CZ282523B6

CZ282523B6 - Iterleukin - 10 pro léčení nádorů, farmaceutický prostředek jej obsahující, jeho použití a způsob výroby

Info

Publication number: CZ282523B6
Application number: CS931412A
Authority: CZ
Inventors: Paulo J. M. Vieira; Kevin W. Moore
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1991-01-16
Filing date: 1992-01-15
Publication date: 1997-07-16
Also published as: DE69201128D1; NO932570L; CZ141293A3; HU218598B; FI933193A0; WO1992012725A1; CA2100553A1; KR100207766B1; JPH06504785A; ATE116550T1; GR3015510T3; HUT69962A; OA09908A; FI933193A; AU652030B2; SK74793A3; JP3260368B2; HU9302066D0; ES2068705T3; SK279556B6

Abstract

Je popsán interleukin-10 pro léčení nádorů, jeho použití pro výrobu léčiva pro léčení nádorů farmaceutický prostředek obsahující interleukin-10 a způsob jeho výroby.ŕ

Description

Použití lidského iterleukinu-10 nebo virového interleukinu-10 pro výrobu léčiva a farmaceutický prostředek pro léčení nádorů interleukin-10 obsahující (57) Anotace:

Je popsáno použití interleukinu-10 pro výrobu léčiva pro léčení nádorů, a farmaceutický prostředek obsahující interleukin-10.

B6

Použití lidského interleukinu-10 nebo virového interIeukinu-10 pro výrobu léčiva a farmaceutický prostředek pro léčení nádorů interleukin-10 obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů a prostředků pro léčení neoplasmů nebo rakovin u lidí a zvláště použití prostředků s interleukinem-10 (IL-10) pro léčení rakovin.

Dosavadní stav techniky

Imunologické přístupy k terapii rakovin jsou založeny na představě, že rakovinné buňky se nějakým způsobem vyhýbají obranám těla proti nahodilým nebo cizím buňkám a molekulám a že 15 tyto obrany mohou být terapeuticky stimulovány pro opětovné získání ztracené půdy, např.

strany 623 až 648 v Kleinovi “Immunology“ (Wiley-Interscience, New York, 1962.). Nedávná pozorování, že některé imunní efektory mohou řídit nebo nepřímo inhibovat růst nádorů, vedla k obnovení zájmu o tento přístup k terapii rakoviny: např. Herberman: Concepts Immunopathol. 1, 96 až 132 (1985) (přirozené killer buňky odolávají růstu nádorových buněk), Rosenberg a 20 spol.: Ann. Rev. Immunol. 4, 681 až 709 (1988) (klinické použití killer buněk (zabiječe) aktivovaných IL-2 pro léčení rakoviny), Ralph a spol.: J. Exp. Med. 167, 712 až 717 (1988) (tumoricidní aktivita makrofágů stimulovaných lymfokiny), Tepper a spol.: Cell_57, 503 až 512 (1989) (IL-4 má protinádorovou aktivitu), M. Cohen “Lymphokines and Tumor Immunity“, str. 237 až 253 v S. Cohen (red.) “Lymphokines and the Immune Response“ (CRC Press, Boča 25 Raton, 1990.) apod.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká použití interleukinu-10 (IL-10) pro snižování a/nebo zabránění růstu nádorů. Tento vynález zahrnuje také farmaceutické prostředky, které obsahují interleukin-10. Interleukin-10 podle vynálezu se s výhodou vybere ze skupiny, která sestává z maturovaných polypeptidů s otevřenými čtecími oblastmi, které jsou definovány sekvencemi aminokyselin uvedenými v sekvenci identifikační číslo 1 a 2 (všechny sekvence identifikačních čísel jsou uvedeny bezprostředně před body patentových nároků), v nichž jsou k označení L-aminokyselin použity standardní třípísmenové zkratky, při čemž se začíná od N-konce. Na tyto dvě formy IL-10 se někdy odkazuje jako na lidský IL-10 (hIL-10 nebo inhibiční faktor syntézy lidského cytokinu) a na virový IL-10 (vIL-10 nebo BCRF1): např. Moore a spol.: Science 248, 1230 až 1234 (1990), Vieira a spol.: Science 88, 1172 až 1176 (1991), Fiorentino a spol.: J. Exp. Med.

1 70, 20 81 až 2095 (1985), Hsu a spol.: Science 250, 830 až 832 (1990). Výhodněji se maturovaný IL-40 používaný ve způsobu podle tohoto vynálezu vybere ze skupiny sestávající z maturovaných polypeptidů s otevřenými čtecími oblastmi, které jsou definovány aminokyselinovými sekvencemi v sekvencích identifikační číslo 3 a 4 zde uvedených.

V následující části budou stručně popsány připojené výkresy.

Obrázek 1 je diagram znázorňující savčí expresní vektor pcD (SRa).

Obrázek 2 je diagram znázorňující bakteriální expresní vektor TRP-C11.

- 1 CZ 282523 B6

Obrázek 3 ukazuje plasmid pGSRG, který nese otevřenou čtecí oblast (ORF) myšího IL-10, virového IL-10 nebo lidského IL-10 vloženého do jeho Xho restrikčního místa. Ukazuje také sekvenci RBS-ATG-polylinkerových oblastí konečné konstrukce (nazvané TAC-RBS).

Tento vynález se týká způsobu používání IL-10 pro prevenci a/nebo snižování postupu rakovin. Tento vynález zahrnuje také farmaceutické prostředky obsahující IL-10 pro použiti podle tohoto způsobu. IL-10 pro použití podle tohoto vynálezu se vybere ze skupiny maturovaných polypeptidů kódovaných otevřenými čtecími fázemi definovanými cDNA inserty pH5C, pH15C a pBCRFl (SRcc), které jsou uloženy v Americké sbírce typů kultur (Američan Type Culture ío Collection; ATCC), Rockville, Maryland, pod čísly 68 191, 68 192 a 68 193.

Pro přípravu polypeptidů podle tohoto vynálezu se používají rozmanité jednobuněčné a vícebuněčné expresní systémy, tj. kombinace hostitel - expresní vektor. Mezi možné typy hostitelských buněk patří, ale nejsou na ně omezeny, bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky, 15 savčí buňky apod. Existuje mnoho přehledných souhrnných prací, které jsou dobrými průvodci pro výběry a/nebo modifikace specifických expresních systémů, např. aby byly jmenovány alespoň některé: de Boer a Shepard: “Strategies for Optimizing Gene Expression in Escherichia coli“, str. 205 až 247 v Kroon (red.) “Genes: Structure and Expression“ (John Wiley and Sons, New York, 1983). přehledný článek několika E. coli expresních systémů; Kucherlapati a spol.: 20 Critical Reviews in Biochemistry 16(4), 349 až 379 (1984) a Banerji a spol.: Genetic Engieering

5, 19 až 31 (1983) podávají přehled způsobů transfekce a transformování savčích buněk; Reznikoff a Goki (red.) “Maximizing Gene Expression“ (Butherworths, Boston, 1986) podávají přehled vybraných způsobů exprese genů v E. coli, kvasinkách a v savčích buňkách a Thilly “Mammalian Cell Technology“ (Butherworths, Boston, 1986) uvádí přehled savčích expresních 25 systémů. Podobně je dostupno mnoho přehledných souhrnných článků, které popisují techniky a podmínky pro navázání a/nebo manipulaci specifických cDNAs a expresi kontrolních sekvencí při tvorbě a/nebo modifikování expresních vektorů vhodných pro použití podle tohoto vynálezu, např. Sambrook a spol. (viz shora).

E. coli expresní systém je popsán Riggsem v USA patentu č. 4 431 739, který-je zde zahrnut jako odkaz. Zvláště užitečným prokarytickým promotorem pro vysokou expresi v E. coli je tac promotor, popsaný de Boerem v USA patentu č. 4 551 433, který-je zde zahrnut jako odkaz. Jsou dostupné také sekreční expresní vektory pro E. coli hostitele. Zvláště užitečné jsou pIN-HIompA vektory popsané Ghrayebem a spol.: EMBO J. 3, 2437 až 2442 (1984), v nichž cDNA.

která má být transkribována, je napojena na část E. coli OmpA genu kódujícího signální peptid ompA proteinu, který dále způsobuje, že maturovaný protein je sekretován do periplasmového prostoru bakterie. USA patenty č. 4 336 336 a 4 338 397 popisují také sekreci expresních vektorů pro prokaryoty. Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Vhodnými hostiteli pro prokaryotické expresní vektory jsou četné kmeny bakterií včetně kmenů E. coli, jako je například W3110 (ATCC č. 27 325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101. X1776 (ATCC č. 31 244). X2282, RR1 (ATCC č. 31 343), MRC1, kmeny Bacillus substilis a jiné enterobakterie, jako je například Salmonella tvphimurium nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas. Obecné způsoby pro odvození bakteriálních kmenů, jako je E. coli K12

XI776. použitelných pro expresi eukaryotických proteinů, jsou popsány Curtisem III v USA patentu č. 4 190 495. Tento patent je zde také zahrnut jako odkaz.

U prokaryotických a eukaroytických mikrogranismů se pro přípravu proteinů podle tohoto vynálezu používají také expresní systémy obsahující buňky odvozené od vícebuněčných 50 organismů. Zvláště zajímavé jsou savčí expresní systémy, protože jejich posttranslačni opracování pravděpodobněji produkuje biologicky aktivní savčí proteiny. Jako vektory' pro savčí hostitele bylo použito několik DNA nádorových virů. Zvláště důležité jsou četné vektory , které obsahují SV40 replikační, transkripční a/nebo translační kontrolní sekvence kondenzované

-2CZ 282523 B6 s bakteriálními replikačními kontrolními sekvencemi, např. pcd vektory vyvinuté Okayamou a Bergen, které jsou popsány v Mol. Cell. Bilo. 2, 161 až 170 (1982) a Mol. Cell. Biol. 3, 280 až 289 (1983) a zlepšené Takefou a spol.: Mol. Cell. Biol. 8, 466 až 472 (1988). Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkaz. Mezi další na SV40 založené savčí expresní vektory patří ty, které byly popsány Kaufmanem a Sharpem v Mol. Cell. Biol. 2, 1304 až 1319 (1982) a Clarkem a spol. v USA patentu č. 4 675 285, obě tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Výhodnými hostiteli shora uvedených vektorů jsou opičí buňky. Tyto vektory obsahující sekvence SV40 počátku replikace a neporušený A gen se mohou replikovat autonomně v opičích buňkách (aby se získaly vysoké počty kopií a/nebo stabilnější počet kopií než u neautonomně replikujících to plasmidu). Navíc vektory obsahující sekvence SV40 počátku replikace bez neporušeného A genu se mohou replikovat autonomně v opičích buňkách COS7 ve vysokém počtu kopií (ale nestabilně), jak je to popsáno Gluzmanem: Cell. 23. 175 až 182 (1981). Tyto buňky jsou dostupné od ATCC (pod číslem CRL 1651). Shora uvedené vektory založené na SV40 jsou schopny transformovat také jiné savčí buňky, jako jsou například myší L buňky, integrací do 15 DNA hostitelské buňky.

Pro přípravu polypetidů podle vynálezu se mohou používat také vícebuněčné organismy, například hmyzích larev, Maeda a spol.: Nátuře 315, 592 až 594 (1985) a Ann. Rev. Entomol. 351 až 372 (1989), a transgenních živočichů, Jaenisch: Science 240, 1468 až 1474 (1988).

1. Testování interieukinu-10: IL-10 vykazují některé biologické účinky, které by mohly být základem pro testy a jednotky. IL-10 mají vlastnost inhibovat syntézu alespoň jednoho cytokinu ve skupině sestávající z IFN-_T, lymfotoxinu, IL-2, IL-3 a GM-CSF v populaci T pomocných buněk indukovaných tak, aby syntetizoval jeden nebo více těchto cytokinů vystavením působení 25 buněk se syngenním antigenem (APCs) a antigenu. U této aktivity se APCs nechají zpracovat tak, že nejsou schopny replikovat, ale jejich antigen-opracovávající systém zůstává funkční. Toho se vhodně dosáhne ozářením APCs, např. asi 1500 až 3000 R (záření τ nebo X) před tím, než se smíchají s T buňkami.

Inhibice cytokinu se může testovat také primární nebo výhodněji sekundární MLR(mixedlymphocyte reaction; reakce smíchaných lymfocytů)). V tomto případě není potřeba používat svngenních APCs. MLRjsou dobře známy odborníkům, např. Bradley, str. 162 až 166 v Mishell a spol. (red.): “Selected Methods in Celluar Immunology (Freeman, San Francisco, 1980) a Battisto a spol.: Meth. In Enzymol. 150, 83 až 91 (1987). Ve stručnosti - smíchají se dvě populace allogenních lymfoidních buněk, jedna populace se před smícháním zpracuje tak, aby se zabránilo proliferaci, např. ozářením. Populace buněk se s výhodou připraví v koncentraci asi 2.10⁶ buněk na ml v doplněném médiu, např. RPMI 1640 s 10 % plodového telecího séra. Pro test jak kontrol, tak testovaných kultur se smíchá 0,5 ml každé populace. U sekundární MLR se buňky, které zbývají po sedmi dnech v primární MLR, restimulují čerstvě připravenými ozářenými stimulátorovými buňkami. Vzorek, o kterém se předpokládá, že obsahuje IL-10, se může přidat k testovaným kulturám v době smíchání a jak kontroly tak testované kultury se testují na produkci cytokinu v době 1 až 3 dny po smíchání.

Testy na IL-10 se získanými populacemi T buněk a/nebo APC populacemi používají způsoby, které jsou dobře známy odborníkům a které jsou plně popsány DiSabatem a spol. (red.).: Meth. In Enzymol. 108 (1984). APCs pro výhodný IL-10 jsou periferní krevní monocyty. Tyto monocyty se získávají standardními způsoby, např. způsobem popsaným Boyumem: Meth. In Enzymol. 108, 88 až 102 (1984), Máge: Meth. In Enzymol. 108, 118 až 132 (1984). Litvín a spol.: Meth. In Enzvmol. 108, 298 až 302 (1984), Stevenson: Meth. In Enzymol. 108. 242 až 249 (1989) a Romain a spol.: Meth. in Enzymol. 108, 148 až 153 (1984), které jsou zde zahrnuty jako odkazy. V IL-10 testech se s výhodou používají pomocné T buňky, které se získávají nejdříve oddělením lymfocytů z periferní krve a potom vybráním, např. “panning“ nebo průtokovou cytometrií, pomocných buněk pomocí komerčně dostupných anti—CD4 protilátek, např. OKT4

-3 CZ 282523 B6 popsaných v USA patentu č. 4 381 295 a dostupných od Ortho Pharmaceutical Corp. Potřebné způsoby jsou plně popsány Boymem ve Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, (Suppl. 97), 77 (1968), v Meth. In Enzymol. 108 (shora uvedená citace) a Bramem a spol.: Meth. In Enzymol. 121. 737 až 747 (1986). Obvykle se PBLs získávají z čerstvé krve odstřeďováním Ficoll-Hypaque hustotním gradientem.

V testu se mohou používat rozmanité antigeny, např. KLH (Keyhole limpet hemocyanin), drůbeží τ-globulin nebo podobné. Výhodněji, místo antigenu, jsou pomocné T buňky v testu stimulovány anti-CD3 monoklonální protilátkou, např. OKT3 popsanou v USA patentu č. 4 361 549.

Koncentrace cytokinu v kontrolních a testovaných vzorcích se měří standardními biologickými a/nebo imunochemickými testy. Konstrukce imunochemických testů pro specifické cytokiny jsou dobře známy odborníkům, jestliže je dostupný vyčištěný cytokin, např. Campbell “Monoclonal Antibody Technology” (Elsevier, Amsterodam, 1984), Tijssen: “Practise and Theory of Enzyme Immunoassays“ (Elsevier, Amsterodam, 1985) a USA patent číslo 4 486 530 jsou příklady rozsáhlé literatury o tomto předmětu. Komerčně dostupné od Goenzyme Corp. (Boston, Ma.) jsou ELISA sestavy pro lidský IL-2, lidský IL-3 a lidský GM-CSF a ELISA sestava pro lidský IFN-τ komerčně dostupný od Endogen, lne. (Boston, Ma.). Polyklonální protilátky specifické pro lidský lymfotoxin. které jsou dostupné od Goenzyme Corp., se mohou používat v radioimunoanalýze lidského lymfotoxinu, např. Chard: “An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques (Elsevier, Amsterodam, 1982).

Pro stanovení IL-10 aktivity se mohou použít také shora uvedené biologické analýzy cytokinu. Biologická analýza lidského lymfotoxinu je popsána Aggarwalem: Meth. In Enzymol. 116, 441 až 447 (1985) a Matthewesem a spol.: str. 221 až 225 Clemensem a spol. (red.) “Lymphokines and Interferons: A Practical Approach“ (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Lidský IL-2 a GM-CSF se mohou analyzovat na faktoru závislými buněčnými liniemi CTLL-2 a KG-1, které jsou dostupné od ATCC pod čísly TIB 214 a CCL 246. Lidský IL-3 se může analyzovat svojí schopností stimulovat tvorbu rozmanitých hematopoietických kolonií v kulturách měkkého agaru, např. jak popsal Metcalf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors“ (Elsevier, Amsterodam, 1984). INF-τ lze kvantifikovat antivirovými analýzami, např. Maeger, str. 129 až 147 v Clemensen a spol. (red.) (shora uvedená citace).

Produkce cytokinu se může zjišťovat mRNA analýzou. Cytokinové mRNA se mohou měřit cytoplasmovou tečkovací hybridizací jak popsali White a spol.: J. Biol. Chem. 257, 8569 až 8572 (1982) a Gillespie a spol.: USA patent č. 4 483 920. Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Mezi další možné přístupy patří blotování tečkováním s využitím vyčištěné RNA, např. kapitola 6 v Hames a spol. (red.): Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach“ (IRL Press, Whashington, D.C., 1985).

V některých případech se vzorky, které se mají testovat na IL-10 aktivitu, musí předem zpracovat tak, aby se odstranily cy tokiny, které mohou interferovat s testem. Například IL-2 zvyšuje produkci IFN-τ v některých buňkách. Podle toho, jaké pomocné T buňky se v testu používají, se IL-2 odstraňuje ze vzorku, který- je testován. Takové odstranění se vhodně provádí tak, že se vzorek nechá projít standardní kolonou s anti-cytoklinovou aktivitou.

Z důvodů vhodnosti se jednotky IL-10 aktivity definují v pojmech schopnosti IL-10 zvětšit proliferaci MC/9 buněk indukovanou IL-4, které jsou popsány v USA patentu č. 4 559 310 a které jsou dostupný od ATCC pod číslem CRL 8306. 1 jednotka/ml je definována jako taková koncentrace IL-10, která poskytuje 50 % maxima stimulace MC/9 proliferace nad hladinou IL-4 v následujícím testu: Připraví se dvojí nebo trojí zředění IL-4 a IL-10 v 50 μΐ média na jamku na standardní mikrotitrovací desce; médium obsahuje RPMI 1640, 10 % plodového telecího séra,

-4 CZ 282523 B6 μΜ 2-merkaptoethanol, 2mM glutamin, penicilín (100 jednotek na litr) a streptomycin (100 pg/l). Přidá se IL-4, 25 μΐ/jamku 1600 jednotek/ml (konečných

400 jednotek/ml) zředěných médiem a inkubuje se přes noc, např. 20 až 24 hodin. Přidá se ³Hthymidin (např. 50 mikroCi/ml v médiu) při hodnotě 0,5 až 1,0 pCi/jamku a opět se buňky 5 inkubují přes noc. potom se buňky isolují a změří se obsažená radioaktivita.

II. Čištění a farmaceutické prostředky: Jestliže k expresi polypeptidů podle tohoto vynálezu dochází v rozpustné formě, například jako sekretovaný produkt transformovaných kvasinek nebo savčích buněk, mohou se tylo polypeptidy vyčistit standardními způsoby známými odborníkům, 10 včetně stupňů srážení síranem amonným, chromatografie na ionexu, gelové filtrace, elektroforesy, afinitní chromatografie a/nebo podobných, např. “Enzyme Purification and Related Techniques. Methods in Enzymology 22, 233 až 577 (1977) a Scopes R.: “Protein Purification: Principles and Practice“ (Springer - Verlag, New York, 1982) poskytují návody pro tato čištění. Podobné jestliže se polypeptidy podle tohoto vynálezu získávají expresí 15 v nerozpustné formé, například jako agregáty, inkluzní tělesa nebo podobně, mohou se vyčistit standardními postupy známými odborníkům, mezi něž patří oddělení inkluzních tělísek z rozbitých buněk odstřeďováním, solubilizací inkluzních těles chaotropními činidly a redukujícími činidly, zředěním solubilizované směsi a snížením koncentrace chaotropního činidla a redukujícího činidla tak, že polypeptid zaujme biologicky aktivní konformaci. Poslední 20 postupy jsou uvedeny v následujících citacích, které jsou zde zahrnuty jako odkazy: Winkler a spol.: Biochemistry 25m 4041 až 4045 (1986), Winkler a spol.: Biotechnology 3, 992 až 998 (1985), Koths a spol.: USA patent č. 4 569 790 a Evropské patentové přihlášky číslo 86306917.5 a 86306353.3.

Pojem “efektivní množství“ tak, jak je zde používán, znamená množství postačující pro snížení nebo zabránění růstu nádoru. Efektivní množství pro příslušného pacienta se může měnit podle závislosti na takových faktorech, jako je stav a typ nádorového onemocnění, které se má léčit, celkový zdravotní stav pacienta způsob podávání, prudkost vedlejších účinků apod. Obvykle se IL-10 podává jako farmaceutický prostředek obsahující efektivní množství IL-10 a farmaceutický nosič. Farmaceutický nosič může znamenat jakoukoliv slučitelnou, netoxickou látku, která je vhodná pro dodávání prostředků podle tohoto vynálezu pacientovi. Obecně jsou prostředky užitečné pro parenterální podávání takových léčiv dobře známy, např. “Remington's Pharmaceutical Science“, 15. Vydání (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). Prostředky podle tohoto vynálezu se mohou do těla pacienta zavádět také implantovatelným nebo 35 injektovatelným systémem pro dodávání léčiva: např. Urquhart a spol.: Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 24. 199 až 236 (1984). Lewis a sol.: “Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals” (Plenům Press, New York, 1981), USA patent č. 3 773 919, USA patent č. 3 270 960 a podobné.

Jestliže se podává parenterálně, pak se IL-10 připraví (formuluje) jako jednotková dávková injektovatelná forma (roztok, suspense, emulze) společně s farmaceutickým nosičem. Mezi příklady takových nosičů patří normální solný roztok, Ringerův roztok, roztok dextrosy a Hankův roztok. Mohou se používat také nevhodné nosiče, jako jsou například netuhnoucí oleje a ethyl-oleát. Vhodným nosičem je 5% roztok dextrosy v solném roztoku (roztoku chloridu sodného ve vodě). Nosič může obsahovat menší množství přísad, jako jsou například látky, které zvyšují isotoničnost roztoku a chemickou stabilitu, například pufry a ochranná činidla. IL-10 se s výhodou připravuje ve formě prostředku ve vyčištěné formě, která v podstatě neobsahuje agregáty a další proteiny v koncentraci od asi 5 do asi 20 pg/ml. IL-10 se s výhodou podává kontinuální infusí tak, že jeho množství se pohybuje v rozmezí asi 50 až 800 pg podávaných 50 denně (tj. asi I až 16 pg/kg/den). Denní infuzní rychlost se může měnit podle sledování vedlejších účinků a podle počtu červených krvinek.

-5CZ 282523 B6

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady slouží pro ilustraci tohoto vynálezu. Zvolené vektory a zvolení hostitelé, koncentrace reakčních činidel, teploty a hodnoty dalších proměnných jsou pouze příklady 5 aplikací podle tohoto vynálezu a nejsou považovány jako omezení tohoto vynálezu.

Příklad 1 ío Exprese lidského CSIF v bakteriálním hostiteli

Z řady chemicky syntetizovaných fragmentů dvouvláknové DNA se sestaví syntetický lidský CSIF gen. Vytvoří se tak expresní vektor označený TAC-RBS-hCSIF. Klonování a exprese se provádí ve standardním bakteriálním systému, například E. coli K-12 kmenu JM101, JM103 15 nebo podobných, popsaných Vierou a Messingem: Gene 19, 259 až 268 (1982). Štěpení restrikčními endonukleasami a reakce s ligami se provádí podle standardních postupů, například Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ (Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 1982).

Alkalický způsob (Maniatis a spol., shora uvedená citace) se používá pro přípravu plasmidů v malém měřítku. Pro přípravy ve velkém měřítku se používá modifikace alkalického způsobu, podle něhož se pro vy srážení nukleových kyselin zvyčeřeného lyzátu použije stejný objem isopropanolu. Vysrážení studeným 2,5M octanem amonným se používá pro odstranění RNA před odstřeďováním rovnovážnou hustotou chloridu česného a detekcí ethidiumbromidem.

Při hybridizaci na filtru se pro přenesení kolonií, které se pak lysují a fixují reakcí (vždy po dobu dvou minut) s 0,5M NaOH, 1,5M NaCl a potom s ÍM Tris.HCl, pH 8.0, 1,5M NaCl a následujícím zahřátím na 80 °C (30 minut), se používají kolečka filtru Whatman 540. Hybridizace se provádí v 6 x SSPE, 20% formamidu, 0,1% dodecylsulfátu sodném (SDS), 30 100 mg/ml E. coli tRNA. 100 mg/ml barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad) při 42 °C po dobu 6 hodin s použitím ^J‘P-značených (kinasovaných) syntetických DNAs (20 x SSPE se připraví rozpuštěním 174 g NaCl, 27,6 g NaFFPO^FFO a 7,4 g ethylendiaminotetraoctové kyseliny v 800 ml vody. pH se upraví hydroxidem sodným na 7,4, objem se upraví na l litr a vzorek se steriluje v autoklávu). Filtry se promyjí dvakrát (15 minut, teplota místnosti) 1 x SSPE, 35 0,1% SDS. Po autoradiografii (Fuji RX film) se positivní kolonie umístí na filtry seřazením vyrostlých kolonií modře vybarvených. DNA se sekvenuje dideoxymetodou, Sanger a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 74, 5463 (1977). Templáty pro dideoxy-reakce jsou buď jednovláknové DNA příslušných oblastí reklonované do vektorů M13mp (např. Messing a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), nebo dvouvláknová DNA připravená minialkalickým způsobem a 40 denaturovaná 0,2M hydroxidem sodným (5 minut, teplota místnosti) a vysrážená z 0,2M hydroxidu sodného a 1.43M octanu amonného přidáním dvou objemů ethanolu. DNA se může syntetizovat fosforamiditovou chemií syntetizátorem Applied Biosystems 38OA Synthesizer; syntéza, odstranění chránících skupin, štěpení a vyčištění (7M močovinová PAGE, eluce, chromatografie na DEAE-celulose) se provádí tak, jak je to popsáno v příručce pro syntetizátor 45 380A.

Doplňková vlákna syntetických DNA, které se mají klonovat (každé 400 ng), se smíchají a fosforylují polynukleotidkinasou v reakci o objemu 50 ml. Tato DNA se liguje v objemu 50 ml za teploty místnosti 4 až 12 hodin s l mg vektorové DNA rozštěpené příslušným restrikčním 50 enzymem. Podmínky pro fosforylaci, štěpení restrikčními enzymy, polymerasové reakce a ligaci, jsou popsány v literatuře (Maniatis a spol.: shora uvedená citace). Spočtou se kolonie na lacZ+ (jestliže je to žádáno) vysetím na L agar doplněný o ampicilin, isopropyl-l-thiobeta-Dgalaktosid (IPTG) (0,4mM) a 5-brom-4-ehlor-3-indolyl~beta-D-galaktopyranosid (x-gal) (40 mg/ml).

-6CZ 282523 B6

Vektor TAC-RBS se zkonstruuje doplněním DNA polymerasou jediného Bam HI místa tacPnesoucího plasmidu pDR540 (Pharmacia). Ten se potom liguje s nefosforylovanými oligonukleotidy (Pharmacia), které tvoří dvojvláknový fragment kódující souhlasné ribosomové s vazebné místo, jak je to uvedeno v sekvenci identifikační číslo 5, a označí se RBS. Po ligaci se směs fosforyluje a religuje s Sstl linkerem ATGAGCTCAT. Tento komplex se pak rozštěpí působením Sstl a EcoRI. Elektroforesou na polyakrylamidovém gelu (PAGE) se isoluje fragment o 173 párech nukleotidů (pn). Tento fragment se klonuje do pUC19 (Pharmacia) rozštěpeného působením EcoRI a Sstl (jak shora popsáno). Sekvence RBS-ATG-polylinkerových oblastí ίο konečné konstrukce (nazvaná TAC-RBS) je uvedena na obrázku 3.

Tento syntetický IL-10 gen se vestaví do plasmidu pUC19 v osmi stupních. V každém stupni inserty bez delecí anebo insercí se mohou detegovat po klonování zachováním lacZ(a) genu pUC19 v oblasti s ATG start kodonem vloženým ve stupni 1. Klony, které obsahují deleční 15 a/nebo inserční změny, se mohou odfiltrovat vyhodnocením modrých kolonií na Lampicilinových deskách obsahujících x-gal a IPTG. V každém stupni se sekvence insertů mohou snadno potvrdit použitím universálního sekvenačního primeru při přípravách plasmidové DNA v malém měřítku, např. dostupných od Boehringer Mannheim.

Ve stupni 1 se vektor TAC-RBS rozštěpí působením Sstl, nechá se zreagovat ss T4 DNA polymerasou (jejíž 3'-exonukleasová aktivita štěpí 3'-přečnívající vlákna Sstl štěpů za vzniku fragmentů se zarovnanými konci) a po deaktivaci T4 DNA polymerasy, se nechá zreagovat s EcoRI. Vznikne tak fragment o 173 párech nukleotidů obsahující TAC-RBS oblast, který· má zarovnaný konec na ATG start kodonu a EcoRI rozštěpení na opačném konci. Nakonec se isoluje fragment TAC-RBS o 173 párech nukleotidů.

Ve stupni 2 se isolovaný TAC-RBS fragment ze stupně 1 smíchá s plasmidem pUC19 rozštěpeným působením EcoRI a KpnI a syntetický fragment 1A/B uvedený v níže uvedené sekvenci identifikační číslo 6 má zarovnané konce na konci proti směru vlákna a posunuté konce 30 odpovídající štěpu KpnI na svém konci po směru vlákna. Tento KpnI konec je přilehlý k místu

BstEII o po směru vlákna místa BstEII. Tyto fragmenty se ligují. Vytvoří se pUC19 stupně 2.

Ve stupni 3 se syntetický fragment 2A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 7 a 3A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 8 smíchá s plasmidem pUC19 ze stupně 2 rozštěpeným 35 působením BstEII a Smál (po amplifikaci a vyčištění) a liguje se za vzniku plasmidu pUC19 stupně 3. Povšimněte si, že konec po směru vlákna fragmentu 3A/B obsahuje další nukleotidy, které tvoří Smál zarovnaný konec. Tyto další nukleotidy jsou štěpeny ve stupni 4. Také fragmenty 2A/B a 3A/B mají doplňkové jednovláknové konce o 9 zbytcích, které se anelují po smíchání a zanechávají tak BstEII štěp 2A/B proti směru vlákna a zarovnaný konec 3A/B po 40 směru vlákna pro ligování na pUC19.

Ve stupni 4 se pUC19 ze stupně 3 rozštěpí působením AflII a Xbal, amplifikuje, vyčistí, znovu vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 4A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 9 a liguje za vzniku pUC19 za stupně 4.

Ve stupni 5 se pUC19 ze stupně 4 rozštěpí působením Xbal a Salí, amplifikuje a vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 5A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 10 a liguje se za vzniku pUC190 ze stupně 5. Povšimněte si, že Sall posunutý· konec fragmentu 5A/B se odstraní štěpením působením Hpaí ve stupni 6.

Ve stupni 6 se pUC19 ze stupně 5 rozštěpí působením Hpaí a Pstl, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 6A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 11 a liguje za vzniku pUC19 ze stupně 6.

-7CZ 282523 B6

Ve stupni 7 se pUC19 ze stupně 6 rozštěpí působením Clal a Sphl, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 7A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 12 a liguje za vzniku pUC19 ze stupně 7.

Ve stupni 8 se pUC ze stupně 7 rozštěpí působením Mlul a HindlII, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickými fragmenty 8A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 13 a 9A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 14 a liguje za vzniku konečné konstrukce, která se pak vloží do E. coli K-12 kmen JM101, např. dostupný od ATCC pod číslem 33 876, standardními způsoby, io Po kultivaci se protein extrahuje z buněk JM101. Zředění extraktů se testují na biologickou aktivitu.

Příklad 2

Exprese vIL-10 v opičích buňkách COS 7

Gen, který kóduje otevřenou čtecí oblast pro vIL-10, se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím primerů, které umožňují pozdější vložení amplifikovaného fragmentu do 20 vektoru pcD(SRa) rozštěpeného působením EcoRI (obrázek 1). Kódující vlákno vloženého fragmentu je uvedeno v sekvenci identifikační číslo 15.

Klony, které nesou insert v příslušné orientaci, se identifikují expresí vIL-10 a/nebo elektroforetickou sestavou restrikčních štěpů. Jeden takový vektor, nesoucí gen vIL-10, se označí 25 pBCRFl(SRa). Tento vektor byl uložen v ATCC pod číslem 68 193. PBCRFl(SRa) se amplifikuje v E. coli MCI061, isoluje se standardními způsoby a použije se pro transfekci opičích buněk COS 7 následujícím způsobem: Jeden den před transfekci se přibližně 1,5.10⁶opičích buněk COS 7 vyseje na jednotlivé 100 mm misky v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca (DME), které obsahuje 5 % plodového telecího séra (FCS) a 2 mM glutaminu. 30 Pro provedení transfekce se buňky COS 7 odstraní z misek inkubací s trypsinem, promyjí se dvakrát DME bez séra a suspendují se na množství 10⁷ buněk/ml v DME bez sera. 0,75 ml podíl se smíchá s 20 μg DNA a přenese se do sterilní 0,4 cm elektroporační kyvety. Po 10 minutách se na buňky působí pulsem 200 voltů, 960 μΕ v jednotce BioRad Gene Pulser. Po dalších deseti minutách se buňky odstraní z kyvety a přidají se ke 20 ml DME obsahujícího 5 % FCS, 2 mM 35 glutaminu, penicilín, streptomycin a gentamycin. Tato směs se rozdělí na stejné díly do čtyř 100 mm misek pro tkáňové kultury. Po 12 až 24 hodinách při 37 °C s 5 % oxidu uhličitého se médium nahradí podobným médiem, které obsahuje pouze 1 % FCS a v inkubaci se pokračuje dalších 72 hodin při 37 °C s 5 % CCty Potom se médium isoluje a testuje se na schopnost inhibovat syntézu IFN-τ.

Desetimililitrové podíly čerstvě isolovaných PBL (asi 2.10⁶ buněk/ml) se inkubují při 37 °C sPHA (100 ng/ml) v médiu, které sestává z i) 90% DME doplněného 5% FCS a 2 mM glutaminu a ii) 10% supematantu z buněk COS 7 předem zpracovaných s pBCRFl(SRa). Po 24 hodinách se buňky a supematanty isolují a testují se na přítomnost buď IFN-τ mRNA, nebo 45 IFN-τ proteinu. Kontroly byly připraveny stejným způsobem až na to, že 10% supematantu z kultury COS 7 bylo předem transfektováno s plasmidem nesoucím nepříbuzný cDNA insert. vIL-10 - zpracované vzorky vykazovaly asi 50 % inhibici syntézy IFN-τ vzhledem ke kontrole.

-8CZ 282523 B6

Příklad 3

Exprese vIL-10 v Esherichia coli

Gen, který kóduje maturovaný vIL-10 uvedený v sekvenci identifikační číslo 4, může být expresován v E. coli.

cDNA insert pBCRFl(SRct) se reklonuje do plasmidu M13, kde se změní dvojitou místně řízenou mutagenesí: Nejdříve se vytvoří místo Clal na 5'-konci kódující oblasti pro maturovaný ío vIL-10 polypeptid a potom se vytvoří místo BamHI na 3'-konci kódující oblasti pro maturovaný vIL-10 polypeptid. Mutovaná sekvence se pak ihned vloží do dále popsaného TRPC11 expresního vektoru.

Vektor TRPC11 se zkonstruuje ligací syntetického souhlasného RBS fragmentu s Clal linkery (ATGCAT) a klonováním výsledných fragmentů do pMTllhc (který byl předem modifikován tak, aby obsahoval místo Clal) rozštěpeného působením Clal. PMTllhc je malý (2 300 párů nukleotidů) AMP^R, TET^R derivát plasmidu pBR322 o vysokém počtu kopií, který nese EcoRIHindlII polylinkerovou oblast plasmidu kVX (tcVX je popsán Maniatisem a spol.: “Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Tento plasmid byl modifikován tak. aby obsahoval místo Clal štěpením pMTllhc působením EcoRI a BamHI, doplněním výsledných přečnívajících konců a ligací s Clal linkerem (CATCGATG). Obnoví se tak místa EcoRi a BamHI a místo Smál se nahradí místem Clal. Jeden transformant z konstrukce TRPCÍ l měl tandem RBS sekvence obklopený místy Clal. Jedno z Clal míst a část druhé kopie RBS sekvence se odstraní rozštěpením tohoto plamidu působením Pstl, zpracováním s nukleasou 25 Bal31, štěpením působením EcoRi a reakcí s T4 DNA polymerasou v přítomnosti všech čtyř deoxynukleotidtrifosfátů. Výsledné fragmenty o 30 až 40 párech nukleotidů byly isolovány PAGE a klonovány do pUC12 rozštěpeného působením Smál. E. coli trpP-nesoucí EcoRi fragment o 248 párech nukleotidů odvozený od pKClOl (popsaný Nicholsem a spol. v Methods in Enzymology 101. str. 155 (Academie Press, N.Y. 1983) se pak klonuje do místa EcoRi.

Doplní se tak konstrukce TRPCÍ 1, která je ilustrována na obrázku 2. TRPCÍ 1 se použije jako vektor provIL-10 nejdříve rozštěpením působením Clal a BamHI, vyčištěním a potom smícháním ve standardním ligačním roztoku s Clal-BamHI fragmentem M13 obsahujícím sekvenci nukleotidů kódující maturovaný BCRF1. TRPCÍ 1, který obsahuje insert, označený jako TRPCÍ 1-BCRF1, se množí v E. coli K12 kmen JM101, např. dostupném z ATCC pod číslem 35 33 876.

Příklad 4

Potlačení nádorů u myší účinkem IL-120

Vliv IL-10 na růst nádorů byl testován v testu podobném tomu, který popsal Tepper a spol.: Cell 57, 503 až 512 (1989). Stručně - tento test, jak je zde používán, zahrnuje oddělené injekční podání dvou skupin buněk syngenní nádorové buněčné linie myším; jedna skupina je stabilně 45 trasfektována plasmidem expresujícím IL-10, druhá skupina znamená netransfektovanou kontrolu. Potom se srovná výskyt tvorby nádorů u myší, kterým byly injekčně podány buňky těchto dvou skupin.

Ve všech pokusech byly myším BALB/c injekčně podány buď transfektované, nebo netransfektované NS1 myelomové nádorové buňky, které jsou dostupné z ATCC pod číslem TIB 18. Buňky NS1 byly transfektovány elektroporací plasmidem pGSRG (ilustrovaným na obrázku 3) nesoucím otevřenou čtecí oblast (ORF) myšího IL-10, virového IL-10 nebo lidského IL-10 vloženou do restrikčního místa Xho 1. pGSRG obsahuje markér pro stanovení stabilně

-9CZ 282523 B6 transfektovaných buněk NS1 a je derivátem pSVDtp popsaným Schneem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 84, 6904 až 6908 (1987). IL-10 inserty pro pGSRG se získávají následujícím postupem. PCR primery obsahující sekvence EcoRI linkeru se připraví pro každý z plasmidu pH5C, pBCRFl a pcD(SRoc)-Fl 15 tak, aby se ORF příslušných cDNA insertů mohly amplifikovat. Amplifikované ORF se reklonují do pcD(SRa) vektorů rozštěpených působením EcoRI a odděleně se expresuji tak, aby se vybraly vektory, které obsahují ORF se správnou orientací. A konečně se Xhol fragmenty plasmidu pcD(SRa) reklonují do příslušných pGSRG plasmidů rozpuštěných působením Xhol.

Buňky NS1 se transfektují plasmidem pGSRG následujícím způsobem. Buňky (2 až 3.10⁶) z polokonfluentní 100 mm Petriho misky se odstřeďují, promyjí se jednou 10 ml sterilního fosforečnanem pufrovaného sterilního solného roztoku (PBS), odstřeďují a resuspendují v 0,5 ml PBS. V 1 ml PBS se suspenduje 20 až 100 pg plasmidové DNA. Buňky se smíchají s DNA, umístí se do kyvety v ledu a elektricky se na ní působí šoky v zařízení Bio-Rad gene Pulser nastaveném na kapacitu 960 mikrofardů a 200 až 300 voltů. Po deseti minutách v ledu se buňky vysejí na standardní mikrotitrovací desku s 96 jamkami v objemu 100 μΐ. Po 48 až 78 hodinách se do každé jamky přidá 100 μΐ selekčního média s mykofenolovou kyselinou (0,5 pg/ml mykofenolové kyseliny, 100 pg na ml xanthinu, 15 pg/ml hypoxanthinu, 12 až 15 % plodového telecího séra, 600 pg/ml glutaminu v DME High glukose).

V prvním pokusu se intraperitoneální injekcí 4, 3, 4 a myším podá 5.10⁶ netransformovaných buněk (kontrola), pGSRG-mlL 10-transformovaných buněk, pGSRG-vILlO-transformovaných buněk a pGSRG-hlL 10-transformovaných buněk. Po čtyřech týdnech se třem ze čtyř kontrolních myší vyvinuly viditelné nádory. U žádné z pokusných myší se nevyvinuly nádory během 4 tý dnů.

V druhém pokusu se intraperitoneální injekcí 16 myším podá 5.10° netransformovaných buněk a 15 myším se intraperitoneálně podá 5.10⁶ pGSRG-mlL 10-transformovaných buněk. Po dvou týdnech se osmi kontrolním myším znovu injekčně podá 5.10⁶ netransformovaných buněk a 7 z 15 myší 5.10⁶ pGSGR-mIL 10-transformovaných buněk. Po čtyřech týdnech od původních injekcí se myši zkoumají na přítomnost vývoje nádorů. U 16 ze 16 kontrolní myší, byly vyvinuty viditelné nádory'. U žádné z pokusných myší se nevyvinuly žádné známky nádorů.

Popisy předcházejících uspořádání podle vynálezu jsou zde popsány pro účely ilustrace a popisu. Nejsou zamýšleny jako vyčerpávající nebo jako omezující tento vynález na přesné zde popsané formy. Je zřejmé, že vedle shora uvedeného popisu existuje mnoho modifikací a variací. Tato uspořádání byla vybrána a popsána, aby nejlépe vysvětlila principy tohoto vynálezu, a tím umožnila jiným zručným odborníkům co nejlépe využít vynález v různých uspořádáních a s různými modifikacemi podle toho, jak je toho potřeba. Rozsah vynálezu je definován připojenými body patentových nároků.

Žadatelé uložili kultury E. coli MC1061 nesoucí pH5C, pH15C a pBCRF(SRa) v Americké sbírce typů kultur (Američan Type Culture Collection), Rockville, Md., USA (ATCC) pod čísly 68 191, 68 192 a 68 193. Tato uložení byla provedena za podmínek stanovených ATCC dohodou o ukládání kultur pro patentové účely, podle které se zajišťuje, že uložení budou dostupná USA úřadu pro patenty a ochranné známky podle 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a budou veřejně dostupná po vydání USA patentu, což vyžaduje, aby tato uložení byla uchovávána. Dostupnost uloženého kmene není konstruována jako licence k praktickému využívání vynálezu v rozporu s právy garantovanými autoritou jakékoliv vlády v souladu s jejími patentovými nároky.

- 10CZ 282523 B6

V následující části tohoto spisuje uveden seznam sekvencí.

Sekvence identifikační číslo: 1

Typ sekvence: aminokyselinová

Délka sekvence: 178 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Původní zdroj (organismus): člověk

Vlastnosti: lidský IL-10 (lidský inhibiční faktor syntézy cytokinu, lidský CSIF)

Met

His

Ser

Ala 5

Leu

Cys

Leu 10

Val

Leu

Thr

Gly 15

Val

Arg

Ala

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

20

25

30

Thr

His

Phe

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

35

40

45

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

50

55

60

Leu

Asp

Asn

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

65

70

75

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

80

85

90

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

95

100

105

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

110

115

120

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

125

130

135

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

140

145

150

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

155

160

165

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

170 175

Sekvence identifikační číslo: 2

Typ sekvence: aminokyselinová

Délka sekvence: 170 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Vlastnosti: virový IL-10 (BCRF1)

Met

Glu

Arg

Leu 5

Val

Thr

Leu

Gin 10

Cys

Leu

Val

Leu

Leu 15

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Cys

Gly

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

20

25

30

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

40 45

- 11 CZ 282523 B6

Thr

Phe

Gin

Thr 50

Lys

Asp

Glu

Val

Asp 55

Asn

Leu

Lys 60

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

65

70

75

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

80

85

90

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

95

100

105

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

110

115

120

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

125

130

135

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

140

145

150

Met

Ser

Glu

phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

155

160

165

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

170

Sekvence identifikační číslo: 3

Typ sekvence:aminokyselinová

Délka sekvence: 160 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Původní zdroj (organismus): člověk

Vlastnosti: maturovaný lidský IL-10 (maturovaný lidský CSIF)

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly 5

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn 10

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

20

25

30

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

65

70

75

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

80

85

90

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

95

100

105

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

110

115

120

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

125

130

135

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

140

145

150

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

155 160

- 12CZ 282523 B6

Sekvence identifikační číslo: 4

Typ sekvence: aminokyselinová

Délka sekvence: 147 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Vlastnosti: virový IL-10 (BCRF1)

10

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

5

10

15

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

20

25

30

Val

Asp

Asn

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

15

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

65

70

75

20

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

95

100

105

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

25

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

30

140

145

Sekvence identifikační číslo: 5

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 15 nukleotidů

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická (komerční, Pharmacia)

Vlastnosti: dvojvlákonový fragment kódující souhlasné ribosomové vazebné místo

GTAAGGAGGT TTAAC

Sekvence identifikační číslo: 6

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 56 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Charakteristika: malá písmena znamenají, že nukleotid se liší od nukleotidů přírodní sekvence ve stejném místě

- 13 CZ 282523 B6

Vlastnosti: fragment 1A/B syntetického CSIF genu

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCCCAGG 50

TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGGGTCC tAACCggtac 60 aTTGGc

Sekvence identifikační číslo: 7

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 48 párů nukleotidů s přečnívajícími konci s 5 a 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Charakteristika: malá písmena znamenají, že nukleotid se liší od nukleotidu přírodní sekvence ve stejném místě

Vlastnosti: fragment 2A/B syntetického CSIF genu

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTG 50

GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTCTCAC

AAGACTTTCT TT 62

TTC

Sekvence identifikační číslo: 8

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 35 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem s 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Charakteristika: malá písmena znamenají, že nukleotid se liší od nukleotidu přírodní sekvence ve stejném místě.

Vlastnosti: fragment 3A/B syntetického CSIF genu

C AAATGAAGGA TCAGCTGGAC AACTTGTTcT tAAG 35

TGAAAGAAAG TTTACTTCCT AGTCGACCTG TTGAACAAgA aTTC

Sekvence identifikační číslo: 9

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 69 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

-14 CZ 282523 B6

Vlastnosti: fragment 4A/B syntetického CSIF genu

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGAACAG

TGAGATGATC CAGTTTTAt

ACTCTACTAG GTCAAAATaG AtC io Sekvence identifikační číslo: 10

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 61 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 5A/B syntetického CSIF genu

CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCAAGGC 50

GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGTTCCG

GCATGTtAAC g 61

CGTACAaTTG cagct

Sekvence identifikační číslo: 11

Typ sekvence: nukleotid

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 6A/B syntetického CSIF genu

	AACTCCCTGG TTGAGGGACC	GGGAGAACCT CCCTCTTGGA	GAAGACCCTC CTTCTGGGAG	AGGCTGAGGC TCCGACTCCG	TACGGCGCTG ATGCCGCGAC	50
45	TCATCGATct AGTAGCTAg	gca				63

Sekvence identifikační číslo: 12

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence:

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

15CZ 282523 B6

Vlastnosti: fragment 7A/B syntetického CSIF genu

CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA 50

TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACTTCTT cGCgTgcatg 60 gCGcAc

Sekvence identifikační číslo: 13

Typ sekvence: 45 párů nukleotidů s přečnívajícími konci se 4 a 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 8A/B syntetického CSIF genu

CGCGTTTATT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATGAGTG 50

ΆΑΑΤΤΑ TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTACTCA

AGTTTGAC 58

Sekvence identifikační číslo: 14

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 51 párů nukleotidů s přečnívajícími konci s 9 a 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 9A/B syntetického CSIF genu

A TCTTCATCAA CTACATAGAA GCCTACATGA CAATGAAGAT 50

CTCAAACTGT AGAAGTAGTT GATGTATCTT CGGATGTACT GTTACTTCTA

ACGAAACTGA 60

TGCTTTGACT tcga

Sekvence identifikační číslo: 15

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 499 nukleotidů

Druh vlákna: jednovláknová Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Vlastnosti: kóduje virový IL-10

- 16CZ 282523 B6

AATTC ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG 44

CTG CTT TAC CTG GCA CCT GAG TGT GAC AAT TTT CCC CAA ATG TTG AGG AGT CGT GTT AAA ACC TTT TTC CAG AAC CTT TTG CTC AAG GAG TCT CTG TAC CTT GGA TGC CAG GCC CTG TCA CTG GAG GAA GTC ATG CCA CAG GCT GCT AAG GAC CAT GTC AAT TCT TTG CTA CGG CTC CGC CTG CGC AGG TGC GAG AAC AAG AGT AAA GCT GTG GAA AAC AAG CTG CAG GAA AAA GGA ATT TTT GAC ATT TTT ATT AAC TAC ATA AAA GCC AGG TGA G

GGA GGT ACA GAC CAA TGT 86 GAC CTA AGA GAT GCC TTC 128 ACA AAG GAC GAG GTA GAT 170 CTA GAG GAC TTT AAG GGC 212 GAA ATG ATC CAA TTC TAC 254 GAA AAC CAG GAC CCG GAG 296 GGT GGA AAT CTA AAG ACC 338 CAC AGG TTC CTG CCG TGT 380 CAG ATA AAA AAT GCC TTT 422 TAC AAA GCC ATG AGT GAA 464 GAA GCA TAC ATG ACA ATT 506

519

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití lidského interleukinu-10 nebo virového interleukinu-10 pro výrobu léčiva pro léčení nádorů u pacienta.

2. Farmaceutický prostředek pro léčení nádorů, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku lidský interleukin-10 nebo virový interleukin-10 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.

3 výkresy

- 17CZ 282523 B6

Obrázek 1

-18CZ 282523 B6

Clal

EcoRI RBS Clal

GflflŤŤČcCRGGTTTflflCGTfiRGGRGGTTTfifiCCRTCGRTG

Obrázek 2

- 19CZ 282523 B6 c o u ·*-* c