erste Wellenlänge)
1005 Blitz (Beleuchtung durch Laserlicht)
1006 gestrichelte Linie (zweite Wellenlänge)
1100 graphische Darstellung
1101 erstes Emissionsspektrum
1102 zweites Emissionsspektrum
1103 Abtastintervall
1105 spezifisches Abtastintervall
1106 spezifisches Abtastintervall
1107 spezifisches Abtastintervall
1201 Übertragungsspektrum (erster Farbstoff)
1202 Übertragungsspektrum (zweiter Farbstoff)
1203 Beleuchtungs-/Detektionsband
1204 Beleuchtungs-/Detektionsband

Claims

1. Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Erzeugen eines Beleuchtungslichtstrahls (3) wobei das erzeugte Beleuchtungslicht einen kontinuierlichen Wellenbereich im Spektrum umfasst;

b) Selektion eines kontinuierlichen Teilwellenbereichs aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts;

c) Einstellen der Detektionseinheit auf einen ausgewählten Teilwellenbereich;

d) Durchführen eines Bild- oder Volumenaufnahmeprozesses; und

e) Verarbeitung der aufgenommenen Bilddaten durch einen Algorithmus zur Datenanalyse und graphische Darstellung der analysierten Daten.

2. Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop, nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch: Selektion eines kontinuierlichen Teilwellenbereichs aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts durch den Benutzer; und Einstellen der Detektionseinheit auf den ausgewählten Teilwellenbereich durch den Benutzer.

3. Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop, nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch: Selektion eines kontinuierlichen Teilwellenbereichs aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereichs des Beleuchtungslichts durch einen Computeralgorithmus; und Einstellen der Detektionseinheit auf ein ausgewähltes Teilwellenbereich durch einen Computeralgorithmus.

4. Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop, nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Systematische Veränderung der zur Beleuchtung herangezogenen Teilwellenbereiche;

b) Durchführung eines Punkt, Linien, Bild, oder Volumenaufnahmeprozesses;

c) Pixelweise Rekonstruktion der Anregungs- /Emissionscharacteristik χ(λ^ex, λ^em)

d) Visualisierung der Anregungs-/Emissionscharacteristik χ(λ^ex, λ^em)

5. Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralscanmikroskop, nach Anspruch 3 oder 4, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) sequentielles Aufnahmen der Anregungs- /Emissionscharakteristiken χ(λ^ex,, λ^em) einzelner Farbstoffe;

b) Ablagen der aufgenommenen Anregungs- /Emissionscharakteristiken χ(λ^ex, λ^em) in einem Speicher, einer Datenbank oder eines Files. und

c) Bestimmung optimaler Beleuchtungs- und Detektionsbereiche durch einen Computeralgorithmus,

6. Spektralscanmikroskop mit einem Beleuchtungssystem (1), das einen Beleuchtungslichtstrahl (3) aussendet, einem Mittel (5) zur spektralen Selektion des Beleuchtungslichtstrahls (3), mindestens einen spektralen konfigurierbaren Detektor (36, 37), gekennzeichnet dadurch, dass ein Rechnersystem (23) vorgesehen ist, das eine Speicher und eine Datenbank umfasst, und dass in Verbindung mit dem Rechnersystem (23) und/oder der Datenbank mit dem spektralen Selektionsmittel (5) aus einem kontinuierlichen Wellenlängenbereich ein kontinuierlicher Teilwellenbereich auswählbar ist, um ein Objekt (15) zu beleuchten und dass in Verbindung mit dem Rechnersystem (23) und/oder der Datenbank mit dem spektralen Selektionsmittel (5) aus dem Detektionslichtstrahl (17) ein Detektionsband auswählbar ist.

7. Spektralscanmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungssystem (1) eine Weißlichtquelle umfasst.

8. Spektralscanmikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Weißlichtquelle aus einem Laser (10) besteht, der einen gepulsten Lichtstrahl (50) aussendet, und dass der gepulste Lichtstrahl in ein mikrostrukturiertes optisches Element (8) eingekoppelt ist.

9. Spektralscanmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mikrostrukturierte optisches Element (8) aus Photonic-band- Gap-Material besteht.

10. Spektralscanmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mikrostrukturierte optisches Element (8) aus einem Lichtleiter besteht, der mit einer Querschnittsverjüngung versehen ist.

11. Spektralscanmikroskop nach 6 dadurch gekennzeichnet dass die Weißlichtquelle aus einer Bogenlampe besteht.

12. Spektralscanmikroskop nach 6, dadurch gekennzeichnet dass das Mittel zur spektralen Selektion ein AOTF ist.

13. Spektralscanmikroskop nach 6 dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine spektral konfigurierbare Detektor (36, 37) ein SP Modul ist.

14. Spektralscanmikroskop nach 6, dadurch gekennzeichnet dass der spektral konfigurierbare Detektor auf der Basis eines Gratings und eines Multi-Channel PMT aufgebaut ist.