CN1599754A - 抗trail－r抗体 - Google Patents

Abstract

抗TRAIL－R1和TRAIL－R2的抗体或其功能性片段，所述抗体具有至少一种选自以下(a)－(c)的特性：(a)具有诱导表达TRAIL－R1和/或TRAIL－R2的癌细胞凋亡的活性；(b)对表达TRAIL－R1和/或TRAIL－R2的人正常细胞没有影响；和(c)不诱导对人肝细胞的损害。

Description

抗TRAIL-R抗体

发明领域

本发明涉及识别参与细胞凋亡的细胞膜分子TRAIL受体1(TRAIL-R1)或TRAIL受体2(TRAIL-R2)的抗TRAIL受体(TRAIL-R)抗体。

此外，本发明涉及含有抗TRAIL-R抗体作为有效成分的预防药或治疗药以及使用该预防药或治疗药抵抗由表达TRAIL-R的细胞引起的疾病，并且本发明尤其涉及抵抗恶性肿瘤所用的治疗药物。

发明背景

在活的生物体中，由正常细胞改变所引起的生理性细胞死亡被称为凋亡，而所述凋亡不同于坏死，坏死为病理性细胞死亡[参见Kerr等(1972)Br.J.Cancer 26，239]。凋亡是一般在例如胚胎发生过程和淋巴细胞(T细胞和B细胞)选择中所观察到的现象[参见Itoh，S.等(1991)Cell 66，233-243]。人们认为，当本来应该通过凋亡清除的细胞未被清除时，可以引起癌症、狼疮、疱疹病毒感染和其它问题。此外，当本来应该存活的细胞通过凋亡清除时，可以引起诸如AIDS、早老性痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、色素性视网膜炎、再生障碍性贫血、心肌硬塞、脑卒中或毒性物质诱导的肝病等疾病和病理病症[参见Kataoka，S.等(1996)The Oncologist 1，399-401]。

在细胞凋亡期间，观察到各种特征性现象，例如细胞表面弯曲、核染色质凝聚、染色体DNA碎裂和线粒体功能丧失。各种内在和外在信号被认为引起这些细胞改变。已有报道，癌基因例如myc和bcl-2以及肿瘤抑制基因例如p53作为内在信号参与细胞凋亡的诱导[参见KATAOKA等，(1993)JIKKEN IGAKU 11，17，2324-2328]。已知化疗药物、辐射等作为外在信号诱导细胞凋亡[参见KATAOKA等，(1994)SAISHIN IGAKU 49，6，1152-1157]。

作为参与细胞凋亡的分子，已经鉴定出属于肿瘤坏死因子家族(TNF家族)例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和Fas配体的分子。已有报道，TNF-α和TNF-β诱导癌细胞凋亡[参见Schmid等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83，1881；参见Dealtry等，(1987)Eur.J.Immunol.17，689]。由于具有突变Fas或Fas配体的小鼠发生自身免疫病的病症，因此强有力的表明，Fas配体具有通过细胞凋亡清除周边自身反应性淋巴细胞的功能[参见Krammer等，(1994)Curr.Op.Immunol.6，279-289；参见Nagata等，(1995)Science 267，1449-1456]。已有报道，与Fas特异性结合的激动性小鼠单克隆抗体发挥作用使针对癌细胞的细胞凋亡诱导活性至与TNF-α所发挥的水平相同的水平[Yonehara等，(1989)J.Exp.Med.169，1747-1756]。

这些TNF家族分子通过与细胞表面特异性受体结合将各种信号传递至细胞。TNF家族分子的多种受体是已知的，它们被称为TNF受体家族分子。

TNF受体家族分子由胞外结构域的富半胱氨酸重复的存在来限定。其中，Fas和TNFR1，均为Fas配体和TNF-α的受体，在细胞内含有被称为“死亡结构域”的区域，该区与果蝇自杀基因reaper共享同源性[参见Golstein，P.等，(1995)Cell 81，185-186；参见White，K.等(1994)Science 264，677-683]，并且该死亡结构域是细胞凋亡信号转导所必不可少的。Fas的活化启动含有死亡结构域的衔接分子FADD/MORT1的缔合，然后诱导与FADD/MORT1结合的caspase-8的活化。活化caspase-8激活序列中的下游caspase分子，从而最终导致细胞凋亡[参见Nagata，S.，(1997)Cell 88，355-365]。

最近，已经发现诱导细胞凋亡的新型TNF家族分子。Wiley等[参见Immunity(1995)3，673-682]将所述分子命名为“TNF相关细胞凋亡诱导配体”，或者简称为“TRAIL”。该分子也称为“Apo-2配体”或“Apo-2L”[参见Pitt，R.M.等(1996)J.Biol.Chem.271，12687-12690]。为了方便起见，在本说明书中，将该分子称为TRAIL。

与Fas配体不同，在许多人体组织(例如脾脏、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小肠、大肠、外周血淋巴细胞、胎盘和肾脏)中，检测出显著性水平的TRAIL。在某些细胞系中，TRAIL经组成型转录。也已表明，TRAIL以比通过TNF诱导快得多的节拍快速激活细胞凋亡，其时间框类似于Fas的死亡信号转导[参见Marsters，S.A.等，(1996)Curr.Biol.6，750-752]。

现在，5种蛋白已经被鉴定为TRAIL受体。已有报道，2种受体TRAIL-R1(也称为DR4)和TRAIL-R2(也称为DR5)在胞内区中均具有死亡结构域。TRAIL-R1的转录物在包括脾脏、外周血淋巴细胞、小肠和胸腺在内的许多人体组织中被识别。在包括脾脏、外周血淋巴细胞和卵巢在内的许多组织中检测出TRAIL-R2的转录物[参见Pan，G.等(1997)Science 276，111-113；参见Pan，G.等(1997)Science 277，815-818；参见Walczak，H.等(1997)EMBO J 16(17)5386-5397]。

在癌细胞中存在由可变剪接产生的TRAIL-R2的两种形式和包含440个氨基酸的高表达量的TRAIL-R2已有报道[参见Screaton，G.R.等，(1997)Curr Biol 7(9)，693-696；参见Arai，T.等，(1998)CancerLetters 133，197-204]。

重组人TRAIL是一种包含TRAIL胞外区的重组蛋白，并且在许多类型的癌细胞中诱导细胞凋亡已有报道[参见Griffith，T.S.等(1998)Curr.Opin.Immunol.，10，559-563]。

此外，采用人结肠癌细胞和乳腺癌细胞，所述重组人TRAIL对携带肿瘤的小鼠模型产生影响[参见Walczak，H.等(1999)NatureMedicine 5，2，157-163]。与也属于TNF受体家族并且具有细胞凋亡诱导活性的TNF-α或FAS配体不同，TRAIL对小鼠或猕猴的正常组织不造成损害[参见Ashkenazi，A.等(1999)J.Clin.Invest.104，155-162]。

根据这些报道，人们认为，TRAIL选择性地诱导肿瘤细胞死亡。然而，这样的选择性尚未有理论支持，因为TRAIL受体也在正常细胞中表达。此外，所述重组人TRAIL诱导正常人肝细胞凋亡最近也有报道[参见Jo，M.等(2000)Nature Medicine 6，No.5，564-567]以及也诱导人脑细胞凋亡已有报道[参见Nitsch，R.等(2000)The Lancet 356，827-828]。因为诱导肝细胞凋亡的激动性抗Fas抗体在非常短的时间内诱导暴发性肝炎，因而引起小鼠和黑猩猩死亡，TRAIL对肝细胞的细胞死亡诱导引起人们注意到一个特别有意义的问题。利用TRAIL作为人用药品的安全性一直成问题[参见Nagata，S.等(2000)NatureMedicine 6，5，502-503]。

也有报道，TRAIL对肝细胞的细胞死亡诱导活性的存在与否取决于重组TRAIL蛋白的类型[参见Lawrence，D.(2001)NatureMedicine 7，4，383-385]。然而，重组TRAIL蛋白的安全性仍在研究之中。

最近，首次报道了抗Fas抗体当给予小鼠时不诱导肝病[参见Ichikawa，K.等(2000)International Immunology 12，No.4，555-562]。还没有证实不引起肺病的已知重组Fas配体。这表明，可以获得具有配体所没有的活性的抗体。然而，还未揭示出所述抗体诱导T细胞凋亡但却没有肝毒性的原因的理论背景。例如，就诸如TRAIL的一种不同抗原而论，尚未证实是否可以获得没有毒性的激动性抗体。

TRAIL与TRAIL-R1、TRAIL-R2或者它们两者结合，并诱导细胞凋亡。然而，通过所述受体，诱导肝细胞凋亡的信号通过TRAIL介导尚未被证实。此外，基于通过给激动性抗体加入TRAIL-R1/R2选择性是否可以避免肝毒性的构思，一直没有进行过研究。

有效治疗恶性肿瘤的方法包括清除癌细胞和保护正常组织或细胞。其作用机制为通过重组人TRAIL诱导细胞凋亡的药物可能对正常组织、特别肝脏和脑造成损害，即使所述药物能够清除癌细胞。

目前，使用单克隆抗体例如靶向CD20(细胞膜上存在的一种受体)的嵌合抗体和靶向Her2/neu的人源化抗体来抵抗目标疾病恶性肿瘤，其治疗效果已得到普遍认可。由于抗体的特征包括血液中半寿期长和对抗原的高特异性，因此它们尤其可用作抗肿瘤药。例如，就靶向肿瘤特异性抗原的抗体而论，认为所给予的抗体在肿瘤中累积。因此，可以预期通过免疫系统的补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞介导细胞毒性攻击癌细胞。另外，诸如放射性核素、细胞毒性物质等药物与所述抗体的结合能够将与所述抗体结合的药物有效传递至肿瘤部位。同时，由于到达其它非特异性组织的药物量减少，因此可以预期副作用降低。当肿瘤特异性抗原具有诱导细胞死亡的活性时，给予具有激动性活性的抗体，而当肿瘤特异性抗原参与细胞增殖和存活时，给予具有中和活性的抗体。因此，由于所述抗体的活性，可以预期肿瘤特异性抗体的累积和肿瘤生长的抑制或者肿瘤的消退。

人们认为，因为上述特征，适于将抗体用作抗肿瘤药。另外，如果抗体是针对TRAIL受体的抗体，则可以获得可以避免对肝脏造成损害的抗体，并且该抗体具有针对癌细胞的等同细胞凋亡诱导活性，而对肝脏造成损害是用重组人TRAIL所不能避免的。

发明概述

本发明的第一个目的是提供一种新型抗体或其分子类似物，所述新型抗体或其分子类似物能够与人TRARIL-R1和/或人TRAIL-R2结合并且特异性地诱导癌细胞凋亡，而不会引起正常人肝细胞的损害，但重组人TRAIL却可能对正常人肝细胞产生损害。本发明的第二个目的是提供一种包含上述抗体或其分子类似物作为有效成分的预防药或治疗药，以抵抗目前难以治疗的各种恶性肿瘤，包括实体瘤。

由于对制备抗人TRAIL-R1和人TRAIL-R2的抗体进行了深入研究，我们通过下述步骤从培养上清液中成功地获得了单克隆抗体：通过基因工程技术，用人TRAIL-R1或人TRAIL-R2免疫能够产生人抗体的转基因小鼠，采用Kohler和Milstein等的方法[参见(1975)Nature 256，495]，产生杂交瘤，从而产生与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合的新型单克隆抗体，该方法一般用于单克隆抗体的生产。

此外，我们由于发现所述新型单克隆抗体通过与癌细胞表面存在的TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合而特异性地诱导癌细胞凋亡，而完成了本发明。

本发明描述如下：

(1)一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合。

上述抗体或其功能性片段具有至少一种选自以下(a)-(c)的特性：

(a)具有诱导表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌细胞凋亡的活性；

(b)对表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常细胞没有影响；和

(c)不诱导人肝细胞毒性。

在本发明中，优选具有所有上述特性(a)-(c)的抗体或其功能性片段。此外，本发明的抗体或其功能性片段也包括具有至少一种以上(a)-(c)的特性的抗体或其功能性片段，并且(1)本发明抗体或其功能性片段与TRAIL-R2结合，但不与TRAIL-R1结合，或者(2)本发明抗体或其功能性片段既与TRAIL-R2结合也与TRAIL-R1结合。

(2)上述抗体是一种由小鼠-小鼠杂交瘤例如E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304或KMTR1产生的单克隆抗体，最好是人抗体。由E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、0304或KMTR1产生的单克隆抗体类型为免疫球蛋白G(IgG)，而由G-3-10产生的单克隆抗体类型为免疫球蛋白M(IgM)。上述杂交瘤中的H-48-2、E-11-13、F-4-8、L-30-10、0304和KMTR1已分别进行国际保藏，保藏信息如下。

名称	保藏号	保藏日	保藏地点：
				H-48-2	FERM BP-7599	2001年5月18日	独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International PatentOrganismDepositary，NationalInstitute ofAdvanced IndustrialScience andTechnology(Central6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))
E-11-13	FERM BP-7698FERM BP-7770	2001年8月8日2001年10月11日
			F-4-8L-30-10	FERM BP-7699FERM BP-7768FERM BP-7700	2001年8月8日2001年10月11日2001年8月8日
	FERM BP-7769	2001年10月11日
			0304	FERM BP-8037	2002年5月10日
KMTR1	FERM BP-8038	2002年5月10日

癌细胞的实例包括结肠癌细胞、Colo205、神经胶质瘤U251细胞和T细胞淋巴瘤Jurkat细胞。癌细胞适于从这些细胞中挑选出来。

(3)本发明的抗体或其功能性片段对于人肝细胞在细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时的条件下的LD50值为0.01μg/ml或0.01μg/ml以上，优选0.1μg/ml或0.1μg/ml以上，更优选2-10μg/ml，再更优选10-100μg/ml，或者最优选10μg/ml或10μg/ml以上(例如100μg/ml或100μg/ml以上)。同时，本发明的抗体或其功能性片段对于癌肝细胞(例如Colo205细胞、U251细胞或Jurkat细胞)在细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时的条件下的LD50值为100μg/ml或100μg/ml以下，优选10μg/ml或10μg/ml以下，更优选0.7μg/ml或0.7μg/ml以下，再更优选0.02-0.11μg/ml，或者最优选0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。此外，在本发明中特别优选的抗体或其功能性片段具有一个各LD50值的综合值，其中对于人肝细胞在细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时的条件下的LD50值为2-100μg/ml，而对于癌细胞在细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时的条件下的LD50值为0.02-0.11μg/ml。

通过用110-120μl反应体积/反应系统(孔)进行测量，获得本发明抗体对于肝细胞或癌细胞的上述LD50值。

(4)此外，本发明的抗体或其功能性片段对于人肝细胞在细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时的条件下的LD50值要比本发明的抗体或其功能性片段对于癌细胞在细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时的条件下的LD50值高2倍或2倍以上，优选10倍或10倍以上，更优选50倍或50倍以上(例如50-100倍)，再更优选100倍或100倍以上(例如100-250倍)，再更优选250倍至1000倍，或者最优选1000倍或1000以上。

(5)此外，本发明的抗体或其功能性片段可以抑制肿瘤(例如来源于将Colo205细胞移植到裸鼠的肿瘤)的生长或者使肿瘤消退。在这种情况下，给予本发明的抗体或其功能性片段后，可以抑制肿瘤细胞增殖或可以实现肿瘤消退的时间为至少9天，优选至少11天，或者更优选至少13天。在下文中，优选的时间顺序如下：至少30天，至少60天，最优选至少120天。另外，将本发明的抗体或其功能性片段给予携带肿瘤的待测动物(例如携带肿瘤的实验动物的体重为20g)的剂量为0.1μg/生物体(5μg/kg)至100μg/生物体(5mg/kg)。例如，剂量为100μg/生物体或5mg/kg，优选20μg/生物体或1mg/kg，更优选4μg/生物体或200μg/kg，或再更优选1μg/生物体或50μg/kg。也可以给予0.5μg/生物体(25μg/kg)的剂量。给药频率为例如每周1-3次，或者每隔1天进行给药。

此外，本发明的抗体(例如0304抗体或E-11-13抗体)或其功能性片段在携带肿瘤的小鼠中的抗肿瘤效应如下：

(a)当将本发明的抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后4天，可以诱发平均14％或14％以上的肿瘤缩小。在这种情况下，平均14％或14％以上的肿瘤缩小可以保持至少7天。

(b)当将本发明的抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后4天，可以诱发平均65％或65％以上的肿瘤缩小。

(c)当将本发明的抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后7天，可以诱发平均80％或80％以上的肿瘤缩小。在这种情况下，平均80％或80％以上的肿瘤缩小可以保持至少4天。

(d)当将本发明的抗体或其功能性片段以25μg/小鼠的浓度给予12周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后3天，可以诱发平均45％或45％以上的肿瘤缩小。

(e)当将本发明的抗体或其功能性片段以25μg/小鼠的浓度给予12周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后5天，可以诱发平均65％或65％以上的肿瘤缩小。在这种情况下，平均65％或65％以上的肿瘤缩小可以保持至少27天。

(f)当将本发明的抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有300mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，初次给药后4天，可以诱发平均39％或39％以上的肿瘤缩小。在这种情况下，平均39％或39％以上的肿瘤缩小可以保持至少14天。

相关肿瘤的实例包括至少一种选自以下的肿瘤：结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳癌、脑肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜细胞增生、男性胚细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、错构母细胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤和维耳姆斯氏瘤。

(6)一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有以下的氨基酸序列：由杂交瘤E-11-13产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：17和19；由杂交瘤L-30-10产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：21和23；由杂交瘤H-48-2产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：25和27；由杂交瘤0304产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：29和31；或由杂交瘤KMTR1产生的抗体的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：33和35。

上述抗体或其功能性片段具有以下的氨基酸序列：由从杂交瘤E-11-13中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：16和18编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤L-30-10中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：20和22编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤H-48-2中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：24和26编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤0304中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：28和30编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；或由从杂交瘤KMTR1中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：32和34编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列。

(7)一种产生与TRAIL-R2结合的单克隆抗体的杂交瘤，所述杂交瘤选自E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304和KMTR1。

(8)一种生产抗TRAIL-R2单克隆抗体的方法，所述方法包括培养上述杂交瘤，从所得培养物中收集与TRAIL-R2结合的抗体。

(9)一种生产抗TRAIL-R2单克隆抗体的方法，所述方法包括从上述杂交瘤中分离编码的单克隆抗体的基因，构建带有所述基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主中，以表达上述单克隆抗体，然后收集来自所述宿主或者所得宿主的培养上清液或分泌物的抗TRAIL-R2单克隆抗体。

宿主的实例包括选自大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞以及哺乳动物的任何宿主。

(10)一种预防性或治疗性抗肿瘤药物，所述药物包含作为有效成分的上述抗体或其功能性片段。

所述肿瘤的实例包括至少一种选自以下的肿瘤：结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳癌、脑肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜细胞增生、男性胚细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、错构母细胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤和维耳姆斯氏瘤。

本发明详细解释如下。本说明书包括日本专利申请号2001-150213(申请日为2001年5月18日)、日本专利申请号2001-243040(申请日为2001年8月9日)和日本专利申请号2001-314489(申请日为2001年10月11日)的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，所述日本专利申请为本申请的优先权文件。

所述抗TRAIL-R1单克隆抗体和抗TRAIL-R2单克隆抗体具有诱导癌细胞凋亡的活性已有报道[参见Griffith，T.S.等(1999)J.Immunol.162，2579-2605；参见Chuntharapai，A.等(2001)J.Immunol.166，4891-4898]。然而，这些抗体来源于小鼠。

另外，对正常人肝细胞的细胞毒性值得关注，该细胞毒性也是重组人TRAIL蛋白的问题。

令人惊奇的是，已经表明，本发明的新型人抗TRAIL-R2单克隆抗体不仅没有诱发针对来源于人正常组织的细胞的细胞毒性而且没有诱发针对来源于正常肝细胞的细胞毒性的副作用，而重组人TRAIL蛋白对正常肝细胞的细胞毒性被人们所关注。我们获得了一种新型抗TRAIL-R2单克隆抗体。也就是说，我们通过在世界上首次成功地制备可能有改进的安全性和治疗效果优点的新型单克隆抗体，因而完成了本发明。所述单克隆抗体最好是人抗体。已经避开了其抗原性，该抗原性就来源于小鼠的抗体而论总是成问题。

免疫球蛋白G(IgG)、A(IgA)、E(IgE)或M(IgM)的任何抗体类型都可以适合用作所述抗体。通常，更优选IgG。

如下通过明确地给出本发明中所用的词和短语的含义，详细地解释本发明。

1.TRAIL及抗体

本发明的抗体是一种针对肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的受体(TRAIL-R)的抗体。本发明的抗体是(1)与TRAIL-R1反应的抗体、(2)与TRAIL-R2反应的抗体或(3)与TRAIL-R1和TRAIL-R2两者反应的抗体。在本发明中，抗体(1)可以称为“抗TRAIL-R1抗体”，而抗体(2)和(3)可以称为“抗TRAIL-R2抗体”。另外，两种TRAIL受体即TRAIL-R1和TRAIL-R2在本说明书中为简便起见，可以将其称为“TRAIL-R1和R2”。因此，例如“TRAIL-R1和R2表达载体”的描述(参见下文实施例1)意在解释两种表达载体即TRAIL-R1的表达载体以及TRAIL-R2的表达载体。

本发明的“抗体”是具有对人TRAIL-R1和R2或其如上定义的部分有反应性的抗体或其部分，并且包括这些抗体的功能性片段。所述“功能性片段”是指保留所述抗体对抗原的一个或多个作用的抗体部分(部分片段)。功能性片段的具体实例包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)及其聚合物(D.J.King.，Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.，1998 T.J.International Ltd)。

本发明中的“人抗体”是指作为人源化抗体基因的表达产物的抗体。

本发明抗体的实例包括具有诱导表达人TRAIL-R1和R2的癌细胞凋亡特性的各种抗体，如下文实施例7中所描述的。

本发明的抗体包括包含重链和/或轻链的单克隆抗体，其中所述抗体的重链和/或轻链的每个氨基酸序列中具有缺失、取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。通过例如涉及对编码所述氨基酸序列的核苷酸序列进行部分改变的方法，可以在本发明抗体的氨基酸序列中引入上述部分氨基酸改变(缺失、取代、插入或添加)。通过采用已知的定点诱变的标准方法(Proc Natl Acad Sci USA，1984第81卷：5662)，可以在所述核苷酸序列中引入所述部分改变。在此，所述抗体为免疫球蛋白，其中构成所述免疫球蛋白的所有区，包括重链可变区和重链恒定区以及轻链可变区和轻链恒定区都从编码免疫球蛋白的基因获得。

本发明的抗体也包括具有任何免疫球蛋白类别和同种型的抗体。

可以通过以下生产方法，生产本发明的抗TRAIL-R1和R2抗体。具体地说，例如，将上述人TRAIL-R1和R2或其部分与用于增加抗原的抗原性的合适物质(例如牛血清白蛋白)结合，用结合的产物、必要时与免疫增强剂(例如弗氏完全或不完全佐剂)一起免疫非人类哺乳动物，包括人抗体生产的转基因小鼠等。或者，也可以如下进行免疫：通过引入编码人TRAIL-R1或人TRAIL-R2的基因，然后给予在细胞表面过度表达TRAIL-R1或TRAIL-R2的动物细胞。单克隆抗体可以通过下述步骤获得：培养通过将从免疫动物获得的抗体生产细胞与不能产生自身抗体的骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤，然后选择产生显示对免疫所用的抗原有特定亲和性的单克隆抗体的克隆。

本发明的抗体包括采用本领域技术人员已知的基因工程技术经改变转变为具有不同亚类的抗体。例如，本发明抗体转换为IgG2或IgG4亚类使得获得对Fc受体具有低结合活性的抗体。另外，本发明抗体转换为IgG1或IgG3亚类使得获得对Fc受体具有高结合活性的抗体。此外，对Fc受体的结合活性也可以通过人工改变本发明抗体的恒定区的氨基酸序列而改变或者通过与具有这种改变序列的恒定区序列结合而改变。此外，通过将放射性核素例如碘、钇、铟或锝(J.W.Goding，Monoclonal Antibodies：principles and practice.，1993，Academic Press)、细菌毒素例如绿脓毒素、白喉毒素或溶素、化疗药例如甲氨蝶呤、丝裂霉素或加利车霉素(D.J.King，Applications andEngineering of Monoclonal Antibodies.，1998 T.J.International Ltd.；M.L.Grossbard.，Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.，1998Marcel Dekker Inc)或其它前体药物例如美登木素生物碱(Chari等，Cancer Res.，1992，第52卷：127；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，第93卷：8681)与本发明的抗体结合，可以进一步增强对诸如癌症等疾病的治疗效果。

此外，我们已经发现具有与TRAIL-R2结合的特性、但不具有与TRAIL-R1结合的特性的本发明抗体包括不诱导人肝细胞毒性的抗体。因此，本发明也提供一种用于生产没有肝细胞毒性的抗TRAIL-R2抗体的方法，所述方法包括选择不与来自与TRAIL-R2结合的抗体群体的TRAIL-R1结合的抗体的步骤。然而，没有肝细胞毒性的本发明抗体并不限于具有与TRAIL-R2结合的特性、但不具有与TRAIL-R1结合的特性的抗体。

在单克隆抗体产生中，本发明包括下述操作步骤。具体地说，所述步骤是例如：(1)纯化生物聚合物和/或制备在细胞表面过度表达抗原蛋白的细胞(这些生物聚合物和/或细胞用作免疫原)；(2)通过注射抗原、血液收集物免疫动物，测试抗体效价，然后确定切取脾脏等的时间，接着制备抗体生产细胞；(3)制备骨髓瘤细胞(在下文称为“骨髓瘤”)；(4)将所述抗体生产细胞与骨髓瘤进行细胞融合；(5)选择产生靶抗体的一组杂交瘤；(6)分离单细胞克隆(克隆)；(7)必要时，培养杂交瘤，用于大量生产单克隆抗体，或者培育其体内移植有所述杂交瘤的动物；和(8)研究如此生产的单克隆抗体的生理学活性和识别特异性，或者测试作为标记试剂的特征。

上述步骤详细描述了抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体的生产方法，但是所述抗体的生产方法并不限于该方法。例如，也可以使用除脾细胞以外的抗体生产细胞和骨髓瘤。

(1)抗原的纯化

作为抗原，可以使用人TRAIL-R1和R2的胞外区与人IgG的Fc区的融合蛋白(在下文称为TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc)。可以通过将编码TRAIL-R1或R2与人IgG的Fc区的融合蛋白的DNA整合到动物细胞的表达载体中，将所述表达载体导入动物细胞中，然后纯化所得转染子后细胞株的培养上清液，获得TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc。或者，也可以使用ALEXIS等的市售TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc。此外，也可以用来自人细胞系的细胞膜的纯化TRAIL-R1和R2作为抗原。此外，TRAIL-R1和R2的一级结构是已知的[参见Pan，G.等(1997)Science 276，111-113和Science 277，815-818；参见Walczak，H.等(1997)EMBO J 16(17)5386-5397]。因此，按照本领域技术人员已知的方法，用TRAIL-R1和R2的氨基酸序列化学合成肽，然后也可以用所述肽作为抗原。

作为免疫原，用表达载体pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ转染到L929细胞中并且在细胞表面过度表达TRAIL-R1和R2δ的细胞是有效的，所述表达载体中含有编码缺失死亡结构域和胞内区死亡结构域C末端侧氨基酸的人TRAIL-R1和R2的DNA(在下文称为TRAIL-R1和R2δ)。可以通过将编码人TRAIL-R1δ蛋白的DNA和编码人TRAIL-R2δ蛋白的DNA分别整合到动物细胞表达载体pEFneo中，制备pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ[参见Ohashi.H.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91，158-162]。编码TRAIL-R1和R2的DNA、载体、宿主等并不限于此。

具体地说，培养通过用pEF-TRAIL-R1和R2δ转染L929细胞获得的转染子细胞株。采用通过其中插入了pEFneo载体的细胞所获得的新霉素抗体性状作为指标，并且采用山羊抗TRAIL-R1和R2多克隆抗体(DAKO)证实TRAIL-R1和R2δ的表达，可以制备在细胞表面过度表达人TRAIL-R1和R2δ的L929细胞。

(2)抗体生产细胞的制备步骤

将(1)中获得的抗原、弗氏完全或不完全佐剂或助剂例如硫酸铝钾混合，然后用所述混合物作为免疫原免疫实验动物。最优选用能够产生人源化抗体的转基因小鼠作为实验动物，这样的小鼠描述于Tomizuka等的出版物[Tomizuka等，Proc Natl Acad Sci USA，2000，第97卷：722]中。

小鼠免疫时给予免疫原的方法可以是皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射、皮内注射、肌内注射或爪垫注射中的任一种。优选皮下注射、腹膜内注射、爪垫注射或静脉内注射。

免疫可以进行1次，或以适当间隔(优选3天至1周的间隔或者2周的间隔)重复进行(多次)。随后，测量所述免疫动物血清中针对所述抗原的抗体效价，将显示具有足够高抗体效价的动物用作抗体生产细胞源，以提高下述步骤的效率。一般而言，从最后一次免疫后3-5天的动物收获的抗体生产细胞优选用于后续细胞融合步骤。

本文中所用的测定抗体效价的方法的实例包括各种已知技术，例如放射免疫测定(在下文称为“RIA法”)、酶联免疫吸附测定(在下文称为“ELISA法”)、荧光抗体法和被动血凝测定法。鉴于例如检测灵敏度、快速、准确性和操作自动化的可能性，更优选RIA法或ELISA法。

在本发明中，可以按照例如ELISA法，通过以下程序测量抗体效价。首先，将纯化或部分纯化的重组人TRAIL-R1和R2吸附至固相(例如96孔ELISA板)的表面。尚未吸附抗原的固相表面再用与所述抗原无关的蛋白例如牛血清白蛋白(在下文称为“BSA”)封闭。洗涤所述表面后，让孔表面与作为第一抗体的经过连续稀释的样品(例如小鼠血清)接触。使所述样品中的抗TRAIL-R1和R2抗体与上述抗原结合。加入作为第二抗体的针对人抗体的酶标抗体，以与人抗体结合。洗涤后，加入所述酶的底物，然后测量由于底物降解引起的显色所致的吸光度的变化等。通过该方法，计算抗体效价。

(3)骨髓瘤细胞的制备

可以使用能够产生自身抗体并且来源于哺乳动物例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人的细胞作为骨髓瘤细胞。一般而言，优选使用得自小鼠的已建立细胞系，例如8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(得自BALB/c)骨髓瘤细胞株P3X63Ag8U.1(P3-U1)[Yelton D.E.等，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，81，1-7(1978)]、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)[Kohler，G.等，European J.Immunology，6，511-519(1976)]、Sp2/O-Ag14(SP-2)[Shulman，M.等，Nature，276，269-270(1978)]、P3X63Ag8.653(653)[Keamey，J.F.等，J.Immunology，123，1548-1550(1979)]和P3X63Ag8(X63)[Horibata，K.和Harris，A.W.Nature，256，495-497(1975)]。将这些细胞系在例如以下的培养基中传代培养：8-氮鸟嘌呤培养基[通过将8-氮鸟嘌呤加入到补充谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(在下文称为“FCS”)的RPMI-1640培养基中而制备的培养基]、Iscove氏改进的Dulbecco氏培养基(在下文称为“MDM”)或Dulbecco氏改进的Eagle培养基(在下文称为“DMEM”)。在细胞融合前3-4天，采用正常培养基(例如含有10％FCS的DMEM培养基)进行传代培养，以确保在细胞融合当天可得到至少2×10⁷细胞。

(4)细胞融合

抗体生产细胞是血浆细胞或淋巴细胞，所述血浆细胞或淋巴细胞是其祖细胞并且可以从动物任何部位获得。一般而言，所述细胞可以来源于例如脾脏、淋巴结、骨髓、扁桃体、外周血或它们的合适组合。最常使用脾细胞。

在最后一次免疫后，从具有预定抗体效价的小鼠中取出脾脏，其中脾脏是存在抗体生产细胞的一个部位，从而制备脾细胞即抗体生产细胞。目前，用于将脾细胞与在步骤(3)中获得的骨髓瘤细胞融合的最常用方法是利用聚乙二醇的方法，聚乙二醇的细胞毒性比较低并且用该方法使融合程序简单化。例如该方法包括下述步骤。

将脾细胞和骨髓瘤细胞用无血清培养基(例如DMEM)或磷酸缓冲盐溶液(在下文称为“PBS”)充分洗涤，然后进行充分混合，使得脾细胞与骨髓瘤细胞的细胞数目比率约为5∶1至10∶1，然后离心。弃去上清液，然后使沉淀细胞群充分松散。向沉淀中边搅拌边滴加1ml含有50％(w/v)聚乙二醇(分子量为1,000-4,000)的无血清培养基。随后，缓慢加入10ml无血清培养基，然后离心。再次弃去上清液。将沉淀的细胞悬浮于含有适量次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(在下文称为“HAT”)的溶液(在下文称为“HAT培养基”)和人白介素-6(在下文称为“IL-6”)的正常培养基中，然后将悬浮液加入到培养板(在下文也简称为“板”)的各孔中，然后在5％CO₂气体存在下、于37℃培养约2周。在培养期间，可适当地补充HAT培养基。

(5)杂交瘤的选择

当上述骨髓瘤细胞是抗8-氮鸟嘌呤细胞株即次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)有缺陷的细胞时，非融合的骨髓瘤细胞和骨髓瘤-骨髓瘤融合细胞都不能在含有HAT的培养基中存活。尽管两种抗体生产细胞的融合细胞或者抗体生产细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞可以存活，但是两种抗体生产细胞的融合细胞仅有有限的寿命。因此，在含有HAT的培养基中连续培养时，仅抗体生产细胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞存活，致使可以选择出所述杂交瘤细胞。

用于杂交瘤生长形成集落，则将HAT培养基更换为缺乏氨基蝶呤的培养基(在下文称为“HT培养基”)。此后，收集培养上清液的一部分，然后通过ELISA法测量例如抗TRAIL-R1和R2抗体效价。然而，当将上述融合蛋白用作ELISA抗原时，也必需去除产生与人IgG的Fc区特异性结合的抗体的克隆的步骤，以便不选择出这种克隆。这种克隆的存在与否可以采用人IgG的Fc区作为抗原通过例如ELISA加以证实。

使用抗8-氮鸟嘌呤细胞株的方法见以上的示例性说明。根据杂交瘤的选择方法也可使用其它细胞株。在此情况下，根据所用的方法使用不同的培养基组分。

(6)克隆步骤

将采用与步骤(2)中测量抗体效价的相似方法证明生产特异性抗体的杂交瘤细胞转移到另一板中，然后进行克隆。克隆方法的实例包括：有限稀释法，其中进行稀释，使得板的各孔含有一个杂交瘤细胞，然后进行培养；软琼脂法，其中在软琼脂培养基中进行培养，然后收集集落；用显微操作器挑出单细胞后进行培养的方法；和“分选器克隆法(sorter clone method)”，其中通过细胞分选器分离单细胞。有限稀释法是便捷的常用方法。

对于检测出抗体效价的每个孔，通过有限稀释法将克隆程序重复2-4次，然后选择具有稳定抗体效价的细胞株作为抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体生产杂交瘤细胞株。

另外，作为本发明的人抗TRAIL-R2单克隆抗体生产细胞的小鼠-小鼠杂交瘤H-48-2于2001年5月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent OrganismDepositary at the National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))。国际保藏号为FERM BP-7599。另外，同时于2001年8月8日，将杂交瘤E-11-13进行国际保藏，保藏号为FERM BP-7698；将杂交瘤F-4-8进行国际保藏，保藏号为FERM BP-7699；将杂交瘤L-30-10进行国际保藏，保藏号为FERM BP-7700。另外，同时于2002年5月10日，将杂交瘤0304进行国际保藏，保藏号为FERM BP-8037；将杂交瘤KMTR1进行国际保藏，保藏号为FERM BP-8038。因此，例如当采用小鼠-小鼠杂交瘤制备抗体时，可以通过步骤(7)和以下步骤(如下所述)制备所述抗体，而省去步骤(1)-(6)时。此外，进行体内培养例如在小鼠腹水中进行培养，然后可以从所述腹水中分离出抗体。

(7)培养杂交瘤以制备单克隆抗体

克隆完成后，将杂交瘤在正常培养基中培养，更换为HT培养基。

用大培养瓶通过滚动-划线系统(roll-streak system)培养，或者通过旋动培养法，进行大规模培养。采用本领域技术人员已知的方法例如凝胶过滤，纯化得自大规模培养的上清液，以便可以获得作为有效成分的本发明预防药或治疗药中所含有的抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体。此外，杂交瘤也可以在同源小鼠(例如BALB/c小鼠)或Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔腹膜内增殖，可以获得含作为有效成分的本发明预防药或治疗药中所含有的大量抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体的腹水。作为便捷的纯化方法，也可以使用例如市售单克隆抗体纯化试剂盒(例如，MAbTrap GII试剂盒；AmershamPharmacia Biotech)。

如此获得的单克隆抗体对人TRAIL-R1和R2具有高度抗原特异性。

(8)单克隆抗体的证实

如此获得的单克隆抗体的同种型和亚类的测定可以如下进行。鉴定方法的实例包括Ouchterlony法、ELISA法和RIA法。尽管Ouchterlony法是便捷的，但是当单克隆抗体的浓度低时，需要富集步骤。

相比之下，当使用ELISA法或RIA法时，培养上清液可与抗原包被的固相整体反应。通过再利用各种免疫球蛋白同种型和亚类的抗体作为第二抗体，可以鉴定出所述单克隆抗体的同种型和亚类。

此外，可以通过Folin-Lowry法以及通过运用280nm吸光度的计算方法(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)，进行蛋白质的定量。

单克隆抗体所识别的表位的鉴定如下进行。首先，制备单克隆抗体所识别的分子的各个部分结构。为了制备所述部分结构，例如，一种方法用已知的寡肽合成技术生产所述分子的各种部分肽；一种方法通过基因工程技术将编码目标部分肽的DNA序列整合到合适的表达质粒中，然后在宿主(例如大肠杆菌)内、外生产所述肽。一般而言，为达到上述目标，这两种方法常常结合使用。例如，通过本领域技术人员已知的基因工程技术，可以制备从抗原蛋白的C末端或N末端开始适当顺序减小长度的一系列多肽。随后，研究所述单克隆抗体对它们的反应性，以确定大致识别位点。

其次，更准确地讲，采用本领域技术人员已知的寡肽合成技术，合成各种各样的对应于所述位点的寡肽、所述肽的突变体等。然后，检查所述单克隆抗体(作为有效成分包含于本发明预防药或治疗药中)与这些肽结合的能力，或者检查所述肽在所述单克隆抗体与抗原结合中的竞争性抑制活性，从而更加精细地鉴定出所述表位。作为获得种类繁多的寡肽的便捷方法，也可以使用市售试剂盒(例如SPOTs试剂盒，GENOSYS BIOTECHNOLOGIES)和采用multipin合成法等的一系列multipin肽合成试剂盒(Chiron)。

此外，从抗体生产细胞例如杂交瘤细胞中克隆编码人单克隆抗体的基因，将所述基因整合到合适的载体中，然后将所述载体导入宿主(例如哺乳动物细胞系、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞)中。因此，可以制备采用基因重组技术产生的重组抗体(P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000OXFORD UNIVERSITY PRESS，J.W.Goding.，Monoclonal Antibodies：principles and practice.，1993 ACADEMIC PRESS)。

一种用于从杂交瘤中制备编码单克隆抗体的基因的方法包括通过PCR等方法制备分别编码单克隆抗体的轻链可变区、轻链恒定区、重链可变区和重链恒定区的DNA的步骤。在这种情况下，可以将根据抗TRAIL-R抗体基因或氨基酸序列设计的寡DNA用作引物，而可将从所述杂交瘤中制备的DNA用作模板。将这些DNA整合到合适的载体中，然后将所述载体导入表达宿主中。或者，将这些DNA分别整合到合适的载体中，从而引起共表达。

本文所用的载体的实例包括可以在宿主微生物中自主复制的噬菌体或质粒。质粒DNA的实例包括从大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillussubtilis)或酵母中获得的质粒。噬菌体DNA的实例是λ噬菌体。

转化所用的宿主的实例并没有具体的限制，只要它可以表达靶基因即可，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌)、酵母、动物细胞(例如COS细胞和CHO细胞)和昆虫细胞。

将基因导入宿主的方法是已知的，并且可以使用任何这样的方法(例如利用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、磷酸钙法和脂质转染法)。另外，将基因导入动物(如下所述)的方法的实例包括微注射法、通过电穿孔或脂质转染法将基因导入ES细胞的方法以及核移植法。

在本发明中，可以通过培养转化体，从培养物中收集抗体，获得抗TRAIL-R抗体。术语“培养物”是指(a)培养上清液、(b)培养细胞或培养微生物或其破碎的细胞或微生物或(c)转化体的分泌物中的任一种。为了培养转化体，使用适合本文所用的宿主的培养基，并且使用静置培养法，即一种采用滚瓶等的培养法。

培养后，当在微生物或细胞内产生靶蛋白时，通过破碎所述微生物或细胞收集抗体。此外，当在微生物或细胞外产生靶抗体时，使用全部培养液，或者通过离心等除去所述微生物或细胞。随后，可以采用通用生物化学方法中一种方法或其与各种用于蛋白质分离和纯化的色谱法的适当组合，从上述培养物中分离并纯化靶抗体。

此外，通过利用转基因动物繁殖技术，产生在其内源基因中整合了靶抗体的基因的动物宿主，例如转基因牛、转基因山羊、转基因绵羊或转基因猪。然后可以从所述转基因动物分泌的乳中大量获得抗体基因源性单克隆抗体(Wright，G.等(1991)Bio/Technology 9，830-834)。可以采用已知的营养培养基，在体外培养杂交瘤，所述营养培养基用来让所述杂交瘤增殖、维持和保存，以便根据各种条件例如待培养细胞类型的特征、实验或研究的目的及培养方法，使所述杂交瘤在培养上清液中产生单克隆抗体；或者可以采用从已知基本培养基诱导和制备的任何营养培养基。

(9)抗体的特征

本发明的抗体具有下述功能特性(a)-(c)，每种特性可以通过例如下文关于(a)-(c)中每项描述的方法加以证实。

(a)当培养人癌细胞、在培养液中含有本发明的抗体并且检查细胞的存活率时，所述抗体具有诱导表达TRAIL-R1和/或R2的癌细胞凋亡的活性。

(b)当培养人正常组织源性细胞、在培养液中含有本发明的抗体并且检查细胞的存活率时，所述抗体对表达TRAIL-R1和/或R2的正常细胞没有影响。

(c)当培养人肝细胞、在培养液中含有本发明的抗体并且检查细胞的存活率时，所述抗体不诱导肝细胞毒性。

本发明抗体的细胞凋亡诱导活性可以用LD50值(在给定实验条件下引起细胞的50％死亡的抗体浓度)作为指标来表示。在下文所述的实验条件下，LD50值为100μg/ml或100μg/ml以下，优选10μg/ml或10μg/ml以下，更优选0.7μg/ml或0.7μg/ml以下，再更优选0.02-0.11μg/ml，或者最优选0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。

此外，术语“对正常细胞没有影响”或“不诱导肝细胞毒性”是指本发明抗体对正常细胞(人肝细胞)的细胞凋亡诱导活性不太显著。当用LD50值作为指标时，在下文所述的实验条件下，LD50值为0.01μg/ml或0.01μg/ml以上，优选0.1μg/ml或0.1μg/ml以上，更优选2-10μg/ml，再更优选10-24μg/ml，或者最优选24μg/ml或24μg/ml以上。

本发明的抗体具有上述活性(a)-(c)中的任一种。所述抗体是一种具有新特征的物质，因为它最好具有上述活性(a)即诱导癌细胞凋亡的活性和上述活性(b)和(c)即不诱导对正常细胞、特别是正常肝细胞的损害的活性。因此，本发明的抗体可用作抵抗恶性肿瘤的预防药或治疗药中所含有的成分。

正常细胞或癌细胞凋亡诱导活性可以用LD50值作为指标来表示。本发明的LD50值可以如下计算。培养正常细胞(例如人肝细胞)或癌细胞(例如人结肠癌细胞系Colo205；ATCC CCL-222)，然后向培养基中加入本发明的抗体。一段时间后，通过MTT测定(Green，L.M.等，J.Immunological Methods，70：257-268(1984))、LDH测定等，测量细胞的存活率。

根据存活率对加入的抗体浓度所作的曲线图，确定对应于50％的存活率的抗体浓度作为LD50值。

可以根据曲线图读出LD50值，或者通过回归计算找出图中曲线的公式，计算出LD50值。

在对癌细胞(Colo205)进行的一个实验中，将2.5×10³细胞以100μl培养基/孔接种到96孔平底板的各孔中，然后在5％CO₂存在下于37℃进行培养。第二天，加入所述抗体，让混合物在上述环境中静置48小时，然后测量细胞的存活率(反应溶液的总体积：110-120μl)。在本发明中，将上述条件描述为“细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时”。

在对正常细胞(肝细胞)进行的一个实验中，将7.5×10⁴细胞以100μl培养基/孔接种到96孔平底板的各孔中，然后在5％CO₂存在下于37℃进行培养。第二天，加入所述抗体，让混合物在上述环境中静置24小时，然后测量细胞的存活率(反应溶液的总体积：110-120μl)。在本发明中，将上述条件描述为“细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时”。

本发明的抗体包括具有以下特性的抗体：当在上述条件下测量LD50值时，对于正常细胞(人肝细胞)而言，LD50值例如为0.01μg/ml(10ng/ml)或0.01μg/ml以上，或者优选0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。可以说正常细胞的LD50值越高，安全性越高。因此，更优选LD50值为2-100μg/ml的抗体。本发明的抗体包括具有以下特性的抗体：当在上述条件下测量LD50值时，对于癌细胞而言，LD50值例如为100μg/ml或100μg/ml以下，或者优选0.7μg/ml或0.7μg/ml以下。可以说癌细胞的LD50值越低，杀死肿瘤细胞的活性越高。因此，更优选LD50值为0.02-0.11μg/ml的抗体。具体地说，本发明的E-11-13抗体、L-30-10抗体和KMTR1抗体具有显示人肝细胞的LD50值为2-100μg/ml或以上(例如2-24μg/ml，优选100μg/ml)且癌细胞的LD50值为0.02-0.11μg/ml的特性。也就是说，这些抗体既对正常细胞具有安全性又对肿瘤细胞具有细胞凋亡诱导效应。此外，令人惊奇的是，本发明的抗体在携带肿瘤的小鼠模型中显著抑制肿瘤细胞增殖。

下一步检查在其中“细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时”的条件下测量的正常细胞的LD50值与在其中“细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时”的条件下测量的癌细胞的LD50值的比值。如上所述，正常细胞的LD50值越高，安全性越高，而癌细胞的LD50值越低，杀死肿瘤细胞的活性越高。因此，正常细胞的LD50值与癌细胞的LD50值的比值较高的抗体可能一般认为是有用的(较高的安全性和较强的癌细胞凋亡诱导活性)。假设癌细胞的LD50值与正常细胞的LD50值之比(表示正常细胞的LD50值比癌细胞的LD50值高多少倍)为N/C比。本发明的抗体具有N/C＝2或2以上的特性，即正常细胞的LD50值比癌细胞的LD50值高2倍或2倍以上。优选正常细胞的LD50值比癌细胞的LD50值高10倍或10倍以上(N/C＝10或10以上)，更优选N/C＝10-25。在下文，顺序优选的N/C比如下：N/C＝50，N/C＝50或50以上，N/C＝50-100，N/C＝100或100以上，N/C＝100-1000，N/C＝250-1000，最优选N/C＝1000或1000以上。

药用组合物

含有通过纯化本发明的人抗TRAIL-R1和R2抗体制备的制备物的制剂也包括在本发明的范围内。这样的制剂除含有所述抗体外最好还含有生理上可接受的稀释剂或载体，可以是与其它抗体或其它药物例如抗生素的混合物。合适载体的实例包括但不限于生理盐水溶液、磷酸缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐葡萄糖溶液和缓冲生理盐水。或者，可以将所述抗体冻干，然后必要时通过加入上述重建缓冲水溶液后使用。这种预防药或治疗药可以各种形式给予。这些药物的给药形式的实例包括利用溶媒的口服给药，例如通过片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或糖浆剂给药，或者利用溶媒的胃肠外给药，例如通过注射、滴注或栓剂给药。

剂量将根据症状、患者的年龄、体重等而变化。通常，就口服给药而论，剂量为约0.01mg-1000mg/天/成人，可以给予1次或在几种不同情况下分开给药。此外，就胃肠外给药而论，可以通过皮下注射、肌内注射或静脉内注射给予约0.01mg-1000mg/次的剂量。

本发明的抗体或药用组合物可以用于治疗或预防可能由表达TRAIL-R1和R2的细胞引起的各种疾病或症状。这类疾病或症状的实例包括各种各样的恶性肿瘤。

这样的肿瘤类型的实例包括结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳癌、脑肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜细胞增生、男性胚细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、错构母细胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤和维耳姆斯氏瘤。应用本发明抗体的肿瘤类型的数目并不限于一种类型，多种类型的肿瘤可以同时发生。

制剂的实例

本发明的分子以无菌溶液或悬浮液的安瓿形式使用，所述无菌溶液或悬浮液通过将所述分子溶于水或药理学上可接受的非水溶液中来制备。另外，安瓿可以装入无菌粉末制剂(最好是在将本发明的分子冻干的情况下)，所述无菌粉末制剂当使用时可以用药学上可接受的溶液稀释。

附图简述

图1显示对在生产人抗TRAIL-R1单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中的Colo205的细胞死亡诱导活性。

图2显示对在生产人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中的Colo205的细胞死亡诱导活性。

图3显示对在生产人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中的Colo205的细胞死亡诱导活性(不加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体)。

图4显示对在生产人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中的HUVEC的细胞死亡诱导活性。

图5a显示人重组TRAIL(阳性对照)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5b显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(H-48-2)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5c显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(E-11-13)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5d显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(L-30-10)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5e显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(F-4-8)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5f显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(W-40-5)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5g显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(0304)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5h显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(0322)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5i显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(KMTR1)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5j显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(D1M)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5k显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(0304，不加入山羊抗人IgG抗体)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图5l显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体(KMTR1，不加入山羊抗人IgG抗体)对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性。

图6显示当每隔1天给予小鼠1μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13、F-4-8、H-48-2、L-30-10和W-40-5共3次后肿瘤大小的测量结果。

图7显示当给予小鼠4μg、20μg和100μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13共4次后肿瘤大小的测量结果。

图8显示当每隔1天给予携带300mm³肿瘤的小鼠20μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13共3次后肿瘤大小的测量结果。

图9显示当每隔1天给予携带100mm³肿瘤的小鼠20μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体0304共3次后肿瘤大小的测量结果。

图10显示当给予携带100mm³肿瘤的小鼠25μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体0304共3次后肿瘤大小的测量结果。

图11a显示重组纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对Colo205细胞的细胞死亡诱导活性(不加入山羊抗人IgG抗体)。

图11b显示重组纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对Colo205细胞的细胞死亡诱导活性(加入山羊抗人IgG抗体)。

实施本发明的最佳模式

通过以下实施例将更加具体地描述本发明。本发明并不限于这些实施例中所描述的实施方案。

实施例1抗原的制备

为了获得在细胞膜上过度表达人TRAIL-R1和R2的细胞，制备人TRAIL-R1和人TRAIL-R2的质粒表达载体(通过去除人TRAIL-R1和R2的全长氨基酸的胞内区中的死亡结构域和死亡结构域C末端侧氨基酸而制备的，在下文称为TRAIL-R1和R2δ)。通过PCR法制备编码TRAIL-R1和R2δ的DNA。

a)全长人TRAIL-R1和R2表达载体的构建

为了进行模板PCR，用保留编码人TRAIL-R1和R2的cDNA的质粒载体pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2作为模板。通过下述方法构建pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2。通过聚合酶链式反应(PCR)，将EcoR I序列添加到5′末端，而将Not I序列和终止密码子添加到3′末端，对全长人TRAIL-R1 DNA和人TRAIL-R2 DNA进行修饰。用人胎盘源性cDNA(Clontech)作为模板，对于TRAIL-R1，使用合成引物5′-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTTCTCGAGGCGGCCGCTTATCACTCCAAGGACACGGCAGAGCCTGTG-3′(SEQ ID NO：2)，而对于TRAIL-R2，使用合成引物5′-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-TTTCTCGAGGCGGCCGCTCATTAGGACATGGCAGAGTCTGCATTACCT-3′(SEQ ID NO：4)，使用铂PfxDNA聚合酶(Gibco BRL)，进行30个循环的PCR反应(每个循环由94℃20秒、60℃30秒和68℃90秒组成)。分离经修饰的TRAIL-R1序列和TRAIL-R2序列作为EcoRI-Not I片段，然后将其连接到已经用同样的酶切割的pcDNA3(Invitrogen)载体中。将所得的质粒命名为pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2。在通过可变剪接形成的两种片段中，pcDNA3-TRAIL-R2中整合的TRAIL-R2包含由1320bp cDNA编码的440个氨基酸。在下文，实施例中的所有PCR的反应温度用GeneAmp PCR系统9700(Perkin Elmer Japan)进行调节。

b)人TRAIL-R1和R2δ表达载体的构建

通过下述方法构建人TRAIL-R1和R2δ表达载体的构建。为了制备包含具有1-351的氨基酸序列的TRAIL-R1部分肽的表达质粒以及包含具有1-348的氨基酸序列的TRAIL-R2部分肽的表达质粒，进行PCR反应，以将EcoR I序列添加到TRAIL-R1和R2部分肽的5′末端，而将Not I序列和终止密码子添加到TRAIL-R1和R2部分肽的3′末端。对于TRAIL-R1，使用寡核苷酸引物5′-CACGAATTCACCATGGCGCCACCACCAGCT-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTCTACGAGCGGCTTATCACAGCCTCCTCCTCTGAGA-3′(SEQID NO：5)，而对于TRAIL-R2，使用寡核苷酸引物5′-CACGAATTCGCCACCATGGAACAACGGGGACAG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-TTCTACGAGCGGCCGCTTATCACAAGTCTGCAAAGTCATC-3′(SEQ ID NO：6)，使用铂PfxDNA聚合酶(Gibco BRL)、pcDNA3-TRAIL-R1和pcDNA3-TRAIL-R2，进行25个循环的PCR(每个循环由94℃20秒、65℃30秒和68℃75秒组成)。分离经修饰的TRAIL-R1和R2部分肽作为EcoR I-Not I片段。然后将所述EcoR I-Not I片段连接到已经用EcoR I和Not I酶切割的pEFneo载体中。将所得的质粒命名为pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ。

c)人TRAIL-R1和R2δ表达细胞的构建

采用LipofectAMINE Plus(Gibco BRL)，将b)中制备的pEF-TRAIL-R1δ和pEF-TRAIL-R2δ导入L929细胞(美国典型培养物保藏中心保藏号CCL-1(American Type Culture Collection No.CCL-1))中。通过手册中描述的方法进行转染。在培养瓶中在5％CO₂气体存在下、于37℃培养细胞(培养面积为75cm²)24小时后，向培养物中加入1mg/ml G418(Gibco BRL)，然后再培养1周。随后，用山羊抗人TRAIL-R1多克隆抗体和山羊抗人TRAIL-R2多克隆抗体(DAKO)，进行FACS分析。因而证明获得了G418抗性性状的转染细胞在细胞膜表面表达包含351个氨基酸的TRAIL-R1δ和包含348个氨基酸的TRAIL-R2δ。

总是利用自动化DNA合成系统(3948型，Perkin Elmer Japan，Applied Biosystems division)，按照手册[参见Matteucci，M.D.和Caruthers，M.H.(1981)J.Am.Chem.Soc.103，3185-3191]，进行寡核苷酸例如PCR引物的合成。合成结束后，从支持体中切下每种寡核苷酸，然后进行去保护。将所得的溶液干燥并固化，将所述产物溶于蒸馏水中，然后于-20℃深低温保藏待用。

实施例2人抗体生产小鼠的产生

免疫所用的小鼠具有这样一种遗传背景：其中它们是内源Ig重链和κ轻链均被破坏的纯合子，并且所述小鼠同时带有第14号染色体片段(SC20)，该染色体片段含有人Ig重链基因座和人Igκ链转基因(KCo5)。让具有人Ig重链基因座的系A小鼠与具有人Igκ链转基因的系B小鼠杂交，产生这些小鼠。系A小鼠是内源Ig重链和κ轻链均被破坏的纯合子并且带有可遗传到子代的第14号染色体片段(SC20)，例如Tomizuka等报道中描述的也是如此(Tomizuka等，ProcNatl Acad Sci USA.，2000，第97卷：722)。此外，系B小鼠(转基因小鼠)是内源Ig重链和κ轻链均被破坏的纯合子，并且带有人Igκ链转基因(KCo5)，例如Fishwild等报道中描述的也是如此(Nat Biotechnol.，1996，第14卷：845)。

通过Tomizuka等报道中描述的方法(Tomizuka等，Proc Natl AcadSci USA.，2000，第97卷：722)，分析通过使系A的雄性小鼠与系B的雌性小鼠杂交获得的子代小鼠、或者使系A的雌性小鼠与系B的雄性小鼠杂交获得的子代小鼠。在血清中同时检测出具有人Ig重链和κ轻链的个体(人抗体生产小鼠)根据(Ishida和Lonberg，IBC′s 11thAntibody Engineering，Abstract 2000；Ishida，I.等，Cloning&Stem Cells4，85-96(2002))进行筛选并将其用于以下免疫实验中。具有上述小鼠的遗传背景改变的小鼠(Isao ISHIDA，2002，JIKKEN IGAKU 20，6，846-851)也用于所述免疫实验中。另外，上述人抗体生产小鼠可得自Kirin Brewery Co.，Ltd(通过联系)。

实施例3抗人TRAIL-R1和R2的人单克隆抗体的制备

在本实施例中，依照在例如Introduction of Experimental Protocolsfor Monoclonal Antibody(Monoclonal Antibody Jikken Sosa Nyumon，Tamie ANDO等编著，KODANSHA，1991)中描述的通用方法，制备单克隆抗体。用实施例1中制备的表达TRAIL-R1和R2δ的L929细胞或者人TRAIL-R1和R2的胞外区和人IgG1的Fc区的融合蛋白作为免疫原。免疫所用的动物是在实施例2中产生的人抗体(人免疫球蛋白)生产小鼠。

为了制备抗人TRAIL-R1的人单克隆抗体，用实施例1中制备的表达TRAIL-R1δ的L929细胞通过右爪垫注射初次免疫人抗体生产小鼠(3×10⁶细胞/小鼠)。初次免疫后，每3天通过左爪垫和右爪垫轮流注射用所述L929细胞进行免疫10次。此外，在获得脾脏和淋巴结前3天(如下所述)，用所述L929细胞通过双爪垫注射进行免疫。为了制备抗人TRAIL-R2的人单克隆抗体，用实施例1中制备的表达TRAIL-R2δ的L929细胞腹膜内初次免疫人抗体生产小鼠(1×10⁷细胞/小鼠)。初次免疫后，每周5次或6次用所述L929细胞进行腹膜内免疫。此外，在获得脾脏前3天(如下所述)，用所述L929细胞或人TRAIL-R2的胞外区和人IgG1的Fc区的融合蛋白通过尾静脉注射进行免疫。此外，将包含人TRAIL-R2的胞外区和人IgG1的Fc区的融合蛋白与弗氏完全佐剂混合。然后所述人抗体生产小鼠用所述混合物进行皮下初次免疫。随后，将同一种蛋白与弗氏不完全佐剂混合，所述小鼠每2周用所述混合物皮下免疫2次。此外，在获得脾脏前3天(如下所述)，用同一种蛋白通过尾静脉注射进行免疫。

通过手术从所述免疫小鼠获得脾脏和/或淋巴结。然后将该器官置入10ml含有350mg/ml碳酸氢钠、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的无血清DMEM培养基(Gibco BRL)(在下文称为“无血清DMEM培养基”)中。然后，然后用刮刀将该器官在筛网(细胞滤过器：Falcon)上切碎。将通过所述筛网的细胞悬浮液离心，以沉淀细胞。该细胞用无血清DMEM培养基洗涤2次，将其悬浮于无血清DMEM培养基中，然后对细胞数计数。同时，将在含10％FCS(Sigma)的DMEM培养基(Gibco BRL)(在下文称为“含血清DMEM培养基”)中在5％CO₂气体存在下于37℃下进行培养以便细胞浓度不超过1×10⁸细胞/ml的骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC No.CRL-1581)以相同的方式用无血清DMEM培养基洗涤。然后，将所述细胞悬浮于无血清DMEM培养基中，然后对细胞数计数。将所收集的细胞悬浮液和小鼠骨髓瘤悬浮液以5∶1的细胞数比率混合。将该混合物离心，从而完全去除上清液。向该沉淀中温和地加入作为融合剂的1ml 50％(w/v)聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)，同时用移液管管尖搅拌沉淀。接着，分2次温和地加入于37℃预热的1ml无血清DMEM培养基，然后加入另外的7ml无血清DMEM培养基。离心后，通过去除上清液获得的融合细胞通过下述有限稀释法进行筛选。通过将杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清(FCS)、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)(在下文称为“HAT”，Sigma)的DMEM培养基中，对所述细胞进行筛选。此外，采用含有10％FCS和HT(Sigma)的DMEM培养基，通过有限稀释法，获得单克隆。在96孔微量滴定板(Beckton Dickinson)中进行培养。通过下文描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选仪(FACS)或通过测量诱导癌细胞的细胞死亡的活性，对产生抗人TRAIL-R1和R2人单克隆抗体的杂交瘤克隆进行筛选并对每个杂交瘤所产生的人单克隆抗体进行表征。

通过实施例4和5中描述的ELISA以及实施例中6描述的FACS分析，获得大量产生具有人免疫球蛋白γ链(hIgγ)和人免疫球蛋白轻链κ并且对人TRAIL-R1和/或R2具有特异性反应性的人单克隆抗体的杂交瘤。此外，在包括本实施例在内的以下实施例中的任一实施例以及显示实施例试验结果的表和附图中，产生本发明的各种人抗人TRAIL-R1和R2单克隆抗体的杂交瘤克隆都用符号表示。用符号表示的克隆加上位于所述符号之前或之后的术语“抗体”是指由各杂交瘤所产生的抗体或者由携带从所述杂交瘤分离的抗体基因(全长或可变区)的宿主细胞所产生的重组抗体。另外，在原文清楚的范围内，杂交瘤克隆的名称可以表示抗体的名称。以下的杂交瘤克隆代表单克隆：1-13、1-18、1-32、1-40、1-43、2-6、2-11、2-12、2-18、2-47、2-52、3-1、3-7、3-10、3-23、3-33、3-42、3-53、1-13-6、1-32-9、1-40-4、1-43-43、2-6-48、2-11-5、2-12-10、2-47-11、2-52-12、3-10-19、3-23-8、3-33-7、3-42-3、3-53-15、2-18-2、3-1-7、E-11、E-14、L-30、N-18、X-14、E-11-13、E-14-4、F-4-2、F-4-8、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-144、X-51-4、X-51-12、A-11、G-3、H-34、I-22、I-35、J-21、J-26、K-8、K-16、K-57、L-4、P-28、P-36、W-42、X-13、X-60、Z-23、1-39、A-4-27、A-4-29、G-3-10、H-34-2、K-57-12、W-42-2、0304、0322、KMTR1和D1M。这些克隆中的H-48-2于2001年5月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(International Patent Organism Depositary at theNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan))。国际保藏号为FERM BP-7599。此外，E-11-13、F-4-8和L-30-10同时于2001年8月8日保藏于上述国际保藏中心。E-11-13的国际保藏号为FERMBP-7698，F-4-8的国际保藏号为FERM BP-7699，而L-30-10的国际保藏号为FERM BP-7700。此外，E-11-13、F-4-8和L-30-10同时于2001年10月11日保藏于上述国际保藏中心。E-11-13的国际保藏号为FERM BP-7770，F-4-8的国际保藏号为FERM BP-7768，而L-30-10的国际保藏号为FERM BP-7769。此外，0304和KMTR1同时于2002年5月10日保藏于上述国际保藏中心。0304的国际保藏号为FERMBP-8037，而KMTR1的国际保藏号为FERM BP-8038。

实施例4具有人免疫球蛋白轻链κ(Igκ)的人抗TRAIL-R1人单克隆抗体或人抗TRAIL-R2人单克隆抗体的检测

加入0.5μg/ml人TRAIL-R1和R2的胞外区和人IgG1的Fc区的融合蛋白(在下文称为“TRAIL-R1-hFc”和“TRAIL-R2-hFc”(ALEXIS)，对于TRAIL-R2-hFc，包含1-183个氨基酸的区也用作TRAIL-R2的胞外区)的磷酸缓冲盐溶液(在下文称为“PBS”)。向96孔ELISA微量滴定板(Maxisorp，Nunc)的各孔中加入50μl如此制备的溶液，并将其在室温下保温1小时或者在4℃下保温过夜，从而使TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc包被在微量滴定板中。随后弃去上清液，向各孔中加入封闭剂(SuperBlock(注册商标)Blocking Buffer(封闭缓冲液)，PIERCE)，然后在室温下保温30分钟，从而封闭其中TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc未结合的部分。因此，制备各孔用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc包被的微量滴定板。

向各孔中加入各杂交瘤的培养上清液(50μl)，在室温下进行反应1小时，然后各孔用含有0.1％Tween20的PBS(PBS-T)洗涤2次。随后，将辣根过氧化物酶标记的山羊抗人Igκ抗体(50μl/孔，BiosourceInternational)用含10％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的PBS-T稀释2000倍。向各孔中加50μl如此制备的溶液，然后在室温下保温30分钟。该微量培养板用PBS-T洗涤3次，然后向各孔中加100μl TMB显色底物溶液(DAKO)，然后在室温下保温20分钟。向各孔中加入0.5M硫酸(100μl/孔)，以终止反应。用微量培养板读出仪(MTP-300，Corona Electric)，测量450nm波长(参比波长为570nm)的吸光度。此外，采用通过实施例10中描述的方法获得的纯化抗体，将由杂交瘤0304、0322、KMTR1和D1M产生的抗体进行上述实验。

表1和表2显示在如此获得的抗人TRAIL-R1和R2抗体中的抗体部分的特征。表1显示所得人抗TRAIL-R1单克隆抗体的亚类和交叉反应性。表2显示所得人抗TRAIL-R2单克隆抗体的亚类和交叉反应性。

表1

人抗TRAIL-R1抗体	亚类	交叉反应性
				TRAIL-R1	TRAIL-R2
		1-13	IgG4			+	-
1-18	IgG4			+	-
		1-32	IgG1			+	-
1-40	IgG1			+	-
		1-43	IgG1			+	-
2-6	IgG1			+	-
		2-11	IgG1			+	-
2-12	IgG1			+	-
		2-18	IgM			+	-
2-47	IgG4			+	-
		2-52	IgG1			+	-
3-1	IgM			+	-
		3-7	IgM			+	-
3-10	IgG4			+	-
		3-23	IgG4			+	-
3-33	IgG4			+	-
		3-42	IgG2			+	-
3-53	IgG1			+	-

+：有反应性

-：无反应性

                        表2

人抗TRAIL-R2抗体	亚类	交叉反应性
				TRAIL-R1	TRAIL-R2
		A-4-27	IgM			-	+
A-4-29	IgM			+	+
		A-11	IgM			-	+
E-11	IgG1			-	+
		E-14	IgG1			-	+
F-4-2	IgG4			-	+
		F-4-8	IgG1			-	+
G-3	IgM			-	+
		H-34	IgM			-	+
H-48-2	IgG1			-	+
		I-22	IgM			-	+
I-35	IgM			-	+
		J-21	IgM			-	+
J-26	IgM			-	+
		K-8	IgM			-	+
K-16	IgM			-	+
		K-57	IgM			-	+
L-4	IgM			-	+
		L-30	IgG1			-	+
N-18	IgG4			-	+
		P-28	IgM			-	+
P-36	IgM			-	+
		W-40-5	IgG1			-	+
W-42	IgM			-	+
		X-13	IgM			-	+

X-14	IgG4	-	+
				X-51-4	IgG1	-	+
X-51-12	IgG4	-	+
				X-60	IgM	-	+
Z-23	IgM	-	+
				1-39	IgM	-	+
0304	IgG4	-	+
				0322	IgG4	-	+
KMTR1	IgG1	+	+
				D1M	IgG1	+	+

+：有反应性

-：无反应性

实施例5各种单克隆抗体亚类的鉴定

通过与实施例4的方法相似的方法，制备各孔用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc封闭的微量培养板，然后各孔用PBS-T洗涤2次。向用TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc封闭的微量培养板各孔中加入实施例4中获得的各杂交瘤的培养上清液(50μl)，进行反应1小时，然后各孔用PBS-T洗涤2次。随后，向各孔中加入分别用辣根过氧化物酶标记并稀释2000倍的绵羊抗人IgG1抗体、绵羊抗人IgG2抗体或绵羊抗人IgG3抗体或绵羊抗人IgG4抗体(50μl/孔，The BindingSite)，然后在室温下保温1小时。用PBS-T洗涤3次后，向各孔中加入底物缓冲液(TMB，100μl/孔，DAKO)，然后在室温下保温20分钟。接着，加入0.5M硫酸(100μl/孔)，以终止反应。用微量培养板读出仪(MTP-300，Corona Electric)，测量450nm波长(参比波长为570nm)的吸光度。另外，采用通过实施例10中的方法获得的纯化抗体，将由杂交瘤0304、0322、KMTR1和D1M产生的抗体进行上述实验。以上表1和表2显示所得结果。

实施例6各种单克隆抗体对TRAIL-R1和R2表达细胞的反应性试验

通过FACS分析，检查实施例4中获得的各种单克隆抗体对实施例1中制备的表达TRAIL-R1δ的L929细胞和表达TRAII-R2δ的L929细胞的反应性。将L929细胞、表达TRAIL-R1δ的L929细胞和表达TRAIL-R2δ的L929细胞以2×106/ml的浓度悬浮于含有1％兔血清、0.1％NaN₃和1％FCS的PBS染色缓冲液(SB)中。向96孔圆底板(Beckton Dickinson)中加入该细胞悬浮液(100μl/孔)。离心(2000rpm，4℃，2分钟)后，去除上清液，然后加入实施例3中培养的杂交瘤的培养上清液(50μl)。搅拌混合物，让其在冰上静置30分钟，然后进行离心(2000rpm，4℃，2分钟)，以去除上清液。沉淀用SB(100μl/孔)洗涤2次后，加入30μl 0.0125mg/ml RPE荧光标记兔抗人IgκF(ab′)₂抗体(DAKO)，然后在冰上保温30分钟。用SB洗涤2次后，将该细胞悬浮于300μl SB中，然后通过FACS(FACScan，Beckton Dickinson)测量每种细胞的荧光强度。结果，观察到所有抗体都仅对表达TRAIL-R1δ的L929细胞或表达TRAIL-R2δ的L929细胞具有强结合活性，而没有观察到对L929细胞的结合活性。因此，表明它们是对TRAIL-R1和TRAIL-R2特异性结合的抗体。

实施例7对癌细胞的细胞死亡诱导活性

用从实施例3或实施例4-6中获得的产生人抗TRAIL-R1单克隆抗体或人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤培养上清液测量对Colo205(ATCC No.CCL-222)细胞的细胞死亡诱导活性，该Colo205细胞为结肠癌细胞。制备2.5×10⁴/ml的浓度、在含有10％FCS的RPMI培养基中培养的Colo205细胞。向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，加入50μl/孔杂交瘤培养上清液。此外，当人抗TRAIL-R1单克隆抗体或人抗TRAIL-R2单克隆抗体为IgG时，向各孔中加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)(10μl/孔)，终浓度为5μg/ml。用所得杂交瘤的一部分制备不补充山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的孔。用终浓度为100ng/ml的人重组TRAIL蛋白(DAKO)作为阳性对照。用人IgG(Biogenesis)作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养48小时后，依照用法说明书中介绍的方法，制备MTS试剂(CellTiter 96 AQ_ueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay：Promega)，然后向各孔中加入20μl该试剂。在5.0％CO₂气体下于37℃再培养2小时后，用微量培养板读出仪(1420 ARVO多标记计数器：WALLAC)，测量490nm波长(参比波长为630nm)的吸光度。采用线粒体的还原能力作为指标，计算细胞的存活率。通过以下公式计算各孔中细胞的存活率：存活率(％)＝100×(a-b)/(c-b)(其中“a”表示试验孔的测量值，“b”表示无细胞孔的测量值，而“c”表示阴性对照孔的测量值)。图1-3及表3和表4显示所得结果。表3显示对Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性(在产生人抗TRAIL-R1单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中)。表4显示对Colo205和人正常肝细胞的细胞死亡诱导活性(在产生人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液中)。

                          表3

人抗TRAIL-R1抗体	亚类	正常人肝细胞存活率	Colo205细胞存活率
				1-13-6	IgG4	-	-
1-32-9	IgG1	-	-
				1-40-4	IgG1	-	-
1-43-43	IgG1	-	-
				2-6-48	IgG1	-	-
2-11-5	IgG1	++	++
				2-12-10	IgG1	-	-
2-47-11	IgG4	+	+
				2-52-12	IgG1	++	++
3-10-19	IgG4	-	-
				3-23-8	IgG4	-	-
3-33-7	IgG4	-	-
				3-42-3	IgG2	-	-
3-53-15	IgG1	-	-
				2-18-2	IgM	++	++
3-1-7	IgM	-	+
				sTRAIL 1μg/ml	-	-	-

++：存活率为80％或80％以上

+：存活率为21％至79％

-：存活率为20％或20％以下

                           表4

人抗TRAIL-R2抗体	亚类	正常人肝细胞存活率	Colo205细胞存活率
				E-11-13	IgG1	++	-
E-14-4	IgG1	+	+
				F-4-2	IgG4	+	-
F-4-8	IgG1	-	-
				H-48-2	IgG1	++	-
L-30-10	IgG1	++	-
				N-18-12	IgG4	++	-
W-40-5	IgG1	++	+
				X-14-4	IgG4	++	+
W-51-4	IgG1	-	-
				X-51-12	IgG4	++	-
A-4-29	IgM	-	-
				G-3-10	IgM	++	-
H-34-2	IgM	-	-
				K-57-12	IgM	+	-
W-42-2	IgM	-	-
				sTRAIL 1μg/ml	-	-	-

++：存活率为80％或80％以上

+：存活率为21％至79％

-：存活率为20％或20％以下

结果表明，与阴性对照相比，人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体明显具有诱导Colo205细胞的细胞死亡活性。此外，已经显示人抗TRAIL-R2单克隆抗体的一部分(其为IgG)甚至在不存在山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的情况下(在没有与人抗TRAIL-R2单克隆抗体交联的情况下)也具有诱导细胞死亡的活性。

实施例8对正常细胞的细胞死亡诱导活性

用实施例4-6中获得的产生人抗TRAIL-R2单克隆抗体的杂交瘤培养上清液测量对HUVEC(Biowhittaker)的细胞死亡诱导活性，该HUVEC细胞为正常人脐静脉内皮细胞。制备5×10⁴/ml的浓度、在EGM-2培养基(Biowhittaker)中培养的HUVEC细胞。向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。将细胞在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，加入50μl/孔杂交瘤的培养上清液。此外，当人抗TRAIL-R1单克隆抗体或人抗TRAIL-R2单克隆抗体为IgG时，向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)，终浓度为5μg/ml。用人IgG(Biogenesis)作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养48小时后，依照用法说明书中介绍的方法，制备MTS试剂(Cell Titer 96 AQ_ueous Non-Radioactive CellProliferation Assay：Promega)，然后向各孔中加入20μl该试剂。在5.0％CO₂气体下于37℃再培养2小时后，用微量培养板读出仪(1420 ARVO多标记计数器：WALLAC)，测量490nm波长(参比波长为630nm)的吸光度。采用线粒体的还原能力作为指标，计算细胞的存活率。通过与实施例7中的公式类似的公式，计算各孔中细胞的存活率。

图4显示所得结果。人抗TRAIL-R2单克隆抗体和阴性对照显示几乎相同的结果，表明该人抗TRAIL-R2单克隆抗体对HUVEC细胞没有显示出细胞毒性。

实施例9对正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性

用从实施例4-6中获得的产生人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体的杂交瘤培养上清液测量对正常人肝细胞(在下文称为“HH细胞”)(Tissue Transformation Technologies)的细胞死亡诱导活性。首先，将冷冻HH细胞于37℃解冻，然后用CM5300培养基(CEDRA)将其制备浓度为7.5×10⁵/ml的细胞。向用胶原蛋白I型封闭的96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。在5.0％CO₂气体下于37℃培养4.5小时后，更换培养基。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，再次更换培养基。随后，加入50μl/孔杂交瘤的培养上清液，然后向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)，终浓度为5μg/ml。用人IgG(Biogenesis)作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，在显微镜下观察HH细胞的形态变化。人抗TRAIL-R2单克隆抗体的结果和阴性对照的结果几乎相同，表明该人抗TRAIL-R2单克隆抗体对HH细胞也没有显示出细胞毒性。

实施例10各种抗体的制备

按照下述方法，纯化来自从实施例4、6和7中获得的杂交瘤的培养上清液的人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体。采用rmp A蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)、0.8×40cm柱(Bio-Rad)、PBS作为吸附缓冲液而0.02M甘氨酸缓冲液(pH 3)作为洗脱缓冲液，将含有人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体的培养上清液进行亲和纯化。通过加入1M Tris(pH 9.0)，将洗脱部分的pH调至7.2左右。采用透析膜(10000cut，Spectrum Laboratories)，用PBS置换如此制备的抗体溶液，然后，用孔径为0.22μm的MILLEX-GV滤膜(Millipore)过滤除菌，从而获得纯化人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体。测量280nm的吸光度，然后用1.4 OD＝1mg/ml计算该纯化抗体的浓度。

按照下述方法，制备含有人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体的培养上清液。首先，让人抗TRAIL-R1和R2单克隆抗体生产杂交瘤在含有10ng/ml重组人IL-6(R&D Systems)和10％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培养基(Kyokutoseiyaku)中适应。将经适应的杂交瘤进行深低温保藏。其次，为了抗体纯化，让杂交瘤的一部分在含有牛胰岛素(5μg/ml，Gibco BRL)、人运铁蛋白(5μg/ml，Gibco BRL)、乙醇胺(0.01mM，Sigma)、亚硒酸钠(2.5×10^-5mM，Sigma)、10ng/ml重组人IL-6(R&D Systems)和1％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培养基(Kyokutoseiyaku)中适应。将杂交瘤细胞在培养瓶中培养，并且当杂交瘤的活细胞比率达到90％时，收集培养上清液。将所收集的上清液上样至10μm滤器和0.2μm滤器(German Science)，从而去除多种废物例如杂交瘤。

实施例11纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对癌细胞和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性

用实施例10中获得的纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体测量对结肠癌细胞Colo205(ATCC No.CCL-222)的细胞死亡诱导活性。制备2.5×10⁴/ml的浓度、在含有10％FCS的RPMI培养基中培养的Colo205细胞，然后向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，加入所述纯化抗体(10μl/孔)，终浓度为10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml。此外，向各孔中加入10μl山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)，终浓度为10μg/ml。用所得杂交瘤的一部分制备不补充山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的孔。用终浓度为0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的人重组TRAIL蛋白(R&D SYSTEMS)作为阳性对照。用人抗HSA抗体作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养48小时，以使所述抗体与细胞表面的受体反应。每个反应系统的体积为120μl。另外，对于0304和KMTR1，进行其中不加入作为交联剂的山羊抗人IgG(γ)特异性单克隆抗体的实验(在表5中描述为“单独的”)。在这种情况下，每个反应系统的体积为110μl。培养后，依照用法说明书中介绍的方法，制备MTS试剂(Cell Titer 96 AQ_ueous Non-Radioactive CellProliferation Assay：Promega)。向各孔中加入20μl该试剂。在5.0％CO₂气体下于37℃培养2小时后，用微量培养板读出仪(1420 ARVO多标记计数器：WALLAC)，测量490nm波长(参比波长为630nm)的吸光度。采用线粒体的还原能力作为指标，计算细胞的存活率。运用与实施例7中的公式类似的公式，计算各孔中细胞的存活率。

接着，用从实施例10中获得的人抗TRAIL-R2单克隆抗体测量对HH细胞(Tissue Transformation Technologies，and In VitroTechnologies)的细胞死亡诱导活性。首先，将冷冻HH细胞于37℃解冻，然后用CM5300培养基(CEDRA)将其制备浓度为7.5×10⁵/ml的细胞。向用胶原蛋白I型封闭的96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。在5.0％CO₂气体下于37℃培养4.5小时后，更换培养基。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，将培养基更换为无血清培养基[含有胰岛素(20μg/ml，Sigma)、胰高血糖素(7ng/ml，Sigma)、氢化可的松(7.5μg/ml，Sigma)和人EGF(20ng/ml，Beckton Dickinson)的DMEM培养基(Sigma)]或CM5300培养基。随后，向各孔中加入所述纯化抗体(10μl/孔)，终浓度为0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml，然后加入10μl山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)，终浓度为10μg/ml和100μg/ml。用所得杂交瘤的一部分制备不补充山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的孔。用人抗HSA抗体作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，让所述抗体和细胞表面的受体反应。每个反应系统的体积为120μl。另外，对于0304和KMTR1，进行其中不加入作为交联剂的山羊抗人IgG(γ)特异性单克隆抗体的实验(在表5中描述为“单独的”)。在这种情况下，每个反应系统的体积为110μl。培养后，HH细胞用PBS洗涤2次，向各孔中加入100μl PBS，然后加入Triton X-100(10μl/孔)，终浓度为0.8％。让细胞于37℃静置1小时，致使活的HH细胞裂解。将裂解液转移至(50μl/孔)一个不同的96孔平底板中，然后进行LDH测定。依照用法说明书中介绍的方法，制备供LDH测定用的试剂(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay：Promega)，然后向各孔中加入50μl该试剂。将板避光，然后让其在室温下静置30分钟。加入50μl/孔反应终止溶液(1M乙酸：Promega)。用微量培养板读出仪(1420 ARVO多标记计数器：WALLAC)，测量492nm波长的吸光度。采用LDH的酶促活性作为指标，计算细胞的存活率。通过与实施例7中的公式类似的公式，计算各孔中细胞的存活率。

此外，用计算出的存活率，按照下述方法计算LD50值。在图中，将纵轴为各种抗体浓度下的计算存活率对横轴为加入细胞中的抗体浓度作图。将相邻的作图点相互连接，以绘出曲线。通过回归计算找出表示该曲线的公式。运用该公式，计算出对应于50％的存活率的抗体浓度，从而得出LD50值。

图5a-5l和表5显示所得结果。在图5中，实线加实心圆(-●-)表示正常人肝细胞，而虚线加实心菱形符号(--◆--)表示Colo205细胞。此外，图5k和图5l显示其中不加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的实验结果。表5显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对结肠癌细胞Colo205和正常人肝细胞的细胞死亡诱导活性(LD50值)。将2.5×10³结肠癌细胞Colo205以100μl培养基/孔接种到96孔平底板中，第二天，向该细胞中加入纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体。当细胞和抗体之间的反应时间达到48小时时，获得LD50值。将7.5×10⁴正常细胞(人肝细胞)以100μl培养基/孔接种到96孔平底板中，第二天，向正常细胞(人肝细胞)中加入纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体。当细胞和抗体之间的反应时间达到24小时时，获得LD50值。与阴性对照相比，显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体明显具有诱导Colo205细胞的细胞死亡的活性。此外，与人重组TRAIL和纯化抗体H-48-2相比，显示纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13、L-30-10和KMTR1的人肝细胞毒性低。

此外，实施例4的结果表明，KMTR1既与TRAIL-R1受体结合，也与TRAIL-R2受体结合。可以预见，该抗体可以通过或者TRAIL-R1受体或TRAIL-R2受体转导细胞死亡诱导信号。

由于所述肝细胞显示甚至当加入10μg/ml L-30-10时的存活率为50％或50％以上，因此L-30-10的LD50为10μg/ml或10μg/ml以上。当根据抗体浓度对存活率所作的曲线图进行回归计算时，LD50为24μg/ml。由于所述肝细胞显示当加入0.1μg/ml F-4-8时的存活率为50％或50％以下，因此F-4-8的LD50为0.1μg/ml或0.1μg/ml以下。同样，根据与L-30-10的方法相似的方法，进行回归计算，LD50为0.002μg/ml。KMTR1和D1M的LD50值均证明为10μg/ml或10μg/ml以上。此外，在其中不加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的情况下(在下文称为“在“单独的”情况下”)，肝细胞的存活率从未低于50％，甚至当以100μg/ml的抗体体积加入KMTR1时也是如此。因此，证明在“单独的”情况下，LD50为100μg/ml或100μg/ml以上。

接着，测量正常肝细胞的LD50值与Colo 205的LD50值之比(表示正常人肝细胞的LD50值比Colo 205细胞的LD50值高多少倍)(N/C比)。结果，就纯化抗体E-11-3而论，N/C＝25.45(10倍或10倍以上)；就D1M而论，N/C＝67或67以上(10倍或10倍以上)；就单独的0304而论，N/C＝50(10倍或10倍以上)；就L-30-10而论，N/C＝240(100倍或100倍以上)；以及就单独的KMTR1而论，N/C＝1000倍或1000倍以上。因此，就功效和安全性而论，表明所有抗体都是极好的(表5)。

                             表5

纯化人抗TRAIL-R2抗体	正常人肝细胞LD50(μg/ml)	Colo205LD50(μg/ml)	N/C比
				E-11-3	2.8	0.11	25.45
F-4-8	0.002	0.02	0.1
				H-48-2	0.12	0.15	0.8
L-30-10	24	0.1	240
				W-40-5	7.47	0.7	10.7
0304	0.002	0.02	0.1
				0322	0.06	0.04	1.5
KMTR1	＞10	0.04	＞250
				D1M	＞10	0.15	＞67
0304(单独的)	1	0.02	50
				KMTR1(单独的)	＞100	0.1	＞1000
人重组TRAIL	0.25ng/ml	2ng/ml	0.125

通过相似的方法，检查纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对U251细胞(得自神经胶质瘤，Riken Genebank No.RCB0461)和Jurkat细胞(得自T细胞淋巴瘤，Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)的细胞死亡诱导活性。在对U251细胞进行的一个实验中，将1.0×10⁴细胞以100μl培养基/孔接种到96孔平底板中，然后在5％CO₂存在下于37℃进行培养。第二天，加入所述抗体。在上述环境下培养48小时后，测量细胞的存活率。在对Jurkat细胞进行的一个实验中，将4.0×10⁴细胞以100μl培养基/孔接种到96孔平底板中，然后加入所述抗体。在5％CO₂存在下于37℃培养48小时后，测量细胞的存活率。各种抗体的LD50值(单位：μg/ml)如下所示。

E-11-13对U251细胞的LD50为0.3，而对Jurkat细胞的LD50为0.1。

L-30-10对U251细胞的LD50为0.17，而对Jurkat细胞的LD50为0.13。

H-48-2对U251细胞的LD50为0.24，而对Jurkat细胞的LD50为0.07。

F-4-8对U251细胞的LD50为0.03，而对Jurkat细胞的LD50为0.004。

W-40-5对U251细胞的LD50为1.0，而对Jurkat细胞的LD50为0.48。

除对U251细胞之外，还用另一个系统进行测定，其中顺铂溶液(NIPPON KAYAKU)与所述抗体一起同时加入，终浓度为4μg/ml。

实施例12纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体对携带肿瘤的小鼠的影响

按照下述方法，用携带肿瘤的小鼠模型检查实施例10中获得的人抗TRAIL-R2单克隆抗体的作用。

给4-6周龄Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan)在其背部皮下移植5×10⁶/小鼠结肠癌细胞Colo 205。移植后1周至10天，测量已粘连的肿瘤大小。将5只或7只平均肿瘤大小约100mm³或300mm³的携带肿瘤的小鼠分为一组。将所述纯化抗体(溶于200μl PBS中)以1μg/小鼠、4μg/小鼠、20μg/小鼠、25μg/小鼠和100μg/小鼠给予携带肿瘤的小鼠腹腔内，然后测量肿瘤大小。用相同体积的人抗HSA抗体作为所述抗体的阴性对照。

图6-10显示上述实验的结果。在其中给予每只小鼠1μg纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13、F-4-8、H-48-2、L-30-10和W-40-5的组中，在已给予H-48-2的组中观察到消退效应。抗肿瘤效应以E-11-13、L-30-10、F-4-8和W-40-5的递减次序越来越低(图6)。在图6中，如果每隔1天给予所述抗体3次，则当从初次给药计算时，观察到至少持续13天的生长抑制和消退效应(H-48-2克隆)。

在给予每只小鼠4μg、20μg和100μg E-11-13的组中，在所有小鼠中都证实有抗肿瘤效应。使用20μg/小鼠的剂量，观察到最高的肿瘤消退效应(图7)。在图7中，如果每隔1天给予所述抗体4次，则当从初次给药计算时，观察到至少持续11天的生长抑制和消退效应。每隔1天给予每只小鼠20μg所述抗体4次(移植后第7天、第9天、第11天和第13天给予)的组中肿瘤体积随时间的变化如下。

初次给药后第2天(对应于图7中的第9天)，平均肿瘤体积为109.5mm³；

初次给药后第4天(对应于图7中的第11天)，平均肿瘤体积为85.1mm³；

初次给药后第6天(对应于图7中的第13天)，平均肿瘤体积为64.3mm³；

初次给药后第8天(对应于图7中的第15天)，平均肿瘤体积为61.8mm³；和

初次给药后第11天(对应于图7中的第18天)，平均肿瘤体积为78.9mm³。

开始给药后第4天的肿瘤体积约为85.1mm³，并且观察到14％或14％以上的肿瘤缩小。这种缩小保持到给药后第11天，表明本发明的抗体具有高抗肿瘤效应。

将E-11-3以20μg/小鼠给予7只为一组的其中肿瘤平均约为300mm³的携带肿瘤的小鼠。结果，观察到显著的肿瘤消退(图8)。在图8中，如果每隔1天给予所述抗体3次，则当从初次给药计算时，观察到至少持续18天的生长抑制和消退效应。每隔1天给予每只小鼠20μg所述抗体3次(移植后第9天、第11天和第13天给予)的组中肿瘤体积随时间的变化如下。

初次给药后第2天(对应于图8中的第11天)，平均肿瘤体积为246.9mm³；

初次给药后第4天(对应于图8中的第13天)，平均肿瘤体积为181.8mm³；

初次给药后第5天(对应于图8中的第14天)，平均肿瘤体积为146.2mm³；

初次给药后第6天(对应于图8中的第15天)，平均肿瘤体积为110.8mm³；

初次给药后第7天(对应于图8中的第16天)，平均肿瘤体积为82.7mm³；

初次给药后第9天(对应于图8中的第18天)，平均肿瘤体积为57.5mm³；

初次给药后第11天(对应于图8中的第20天)，平均肿瘤体积为81.3mm³；

初次给药后第13天(对应于图8中的第22天)，平均肿瘤体积为108.1mm³；

初次给药后第15天(对应于图8中的第24天)，平均肿瘤体积为127.8mm³；和

初次给药后第18天(对应于图8中的第27天)，平均肿瘤体积为163.3mm³。

开始给药后第4天的肿瘤体积约为181.8mm³，并且观察到39％或39％以上的肿瘤缩小。这种缩小保持到给药后甚至第18天，表明本发明的抗体具有高抗肿瘤效应。

0304抗体的活性评价如下。给6周龄Balb/c裸鼠(购自CLEAJapan)在其背部皮下移植5×10⁶/小鼠结肠癌细胞Colo205。移植后8天，测量已粘连的肿瘤大小。将5只平均肿瘤大小约100mm³的携带肿瘤的小鼠分为一组。将所述纯化抗体(溶于200μl PBS中)以20μg/小鼠给予携带肿瘤的小鼠腹腔内，然后测量肿瘤大小。已每隔1天给予0304(20μg/小鼠)3次(移植后第8天、第10天和第12天给予)的组中的所有小鼠都证实抗肿瘤效应(图9)。肿瘤体积随时间的变化如下。

初次给药后第2天(对应于图9中的第10天)，平均肿瘤体积为142.092mm³；

初次给药后第4天(对应于图9中的第12天)，平均肿瘤体积为34.138mm³；

初次给药后第7天(对应于图9中的第15天)，平均肿瘤体积为18.641mm³；和

初次给药后第11天(对应于图9中的第19天)，平均肿瘤体积为9.339mm³。

开始给药后第4天的肿瘤体积约为34.138mm³，并且观察到65％或65％以上的肿瘤缩小。这种缩小保持到给药后甚至第11天，表明本发明的抗体具有极高的抗肿瘤效应。

接着，给12周龄Balb/c裸鼠(购自CLEA Japan)在其背部皮下移植5×10⁶/小鼠结肠癌细胞Colo205。移植后10天，测量已粘连的肿瘤大小。将5只平均肿瘤大小约100mm³的携带肿瘤的小鼠分为一组。将所述纯化抗体(溶于200μl PBS中)以20μg/小鼠给予携带肿瘤的小鼠腹腔内，然后测量肿瘤大小。用相同体积的人抗HSA抗体作为所述抗体的阴性对照。已给予每只小鼠25μg 0304共3次(移植后第10天、第13天和第15天给予)的组中的所有小鼠都证实抗肿瘤效应(图10)。肿瘤体积随时间的变化如下。

初次给药后第3天(对应于图10中的第13天)，平均肿瘤体积为54.626mm³；

初次给药后第5天(对应于图10中的第15天)，平均肿瘤体积为32.357mm³；

初次给药后第8天(对应于图10中的第18天)，平均肿瘤体积为15.895mm³；

初次给药后第12天(对应于图10中的第22天)，平均肿瘤体积为14.377mm³；

初次给药后第15天(对应于图10中的第25天)，平均肿瘤体积为26.654mm³；

初次给药后第19天(对应于图10中的第29天)，平均肿瘤体积为27.565mm³；

初次给药后第25天(对应于图10中的第35天)，平均肿瘤体积为30.802mm³；

初次给药后第29天(对应于图10中的第39天)，平均肿瘤体积为27.092mm³；和

初次给药后第32天(对应于图10中的第42天)，平均肿瘤体积为32.921mm³。

初次给药后第12天(对应于图10中的第22天)，证实在5只小鼠中3只小鼠中肿瘤消失。

初始给药后第3天的平均肿瘤体积约为54.626mm³，并且观察到45％或45％以上的肿瘤缩小。此外，给药后第5天的平均肿瘤体积约为32.357mm³，并且观察到65％或65％以上的肿瘤缩小。这种缩小保持到给药后第32天。准确地说，65％或65％以上的缩小保持到至少27天。因此，表明本发明的抗体具有极高的抗肿瘤效应。

此外，在图10中，则当从初次给药计算时，观察到持续至少32天的生长抑制和消退效应。

另外，在图9和图10中，“溶媒”代表PBS(200μl)，其用作给药时溶解抗体的介质。

如实施例11中所述，单独的0304或KMTR1抗体可以显示细胞死亡诱导活性。此外，如本实施例中所述，证明0304在携带肿瘤的小鼠模型中具有显著的抗肿瘤效应。因此，预期可以单独显示细胞死亡诱导活性和抗肿瘤活性的抗体能够显示抗肿瘤活性，并且给予针对由表达TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞引起的疾病的预防药或治疗药、特别是给予针对恶性肿瘤的治疗药时并不依赖于患者的生理条件(例如免疫细胞的类型或数目)。

实施例13纯化人抗TRAIL-R1和TRAIL-R2单克隆抗体对TRAIL-R1和TRAIL-R2的结合亲和性

按照下述方法，采用BIACORE 2000(Biacore)，对实施例10中获得的纯化人抗TRAIL-R单克隆抗体对TRAIL-R的结合亲和性进行研究。

1)TRAIL-R1-hFc和TRAIL-R2-hFc的固定化

将TRAIL-R1-hFc或TRAIL-R2-hFc用10mM乙酸(pH 4.0)稀释至终浓度为10μg/ml，然后通过胺偶联方法将其固定在传感器芯片CM5上。固定化条件如下。按照用法说明书中描述的方法，进行NHS活化和乙醇胺阻断。按照用法说明书中描述的人工注射法，进行TRAIL-R1-hFc的偶联和TRAIL-R2-hFc的偶联。

(固定化条件)流速：5μl/分钟

NHS活化：7分钟

偶联：人工注射

乙醇胺阻断：7分钟

证明在上述条件下，将377.4RU TRAIL-R1-hFc或495.4RUTRAIL-R2-hFc固定在传感器芯片上。

2)再生条件和再现性的证实

将20μg/ml纯化人抗TRAIL-R1单克隆抗体2-6加到固定有TRAIL-R1-hFc的传感器芯片上达2分钟。因而证实了所述抗体与TRAIL-R1-hFc的结合。随后，加入50mM NaOH达15秒，证实结合抗体从TRAIL-R1-hFc完全解离(在下文完全解离被称为“再生”)。接着，通过KINJECT方法(结合1分钟，解离1分钟)，将纯化人抗TRAIL-R1单克隆抗体2-6以20μl/分钟的流速加入到再生TRAIL-R1-hFc中，然后加入50mM NaOH达15秒，以再生TRAIL-R1-hFc。将该循环重复9次。甚至在上述循环的9次重复后，发现固定在传感器芯片上的TRAIL-R1-hFc量或其上结合的抗体量没有变化。因而表明，TRAIL-R1-hFc再生，没有因加入50mM NaOH达15秒而失活。用在其上固定有TRAIL-R2-hFc的传感器芯片和20μg/ml纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13，进行相似的检查。结果，证明TRAIL-R2-hFc可以在相同的再生条件下再生。

3)相互作用的检查

纯化人抗TRAIL-R1单克隆抗体1-13、2-6和2-12中的每种用HBS-EP(Biacore)连续稀释至2.1nM、4.2nM、8.4nM、16.8nM、33.5nM、67.0nM和134.0nM。通过KINJECT方法(结合2分钟，解离6分钟)，以20μl/分钟的流速顺序加入各抗体的稀释系列，从而获得sensorgram。同样，纯化人抗TRAIL-R2单克隆抗体E-11-13、L-30-10、H-48-2、F-4-8、W-40-6和X-14-4中的每种用HBS-EP(Biacore)连续稀释至0.52nM、1.05nM、2.1nM、2.09nM、4.19nM和8.38nM。通过KINJECT方法(结合2分钟，解离2分钟)，以20μl/分钟的流速顺序加入各抗体的稀释系列，从而获得sensorgram。运用每种sensorgram和BIAevaluation软件ver3.2(Biacore)，对各抗体进行动力学分析。作为拟合模型，用Bivalent模型进行全局拟合，致使找出结合速率常数和解离速率常数。另外，根据这两个常数，计算解离常数(Kd值)。另外，在减去对照细胞和缓冲液校正值后，用所述sensorgram进行拟合。表6和表7显示所得结果。在该表中，“kass”表示结合速率常数，“kdiss”表示解离速率常数，而“K_D”表示解离常数。

                             表6

纯化人抗TRAIL-R1抗体	kass(1/Ms)	kdiss(1/s)	KD(nM)
				1-13	1.08×105	4.58×10-4	4.24
2-6	1.62×105	1.86×10-4	1.15
				2-12	1.63×105	7.80×10-4	4.79

                               表7

纯化人抗TRAIL-R2抗体	kass(1/Ms)	kdiss(1/s)	KD(nM)
				E-11-13	5.27×105	3.84×10-5	0.0729
L-30-10	6.13×105	1.44×10-3	2.35
				H-48-2	5.75×105	1.58×10-3	2.75
F-4-8	5.63×105	7.05×10-4	1.25
				W-40-6	1.74×105	2.92×10-3	16.8
X-14-4	6.55×104	2.93×10-3	44.7

实施例14单克隆抗体编码基因的制备和重组抗体表达载体的构建

(1)E-11-13、L-30-10和H-48-2抗体基因的cDNA克隆和表达载体的构建

杂交瘤E-11-13、L-30-10和H-48-2在含有10ng/ml重组人IL-6(R&D Systems)和10％低IgG胎牛血清(HyClone)的eRDF培养基(Kyokutoseiyaku)中培养。通过离心收集细胞后，加入TRIZOL(GibcoBRL)，然后依照用法说明书提取总RNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，按照所附的用法说明书，对抗体cDNA的可变区进行克隆。用5μg总RNA作为模板，制备第一链cDNA。

1)第一链cDNA的合成

总RNA 5μg/3μl

5′CDS 1μl

SMART oligo 1μl

反应后，将具有上述组成的溶液于70℃保温2分钟后，加入具有下列组成的溶液：

5x缓冲液2μl

DTT 1μl

DNTP混合物1μl和

Superscript II 1μl

接着于42℃保温1.5小时。

此外，在加入100μl Tricine缓冲液后，于72℃保温7分钟，从而获得第一链cDNA。

2)通过PCR扩增重链基因和轻链基因以及重组抗体表达载体的构建

对于cDNA扩增，使用Z-Taq(Takara)。

cDNA 2μl

10x Z-Taq缓冲液5μl

dNTP混合物4μl

Z-Taq 1μl

引物1

引物2

用双蒸水制备具有以上组成的反应溶液，终体积为50μl，然后进行PCR。

为了扩增重链，使用UMP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech)和hh-6引物(5′-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTCCTT-3′)(SEQ ID NO：7)，将98℃1秒和68℃30秒的循环重复30次。此外，用1μl反应溶液作为模板，使用NUMP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech)和hh-3引物(5′-GTG CAC GCC GCT GGT CAGGGC GCC TG-3′)(SEQ ID NO：8)，将98℃1秒和68℃30秒的循环重复20次。随后，用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化PCR扩增产物，然后用hh-4(5′-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3′)(SEQ IDNO：9)作为引物，测定核苷酸序列。根据序列信息，发现E-11-13、L-30-10和H-48-2的3个克隆的N端区序列相同。因此，使用共同引物进行亚克隆并测定核苷酸序列。根据序列信息，合成tnH48KBgl(5′-ATA TAG ATC TCT CAG TTA GGA CCC AGA GGG AAC C-3′)(SEQ ID NO：10)。使用该引物，也从相反方向测定该序列。用特异性引物tnCHNhe(5′-GAT GGG CCC TTG GTG CTA GCT GAG GAGACG G-3′)(SEQ ID NO：11)，进行PCR(98℃1秒、60℃30秒和72℃30秒)。经扩增的重链cDNA片段用Sal I和Nhe I消化，然后将其导入已经用相同的酶切割的N5KG1-Val Lark载体(N5KG1的修饰载体，得自IDEC Pharmaceuticals)(美国专利6001358)中。用该载体作为模板，进行测序，以便证实所插入的序列与通过直接测序测定的序列相同。

用UMP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech)和hh-2引物(5′-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3′)(SEQ ID NO：12)，通过将98℃1秒和68℃30秒的循环重复30次，扩增轻链。此外，用1μl反应溶液为模板、NUMP(SMART RACE cDNA扩增试剂盒；Clontech)和hk-6引物(5′-T GGC GGG AAG ATG AAG ACAGAT GGT G-3′)(SEQ ID NO：13)，将98℃1秒和68℃30秒的循环重复20次。随后，用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化PCR扩增产物，然后用hk-6(5′-tggc ggg aag atg aag aca gat ggt g-3′)引物测定核苷酸序列。根据序列信息，发现3个克隆的N端区序列完全相同。因此，使用共同引物进行亚克隆。根据序列信息，合成tnH48Hsal(5′-ATATGT CGA CTA CGG GGG GGCTTT CTG AGA GTC-3′)(SEQ ID NO：14)。使用该引物，也从相反方向进行测序。用特异性引物和tnCkBsi(5′-AAG ACA GAT GGT GCA GCC ACC GTA CGT TTG AT-3′)(SEQID NO：15)，进行PCR(98℃1秒、60℃30秒和72℃30秒)。经扩增的轻链cDNA片段用Bgl II和BsiW I消化，然后将其导入已经用相同的酶切割的N5KG1-Val Lark载体中。用该载体作为模板，进行测序，以便证实所插入的序列与通过直接测序测定的序列相同。

编码E-11-13重链可变区和轻链可变区的DNA以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如以下所示。

<E-11-13重链可变区>(SEQ ID NO：16)

GTCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAA

AATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGG

GTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG

CCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAT

CAGTAAAAGTTCCTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGG

GCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATTATAGTGGGAGTACCTTCTACAACC

CGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCA

GTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTAT

TACTGTGCGAGACTGACAGTGGCTGAGTTTGACTACTGGGGCCAGGGA

ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC

<E-11-13重链可变区>(SEQ ID NO：17)

MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV

SGGSIISKSSYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTFYNPSLKSRVTISVDTSK

NQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLTVAEFDYWGQGTLVTVSSAS

<E-11-13轻链可变区>(SEQ ID NO：18)

TCACAGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGC

TCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAA

ATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAA

GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTTCTTAGC

CTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAT

GCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGG

TCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATT

TTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCTCACTTTCGGC

CCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG

<E-11-13轻链可变区>(SEQ ID NO：19)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSFL

AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV

YYCQQRSNWPLTFGPGTKVDIKRT

重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：16的5′末端起第30号腺嘌呤(A)。抗体可变区和恒定区的边界位于从5′末端起第461号腺嘌呤(A)和第462号鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，重链可变区的范围是从SEQ ID NO：17的N末端至第144号丝氨酸(S)残基，而恒定区的范围是第145号丙氨酸(A)和以后的残基。对纯化重链蛋白N末端的分析揭示出，重链信号序列的范围是从SEQID NO：17的N末端至第26号丝氨酸(S)残基，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：17的第27号谷氨酰胺(Q)。

轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：18的5′末端起第35号A，而可变区的范围是从5′末端至第415号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：19的N末端至第127号赖氨酸(K)。对纯化轻链蛋白N末端的分析揭示出，轻链信号序列的范围是从SEQ ID NO：19的N末端至第20号甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：19的第21号谷氨酸(E)。

编码L-30-10重链可变区和轻链可变区的DNA以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别示于以下。

<L-30-10重链可变区>(SEQ ID NO：20)

GTCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAA

AATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGG

GTCCTGTCCCAGTTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAG

CCCTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCA

GCAGTAGGAGTAACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGG

GGCTGGAGTGGATTGGGAATGTCTATTATAGAGGGAGCACCTACTACAA

TTCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAAC

CAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGTCGCAGACACGGCTGTGT

ATTACTGTGCGAGACTGTCAGTGGCTGAGTTTGACTACTGGGGCCAGGG

AATCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC

<L-30-10重链可变区>(SEQ ID NO：21)

MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV

SGGSISSRSNYWGWIRQPPGKGLEWIGNVYYRGSTYYNSSLKSRVTISVDT

SKNQFSLKLSSVTVADTAVYYCARLSVAEFDYWGQGILVTVSSAS

<L-30-10轻链可变区>(SEQ ID NO：22)

AGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAG

CTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGT

GTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGC

CACCCTCTCTTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTTCTTAGCCTGG

TACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCAT

CCAACAGGGCCACTGGCAGCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTG

GGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGC

AGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCGACTGGCCTCTCACTTTCGGCCCT

GGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG

<L-30-10轻链可变区>(SEQ ID NO：23)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSFL

AWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGSPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV

YYCQQRSDWPLTFGPGTKVDIKRT

重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：20的5′末端起第30号腺嘌呤(A)。抗体可变区和恒定区的边界位于从5′末端起第461号腺嘌呤(A)和第462号鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，重链可变区的范围是从SEQ ID NO：21的N末端至第144号丝氨酸(S)残基，而恒定区的范围是第145号丙氨酸(A)和以后的残基。通过基因序列预测软件(Signal P ver.2)预测，重链信号序列的范围是从SEQ ID NO：21的N末端至第26号丝氨酸(S)。对纯化重链蛋白N末端的分析揭示出，重链信号序列的范围是从SEQ DI NO：21的N末端至第26号丝氨酸(S)，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：21的第27号谷氨酰胺(Q)。

轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：22的5′末端起第31号A，而可变区的范围是从5′末端至第411号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：23的N末端至第127号赖氨酸(K)。对纯化轻链蛋白N末端的分析揭示出，轻链信号序列的范围是从SEQ ID NO：23的N末端至第20号甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：23的第21号谷氨酸(E)。

编码H-48-2重链可变区和轻链可变区的DNA以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别示于以下。

<H-48-2重链可变区>(SEQ ID NO：24)

TCGACTACGGGGGGGCTTTCTGAGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAA

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGG

TCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGC

CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAG

CAGTAGTAGTTACTACTGGGGCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGG

GCTGGAGTGGATTGGGAGTATCCATTATAGTGGGAGTACTTTCTACAACC

CGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATTTCCGTAGACACGTCCAAGAACCA

GTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGACTGTGTAT

TACTGTGCGAGACAGGGGTCTACTGTGGTTCGGGGAGTTTACTACTACG

GTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTA

GC

<H-48-2重链可变区>(SEQ ID NO：25)

MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV

SGGSISSSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGSIHYSGSTFYNPSLKSRVTISVDTS

KNQFSLKLSSVTAADTTVYYCARQGSTVVRGVYYYGMDVWGQGTTVTV

SSAS

<H-48-2轻链可变区>(SEQ ID NO：26)

AGATCTCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCCCAGCGCAG

CTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGT

GTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGC

CACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCC

TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTG

CATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGT

CTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTT

TGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTGTACACTTTTG

GCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG

<H-48-2轻链可变区>(SEQ ID NO：27)

METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSS

YLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF

AVYYCQQYGSSPLYTFGQGTKLEIKRT

重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：24的5′末端起第29号腺嘌呤(A)。抗体可变区和恒定区的边界位于从5′末端起第484号腺嘌呤(A)和第485号鸟嘌呤(G)之间。在氨基酸序列中，重链可变区的范围是从SEQ ID NO：25的N末端至第152号丝氨酸(S)残基，而恒定区的范围是第153号丙氨酸(A)和以后的残基。通过基因序列预测软件(Signal P ver.2)预测，重链信号序列的范围是从SEQ ID NO：25的N末端至第26号丝氨酸(S)。对纯化重链蛋白N末端的分析揭示出，重链信号序列的范围是从SEQ ID NO：25的N末端至第26号丝氨酸(S)，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：25的第27号谷氨酰胺(Q)。

轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：26的5′末端起第31号A，而可变区的范围是从5′末端至第417号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：27的N末端至第129号赖氨酸(K)。对纯化轻链蛋白N末端的分析揭示出，轻链信号序列的范围是从SEQ ID NO：27的N末端至第20号甘氨酸(G)，而成熟蛋白的N末端为SEQ ID NO：27的第21号谷氨酸(E)。(2)0304抗体基因的cDNA克隆和表达载体的构建

通过离心收集杂交瘤0304细胞，然后依照使用ISOGEN RNA提取试剂(NIPPON GENE)的方案，纯化约900μg RNA。接着，用Oligotex^TM-dT30<Super>(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，从300μgRNA获得13μg polyA⁺RNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech company)，按照所附的说明，用所得的polyA⁺RNA作为材料，进行克隆实验，从而获得抗体基因可变区的cDNA。具体地说，用1.0μg纯化polyA⁺RNA作为材料，通过逆转录酶合成第一链cDNA。用所得的cDNA作为模板，并且使用以下引物组：人抗体重链(在下文所述重链也称为“H-链”)恒定区和轻链(在下文所述轻链也称为“L-链”)恒定区的DNA的各种特异性PCR引物(对于H-链为IgGlp，对于L-链为hk-2)、以及SMART RACE cDNA扩增试剂盒中所附的UMP引物(与所制备的合成cDNA 5′端的共同序列互补的寡核苷酸)，通过PCR扩增H-链前导序列和可变区(在下文也称为“HV”)和L-链前导序列和可变区(在下文也称为“LV”)。在PCR中，使用TaKaRa LA Taq^TM(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，该酶为LA PCR的Taq DNA聚合酶。将模板DNA加入到含有1xLA PCR缓冲液II(含有Mg²⁺)和dNTP混合物各400μM(终浓度)、2种类型的引物各0.2μM和2.5单位TaKaRa LA Taq^TM/50μl的溶液中。通过touchdown PCR(94℃5秒和72℃3分钟(5个循环)→94℃5秒，70℃10秒和72℃3分钟(5个循环)→94℃5秒，68℃10秒和72℃3分钟(20个循环))，进行反应。通过乙醇沉淀、琼脂糖凝胶电泳收集PCR扩增片段，然后用QIAquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(QIAGEN)进行纯化，该试剂盒是一种使用膜的DNA纯化试剂盒。用ABI PRISM^3700 DNA分析仪(Applied Biosystems)，测定纯化HV和LV片段的DNA核苷酸序列。此外，用TA克隆法，将HV和LV扩增片段分别亚克隆到pGEM^-T Easy载体系统(Promega)中。分析如此获得的克隆的质粒DNA中插入DNA的核苷酸序列。将该结果与对PCR产物所进行的直接序列分析的结果进行比较。用于测定DNA核苷酸序列的引物序列(H-链：hh-4；L-链：hk-5和hk-6；对于pGEM^-TEasy载体：SP6和T7)示于表8中。对每种HV和LV PCR片段所进行的直接序列分析结果和(亚克隆的)多克隆的DNA核苷酸序列分析结果完全相同。

用0304抗体L-链的DNA作为模板，并且用已经设计将限制性酶切位点添加到连接末端的引物，通过PCR扩增0304 L-链前导序列和可变区。本文所用的引物组序列示于表8(C23LBCL和C23LBsi)。通过乙醇沉淀收集所得的PCR片段，将其用限制性酶Bgl II消化，然后用BsiW I切割。将消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，以便收集约400bp片段。用QIAquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(该试剂盒是一种使用膜的DNA纯化试剂盒)(QIAGEN)进行纯化。同时，将载体N5KG4-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals，N5KG1的修饰载体(美国专利6001358))同样用限制性酶Bgl II和BsiW I顺序消化，然后进行去磷酸化处理(用碱性磷酸酶(E.coli C75)(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)处理)。然后通过琼脂糖电泳和DNA纯化试剂盒收集约9kb以下的DNA。这两种片段用T4 DNA连接酶连接，然后将其导入大肠杆菌DH5α中，以获得转化体。选择通过将0304抗体L-链前导序列加上可变区插入到N5KG4-Val Lark中制备的质粒DNA N5KG4-0304L。测定插入片段周边的DNA核苷酸序列，从而证实在所述DNA核苷酸序列中没有突变等。为了将H-链可变区等插入如此获得的N5KG4-0304L中，该质粒DNA顺序用限制性酶Nhe I和Sal I切割，进行去磷酸化处理，然后纯化约9.3kb载体DNA。同时，用抗体H-链的质粒DNA作为模板，通过PCR扩增0304抗体H-链基因前导序列和可变区。扩增所用的引物组(T0304Sal和T0304Nhe)示于表8。

将如此获得的PCR片段用限制性酶Nhe I和Sal I切割，进行琼脂糖凝胶电泳，从而纯化约450bp片段。将这两种类型的DNA连接，然后将其导入大肠杆菌中，以获得转化体，然后对具有其中插入了靶H-链前导序列和可变区的克隆进行选择。测定插入部分的DNA核苷酸序列，从而实证在通过PCR扩增的插入序列和用作模板的基因序列之间没有差异。

编码0304重链可变区和轻链可变区的DNA以及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别示于以下。

<0304重链可变区>(SEQ ID NO：28)

CTCAACAACC ACATCTGTCC TCTAGAGAAA ACCCTGTGAG CACAGCTCCT CACCATGGAC

TGGACCTGGA GGATCCTCTT CTTGGTGGCA GCAGCTACAA GTGCCCACTC CCAGGTGCAG

CTGGTGCAGT CTGGGGCTGA GATGAAGAAG CCTGGGGCCT CAGTCAAGGT CTCCTGCAAG

ACTTCTGGAT ACACCTTCAC CAATTATAAG ATCAACTGGG TGCGACAGGC CCCTGGACAA

GGACTTGAGT GGATGGGATG GATGAACCCT GACACTGATA GCACAGGCTA TCCACAGAAG

TTCCAGGGCA GAGTCACCAT GACCAGGAAC ACCTCCATAA GCACAGCCTA CATGGAGCTG

AGCAGCCTGA GATCTGAGGA CACGGCCGTG TATTACTGTG CGAGATCCTA TGGTTCGGGG

AGTTATTATA GAGACTATTA CTACGGTATG GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACC

GTCTCCTCA

<0304重链可变区>(SEQ ID NO：29)

MDWTWRILFL VAAATSAHSQ VQLVQSGAEM KKPGASVKVS CKTSGYTFTN YKINWVRQAP

GQGLEWMGWM NPDTDSTGYP QKFQGRVTMT RNTSISTAYM ELSSLRSEDT AVYYCARSYG

SGSYYRDYYY GMDVWGQGTT VTVSS

<0304轻链可变区>(SEQ ID NO：30)

GAGGAACTGC TCAGTTAGGA CCCAGAGGGA ACCATGGAAG CCCCAGCTCA GCTTCTCTTC

CTCCTGCTAC TCTGGCTCCC AGATACCACC GGAGAAATTG TGTTGACACA GTCTCCAGCC

ACCCTGTCTT TGTCTCCAGG GGAAAGAGCC ACCCTCTCCT GCAGGGCCAG TCAGAGTGTT

AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAACAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT

GATGCATCCA ACAGGGCCAC TGGCATCCCA GCCAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA

GACTTCACTC TCACCATCAG CAGCCTAGAG CCTGAAGATT TTGCAGTTTA TTACTGTCAG

CAGCGTAGCA ACTGGCCGCT CACTTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGA

<0304轻链可变区>(SEQ ID NO：31)

MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP

GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG

GTKVEIKR

重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：28的5′末端起第55号腺嘌呤(A)。抗体可变区的范围是从5′末端至第489号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，重链可变区的范围是从SEQ ID NO：29的N末端至第145号丝氨酸(S)残基。通过基因序列预测软件(Signal Pver.2)预测，重链信号序列的范围是从SEQ ID NO：29的N末端至第19号丝氨酸(S)。成熟蛋白的N末端被认为是SEQ ID NO：29的第20号谷氨酰胺(Q)。

轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：30的5′末端起第34号A，而可变区的范围是从5′末端至第414号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：31的N末端至第127号赖氨酸(K)。通过基因序列预测软件(Signal P ver.2)预测，轻链信号序列的范围是从SEQ ID NO：31的N末端至第20号甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被认为是SEQ ID NO：31的第21号谷氨酸(E)。

                           表8合成DNA的核苷酸序列

编号	引物名称	序列(5’→3’)	长度	SEQ IDNo：
					1	IgG1	TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG	31-mer	36
2	hk-2	GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC	26-mer	12
					3	hh-4	GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG	23-mer	9
4	hk-5	AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC	30-mer	37
					5	hk-6	TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG	26-mer	13
6	SP6	GATTTAGGTGACACTATAG	19-mer	38
					7	T7	TAATACGACTCACTATAGGG	20-mer	39
8	C23LBCL	ATCACAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTC	41-mer	40
					9	C23LBsi	GGTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCACCTTG	33-mer	41
10	T0304Sal	GCGACTAAGTCGACACCATGGACTGGACCTGGAGGATC	38-mer	42
					11	T0304Nhe	AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACC	32-mer	43
12	SEQU1783	GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA	27-mer	44
					13	SEQU4618	TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC	27-mer	45

(3)KMTR1抗体基因的cDNA克隆

通过离心收集杂交瘤KMTR1细胞，然后用ISOGEN RNA提取试剂(NIPPON GENE)，按照所附方案，纯化约900μg RNA。接着，用Oligotex^TM-dT30<Super>(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，从300μgRNA中获得13μg polyA⁺RNA。用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech company)，按照所附说明，用所得的polyA⁺RNA作为材料，进行克隆实验，从而获得所述抗体基因可变区的cDNA。具体地说，用1.0μg纯化polyA⁺RNA作为材料，通过逆转录酶合成第一链cDNA。用所得的cDNA作为模板，并且使用以下引物组：人抗体重链(在下文所述重链也称为“H-链”)恒定区和轻链(在下文所述轻链也称为“L-链”)恒定区的DNA的各种特异性PCR引物(对于H-链为IgGlp，对于L-链为hk-2)以及SMART RACE cDNA扩增试剂盒中所附的UMP引物(与所制备的合成cDNA 5′端的共同序列互补的寡核苷酸)，通过PCR扩增H-链前导序列和可变区(在下文也称为“HV”)和L-链前导序列和可变区(在下文也称为“LV”)。在PCR中，使用TaKaRa LA Taq^TM(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，该酶为供LA PCR用的Taq DNA聚合酶。将模板DNA加入到含有1xLA PCR缓冲液II(含有Mg²⁺)和dNTP混合物各400μM(终浓度)、2种类型的引物各0.2μM和2.5单位TaKaRa LA Taq/50μl的溶液中。通过touchdown PCR(94℃5秒和72℃3分钟(5个循环)→94℃5秒，70℃10秒和72℃3分钟(5个循环)→94℃5秒，68℃10秒和72℃3分钟(20个循环))，进行反应。通过乙醇沉淀、琼脂糖凝胶电泳收集PCR扩增片段，然后用QIAquick Gel Extraction Kit(凝胶提取试剂盒)(QIAGEN)进行纯化，该试剂盒是一种使用膜的DNA纯化试剂盒。用ABI PRISM^3700DNA分析仪(Applied Biosystems)，测定纯化HV和LV片段的DNA核苷酸序列。此外，用TA克隆法，将HV和LV扩增片段分别亚克隆到pGEM^-T Easy载体系统(Promega)中。分析如此获得的克隆的质粒DNA中插入DNA的核苷酸序列。将该结果与对PCR产物所进行的直接序列分析的结果进行比较。用于测定DNA核苷酸序列的引物序列(H-链：hh-4；L-链：hk-5和hk-6；对于pGEM^-T Easy载体：SP6和T7)示于以上表8中。对每种HV和LV PCR片段所进行的直接序列分析的结果和(亚克隆的)多克隆的DNA核苷酸序列分析结果完全相同。显示了如此测定的KMTR1细胞上表达的人抗体基因H-链和L-链的DNA核苷酸序列和氨基酸序列。

<KMTR1重链可变区>(SEQ ID NO：32)

GAGCTCTGAG AGAGGAGCCC AGCCCTGGGA TTTTCAGGTG TTTTCATTTG GTGATCAGGA

CTGAACAGAG AGAACTCACC ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GCTTTTTCTT GTGGCTATTT

TAAAAGGTGT CCAGTGTGAG GTACAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG

GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGCAGC TATGCCATGA

GCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT CTCAGCTATT AGTGGTAGTG

GTGGTAGCAG ATACTACGCA GACTCCGTGA AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT

CCAAGAACAC GCTGTATCTG CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT

ACTGTGCGAA AGAGAGCAGT GGCTGGTTCG GGGCCTTTGA CTACTGGGGC CAGGGAACCC

TGGTCACCGT CTCCTCA

<KMTR1重链可变区>(SEQ ID NO：33)

MEFGLSWLFL VAILKGVQCE VQLLESGGGL VQPGRSLRLS CAASGFTFSS YAMSWVRQAP

GKGLEWVSAI SGSGGSRYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKESS

GWFGAFDYWG QGTLVTVSS

<KMTR1轻链可变区>(SEQ ID NO：34)

GATCTTAAAA GAGGTTCTTT CTCTGGGATG TGGCATGAGC AAAACTGACA AGTCAAGGCA

GGAAGATGTC GCCATCACAA CTCATTGGGT TTCTGCTGCT CTGGGTTCCA GCCTCCAGGG

GTGAAATTGT GCTGACTCAG TCTCCAGACT TTCAGTCTGT GACTCCAAAG GAGAAAGTCA

CCATCACCTG CCGGGCCAGT CAGAGCATTG GTAGTAGCTT ACACTGGTAC CAGCAGAAAC

CAGATCAGTC TCCAAAGCTC CTCATCAAGT ATGCTTCCCA GTCCTTCTCA GGGGTCCCCT

CGAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAG ATTTCACCCT CACCATCAAT AGCCTGGAAG

CTGAAGATGC TGCAGCGTAT TACTGTCATC AGAGTAGTAG TTTACCGATC ACCTTCGGCC

AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGA

<KMTR1轻链可变区>(SEQ ID NO：35)

MSPSQLIGFL LLWVPASRGE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQSIGS SLHWYQQKPD

QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAAAYYCHQS SSLPITFGQG

TRLEIKR

重链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：32的5′末端起第81号腺嘌呤(A)。抗体可变区的范围是从5′末端至第497号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，重链可变区的范围是从SEQ ID NO：33的N末端至第139号丝氨酸(S)残基。通过基因序列预测软件(Signal Pver.2)预测，重链信号序列的范围是从SEQ ID NO：33的N末端至第19号半胱氨酸(C)。成熟蛋白的N末端被认为是SEQ ID NO：33的第20号谷氨酸(E)。

轻链DNA的翻译起始位点是ATG密码子，始于从SEQ ID NO：34的5′末端起第66号A，而可变区的范围是从5′末端至第443号腺嘌呤(A)。在氨基酸序列中，可变区的范围是从SEQ ID NO：35的N末端至第126号赖氨酸(K)。通过基因序列预测软件(Signal P ver.2)预测，轻链信号序列的范围是从SEQ ID NO：35的N末端至第19号甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被认为是SEQ ID NO：35的第20号谷氨酸(E)。

实施例15重组抗体的制备

将实施例14中构建的重组抗体表达载体导入宿主细胞中，从而制备重组抗体表达细胞。使用例如CHO细胞的dhfr缺陷型细胞株(ATCC CRL-9096)作为宿主表达细胞。将该载体通过电穿孔导入宿主细胞中。用一种限制性酶将约2μg抗体表达载体线性化。在350V和500μF的条件下，用Bio-Rad电穿孔仪，将该基因导入4×10⁶CHO细胞中，然后将该细胞接种到96孔培养板中。加入对应于所述表达载体的选择标记的药物，然后继续进行培养。集落得到证实后，通过实施例4中描述的方法，对抗体表达系进行选择。如实施例10中描述的方法，从所选细胞中纯化所述抗体。

实施例16重组抗体对癌细胞的细胞死亡诱导活性

用实施例15中获得的重组人抗TRAIL-R2单克隆抗体，测量对结肠癌细胞Colo205(ATCC No.CCL-222)的细胞死亡诱导活性。制备浓度为1.0×10⁵/ml、在含有10％FCS的RPMI培养基中培养的Colo205细胞，然后向96孔平底板(Beckton Dickinson)的各孔中加入100μl悬浮液。在5.0％CO₂气体下于37℃培养24小时后，以终浓度为10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml和10000ng/ml加入纯化抗体E11(CHO-3)和H48(CHO-3)(10μl/孔)。此外，向各孔中以终浓度为10μg/ml和100μg/ml加入10μl山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体(Sigma)。对于所得的杂交瘤，制备没有补充山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的各孔。用终浓度为1ng/ml和10ng/ml的人重组TRAIL蛋白(R&D SYSTEMS)作为阳性对照。用人抗HSA抗体作为阴性对照。在5.0％CO₂气体下于37℃培养48小时后，按照用法说明书中描述的方法，制备MTS试剂(Cell Titer 96 AQ_ueous Non-Radioactive CellProliferation Assay：Promega)。向各孔中加入20μl所述试剂。在5.0％CO₂气体下于37℃培养2小时后，用微量培养板读出仪(1420 ARVO多标记计数器：VALLAC)，测定490nm波长(参比波长为630nm)的吸光度。采用线粒体的还原力作为指标，计算细胞的存活率。用与实施例7中描述的公式相似的公式，计算各孔中细胞的存活率。

图11a和图11b显示所得结果。图11a显示其中不加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的实验结果，而图11b显示其中加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体的实验结果。

如图11a所示，重组抗体E11(CHO-3)和H48(CHO-3)就单独的抗体而论具有诱导Colo205细胞的细胞死亡活性。此外，如图11b所示，当加入山羊抗人IgG(γ)特异性多克隆抗体时，显示所述重组抗体的细胞死亡诱导活性等同于从杂交瘤培养上清液中纯化的抗体的细胞死亡诱导活性。

本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到本文中。

工业应用性

按照本发明，提供一种具有极高安全性、可用作抵抗由表达TRAIL-R1和R2的细胞引起的疾病、尤其是恶性肿瘤并且可以避免对肝脏造成损害的预防药或治疗药的分子。

序列表的独立文本

SEQ ID NO：1：合成DNA

SEQ ID NO：2：合成DNA

SEQ ID NO：3：合成DNA

SEQ ID NO：4：合成DNA

SEQ ID NO：5：合成DNA

SEQ ID NO：6：合成DNA

SEQ ID NO：7：合成DNA

SEQ ID NO：8：合成DNA

SEQ ID NO：9：合成DNA

SEQ ID NO：10：合成DNA

SEQ ID NO：11：合成DNA

SEQ ID NO：12：合成DNA

SEQ ID NO：13：合成DNA

SEQ ID NO：14：合成DNA

SEQ ID NO：15：合成DNA

SEQ ID NO：36：合成DNA

SEQ ID NO：37：合成DNA

SEQ ID NO：38：合成DNA

SEQ ID NO：39：合成DNA

SEQ ID NO：40：合成DNA

SEQ ID NO：41：合成DNA

SEQ ID NO：42：合成DNA

SEQ ID NO：43：合成DNA

SEQ ID NO：44：合成DNA

SEQ ID NO：45：合成DNA

Claims (62)

1.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与TRAIL-R1和TRAIL-R2结合。

2.权利要求1的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有至少一种选自以下(a)-(c)的特性：

(a)具有诱导表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌细胞凋亡的活性；

(b)对表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常细胞没有影响；和

(c)不诱导人肝细胞毒性。

3.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有所有以下特性(a)-(c)：

(a)具有诱导表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的癌细胞凋亡的活性；

(b)对表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的人正常细胞没有影响；和

(c)不诱导人肝细胞毒性。

4.权利要求2或3的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段与TRAIL-R2结合，但不与TRAIL-R1结合。

5.权利要求2或3的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段既与TRAIL-R2结合又与TRAIL-R1结合。

6.权利要求1-5中任一项的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段是由小鼠-小鼠杂交瘤产生的单克隆抗体。

7.权利要求1-6中任一项的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段是人抗体。

8.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.01μg/ml或0.01μg/ml以上。

9.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。

10.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为2-10μg/ml。

11.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为10μg/ml或10μg/ml以上。

12.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为10-100μg/ml。

13.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为100μg/ml或100μg/ml以上。

14.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于癌细胞而言，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为100μg/ml或100μg/ml以下。

15.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于癌细胞而言，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为10μg/ml或10μg/ml以下。

16.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于癌细胞而言，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.7μg/ml或0.7μg/ml以下。

17.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于癌细胞而言，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.02-0.11μg/ml。

18.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于癌细胞而言，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.02μg/ml或0.02μg/ml以下。

19.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，对于人肝细胞而言，当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为2-100μg/ml；而对于癌细胞，当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时，所述抗体或其功能性片段的LD50值为0.02-0.11μg/ml。

20.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的2倍或2倍以上。

21.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的10倍或10倍以上。

22.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的50倍或50倍以上。

23.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的50-100倍。

24.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的100倍或100倍以上。

25.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的100-1000倍。

26.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的250-1000倍。

27.权利要求1-7中任一项的抗体或其功能性片段，其中人肝细胞当细胞数为7.5×10⁴且反应时间为24小时时的LD50值是癌细胞当细胞数为2.5×10³且反应时间为48小时时的LD50值的1000倍或1000倍以上。

28.权利要求8-27中任一项的抗体或其功能性片段，其中反应体积在110μl和120μl之间。

29.权利要求2、3和14-28中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述癌细胞是Colo205细胞。

30.权利要求2或3中的抗体或其功能性片段，其中所述癌细胞是Colo205细胞、U251细胞或Jurkat细胞。

31.权利要求1-30中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段可以抑制肿瘤生长或者使肿瘤消退。

32.权利要求31的抗体或其功能性片段，其中所述肿瘤是至少一种选自以下的肿瘤：结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳癌、脑肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜细胞增生、男性胚细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、错构母细胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤、维耳姆斯氏瘤等。

33.权利要求31的抗体或其功能性片段，其中所述肿瘤来源于移植在裸鼠体内的Colo205细胞。

34.权利要求31-33中任一项的抗体或其功能性片段，其中肿瘤生长可以被抑制或者可以实现肿瘤消退的时间为至少9天。

35.权利要求31-34中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段的剂量为100μg/生物体或5mg/kg。

36.权利要求31-34中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段的剂量为20μg/生物体或1mg/kg。

37.权利要求31-34中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段的剂量为4μg/生物体或200μg/kg。

38.权利要求31-34中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段的剂量为1μg/生物体或50μg/kg。

39.权利要求1-38中任一项的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其功能性片段是免疫球蛋白G抗体。

40.一种抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后4天诱导平均14％或14％以上的肿瘤缩小。

41.权利要求40的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段可以保持平均14％或14％以上的肿瘤缩小至少7天。

42.权利要求40的抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后4天诱导平均65％或65％以上的肿瘤缩小。

43.权利要求40的抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后7天诱导平均80％或80％以上的肿瘤缩小。

44.权利要求43的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段可以保持平均80％或80％以上的肿瘤缩小至少4天。

45.权利要求40的抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以25μg/小鼠的浓度给予12周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后3天诱导平均45％或45％以上的肿瘤缩小。

46.权利要求45的抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以25μg/小鼠的浓度给予12周龄带有100mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后5天诱导平均65％或65％以上的肿瘤缩小。

47.权利要求46的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段可以保持平均65％或65％以上的肿瘤缩小至少27天。

48.权利要求40的抗体或其功能性片段，当将所述抗体或其功能性片段以20μg/小鼠的浓度给予4-6周龄带有300mm³肿瘤的携带肿瘤的小鼠时，可以在初次给药后4天诱导平均39％或39％以上的肿瘤缩小。

49.权利要求48的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段可以保持平均39％或39％以上的肿瘤缩小至少14天。

50.权利要求40的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段是0304抗体。

51.权利要求40的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段是E-11-13抗体。

52.一种与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段由以下杂交瘤产生：E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304或KMTR1。

53.一种与TRAIL-R1和/或TRAIL-R2结合的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段由以下杂交瘤产生；保藏号为FERMBP-7599的杂交瘤H-48-2、保藏号为FERM BP-7698或FERM BP-7770的杂交瘤E-11-13、保藏号为FERM BP-7699或FERM BP-7768的杂交瘤F-4-8、保藏号为FERM BP-7700或FERM BP-7769的杂交瘤L-30-10、保藏号为FERM BP-8037的杂交瘤0304或保藏号为FERM BP-8038的杂交瘤KMTR1。

54.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有以下的氨基酸序列：由杂交瘤E-11-13产生的抗体重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：17和19；由杂交瘤L-30-10产生的抗体重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：21和23；由杂交瘤H-48-2产生的抗体重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：25和27；由杂交瘤0304产生的抗体重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：29和31；或由杂交瘤KMTR1产生的抗体重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO：33和35。

55.一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有以下的氨基酸序列：由从杂交瘤E-11-13中分离的核酸序列、分别为SEQID NO：16和18编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤L-30-10中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：20和22编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤H-48-2中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：24和26编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；由从杂交瘤0304中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：28和30编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列；或由从杂交瘤KMTR1中分离的核酸序列、分别为SEQ ID NO：32和34编码的重链可变区和轻链可变区的成熟部分的氨基酸序列。

56.一种产生与TRAIL-R2结合的单克隆抗体的杂交瘤，所述杂交瘤选自E-11-13、H-48-2、L-30-10、N-18-12、W-40-5、X-14-4、X-51-12、F-4-8、G-3-10、0304和KMTR1。

57.一种产生与TRAIL-R2结合的单克隆抗体的杂交瘤，所述杂交瘤选自保藏号为FERM BP-7599的杂交瘤H-48-2、保藏号为FERMBP-7698或FERM BP-7770的杂交瘤E-11-13、保藏号为FERM BP-7699或FERM BP-7768的杂交瘤F-4-8、保藏号为FERM BP-7700或FERMBP-7769的杂交瘤L-30-10、保藏号为FERM BP-8037的杂交瘤0304和保藏号为FERM BP-8038的杂交瘤KMTR1。

58.一种抗TRAIL-R2单克隆抗体的生产方法，所述方法包括培养权利要求56或57的杂交瘤，并且从所得的培养物中收集与TRAIL-R2结合的抗体。

59.一种抗TRAIL-R2单克隆抗体的生产方法，所述方法包括从权利要求56或57的杂交瘤中分离编码抗TRAIL-R2单克隆抗体的基因，构建具有所述基因的表达载体，将所述表达载体导入宿主中，以表达所述单克隆抗体，并且从所得的宿主或者所述宿主的培养上清液或分泌物中收集抗TRAIL-R2单克隆抗体。

60.权利要求59的生产方法，其中所述宿主是选自大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞以及哺乳动物的任何宿主。

61.一种抵抗肿瘤的预防药或治疗药，所述预防药或治疗药包含作为有效成分的权利要求1-55中任一项的抗体或其功能性片段。

62.权利要求61的预防药或治疗药，其中所述肿瘤是任一种选自以下的肿瘤：结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳癌、脑肿瘤、恶性黑素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜细胞增生、男性胚细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突神经胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成神经节细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、错构母细胞瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肉瘤、维耳姆斯氏瘤等。

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