CZ300141B6 - Antiangiogenní peptidy, polynukleotidy je kódující a zpusoby inhibice angiogeneze - Google Patents

Abstract

Rešení popisuje savcí fragmenty smycky 5 a fúzní proteiny smycky 5 jako látky vhodné pro lécbu angiogenních onemocnení. Také se popisují zpusoby a kompozice vhodné pro inhibici angiogenního onemocnení.

Description

Antiangiogenní peptidy, polynnkleotidv je kódující a způsoby inhibiee angiogeneze

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti chemie peptidů. Vynález zvláště popisuje přípravu a použití peptidů. které obsahují aminokyselinové sekvence v podstatě podobné sekvencím odpovídajícím oblasti smyčky 5 savčího plazminogenu, dále se popisují farmaceutické kompozice, které obsahuji peptidy. protilátky specifické pro receptor angiostatinu. způsoby detekce a měření angiostalinu. in cytotoxická činidla spojená s proteiny angiostatinu a léčba onemocnění, které způsobuje nebo zesiluje angiogeneze.

Dosavadní stav tec láníky 15

Angiogeneze je proces tvoření nových krevních cév. Tento proces je nezbytný pro normální tělní aktivity, jako je reprodukce, vývoj a hojení ran. Ačkoli tento proces není zcela objasněn, věří se, žc zahrnuje vzájemné působení molekul, kterc regulují růst endoteliálních buněk (primární buňky krevních kapilár). Za normálních podmínek tyto molekuly udržují po dlouhou dobu tnikrovasku20 larizaci ve stádiu klidu (to znamená netvoří se další kapiláry), což může trvat týdny nebo ve stejných případech dekády. Když je to nezbytné (např. během hojení ran), tyto sc buňky začnou rychle množit, přičemž tato změna proběhne během 5 dnů (Folkman, J. a Sh ing, Y„ The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 10931-10934. a Folkman, J. and Klagsbrun. M., Science, 235,442-447(1987).

Ačkoli angiogeneze je za normálních podmínek vysoce regulovaný proces, řada onemocnění (které jsou charakterizovány jako angiogenní onemocnění) se řídí trvalou neregulovanou angiogenezí. Jinak řečeno neregulovaná angiogeneze může buď způsobit určité onemocnění přímo nebo zhoršit existující patologické podmínky. Například oční neovaskularizace se uvádí, jako so jeden / nej běžnějších důvodů slepoty a dominuje přibližně při 20 onemocnění očí. Při určitých onemocněních, jako je artritida, se v kloubech tvoří nové krevní kapiláry, jenž poškozují chrupavku. Při cukrovce se nové kapiláry tvoří v sítnici, prorůstají do sklivce. krvácejí a způsobují slepotu. Růst a metastázy pevných nádorů také závisí na ángiogenezi (Folkman, J., Cancer research, 46. 467-473 (1986), Folkman. J., Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6 (1989). Ukázalo se například, že nádory, které dosahují velikosti větší než 2 mm, musí mít svůj vlastní přívod krve a proto indukují růst nových krevních kapilár. Jestliže tyto nové krevní cévy jednou v nádoru vzniknou, je to způsob jak nádorové buňky vstupují do krevního systému a metastazují vc vzdálených místech, jako jsou játra, plíce nebo kosti (Weidner.N.. et al., The New England Journal of Medici ne, 324 (1): 1-8 (1991)).

ío

Do dnešní doby se popsalo a charakterizovalo několik přirozeně se vyskytujících angiogenních faktoru (Fidler. J.I. and Ellis, L. M„ Cell, 79: 185-189 (1994)). 0'Reilly a kol, izoloval a purifikoval ze séra a moče myší, které nesou nádor, protein o molekulové hmotnosti 38 kDa, jenž inhibuje proliferaci endoteliálních buněk (0'Reilly, M., et al., Cell, 79: 315-328 (1994) a meziná4? rodní přihláška WO 95/29 242, zveřejněná 2. listopadu 1995). Mikrosekvenční analýza uvedeného endoteliálního inhibitoru vykazuje 98% sekvenční homologii s interním fragmentem myšího plazminogenu. Angiostatin, jak se pojmenoval myší inhibiční fragment, je peptid, který zahrnuje první čtyři smyčkové oblasti myšího plazminogenu. Fragment peptidu ze stejné oblasti lidského plazminogenu (to znamená, žc obsahuje smyčky 1 až 4), také silně inhibuje proliferaci endote50 liálních buněk kapilár in vitro a in vivo. Neporušený plaztninogen. ze kterého se uvedený peptidový fragment získal, nevykazuje tak silný inhibiční účinek.

V současné době se vyvíjí několik inhibitorů angiogeneze za účelem použití při léčbě angiogenních onemocnění (Gasparini, G. and Harrís. A. T„ J, Clin. OncoL 13 (3): 765-782, (1995)), ale jsou zde nevýhody související s těmito sloučeninami. Suramin je například silný inhibitor angio- 1 Q7. 300141 Bó geneze, ale způsobuje u lidí silnou systémovou toxicitu, když se aplikuje v dávkách, které jsou nutné při proti nádorové aktivitě. I.átky jako jsou retinoidy, intcrferony a antiestrogeny jsou pro lidi bezpečné, ale mají slabé angiogenní účinky. Příprava jiných látek je stále obtížná nebo drahá.

? Proto je nutné získat látky pro léčbu angiogenních onemocnění u savců. Přesněji je nutné získat inhibitory' angíogeneze, které jsou bezpečné při léčebném použití a které vykazují selektivní toxicitu s ohledem na patologické podmínky, jakoje selektivní inhibice proliferace endoteliálních buněk, zatímco nevykazují žádný stupeň toxicity nebo nízkou toxicitu k normálním buňkám (to znamená k nekarcinogenním buňkám). Příprava takových látek by měla být jednoduchá a laciná.

Podstata vynálezu

Ve svém základním provedení vynález popisuje sloučeninu obsahující peptid smyčky 5. která je reprezentována strukturním vzorcem A-B C X-Y (I) nebo její farmaceuticky přijatelnou soli, esterem nebo proléčivem. kde symbol A není přítomen nebo jde o skupinu chránící dusík: symbol Y není přítomen nebo jde o skupinu chráníc i karboxylovou kyselinu; symbol B není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 197 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvencí z pozice aminokyseliny 334 do pozice 530 SEQ ÍD NO: 1: C je zo R¹ - R~- R- R⁴, kde R¹ je lysylová skupina; R je leucylová skupina nebo arginylová skupina; R’jc ly rosy lová skupina, 3-1 tyrosylová skupina nebo fenylalanylová skupina; R¹ je aspartylová skupina; a symbol X není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 12 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, kterc odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 535 až do přibližně pozice aminokyseliny 546 SEQ ID NO: I a jejích homologíi a analogů,

Vynález také popisuje sloučeninu obsahující peptid smyčky 5 reprezentovanou strukturním vzorcem A-B,-C|- X|-Y (II) nebo její farmaceuticky přijatelnou solí, esterem nebo proléčivem, kde symbol A není přítomen nebo jde o skupinu cliránicí dusík; symbol Y není přítomen nebo jde o skupinu chránící karboxylovou kyselinu; symbol B i není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibit) ližně 176 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 334 do pozice 513 SEQ ID NO: 1; symbol Ci je sekvence od pozice aminokyseliny 514 do pozice aminokyseliny 523 SEQ ID NO: 1; a symbol X[ není přítomen nebo jde o jeden ze 1 až přibližně 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci z pozice aminokyseliny 524 až do přibližně pozice aminokyseliny 533 SEQ ID NO: 1 a .is jejích homo logů a analogů.

Vynález také zahrnuje způsob léčení pacienta, jenž potřebuje anti angiogenní léčbu, který zahrnuje aplikaci sloučeniny obsahující fragment peptidu smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5,

Vynález také zahrnuje kompozici pro léčbu pacienta, který potřebuje antiangiogenní léčbu. Tato kompozice zahrnuje sloučeninu obsahující peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5, receptorové agonisty a antagonisty smyčky 5 a antagonisty smyčky 5 spojené s cytotoxickým i činidly, buď samotnými nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem a/nebo s postupně uvolňovanými sloučeninami za vzniku terapeutické kompozice.

Vynález dále popisuje kompozici pro léčbu onemocnění vybraných ze skupiny zahrnující rakovinu, artritidu, masku lámí degeneraci a diabetickou retinopatii, přičemž tato kompozice zahrnuje sloučeninu obsahující peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5.

5(i Vynález také zahrnuje kompozici obsahující izolovanou jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou polynukleotidovou sekvenci, která kóduje peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5. l akovým polynukleotidem je výhodně molekula DNA. Vynález také zahrnuje vektor obsahující sekvenci DNA kódující peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5, kde vektor je schopný exprimovat peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5. je-li přítomen v buňce, přičemž buňka obsahuje kompozici, jenž začleňuje vektor, který obsahuje sekvenci DNA kódují cí peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5. Vynález dále zdůrazňuje způsoby genové terapie, přičemž se do pacienta zavede sekvence DNA kódující peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 nebo konjugát peptidového fragmentu smyčky 5 za účelem in vivo modulace hladin smyčky 5.

Vynález také zahrnuje způsob přípravy peptidového fragmentu smyčky 5 zahrnující kroky: (a) vystavení savčího plazminogenu lidské nebo prasečí elastáze v poměru přibližně 1 : 100 až přibližně 1 : 300 za vzniku směsi uvedeného plazminogenu a uvedené elastázy: (b) inkubace uvedené směsi a (e) izolace peptidového fragmentu smyčky 5 z uvedené směsi.

io

Vynález také zahrnuje způsob přípravy peptidového fragmentu smyčky 5 obsahující kroky: (a) vystavení savčího plazminogenu lidské nebo prasečí elastáze v poměru elastáza : plazminogen přibližně l : 100 až přibližně l ; 300 za vzniku směsi uvedeného plazminogenu a uvedené elastázy; (b) inkubace uvedené směsi a (c) izolace proteinového konjugátu peptidového frag15 mentu smyčky 5 z uvedené směsi; (d) vystavení uvedeného proteinového konjugátu peptidového fragmentu smyčky 5 pepsínu v poměru přibližně 1 : 0.2 za vzniku směsi uvedeného pepsinu a uvedeného plazminogenu a (d) izolace uvedeného peptidového fragmentu smyčky 5 ze směsi. V jiném případě peptidový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 se může připravit způsobem. který obsahuje kroky: (a) izolace póly nukleotidu, který' kóduje uvedený peptidový frag20 ment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5; (b) klonování polynukleotidu do expresívního vektoru; (c) transformace vektoru do vhodné hostitelské buňky; a kultivace hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresi rozpustného peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. č. 1 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci lidského plazminogenu (SEQ ID NO: 1).

Obr. č. 2 zobrazuje komparativní homologii aminokyselinových sekvencí lidské (SEQ ID su NO: 34). myší (SEQ ID NO: 35). makak rhesus (SEQ ID NO: 36), hovězí (SEQ ID

NO:37) a prasečí (SEQ ID NO: 38) smyčky 5.

Obr. č. 3 zobrazuje sekvenci DNA (SEQ ID NO: 12) lidského plazminogenu.

Obr. č. 4 zobrazuje graf anti—proliterační aktivity jedné dávky různých fragmentů smyčky na bovinní kapilární endoteliální buňky (BCE), které se testovaly in vitro v testu pro3> liferace buněk.

Obr. č. 5 zobrazuje mapu expresívního vektoru pHil-D8, která obsahuje vedoucí sekvenci pro sekreci rekombinantního proteinu.

Obr. č. 6 zobrazuje fotografii z SDS-PAGE gelu obarveného ..Cooniassie Blue“ supematantu (do jedné dráhy se naneslo 10 pl) kultury Pichia pastoris exprimující peptidový

4d fragment nebo fúzní protein smyčky 5. Dráhy 1,6 a 10 obsahují negativní kontroly, dráhy 2, 3 a 4 obsahují tři odlišné klony exprimující K5A; dráha 5 obsahuje klon exprimující K5F: dráhy 7 a 8 obsahují klony exprimující K4-5A; dráha 9 obsahuje klon exprimující K.4-5F. Šipky indikují pruhy proteinů K5A (přibližná molekulová hmotnost je 11 000) a K4-5F (přibližná molekulová hmotnost je 20 000). Markéry

4? molekulových hmotností jsou naneseny v drahách, které předcházejí drahám I a 10.

Obr. č. 7 zobrazuje naskenovaný SDS-PAGE gel odbarvený „Coomassie Blue“ kmenů E. coli exprimujících peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5. Není-li jinak uvedeno každá dráha obsahuje 10 pl kultury, která je ekvivalentní hodnotě 10 absorbance při vlnové délce 600 nm. Dráha 1 obsahuje markéry nízkých molekulových hmotností. Dráha 2 obsahuje celkovou kulturu K5A/pET32a; dráha 3 obsahuje celkovou kulturu K5A/pET32a (nanesla se 1/10 množství, které je obsaženo v dráze 2); dráha 4 obsahuje rozpustnou frakci K5A/pET32a; dráha 5 obsahuje nerozpustnou frakci K5A/pET32a; dráha ó obsahuje celkovou kulturu K4-5A/pET32a; dráha 7

- j CZ 300141 B6 obsahuje celkovou kulturu K4-5A/pET32a (nanesla se 1/10 množství, které je obsaženo v dráze 6); dráha 8 obsahuje rozpustnou frakci K4-5A/pET32a: dráha 9 obsahuje nerozpustnou frakci K4-5A/pET32a: dráha 10 obsahuje celou kulturu K45A/pGEX»2: dráha 11 obsahuje rozpustnou frakci Κ4-5Λρ6Ε\-ΤΓ-2: dráha

12 obsahuje nerozpustnou frakci K4-5A/pGEX»2: dráha 13 standard smyčky 5;

dráha 14 obsahuje markéry vysokých molekulových hmotností.

Detailní popis vynálezu lil

Termín „smyčka 5” (K5) znamená oblast savčího plazminogenu. která má tři disulfídové můstky, které se podílejí na specifické trojrozměrnou konformaci definované oblastí smyčky 5 molekuly savčího plazminogenu. Jeden takový disulfidový můstek se váže na cysteinové zbytky, kterc se nacházejí v pozicích aminokyselin 462 a 541, druhý můstek se váže na cysteinové zbytky umísíš těné v pozicích aminokyselin 483 a 524 a třetí se váže na cysteinové zbytky umístěné v pozicích aminokyselin 512 a 536. Na obr. č. 1 (SEQ ID NO: 1) je zobrazena aminokyselinová sekvence celé molekuly savčího plazminogenu (molekula lidského plazminogenu).

Termín „fragment peptidů smyčky 5“ znamená peptid mezi aminokyselinami 4 a 104 (včetně) s zo podstatnou sekvenční homologii s odpovídajícím peptidovým fragmentem savčího plazminogenu, jehož α-N-koncc se nachází přibližně v aminokyselinové poloze 443 intaktního savčího plazminogenu a α-C-konec jc přibližně v poloze 546, Celková délka peptidového fragmentu smyčky 5 může být různá v závislosti na způsobu, kterým se peptid smyčky 5 získal nebo se může lišit sekvencí v závislosti na species, ze kterých se získal. Jisté formy peptidových frag25 mentu smyčky 5 se mohou produkovat proteolytickým štěpením glu-plazminogenu, lys-plazminogenu nebo miniplazminogenu za použití enzymů lidské nebo prasečí elastázy. Když se připravují uvedeným způsobem, a--C--konec peptidových zbytků se nachází okolo aminokyseliny 543 SEQ ID NO: I, ale u-N-konec aminokyseliny muže začínat v pozici aminokyseliny 443, 449 nebo 454. Fragment peptidů smyčky 5, jestliže je výsledek štěpení glu-plazminogenu, lys-plazminogenu nebo miniplazminogenu lidskou nebo prasečí elastázou. může mít celkovou délku 101. 95 nebo 90 aminokyselin. Souhrn těchto fragmentů peptidů smyčky 5 je uveden v tabulce ě. 1. Když se postupuje shora uvedeným způsobem, získá se směs těchto tří fragmentů, kde přibližně 60 % fragmentů má délku 95 aminokyselin, přibližně 35 % fragmentů má délku 101 aminokyselin a přibližně 5 % fragmentů má délku 90 aminokyselin. Je-li to nutné tyto různé fragmenty se mohou dále čistit na HPLC s reverzní fází, což je metoda dobře známá v oboru. Nehledě na tyto odlišnosti v délce, peptidový fragment K5 podle vynálezu zahrnuje buď sekvenci Lys-Eeu-Tyr Asp (to znamená z pozice aminokyseliny 531 až do pozice aminokyseliny 534 sekvence SEQ ID NO: 1) nebo Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly Gly-Pro-Trp (to znamená z pozice aminokyseliny 514 až do pozice aminokyseliny 523 sekvence SEQ ID NO: 1) nebo jeho analogy.

io lermín „fúzní protein smyčky 5“ znamená polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci získanou ze dvou nebo více jednotlivých proteinů, přičemž jeden z nich je peptidový fragment K5. Fúzní protein se tvoří expresí polynukleotidu Jehož kódující sekvence fragmentu peptidů smyčky 5 je spojena s kódující sekvencí jednoho dalšího polypeptidu tak, že v rámci jsou dva (nebo více) čtecích rámců. Preferují se ty fúzní proteiny smyčky 5, kde fragment peptidů smyčky 5 se fúzoval s odpovídající sekvencí lidského plazminogenu, jako je smyčka 4 (K4), smyčky 3 až 4 (K3-4), smyčky 2 až 4 (K2>) a smyčky 1 až 4 (KI L). Preferovaný fúzní protein K5 je tvořen smyčkami 4 až 5 (K4-5). Jiné příklady fúzních proteinů smyčky 5 podle vynálezu zahrnují peptidový fragment K5 nebo K4-5 připojený k biologické značce („tag“). lakové fúzní proteiny mohou nebo nemusí být štěpíte íné na jednotlivé proteiny, z kterých se získaly.

Termín „konjugát peptidového fragmentu K5^Lt znamená fragment peptidů smyčky 5, který je chemicky spojen s jiným proteinem za vzniku konjugátu. Příklady konjugátu peptidových fragmentů smyčky 5 zahrnují peptidový fragment smyčky 5 spojený s albuminem nebo s peptidovým

-4 C7. 300141 B6 fragmentem z jiné oblasti smyčky savčího plazminogenu. Molekulové hmotnosti konjugátů peptidových fragmentů smyčky 5 jsou v rozsahu přibližně od 1000 a 25 000.

Termín ..podstatná sekvenční homologie” znamená přibližně 60% shodnost aminokyselin, prefe5 ruje se alespoň přibližně 70% shodnost aminokyselin, více se preferuje přibližně 80% shodnost aminokyselin, nejvíce se preferuje přibližně 95% shodnost aminokyselin odpovídající peptidové sekvence lidského plazminogenu. Sekvence, které vykazují podstatnou sekvenční homologií $ lidským plazminogenem, jsou označovány jako ..homologií”. Vedle podstatné sekvenční homologie vykazují homology podle vynálezu podobnou biologickou aktivitu (to znamená anti-angioio genní aktivitu) jako zde popsané fragmenty peptidu K5. Protože aminokyselinové sekvence nebo počet aminokyselin v peptidovém fragmentu smyčky 5 se může lišit v závislosti na species nebo v závislosti na metodě, klerá se použila při produkci, je obtížné stanovit přesné celkové množství aminokyselin v peptidovém fragmentu smyčky 5. Je-li dáno. že tyto sekvence jsou svými aminokyselinami identické ze 73 %. rozumí se. že aminokyselinová sekvence peptidového fragmentu smyčky 5 je v podstatě mezi species podobná a že způsoby produkce peptidových fragmentů smyčky 5 poskytují peptidovc fragmenty smyčky 5 s podstatnou sekvenční homologií k odpovídajícím aminokyselinovým sekvencím lidského plazminogenu. Obr. č. 2 zobrazuje srovnání aminokyselinové sekvence peptidového fragmentu lidské smyčky 5, která má 95 aminokyselin (SEQ ID NO: 34) se sekvencemi fragmentů smyčky 5 pocházející z plazminogenu myší (SEQ ID

2o NO: 35). makak rhesus (SEQ ID NO: 36). hovězího dobytka (SEQ ID NO: 37) a prasete (SEQ ID NO: 38).

Vynález dále uvádí sekvence aminokyselinových zbytků, které jsou analogy zde uvedených sekvencí tak. že tyto sekvence (analogy) vykazují podobnou biologickou aktivitu peptidových frag25 mentu smyčky 5 a jejich fúzních proteinů. Je dobře známo, že k modifikacím a změnám může dojít, aniž se podstatně změní biologické funkce takového peptidu. Při takových změnách se mohou provést substituce podobných aminokyselinových zbytku na základě relativní podobnosti substituentů vedlejšího řetězce, např. jejich velikost, náboj, hydrofobicita, hydroťílicita a podobně. Popsané změny se mohou provést zvýšením potence peptidu nebo jeho stability vzhledem k mi působení enzymů nebo farrnakokinetíky. Uvažované sekvence podle vynálezu zahrnují ty analogové sekvence charakterizované změnou sekvence aminokyselinových zbytků nebo typ, kde změna nemění základní podstatu a biologickou aktivitu dříve zmíněných peptidových fragmentů

K5 a/nebo fúzních proteinů.

Peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 podle vynálezu se může charakterizovat na základě potence, kdy se testovala jeho schopnost inhibovat růst bovinntch kapilárních buněk (BCE) in vitro. Data v tabulce ě. 1 a na obr. ě. 4 ukazují, že peptidový fragment K5 má sekvenci od pozice aminokyseliny 443 do pozice aminokyseliny 543 SEQ ID NO: 1, což ukazuje na přibližné 300 násobné zvýšení aktivity (to znamená aktivity při inhibici proliferace buněk BCE) ve srovnání s

4o peptidovým fragmentem smyčky 5, který má sekvenci od pozice aminokyseliny 443 do pozice aminokyseliny 546 sekvence SEQ ID NO: 1 a přibližně 800 násobné zvýšení aktivity ve srovnání s peptidovými fragmenty 1 až 4.

Termín „izolovaný” znamená, že se materiál odstranil ze svého původního prostředí (např. jestli4? že jde o přirozené se vyskytující materiál odstraňovaný z přirozeného prostředí). Například přirozené se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přítomný v živých organizmech není izolován, aleje izolován stejný polynukleotid nebo DNA nebo polypeptid, který se separoval z některého nebo ze všech koexistujících materiálů v přirozeném systému. Takový polynukleotid může být součástí vektoru a/nebo takový polynukleotid nebo polypeptid může být součástí kompozice a stále se může izolovat, i když vektor nebo kompozice není částí jeho přirozeného prostředí.

Termín „primer“ znamená specifickou oligonukleotidovou sekvenci komplementární s cílovou nukleotidovou sekvencí a slouží jako počáteční bod polymerizace nukleotidů, která je katalyzována buď DNA polymerázou, RNA polymerázou, nebo reverzní transkriptázou.

- S CZ 300141 Bó

Termín ..sonda znamená definovanou část nukleové kyseliny (nebo část analogu nukleové kyseliny. tj. PNA), které' se může použít k identifikaci specifické DNA přítomné vc vzorcích, klcré nesou komplementární sekvenci.

Termín „rekombinantní polypeptid znamená alespoň polypeptid, který svým původem nebo manipulací není spojen s celým nebo s částí polypeptidu. se který m je v přírodě spojován a/nebo je spojen jiným polypeptidem, než je ten, se kterým je spojován v přírodě. Není nezbytné, aby rekombinantní nebo odvozené polypeptid byl translatován z určené sekvence nukleové kyseliny. Toho lze také dosáhnout libovolným způsobem, který' zahrnuje chemickou syntézu nebo expresi io rekombinantního expresívního systému.

Termín „syntetický peptid se zde užívá ve smyslu polymerní formy aminokyselin v libovolné délce, která může být syntetizovaná chemicky způsoby, které jsou dobře známy v oboru. Tyto syntetické peptidy se mohou použít při různých aplikacích.

„Č ištěný polynukleotid znamená polynukleotid nebo jeho fragment, který je v podstatě volný, to znamená, že obsahuje méně než 50 %, s výhodou méně než asi 70 % a upřednostňuje se méně než asi 90% proteinu, se kterým je polynukleotid přirozeně spojován. Způsoby čištění požadovaných polynukleotidu jsou dobře známy v oboru a zahrnují například distribuci buněk obsahují2o cích polynukleotid s chaotropním činidlem a separaci polynukleotidu(ů) a proteinů ionexovou chromatografií, afinitní chromatografií a sedimentací podle hustoty. Termín „čištěný polypeptid pak znamená polypeptid nebo jeho fragment, který je v podstatě volný, což znamená, že obsahu je méně než asi 50 %, s výhodou méně než asi 70 % a upřednostňuje se méně než asi 90 % buněčných složek, se kterými je požadovaný polynukleotid přirozeně spojován. Způsoby čištěni jsou v oboru dobře známy.

Termín „polypeptid“ znamená molekulový řetězec aminokyselin, přičemž neříká nic o specifické délce produktu. Tudíž do definice peptidů spadají peptidy. oligopeptidy a proteiny. Tento termín sc také vztahuje na post-expresívní modifikace polypeptidu, například glykosylace. acety láce, so fosfory lace a podobné.

Termín „rekombinantní hostitelské buňky, „hostitelské buňky, „buňky, „buněčné linie. „buněčné kultury a jiné takové termíny označující mikroorganizmy nebo buněčné linie vyšších eukaryontů kultivované jako uniccfulární entyty, které znamenají buňky, jenž mohou být nebo mohou mít nebo se mohou používat jako recipienty rekombinantního vektoru nebo jiné transferované DNA a zahrnují původní progen původní buňky, která se transfektovala.

Termín „replikou znamená libovolný genetický element, jako jc plazmid. chromozom nebo virus, který se v buňce chová jako autonomní jednotka replikace polynukleotidu.

Termín „vektor je replikou, vc kterém se připojí jiný polynuklcotidový segment tak, aby došlo k replikaci a/nebo expresi připojeného segmentu.

Termín „řídicí sekvence pak zahrnuje polynukleotidové sekvence, které jsou nezbytné k ovliv45 není exprese kódujících sekvencí, do kterých jsou ligovány. Podstata takových řídicích sekvencí se liší v závislosti na hostitelském organizmu. IJ prokaryontů takové řídicí sekvence obecně zahrnují promotor, ribozomální vazebné místo a terminátory ; u eukaryontů takové kontrolní sekvence obecně zahrnují promotory, terminátory a v některých případech zesilovače. Termín „řídicí sekvence tedy zahrnuje minimálně všechny komponenty, jejichž přítomnost je nezbytná při expresi a může také zahrnovat další komponenty, jejichž přítomnost jc výhodná například vedoucí sekvence.

Termín „operabilitě spojená popisuje situaci, kde popsané komponenty jsou ve vztahu, který jim umožňuje fungoval zamýšleným způsobem. Tak například kontrolní sekvence „operabilitě spoje-ň CZ 300141 B6 ná s kódující sekvencí se ligovala tak, že exprese kódující sekvence je dosažena za podmínek kompatibilních s řídicími sekvencemi.

Termín „otevřeny čtecí rámec nebo „ORF” znamená oblast polynukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid; tato oblast může reprezentovat část kódující sekvence nebo celou kódující sekvenci.

Termín „kódující sekvence¹'je polynukleotidová sekvence, která se, je-li řízena vhodnou regulační sekvencí, přepisuje na mRNA a překládá se do polypeptidu. Hranice kódující sekvence jsou určeny kodonem počátku translace na 5-konci a translačním stop kodonem na 3'-konci. Kódující sekvence může zahrnovat, ale není to nikterak limitováno. mRNA, cDNA a rekombinantní polynukleotidové sekvence.

Termín „transformace znamená začlenění exogenního polynukleotidu do hostitelské buňky bez ohledu na způsob začlenění inzertu. Transformace může být provedena přímým pohlcením, transd u ke i nebo f-spojením. Exogenní polv nukleotid se může udržet jako ne integrovaný vektor, například plazmid, nebo v jiném případě se muže integrovat do hostitelského genomu.

Termín „čištěný produkt“ znamená přípravu produktu, který se separoval od buněčných konsti2íi tuentů. se kterými je produkt normálně spojen a od jiných typů buněk, jenž se mohou vyskytovat ve vzorku.

Všechny peptidové sekvence jsou popsány podle obecně přijaté úmluvy, přičemž na levé straně je aminokyselinový zbytek α-N-koncc a na pravé straně je aminokyselinový zbytek a-C-konce.

Termín „a-N-konee znamená volnou alfa-aminoskupinu aminokyseliny v peptidu a termín ..aC-konec znamená konec volné alfa karboxylové kyseliny aminokyseliny peptidu.

l ermín „N-chránici skupina“ znamená ty skupiny, které chrání α-N-terminální aminokyselinu nebo peptid nebo jiný způsob ochrany aminoskupiny aminokyseliny peptidu před nežádoucími reakcemi bčhem syntetických postupů. Běžně používané N-ehránieí skupiny jsou uvedeny v publikaci Greene. „Protective Groups In Organic Synthesi“ (John Wiley and Sons, New York (1981), což je zde uvedeno jako odkaz.

Chránící skupiny se mohou navíc použit jako proléčiva, které se snadno štěpí in vivo například enzymatickou hydrolýzou. přičemž se uvolňuje biologicky aktivní mateřská sloučenina. N-chránící skupiny obsahují nižší alkanoylové skupiny, jako je formyI, acetyl („Ac), propionyl, pivaloyl, t—butyl acetyl a podobně: jiné acyiové skupiny zahrnují 2 ehloracetyl, 2-bromacetyl. trifluoraeetyl. triehloracetyl, ftalyl, o-nitrofenoxyacetyl, α-chlorbutyryl, benzoy l, 4-chlor-benzoyl. 4-brombenzoyl. 4-nitrobenzoyl a podobně: sulťonylové skupiny, jako je benzensulfonyl. p•in toluensulfonyl a podobně: skupiny tvořící karbamát, jako je benzyloxykarbonyl. p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-metoxy benzy Ikarbonyl. p-n i tro-benzy loxy karbonyl. 2-nitrobenzy loxykarbony I, p brombenzyloxykarbonyl. 3,4-di-metoxybenzyloxykarbonyI. 3,5-dimeto\ybenzylo\ykarbonyk 2,4-dimetoxybenzyloxykarbonyl, 4-dimetoxybenzy loxy karbonyl, 2--nitro—4,5-dimetoxybenzyloxykarbonyl. 3,4.5-trimetoxybenzy loxykarbony l. 1-{p-bifenylyl)-l-metyletoxykarbonyl, α.α· dimetyl-3,5 dimetoxybenzyloxykarbonyl, benzhydry loxykarbony I, t-buty loxykarbony I, diizopropylmetoxykarbonyl, isopropyloxy karbonyl, etoxykarbonyl, metoxykarbonyl. allyloxykarbonyl, 2,2.2 trichloretoxykarbonyl, fcnoxykarbonyl, 4-nitrofenoxykarbonyl. fluorenyl 9 metoxykarbonyl, cyklopentyl oxykarbonyl, adaman ty loxykarbony I. cyklohexyl oxy karbonyl, fenylthiokarbonyl a podobně; arylalkylové skupiny jako je benzyl. trifenylmetyl, benzyloxymetyl, 950 fluorenylmclyloxykarbonyl (Fmoc) a podobně a silylové skupiny, jako je trimetylsilvl a podobně, Preferovanými N-chránicími skupinami jsou formyI, acetyl, benzoyl, pivaloyl, ΐ-butylacetyl. Ienylsulfony I, benzyl. t-buty loxykarbony I (Boc) a benzoyl oxykarbonyl (Cbz). Lysin může být například chráněn na u-N-konci skupinou, která je labilní v kyselém prostředí (např. Boc) a na ε-N-konci skupinou, která je labilní v zásaditém prostředí (např. Fmoc). pak se mohou tyto chrá55 ničí skupiny odstranit selektivně během syntézy.

- 7 CZ 300141 B6

Termín „karboxy-ehránicí skupina znamená esterovou nebo amidovou skupinu chránící karboxyl o vou kyselinu. Tyto uvedené skupiny blokují nebo chrání funkčnost karboxylové kyseliny, zatímco se do reakce zapojují jiná funkční místa sloučeniny. Karboxy-ehránicí skupiny jsou uve5 děny v publikaci Greene, „Protective Groups In Organic Synthesi 152-186 (1981). Skupiny chránící karboxylovou skupinu se mohou navíc použít jako proléčiva. která se snadno štěpí in vivo například enzymatickou hydrolýzou za uvolnění biologicky aktivní mateřské sloučeniny . Takové karboxy-ehránicí skupiny jsou dobře známy v oboru, používají se ve velkém rozsahu při ochraně karboxylových skupin u penicilinu a cefalosporinu, jak se popisuje v publikacích patent io US 3 840 556 a US 3 719 667, popis je zde uvedeno jako odkaz. Reprezentativní karboxy-chránicí skupiny jsou Cj-G nižší alkyl (např. metyl, etyl nebo t-butyl a podobně); arylalkyl, jako je fenetyl nebo benzyl ajejich substituované deriváty, jako je alkoxy benzy lové nebo nitrobenzylové skupiny; ary lalkenyt jako je fenyletenyl a podobně; aryi ajejich substituované deriváty, jako je 5-indanyl a podobně; dialkylaminoalkyl., jako je dimetylaminoetyl a podobně; alkanoyloxyalky15 love skupiny, jako je acetoxymelyl, butyry loxy metyl; valeryloxynietyl, isobutyry loxy metyl, isovaleryloxy metyl, l-(propionyloxyEl —ctyh l-<pivaloyloxyl)— I - etyl. I-metyl-1 ••(propionyloxyEl-ctyl. pivaloyloxymetyl, propionyloxymetyl a podobně; cykloalkanoyloxyalkylové skupiny. jako je cyklopropy Ikarbonyloxymetyl, cyklobutylkarbonyloxymetyl, cyklopentylkarbonyloxymetyl, evklohexylkarbonyloxymetyl a podobně; aroyloxyalkyl. jako je benzoyloxynietyl.

2o benzoyloxyetyl a podobné; arylalkylkarbonyloxyalkyl jako je benzyl karbony loxy metyl. 2-be lizy 1 karbony loxy etyl a podobně; alkoxykarbonylalkyl nebo cykloalkyloxykarbonylalkyl, jako je metoxy karbony lmetyl, cyklohexyloxykarbony lmetyl. I-metoxy karbonyl-1-etyl a podobně; alkoxy karbonyl oxy alkyl nebo cykloalky loxy karbony loxyalkyl, jako je metoxy karbony loxy metyl, t-buly loxy karbony loxy metyl 1 -etoxykarbonyloxy-f-etyl, 1-cyklohexyloxykarbony loxy-I etyl a podobné; aryloxykarbonyloxyalkyl, jako je 2-(fenoxykarbonyloxy)etyl. 2-(5-indanyloxykarbonyloxyjctyl a podobně; alkoxyalkylkarbonyloxyalkyl, jako je 2—(1 metoxy-2-metylpropan- 2-oyloxy)etyl a podobně; arylalkvloxykarbonyloxyalkyl, jako je 2-(benzyloxykarbonyIoxy)etyl a podobně; arylalkenyloxykarbonyloxyalkyl, jako je 2-(3-fenylpropen-2-yloxykarbonyloxyjethyl: alkoxykarbonylaminoalkyl. jako je t-b uty loxy karbony lam i nom etyl a podobně; so alkylaminokarbonylaminoalkyl, jako je metylaminokarbonylaminometyl a podobně: alkanoylaminoalkvl, jako je acetylaminometyl: hetcroevklieký karbonyloxyalkyl. jako je 4-metylpiperazinylkarbonyloxymetyl a podobné, dialkylaminokarbonylalkyl, jako je dimetylaminokarbonylmetyl. dietylaniinokarbonylmetyI a podobně; (5-(nižší alkylý-2-oxo-1,3 dioxolen-4-yl)alkyI, jako je (5 t-butyí-2-oxo-l,3-díoxolen—4—yljmetyl a podobně; a (5-fenyl-2-oxo-l.3-dioxolen55 4-yl)alkyl. jako je (5-fenyl-2-oxo-l .3-dioxolenG-yl)nietyl,

Reprezentativní amidové skupiny chránící karboxylovou skupinu jsou aminokarbonylové a nižší a 1 ky 1 am i nokarbony 1 o v é skup i ny.

Preferované sloučeniny s chráněnou karboxylovou skupinou podle vynálezu jsou sloučeniny, kde chráněná karboxylová skupina je nižší alkyl, cykloalkyl nebo arylalkyl ester. např. mety lester. ety lester, propy lester, isopropylester. butylester. sekundární butylester, isobutylester, amylester, i soa myl ester, okty lester, cyklohexyl ester, fenyl ety lester a podobně nebo alkanoyl oxy alkyl, cykloalkanoyloxyalkyl, aroyloxyalkyl nebo arylalkylkarbonyloxyalkylester. Preferované amidové skupiny chránící karboxylovou skupinu jsou nižší alkylaminokarbonylové skupiny. Například a(-konec kyseliny aspartové se může chránit skupinou, která je labilní v kyselém prostředí (tbutylová skupina), a β C-konec je chráněn skupinou, která je selektivně odstranitelná hydrogenací (např. benžylová skupina) během syntézy.

Termín „nižší alky lam i nokarbony I znamená skupinu -C(O)NI IR¹⁰, která chrání α-C -konec syntetického peptidového fragmentu smyčky 5. kde R¹⁰ je C_t až Cá alkyl.

Termín „aminokarbonyt“ znamená skupinu -C'(O)NH₂, která chrání α-C-koncc syntetického peptidového fragmentu smyčky 5.

-8CZ 300141 B6

Termín „protécivo znamená sloučeninu, která se rychle transformuje in vivo za vzniku mateřské sloučeniny, např. enzymatickou hydrolýzou v krví (T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel

Delívery Systems, Vol. 14 A.C.S. Symposium Series a Edward B. Roehe. ed.. Bioreversible

Carriers in Drug Design. American Pharmaceutical Association and Perganion Press, 1987).

Termín ..farmaceuticky přijatelné proléčivo znamená (1) ty proléčiva sloučenin podle vynálezu, které z hlediska medicíny mohou přijít do kontaktu s lidskou tkání a s tkání nižších zvířat, aniž mají. toxický, dráždivý, alergický účinek a podobné, vykazující vhodný poměr výhoda ku riziku ajejich použití je účinné a (2) tam, kde je to možné, zwiterionové formy mateřské sloučeniny.

io

Termín „aktivovaný esterový derivát znamená halogenidy kyselin, jako jsou chloridy kyselin a aktivované estery zahrnující, ale není to nikterak limitováno, anhydridy odvozené od kyseliny mravenčí a octové, anhydridy odvozené od alkoxykarbonilhalogenidů. jako je isobutyloxykarbonylehlorid a podobně, estery odvozené od N -hydroxysukcinimidu, estery odvozené od hydroxyb ftalimidu, estery odvozené od N-hydroxybenzotriazolu, estery odvozené od N-hydroxy-5norbornen-2.3-dikarboxamidu, estery odvozené od 2.4,5-trichIorfénolu.

Termín „antiangiogenní aktivita znamená schopnost molekuly inhibovat růst krevních cév.

Termín „inhibiční aktivita vůči endoteliálním buňkám znamená obecně schopnost molekuly inhibovat angiogenezí, což znamená např. inhibici růstu nebo migrace bovinních kapilárních endoteliálních buněk v kultuře v přítomnosti růstového faktoru fibroblastů nebo jiných známých růstových faktorů.

Termín „EDsJ je zkratka pro dávku peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5, která je účinná při inhibici růstu krevních cév nebo při inhibici růstu bovinních kapilárních endoteliálních buněk v kultuře v přítomnosti růstového faktoru fibroblastů nebo jiných známých růstových faktorů nebo inhibuje migraci endoteliálních buněk poloviční dávkou než jaká by byla potřebná pro růst nebo migraci v nepřítomnosti inhibitoru.

Ve většině případů se ve vynálezu používají jména přirozeně se vyskytujících aminokyselin nebo ami noacy lových zbytků ve shodě s pravidly IUPAC Commission on the N omene latu re of Organ ic Chemistry' a the IUPAC 1UB Commission on Biochcmieal N omene latu re. jak se uvádí v publikaci Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendetions, 1974), Biochemistry. 14 (2).

(1975). Termíny ..Ala, „Arg, „Asn, „Asp. „Cys, „Gin, „Glu, „Cíly”, „His, „Ile „Leu“, „Tys. „Mel, „Phe“, „Pro, „Ser, „Thr“. „Trp, „Tyr a „Val znamená aminokyseliny alanin, argínin, asparagin, kyselina aspartová. cystein, glutamin, kyselina glutamová. glycin. hislidin. isoleucin, leucin. lysin, metionin, fenylalanin, prolin, serin. trconin. Iryptofan. tyrosin a valin. a jejich odpovídající aminoacylové zbytky v pcptidech v jejich U-. D- nebo D. L- formách. V

4o případě uvedení nespecifické konfigurace bude odborníkovi jasné, že ct—uhlík aminokyselin a ami noacy lových zbytků v peptidcch popsaných v popisné částí a v patentových nárocích se vyskytuje v přirozené formě nebo v „L konfiguraci. Výjimku tvoří achirální molekula glycinu a libovolné aminokyseliny, které jsou achirální nebo označené jako „D-

Termín „3-1-Tyr znamená L-, D nebo D.Lty rosy lový zbytek, kde vodíkový radikál, který je v ortho poloze vůči hydroxy lu fenolu je nahrazen jodídovým radikálem. Jodidový radikál může být radioaktivní nebo neradioaktivní.

Vynález také popisuje aminokyselinové zbytky s vedlejšími řetězci, které se nevyskytují přirozc50 ně. jako je homofenylalanin, fenylglyein, norvalin, norlcucin, ornitin, tiazoylalanín (substituovaný v poloze 2, 4 a 5).

Rozumí se, že vynález zdůrazňuje libovolné deriváty peptidových fragmentů a fúzních p rotě inu smyčky 5, které mají antiangiogenní aktivitu a zahrnují celou třídu zde popsaných peptidových fragmentů a fúzních proteinů smyčky 5 a homology nebo analogy těchto fragmentů a proteinů.

-9CZ 300141 Bó

Navíc vynález nezávisí na způsobu produkce peptidového fragmentu nebo fúzního proteinu smyčky 5. to znamená (1) proteolytickým štěpením izolovaného savčího plazminogenu. (2) expresí rekombinantní molekuly, která má póly nukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci peptidového fragmentu nebo fúzního proteinu smyčky 5 a (3) syntézou na pevné fázi. Tyto způ5 soby produkce jsou dobře známy v oboru,

V jednom provedení vynálezu se popisují peptidy, které mají obecnou strukturu B-C-X, kde B je 88-mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴' a končící aminokyselinou Arg''' sekvence SEQ JD NO: i; C je 4-nicrový pepttd. kde R‘ a IC odpovídá předchozí definici, R je leucylová io skupina a Rje tyrosylová skupina; a X je 9 měrový peptid začínající aminokyselinou Tyf ' a končící aminokyselinou AIa^Ml sekvence SEQ ID NO:1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C X, kde B jc 82 měrový peptid začínající aminokyselinou Va!¹⁴⁹ a končící aminokyselinou Arg¹¹' sekvence SISQ i? ID NO:© C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R^l mají shora definovaný význam. R'je leuevlová skupina a R' je tyrosylová skupina: a X je 9-inérovv peptid začínající aminokyselinou Tyf'¹ a končí aminokyselinou Ala¹⁴' sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vvnálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X. kde B je 772t) měrový peptid, který začíná aminokyselinou Val^{4 4} a končí aminokyselinou Arg¹’⁰ sekvence SEQ

ID NO:1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R' je leucylová skupina a R' je tyrosylová skupina: a X je 9-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyf¹¹ a končící aminokyselinou Ala'¹⁴³ sekvence SEQ ID NO:1.

V dalším provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 88mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴' a končící aminokyselinou Arg^?'⁽¹ sekvence SEQ ID NO:© C jc 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R’ je leucylová skupina a R' je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyf³ a končící aminokyselinou Phe⁴⁶ sekvence SEQ ID NO: 1.

31)

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X. kde B je 82 měrový peptid začínající aminokyselinou Val⁴⁴⁹ a končící aminokyselinou Arg' sekvence SEQ ID NO:I: C je 4-mérový peptid. kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, 10 je leucylová skupina a R’jc tyrosylová skupina: a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou lyf a

3? končící aminokyselinou I’he^>46 sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B C-X, kde B je 77mérový peptid začínající aminokyselinou Val⁴¹⁴ a končící aminokyselinou Arg'™ sekvence SEQ ID NO:1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R² jc leucylová •κι skupina a R' je tyrosylová skupina; a X jc 12-měrní peptid začínající aminokyselinou Tyf³¹ a končící aminokyselinou Phe'⁴'’ sekvence SEQ ID NO: 1.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 176merový peptid začínající aminokyselinou Val^35? a končící aminokyselinou Arg³⁰ sekvence SEQ

ID NO:1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R² je leucylová skupina a R je tyrosylová skupina; a X je 12-mérový peptid začínající aminokyselinou Tyf ³¹ a končící aminokyselinou Ala¹¹' sekvence SEQ ID NO.l.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou B-C-X, kde B je 176—

5d měrový peptid začínající aminokyselinou Va©⁵ a končící aminokyselinou Arg¹' sekvence SEQ

ID NO: 1; Q je 4-mcrový peptid, kde R^! a R⁴ mají shora definovaný význam, R² je leucylová skupina a R'je tyrosylová skupina; a X je 12-mcrový peptid začínající aminokyselinou Tyf ' a končící aminokyselinou Phe¹⁴⁶ sekvence SEQ ID NO:1,

- 10CZ 300141 Bó

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-C-Y, kde A jc acety lová skupina: C je 4-mcrový peptid. kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam. R² je leucylová skupina a R'je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou Λ-C-X-Y. kde A je acetylová skupina; C je 4- měrový peptid. kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam. R² je leucylová skupina a R je tyrosylová skupina: X je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

io V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-Y, kde A je acety lová skupina: B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro'²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg'^,l} sekvence SEQ ID NO: 1; C je 4- měrový peptid, kde R¹ a R¹ mají shora definovaný význam. R je leucylová skupina a R' je tyrosylová skupina; a Y jc aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C Y. kde A je acetylová skupina; Bje dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro^<?) a končící aminokyselinou v pozici Arg⁵*’⁰ sekvence SEQ ID NO:1; C je 4-mcrový peptid. kde R^l a R⁴ mají shora definovaný význam. R jc leucylová skupina a R' je tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupi20 na.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acety lová skupina; B je hexapeptid začínající aminokyselinou v pozici Tyr'²' a končící aminokyselinou v pozici Arg⁽⁾ sekvence SEQ ID NO: í; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R'¹ mají shora

2? definovaný význam. R“ je leucylová skupina a R je tyrosylová skupina; X a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde Aje acety lová skupina; Bje arginylová skupina; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora detlnovaný význam, R je leucylová skupina a R je tyrosylová skupina: X je tyrosylová skupina a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B=C-X-Y, kde Aje acety lová skupina; Bje dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro'²⁹ a končící aminokyseli15 nou v pozici Arg° sekvence SEQ ID NO: I; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R je leucylová skupina a R’ je tyrosylová skupina; X je 3-1- tyrosylová skupina a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B-C-X-Y, kde A je acety lová skupina; B je dipeptid začínající aminokyselinou v pozici Pro'²⁹ a končící aminokyselinou v pozici Arg^,?í) sekvence SEQ ID NO:1; C je 4-mérový peptid, kde R¹ a R⁴ mají shora definovaný význam, R² je leucylová skupina a R’je tyrosylová skupina; Xje tyrosylová skupina; a Y je aminokarbonylová skupina.

V jiném provedení vynálezu se popisují peptidy s obecnou strukturou A-B|=C,-Xi-Y, kde A je acety lová skupina; B| aX] nejsou přítomny, C, jc 10-rnérový peptid začínající aminokyselinou v pozici Arg'¹⁴ a končící aminokyselinou v pozici Trp⁵²' sekvence SEQ ID NO: 1 a Y je aminokarbonylová skupina.

Reprezentativní sloučeniny podle vynálezu zahrnují sloučeniny, kde A je acetyl a Y je aminokarbonyl a B-C-X je (a) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokvselinv 355 do pozice

543;

CZ 300141 Bó (b) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 546:

(c) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO 543:

(d) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO 543:

(c) sekvence pocházející zc sekvence SEQ ID NO: 543;

(f) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 546;

(g) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 546:

(h) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO 546;

(i) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 535;

(j) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 535;

(k) sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 535;

od pozice aminokyseliny 355 do pozice

I od pozice aminokyseliny 443 do pozice od pozice aminokyseliny 449 do pozice od pozice aminokyselin) 454 do pozice od pozice aminokyseliny 443 do pozice

I od pozice aminokyseliny 449 do pozice od pozice aminokyseliny 454 do pozice od pozice aminokyseliny 525 do pozice od pozice aminokyseliny 529 do pozice od pozice aminokyseliny 530 do pozice

Jiná reprezentativní sloučenina je ta, kde A ie acetyl a Y je am inokarbonyl a B| C|- Xi je sekvence pocházející ze sekvence SEQ ID NO: 1 od pozice aminokyseliny 514 do pozice 523.

Fragmenty K5 nebo fúzní proteiny K5 sc mohou získat expresí rekombinantní molekuly obsahující polynukleotid, jehož sekvence kóduje protein nesoucí peptidový fragment smyčky 5 a čištěním exprimovaného peptidového produktu (viz Menhart, N., et al., Biochemistry, 32: 8799-8806 (1993). Sekvence DNA lidského plazminogenu se publikovala (Browne, M. J. et al., Fibrinolysis. 5 (4): 257-260 (1991) a jc zobrazena na obr, ě. 3 (a až b) (sekvence SEQ ID NO: l 12). Poly50 nukleotidová sekvence kódující smyčku 5 začíná přibližně v pozici nukleotidu 1421 sekvence SEQ ID NO: 12 a konči přibližně v pozici nukleotidu 1723.

Gen kódující peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se muže izolovat z buněk nebo tkání, které exprimují vysoké množství lidského plazminogenu nebo fúzních proteinů K5 (1) izolací mediátorové RNA z tkáně nebo buněk. (2) použitím reverzní transkríptázy za vzniku odpovídající sekvence DNA a (3) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s vhodnými primery pro amplifíkaei sekvence DNA. která kóduje aktivní aminokyselinovou sekvenci K5 nebo její fúzní protein. Polynukleotid kódující peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se může klonovat do libovolného běžné dostupného expresívního vektoru (jako jsou pBR322. pUC vektory a podobně) nebo expresívních/čistieíeh vektoru jako je fúzní vektor GST (Pharmacia®, Piscataway, NJ)) a pak exprimován ve vhodném prokaryontním, virovém nebo eukaryontním hostiteli. Čištění pak muže být provedeno konvenčním způsobem nebo v případě běžného expresívního/ěistieího systému se postupuje podle instrukcí výrobce.

Peptidový fragment K5 nebo fúzní protein K5 se muže syntetizovat standardními chemickými metodami na pevné fázi, které jsou v oboru dobře známy. Peptidové fragmenty smyčky 5 se například mohou syntetizovat postupem, který se popisuje v publikaci Stevvarda and Younga (Steward, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2^ntl Ed., Pierce Chemical Conipanv, Roekford, IE, (1984) za použití syntetizátoru (Applied Biosyslem synthesizer). Podobno ně se muže syntetizovat více fragmentu, které jsou spojeny dohromady a tvoří větší fragmenty. Tyto syntetické peptidové fragmenty se mohou také připravit substitucemi aminokyselin ve specifických lokacích za účelem testování anti-angiogenní aktivity in vitro a in vivo. Pro syntézu peptidů na pevné fázi se hodí řada metod, které se popisují v publikacích J. M. Stewart and J. D.

- n CZ 300141 B6

Young. Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Ereeman Co, (San Francisco). 1963 a J.

MeicnhoFcr. Hormonal Proteins and Peptides. vol. 2, p. 46. Academie Press (New York). 1973.

Klasická syntéza v roztoku se popisuje v publikaci G. Schroder and K. Lupke. The Peptides, Vol.

1, Academie Press (New York). Tyto metody obecně zahrnují sekvenční adici jedné nebo více aminokyselin nebo vhodně chráněných aminokyselin za účelem tvorby peptidového řetězce. V normálním případě je chráněna amino nebo karboxylová skupina první aminokyseliny vhodnou chránící skupinou. Chráněná nebo derivatizovaná aminokyselina je pak buď připojena k inertní pevné podložce nebo je v roztoku a za podmínek vhodných pro vytvoření amidové vazby se k sekvenci adujc další aminokyselina, která má vhodně chráněnou komplementární (amino- nebo m karboxylovou skupinu) skupinu. Chrániči skupina sc pak z nově připojeného aminokyselinového zbytku odstraní a přidá se další (vhodně chráněná) aminokyselina atd. Poté, co se z aminokyselin složí správná sekvence, odstraní sc sekvenčně nebo konkurenčně libovolné zbývající chránící skupiny (a také pevné podpory) za vzniku konečného polypeptidu. Jednoduchou modifikací tohoto obecného postupu je v jednom okamžiku možné přidat více jak jednu aminokyselinu. Napří15 klad kondenzací (za podmínek, které neracemizují chiráiní centra) chráněného tripeptidu se správné chráněným dipeptidem za vzniku (po odstranění chránících skupin) pentapeptidu.

Zvláště preferovaným způsobem přípravy sloučenin podle vynálezu je syntéza peptidů na pevné fázi. kde aminokyselina α-N-konce je chráněna skupinou citlivou na kyselé nebo bazické pro20 středí. Taková chránící skupina by měla být stabilní za podmínek, kdy se tvoří peptidová vazba, přičemž by se měla dát snadno odstranit, aniž se poruší rostoucí peptidový řetězec nebo aniž dojde k racemizaci jakéhokoliv vzniklého chirálního centra. Vhodné chránící skupiny jsou 9-fluoreny lmety loxykarbony lová (Emoc), t-buly loxykarbony lová (Boc). benzy loxykarbony lová (Cbz), bifenyl izo propy loxy karbony lová, t-amy loxykarbony lová, isoborny loxykarbony lová, α,α25 dimetyl 3.5-dimetoxybenzyloxykarbonyIová. o-nitrofenylsul fenylová, 2-kyano i-butylkarbonylová skupina. Při synteze peptidových fragmentů smyčky 5 se zvláště preferuje 9-11 uorenyImety loxykarbony lová (Emoc) chránící skupina. Jinými preferovanými skupinami, které chrání aminoskupiny vedlejšího řetězce jako je lysin a arginin, jsou 2,2.5,7,8-pentametylchroman-ósulfonylová skupina (pmc), nitroskupina. p-toluensulfonylová skupina, 4-metoxybenzensulfo30 nylová skupina, Cbz, Boc a adamantyloxykarbonylová skupina; v případě tyrosinu to je benzylová skupina, o·-brom benzy loxykarbony lová skupina. 2,6 -dichlorbenzy lová, isopropylová, tbutylová (t-Bu), cyklohexylová skupina, cyklopentylová a acetylová skupina (Ac); v případě serinu to je t-butylová. benzylová a tetrahydropyranylová skupina, v případě histidinu to je trity lová, benzylová skupina, Cbz, p-toluensul fony lová a 2,4-dinitrofenylová skupina; v případě tryptofanu to je fonnylová skupina; v případě kyseliny aspartovč a glutamovč to je benzylová a t-butylová skupina a v případě cysteinu to je trifenylmetylová (tritylová) skupina. Při syntéze peptidů na pevné lází je α-C-konec aminokyseliny vázán k vhodnému pevnému nosiči nebo pry skyřici. Vhodné pevné nosiče použitelné při shora uvedené syntéze jsou ty materiály, které jsou inertní vůči činidlům a reakčním podmínkám reakcí zahrnujícím kondenzaci a odstranění to chránících skupin, a které jsou nerozpustné v používaném médiu. Preferovaný pevný nosič pro syntézu peptidů s α C -koncovými karboxy-skupinami jc 4 hydroxyinetylfenoxymetyl-kopoly( styren- l%di vinyl benzen). Preferovaný pevný nosič pro peptidy s α-C-koncovými amidovými skupinami, je 4-{2',4'-dimetoxyfenyl-Pmoc aminomctyl)-fenoxyacetamidoetylová pryskyřice dostupná u firmy Applied Biosystems (Poster City, CA). Aminokyselina s α-C-koncem je při45 pojena k pryskyřici pomocí N.N'-dicyklohexvlkarbodiimidu (DCC), N.N'-diizopropylkarbodiimidu (DIC) nebo 0-benzotriazol-l-yl-N,N.N'.N'-tetranietyluronium-hexafluorofosfátu (FIBTlj) s pomocí nebo bez 4-dimetylaminopyridinu (DMAP). 1-hydroxy benzotriazolu (HOBT), benzotriazol-1-y loxy ·7π.ν(άί mety lamino)fosfonium-hexalluorofosfátu (BOP) nebo bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfinchlorid (BOPC1). S těmito činidly se kondenzace provádí po so dobu 1 až 24 hodin při teplotě v rozmezí od 10°C do 50 °C v prostředí rozpouštědla, např. dichlormelanu nebo DMF. V případě, že pevným nosičem je 4-(2'₁4'-dimetoxyfenyl-Fnioeaminometyl)fenoxyacetamidoetylová pryskyřice, skupina Fmoc je před kondenzací s a-C-koncovou aminokyselinou, jak se popisuje shora v textu, štěpena sekundárním aminem, výhodné ptperidinem. Preferovaným způsobem kondenzování k nechráněné 4 (2'.4'-důneto\yfenyl55 Emoc-aminometyl)fenoxy-acetamidetylové pryskyřici jc kondenzace s O benzotriazol-1 yl- 13 CZ 300141 B6

Ν.Ν,Ν'.Ν'-tetrametyluronium hexafluorofosfátem (HBTU, 1 ekviv.) a 1-hydroxybenzotriazolem (HOBT, 1 ekviv.) v DMF. Kondenzace úspěšně chráněných aminokyselin se provádí na automatizovaném syntctizátoru polypeptidu. který je dobře znám v oboru. V preferovaném provedení jsou α-N-konce aminokyselin rostoucího peptidového řetězce chráněny skupinou Fmoc.

? Odstranění chránící skupiny Fmoc z α-N-konce rostoucího peptidu je provedeno reakcí se sekundárním aminem, výhodně piperidinem. Každá chráněná aminokyselina se pak používá v asi třínásobném molárním přebytku a kondenzace se provádí výhodně v DMF. Kondenzační činidlo je běžně O-benzotriazol-I-yl -Ν,Ν,Ν',Ν-tetrametyluroniumhexafluorofosfát (HBTU. 1 ekviv.). Na konci syntézy na pevné fázi je polypeptid odstraněn z pevného nosiče a zbaven chránících io skupin reakcemi, které po sobě následují, nebo jedinou operací, štěpícím činidlem obsahujícím thianizol. vodu, etanditiol a kyselinu trifluoroctovou. V případech, kde u-C-konec polypeptidu je alkvlamid, se pryskyřice štěpí aminolýzou alkylaminem. V jiném případě se peptid může odstranit transesterifikaeí. např. metanolem, po čemž následuje aminolýzou. nebo přímou transamidaeí. Chráněný peptid se může v tento okamžik čistit a nebo se může použít přímo v dalším stupni, |5 Odstranění skupin, které chrání vedlejší řetězce, se provede za použití shora popsaného koktejlu určeného pro štěpení. Peptid s kompletně odstraněnými chránícími skupinami se čistí řadou ehromatografických stupňů, kde se používají libovolné nebo všechny následující typy ehromatografií: výměna iontů na slabě bazické pryskyřici (acetátová forma); hydrofobní adsorpční chromatografie na nederi vat izo váném polystyren-divinylbenzenu (např. A in ber lite XAD); adsorpční ehro20 matografie silikagelu. ionexů chromatografie na karboxy mety leelulóze; rozdělovači chromatografie. např. na Sephadexu G-25, Lll-20 nebo chromatografie v protiproudovém uspořádání; vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC), zvláště HPLC na reverzní fází, přičemž náplní kolony je fáze vázaná na oktyl— nebo oktadecylsilyl. Molekulové hmotnosti těchto peptidových fragmentů smyčky 5 se určují za použití hmotnostní spektroskopie FAB (Fast Atom

Bombardment Mass Spektroscopy). Syntéza peptidového fragmentu smyčky 5 na pevné fázi sc popisuje v příkladu 1 až 12.

V závislosti na způsobu produkce se peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5 může vyskytovat s nebo bez dříve uvedených disulfidových můstků oblasti smyčky 5 savčího plazmino50 genu nebo v případě fúzního proteinu s jinými oblastmi savčích smyček s nebo bez disulfidových vazeb těchto odpovídajících oblastí nebo mohou existovat s d i sulfidovým i vazbami za vzniku terciální struktury, která se liší od terciální struktury nativního savčího plazminogenu. Peptidové fragmenty smyčky 5 vznikající enzymatickým štěpením Glu- Lvs- nebo min i plazminogenu elastázou a/ncbo pepsinem (enzymy, které štěpí místa spojení cysteinu) obsahují nativní terciální strukturu proteinu smyčky 5; peptidové fragmenty smyčky 5 připravené syntézou na pevné fázi mohou nebo nemusí obsahovat cystylaminoacylové zbytky a peptidové fragmenty smyčky 5 připravené expresí mohou obsahovat d i sulfidové můstky v odlišných polohách, než v peptidových fragmentech, které vznikly enzymatickým štěpením.

4o Sloučeniny podle vynálezu zahrnující, ale nejsou omezeny na ty, které se popisují v příkladech vykazující anti-angiogenní aktivitu. Jako inhibitory angiogeneze se tyto látky používají pro léčbu primárních a me t a st azo váných pevných nádorů a karcinomů prsu, tlustého střeva, konečníku, orhofarynxu, esofagu, žaludku, pankreatu, jater, žlučníku, žlučovodu, tenkého střeva, močového systému včetně ledvin, močového měchýře a urotelia. ženských genitálií včetně děložního čípku, dělohy, vaječníků, choriokarcínomu a gestacionálního trofoblastového onemocnění, mužských genitálií včetně prostaty, chámovodú, varlat a nádorů zárodečných buněk; žláz z vnitřní sekrecí, které zahrnují štítnou žlázu, adrenální žlázu a pod věse k mozkový; kůže včetně hemangiomů. melanomů, sarkomů vznikajících v kostech nebo v měkkých tkáních a Kaposiho sarkomu; nádory mozku, nervů, očí a mozkových blan, které zahrnují astrocytomy, gliomy, glioblastomy, retinoblastomy, neuromy, neuroblaslomy, Schwannomy a meningioniy; pevné nádory vznikající z hcmatopoietických maligních nádorů, jako jsou leukémie, zahrnující chloromy, plazmacytomy, plaky a nádory mukózy fungoides a kožní mykóza T buněčného lymfomu/leukemie; lymfomy zahrnující Hodkinsův nebo non-l lodkinsův lymfom; při profylaxi auloimunitního onemocnění, jakoje revmatitida. imunitní a degenerativní artritida; oční onemocnění, jako je diabetická retino55 patie, retinopatie při předčasné dospělosti, odmítnutí implantátu rohovky, retrolentální fibro- 14 CZ 300141 B6 plazie. neovaskulární glaukom, rubeosis. reiinální neovaskularizace způsobená maskulární degenerací a hypoxie: abnormální neovaskularizace u očí: kožní onemocnění, jako je psoriáza;

onemocnění krevních žil, jako jsou hemagiomy a proliferace kapilár s arteosklerotíckými plaky:

Os ler Webberúv syndrom: myokard iální angiogeneze: p laková neovaskularizace; telangiectasia;

? hemofiliální klouby; angiofíbrom; granulace poranění; onemocnění charakterizované nadměrnou nebo abnormální stimulací endoteliálních buněk, jako je intestinální adheze. C roh nova nemoc, ateroskleróza: skleroderma a hypertrofie jizev (tj. keloidy) a onemocnění, které má angiogenezí jako patologický rys. mezi něž patří onemocnění kočičího škrábnutí (Rochele minul iu quanlosa) a vředy (Helicobacter pylori). Dále se mohou použít jako antikoncepce, která inhibuje ovulaci a io vznik placenty.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít při prevenci tvorby metastáz shora popsaných nádorů, buď když se používají samostatně nebo v kombinaci s radioterapií a/nebo s jiným chemoterapeutickými ošetřeními, které sc běžně aplikují u pacientů při léčbě angiogennich onemocnění, i? Když se uvedené látky podle vynálezu používají při léčbě pevných nádorů, mohou se aplikoval s chemolcrapcutickýmí činidly, jako je alfa interferon, COMP (cyklofosfamid, vinkristin. metotrexata a prednison). etoposid, mBACOD (mctortrexát, bleomycin, doxorubicin, cyklofosfamid. vinkristin a dexametason), PRO-MACE/MOPP (prednison, metotraxát „w/lcucin rescue. toxorubicin, cyklofosfamid, taxol, etoposid/meehloretamin, vinkristin, prednison a prokarbazin) vin2o kristin, vinbiastin. angioinhibiny, TNP-470, pentosanpolysulfát, faktor 4 krevních destiček, angiostatin. LM 609. SU 101, CM-101, Techgalan, talidomid, SP-PG a podobné. Mezi jiná chemoterapeutická činidla patří alkylační činidla, jako jsou dusíkaté yperily. které zahrnují meehloetamin, melfan. chlorambucil, cyklofosfamid a ifosfamid; nitromočoviny, které zahrnují karmustin, lomustin, semustin a streptozoein; alkyIsulfonáty zahrnující busulfan; triaziny zahr25 nujíeí dakarbazin; ethyleniminy, jako je tiotepa a hcxamctylmclamin; analogy kyseliny listové, jako je metotrexat; analogy pyrímidinu, jako je 5—fluoruraciI, cytosinarabinóza: analogy purinu, jako je ó-merkaptopurin a 6-thioguanin; protinádorová antibiotika, jako je aktinomyein D; antracykliny, jako je doxorubicin, bleomycin, mitomycin C a metramycin: hormony a antagonisty hormonů, jako je tamoxifen a kortikosteroidy a rozmanitá činidla, která zahrnují cisplatinu a

3o brequinar. Nádor se může léčit běžným způsobem chirurgicky, zářením nebo chemoterapií a aplikací smyčky 5 s následnou další aplikací smyčky 5, aby došlo k prodloužení stádia latence mikronietastáz a stabilizaci a inhibici růstu libovolného reziduálního primárního nádoru.

Cytotoxické činidla, jako je ricin sc mohou vázat na peptidové fragmenty, přičemž poskytují nástroj pro destrukci buněk, které váží smyčku 5. Peptidy, které se váží na ey to toxická činidla, se mohou zavádět infuzi způsobem, který maximalizuje zavedení do požadované oblasti. Fragmenty smyčky 5 s vysokou afinitou, na které je navázán ricin. se mohou zavádět prostřednictvím kanyl přímo do cílové oblasti nebo do cév, které zásobují cílové místo. Taková činidla se mohou také zavádět řízeným způsobem prostřednictvím osmotickýeh pump, které jsou připojeny na infúzní kanvly. Kombinace antagonistů smyčky 5 se může aplikovat se stiniu látory angiogeneze. přičemž dochází ke zvýšení vaskularizace tkáně. Tato léčba muže být úspěšný způsob odstraňování melastázované rakoviny.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou použít ve formé farmaceuticky přijatelných solí odvoze45 ných od anorganických nebo organických kyselin. Termín „farmaceuticky přijatelná sůl znamená ty sole. které jsou podle lékařského pohledu, vhodné pro kontakt s lidskou tkání a tkaní nižších zvířat, aniž vyvolají toxickou, iritační, alergickou odezvu a podobně, a vykazují přijatelný poměr přínos/riziko. farmaceuticky přijatelné sole jsou v oboru dobře známy, viz publikace S. M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: I et seq, která je zde uvedena jako odkaz.

Sole se mohou připravit in šitu během konečné izolace a čištění sloučenin podle vynálezu nebo odděleně reakcí volné báze s vhodnou organickou kyselinou. Reprezentativní adiční sole kyselin jsou například acetát, adipát, alginát, citrát, aspartát, benzoát, benzensulfonát. bisulfát, butvrát, kainforál, kamforsulfonát, diglukonát, glycerolfosfát. hemisulfat, heptanoát, hexanoát, fumarát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetansulfonát (isetionát), laktát. maleát. melan- 15 CZ 300141 B6 sulfonát, níkotinát, 2-naftalensulfonát. oxalát. pamoát. pektinát, persulfát. 3-fenylpropionát. pikrát, pivalát. propionát. sukcinát. tartrát. thiokyanát. fosfát, glutamát. hydrogenuhličitan, p-toluensulfonát a undckanoát. Skupiny obsahující bazický dusík se mohou kvatcmizovat činidly, kterými jsou halogenidy nižších alkylů, jako je metyl, etyl, propyl a butylehloridy. bromidy a jodidy.

? dialkylsulfaly, jako jsou dimetyl, dietyl. dibutyl a diamylsulfáty; halogen idy s dlouhým řetězcem, jako jsou decyl. lauryl, myristyl a stearylchloridy, bromidy a jodidy; arylalkylhalogenidy. jako jsou benzyl a fenetylbromidy a jiné sole. Tímto způsobem se připraví vodné nebo v oleji rozpustné nebo dispergovatelné produkty. Příklady kyselin, které se mohou použít při tvorbě farmaceuticky přijatelných adičnich solí kyselin, jsou anorganické kyseliny, jako jsou kyselina chloroio vodíková, bromovodíková. sírová a fosforečná a organické kyseliny, jako jsou kyselina oxalová, maleinová. sukcinová a kyselina citrónová.

Bazické adični sole se mohou připravit in šitu během konečné izolace a čištění peptidových fragmentů smyčky 5 reakcí látek, které obsahují karboxylovou kyselinu s vhodnou bází. jako jc hydroxid, karbonát nebo bikarbonát farmaceuticky přijatelného kationtu kovu nebo amoniak nebo organický primární, sekundární nebo terciární amin. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují, ale nejsou omezeny na kationty omezené na kationty alkalických kovu nebo kovů alkalických zemin, jako jsou sole litia, sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku a hliníku a podobné a nctoxiekých kvartéru ích amoniových solí a aminových kationtu. které zahrnují anion i um, tetrametylamoniuin.

tclraclylamonium, rnclylamin. dimelylamin. triinetylamin, trictylamin, dielylamin. ctylamin a podobně. Jiné reprezentativní organické aminy, které jsou použitelné při tvoření bazických adičních solí. zahrnují etylendiamin. etanolamin, dietano lamin, piperidin, pipcrazin a podobně. Preferované sole sloučenin podle vynálezu zahrnují fosforečnan, tris a acetát.

2? Peptidové fragmenty smyčky 5. antisera smyčky 5. receptorové agonistv smyčky 5, receptorové antagonisty smyčky 5 nebo jejich kombinace se mohou použít společně s farmaceuticky přijatelnou postupně sc uvolňující matricí, jako jsou biodcgradovatclné polymery, za vzniku terapeutických kompozic. Postupně se uvolňující matrice je připravená z materiálů obvykle z polymerů, které jsou rozložitelné enzymy nebo bazickou nebo kyselou hydrolýzou nebo rozpuštěním. Když se matrice zavede do těla, působí na ní enzymy a tělní tekutiny. Požaduje se, aby postupně sc uvolňující matrice byla vybrána z biokompatibilních materiálů, jako jsou lipozomy, polylaktidy (polymery' kyseliny mléčné), polyglykolid (polymer kyseliny glykolové). polyanhydridy polylaktid—ko—glykolidu (kopolymer kyseliny mléčné a kyseliny glykolové), poly(orto)estery, polypeptidy, kyselina hyaluronová, kolagen, chondroítinsullát, karboxylové kyseliny, mastné kyseliny, fosfolipidy, polysaeharidy, nukleové kyseliny, polyaminokyseliny. aminokyseliny, jakoje fcnylalanin, tyrosin. isoleucin, polynukleotidy. polyvinylpropylen. polyvinylpyrolidon a silikon. Preferovaná biodegradovatclná matrice je matrice zhotovena bud¹ z polylaktidu. polyglykolidu. nebo z polylaktid—ko—glykolidu (kopolyméry kyseliny mléčné a kyseliny glykolové).

Peptidové fragmenty smyčky 5, fúzní proteiny smyčky 5, receptorové ago ni sty smyčky 5. receptorové antagonisty smyčky 5 nebo jejich kombinace se mohou aplikovat společně s farmaceuticky přijatelnými excipíenty nebo nosiči za vzniku terapeutických kompozic. Farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipicnt znamená neloxické. pevné, semi-pevné nebo kapalné plnidlo, rozpouštědlo, materiál pro tvorbu kapsu lí nebo pro tvorbu čípků libovolného typu. Kompozice se aplikují parenterálně, pod jazyk, intracisternálně, intravaginálně, intraperitonálně, rektálně, bu kalně nebo povrchově (ve Formě prášku, masti, kapek, transdermálních náplastí nebo pomocí iontoforézu ích přístrojů).

fermín „parenterální“ znamená model aplikace, který zahrnuje Íntravenózní, intramuskulámí, íntraperitonální. inlrasternální, podkožní a intraartikulární injekce a infuze. Farmaceutické kompozice vhodné pro parenterální injekci obsahují farmaceuticky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, stejně jako sterilní prásky, které se rekonstitují do i njekto vatclných roztoků nebo disperzí bezprostředně před použitím. Příklady vhodných vodných a nevodných nosičů, rozpouštědel, ředidel zahrnují vodu, etanol. polyoly (jakoje glycerol, propylenglykol, polyetylenglykol a podobně), karboxymetylcclulózu a jejich vhodné směsi, rost- 16 CZ 300141 B6 linné oleje (jako je olivový olej) a injektovatelné organické estery, jako je etyloleát. Vhodná tekutost sc udržuje například použitím vhodných potahových materiálů, jako je lecitin, udržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím povrchově aktivních látek. Tyto kompozice mohou také obsahovat adjuvans. jako jsou konzervační činidla, smáčecí činidla.

emulgátor) a disperzní činidla. Prevence proti působení mikroorganizmů se může zaručit inkluzí různých antibakteriálních a anti fungálních činidel, jako je paraben, chlorobulanok kyselina fenol sorbová. Může být také nutné zahrnout izotonieká činidla, jako je cukr, chlorid sodný a podobně. Prodloužené absorpce injektovatelné farmaceutické formy se může dosáhnout inkluzí činidel, jako je monosterát hlinitý a želatina, což jsou látky, které zpožďují absorpci, lnjektova10 tělně depotní formy se připravují tvořením mikrokapsulových matric léčiv v biodcgradovatelnýeh polymerech, jako je pólylaktidpolyglykolid. poly(ortoestery) a po ly( anhydridy), Rychlost uvolňování léčiva se může řídit v závislosti na poměru léčiva a polymeru a podstatě použitého polymeru. Depotní injektovatelné formulace se připravují zachycením léčiva do lipozomů nebo mikroemulzích. které jsou kompatibilní s tělními tkáněmi. Injektovatelné formulace se sterilizuji.

například filtrací přes filtr zachycující bakterie nebo přidáním steří li začn ího činidla ve formě sterilních pevných kompozic, které se rozpustily nebo dispergovaly ve sterilní vodě nebo v jiném sterilním injektovatelném médiu tésně před použitím.

Povrchová aplikace zahrnuje aplikaci na kůži, sliznici a povrch plic a do očí. Kompozice, které jo jsou vhodné k povrchové aplikaci, zahrnují formy použitelné pro inhalaci, které se připraví jako suchý stlačený nebo nestlačený prášek. V kompozicích, kde prášek není stlačen, se aktivní látka může použít ve formě směsí s farmaceuticky přijatelným inertním nosičem o větší velikosti, jenž zahrnuje partikule, jejichž velikost je například až 100 mikrometrů v průměru. Vhodné inertní nosiče jsou cukr)', jako je laktóza. Je nutné, aby nejméně 95 % hmotnosti částic aktivní látky mělo účinnou velikost partikul·' v rozmezí 0,01 až 10 mikrometrů. Při povrchové aplikaci do očí se látka podle vynálezu zavede na farmaceuticky přijatelném oftalimickém nosiči tak. žc látka se udržuje v kontaktu s povrchem oka dostatečně dlouhou dobu. aby se umožnilo látce proniknout do vnitřních oblastí oka a rohovky, jako například přední komora oční, zadní komora, tělo sklivce, komorová voda, voda ve sklivci, rohovka, duhovka/řasy. čočka, choroidea/sítnice a oční so bělmo. Farmaceuticky přijatelný oftalmický nosič je například mast, rostlinný olej nebo enkapsulaění materiál. V jiném případě se látky podle vynálezu mohou přímo zavést injekcí do komorové nebo skliveové vody.

Kompozice se může uchovávat pod tlakem. Může tedy obsahovat stlačený plyn, jako je dusík nebo kapalný plynový propelent. Preferuje se zkapalněné rozprašovací médium a samozřejmě taková celková kompozice, kde akt i vní látka není rozpuštěna v podstatném množství. Kompozice uchovávaná pod tlakem může také obsahovat povrchově aktivní činidlo, jako je kapalné nebo pevné neiontové povrchové aktivní činidlo nebo to může být aniontového povrchově aktivní činidlo. Preferuje se použití pevného an iontového povrchově aktivního činidla ve formě sodné sole.

L kompozic vhodných pro rektální a vaginální aplikaci se preferují čípky, které se mohou při pravovat smícháním látek podle vynálezu s vhodnými neiritujícími excipienty nebo nosiči, jako je kakaové máslo, polyetylenglykol nebo vosk, což jsou materiály, které jsou pevné při teplotě místíš nosti, ale kapalné při teplotě těla a proto tají v rektu nebo ve vaginální dutině a tím se uvolňuje se aktivní látka.

Látky podle vynálezu se mohou také aplikovat ve formě lipozomů. Jak je známo v oboru li pozorný se obecně odvozují z fosfolipidu nebo jiných lipidovýeh látek. Li pozorný se tvoří <<) mono nebo multi-lamelámími hydratovanými kapalnými krystaly, které se dispergovaly ve vodném roztoku. Může se použít libovolný netoxický fyziologicky přijatelný a metabol izo vatě lný lipid schopný tvořit li pozorný. Kompozice v lipozomové formě mohou obsahovat vedle látek podle vynálezu stabilizátor), konzervační činidla, excipienty a podobně. Preferovanými lipidy jsou fosfolipidy a fosfatidylcholiny (lecitiny), jak přirozené tak syntetické. Metody pro tvorbu

- 17CZ 300141 B6 lipozomu jsou dobře známy v oboru (Prescott. Ed.. Methods in Cell Biology. Volume XIV,

Academie Press. New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq.).

Při shora uvedené léčbě nebo při jiném druhu léčby se použije terapeuticky úěinné množství jedné z kompozic podle vynálezu v čisté formě nebo v případě, že takové formy existují, ve formě farmaceuticky přijatelné sole a s nebo bez farmaceuticky přijatelného nosiče. ..Terapeuticky přijatelné množství látky podle vynálezu znamená dostatečné množství látky pro léčbu angiogenního onemocněni (např. omezení růstu nádoru, zablokování nebo zpomalení vzniku metastáz nádoru) při přijatelném poměru přínos/riziko, který se dá aplikovat na libovolný způsob κι léčby. Rozumí se však, žc mód aplikace by měl určit lékař. Specifická terapeuticky účinná dávka pro libovolného pacienta závisí na různých faktorech, které zahrnují druh léčené poruchy a stádium poruchy: aktivitu použité specifické látky; použitou specifickou látku; věk; tělesnou hmotnost, obecný zdravotní stav, pohlaví a dietetické návyky pacienta; čas aplikace; způsob aplikace; rychlost exkrece specifické použité látky; trvání léčby; kombinace použitých medikamentů a specifikách látek podle vynálezu a podobných faktorů, které jsou dobře známy v oboru. Odborníkovi je známo, že, aby se dosáhlo požadovaného terapeutického účinku, je vhodné začít s nižší dávkou, která se postupně zvyšuje, až se dosáhne požadovaného účinku. Celková denní dávka peptidových fragmentů nebo fúzních proteinů smyčky 5, které se lidem nebo jinému savčímu hostiteli aplikují lokálně nebo systematicky v jedné nebo v rozdělených dávkách, se např. pohy2d buje v rozmezí od 0.0001 do 200 mg/kg tělesné hmotnosti a nebo více obvykle v rozmezí od 1 do 300 mg/kg tělesné hmotnosti. Je-li to nutné účinná denní dávka se může rozdělit pro účely aplikace do více dávek. Kompozice podávaná v jedné dávce může obsahovat lakové množství nebo jeho násobek menší než jedna, aby se dala aplikovat denní dávka.

Rozumí se, že činidla, která se mohou kombinovat s látkou podle vynálezu vhodnou pro inhibici, léčbu nebo profylaxi angiogenníeh onemocnění nejsou omezena na látky uvedené shora v textu, ale v principu zahrnují libovolná činidla pro léčbu nebo profylaxi angiogenníeh onemocnění.

Vynález také popisuje izolované póly nukleotidy, které kódují savčí peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5. který vykazuje aktivitu inhibující angiogenezi. Takové polynukleotidy se mohou použít při expresi rekombinantních peptidových fragmentů smyčky 5 nebo při genové terapii (jak se popisuje dále v textu).

Póly nukleotid podle vynálezu se může vyskytovat ve formě mRNA nebo DNA. V tomto vynále35 zu se také popisují polynukleotidy ve formě DNA, cDNA, genomové DNA a syntetické DNA. DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová a jestliže je jednořetězcova může se jednat o kódující (sen se) řetězec nebo nekódující (ant i-sen se) řetězec. Po ©nukleotid podle vynálezu může být v nemodifikované formě nebo zahrnuje modifikace jako je metylace nebo úprava čepičkou.

Kódující sekvence, která kóduje polypeptid může být stejná jako zde popisovaná kódující sekvence nebo se může lišit, jako výsledek redundance a degenerace genetického kódu, přičemž kóduje stejný polypeptid jako zde popsaná DNA. Tento póly nukleotid může zahrnovat pouze kódující sekvenci pro polypeptid nebo kódující sekvenci pro polypeptid a další kódující sekvenci, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo pro-proteinová sekvence nebo kódující sekvence polypeptidú (a další kódující sekvenci) a nekódující sekvenci, jako je nekódující sekvence 5' a/nebo 3' kódující sekvence polypeptidu.

Navíc vynález zahrnuje různé polynukleotidy obsahující modifikace, jako jsou delece polemik leot i dú. substituce nebo adice; a libovolné modifikace polypeplidů, které vznikají z různých polynukleotídových sekvencí. Polvnukleotid podle vynálezu může mít kódující sekvenci, která je přirozeně se vyskytující alelová varianta zde popsané kódující sekvence.

Navíc kódující sekvence polypeptidú se může fúzovat ve stejném čtecím rámci s póly nukleotidovou sekvencí, která napomáhá při exprimaei a sekreci polypeptidú z hostitelské buňky. Je to například vedoucí sekvence, která funguje jako sekreční sekvence řídicí transport polypeptidú z

- 18CZ 300141 B6 buňky. Polypeptid mající vedoucí sekvenci je pre-protein a může mít vedoucí sekvenci štěpenou hostitelskou buňkou za vzniku polypeptidu. Polynukleotidy mohou také kódovat pro-protein, který' je tvořen proteinem plus dalšími 5' aminokyselinovém i zbytky. Protein, který' má pro- sekvenci je pro-protein a může v některých případech být neaktivní formou proteinu. Jestliže je pro sekvence štěpena, zůstává aktivní protein. Polynukleotid podle vynálezu může kódovat protein nebo protein, který má pro-sekvenei. nebo protein, který' má pre-sekvenci (vedoucí sekvenci) a pro-sekvenci.

Polynukleotidy podle vynálezu mohou také mít kódující sekvenci fúzovanou v rámci s markero10 vou sekvencí, která umožňuje čištění polypeptidu podle vynálezu. Markerová sekvence může být sekvencí GST značky (,.GST tag“) doplněná vektorem pGEX, přičemž v případě bakteriálního hostitele vzniká za účelem čištění polvpeptidů fúzovaného s markérem. Markerová sekvence může být například hemaglutinin („HA tag“). v případě, že se používá savčí hostitel, např. buňky COS-7. Sekvence HA tag koresponduje s epitopem odvozeným od hemaglutininového proteinu i? viru influenzy (I. Wilson, et al.. Cell 37: 767 (1984)).

Polynukleotid se může generovat libovolným způsobem zahrnujícím chemickou syntézu, replikaci, reverzní transkripci nebo transkripci, která je založena na informaci poskytované sekvencí bází v oblasti (oblastech), ze kterých je odvozen polynukleotid; což tnůže být reprezentovat buď sense nebo antisense orientace původního polynukleotidu. Preferovanou metodou vzniku polynukleotidu je polymerázová řetězcová reakce, která se popisuje v patentu US 4 683 195 a US 4 683 202.

Předpokládá se. že polynukleotidy hybridizují se zde popsanými sekvencemi, jestliže vykazují nejméně 50%. s výhodou 70% shodnost mezi polynukleotidem a sekvencí.

Vynález také zahrnuje vektory, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelské buňky, do kterých se vnáší vektory podle vynálezu a způsoby rekombinantní produkce polv peptidů podle vynálezu. Takové metody zahrnují kultivaci hostitelských buněk za podmínek vhodných pro su expresi polynukleotidu odvozeného od smyčky 5 a izolaci polypeptidu z kultury, který je odvozen od smyčky 5.

Polynukleotidy podle vynálezu se mohou použít při produkcí polypeptidů postupy genového inženýrství, Poiynukleotidová sekvence pak může zahrnovat jeden z expresívních nosičů, zv láště vektorů nebo plazmidů pro expresi polypeptidů. Takové vektory zahrnují chromozomální, nechromozomální a syntetické sekvence DNA, například deriváty SV40; bakteriální plazmidy, fágovou DNA: kvasinkové plazmidy, vektory získané z. kombinace plazmidů a fágové DNA, virové DNA, jakoje vakciníe. adenoviry'. virus spalniček a virus planých neštovic. Může se však použít libovolný jiný vektor nebo plazmid, který' se replikuje v hostiteli a je pro něj vhodný,

Vhodná sekvence DNA se může začlenit do vektoru různými způsoby. Sekvence DNA se začlení do vhodného restrikčního místa postupem, který' je dobře znám v oboru. Takové a jiné postupy jsou dobře známy v oboru. Sekvence DNA je v expresívnírn vektoru operabilně spojena s vhodnou expresívní řídicí sekvencí (sekvencemi) (jakoje promotor), aby řídila syntézu mRNA. Rep45 rezentativní příklady takových promotorů zahrnují promotor LTR nebo SV40. promotor lac nebo trp bakterie E.eoli, promotor fága lambda P sub E ajiné promotory', které kontrolují expresi genů v prokaryontních a eukaryontních buňkách nebo jejich virech. Expresívní vektor také obsahuje ribozómovc vazebné místo pro iniciaci translace a terminátor transkripce. Vektor může také zahrnovat vhodné sekvence pro amplifikaci exprese. Expresívní vektory' navíc obsahují gen, který poskytuje fenotyp vhodný pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jakoje dihydrofolát reduktáza nebo v případě kultury eukary ontních buněk jde o rezistenci na neomycin nebo u bakterií E.eolije to rezistence na tetracyklin nebo ampicilin.

Vektor obsahující vhodnou sekvenci DNA, která je stejně dobře popsaná jako shora uvedený vektor a řídicí sekvence, se může použít pro transformaci vhodného hostitele, přičemž umožní

- 19CZ 300141 B6 hostiteli exprimovat protein. Jako reprezentativní vzorky vhodných hostitelů se uvádějí bakteriální b u ň ky, j a ko j e E coli, Salmon ella typh imurium; Streptomyces spp.; buňky hub.jako jsou kvasinky: hmyzí buňky, jako je Drosophila a Sfié a zvířecí buňky, jako je CHO. COS nebo Bowes atd. Předmětem vynálezu je také selekce vhodného hostitele.

Vynález také zvláště zahrnuje rekombinantní konstrukty obsahující jednu nebo více zde popsaných sekvencí. Konstrukty obsahují vektor, jako je virový vektor, do kterého se sekvence začlení, bud' v přímé, nebo obrácené orientaci. V preferovaném provedení vynálezu konstrukt dále obsahuje regulační sekvence například promotor operabilitě spojený se sekvencí. V oboru je známo io velké množství vhodných vektoru a promotorů a jsou běžně dostupné. Následující vektory se popisují způsobem příkladů. Bakteriální vektory jsou: pSPORTI (GIBCO BRL. Gaithesburg.

MD), pQE70, pQE60, pQF-9 (Qiagen) pBS. phageseript, psiX 174. pBlueseript SK, pBsKS, pNHSa, pNHlóa, pNIHKa, pN 1146a (Stratagene®, La Jolla, CA): pTrc99A, pKK223-3. pKK233-3. pDR540. pRIT5 (Pharmacia®). Eukaryontní vektory: pWEneo. pSV2cat pOG44. is pXTI. pSG (Stratagene®) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVE (Pharmacia®). Může se použít libovolný jiný vektor nebo plazmid, pokud je replikovatelný v hostiteli a pokud je pro něj také vhodný.

Promotorové oblasti se mohou vybrat z libovolného požadovaného genu za použití vektorů CAT (chloramfenikol transferáza) a jiných vektorů se selektovatelnými markéry. Dva vhodné vektory jsou pKK232 S a pCM7. Zvláště jmenované bakteriální promotory zahrnují lad. lacZ, T3, SP6, co T7, gpt, lambda P sub R. P sub L, P sub L a trp. Eukaryontní promotory zahrnují časný promotor cytomegaloviru (CMV), thymidin kinázu viru herpes simplex (HSV). časný a pozdní promotor

SV 40. promotor LIR z retrovirů a myší metal lot hioncin-E Způsob selekce vhodného vektoru a promotoru jc pro odborníka zřejmý.

V dalším provedení vynálezu se popisují hostitelské buňky obsahující shora popsaný konstrukt.

Hostitelskou buňkou může být buňka vyššího eukaryonta, jako je savčí buňka, nebo buňka nižšího cukaryonta. jako je kvasinková buňka, nebo hostitelskou buňkou může být prokaryonlní buňka, jako je bakteriální buňka. Zavedení konstruktu do hostitelské buňky se může ovlivnit transfekcí s fosforečnanem vápenatým, transfekci zprostředkovanou DEAE-Dextran nebo elektrosu poraď (E. Davis et al., „Basic Methods in Molecular Biology,“ 2^ntl edition. Appleton and Lang,

Pramount Publishing, East Norwalk, CT (1994)).

Konstrukty v hostitelských buňkách se mohou použít běžným způsobem za účelem produkce genového produktu rekombinantní sekvencí. V jiném případě polypeptidy podle vynálezu se mohou produkovat syntetickou cestou na běžných peptidových syntetizátorech.

Proteiny se mohou exprimovat v savčích buňkách, kvasinkách, bakteriích nebo jiných buňkách za kontroly vhodnými promotory. Bezbuněčné translační systémy se mohou také použít při produkci takových proteinů za použití RNA odvozených od DNA konstruktu podle vynálezu. Vhodné tn klonovací a expresívní vektory, které se mohou použít u prokaryontních a eukaryontních hostitelů, jak se popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Clon ing: A Laboratory Manual.

Second Edition, (Cold Spring I larbor. N.Y. 1989).

Transkripce DNA, která kóduje polypeptidy podle vynálezu, ve vyšších eukaryontcch se zesiluje 45 inzercí sekvence zesilovače do vektoru. Zesilovače jsou cis-působící elementy DNA. jejichž obvyklá velikost je od 10 do 300 bp. a které působí na promotor, a tím zesilují transkripci. Příklady zahrnují zesilovač SV40 na pozdní straně počátku replikace (bp 100 až 270), zesilovač časného promotoru cytomegaloviru, zesilovač na pozdní straně počátku replikace polyoma viru a adenovirové zesilovače.

Rekombinantní expresívní vektory' budou obecné zahrnovat počátky replikace a volitelné markéry, které umožňují transformaci hostitelské buňky, například gen rezistence na ampicilin bakterie E. coli a gen TRPÍ S.cerevisiae a promotor ze silně exprimovaného genu, aby řídili transkripci downstream strukturní sekvence. Lakové promotory' se mohou odvodit z operonů.

kterc kódují gly kolvtické enzymy, jako je mezi jinými 3 fosfoglycerátkináza (PGK), faktor alfa.

-20 CZ 300141 B6 kyselá fosfatáza nebo proteiny teplotního šoku. Heterologní strukturní sekvence je uspořádána ve vhodné fázi s iniciačními a terminačními sekvencemi translace a je výhodné, aby vedoucí sekvence byla schopna řídit sekreci translatovancho proteinu do periplazmatického prostoru nebo do extracelulárního média. Heterologní sekvence může kódovat fúzní protein, který zahrnuje N5 terminální identifikační peptid. jenž propůjčuje fúznímu proteinu požadované charakteristiky, např. stabilizaci nebo zjednodušené čištění exprimovaného rekombinantního produktu.

Expresní vektory použitelné u bakterií se konstruují inzercí strukturní sekvence DNA. která kóduje požadovaný protein dohromady s vhodnými iniciačními a terminačními signály translace io v operabilitě čtecí íázi s funkčním promotorem. Vektor bude obsahovat jeden nebo více fenotypických volitelných markérů a původ replikace, aby se zaručilo udržení vektoru a, jestliže je to nutné, vektor umožní amplifikací v hostiteli. Mezi vhodné prokaryontní hostitele pro transformaci patří E.coli, ftucillus subfili.s, Sahnomdla typhiniurin a různé species rodu Eseudomonas,

Streptomyces a Staphylococcus. V praxi se však mohou také použít jiné druhy.

Použitelné expresí vní vektory v případě bakterií obsahují volitelný markér a bakteriální počátek replikace, který'je odvozen z plazmidu obsahujících genetické elementy dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC370I7). Jiné vektory zahrnují na PKK223-3 (Pharmacia® Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) a GEMI (Promega Biotec, Madison, Wl). Tyto základní sekce

2o plazmidu pBR322 se kombinují s vhodným promotorem a strukturní sekvencí, která sc má exprimovat.

Použitelné expresívní vektory mohou laké obsahovat fúzního partnera, který' umožňuje jednoduché čištění žádaných polypeptidů vynálezu nebo pro produkci rozpustných polypeptidů. Příklady dostupných fúzních vektorů zahrnují vektor pE132a (Novagen, Madison. Wl). pGEX-4T-2 (Pharmacia®) a pCYB3 (New' England Biolabs, Beverly, MA). Za účelem dosáhnout vysokého stupně exprese peptidovýeh fragmentů nebo fúzních proteinů smyčky 5 v bakteriálních buňkách se mohou konstruovat expresívní vektory, které brání použití fúzních partnerů. Vektory' se například mohou připravit tak, aby se optimalizovalo translační párování, jak popisuje Pilot-Matias, T.

J., et al., in Gene, 128: 219-225 (1993). zde je uvedeno jako odkaz. V jiném případě póly nukleotid podle vynálezu se může exprimovat dohromady se separovaným připojeným plazmidem. který kóduje protein nebo peptid napomáhající rozpustnosti prvního peptidu (Makridcs, S. C., Microbiological Reviews. 60: 512 (1996)). Jisté peptidové fragmenty smyčky 5 (které vykazují produkci rozpustných fúzních proteinů s thioredoxinem (příklad 20)) se například mohou expri35 movat z nefúzního vektoru současně (to znamená ve stejné hostitelské buňce) jako druhý vektor, jenž exprímuje thioredoxin.

Následuje transformace vhodného hostitelského kmene a jeho kultivace až do dosažení vhodné optické hustoty buněk, přičemž vy braný promotor se potlačuje vhodným způsobem (např. posuto nem teploty nebo chemickou indukcí) a kultivace buněk pokračuje. Buňky sc v typickém případě shromáždí centrifugách buněčná stěna sc poruší fyzikálním nebo chemickým způsobem. Vzniká surový extrakt, který sc podrobí dalšímu čištění. Mikrobiální buňky, které sc používají při expresi proteinů se mohou porušit libovolnou z běžných metod. Mezi tyto metody patří cyklus rozmražení a zmrazení, sonikace, mechanické rozrušení nebo použití lyžujícího činidla; takové metody jsou dobře známy v oboru.

Při expresi rekombinantního proteinu se také mohou použít různé kultivační systémy savčích buněk. Příklady savčích expresívních systémů zahrnují buněčné linie COS-7, což jsou fibroblasty opicích ledvin popsané v publikaci Gluzman, Cell 23: 175 (1981) a jiné buněčné linie

5d schopné exprimovat kompatibilní vektor, jako je Cl27, 3T3. CHO, HeLa a BHK. Savčí expresívní vektory obsahují počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač a také. je-li to nezbytné, ribozomální vazebná místa, po lyadeny lační místo, donorová a akceptorová místa sestřihu, term i načni sekvence transkripce a nepřepisované sekvence lemující 5'-konec. Za účelem získání požadované nepřepisovaných genetických elementů se mohou použít sekvence DNA odvozené z virového genomu SV40. např. počátek replikace SV40. časný promotor, zesilovač, polyadeny-21 CZ 300141 B6 lační místa a místa sestřihu. Mezí reprezentanty použitelných vektorů patří pRc/CMV a pcDNA3 (které jsou dostupné u firmy Invitrogen. San Diego, CA).

Vynález dále popisuje genovou terapii, přičemž u pacienta se reguluje gen kódující peptidové fragmenty smyčky 5 nebo peptidové fragmentovc konjugáty smyčky 5. Různé metody, které umožňují transfer nebo zavádění DNA do bunčk za uceleni exprese proteinového produktu genu. což se označuje jako genová terapie, se popisují v publikaci Gene Transfer into Mammalian Samatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotcchn. 12(4): 335-356 (1992), zde je uvedeno jako odkaz. Genová terapie zdůrazňuje i n korporaci póly nukleotidových sekvencí do somatických io buněk nebo do linie zárodečných buněk, eož se dále využívá buď při terapii ex vivo. nebo in vivo. Při genové terapii dochází k výměně genů, aby se dosáhlo normální nebo abnormální genové funkce a dalo se vzdorovat infekčnímu onemocnění a jiným infekčním agents.

Strategie léčby zdravotních problémů pomocí genové terapie zahrnuje terapeutické strategie, jako je identit!kace detektivního genu a pak přidání funkčního genu, který bud¹ nahradí funkci defektního genu nebo posílí slabě fungující gen. Nebojsou to protylaktické strategie, jako je adice genu. který kóduje proteinový produkt, fento proteinový produkt se použije při léčbě patologických stavů nebo umožní, aby tkáně a orgány byly citlivější na režim léčby. Příkladem profýlaktické strategie jc, že se gen kódující peptidový fragment smyčky 5 nebo konjugát peptidového fragmentu smyčky 5 zavede do pacienta, čímž se předchází výskytu angiogeneze, nebo se do pacienta může zavést gen, čímž se nádorové buňky mohou stát citlivější k záření, což znamená, že při ozáření nádoru odumře více nádorových buněk.

V tomto vynálezu se popisuje řada protokolů, jenž se používají při transferu DNA kódující pepli25 dový fragment smyčky 5 nebo fúzní protein smyčky 5 nebo při transferu regulačních sekvencí DNA peptidového fragmentu smyčky 5 (nebo regulačních sekvencí fúzních partnerů). Genová terapie podle vynálezu také zahrnuje transfekci promotorových sekvencí jiných než jsou ty spojené s peptidovým fragmentem smyčky 5 nebo jiných sekvencí, které zvýší produkci peptidových fragmentů smyčky 5. Příklad této technologie lze nalézt v publikaci Transkaryoiic Therapies,

3o lne., of Cambridge, Massachusetts. Pro inzerci ..genového přepínače“ se používá metoda homologní rekombinace, která umožňuje přepínání genu erytropoitinu v buňkách, jak se popisuje v publikaci Genet ic bngineering News. Apríl 15, 1994. zde je uvedeno jako odkaz. Takové genové přepínače se mohou použít při aktivaci peptidového fragmentu smyčky 5 (nebo receptorů smyčky 5) v buňkách, které normálně uvedené proteiny neexprimují.

Metody transferu genů při genové terapii se dělí do tří kategorií: (I) fyzikální (např. elektroporace. přímý přenos genů a bombardování částicemi) (2) chemické (např. nosiče založené na lipidech a jiné nevirové vektory) a (3) biologické (např. vektory' odvozené od virů). Například nevirové vektory, jako jsou lipozomy potažené DNA, se mohou do pacienta zavést přímo intra40 venózní injekcí. Věří se. že komplexy lipozom/DNA se koncentrují v játrech, kde DNA vstupuje do makrofágů a Kupfíerových buněk. Vektory nebo jiná „nahá“ genová DNA se může také přímo zavést injekcí do požadovaného orgánu, tkáně nebo nádoru za účelem cíleného zavádění terapeutické DNA.

Metodologie genové terapie se také popisuje místem zavedení. Základní způsob zavedení genů zahrnuje transfer genu ex vivo, transfer genu in vivo a transfer genu in vitro. Při transferu genu ex vivo se buňky odeberou z pacienta a kultivují se v kultuře. Buňky se transfekují DNA a transfekované buňky se pomnoží a implantují se zpět do pacienta. Při genovém transferu in vivo transformované buňky jsou buňky rostoucí v kultuře, jako jsou buňky tkáňových kultur, a ne určíte buňky z určitého pacienta. Tyto „laboratorní buňky“ se transfekují, izolují se transfekované buňky, pomnoží se a implantují se zpět do pacienta nebo se použijí pro jiné účely. Transfer genu in vivo zahrnuje zavedení DNA do buněk pacienta, kdy buňky neopouštějí tělo pacienta. Všechny tři shora popsané kategorie se mohou použít při transferu genu in vivo. ex vivo a in vitro.

- 22 CZ 300141 B6

Mechanické (to je fyzikální) metody zavedení DNA jsou mikroinjckce DNA do zárodečných nebo somatických buněk, pneumatické zavedení partikul] potažených DNA, jako jsou částice zlata, které se používají v tzv. „genových zbraních přístupy z anorganické chemie, jako je například transfekce fosforečnanem vápenatým. Zjistilo se. že pomocí fyzikální injekce plazmidové

DNA do svalových buněk dochází k transfekci velkého procenta buněk a uvedené brníky vykazují stálou expresi markerových genu. Plazmidová DNA se může nebo nemusí integrovat do genomu buněk. Jestliže nedojde k začlenění transfekované DNA, umožňuje to transfekci a expresi genových proteinových produktů v termínálně diferenciovaných, neproliterovaných tkáních po prodlouženou dobu bez nebezpečí mutovaných inzercí, delecí nebo změn v buněčném nebo mitoio chondriálním genomu. Dlouhodobý, ale ne nezbytně trvalý transfer terapeutických genů do specifických buněk, umožňuje léčbu genového onemocnění nebo použití při profylaxi. DNA se může zavádět injekcí periodicky, aby se udrželo množství genového produktu, aniž se v genomech recipientních buněk objeví mutace. Jestliže se exogenní DNA nezačlení, je možná přítomnost několika konstruktů exogenní DNA v jedné buňce s lim. že všechny konstrukty exprimují různé ís genové produkty.

Transfer genu zprostředkovaný částicemi se může použít pro injektování DNA do buněk, tkáně a orgánů. Jestliže se používají přístroje pro bombardování částicemi nebo tzv. ..genové zbraně, generuje se rychlost, aby se part i ku lim s vysokou hustotou, potaženým DNA (vhodným materiá20 lem pro partikule jsou zlato a wolfram) udělila vysoká rychlost, která jim umožní vstoupit do cílových orgánů, tkání a buněk. Elektroporace, která je vhodná při transferu genu. používá elektrický proud, aby se buňky nebo tkáně staly přístupné transferu genu. Používá se krátký elektrický impuls s daným silovým polem, aby se zvýšila permeabilita membrány takovým způsobem, že molekuly DNA mohou vniknout do buněk. Způsoby transferu genu prostřednictvím par25 tikulí a elektroporace jsou dobře známy v oboru.

Chemické metody genové terapie zahrnují transfer genu zprostředkovaný nosičem za použití fúzogenních lipidových partikulí, jako jsou lipozomy nebo jiné nosiče pro membránovou fúzí. Nosič nesoucí požadovanou DNA může být vhodně začleněn do tělních tekutin nebo do krevního řečiště a pak je místně specificky řízen do cílového orgánu nebo tkáně v těle. Muže se například vyvinout buněčně nebo orgánově specifická DNA, kterou nesou lipozomy a která je absorbovaná těmito specifickými buňkami. Injekce imunolipozomů, které jsou cílené na specifický receptor na určitých buňkách se může použít jako vhodná metoda inzerce DNA do buněk nesoucích receptor. Jiným použitelným nosičovým systémem je asialoglykoprolein/polylysin konjugační systém, který je vhodný pro zavedení DNA do hepocytů při transferu genu in vivo.

Translekovaná DNA může být také v komplexu s jinými druhy nosičů tak. žc DNA se zavede do recipientní buňky, a pak se uloží do cytoplazmy nebo nukleoplazmy. DNA se může párovat s nosičovými jadernými proteiny ve specificky připravených komplexech a vnáší se tak přímo do jádra.

hran sfér genu zprostředkovaný nosičem může také zahrnovat použití sloučenin na bázi lipidů, které nejsou lipozomy. Lipofektiny a eytofekliny jsou pozitivní ionty na bázi lipidů, které se váží na negativně nabitou DNA, a tvoří komplex umožňující přenést DNA skrz buněčnou membránu,

4? Jiným způsobem transferu genu zprostředkovaným nosičem je endoeytóza založená na receptorů. Při této inetodč sc vytvoří komplex ligand (který je specifický pro buněčný povrchový receptor) s genem a ten se pak injekcí zavede do krevního řečiště. Cílové buňky, které pak mají buněčný povrchový receptur, se budou specificky vázat na ligand a dochází ke transportu komplexu DNA-ligand do buňky.

Biologické metody gertové terapie používají pro zavedení genů do buněk virové nebo nevirové vektory⁷ (jako konjugáty ligand-DNA. lipozomy a shora uvedené komplexy ligand-DNA). Transfekované buňky mohou být buňky získané z normální tkáně pacientů, pacientovi nemocné tkáně nebo z buněk, které nepocházejí z pacienta.

-23CZ 300141 B6

Může byt žádoucí, aby rekombinantní molekula DNA obsahující sekvenci DNA peptidového fragmentu smyčky 5 nebo sekvenci DNA fúzního proteinu smyčky 5 byla operabilitě spojena s expresívní kontrolní sekvencí za vzniku expresívního vektoru schopného exprimovat peptidový fragment nebo fúzní protein smyčky 5. V jiném případě genová regulace peptidového fragmentu smyčky 5 nebo fúzního proteinu smyčky 5 se muže uskutečnit aplikací sloučenin, které se váží na gen smyčky 5. fúzní partnerský gen nebo kontrolní oblasti spojené s genem smyčky 5 nebo genem jeho fúzního partnera nebo se váží na odpovídající transkript RNA za účelem modifikace rychlosti transkripce nebo translace.

Virové vektory, které se používaly podle protokolů metod genové terapie, zahrnují, ale nejsou omezen v na retro viry, jiné RNA viry; jako jsou poliovirus nebo virus Sindbis, adenovirus, adeno-asociované viry, herpes virus. SV 40. virus vakcinie a jiné DNA viry. Jako transferové vektory genů se mohou také využívat replikačně defekt ní myší retrovirové vektory. Retro viry' myší leukemie tvoří jednořetězcová RNA, která je v komplexu s proteinem jaderného eore a polymerázovými (pol) enzymy. Komplex je opouzdřen proteinovým eorc (gag) a obklopen glykoproteinovým obalem (env). který určuje rozmezí hostitelů, Genomová struktura retrovirů zahrnuje geny gag, pol a env. které sousedí s 5' a Y dlouhými terminálními repeticemi (I.TR). Retrovirové vektorové systémy využívají skutečnost, že minimální vektor obsahující 5' a 3' L I R a balicí signál je dostatečný, aby umožnil balení vektoru a infekci a integraci do cílových buněk,

2o přičemž virové strukturální proteiny se dostávají in trans do balící se buněčné linie. Základními výhodami rctrovirových vektorů při transferu genů je účinná infekce a exprese genu ve většině buněčných typů, integrace vektoru do ehromozomální DNA cílové buňky s přesnou jedinou kopií a jednoduchá manipulace retrovirovcho genomu. Změněné retrovirové vektory se například používají při metodách ex vivo při zavedení genů do periferních a nádor infiltruj ících lymfocytů, hepatocytů. epidermálních buněk, myocytů nebo jiných somatických buněk (které se pak mohou zavést do pacienta, aby vznikl genový produkt z inzerované DNA).

Adenovirus tvoří lineární dvouřetězcová DNA. která je v komplexu s proteiny core a je obklopena kapsidovými proteiny. Výhody molekulární virologie spočívají ve schopnosti využít biologii so těchto organizmů pro vznik vektorů schopných transdukovat nové genetické sekvence do cílových buněk in vivo. Vektory založené na adeno virech vykazují silnou expresi genových peptidových produktů. Adenovirové vektory mají vysoce účinnou infekčnost, dokonce při nízkém titru viru. Navíc virus jc plně infekční ve formě bezhuněčných virionů. proto není nezbytné injektovat producenta buněčné linie. Jinou potencionální výhodou adenovirových vektorů je schopnost dosáhnout dlouhodobé exprese heterologních genů in vivo.

Virové vektory' se také používají pro inzerci genů do buněk za použití protokolů in vivo. Při řízení tkáňové specifické exprese cizích genů se mohou používat cis-působící regulační elementy nebo promotory; o kterých se ví, že jsou tkáňově specifické. V jiném případě toho lze dosáhnout použitím in silu zavedením DNA nebo virových vektorů do specifických anatomických míst in vivo. Přenosu genu do krevních cév in vivo se například dosahuje implantací in vitro transdukovaných endoteliálních buněk do vybraných míst na arteriálníeh stěnách. Okolní buňky infikované virem také exprimují produkt genu. Virový vektor se může zavést přímo do místa in vivo (například použitím katétru), což umožňuje virem infikovat pouze určité oblasti a dlouhotrvající místně specifickou genovou expresi. Také se demonstroval transfer genu in vivo za použití retro v i rových vektorů do savčí tkáně a hepat ické tkáně tak, že se do krevních cév, které prokrvují orgány; zavede pozměněný virus injekcí.

Peptidové fragmenty smyčky 5 se mohou také produkovat a použít při různých aplikacích.

5(i Například různé peptidové fragmenty smyčky 5 se mohou použil (1) jako agonisty a antagonisty; které jsou aktivní ve vazebných místech smyčky 5. (2) jako antigeny pro vývoj specifického antiséra, (3) jako peptidy při použití jako diagnostické kity a (4)jako peptidy spojené s cytotoxickými činidly nebo používané společně s cytotoxickými činidly za účelem cíleného usmrcování buněk, které vážou peptidové fragmenty smyčky 5, Aminokyselinové sekvence, které obsahují

5? uvedené peptidové fragmenty; mohou být vybrány na základě pozic bází v externích oblastech

-24C7. 300141 B6 molekuly, které jsou náchylné pro navázání antiséra nebo mají inhibiční účinnost peptidových fragmentů vůči procesům vznikajícím nebo exacerbovaným angiogenezi. Dále se tyto peptidové sekvence mohou srovnal sc známými sekvencemi za použití databáze proteinových sekvencí, jakoje GenBank. Brookhaven Protein. SWISS-PROT a PIR za účelem stanovení potencionální sekvenční homologie. Tyto informace umožňují eliminovat sekvence, které vykazují vysoký stupeň homologie s jinými molekulami, čímž se zvyšuje potenciál pro vysokou specifitu při vývoji antiséra, agonistů a antagonistú sc smyčkou 5.

Peptidové fragmenty a fúzní proteiny smyčky 5 se také mohou použít za účelem izolace recepto10 ru smyčky 5 imobil izací peptidového fragmentu nebo fúzního proteinu smyčky 5 na pevném povrchu například v afinitních kolonách, kterými kultivované endoteliální buňky nebo membránové extrakty procházejí. Jak je známo v oboru, izolace a čištění receptorů smyčky 5 může být následováno sekvenováním aminokyselin za účelem identifikace a izolace polynukleotidu. které kódují receptor smyčky 5. l akové polynukleotidy se pak mohou klonovat do vhodného expresív15 ního vektoru a transfekovat do nádorových buněk. Exprese receptorů transfekovanými nádorovými buňkami může zvýšit odezvu těchto buněk na endogenní nebo exogenní peptidové fragmenty smyčky 5. přičemž se snižuje rychlost růstu metastáz. Rekombinantní exprese tohoto receptorů dále umožňuje, aby se produkovalo větší množství receptorů. například, aby se produkovalo dostatečné množství pro test s vysokou propustností za účelem identifikace menších antážu gonistú, které mimiku jí účinky smyčky 5.

Systematická substituce aminokyselin těmito syntetizovanými peptidy vede ke vzniku agonistů peptidů a antagonistú reeeploru smyčky 5 se silnou afinitou, které podporují nebo zeslabují navázání peptidového fragmentu smyčky 5 na jeho receptor. l akových agonistů sc může použít při potlačení růstu mikrometastáz a tím omezit rozšíření rakoviny, V případech neadekvátní vaskular i zace mohou být, antagonisté peptidových fragmentů smyčky 5 se mohou aplikoval za účelem zablokování inhibičních účinků peptidových fragmentů smyčky 5 a podpoření angiogeneze. Tento typ léčby může mít například terapeutické účinky při podpoře hojení ran u diabetiků.

Peptidové fragmenty nebo fúzní proteiny smyčky 5 nebo konjugáty podle vynálezu se mohou také použít jako antigeny za účelem vzniku polyklonálních nebo monoklonálníeh protilátek, které jsou specifické pro inhibitor smyčky 5. Takové protilátky se mohou použít při diagnostických metodách a v kitech pro detekci nebo kvantifikaci peptidových fragmentů smyčky 5 v tělních tekutinách nebo tkáni. Výsledky tčehto testů se mohou použít pro diagnostiku nebo stanovení prognostické relevance peptidových fragmentů smyčky 5.

Peptidové fragmenty smyčky 5 nebo fúzní proteiny smyčky 5 se mohou značit radioaktivními izotopy (příklad 13) nebo se mohou chemicky připojit k proteinům za vzniku konjugátu. Konjugáty zahrnují enzymy, nosičové proteiny, eylotoxieká činidla, fluorescenční, chcmoluminiscenční

4o a bioluminiscenční molekuly, které se používají při provedení testu schopnosti látek, jenž obsahují peptidové fragmenty smyčky 5, vázat antiséra smyčky 5, detekovat buněčné typy vykazující receptor peptidového fragmentu smyčky 5 nebo napomáhat čištění peptidových fragmentů smyčky 5. Metoda kondenzace se vybrala na základě funkčních skupin dostupných na aminoskupinách sekvence peptidového fragmentu smyčky 5, které zahrnují alkylovou skupinu, aminosku45 pinu, sulfhydrylovou. karboxylovou. amidovou, fenolovou, indolylovou a imidazoy lovou skupinu. Různá činidla, která se používají, aby ovlivnila párování, zahrnují mezi jinými glutaraldehyd. diazotizovaný benzidin, karbodiimidy a p-benzochinon. Účinnost párovací reakce se stanovila použitím různých metod vhodných pro specifickou reakci. Radioaktivní značení peptidů smyčky 5 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu například pomocí l'~ se může provést použitím chloraminu T a NaI^L' s vysokou specifickou aktivitou. Reakce se ukončí metabisiřičitanem a ze směsi se odstraní sole na kolonách najedno použití. Značený peptid je eluován z. kolony a shromáždí se frakce. 7 každé frakce se odeberou alikvoty a radioaktivita se měří na gama počítači. Tento postup poskytuje radioaktivně značený peptidový fragment smyčky 5 bez nezrcagovancho Nal^l?\ V jiném provedení vynálezu se krevní nebo tkáňový extrakt obsahující peptidový trag55 ment smyčky 5 spojený se smyčkou 4 může čistit na afinitní koloně s polylysinovou pryskyřicí.

-25 CZ 300141 B6 přičemž peptidový fragment smyčky 4 - smyčky 5 se váže na pry skyřici prostřednictvím afinity peptidového fragmentu smyčky 4 pro lysin. Eluce vázaného proteinu poskytne čištěný fragment smyčky 4 - smyčky 5,

Jiná aplikace peptidového konjugátu je produkce polyklonálního antiséra. Produkce anti séra proti peptidovým fragmentům smyčky 5, analogům peptidových fragmentů smyčky 5 a receptorů smyčky 5 se muže provést za použití zavedené metody dobře známé v oboru. Peptidové fragmenty smyčky 5 obsahující lysínové zbytky se mohou spojit k čištěnému bovinnímu sérovému albuminu (BSA) za použití glutaraldehydu. Účinnost této reakce sc může určit měřením ínkorpoio race radioaktivně značeného peptidu. Nezreagovaný glutaraldehyd a peptid se může separovat dialýzou a konjugál se může použít pro přípravu polyklonálního antiséra v králících, v ovcích, v kozách nebo v jiných zvířatech. Peptidové fragmenty smyčky 5 konjugované s molekulou nosiče, jako je BSA. se muže kombinovat se směsí adjuvans, emulgovat a zavést podkožní injekcí do několika míst na zádech, krku, boku a někdy do tlapek vhodného hostitele. Opakované injekce se i? aplikují v pravidelných intervalech, každé 2 až 4 týdny. Přibližně 7 až 10 dnů po každé injekci. Vzorky se získávají z cév například po dilataci marginálních cév. Vzorky krve se nechávají srážet přes noc při teplotě 4 °C a centrifugují se přibližně při 2 400 X g při teplotě 4 °C po dobu 30 minut. Sérum sc izoluje, rozdělí se do alikvotíi a skladuje se při teplotě 4 °C. jestliže se má použil bezprostředně pro následnou analýzu nebo při teplotě 20 až 90 °C.

Vzorky séra, které vznikly při přípravě polyklonálního antiséra, nebo vzorky média odebrané při produkci monoklonálního antiséra se mohou analyzovat za účelem stanovení titru protilátek, zvláště při stanovení vysokého titru protilátek. Pak se testuje nejvyšší titr antiséra peptidového fragmentu smyčky 5, aby se zjistily následující hodnoty: a) optimální ředění antiséra, při kterem dochází největšímu specifickému navázání antigenů a také k jeho nejmenšímu nespecifickému navázání, b) schopnost vázat zvýšená množství peptidových fragmentů smyčky 5 na standardní substituční křivce, c) potenciální zkřížená reaktivita s příbuznými peptidy a proteiny, které zahrnují plazminogen a peptidové fragmenty příbuzných species a d) schopnost detekovat peptidové fragmenty smyčky 5 v buněčném kultivačním médiu a v extraktech plazmy, moče a tkáně. Titr se so muže stanovit několika způsoby, které jsou dobře známy v oboru, je to například ,.dot biot“ a analýza hustoty a také precipitací radioaktivně značeného komplexu peptid protilátka za použití proteinu A. sekundárního proti séra, chlazeného etanolu nebo aktivní uhlí-dextran. Pak následuje měření aktivity na gama počítači. Je-li to nutné antisérum s nejvyšším titrem se může dále čistit na afinitníeh kolonách. Peptidové fragmenty smyčky 5 se například mohou spojovat s běžně dostupnými pryskyřicemi a mohou se použít při tvorbě afinitníeh kolon. Vzorky antiséra pak mohou procházet přes kolonu tak. že protilátky smyčky 5 se vážou (prostřednictvím peptidových fragmentů smyčky 5) na kolonu. Tyto navá/anc protilátky se následně cluuj i. izoluj i a stanovuje se hodnota titru a specifita.

Vynález dále popisuje kity pro měření peptidových fragmentů smyčky 5 a receptor smyčky 5. Antiséra, která mají nejvyšší titr a spéci fitu a mohou detekovat peptidové fragmenty smyčky 5 v extraktech plazmy, moče. tkáni a buněčného kultivačního média, se mohou použít jako testovací kity pro rychlé, vhodné, citlivé a specifické měření a lokalizaci peptidových fragmentů smyčky 5. Uvedené testovací kity se mohou použít, ale nejsou omezeny na následující metody: kompetitivní

4? a někom petit ivn i testy, rádio i mu no logické testy, bioluminiscenční a chemoluminisccnční testy, fluorometrické testy, sendvičové testy, dot bloty. testy navázaných enzymů, mezi něž patří ELISA, testy na mikrotitračních destičkách, imunoeytocheinické testy a stripy potažené protilátkami nebo papírky pro ry chlé vy šetření moče nebo krve. V případě každého kitu je nutné stanovit rozmezí, citlivost, přesnost, vhodnost, spec i fitu a reprod uko vatě I nost stanovení způsoby, které jsou dobře známy v oboru.

Příkladem testovacího kitu, který' se běžně užívá ve výzkumu a při klinické praxi je kit pro radioinuinologieký test (RIA). RIA s peptidovým fragmentem smyčky 5 se může stanovit následujícím způsobem: Po úspěšné radiojodinaci a čištěni peptidového fragmentu smyčky 5 sc přidají

5? do zkumavek obsahujících relativně konstantní množství radioaktivity, jako je 10 000 cpm. ve

-26CZ 300141 Bó vhodném sytému pufru v několika ředěních protilátky proti peptidovému fragmentu smyčky 5.

(Pufr nebo preimunitní sérum se přidá do jiných zkumavek za účelem stanovení nespecifického navázání.) Po inkubaci při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin se do všech zkumavek přidá protein A a zkumavky sc míchají na vortexu, inkubují se při teplotě místnosti po dobu 90 minut a centrifugují se přibližně při 2000 až 2500 X g při teplotě 4 °C k precipitaci komplexu protilátky navázané na značeném antigenů. Supernatant se odsál a radioaktivita pelet se stanovila na gama počítači. Za účelem další charakterizace se vybralo ředění antiséra. které váže přibližně 10 až 40 % značeného peptidu po odečtení nespecifického navázání.

io Dále rozmezí ředění (přibližně OJ pgaž 10 ng) peptidového fragmentu smyčky 5. které se používá při přípravě antiséra, se hodnotí přidáním známého množství peptidu do zkumavek, které obsahují radioaktivně značený peptid a antisérum. Po inkubační době (např. 24 nebo 48 hodin) se přidá protein A a zkumavky se centrifugují. Dále se odstraní supernatant a určí se radioaktivita peletu. Substituce navázání radioaktivně značeného peptidového fragmentu smyčky 5 za nezna15 ěený peptidový fragment smyčky 5 vykazuje standardní křivku. Navíc se do testovacích zkumavek miiže přidat několik koncentrací dalších peptidových fragmentů smyčky 5. plazminogenů. peptidovýeh fragmentů smyčky 5 / různých species a homologní peptidy za účelem charakterizace specifity antiséra proti peptidovému fragmentu smyčky 5.

Extrakty různých tkání zahrnují, ale nejsou omezeny na primární a sekundární nádory; Lewisuv karcinom plic, kultury buněk produkujících peptidový fragment smyčky 5. placentu, dělohu a jiné tkáně, jako je mozek, játra a střeva, které se připraví způsobem, jenž se úspěšně použil při extrakci peptidových fragmentů smyčky 5. Po přípravě extraktů tkáně se přidá testovací pufr a různé alikvóty se dají do zkumavek určených pro test RIA. Extrakty buněk produkujících pepti75 dový fragment smyčky 5 vykazují substituční křivky; které jsou paralelní ke standardní křivce, zatímco extrakty tkání, které neprodukují peptidové fragmenty smyčky 5, nesubstituují radioaktivně značené peptidové fragmenty smyčky 5 z antiséra proti peptidovému fragmentu smyčky 5. Takové substituční křivky indikují využití testu peptidového fragmentu smyčky 5 pro měření množství peptidových fragmentů myčky 5 v tkáních a tělních tekutinách.

Tkáňové extrakty, které obsahují peptidové fragmenty smyčky 5, se mohou také charakterizovat na HPI.C s reverzní fází. Shromáždily se eluované frakce, sušily se na zařízení Speed Vac, rekonstituovaly se v pufru RIA a analyzovaly se v testu RIA pro smyčku 5. V tomto případě se maximální množství imunoreaktivity peptidového fragmentu smyčky 5 nachází ve frakcích, které odpovídají pozici eluce peptidového fragmentu smyčky 5.

Shora popsaný testovací kit obsahuje instrukce, antisérum, peptidový fragment smyčky 5 a je možné, aby obsahoval radioaktivně značený peptidový fragment smyčky 5 a/nebo činidla pro precipitaci komplexů peptidový fragment smyčky 5/protilátka smyčky 5. lakový kit se může použít pro měření peptidových fragmentů smyčky 5 v biologických tekutinách a tkáňových extraktech zvířat a lidí s nebo bez. nádorů.

Jiný kit se může použít pro vizualizaci nebo lokalizaci peptidových fragmentů smyčky 5 v tkáních a buňkách, Imunohistoehemické metody a kity; ve kterých se používají takové metody, jsou dobře známy v oboru. V oboru je také známo, že imunohistoehemické kity obsahují antisérum proti peptidovému fragmentu smyčky 5 a pravděpodobně blokovací sérum a sekundární antiscruni spojené s fluorescenční molekulou, jako je fluoreseinizolhiokyanát nebo s jiným činidlem, které se používá při vizualizaci primárního antiséra. Za použití této metody se mohou u biopsii nádorů testovat místa, která produkují peptidový fragment smyčky 5 nebo místa receptorů pepti50 dového fragmentu smyčky 5. V jiném případě kit obsahuje radioaktivně značené nukleové kyseliny; které se používají při in šitu hybridizaci jako sondy pro mediátorovou RNA peptidového fragmentu smyčky 5.

l átky podle vynálezu se mohou připravoval za použití postupu dobře známého v oboru (např.

Sottrup—Je nsen et al., Progress in Chemical Fibrinolvsis and 4 hrom boly sis. Vol. 3. Davidson. J.

-27 CZ 300141 B6

F.. Rowan, R. M., Samama, M.M. and Desnoyers, P.C. editors, Raven Press. New York, 1978).

Jedním způsobem, jak připravit peptidové fragmenty smyčky 5. je enzymatické štěpení nativního proteinu (glu-plazminogen) nebo jeho variant (což znamená zkrácená forma proteinu v plné délce, který je schopný být štěpen enzymy a který obsahuje nejméně sekvenci smyčky 5, jak se definuje shora v textu, jako je lys-plazminogen nebo miniplazminogen). Tato metoda nejdříve vyžaduje izolaci proteinu z lidské plazmy, aniž jsou přítomny inhibitory plazminu, přičemž se podporuje konverze glu plazminogenu na lys- plazminogen (Novokhatny, V. and Kudinov, S.A., J. Mol. Biol. 179: 215-232 (1984), Následně je zkrácená molekula ošetřena proteolytickým enzymem v koncentraci, která je dostatečná pro štěpení peptidových fragmentů smyčky 5 z io polypeptidu, a pak se čistí od zbývajících fragmentů způsobem, jenž je dobře znám v oboru. Preferovaným proteolytickým enzymem je lidská nebo prasečí elastáza, která štěpí plazminogen a jeho zkrácené varianty mezi oblastmi smvěky 3 až 4 a 4 až 5 (a tím je schopná tvořit peptidové fragmenty, které obsahují smyčky 1 až 3 a 1 až 4 nebo samotné smyčky 4 nebo 5). Lys-plazminogen nebo glu-plazminogen se může například ošetřit prasečí nebo lidskou neutrofylelastázou v poměru okolo 1 : 100 až 1 : 300 lys-plazminogenu : elastáze (upřednostňuje se poměr 1 : 150 až 1 : 250 a více sc upřednostňuje poměr l : 150 v roztoku pufru, jako je Tris-HCI, NaCI, fosforečnan sodný a podobně). V jiném případě se může nejdříve imobilizovat (například na pryskyřici), aby proběhla purifikaee štěpeného produktu. Glu plazminogen nebo lys plazntinogen se obecně ošetřuje lidskou nebo prasecí elastázou při teplotách, které leží v rozmezí od přib20 ližnč 10 do přibližně 40 °C a po dobu od přibližně 4 do přibližně 24 hodin v závislosti na požadovaném rozsahu štěpení. Za účelem dosažení celkového štěpení glu-plazminogcnu, Ivs-plazminogenu nebo miniplazminogenu lidskou nebo prasečí elastázou je nutné, aby enzym na polypeptidy působil nejméně okolo 12 hodin při teplotě místnosti, Kolísavé pH a doba expozice vede k minimálnímu nebo částečnému Štěpení jednoho nebo více přístupných štěpících míst. Produkty štěpení se pak čistí libovolným způsobem, jenž je dobře znám v oboru (jako je například kolonová chromatografie). Preferované schéma čištění zahrnuje aplikaci produktů štěpení na lysin— sepharosovou kolonu, jak se popisuje v příkladu 14.

o Příklady provedení vynálezu

Syntéza peptidových fragmentů smyčky 5 na pevné fázi.

Následující příklady mají sloužit k další ilustraci přípravy nových sloučenin vynálezu.

Příklad 1

N - Ac - Val - Leu - Leu - Pro - Asp - Val - Glu - Thr - Pro - Ser - Glu - Glu - Asp - NH_?

Kolona pro syntézu amidu peptidu (Applied Biosystems) se umístila do Perkin Elmer/Applied Biosynthesis „Synergy syntetizátoru peptidu a použily se následující syntetické stupně:

1. Solvataee pryskyřice s DMF po dobu 5 minut;

2, Odstranění skupiny Fmoc z α-N-konce aminokyseliny vázané na pryskyřici za použití 20 % piperidinu v DMF po dobu okolo 15 minut;

3, Promývání pryskyřice s DMF po dobu okolo 15 minut;

4. Aktivace ot-C-konce aminokyseliny č. 1 (Fmoc Asp(B-O’Bu). 25 pmol) za použiti 0,2 M roztoku 11 BIU (25 pmol) a HOBT (25 pmol) v DMSO NMP (N metyl pyrrol idin) a 0,4 M roztoku diizopropylethylaminu (25 pmol) v DMSO - NMP a navázání aktivované aminokyseliny na pryskyřici;

CZ 3UU14I 136

5. Spojení aktivované aminokyseliny chráněné skupinou Fmoc (připravené v kroku 5) s aminokyselinou vázanou na pryskyřici (připravenou v kroku 2) v roztoku DMF po dobu přibližně minut:

6. Promývání s DMF po dobu 5 minut;

7. Opakování kroku 3 až 6 s následujícími aminokyselinami; ě. aminokyselina

2. r moc-G 1 ιι(γ-Ο^τ Bu) io 3. Fmoc Glu(y-O'Bii)

4. Fmoc-SerfBu)

5. Fmoc- Pro

6. Fmoe-Thr(^lBu)

7. Fmoc-Glu(y-O'Bu) i? 8. Fmoc-Val

9. Fmoc Asp(pM)‘Bu)

10. Fmoc-Pro

11. Fmoc-Leu

12. Fmoc-Leu 2o 13. Fmoc-Val

8. Spojení kyseliny octové s α-N-koncem peptidu vázaného na pryskyřici za podmínek uvedených v kroku 4 a 5.

9. Promývání pryskyřice s THE po dobu okolo 5 minut, aby se odstranilo DMI . sražení pryskyřice, sušení pryskyřice v atmosféře argonu po dobu 10 minut a v atmosféře dusíku po dobu dalších 10 minut za vzniku čistého peptidu vázaného na pry skyřici.

10. Odštěpení peptidu z pryskyřice, přičemž dochází k odstranění chránících skupin z vedlejšího .to řetězce aminokyseliny smícháním se štěpícím činidlem (čerstvé připravený thioanisol (100 μ|), voda (50 μΙ), ethandithiol (50 μΙ) a kyselina trífluorooctová (1,8 ml) při teplotě 5 až -10 °C) při teplotě 0 °C po dobu 10 až 15 minut a pak při teplotě okolí po dalších 1.75 hodiny (plus další půl hodiny pro každý Arg(Pme), je li přítomen). Množství použitého štěpícího činidla se stanoví podle následujícího vzorce:

hmotnost pryskyřice s vázaným peptidem (mg)	množství štěpícího činidla (μθ
0 až 10	100
10 až 25	200
25 až 50	400
50 až 100	700
100 až 200	1 200

11. Filtrace a promytí produktu s neředěnou kyselinou trifluoroctovou, přidání filtrátu v 0,5 ml podílech do centrifugaění zkumavky, klerá obsahuje přibližně 8 ml chladného dictylctcru. cenlrifugace a dekantace. Proces se opakuje až se vysráží všechny peptidy (jestliže se všechny peptidy po přidání éteru nevysrážely, směs se extrahuje 30 % vodnou kyselinou octovou (3 x I ml) a spojené vodné extrakty se lyofilizovaly za vzniku produktu).

-29CZ 300141 B6

12. Použití surového peptidu nebo čištěného peptidu na HPLC (za použití 7 μηι Symmetry Prep

Cl8 kolonx (7,8 x 300 mm) se směsí rozpouštědel s gradientem od 5 % do 100 % acetonitriHvoda. 0.1 % TPA) po dobu 50 minut, pak následuje lyofílizace za vzniku 35 mg N - Ac

- Va! - Leu - Leu - Pro - Asp - Val - Glu Thr - Pro - Ser - Glu - Glu - Asp -Nil·

Příklad 2

N - Ac - Met - Phe - Čily - Asn - Gly - Lys - Glv —Tyr - Arg - Gly -Lys Arg - Ala - Thr io thr Val - Thr-Gly - Thr Pro - NH₂

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Pro. Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

i? č. aminokyselina

2. Fmoc-Thr('Bu)

3. Fmoc-Gly

4. Fmoc-Thr(‘Bu)

5. Fmoc-Val

2o 6. Fmoc-Thr(’Bu)

7. Fmoe-Thr(’Bu)

8. Fmoc-Ala

9. Fmoc Arg(Pmc)

10. Fmoc-Lys(Boc)

11. Fmoc-Gly

12. Fmoc-Arg(Pmc)

13. Fmoc-Tyr(‘Bu)

14. Fmoc-Gly

15. Fmoc-Lys(Boc)

5o 16. Fmoc-Gly

17. Finoc-Asn(Trt)

18. Fmoc-Gly

19. Fmoc Phe

20. Fmoc-Met za vzniku 35 mg N - Ac - Met - Phe Gly Asn - Gly - l.ys - Gly -Tyr - Arg Gly -Lys Arg - Ala - Thr - Thr - Val - Thr - Gly - t hr -Pro - Nl F

Příklad 3 to

Ac - Gin - Asp - Trp - Ala - Ala - Gin - Glu - Pro - His - Arg - His - Ser - Ile - Phe ThrPro - Glu - Thr - Asn - Pro Arg Ala - Gly - Leu - Glu - Lys - Asn - Tyr NH₂

Požadovaná sloučenina uvedená v názvu příkladu se připravila za použití syntetického postupu 45 popsaného v příkladu 1 a za použití Fmoc-Tyr('Bu) jako aminokyseliny č. 1. Následující aminokyseliny sc přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina

2. Fmoc-Asn(Trt)

3. Fmoe-Lys(Boc)

4. Fmoc-Glu(Y-()’Bu)

5. Fmoc-Leu

6. Fmoc Gly

7. Fmoc-Ala

-30CZ 300141 B6

8. Lmoc-Arg(Pme)

9. Fmoc-Pro

10. Fmoc-Asn(Trt)

11. Fmoc-Thr(’Bu) ? 12. Fmoc-Glu(y-O’Bu)

13. Fmoc-Pro

14. Fmoc-Tlir(‘Bu)

15. Fmoc-Phe

16. Fmoe-lle io 17. Fmoc-Ser('Bu)

18. Fmoc Hís(Trt)

19. Fmoc-Arg(Pmc)

20. Fmoc-His(Tri)

21. Fmoc-Pro i? 22. Fmoc-Glu(y-O^lBu)

23. Fmoc-Gln(Trt)

24. Fmoc-Ala

25. Fmoc-Ala

26. Fmoc Trp

27. Fmoc-Asp([3-O^,Bu)

28. Fmoe-Gln(Trt) za vzniku 40 mg N - Ac - Gin - Asp - I rp Ala Ala Gin - Glu - Pro - Ilis - Arg - His Ser - [le Phe Thr -- Pro - Glu - Thr - Asn - Pro - Arg - Ala - Gly - Leu Glu - Lys - Asn 2^ Tyr-NIT.

Příklad 4

N - Ac - Arg-Asn - Pro - Asp-Val - Gly - Gly Pro Trp NIL

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc Trp. Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

Λ S

č. aminokyselina

2. Fmoc-Pro

3. Fmoc-Gly

4. Fmoc-Gly 4o 5. Fmoc-Val

6. Fmoc-Asp(h-O'Bu)

7. Fmoc-Gly

8. Fmoc-Asp(P-O'Bu)

9. Fmoc-Pro

10. Fmoc-Asn (Trt)

11. Fmoc-Arg(Pmt) za vzniku 20 mg N - Ac - Arg - Asn - Pro - Asp - Val - Gly Gly - Pro - Trp -NI T

Příklad 5

N - Ac - T yr - I hr - l hr - Asn - Pro - Arg - Lys - Leu -Tyr - Asp - Tyr NFL

-31 CZ 300141 B6

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Ί yr(’Bu). Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č, aminokyselina 5 2. Fmoc Asp((3~O'Bu)

3. Fmoc-TyrfBu)

4. Fmoc Leu

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc) io 7. Fmoc-Pro

8. Fmoc-Asn( Trt)

9. Lmoe-Thr(^!Bu)

10. Fmoc-Thr(‘Bu)

11. Lmoc-Tyr(’Bu) za vzniku 10 mg N - Ac - Tyr - Thr - Thr - Asn Pro - Arg - I.ys - Leu —Tyr - Asp Tyr NFF.

Příklad 6

2(1

N Ae - Pro - Arg - Tys - Leu - 1 yr - Asp NPT

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č, 1 a jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-TyrfBu). Následující aminokyseliny sc přidaly za urče25 ných podmínek:

č. aminokyselina

2. Fmoc-Asp(p-O‘Bu)

3. Fmoc-Tyr(*Bu)

4. Fmoc Leu

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc)

7, Fmoc-Pro za vzniku 4 mg N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu Tyr - Asp - Tyr - NI L. MS (LAB) m/z 995 (M+H) .

Příklad 7

N - Ac Pro Arg - 1 .ys - Leu - Tyr - Asp - Nik 40

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1. Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina

2. Fmoc-Tyr(^lBu)

3. Fmoc Leu

4. Fmoe-Lys(Boe)

5. Fmoc-Arg(Pme)

6. Fmoc Leu za vzniku 6 mg N - Ae - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH> MS (LSI) m/z 832 (M+H)’.

-32CZ 300141 B6

Příklad 8

N - Ac - Pro - Glu Lys - Arg - Tyr - Asp - Tyr - NIK

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. I. Jako aminokyselina č. i se použila Fmoc-1yr(^lBu). Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina io 2. Fmoc-Aspíp-(ýBu)

3. Fmoc TyrfBu)

4. Fmoc-Arg(Pmc)

5. Fmoc-Lys(Boc)

6. Fmoc Glu

7. Fmoc-Pro za vzniku 6 mg N - Ac - Pro - Glu Lys Arg - Tyr - Asp - Tyr - NI L. MS (FAB) m/z (1101) (M+H)'.

2o Příklad 9

N - Ae Arg Lys - Leu - Tyr -Asp - Tyr -NI L

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1.

Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Ίyr(’Bu). Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č, aminokyselina

2. Fmoc Asp(p-O’Bu)

3. Fmoc-Tyr('Bu) io 4. Fmoc-Leu

5. Fmoc Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc) za vzniku 8 mg N - Ac - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp - Tyr NIT. MS (ESI) m/z (898) (Μ III)'.

Příklad 10

N - Ac-Pro-Arg-Lys- Leu 3 l Tyr-NH_: (SEQ ID NO: 13)

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Emoc-Tyr(‘Bu). Následující aminokyseliny sc přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina

2. Fmoc-Asptp-O^u)

3. Fmoc-a-l-TyrpBu)

4. Fmoc-Leu

5. Fmoe-Lys(Boc)

6. Fmoc Arg(Pme)

7. Fmoc-Pro za vzniku 2 mg N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - 3 - 1 - Tyr -NH₂. MS (ESI) m/z (1121) (M+H)'.

- jj CZ 300141 B6

Příklad 11

N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - 3 - I - Tyr NLT (SEQ ID NO: 14)

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1. Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-3-I-Tyr(’Bu). Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina io 2. Emoe Asp([3-O‘Bu)

3. Fmoc-TyrfBu)

4. Einoe- Leu

5. Enioe-Lys(Boc)

6. Fmoc-Arg(Pmc) is 7. Emoc-Pro za vzniku 2.5 mg N Ae - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - 3 - 1 - Tyr -NH₂. MS (ESI) m/z 1121 (M+H).

Příklad 12

N - Ae - Lys - Leu - Tyr - Asp - NIT

Požadovaná sloučenina se připravila za použití syntetického postupu popsaného v příkladu č. 1.

Jako aminokyselina č. 1 se použila Fmoc-Asp(B-0’Bu). Následující aminokyseliny se přidaly za určených podmínek:

č. aminokyselina

2. Fmoc-TyrfBu)

3. Fmoc-Lcu

4. Fnioc-Tys za vzniku 2 mg N - Ac - Lys - Leu - Tyr - Asp - NH₂.

Příklad 13 } “š

Příprava a separace směsí N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu Tyr — Asp - 3 - I¹'⁵ - Tyr NI E a N - Ac - Pro - Arg - 1 ys - Leu - 3 - I^12s - Tyr ’· - NIT (SEG^ID NO: 13) a SEQ ID NO: 14).

Do roztoku s 30 pg N- acety! -prolyl - arginyl - lysyl - leucyl - tyrosyl aspartyl - ty rosy Ιίο amidu v 80 ml fyziologického roztoku (PBS) pilířovaného fosforečnanem se přidá jedno lože s jódem (Pierce, Rockford, IE) a 100 pCi Nal¹²'. Po 10 minutách se odstraní nadbytek Nal'²' tím, že se reakční směs nanese na kolonu Water C18-Light SepPack a sloupce se eluuje vodou pak

0.1 % ITA ve směsi 1 : 1 CH₂CN/voda a sbírají se frakce 3 x 200 μΐ, aby vznikla směs radioaktivně značených peptidů Tyr ⁵ a Tyr.

Radioaktivní smčs peptidů se nanesla injekcí na kolonu C 18 HPLC s ekvimolárním roztokem chlazených nosičů N Ac - Pro - Arg - Lys - Leu - Tyr - Asp - 3 - I -Tyr - NI T a N - Ac Pro - Arg - Lys - Leu - 3 - I - Tyr - Asp - 3 - I -Tyr - NIT, eluční časy se předem určily na 36 minut a 38 minut. Kombinovaly se opakované eluce se systémem rozpouštědel z příkladu 1 a lyofilizace: v relevantních frakcích byla požadovaná látka N Ac Pro - Arg - I .ys - Leu - Tyr

- Asp - 3 - I -Tyr - NH₂ s minimálním znečištěním s N - Ac - Pro - Arg - Lys - Leu 3 1

Tyr - Asp - 3 - Í-Tyr - NI E.

- 34 CZ 300141 Bó

Obecné metody

Příklad 14

Izolace a čištění peptidových fragmentu smyčky 5,

Peptidové fragmenty smyčky 5 se připravily z produktu štěpení Lys plazminogenu (Lys-HPg. Abott Laboratories. Abbott Park, IL) prasečí elastázou (SIGMA, St. Louis, MO) modifikovanou io metodou podle Powell et al. (Arch Biochem. Biophys. 248 (1): 390M00 (1986). 1.5 mg prasečí elastázy se inkubovalo s 200 mg Lys-HPg v 50 mM I ris HCI pH 8,0 a směs se míchala za stálého houpání přes noc při teplotě místnosti. Reakce se ukončila přidáním DPL (d i izopropy I fluorofosforečnanu, SIGMA) tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM. Směs se míchala na houpací míchačce po dalších 30 minut dialyzovala se proti 50 mM Tris pH 8.0 přes noc a zákon cent ro15 vala se. Štěpený plazminogen se nanesl na 2,5 cm x 15 em velkou kolonu lysin-Sepharose 4B (Brockway, W. J. and Castellino, F. J„ Arch. Biochem. Biophys. 151:194 199 (1972), což je zde uvedeno jako odkaz, a kolona se ekvilobrovala 50 mM Tris pH 8,0 až se dosáhla hodnota absorbanee 0,05 (při vlnové délce 280 nm). Tento krok se uskutečnil, aby se odstranily libovolné fragmenty, které obsahují oblast smyčky 1 a/nebo oblast smyčky 4 (obě oblasti vážou lysin)).

2o Neabsorbované peptidové fragmenty smyčky 5 se dia lyžovaly proti 50 mM pufru Na;P()₄. pl I 5,0 a pak se nanesly na kolonu BioRad Mono-$. která se ekvilibrovala stejným pufrem. Dominantní frakce obsahující štěpenou část smyčky 5, neštěpený mini-HPg a zbývající proteáza se eluovala 0 až 20 %, 20 až 50 % a 50 až 70 % postupným gradientem roztoku 20 mM fosforeěnanu/1 M KCI pH 5,0. Elektroforézou na gelu se zjistilo, že peptidové fragmenty smyčky 5 se duo vály při gradientu 50 %. Sebrané frakce s koncentračním pikem se dialyzovaly přes noc proti 20 mM I ris pH 8,0.

Pomocí chromatografie FPLC a DodSO4/'PAGL s barvením stříbrem (Coomassie Blue) se stanovilo. že separované fragmenty smyčky 5 dosahují přinejmenším 95 % čistoty. Sekvenční analýza aminoterminální části puri fi kovaných fragmentů ukázala na přítomnost třech polypeptidu. jenž mají a-N-terminaění sekvence VLI.PDVLTPS, VAPPPVVLL a V LTP SLED, které korespondují s aminokyselinami v pozicích Val”⁹ až Ser⁴'⁸. Val^44, až Lcu^1M) a Val^4M až Asp⁴⁶' sekvence SLQ ID NO: 1.

Příklad 15

Endoteliální proliferační test.

Proliferace endoteliálních buněk in vitro se stanovala podle Lingen. et al.. Laboratory lnvestigation. 74: 476-483 (1996) za použití kitu Cell l iter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega Corporation, Madison. Wl). Bovinní kapilární (adrenální) endoteliální buňky se nanesly na destičky s 96 prohlubněmi v hustotě 1000 buněk na prohlubeň destičky v Dulbeeco modifikovaném Lagle médiu (DMEM), které obsahuje 10 % donorové telecí sérum a 1 % BSA (bovinní sérový albumin, G1BCO BRL, Gaithesburg, MD). Po 8 hodinách se buňky nechaly vyhladovět přes noc v DMEM, které obsahuje 0.1 % BSA, pak sc znovu nakrmily médiem, které obsahuje specifikované koncentrace inhibitoru a 5 ng/ml bFGF (základní fibroblastový růstový faktor). Výsledky testu se upravily jak pro nestimulované buňky (to znamená, že se nepřidalo bFGF), což se používá jako základní hodnota, a pro buňky stimulované samol50 ným bFGF (to znamená, že se nepřidal inhibitor) jako maximální proliferace. Když se zkombinovaly výsledky více pokusů, výsledky sc prezentovaly jako procento změny v poetu buněk ve srovnání se samotným bFGF.

-35 CZ 300141 B6

Příklad 16

Migrační test endoteliálních buněk.

Test migrace endoteliálních buněk se provedl v podstatě podle. P. J. Polverini et al.. Methods Enzymol. 198: 440-450 (1991). což je zde uvedeno jako odkaz. Bovinní kapilární (adrenální) endoteliální buňky (BCE. které se získaly od Judah Folkman. Harvard University Medical School) se nechaly přes noe vyhladovět v médiu DMEM. které obsahuje 0.1% bovinní sérový albumin (BSA). Buňky se pak uvolnily z podkladu trypsinem, shromáždily se a resuspendovaly ι» se v DMEM s 0,1% BSA v koncentraci 1,5 x 10⁶ buněk na ml. Buňky se daly na dno modifikované Boydenovy komory s 48 prohlubněmi (Nukleopore Corporation, Cabin John, MD). Komora se sestavila, obrátila a buňky se nechaly přichytit po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C na polvkarbonátové membrány pro chemotaxi (velikost póru 5 pm), pak se přes noe namočily do 0.1 % želatiny a nechaly sc uschnout. Komora se pak znovu obrátila a do každé prohlubně horní komo15 ry se přidaly testovací látky (přičemž celkový objem je 50 pl); přístroj se pak inkuboval po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Membrány se pak fixovaly a barvily (Diffcpiick. Eisher Scientifíc, Pitlsburg, PA) a spočítal se počet buněk, které migrovaly do horní komory' přes 10 silných silových polí. Odečetla se zpětná migrace do DMEM + 0,1 % BSA a data se označila jako počet buněk migrujících přes 10 vysokých silových polí (400x) nebo v případě, že se zkombinovaly výsledky z více experimentů, vyjadřují se jako procento inhibice migrace ve srovnání s pozitivní kontrolou. Výsledky jsou uvedeny v tabulce ě. 1.

Příklad 17

Účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na proliferaci endoteliálních buněk in vifro.

Stanovil se účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na proliferaci endoteliálních buněk in vitro za použili shora popsaného testu proliferace endoteliálních buněk. Při těchto experimentech se sn připravily peptidové fragmenty smyčky 5 podle příkladu 1 až 14 a testovaly se různé koncentrace v rozmezí přibližně 100 až 1000 pM. Jako kontrola maximální proliferace se použilo bFGF. Peptidový fragment smyčky 5 se sekvencí SEQ ID NO: 3 byl účinný při inhibici proliferace buněk

BCE v závislosti na dávce. Koncentrace peptidového fragmentu se sekvencí SEQ ID NO: 3. při které se dosáhne 50% inhibice (EDsQ je přibližně 300 pM. Naopak FTX_n u smyček 1 až 4 je vs 135 nM.

Účinek peptidových fragmentů jiné smyčky na inhibici proliferace buněk BCE se uvádí v tabulce ě. 1. Peptidový fragment smyčky 3 vykazuje nejnižší účinek při inhibici proliferace buněk BCE (hodnota ED₅₍₎ je 460 nM). pak následuje peptidový fragment smyčky 1 (hodnota ED.™ je

320 nM), peptidové fragmenty smyček 1 - 4 (hodnota ED.™ je 135 11M) a peptidové fragmenty smyček 1 - 3 (hodnota ED™ je 75 nM). Nej účinnější při inhibici proliferace buněk BCE je peptidový fragment smyčky 5 s hodnotou ED™ 0,3 nM.

Příklad 18

Účinek peptidových fragmentů smyčky 5 na migraci endoteliálních buněk in vivo.

Za použití popsaného testu migrace endoteliálních buněk se také stanovil účinek peptidových

5o fragmentů smyčky 5 na in vilro migraci endoteliálních buněk. Peptidové fragmenty smyčky 5 inhibovalv migraci buněk BCE v závislosti na dávce, přičemž hodnota ITT, je přibližně 300 pM.

Koncentrace peptidových fragmentů smyčky 5 nutná pro maximální inhibici buněk BCE. také inhibovala buňky PC-3 a MDA 486. Tento výsledek, když se spojí dohromady s výsledkem z příkladu 2, ukazuje, že inhibice stimulace proliferace a migrace buněk BCE peptídovými ťrag- 36 CZ 300141 B6 menty smyčky 5 je pro endoteliální buňky silná a specifická. To však neplatí v případě normálních a nádorových buněk.

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a neomezují vynález na doložené látky. Varianty a 5 změny, které jsou odborníkům v oboru zřejmé, spadají rovněž do rozsahu a charakteru předloženého vynálezu, který je plně definován v přiložených patentových nárocích. V tabulce č. 1 jsou uvedeny hodnoty Εί>₍ι. které se získaly při inhibicí proliferace bunék CBE a migrace buněk fragmenty různých smyček in vitro. Peptidové fragmenty uvedené v tabulce se značí vzhledem k jejich odpovídající frekvenční homologii se sekvencí SEQ IL) NO: 1. Symbol označuje data to převzatá z publikace Marti ct al.. Eur. J. Biochem.. 219: 455—462 (1994) a symbol označuje případy, kde data neexistují.

-37CZ 300141 B6

Tabulka č. 1

Proteinový fragment z SEQ ID NO: 1	Antiproliferační aktivita buněk BCE (ED50)	Inhibice migrace buněk HMVEC (ED>o)
smyčky 1-4 (angiostatin)*	135 nM	160 nM
smyčka 1 (Tyr8u-Glu,6j) *	320 nM	-
smyčka 2 (Glul61-Thr24i) *	nemá aktivitu	-
smyčka 3 (Thr253-Ser335 ) *	460 nM	-
smyčka 4 (Val154-Val443) ‘	bez aktivity	-
smyčky 1-3 (Tyr80-Pro353) *	75 nM	60 nM
smyčky 2-3 (Gh^-Ser335) *	-	-
smyčka 5 (Val44-'’-Ala343) *	250 pM	200 pM
smyčka 5 (Val449-Ala543) *	-	240 pM
smyčka 5 (Va/^-Ala543) *	-	220 pM
smyčka 5 (Val443-Phc546) *	60 nM	55 nM
smyčka 5 (Val449-Phe546) *	-	-
smyčka 5 (Val434-Phe^45 *	-	-
smyčky 4-5 (Val355-AlaS43) *	-	280 pM
smyčky 4-5 (Val35S-Phe546) *	-	-
N-Ac-Val44í'-Asp'lí,1-NH2	-	> 1 mM
N-Ac-Met4','-Pro4#2-NH2	-	> 1 mM
N-Ac-Gln^-Tyr^-NIIi	-	> 100 μΜ
N-Ac-Arg,l3-Trp5i3-NH2	-	500 pM
N-Ac-ryTi25-Tyr535-NIl2	-	200 pM
N-Ac-Pro^-Tyr^-Nfy	-	120 pM
N-Ac-Pro,29-Asp5'!4-NH2	-	123 pM
N-Ac-Prol5u-Tyrl56-NH2	-	160 nM
N-Ac-Arg53U-Tyr535-Nll2	-	80 pM
N-Ac-Pro -Arg-Lys-Leu-3- I-Tyr-Asp-Tyr-NH2	-	> 100 nM
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Lcu- Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH2		400 pM
N-Ac-Lys'‘'il-TyrS34-Nll2	-	-

-38CZ 3UU141 B6

Příklad 19

Rekombinantní exprese fragmentu smyčky 5 v Pichiapastoris.

A. Produkce cDNA kódující fragmenty smyčky 5 PCR:

PCR se použilo pro generaci cDNA fragmentu, které kódují peptidové fragmenty smyčky 5. jejichž aminokyselinová sekvence leží (1) mezi aminokyselinami sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích 450 až 543 (K5A), (2) mezi aminokyselinami sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích io 450 až 546 (K5F), (3) mezi aminokyselinami v pozicích 355 až 543 (K4-5A) jejichž aminokyselinová sekvence leží (1) mezi aminokyselinami sekvence SEQ ID NO: 1 v pozicích 355 až 546 (K4 5F) a které se používají pro klonování a expresi v eukaryontních a prokaryontních hostitelích, Fragmenty DNA se generovaly za použití cDNA, která kóduje lidský plazminogen (získaly se od Dr. F. Reich, State University of New York. Stony Brook, NY) a která se používá jako i? templátová DNA a dopředný a reverzních primerů (získaly se od firmy Operou Technologies,

Inc. Alameda, CA), jak je uvedeno dále v textu:

5 ' -ATTAATGGATGCTTGGACAAGAGGCTGCTTCCAGATGTAGAGACT--3 '	SEQ ID NO:2
5'-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGGTCCAGGACTGCTACCATGGT-3'	SEQ ID NO:3
5'-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAGGCCGCACACTGATGGACA-3'	SEQ ID NO:4
5'-ATTAATCTCGAGGCATGCTTAAAATGAAGGGGCCGCACACT-3'	SEQ ID NO:5

Amplifikace PCR se provedla za použití primerů se sekvencemi SFQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4 (pro fragment K5A). SEQ ID NO: 2 a SFQ ID NO: 5 (K5F), SFQ ID NO:3 a SFQ ID NO: 8 (K.4-5A) a SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO:5 (K4-5A) za standardních podmínek pro PCR, To znamená že reakční směs při celkovém reakčním objemu 100 μΐ obsahuje 200 μΜ každý dNTP. kde N je A, T, G a C, 0,2 μΜ každého primeru, přibližně 10 ng templátové DNA a 1 jednotku Vent® DNA polymerázy (New Fngland Biolabs). Amplifikace proběhla celkem v 25 cyklech (1 cyklus = 94 °C po dobu jedné minuty, 48 °C po dobu dvou minut, 72 °C po dobu I minuty) na přístroji DNA Thermal Cyclcr 480 (Perkin Elmer, Poster City, CA), Po amplifikaci se produkty PCR čistily na gelu, štěpily restrikeními endonukleázami BanňII a Xho] (New Fngland Biolabs), ligovaly se do modifikovaného expresívního vektoru Pichia (pHil D8. uvedeno dále v textu), který je štěpen stejnými enzymy a transformuje se elektroporací do buněk HB101 (BioRad). Z individuálních klonů se připravila DNA a štěpila se restrikeními enzymy a podrobila se sekto venění analýze za účelem identifikace klonů, které obsahují inzerty se správnou sekvencí a ve správné orientaci. Plazmidy z pozitivních klonů se transformovaly do kmene GS 115 Pichia pastoris (Ínvitrogen. Carisbad, CA) s ohledem na instrukce výrobce. Za účelem identifikace pozitivních klonů v Pichia se buňky kultivovaly v 5 ml média BMGY (Ínvitrogen) při teplotě 29 °C, buňky se shromáždily centrifugací a resuspendovaly se za účelem exprese v médiu

BMMY (Ínvitrogen) o objemu 0.5 ml. Po inkubaci při teplotě 29 °C po dobu 2 dní se supernatanty kultury shromáždily a alikvoty se analyzovaly na SDS PAGF a technikou western biot podle metod, které jsou dobře známy v oboru. SDS-PAGE gel je na obr. č. 6.

B. Konstrukce expresívního vektoru pHiI-D8:

Expresívní vektor Pichia pHil-D8 se konstruoval modifikací vektoru pl lil—D2 (ínvitrogen), abv zahrnoval syntetickou vedoucí sekvenci za účelem sekrece rekombinantního proteinu (obr. 5). Vedoucí sekvence 5'ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTTTGCAAT CTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACrACCGTTGGTTCCGCTGCCGA GGGATCC-3' (SEQ ID NO: 9)

4? kóduje sekrecní signál PIIOl (podtrženo jednoduchou čarou) operativně spojený s pro-peptido-39CZ 300141 Bó vou sekvencí (vyznačeno tučným písmem) pro štěpení KEX2. K vytvoření konstruktu pHil-D8 se použilo PCR. kde se jako templát použil pHil—S1 (Invitrogen). protože tento vektor obsahuje sekvence kódující PI1O1, dopředný primer (SEQ ID NO: 7) odpovídá nukleotidům 509 až 530 pHil—Sl a reverznímu primem (SEQ ID NO: 8), jehož nukleotidová sekvence kóduje pozdní část sekrečního signálu PHO1 (nukleotidy 45 až 66 sekvence SEQ ID NO: 9) a pro-peptidovou sekvenci (nukleotidy 67 až 108 sekvence SEQ ID NO: 9). Sekvence primerů (získaného z firmy Operon Technologies, lne. Alamede. CAjjsou uvedeny dále v textu:

5 '-GAAACTTCCAAAAGTCGCCAJ A-3'	SEQ ÍD NO: 7
5 ATTÁA rGAAlTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGG aaccaacggtagtgcagataactggctgagcgaagattgcaa AGTA-3'	SEQ ID NO: 8

11)

Amplifikace sc uskutečnila v 25 cyklech, jak se popisuje v příkladu 19. Produkt PCR (přibližně 500 bp) se čistil na gelu, štěpil se restrikěními endonukleázami Blpl a EcoRl a ligoval se do vektoru plili 1)2. který sc štěpil stejnými enzymy. DNA se trans formovala do buněk bakterií E. coli HB 101 a štěpením restrikěními enzymy a sekvenční analýzou se identifikovaly pozitivní klony.

i? Jeden klon, který vykazuje správnou sekvenci sc označil pl lil-D8.

Příklad 20

2o Rekombinantní exprese peptidových fragmentů smyčky 5 v bakterii.

Restrikční a jiné modifikující enzymy stejně jako jiná činidla se získala z komerčních zdrojů. Primery se syntetizovaly v Abbott Laboratories na automatickém syntetizátoru podle standardního postupu, který je dobře znám v oboru.

DNA peptidových fragmentů smyčky 5 se také generovaly PCR amplifíkaci za účelem klonování a exprese do bakteriálních buněk (E. coli). Základní přístup byl vytvořit fragmenty PCR požadovaných kódujících sekvencí s nebo bez term inaěn ích kodonů, kinázovýcb konců a klonování fragmentů přímo do zvolených vektorů. Vektorové konstrukty se pak transformovaly do vhod50 ných hostitelských buněk a kolonií, které se testovaly PCR s primery vektoru za účelem potvrzení přítomnosti inzertu. Za účelem stanovení orientace inzertu se v reakcích PCR vykazující přítomnost inzertu v klonech provedla přímá PCR za použití jednoho vektorového primerů a jednoho primem inzertu.

A, Příprava fosfatizovaných vektorů s tupými konci:

Popis expresívníeh vektorů, které jsou použitelné při bakteriální produkci peptidových fragmentů smyčky 5, se uvádí v tabulce ě. 2.

-40CZ 300141 B6

Tabulka č. 2

vektor	zdroj	restrikční enzymy	fúze
UpET	modifikovaný pET21 d podle Abbotta	Sap\	není
UpET-IITh	modifikovaný pET21 d podle Abbotta	Sap\	rozeznává N -terminální His6-trombin
LpET-Lbi	modifikovaný pET21d podle Abbotta	Sap\	rozeznává N-terminál- ní Hisó-ubiquitin- enterokinázu
pET32a	Novagen	Nco\ * Ύ/iol	rozeznává thioredoxin. a enterokinázu
pGEX-4T-2	Pharmacia®	EcoRX - Not\	GST
pCYB3	New Engíand Biolabs	NcoX t Sapi	C-terminální intein

Všechny vektory se nejdříve izolovaly na kolonách Qiagen v souladu a instrukcemi výrobce (QIAGEN. Inc., Santa Clarita. CA). Vektorová DNA (1 gg) se štěpila vhodnými restrikčními enzymy (tabulka č. 2) ve 20 pl pufru NEB4 (New England Biolabs), který obsahoval 100 pg/ml bovinního sérového albuminu (BSA). Reakce se rychle centrifugovala a do směsi se přidalo 20 pl neionizované vody, 0,4 pl směsi dNTP (Pharmacia®; 20 mM každého dNTP) a 0,25 pl klonovaní né DNA polymerázy pfu (Stratagene®; 2.5 jednotek/μΙ) a vše se inkubovalo při teplotě 65 °C po dobu 20 minut, přičemž došlo k zaplnění konců vektoru. Reakční smčs se znovu krátce centrifugovala a přidalo se 4 μΙ ředěné telecí intenstinální fosfatázy (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD: celkem 5 jednotek). Směs se pak inkubovala při teplotě 50 °C po dobu jedné hodiny. Do reakce se přidalo 5 pl 10% SDS, 2 pl 5 M NaCl. 2 pl 0,5 M EDTA a 45 pl vody a vše se krátce centrifu15 govalo a pak se inkubovalo při teplotě 65 °C po dobu 20 minut. Reakce se extrahovala třikrát pufrem saturovanou směsí fenol-chloroform (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD;) a jednou chloroformem, Vodná fáze se čistila na koloně CHROMÁ SPIN™ 1000 TE (CLONTECH, Palo Alto. CA).

B. Tvorba DNA fragmentů pomocí PCR:

Připravily se primery PCR na základě publikované sekvence pro lidský plazminogen (SEQ ID NO: 12) a jejich sekvence jc uvedena dále v textu:

5'- GTCCAGGACTGCTACCAT-3'	SEQ ID NO. 10
5'- CTGC’1TCCAGATGTAGAGA-3'	SEQ ID NO: 11
5'- TTATTAGGCCGCACACTGAGGGA-3'	SEQ ID NO: 13

-41 25

Jestliže není uvedeno jinak, všechny PCR se provedly DNA polymerázou pfu a v pufru (Stratagene®. za použití 200 pM každého dNTP a 1 pM každého při meru. Používaná sada primerů má sekvence SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 13 (v případe K5A) a SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO:

so 13 (v případě K.4-5A). Jako templát se použil vektor pHil-D8. který obsahoval Κ4-Κ5Λ (popsaný v příkladu 19). Před tím než se použil jako templát, uvedená DNA se štěpila restrikčním enzymem Dral (který' štěpí DNA na několika místech vně smyčkových oblastí) za účelem eliminovat pozadí způsobené vektorem pl lil-D8 při transformacích. Do reakce PCR o objemu 50 μΙ se použilo přibližně 10 ng tcmplátu. Reakce PCR proběhly při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak 15 cyklů při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund; 49 °C. 1 min.; 72 °C. 4 minuty; a 72 °C po dobu 7 s minut. Po PCR reakci sc přidalo 0.5 μΐ 100 mM ATP a 5 jednotek T4 kinázy a reakce se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 20 minut za účelem upravit konce kinázou. Směs sc pak zahřála na teplotu 68 °C po dobu 15 minut a čistila se na koloně S400-HR (Pharmacia®) za účelem ligaee.

C. Ligaee fragmentů PCR do expresí vn ích vektorů:

io

Šest rekombinantních konstruktů (specificky (i) K5A v ΙίρΕΊ -PS3. (ii) K5A v pET32a, (iii) K45Λ v UpET-PS3. (iv) K4-5A v UpET-Ubí, (v) Κ4-5Λ v pET32a a (vi) K4-5A v pGEX-4T-2) se připravilo následovně: vektor upravený fosfatázou s tupými konci (1 μΙ z kroku A shora v textu) a fragment PCR (1 μΐ z kroku B shora v textu) se ligoval do celkového objemu 5.5 μΐ pomocí kitu Rapid Ligation kit, přičemž, se postupovalo podle instrukcí výrobce (BoehringerMannheim Corp., Indianapolis, IN). Ligaení směs (1 μΐ) se pak transformovala do 20 μΐ kompetentních buněk (XLl-Bkie superkompetentní buňky nebo XL-2-Bluc Ultrakompetentní buňky (Stratagene®)) podle instrukcí výrobce. Rekombinantní buňky se selektovaly na plotnách s l.BAmp agarem (MicroDiagnostics. Lombard. IE).

2Í)

D. Studie exprese:

Vektory pGEX se exprimovaly v bakteriích E. co/i XLl-Blue nebo XL2-Blue. Všechny ostatní vektory se izolovaly a retransťormovaly do bakterií E. coli BL21 (DE3) (Novagen) podle instrukcí výrobce. Jednotlivé kolonie se inokulovaly do 2,5 ml LB/Amp a míchaly se při 225 ot/min.; při teplotě 37 °C, přes noc. Kulturou kultivovanou přes noc (0,5 ml) se pak inokulovalo 50 ml LB/Amp ve kultivačních nádobách o objemu 250 ml a míchalo se při 225 ot./min při teplotě 37 °C až hodnota OD600 byla mezi 0,5 až 0.6. Pak se přidal isopropvl-1-thio P D-galaktopyranozid (IPTG, 100 mM) tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM. Kultura se míchala při 225 .to ot./min. při teplotě 30 °C po dobu 3 hodin a pak se buňky cen tri fugo vály na dno kultivační nádoby. Vzorky se připravily pro účely testu SDS-PAGE za použití známých metod. Předchozí experimenty ukazují, že buňky nesoucí K5A/pET32a, K4-5A/pET32a a K4-5A/pGEX produkují většinu rekombinantního proteinu. Kultury těchto klonů se pak analyzovaly SDS PAGE za účelem zjistit, zda produkt exprese je rozpustný nebo nerozpustný. Jak je zobrazeno na obr. č. 7 konstrukce K5A/pET32a produkuje rekombinantní protein, který jc skoro zcela rozpustný (porovnej dráhy S a P Trx-K5A), zatímco konstrukce K4-5A/pGEX produkuje protein, který je rozpustný pouze ze 75 %.

E. Konstrukce vektorů modifikovaného podle A b bot a:

i. Příprava kazet VB1, VB2, VB3 a VB4:

Kazety VBE VB2, VB3 a VB4 se připravily jako syntetické DNA za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. Sekvence synVBl, synVB2. synVB3 a synVB4 se uvádí dále v textu;

-42CZ 300141 B6

synVBl	5'-agcgtctcatgaagagctggctcaccttqgggtgggcctttctgc GCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAACCGGGAGCCCGCCTAATGAGCGG GCTTTTTTTTGCTCTTCATAGTGACTGAGACGTCG-3'	SEQ ID NO:14
synVB2	5'-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT CTGGTGCCGCGCGGCAGCTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCT TTCTGCGCCTTGGCGCGCCAACCTTAATTAAGCGGGACCCCCCCTAAT GAGCGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3'	SEQ ID NO:15
synV33	5'-AGCGTCTCAGGTGGTGGTCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGT TGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGCCTTGGCGCGC CAACCTTAATTAACCGGGACCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGC TCTTCACGAGACGTC-3'	SEQ ID NO:16
synVB4	5'-agcgtctcaggtggtcgtcatcaccatcaccatcacggtggtggt GATGACGATGACAAGTGAAGAGCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTC tgcgccttggcgcgccaaccttaattaaccgggagcccgcctaatgag CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCACGAGACGTCG-3'	SEQ ID NO:17

Každá syntetická sekvence se připravila jako dvouřetězcová a klonovala se do vektoru PCRScript Cam™ (Stratagene®) podle instrukcí výrobce; klony se správnou sekvencí se pak izolo5 vály podle standardních postupů. 5 pg čištěné DNA se štěpilo 8 jednotkami restrtkčniho enzymu ZfcwBI při teplotě 55 °C při reakci o objemu 20 pl v pufru lx NEB4 obsahujícím 100 pg/ml BSA. Reakce se krátce centrifugovala a přidalo sc 20 pl deionizované vody. 0,4 pl směsi dNTP (Pharmacia®: 20 mM každého dNTP) a 0,25 μΙ klonované pfu DNA polymerázy (Stratagene®; 2.5 jednotky na jeden rnikrolitr) a reakce se inkubovala při teplotě 65 °C po dobu 20 minut, přiio čemž se zaplnily konce. DNA se pak podrobila elektroforéze na 3 % agarózových gelech 3% MetaPhor™ (PMC, Rockland, Maine) v pufru 0,5 x Tris acetát-EDTA (TAE). Pruh DNA kazety se pak vyřízl z gelu a DNA se eluovala zmrazením gelu a centrifugací pufru pres náplň Ultrafree™ Probind (MILLIPORE Corp., Bedford, MA). Pak následovalo srážení isopropanolcm, přičemž se jako nosič použil Pellet Pa int™ (Novagen). DNA (cfVBl. cfVB2, efVB3 a ctVB4) se i? promyla 70% etanolem, krátce se sušila a resuspendovala se v 25 pl pufru Tns-EDTA (TE). i i) Konstrukce UpET:

Vektor pET21d (Novagen) se štěpil restrikením enzymem Λ//4, dále se aplikovala T4 DNA polymeráza idGTP. nukleáza fazole mungo, pak DNA polymeráza 1 Klenow fragment a vektor se znovu ligoval. Testovaly se jednotlivé kolonie za účelem selekce plazmidu, ve kterém se eliminovalo existující restrikční místo Sap\. Uvedená DNA se pak štěpila restrikením i enzymy Acol + Zfc/wHI a ligovala se do sekvencí 5'-CATGTC.AAGAGC-3' (SEQ ID NO: 19) + 5'GATCGCTCTTCA-3' (SEQ ID NO: 20) za účelem zavedení jediného restrikčního místa Sap\. Čištěná a ověřená klonovaná DNA se štěpila restrikěními enzymy Sapl + ///w/lll, upravily se tupé konce a aplikovala se fosfatáza, jak se popisuje shora v textu. DNA se ligovala do kazety cfVBl, transformovala se do bakterií E.coli a ty se nanesly na plotnu s LB-amp. Kolonie se přenesly sterilní špičkou pipety na plotny s LB-Amp agarem a do 20 pl AmpliTaq® PCR směsi (Perkin Elmer) v destičkách Costar Thcrmowell, které obsahují 1 μΜ každého vektorového primem o sekvenci 5 AGATCTCGATCCCGCGAA 3' (dopředný primer. sekvence SEQ ID NO:

21) a 5' A TCCGGATATAG Γ ICCTC 3' (SEQ ID NO: 22). Reakce se zahřály na teplotu 94 °C po dobu 30 sekund; a pak se zpracovávaly na termálním cyklem GeneAmp 9600 při 30 jednotlivých cyklech: při teplotě 94 °C po dobu 5 min; 40 °C po dobu I minuty; 72 °C po dobu 2 minut.

pl z každé reakce se běžet na agarózových gelech, /a účelem stanovení orientace kazety se

0,25 pl testu PCR reakce o správné velikosti přidalo do čerstvé reakce, která obsahovala reverzní

-43 Q7. 300141 B6 vektorový primer a primer kazety 5'-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTA-3' (SEQ ID NO: 23).

Reakce se amplifikovaly v dalších deseti stejných cyklech, jako je uvedeno shora v textu. Konečné vektory se sckvcnovaly za použití standardního postupu a jeden klon se označil jako UpET.

iii. Konstrukce UpET-1 ITh:

UpET se štěpil restrikčním enzy mem Supí a upravily se tupé konce, poté se aplikovala fosfataza za účelem klonování. Fragment se ligoval do kazety cřVB2, ta se transformovala a jednotlivé kolonie se testovaly a provedla sc sekvenční analýza za účelem stanovení shora popsané ligace cfVBl.

io iv. Konstrukce UpET-IE

UpET se štěpil restrikčním enzymem Supi a upravily se tupé konce, poté se aplikovala fosíátáza za účelem klonování. Fragment se ligoval do kazety cfVB3, ta se transformovala a jednotlivé kolonie se testovaly a provedla se sekvenční analýza za účelem stanovení shora popsané ligace cfVBl.

v. Konstrukce UpET—Ubi:

Fragment PCR kódující ubiquitin A cerevisicte se generoval za použití Ultma DNA polymerázy a pufru (Perkin Elmer), 40 μΜ každého dNTP, 1 μΜ každého z primerů o sekvenci 5 20 CAGATTTTCGTCAAGAC1 1-3' (Ubi 5p, SEQ ID NO: 24) a 5-ACCACCICl IAGCCTTAG-3' (libí-3p, SEQ ID NO: 25) a 1,75 pg kvasinkové DNA při teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 25 jednotlivých cyklů při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty: 40 °C. po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. Fragment PCR vznikl z 20 ng pETl5b (Novagen) za použití primerů se sekvencí 5-CATGGTATATCTCCTTCTT-3' (pET3p-ATG.

SEQ ID NO: 26) a 5'-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3' (T7RevTerm. SEQ ID NO: 27) při teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 10 cyklů při režimu 94 °C po dobu 45 vteřin: 42 °C? po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 15 minut; pak 72 °C po dobu 7 minutu. PCR fragmenty pro ubiquitin a odvozený od pET15b se čistily na gelu a ligovaly se za použití BRL T4 ligázy a ligačního pufru. Fragment PCR T7 promotor-ubiquitin (T7-ubiquitin) se vytvořil PCR reakcí,

3o kde ligační smčs sloužila jako tem plát a přidaly se Ultma DNA polymeráza a primery sc sekvencemi 5 -AGATCTCGATCCCGCGAA--3'(pET5p, SEQ ID NO: 28) a SEQ ID NO: 25 při teplotě 94 °C po dobu 2 minut a pak proběhlo 25 cyklu v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 sekund; teplota 42 °C po dobu 1 minuty; teplota 72 °C po dobu 3 minut; pak teplota 72 °C po dobu 7 minut. PCR fragment T7—ubiquitinu se čistil na gelu.

PCR fragment přirozeného lidského Stromelysinu se připravil za použití Ultma DNA polymerázy (.jakje uvedeno shora) s příměrem se sekvencí 5-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3' (Strom-3p. SEQ ID NO: 29) a primerem upraveným kinázou o sekvenci 5'-TI CAGAACCTTTCCTGGCA3' (Strom-5 p. SEQ ID NO: 30) a za použití přibližně 20 ng tem plátu (to je stromelysin klonovalo ný do pET3b (Novagen)) při teplotě 94 °C po dobu 2 minut, pak proběhlo 15 cyklů při režimu teplota 94 °C po dobu 1 minuty; teplota 44 °C po dobu I minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak °C po dobu 7 minut. PCR reakce s fragmentem Stromelysinu (10 μΙ) se ligovala s 100 pMol denaturovaných oligonukleotidů se sekvencemi 5-AGCGGCGACGACGACGACAAG-3' (Ek— Cut-5p. SEQ ID NO: 31) a 5-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGC 1-3' (Ek-Cul 3p, SEQ ID

NO:32, kóduje štěpící místo enterokinázy) ve 40 μΐ BRE ligázy a ligačního pufru. PCR fragment nesoucí místo pro štěpení enterokinázou-přirozený stromelysin (Ek-stromelysin) se připravil reakcí PCR, kde se jako tempiát použil 1 μ! ligační směsi, primery'' SEQ ID NO: 29 a primer upravený kinázou o sekvenci SEQ ID NO: 31, Ultma DNA polymeráza a pufr. PCR začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 10 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 1 minuty;

teplota 44 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 2 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut. PCR fragment Ek stromelysin se čistil na gelu.

Fragmenty T7—ubiquitin a Ek-stromelysin se ligovaly dohromady BRL li gázou v ligaěním pufru,

PCR fragment T7-ubiquitinu-Ek-stromc!ysinu se pak připravily reakcí PCR, kde sc jako tempiát

-44C7. 300141 B6 použila ligačni směs a Ultma DNA polymeráza a primery se sekvencemi SEQ ID NO: 28 a SEQ ID NO: 29. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 25 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 42 °C po dobu 1 minuty: 72 °C po dobu 6 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut.

PCR fragment vznikl PCR reakcí, kde se použil jako temp lát plazmid strome lysin-pET3b. dále se použily primery se sekvencemi SEQ ID NO: 26 a SEQ ID NO: 30. KlenTaq (AB Peptides, Sl. Louis, MO) a pfu DNA polvmerázy, PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 15 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 42 °C po dobu 2 minut;

68 °C po dobu 20 minut. Tento PCR fragment sc smísil s PCR fragmentem T7-ubiquitin Ekstromelysin a směs sc transformovala do kompetentních buněk BRL DH5a s maximální účinností. Správné klony se identifikovaly izolací plazmidové DNA. Transfekce do BL2l(DE3) a studovaná exprese se popisuje shora v textu.

PCR fragment z konstrukce ubiquitin—Ek se vytvořil ze správného expresívního plazmidu T7ubiquitin Ek stromelysin použitím PCR reakce s primery se sekvencemi SEQ ID NO: 24 a SEQ ID NO: 32 a spfu DNA polymerázou. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 20 cyklů v režimu: teplota 94 ^ŮC po dobu 30 vteřin; teplota 40 °C po dobu 1 minuty: 72 °C po dobu 3 minut; pak 72 °C po dobu 7 minut, f ragment se čistil pomocí kolony Pharmacia

2i) S-400 flR Spin a ligoval se do kazety VBC1 za použití kitu Rapid DNA Ligation. PCR fragment vznikl reakcí PCR, kde se jako lem plát použila ligačni směs a primery se sekvencemi SEQ ID NO: 24 a 5 -TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCGCE (SEQ ID NO: 33) a pfu DNA polymeráza. PCR reakce začala při teplotě 94 °C po dobu 2 minut; pak proběhlo 20 cyklů v režimu: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin; teplota 40 °C po dobu 1 minuty: 72 °C po dobu 2 minul; pak 72 °C po dobu 7 minut. PCR fragment se upravil kinázou a ligoval se do vektoru Upct-fl, který se za účelem klonování upravil na fragment s tupými konci a aplikovala se fosťatáza, Ligačni směs se transformovala do kompetentních buněk a kolonie se testovaly pomocí PCR. jak se popisuje shora v textu, Za účelem stanovení správných klonů IJpET-lJbi se plazmidová DNA sekvenovala.

Claims (23)

1. Sloučenina vzorce

A-Bl-Cl-Xl-Y nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo ester, kde symbol A není přítomen nebo představuje skupinu chrániči dusík;

symbol Y není přítomen nebo představuje skupinu chránící karboxylovou kyselinu;

symbol Bl není přítomen nebo je aminokyselinový zbytek čítající 1 až 176 přirozeně se vysky45 tujících aminokyselin, který' odpovídá sekvenci z pozice aminokyseliny 334 do pozice 513 z SEQ

ID NO 1 symbol C1 je sekvence z pozice aminokyseliny 514 do pozice 523 z SEQ ID NO I a symbol XI není přítomen nebo je aminokyselinový zbytek čítající 1 až 10 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, který odpovídá sekvenci z pozice aminokvseliny 524 do pozice 533 z SEQ

50 1DNO l:

a jejich homologa a analoga.

-45C7. 300141 B6

2. Sloučenina podle nároku 1, kde symboly Bl a XI nejsou přítomné a symboly A. Cl a Y mají zde definovaný význam.

3. Sloučenina podle nároku 2. kde symbol A je N-Ae a symbol Y je -NH;.

4. Farmaceutická kompozice, vyznačující se t í m , že obsahuje sloučeninu definovanou v nárocích 1.2 nebo 3 a farmaceuticky přijatelný excipient.

5. Použití sloučeniny definované v nárocích 1. 2 nebo 3 pro výrobu léčiva pro léčení onemocni nění u pacienta, při potřebě antiangiogenní terapie.

6. Použití podle nároku 5, kde onemocnění je vybráno ze skupiny sestávající z rakov iny, artritidy. makulární degenerace a diabetické retinopatie.

15

7. Použití podle nároku 6, kde uvedené onemocnění je rakovina.

8. Použití podle nároku 7, kde uvedená rakovina je vybrána z primárních metastatiekýeh pevných nádorů, karcinomů, sarkomů, lymfomů, psoriázy' a hemangiomy.

20

9. Kompozice pro výrobu polypeptidu. které inhibují angiogenezí, vyznačující se tím, že obsahuje izolovanou jednořetězcovou nebo dvou řetězcovou polynuklcolidovou sekvenci, která kóduje sloučeninu podle nároku 1.

10. Kompozice podle nároku 9. kde uvedená polynukleolidová sekvence je sekvence DNA.

11. Buňka vhodná k implantaci do lidského nebo nehumánního živočišného subjektu, přičemž buňka obsahuje vektor, obsahující sekvenci DNA kódující sloučeninu podle nároku 1.

12. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku ^vyznačující se t í m , že zahrnuje kro30 ky:

(a) vystavení savčího plazminogenu účinkům elastázy v poměru přibližně I : 100 až 1 : 300 za vzniku směsi uvedeného plazminogenu a uvedené elastázy;

(b) inkubace uvedené směsi; a (c) izolace uvedené sloučeniny z uvedené směsi.

13. Izolovaný jednořetězcový nebo dvouřetězcový polynukleotid, který' kóduje sloučeninu podle nároku 1.

14. Polynukleotid podle nároku 13. který je molekula DNA.

15. Polynukleotid podle nároku 13. který je molekula RNA,

16. Vektor obsahující polynukleotid, který kóduje sloučeninu podle nároku I pro použití jako inhibitoru angiogeneze.

17. Vektor podle nároku 16, který je expresivním vektorem.

18. Vektor podle nároku 17, kde expresívní vektor je konstruován zabudováním polynukleotidu, který kóduje sloučeninu podle nároku 1, do vektorů vybraných ze skupiny sestávající z pHil-D8,

50 pET32a, pGEX 4T-2. UpET-Ubí a pCYB3.

-4619. Vektor podle nároku 17 dále obsahující hostitelskou buňku transformovanou uvedeným vektorem.

C.7. 300141 B6

20. Vektor podle nároku 19. kde uvedená hostitelská buňka je eukaryontní buňka.

21. Vektor podle nároku 20. kde uvedená eukaryontní buňka je Pichia pastoris.

5

22. Vektor podle nároku 19, kde uvedená hostitelská buňka je prokaryontní buňka.

23. Vektor podle nároku 22. kde uvedená prokaryontní buňka je £. coli.

24. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1, vy zn ač uj í c í st t í m . že zahrnuje: io (a) izolaci polynukleotidu, který- kóduje uvedenou sloučeninu;

(b) klonování uvedeného polynukleotidu do expresívního vektoru:

(c) transformaci uvedeného vektoru do vhodné hostitelské buňky; a (d) kultivaci uvedené hostitelské buňky za podmínek vhodných pro expresí uvedené sloučeniny.