DD271711A1

DD271711A1 - METHOD FOR DETERMINING THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF CORONATIN, DERIVATIVES OF CORONATIN AND CORONATINIC COMPOUNDS

Info

Publication number: DD271711A1
Application number: DD31528088A
Authority: DD
Inventors: Hans-Peter Schmauder; Birgit Wichetek; Adelheid Orthaus; Joachim Senf; Peter Doebel
Original assignee: Univ Schiller Jena
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1988-05-02
Publication date: 1989-09-13

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivitaet von Coronatin, Derivaten des Coronatins und coronatinaehnlichen Verbindungen beschrieben. Nach dem neuen Verfahren wird die biologische Aktivitaet mit Hilfe von Zellkulturen von Lycopersicon peruvianum, Chenopodium album und/oder Phaseolus coccineus cv. "Red Kidney" durch die Bestimmung ausgewaehlter physiologischer Parameter, wie beispielsweise des Wachstums, des Gehaltes an freien Aminosaeuren, des Proteingehaltes, verschiedener Enzyme des Grundstoffwechsels, ermittelt. Die Zellkulturen koennen dabei sowohl emers auf verfestigten Medien als auch submers in fluessigen Medien bei 20-30C kultiviert werden. Die Bestimmung von Hemmhoefen ist ebenfalls moeglich. Die zu testenden Proben werden unmittelbar nach dem Impfen oder spaetestens nach 24 Stunden zugesetzt und nach 1-5 Tagen ist das Ergebnis ermittelbar.A method is described for determining the biological activity of coronatin, derivatives of coronatin and coronatal compounds. According to the new method, the biological activity is determined by means of cell cultures of Lycopersicon peruvianum, Chenopodium album and / or Phaseolus coccineus cv. "Red Kidney" by the determination of selected physiological parameters, such as the growth, the content of free amino acids, the protein content, various enzymes of the metabolism, determined. The cell cultures can be cultured both on solidified media and submersed in liquid media at 20-30C. The determination of inhibitory sites is also possible. The samples to be tested are added immediately after vaccination or at the latest after 24 hours and after 1-5 days, the result can be determined.

Description

Field of application of the invention

Eine Reihe von mikrobiell gebildeten wie auch durch chemische Synthese zugängliche Substanzen besitzen phytotoxische bzw. phytoeffektive Eigenschaften. Zur Entwicklung umweltfreundlicher Wirkstoffe für Landwirtschaft und Gartenbau ist es notwendig, Testsysteme zu besitzen, mit deren Hilfe man wirksame Substanzen schnell auffinden kann. Für solche Untersuchungen sind Bioteste am besten geeignet, da sie sofort Röckschlüsse auf die biologische Aktivität der jeweiligen Produkte erlauben. Pflanzliche Zeilkulturen sind hierfür besonders geeignet, da ihre Anwendung die Berücksichtigung einer Vielzahl von spezifischen Stoffwechseleigenschaften pflanzlicher Zellen gestattet..Eine solche stoffwechselaktive Substanz ist das Coronatin. Es ist stark phytotoxisch, zum Beispiel gegenüber Nachtschattengewächsen, wie beispielsweise der Tomate. Es induziert unter anderem Chlorosen. Durch Resistenzzüchtung ist es möglich, gegen diese Phytotoxin resistente Nutzpflanzen zu gewinnen, so daß eine Behandlung der Anbauflächen mit Coronatin, Derivaten des Coronatins und/oder coronatinähnlichen Stoffen zur effektiven und unkrautfreien bzw. -armen Kultivation beitragen kann. Der erfindungsgemäße Biotest mit pflanzlichen Zellkulturen dient dem schnelleren Auffinden von wirksamen Komponenten.A number of microbially formed as well as accessible by chemical synthesis substances have phytotoxic or phyto-effective properties. For the development of environmentally friendly active ingredients for agriculture and horticulture, it is necessary to have test systems that can be used to quickly find effective substances. Biotests are best suited for such studies because they allow immediate conclusions about the biological activity of the respective products. Herbal cell cultures are particularly suitable for this, since their application allows the consideration of a variety of specific metabolic properties of plant cells. One such metabolically active substance is the coronatin. It is highly phytotoxic, for example, against solanaceae, such as the tomato. It induces, among other things, chlorosis. Resistance breeding makes it possible to obtain crops resistant to this phytotoxin, so that treatment of the acreage with coronatin, derivatives of coronatin and / or coronatin-like substances can contribute to effective and weed-free or poor cultivation. The bioassay according to the invention with plant cell cultures serves for the faster finding of effective components.

Characteristic of the known technical solutions

Zur schnellen Identifizierung von Coronatin sind bisher nur qualitativ auswertbare Bioteste bekannt geworden. Daneben kann man diese Substanz sowie dessen Derivate durch Extraktion aus Kulturfilträten verschiedener Pseudomonas-Stämme und anschließende chromatographische Untersuchung, meist mit Hilfe der HPLC-Technik oder der Gaschromatographie der Methylester, identifizieren. Eine quantitative Auswertung ist nur mit Hilfe dieser beiden chromatographischen MethodenFor the rapid identification of coronatine, only qualitatively evaluable biotests have so far become known. In addition, one can identify this substance and its derivatives by extraction from culture filtrates of various Pseudomonas strains and subsequent chromatographic analysis, usually using the HPLC technique or gas chromatography of methyl esters. A quantitative evaluation is only possible with the help of these two chromatographic methods

möglich. Sie setzen aber die Isolierung und meist eine Vorreinigung voraus. Die direkte Analyse mikrobieller Kulturfiltrate ohne große Vorreinigung ist nicht möglich. Ebenso ist das Auffinden strukturverlnderter oder biologisch wirksamer Substanzen sehr erschwertpossible. But they require the isolation and usually a pre-cleaning. The direct analysis of microbial culture filtrates without large prepurification is not possible. Likewise, the discovery of structure-changed or biologically active substances is very difficult

Von den bisher bekannten Biotesten ist vor allem der Hypertrophietest an Kartoffelgewebe zu nennen. Bereits in Konzentrationen von 10~^e-10~⁷ Mol/l bzw. bei Einsatz von 20 ng treten deutliche Wirkungen auf(z. B. Agric. BIoI. Chem. 43 [1979) 1753; Ann. Phytopath. Soc. Japan 45 [1979] 645). Von Nachteil ist allerdings die relativ langeTestzeit von etwa 4 Tagen und der Bofund, daß nur bestimmte Kartoffelsorten eine reproduzierbare Reaktion zeigen.Of the biotests known to date, especially the hypertrophy test on potato tissue should be mentioned. Already in concentrations of 10 ~ ^e -10 ~ ⁷ mol / l or with the use of 20 ng distinct effects occur (eg Agric. BIOL Chem., 43 [1979] 1753; Ann. Phytopath. Soc. Japan 45 [1979] 645). Of disadvantage, however, is the relatively long test time of about 4 days and the Bofund that only certain potato varieties show a reproducible response.

Andere Teste beruhen auf der Fähigkeit des Coronatins, Chloroson bei verschiedenen Testpflanzen auszulösen, wobei u.a. folgende Nachweisgrenzen beschrieben worden sind: Sojabohne 50 ng, Tomate 3 χ 10"⁷ Mol/l, Buschbohne 25ng. Andere Teste an Ganzpflanzen bzw. Keimpflanzen basieren auf der Bestimmung der Wachstumshemmung der Sojabohne, der Keimhemmung bei Salat bzw. verschiedenen Gräsern oder der Hemmung der Wurzelstreckung bei Weizen, (z. B. Agric. Biol. Chem, 43 [1979] 1753; Can. J. Bot. 60 [1982] 645; A-Mavridis, Dies. Univ. Göttingen, 1982; Physiol. Plant. Pathol.20 (1982] 83; Ann. Phytopathol. Soc. Japan 42 (1976] 613). Alle diese Methoden benötigten für die Anzucht homogenen Pflanzenmaterials Gewächshäuser oder Phytotrone sowie eine längere Vorbereitungsphase.Other tests are based on the ability of the Coronatins, Chloroson at various test plants trigger, inter alia the following detection limits have been described. Soybean 50 ng, tomato 3 χ 10 ^"7 mol / l, dwarf bean 25ng other tests on whole plants or seedlings are based on the Determination of growth inhibition of soybean, germ inhibition in lettuce or various grasses or inhibition of root elongation in wheat, (eg Agric., Biol. Chem., 43 [1979] 1753; Can. J. Bot. 60 [1982] 645 Göttingen, 1982, Physiol Plant Plant Pathol.20 (1982) 83, Ann Phytopathol, Soc, Japan 42 (1976) 613. All of these methods required for the cultivation of homogeneous plant material greenhouses or Phytotrone and a longer preparation phase.

Des weiteren liefen in einigen Laboratorien Experimente, deren Ziel es war, den Einfluß von Coronatin auf die Aktivität verschiedener Enzyme zu untersuchen und mögliche Korrelationen zu finden. So galt unter anderem das Interesse folgenden Enzymsystemen: Stärkeabbau, a-Amylase, Phosphorylase, .'olyphenolxidase, Ascorbatoxidase, Peroxidase, Cellulase, Polygalacturonase. In einigen Experimenten und bei einiger Enzymen konnten Effekte nachgewiesen werden, ohne daß sich quantifizierbare oder spezifische Relationen ergaben. Auch diese Experimente benötigten im ailgemeinen Zeiträume von mindestens 2-4 Tagen.In addition, experiments were carried out in some laboratories, the aim of which was to investigate the influence of coronatin on the activity of various enzymes and to find possible correlations. Inter alia, the following enzyme systems have been of interest: starch degradation, α-amylase, phosphorylase, oleodhenol oxidase, ascorbate oxidase, peroxidase, cellulase, polygalacturonase. In some experiments and in some enzymes effects could be detected without quantifiable or specific relations. These experiments also required periods of at least 2-4 days.

Object of the invention

Es ist das Ziel der Erfindung, Zellkultursysteme zu entwickeln, mit deren Hilfe es möglich ist, schnell, quantifizierbar, reproduzierbar und in einfach handhabbarer Weise die biologische Aktivität von Coronatin, Derivaten des Coronatins oder coronatinähnlichen Verbindungen ohne aufwendige Vorreinigungen zu bestimmen, um damit Selektionsverfahren bzw. Screeningprogramme effektiver gestalten zu können.It is the object of the invention to develop cell culture systems by means of which it is possible to determine the biological activity of coronatin, derivatives of coronatin or coronatin-like compounds quickly, quantifiable, reproducible and in an easy-to-handle manner without elaborate pre-purification in order to obtain selection methods or methods Make screening programs more effective.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Biotestsystem zu entwickeln, das die Bestimmung der biologischen Aktivität von Coronatin, Derivaten des Coronatins und coronatinähnlicher Verbindungen erlaubt, das schnelle Informationen über die Beeinflussung der biologischen Aktivität pflanzlicher Zellen gibt und mit dessen Hilfe neben der Auffindung wirksamer Prinzipien eine Quantifizierung der Effekte möglich ist.The invention has for its object to develop a bioassay system that allows the determination of the biological activity of coronatin, derivatives of coronatin and coronatin-like compounds that gives rapid information on the influence of the biological activity of plant cells and with its help in addition to finding effective principles a quantification of the effects is possible.

GemSß der Erfindung wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß bei pflanzlichen Zoll kulturen das Wachstum und/oder ausgewählte Stoffwechselparameter und deren Grad der Beeinflussung durch die zu untersuchenden mikrobiellen Kulturfiltrate, Lösungen und/oder angereicherten bzw. reinen Substanzen, deren biologische Aktivität zu ermitteln sind, bestimmt werden und daß durch Einsatz geringer Konzentrationen der zu untersuchenden Stoffe eine Selektion von resistenten pflanzlichen Zellen erfolgt. Im Mittelpunkt stehen einerseits Zellkulturen aus der Verwandtschaft des Wirtes der coronatinbildenden Bakterienstamme (Pseudomonas sp.), der Tomate, anderer Nutzpflanzen wie auch von typischen Unkräutern, so daß Aussagen zur Spezifität der Wirkung ermöglicht werden.Gems of the invention, the object is achieved in that in plant customs cultures, the growth and / or selected metabolic parameters and their degree of influence by the investigated microbial culture filtrates, solutions and / or enriched or pure substances whose biological activity to be determined be determined and that by using low concentrations of the substances to be examined, a selection of resistant plant cells. The focus is on the one hand cell cultures from the relationship of the host of the coronate-forming bacterial strains (Pseudomonas sp.), Tomato, other crops as well as typical weeds, so that statements on the specificity of the effect are possible.

Im neuen Verfahren werden Kulturen von Lycopersicon peruvianum, Chenopodium album und/oder Phaseolus coccineus cv. ,Red Kidney" eingesetzt, wobei sowohl eine emerse Kultivation auf verfestigten Medien als auch eine submerse Kultivation in flüssigen Medien zur Anwendung kommen können. Auf diesem Wege ist eine Kalluskultur, eine Kultur mit einzelnen Zellen, mit Zellaggregaten beziehungsweise von Protoplasten möglich. Die Kultivation erfolgt auf oder in an sich bekannten Medien, die C-Quellen, N-Quellen, Mineralsalze, Spurenelemente, geringe Mengen von anderen organischen Substanzen und/oder Zusätze von phytoeffektiven Substanzen enthalten können, wie beispielsweise den Medien nach Murashige und Skoog, Linsmeyer und Skoog, Gamborg oder entsprechend der verwendeten Zellinie oder des zu untersuchenden Materials modifizierten Medien. Die zu untersuchenden Proben können sowohl Coronatin, Derivate des Coronatins, die durch partialsynthetische Abwandlungen, Fütterungsexperimente und/oder Neuisolationen aus mikrobiellen oder anderen Kulturlösungen als auch Kulturfiltrate beziehungsweise partiell gereinigte oder angereicherte Kulturfiltrate sein. Die partielle Reinigung oder Anreicherung kann auf an sich bekannte Weise mit beispielsweise Aktivkohle, Ionenaustauschern oder Extraktionsschritten erfolgen. Diese Proben werden sofort oder bis zu 24 Stunden nach dem Impfen zugesetzt. Die Sterilisation kann in Abhängigkeit vom Charakter der Proben church Sterilfiltration oder Autoklavieren erfolgen.In the new method, cultures of Lycopersicon peruvianum, Chenopodium album and / or Phaseolus coccineus cv. "Red kidney" can be used, whereby both an emerse cultivation on solidified media and a submerse cultivation in liquid media can be used, in this way a callus culture, a culture with single cells, with cell aggregates or protoplasts is possible on or in known media which may contain C sources, N sources, mineral salts, trace elements, small amounts of other organic substances and / or additives of phyto-effective substances, such as, for example, the media of Murashige and Skoog, Linsmeyer and Skoog, The samples to be examined may be coronatin, derivatives of coronatin, which may be modified by partial synthetic modifications, feeding experiments and / or reisolations from microbial or other culture solutions as well as culture filtrates or partially fermented gamborg saturated or enriched culture filtrates. The partial purification or enrichment can be carried out in a manner known per se with, for example, activated carbon, ion exchangers or extraction steps. These samples are added immediately or up to 24 hours after vaccination. Sterilization can be carried out depending on the character of the samples sterile filtration or autoclaving.

Die Ermittlung der biologischen Aktivität kann auf verschiedene Weise erfolgen. Einmal kann die Kultur auf festen Medien ausplattiert werden und wie bei der Suche nach Antibiotika ist ein Hemmhoftest möglich. Andereres ist eine Analyse des physiologischen Zustandes der Zellen möglich, wobei ein oder mehrere Parameter charakterisiert werden können, wie beispielsweise das Wachstum, der Gehalt an löslichen Aminosäuren, der Proteingehalt, der Gehalt an Nukleinsäuren, der Redox-Status, das reduzierende oder oxidierende Potential, der Gehalt an anorganischen und/oder organischen Phosphaten beziehungsweise Aktivitäten typischer Enzyme des Grundstoffwechsels. Diese Messungen sind möglich mit intakten, submers in Schottelkulturen angezogenen Zellen oder Protoplasten. Zur Charakterisierung der Beeinflussung bestimmt man im allgemeinen einzelne oder mehrere für die Kultur und den physiologischen Zustand charakteristische Parameter, wobei üblicherweise mehrere Parameter nebeneinander bestimmt werden sollten. Die zur Ermittlung der Beeinflussung anzuwendenden Methoden und Verfahren entsprechen den allgemein bekannten Verfahrensweisen, angepaßt an die jeweils verwendete Zellinie und zu untersuchenden Proben.The determination of the biological activity can take place in various ways. Once the culture can be plated on solid media and as in the search for antibiotics is a Hemmhoftest possible. On the other hand, an analysis of the physiological state of the cells is possible, whereby one or more parameters can be characterized, such as the growth, the content of soluble amino acids, the protein content, the content of nucleic acids, the redox status, the reducing or oxidizing potential, the content of inorganic and / or organic phosphates or activities of typical enzymes of the metabolism. These measurements are possible with intact cells submerged in Schottel cultures or protoplasts. To characterize the influence is generally determined one or more characteristic of the culture and the physiological state parameters, usually several parameters should be determined side by side. The methods and methods to be used for determining the influence correspond to the generally known procedures, adapted to the respectively used cell line and samples to be examined.

Die Erfindung .«lehnet sich dadurch aus, daß die Aussagen Ober den Grad der Beeinflussung der verwendeten Zellkultur nach 1-5 Tagen, im allgemeinen nach 24-72 Stunden getroffen werden kennen. Überraschenderwelse zeigen die verwendeten Zellkulturen im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Systemen eine Reaktionsweise, die Jederzeit reproduzierbar und quantifizierbar Ist. Die Reaktion ist zwischen den einzelnen Zellkulturen graduell unterschiedlich.The invention "is opposed by the fact that the statements about the degree of influence on the cell culture used can be made after 1-5 days, generally after 24-72 hours. Surprising catfish show the cell cultures used, in contrast to the systems described so far, a reaction that is reproducible and quantifiable at any time. The reaction is gradually different between the individual cell cultures.

Zur Testung werden die Zellkulturen mit einem Vorkulturalter von 4-12 Tagen, vorzugsweise 6-8 Tagen, eingesetzt und die Kultivation bei 20-30"C, vorzugsweise 25-29'C, durchgeführt, wobei die SuspeneionskuKuren und Protoplasten in den flüssigen Medien zur besseren Sauerstoff- und Nährstoffversorgung geschüttelt werden sollten.For testing, the cell cultures are used with a preculture age of 4-12 days, preferably 6-8 days, and the cultivation at 20-30 "C, preferably 25-29'C performed, the SuspeneionskuKuren and protoplasts in the liquid media for better oxygen and nutrient supply should be shaken.

embodiments

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährböden für die Zellkulturen entsprechen den üblichen Vorschriften und sind unter anderem in dem Buch: E.F.Goorge, D. J.M.Puttock, H.J.George »Plant Culture Media", Volume 1: «Formulations and Uses", Exegetics Ltd., England, 1987, zu finden. Die Vorschriften zu den biochemischen Methoden sind einschlägigen Anleitungen zu entnehmen.The following examples are intended to illustrate the invention. The culture media used for the cell cultures are in accordance with the usual regulations and are among others in the book: EFGoorge, DJMPuttock, HJ George Plant Culture Media, Volume 1: Formulations and Uses, Exegetics Ltd., England, 1987, too Find. The rules on biochemical methods can be found in relevant instructions.

example 1

Eine 6 Tage alte Vorkultur von Lycopersicon escuientum in modifiziertem MS-Medium wird im Verhältnis 1:10 in neues Medium übertragen. Den Kulturen wird steril filtriertes KultUrfiltrat, das ΙΟμρΛηΙ Coronatin enthalt, zugesetzt. Auf Rundschütteltischen vom Typ Fanal werden diese Kulturen bei 28⁰C inkubiert und im Verlaufe der Kultur werden aus Wachstum, der Proteingehalt der Zellen, der Gehalt an freien Aminosäuren und die Aktivität von Oxidoreduktasen mit Hilfe der TTC-Metnode bestimmt. Die in der Tabelle 1 angegebenen Werte konnten beobachtet werden.A 6 day old preculture of Lycopersicon escuientum in modified MS medium is transferred 1:10 into new medium. Sterile filtered culture filtrate containing ΙΟμρΛηΙ coronatin is added to the cultures. In Rundschütteltischen type Fanal these cultures are incubated at 28 ⁰ C and in the course of the culture, the protein content of the cells, the content of free amino acids and the activity of oxidoreductases by means of the TTC-Metnode be of growth is determined. The values given in Table 1 could be observed.

example According to the data of Example 1, the cell culture of Chenopodium album with coronatlnhaltigem culture filtrate

behandelt. Tabelle 2 enthält die Ergebnisse.treated. Table 2 contains the results.

Table 1 Influence on the culture of Lycopersion peruvianum by coronatin. (Indicate in% of the untreated control)

ml Kulturfiltrat pro 135 ml Medium/ Verdünnung des Kultu rfiltratsml of culture filtrate per 135 ml of medium / dilution of the culture filtrate Alter (Std)Age (hrs) Wachs tumGrowth Protein gehaltProtein content Amino säure gehaltAmino acid content Oxidore duktaseOxidore ductase 10/1:5010/1: 50 48 72 12048 72 120 115 95 29115 95 29 70 68 12570 68 125 IO IO CO co co cnIO IO CO co cn cn 35 2T 5535 2T 55 10/1:10010/1: 100 48 12048 120 125 45125 45 10/1:50010/1: 500 48 12048 120 105 66105 66

Table 2 Influence of coronatin-containing culture filtrates on cell cultures of Chenopodium album. ΙΟμρΛηΙ Coronatin containing Culture filtrate was diluted 1:50. The values are given in% of the untreated control.

Alter der KulturAge of culture Wachstumgrowth Proteinprotein Aminosäureamino acid (Std.)(Hours.) gehaltsalary gehaltsalary 7272 9898 7070 6060 9696 7878 6464 6868 168168 6060 7373 8585 264264 9898 7878 112112

Claims

1. A method for determining the biological activity of coronatin, derivatives of coronatin or coronatin-like compounds, characterized in that in plant cell cultures the Wach * * and / or selected metabolic parameters and their degree of influence by the examined microwave culture filtrates, solutions and / or enriched or pure substances whose biological activity is to be determined, and that by using low concentrations of the substances to be investigated, a selection of resistant plant cells takes place.

2. The method according to claim 1, characterized in that cell cultures of Lycopersicon peruvianum, Chenopodium album and / or Phaseolus coccineus cv. "Red Kidney" can be used.

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the cell cultures are cultured in media with C sources, N sources, mineral salts, trace elements, small amounts of other organic substances and with additions of phyto-effective substances, the cultivation both omers as a callus culture, submersed as a suspension culture as well as a protoplast culture is possible.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the influencing of the cell cultures by determining the growth, the content of proteins, nucleic acids, amino acids, reducing, oxidizing substances or other metabolites, by the determination of regulatory important or other enzyme activities and / or carried out by a Hemmhoftest.

5. The method according to claim 4, characterized in that this influence of the life processes is determined after 1 to 5 days.

6. The method according to claim 5, characterized in that this determination is carried out 24 to 72 hours after addition of the sample to be examined.

7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that the addition of the samples to be tested is 0-24 hours after the seeding and that the samples are sterile filtered or autoclaved prior to addition.

8. Process according to claims 1 to 7, characterized in that the cultivation of the cell cultures takes place at temperatures of 20-30 ⁰ C and in the suspension or protoplast cultures with shaking.

9. The method according to claim 8, characterized in that the cultivation is carried out at 25-29 ⁰ C.

10. The method according to claims 1 to 9, characterized in that are used as precultures for testing 4-12 days old cell cultures.

11. The method according to claim 10, characterized in that are used as precultures for testing 5-8 days old cell cultures.