CN1548419A - Dtpa衍生物的区域选择性合成 - Google Patents

Abstract

本发明提供高产率区域专一性合成DTPA衍生物的方法，该方法不需要应用离子交换色谱分离中间体。而且，该方法得到单一的螯合物区域异构体，其对用作放射标记试剂所需的螯合物提供区域专一性合成。

Description

DTPA衍生物的区域选择性合成

1、发明领域

本发明涉及制备DTPA衍生物的方法。具体地说，本发明涉及区域选择性合成DTPA衍生物的高产率方法，其中所述的DTPA衍生物在放射免疫治疗和显象中用作双官能团螯合剂。

2、背景技术

在显象、肿瘤诊断和免疫治疗中，人们对新放射标记剂的兴趣日益增加，其可减少常规试剂引起的各种缺陷。

常规试剂通常基于放射性含卤素化合物，例如基于碘同位素的放射性化合物。然而，这些试剂存在许多局限性。例如，碳-碘键在体内降解速率非常高，因而极大地限制了碘同位素的应用；另一个限制涉及其发射特性不够理想，并且碘放射性核素的物理半衰期也不够理想。因此，许多工作者努力去开发新的肿瘤诊断剂，以克服基于卤素的放射性标记试剂的缺陷。

提供更有效的显象和肿瘤诊断剂的一个途径是以螯合金属放射核形式的有机金属化合物。通过活性羰基的乙酰化、芳基重氮偶联、溴乙酰基烷基化在蛋白质和螯合物之间形成的共价键或者通过硫脲键，以这种方式通常能够把显象和肿瘤诊断剂偶合到蛋白质上。

然而，已知的有机金属配合物并没有最佳的方式标记和治疗效果。例如，除了需要选择特定的放射同位素外，成功的肿瘤诊断和放射免疫治疗还依赖于对有效螯合物的选择，所述的螯合物必须在保持抗体完整性同时能够容易地连接到特定的抗体以及能够容许放射性核素的插入。

在设计有效的用于显象和肿瘤诊断和/或免疫治疗的放射金属螯合抗体时，必须考虑到若干因素。例如，有效的放射性核素必须根据其理化生物特性来进行选择。理想的核素必须是常规能够得到的，易于结合到MAb并需要具有合适的物理半衰期，从而能够选择性诊断和/或消除靶肿瘤组织，而不影响正常组织。

选择把放射性核酸运载到肿瘤靶的MAb必须基于下列因素：靶抗原的分布、抗体与其靶的特异性和亲和力。

设计有效的放射性金属螯合的抗体需要考虑的另一个重要方面涉及用于把放射性核素结合到抗体的螯合剂(CA)的选择。例如，有效的放射性金属螯合的抗体必须具有体内稳定性。体内稳定性所取决的因素为：螯合连接和放射性标记过程不会改变抗体特异性和生物分布。

另外，为了优化螯合剂和所选放射性核素和MAb之间的适应性，对螯合剂的选择和合成也是重要的。具体地说，选择和合成螯合剂应该避免放射性核素在体内不适当地释放。这一方面也是同样重要的，因为常规螯合剂出现的最常见问题就是它们不能连接到抗体或不能与抗体牢固地结合。结果，在这些试剂到达肿瘤细胞表面之前，大量放射性核素在体内从MAb-CA配合物分离开。游离的毒性放射性核素在正常组织中积累会损害正常组织而且不能有益于治疗和/或诊断肿瘤靶目标。另一个重要方面涉及需要性，即所选择的螯合剂能够使MAb-CA络合物维持由所选MAb的特异性所提供的优点。

因此，对于选定的MAb，选择合适的螯合剂时必须考虑若干标准。例如(a)CA的加入不应改变其MAb对抗原靶的特异性和亲和力；(b)其加入到MAb不应以其它方式损害该抗体(损害抗体将改变其代谢速率和组织分布模式)；(c)其应该牢固地结合放射性金属从而在体内放射性同位素不至于过早地从MAb-CA配合物中释放出来；(d)与MAb的连结不应改变螯合剂容留放射性核素的能力；(e)与MAb的连结方式应该尽可能具有特异性从而有助于对肿瘤靶目标的特异性检测和治疗方案设计以及有助于对肿瘤治疗和检测的相关数据进行分析；和(f)螯合剂必须能够有助于在MAb-CA-放射性核素配合物的分解代谢后清除放射性核素。

一组合适的金属螯合物由二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物提供。业已开发出DTPA和EDTA的化学改性衍生物作为能有效螯合放射性核素的金属配体，其容易与免疫球蛋白结合。然而，由于这些试剂对结合的放射性核素的亲和力降低，因此这些试剂的效果降低到最低，结果放射化学化合物在正常组织中蓄积。

可以通过许多常规方法把EDTA和DPTA金属配合物与蛋白质偶联。然而，这些方法尚未达到有效显象和肿瘤诊断所需要的高效速率。例如，常规方法存在许多缺陷，例如在放射标记前需要进行广泛的纯化，螯合所述金属的能力不足，这是由于在与蛋白质形成共价键时需要应用金属结合位点造成的。因此，已经研究了蛋白连接的新模式，并业已提出了能够保留所有金属结合位点的新模式。

例如，Brechbiel等在1986年第25卷《无机化学(Inorg.Chem.)》第2722-2781页“DTPA和EDTA的(1-(对-异硫氰基苄基)衍生物合成。抗体标记和肿瘤显象研究”一文中详细记载了化学改性的配体，这些配体能够快速高效地与抗体反应，并且其存留金属的时间比显象或治疗所应用的放射性核素的半衰期要长。上文公开的内容在此引入作为参考。

Brechbiel等提出了具有能有效偶联蛋白质的异硫氰酸根基团的化学改性螯合物。此螯合物的合成可总结为“两步法”，其中第一步包括：生成一种乙二胺或二亚乙基三胺，然后对该胺进行烷基化形成相应的聚乙酸；第二步包括：把苄基取代的官能团转变得到用于蛋白偶联的活性部分。

然而，对于合成MX-DTPA和EDTA类似物来说，上述“两步法”被局限为低于2％的低总产率。该方法需要对中间体进行繁杂的纯化过程，包括用于阳离子和阴离子交换色谱。另外，所述合成产生了MX-DTPA的两个位置异构体，并且再现性差。

因此，需要提供一种高产率生产DTPA衍生物的新合成方法。并要求所述新合成方法不需要通过离子交换色谱来分离中间体，从而提供一种能够容易按比例扩大的方法。另外，还需要这样一种制备单一位置异构体螯合物的方法，从而可以对所需要的用作有效放射标记试剂的螯合物进行区域专一性合成。

                      发明概述

本发明涉及制备用作放射免疫治疗和显象中的螯合剂的DTPA衍生物的方法。本发明的方法能够高产率地合成DTPA衍生物。具体地说，本发明包括区域专一性合成DTPA衍生物的方法，所述的DTPA衍生物适合螯合放射性金属以及适合偶联到免疫球蛋白。该方法包括：把单保护的二胺和一种化合物偶联，其中所述的化合物含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶联到免疫球蛋白的部分或者含有胺和能够被转变成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分。

一方面，本发明提供制备式(I)DTPA衍生物的方法，

该方法包括：(a)把N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单保护的二胺(B)偶合生成化合物(C)；(b)除去(C)中的胺保护基团得到TFA-盐(D)；(c)把(D)还原形成(E)；(d)对(E)进行五烷基化得到(F)；(e)除去(F)中的胺保护基团得到三氟乙酸盐(G)；(f)还原(G)中的硝基得到三氟乙酸盐(H)；(g)把(H)中的氨基改变形成DTPA衍生物。

本发明的方法可以合成多种DTPA衍生物。在不限制本发明范围条件下，通过本发明方法能有利地制备DTPA衍生物的例子包括MX-DTPA、1B3M-DTPA和CHx-DTPA。

本发明一方面提供制备DTPA衍生物的方法，其中DTPA衍生物的特性通过选择单保护的二胺(B)来决定。选择化合物(B)中的R1和R2获得化学改性的DTPA衍生物。

本发明另一方面提供制备MX-DTPA的方法，包括：(a)把N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单-N-叔丁氧羰基保护的二胺(B′)偶联形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-对硝基苯丙胺酰胺(C′)；(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-对硝基苯丙胺酰胺TFA-盐(D′)；(c)还原(D′)得到2-甲基-6-(对硝基苄基)二亚乙基三胺三盐酸盐(E′)；(d)对(E′)进行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺(F′)；(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(G′)；(f)还原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(H′)；和(g)把(H′)中的氨基转变形成2-(对异硫氰基苄基)-6-甲基二亚乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中步骤(a)包括应用苯并三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸盐(BOP)作为偶合试剂。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中步骤(a)包括应用双(2-氧-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)作为偶合试剂。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)通过包括下列步骤的方法得到：(i)用氢氧化铵处理乳腈得到α-氨基腈(2)；(ii)用盐酸处理(2)得到胺盐酸盐(3)；(iii)用二叔丁基二碳酸酯(di-tert-butyl dicarbonate)保护该胺得到叔丁氧羰基保护的衍生物(4)；(iv)在两大气压的氢气下，应用阮内镍在饱和乙醇溶液中还原该腈得到单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。

在另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)由包括下列步骤的方法得到：(i)在相转移条件下，对席夫碱(5)进行烷基化得到单烷基化产品(6)；(ii)用1N盐酸脱保护(6)，然后用二叔丁基二碳酸酯保护胺得到叔丁氧羰基保护的胺(4)；和(iii)用阮内镍还原(4)得到单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中，除去(C′)中的叔丁氧羰基形成(D′)的反应是在二氯甲烷中应用三氟乙酸进行的。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中还原(D′)的步骤包括：用硼烷-四氢呋喃配合物处理(D′)，然后接着用盐酸处理得到三胺盐酸盐(E′)。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中对中间体(E′)进行五烷基化的反应通过应用乙腈和碳酸钾进行的。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中对中间体(E′)的五烷基化是通过应用在二甲基甲酰胺中的溴叔丁基乙酸酯和碳酸钠进行的。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中用硅胶色谱纯化(F′)。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中对(F′)中的羧酸脱保护形成五乙酸衍生物(G′)的反应是通过应用三氟乙酸进行的。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中把(G′)中的硝基还原形成(H′)反应进行如下：在水中，在两大气压氢气下，应用钯置于碳表面进行反应。

另一方面，本发明提供合成MX-DTPA的方法，其中把(H′)转变成DX-DTPA的步骤包括：通过硫光气把胺(H′)转变成瓦状异硫氰酸酯基团。该转变可以通过若干方式进行。例如，通过(i)把硫光气加入到含有五乙酸衍生物(H)的氯仿和水的双相混合物中；(ii)快速搅拌该混合物2小时；(iii)减压除去溶剂得到残余物；(iv)用反相硅胶纯化残余物；和(v)用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脱。该转变还可以应用下列物质进行：二氯甲烷和三乙胺，或乙腈和碳酸氢钠或碳酸钠。

另一方面，本发明提供改进的MX-DTPA组合物，其中所述改进包括：其基本上只含有单一的螯合物区域异构体。在本发明中，“基本上只含有”单个区域异构体意指：相对于任何其它异构体，单一异构体的百分比至少为90％，更优选至少95％，最优选至少99％。

另一方面，本发明涉及这样改进的MX-DTPA组合物在制备蛋白质或抗体螯合剂和其放射标记物中的应用。

另一方面，本发明涉及这样改进的MX-DTPA组合物在制备放射标记螯合物中的应用。

另一方面，本发明提供制备CHx-DTPA的方法，包括：(a)把N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)与单保护的二胺(B″)偶联形成化合物(C″)；(b)除去(C″)中的氨基保护基团形成TFA-盐(D″)；(c)还原(D″)得到(E″)；(d)对(E″)进行五烷基化得到(F″)；(e)除去(F″)中的氨保护基团得到三氟乙酸盐(G″)；(f)还原(G″)中的硝基得到三氟乙酸盐(H″)；和(g)转变(H″)中的氨基得到CHx-DTPA。其单保护的二胺(B″)可以用作顺式或反式异构体。

                      附图简述

图1是概述了式(I)DTPA衍生物的区域专一性合成的七步方法的反应方案。

图2是概述了MX-DTPA的区域专一性合成的七步方法的反应方案。

图3是合成(B′)的四步反应方案。

图4是合成(B′)的另一种反应方案。

图5是图2反应方案中另一种步骤1的反应方案。

图6是代表(B′)和4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯在(a)甲醇中和(b)甲苯中的未成功缩合的反应方案。

图7是烷基化(E′)形成(F′)的两种供选择的反应方案(a)和(b)。

图8是一种把(H′)转变成MX-DTPA的另一种反应方案。

图9是概述CHx-DTPA的区域专一性合成的七步方法的反应方案。

图10是描述通过本发明方法选择性制备CHx-DTPA的区域异构体的方案。

图11是合成(B″)的两步反应方案。

                 优选实施方案的详细描述

除非另有说明，此处所用的所有科技术语具有本发明所属技术领域的一般技术人员通常理解的相同意义。虽然可以应用类似于或等同于此处描述的任意方法和材料来实施或测试本发明，但此处描述优选的方法和材料。

本发明提供高产率区域专一性合成化学改性DTPA衍生物的方法，该方法不需要通过离子交换色谱分离中间体。而且，由于该方法得到螯合物的单个区域异构体，其提供用作放射标记试剂所需螯合物的区域专一性合成。

更具体地说，图1是总结区域专一性合成式(I)DTPA衍生物的七步方法的反应方案。在此方案中，本发明提供式(I)DTPA衍生物的制备方法，其包括下列步骤：(a)把N-叔丁氧羰基对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单保护的二胺(B)偶合生成化合物(C)；(b)除去(C)中的胺保护基团得到TFA-盐(D)；(c)把(D)还原形成(E)；(d)对(E)进行五烷基化得到(F)；(e)除去(F)中的胺保护基团得到三氟乙酸盐(G)；(f)还原(G)中的硝基得到三氟乙酸盐(H)；和(g)把(H)中的氨基转变形成式(I)的DTPA衍生物。

本发明方法可以合成多种DTPA衍生物。在不限制本发明的范围条件下，可以通过本发明方法有利地制备DTPA衍生物的例子包括MX-DTPA、1B3M-DTPA和CHx-DTPA。

本发明一方面提供制备DTPA衍生物的方法，其中DTPA衍生物的特性通过选择单保护二胺(B)确定。在化合物(B)中选择R1和R2得到所需要的DTPA化学改性衍生物。

图2含有概述了根据本发明一个方面应用七个步骤进行MX-DTPA区域选择性合成的反应方案。在此方案中，MX-DTPA的区域专一性合成包括下列步骤：(a)把N-叔丁氧羰基对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单-N-叔丁氧羰基保护的二胺(B′)偶联形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-对硝基苯丙胺酰胺(C′)；(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-对硝基苯丙胺酰胺TFA-盐(D′)；(c)还原(D′)得到2-甲基-6-(对硝基苄基)二亚乙基三胺三盐酸盐(E′)；(d)对(E′)进行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺(F′)；(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(G′)；(f)还原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(H′)；和(g)把(H′)中的氨基转变形成2-(对异硫氰基苄基)-6-甲基二亚乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。

从单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)和叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)开始，该区域专一性合成MX-DTPA的方法的总产率约20％，并且该方法适合按比例扩大。因此，与已知方法的总产率(小于2％)相比，本发明MX-DTPA的合成方法的总产率约高一个数量级。并且，以前的合成方法必须通过繁杂的阴离子和阳离子交换色谱技术对中间体进行纯化；相反，本发明方法消除了该昂贵的纯化步骤，并高纯度地提供目标化合物。例如，在本发明方法中，仅仅需要一个正相柱色谱和一个反相柱就可纯化最终化合物。

图3是合成单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)的四步反应方案。合成(B′)方案如下：用氢氧化铵处理市售乳腈得到α-氨基腈(2)，用盐酸处理得到胺盐酸盐(3)。用二叔丁基二碳酸酯保护该胺得到叔丁氧羰基保护的衍生物(4)。在两大气压氢气下，应用阮内镍在饱和乙醇溶液中还原该腈得到所需的单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。从经济角度考虑，该反应方案非常具有吸引力，因为其可再生，并且易于按比例扩大。

还考虑了制备(B′)的许多其它条件。例如，图4显示了合成(B′)的反应方案，其中(B)通过下列方法制备：在相转移环境中，对席夫碱(5)进行烷基化，中等产率地得到单烷基化产物(6)。用1N盐酸对(6)脱保护，然后用二叔丁基二碳酸酯保护得到叔丁氧羰基保护的氨(4)，再用阮内镍还原得到所需要的叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。

在图1显示的方案中，所述合成反应应用了偶合于单-N-叔丁氧羰基保护的二胺(B′)的N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)。进行该反应优选的偶合试剂为苯并三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸盐(BOP)。应用这些条件合成化合物(C′)时，该步骤单独的产率为72-83％。通过酸/碱洗涤再用己烷磨碎来对(C′)进行纯化。

图5是图2反应方案另一种步骤1的反应方案。正如图5所示，应用双(2-氧-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)也导致得到所需产品(C′)；然而，在图2中，步骤1反应的产率可以达到83％，而在图5中步骤1的反应产率仅仅为23％。

合成(C′)的其它反应途径是不成功的。例如，如图6反应方案所示，为了得到(C′)的相关衍生物，把(B′)和4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯(1)通过(a)在甲醇中搅拌或者(b)在甲苯中回流加热来进行缩合，结果没有成功。

已经成功合成化合物(C′)后，可以在二氯甲烷中应用三氟乙酸除去叔丁氧羰基保护基团得到二胺(D′)。在此方法中，定量得到(产率100％)固体(D′)。

正如图2所述，用硼烷-四氢呋喃配合物还原酰胺(D′)，然后用盐酸处理得到三胺盐酸盐(E′)。另外，除图2中所描述的烷基化步骤外，也可以应用其它反应方法。例如，图7显示把(E′)烷基化生成(F′)的两种反应方案(a)和(b)。应用溴叔丁基乙酸酯，在二甲基甲酰胺中以碳酸钠作为碱，或者以乙腈作溶剂和碳酸钾，均可对中间体(E′)进行五烷基化。当应用后一反应条件时，更容易扩大规模，并且不需要应用按常规方法难以除去的二甲基甲酰胺。但反应进行72-96小时时，此步反应单独产率为60％。优选应用硅胶柱色谱纯化(F′)。

如图2所示，可以通过脱保护羧酸(优选通过应用三氟乙酸进行)制备五乙酸衍生物(G′)。在两大气压氢气下，应用置于碳表面的钯在水中进行硝基的还原。需要注意的是：本发明人避免了在现有已知的合成方法中存在的缺陷。例如，本发明避免应用难以除去的氢氧化铵，因为产生硫脲副产品，需要产生异硫氰酸酯的步骤，使合成方法变复杂。

在图2反应方案中，最后一步涉及通过硫光气把胺转变成瓦状异硫氰酸酯(isothiocyanate)基团。关于这一步，本发明者研究了许多操作条件。

把(H′)转变成MX-DTPA的优选条件描述于图2方案最后一步。这些条件包括：把硫光气加入到含有五乙酸衍生物(H′)的氯仿和水双相混合物中，快速搅拌2小时。减压除去溶剂，残余物用反相硅胶纯化，用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脱，高产率地得到目标化合物MX-DTPA。

还研究了其它操作条件。例如，图8显示这样的反应方案：应用二氯甲烷作溶剂，以三乙胺为碱，把(H′)转变成MX-DTPA。然而，除MX-DTPA外，该反应还产生难以除去的副产品盐酸三乙胺。

把(H′)转变成MX-DTPA还可以这样进行：应用乙腈为溶剂，以碳酸氢钠和碳酸钠为碱进行反应。此反应也产生许多杂质。

本发明合成的MX-DTPA可以有效地用于需要螯合剂的许多方面。例如，经本发明方法得到的MX-DTPA提供有效的放射标记螯合剂、抗体螯合剂和蛋白质螯合剂。放射标记的MX-DTPA是许多应用方面的有效工具，例如用于闪烁照相术、放疗和放射免疫分析。

在这一方面，本发明MX-DTPA合成方法具有许多优点。例如，该方法不需要阳离子和阴离子交换色谱进行繁杂的中间体纯化步骤。由于不需要进行阳离子和阴离子交换色谱，本发明方法容易按比例扩大规模。

本发明方法的另一优点是高产率。如上所述，有效用于放射免疫分析的螯合剂必须容易获得，在数量上足以满足可能的高需要。本发明方法可以提供高达20％的MX-DTPA，比现有合成MX-DTPA的方法高一个数量级。

通过本发明方法合成的MX-DTPA螯合物具有高纯度。高纯度的螯合物具有许多优点，例如容易调节和制备螯合的MAbs，其中可以把不需要的副产品降低至最少量。在合成的螯合物中最大限度地减少杂质能够较容易地调理生物学应用中的螯合物。

另一个优点是本发明方法具有区域专一性。本发明提供MX-DTPA区域专一性合成的新途径。

不愿意被任何理论所束缚，本发明可以通过应用单一异构体形式的化合物(A)达到MX-DTPA的区域专一性合成。在合成方法中一旦选择化合物(A)的一个特定异构体作为起始原料，则在整个合成方法中能够维持(A)中手性碳原子的构型。

应用单个区域异构体形式的MX-DTPA具有若干优点。例如，应用MX-DTPA单个异构体具有更好的闪烁照相结果，并且避免由于应用外消旋混合物导致的光学信号损失。而且，应用单个异构体能够设计高特异性的MAb-CA配合物。在这一方面，应用单个异构体能够使所有螯合分子以基本上相同的方式与Mab相连。

专一性合成MX-DTPA单个区域异构体的另一优点在于：能够控制螯合的放射性核素相对于MAb、最终相对于靶肿瘤的相对位置。通过应用MX-DTPA的单个异构体，有可能控制放射性核素的位置。通过应用单个异构体提供单个连结方式的优点包括：能够潜在地改进由MAb-CA配合物得到的显象和免疫治疗结果。

按照本发明合成的MX-DTPA适合螯合多种放射性核素。这些螯合物还适合与多种Mabs和蛋白质络合。因此，可以预料：当与任意适合结合MX-DTPA的放射性核素或MAb结合时，按照本发明区域专一性合成制备的MX-DTPA能够提供等效的放射标记和治疗试剂。

在一个实施方案中，MX-DTPA与2B8抗体结合形成2B8-MX-DTPA。当对淋巴瘤患者给药时，2B8是显示影响B细胞缺失的抗CD-20抗体。在美国专利US 5,736,137中详细记载了制备2B8-MX-DTPA的具体方案，该文内容在此引入作为参考。

然而，本领域技术人员显然明白：按照本发明合成的DTPA螯合物可以用于放射标记其它抗CD-20抗体或者用于放射标记已经结合到DTPA或其它多价螯合剂的任何其它抗体。另外，按照本发明制备的MX-DTPA螯合物可以与其它蛋白质或肽结合，例如受体、激素、生长因子，如生长激素释放抑制因子肽。

上面的详细记载集中针对于MX-DTPA的合成，本发明方法对于合成其它化学改性DTPA衍生物也是同样有用的。在这一方面，本发明方法可以有利地用于区域专一性合成许多适合螯合放射性金属和偶合到免疫球蛋白的DTPA衍生物，该方法包括：把单保护的二胺和一种化合物偶联，其中所述的化合物含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶联到免疫球蛋白的部分，或者含有胺和能够被转变成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分。本领域技术人员容易理解：本发明方法是非常有益的，因为许多单保护的二胺可以偶合到许多种含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶联到免疫球蛋白的部分的、或者含有胺和能够被转变成有效把DTPA衍生物偶合到免疫球蛋白的部分的化合物。这样的DTPA衍生物的合成也包括在本发明范围之内。

例如，在本发明一个方案中，1B3M-DTPA是按照类似于图2反应方案的反应方案制备得到的。1B3M-DTPA是应用异构体(B′)制备的，其中R1(即H)和R2(即CH3)的位置可以交换。

可以按照本发明方法制备的DTPA衍生物的另一个例子是CHx-DTPA。图9是概述CHx-DTPA的合成方法的一个反应方案。在图9方案的步骤(a)中，单叔丁氧羰基保护的二氨基环己烷(B″)与化合物(A)缩合得到化合物(C″)。得到化合物(C″)后，再按照类似于图2的步骤合成CHx-DTPA。

可以应用顺式-或反式-二胺(B″)制备相应的CHx-DTPA异构体。图10描述了CHx-DTPA的区域异构体，其可通过把选定的化合物A和(B″)的异构体组合制备。

单保护的二胺(B″)可以按照多种途径制备，制备(B″)的优选途径描述于图11的两步反应方案中。

                       实施例

应用市售试剂和HPLC级或无水溶剂无需再进行纯化。分别应用ICN硅胶(63-200，60A)和含有荧光指示剂的默克硅胶(60A)进行正相柱色谱和TLC。分别应用EM Science LiChroprep RP-18(40-63um)和含有荧光指示剂的Techware RPS-F反相烃浸渗硅胶进行反相柱色谱和TLC。

1-N-叔丁氧基羰基-2-甲基-乙二胺(B′)的合成

a.2-氨基丙腈盐酸盐(3)的合成

把含有23.1g(324.99mmol)乳腈(技术等级：90％纯度)、7.1g(132.74mmol)氯化铵和86ml(2208.3mmol)氢氧化铵室温下搅拌2小时。混合物用二氯甲烷(2×500ml)提取，有机相用无水硫酸镁干燥。过滤混合物，减压除去溶剂得到24g黄色油(2)。用250ml无水乙醚稀释该黄色油，用冰浴冷却。然后加入350ml(350mmol)1N盐酸的乙醚液。搅拌10分钟后，过滤得到的固体，用乙醚洗涤，真空干燥得到28.79产品，基于起始原料乳腈的纯度计算，产率92.83％。

b.N-叔丁氧羰基-2-氨基丙腈(4)

把104ml(746.16mmol)三乙胺加入到含有28.5g(268.79mmol)2-氨基丙腈盐酸盐的300ml无水二氯甲烷的混合物中。在冰浴中冷却混合物，然后以30分钟时间加入64.5g(295.53mmol)二叔丁基二碳酸酯的100ml无水二氯甲烷溶液。把反应混合物温热至室温，搅拌48小时。通过玻璃烧结漏斗过滤反应混合物，然后减压缩小滤液体积。加入1L乙醚，搅拌混合物15分钟。再次用玻璃烧结漏斗过滤除去剩余的三乙胺盐酸盐。减压浓缩滤液，残余物进行硅胶柱色谱，洗脱剂为30％的乙酸乙酯/己烷，得到18.50g产品，产率为40.44％。

c.1-N-叔丁氧羰基-2-甲基-乙二胺(B′)：

把18.4g(108.10mmol)N-叔丁氧羰基-2-氨基丙腈和200ml用氨饱和的无水乙醇加入到500ml Parr烧瓶中。然后加入阮内镍(10g 50％水浆液)，把烧瓶加压至50psi氢气，然后放气。再次把烧瓶加压至50psi氢气，然后放气。然后，把烧瓶加压至50psi氢气并振摇，直至不在摄取氢气，通常过夜才能达到此效果。让烧瓶放气，把混合物通过硅藻土(celite)521垫。减压浓缩滤液，定量(100％产率)得到19.2g无色油状产品。

或者，2-氨基丙腈盐酸盐(3)可以从N-(二苯基亚甲基)

          氨基乙腈按照下列方法制备：

a.N-(二苯基亚甲基)-2-甲基-氨基乙腈(6)：

把4.5g(19.76mmol)氯化苄基三乙基铵(BTEAC)加入到含有50g(226.98mmol)N-(二苯基亚甲基)氨基乙腈的250ml甲苯中，然后加入28.3g(707.50mmol)氢氧化钠的50ml水溶液中。在冰浴中冷却该反应物，以1小时时间滴入22ml(232.51mmol)硫酸甲酯。把反应物温热至室温24小时。用1升二氯甲烷稀释反应混合物，用水洗涤(2×1L)。用无水硫酸镁干燥有机相。过滤，除去溶剂，残余物进行硅胶柱色谱，用20％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到产品46.2g，产率62.05％。

b.2-氨基丙腈盐酸盐(3)：

把含有3.0g(12.80mmol)N-二苯基亚甲基-2-甲基-氨基乙腈的30ml己烷溶液和25ml(25mmol)1N盐酸水溶液的混合物室温下搅拌72小时。分离水相，用己烷洗涤。减压浓缩水相，得到1.25g产品，产率92.10％。

N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧

     羰基-对硝基苯丙氨酰胺(C′)：

把12.5ml(89.68mmol)三乙胺加入到含有25g(80.57mmol)N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸的300ml无水二氯甲烷溶液中，然后加入37g(83.66mmol)苯并三唑-1-基-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)。室温搅拌1小时后，加入15.1g(86.66mmol)1-N-叔丁氧羰基-2-甲基乙二胺的40ml无水二氯甲烷溶液。室温下搅拌反应20小时。用300ml二氯甲烷稀释反应混合物，用1N盐酸水溶液(2×500ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(2×500ml)和水(1×500ml)洗涤。用无水硫酸镁干燥有机相。过滤，减压除去溶剂，得到黄色固体。加入己烷(600ml)，搅拌反应混合物20分钟。过滤固体，干燥得到27.0g(71.83％)白色固体产品。

N-(2-氨基丙基)-对硝基苯丙氨酰胺TFA-盐(D′)：

把65ml(843.77mmol)三氟乙酸加入到含有26.50g(56.80mmol)N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-对硝基苯丙氨酰胺的300ml二氯甲烷溶液中。室温下搅拌反应1小时，减压除去溶剂，然后加入500ml无水乙醚。用玻璃烧结漏斗过滤得到的固体，然后用400ml乙醚洗涤，真空干燥固体得到32.0g(100％)含有一些残余三氟乙酸和乙醚的产品。

2-甲基-6-(对硝基苄基)二亚乙基三胺三盐酸盐(E′)

把500ml 1M硼烷-四氢呋喃配合物以30分钟时间加入到含有35g(70.80mmol)N-(2-氨基丙基)-对硝基苯丙氨酰胺TFA盐的500ml无水四氢呋喃溶液中。回流加热反应16小时。冰浴冷却反应物后，缓缓加入122ml甲醇除去过量的硼烷试剂。完全放完气体后，减压除去溶剂。残余物溶解于265ml无水乙醇中，在冰浴冷却的同时用盐酸(g)饱和该溶液，然后用200ml无水乙醚稀释混合物，过滤得到的固体，真空干燥得到19.39g产品，产率75.72％。

N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-

 硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺(F′)：

把86.60g(626.58mmol)碳酸钾加入到含有19.0g(52.53mmol)2-甲基-64-对硝基苄基)二亚乙基三胺三盐酸盐的550ml无水乙腈混合物中，然后加入42ml(284.44mmol)溴乙酸叔丁酯。室温搅拌90小时后，用500ml水稀释混合物，用乙酸乙酯提取(2×500ml)。有机相用无水硫酸镁干燥。过滤，减压除去溶剂得到黄色油状物。在硅胶柱上进行柱色谱，用30％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到26.37g产品，产率60.99％。

N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(硝基苯基)甲基]-

       6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(G′)：

把含有5.0g(6.08mmol)N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺在35ml三氟乙酸中的溶液室温下搅拌48小时，减压除去溶剂，真空干燥所得固体，得到4.02g浅黄色固体产品，产率为74.75％。

N，N′，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-

             甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(H′)：

把3.40g(3.84mmol)N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基-]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐和50ml水加入到Parr烧瓶中，然后加入0.3g 5％的钯-碳。把烧瓶加压至30psi氢气并放气，进行两次。然后把容器加压至45psi氢气，振摇。当氢气摄取停止后(一般为2-4小时后)，把烧瓶放气，经硅藻土(celite)垫过滤混合物。用20ml水洗涤该硅藻土。减压浓缩滤液，得到3.02g产品，产率为92.03％。产品的光谱数据符合参考标准值。

2-(对-异硫氰基苄基)-6-甲基二亚乙基三胺-

           N，N，N′，N″N″-五乙酸(MX-DTPA)

在1L装有电磁搅拌器的园底烧瓶中，把7.0g(7.23mmol)N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐加入到含有150ml水和300ml氯仿的混合物中，然后加入4.67(44.06mmol)碳酸钠。所得溶液的pH值约为9.0。把0.64ml(8.39mmol)硫光气加入到此双相混合物中，然后室温下搅拌溶液2小时。减压除去溶剂得到残余物。把残余物溶解于15ml 1％乙酸所水溶液中，将其置于反相硅胶柱上，用1％乙酸洗脱，然后用含有1％乙酸的25％乙腈/水洗脱。把含有所述产品的部分合并，减压除去溶剂，得到2.47g产品，呈淡黄色油状固体，产率为61.60％。

已经以优选实施方案方式描述了本发明，本领域技术人员容易理解：在不偏离本发明精神范围的前提下，可以进行各种修饰、替换、删减和改变。因此，本发明范围应该只能由权利要求书(包括其等同描述)来限定。

Claims (29)

1、区域专一性合成适合螯合放射性金属并适合偶联于免疫球蛋白的DTPA衍生物的方法，该方法包括：区域选择性偶联：

(a)单保护的二胺；和

(b)含有胺和能有效地把DTPA衍生物偶合于免疫球蛋白的部分的化合物；或者含有胺和能转变成有效把DTPA衍生物偶合于免疫球蛋白的部分的化物；

因此合成基本上含纯异构体的DTPA衍生物。

2、制备式(I)DTPA衍生物的方法，

该方法包括：

(a)把N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单保护的二胺(B)反应形成化合物(C)；

(b)除去(C)中的胺保护基团得到TFA-盐(D)；

(c)还原(D)得到(E)；

(d)对(E)进行五烷基化得到(F)；

(e)除去(F)中的氨保护基团得到三氟乙酸盐(G)；

(f)还原(G)中的硝基得到三氟乙酸盐(H)；和

(g)把(H)中的氨基转变形成式(I)的DTPA衍生物。

3、权利要求2的方法，其中式(I)化合物为MX-DTPA。

4、权利要求2的方法，其中式(I)化合物为1B3M-DTPA。

5、权利要求2的方法，其中式(I)化合物为CHx-DTPA。

6、权利要求2的方法，其中DTPA衍生物的特性通过选择二胺(B)控制。

7、制备MX-DTPA的方法，包括：

(a)把N-叔丁氧羰基对硝基-L-苯丙氨酸(A)和单-N-叔丁氧羰基保护的二胺(B′)偶联形成N-(2-N-叔丁氧羰基-氨基丙基)-N-叔丁氧羰基-对硝基苯丙胺酰胺(C′)；

(b)除去(C′)中的叔丁氧羰基得到N-(2-氨基丙基)-对硝基苯丙胺酰胺三氟乙酸盐(D′)；

(c)还原(D′)得到2-甲基-6-(对硝基苄基)二亚乙基三胺三盐酸盐(E′)；

(d)对(E′)进行五烷基化得到N，N，N′，N″，N″-五[(叔丁氧羰基)甲基]-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺(F′)；

(e)除去(F′)中的叔丁氧羰基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-硝基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(G′)；

(f)还原(G′)中的硝基得到N，N，N′，N″，N″-五(羧甲基)-2-[(4-氨基苯基)甲基]-6-甲基二亚乙基三胺三氟乙酸盐(H′)；和

(g)把(H′)中的氨基转变形成2-(对异硫氰基苄基)-6-甲基二亚乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(MX-DTPA)。

8、权利要求7的方法，其中(a)包括：应用苯并三唑-1-基氧三(二甲胺基)鏻六氟磷酸盐(BOP)作为偶合试剂。

9、权利要求7的方法，其中(a)包括：应用双(2-氧-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)作为偶合试剂。

10、权利要求7的方法，其中单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)由包括下列步骤的方法得到：(i)用氢氧化铵处理乳腈得到α-氨基腈(2)；(ii)用盐酸处理(2)得到胺盐酸盐(3)；(iii)用二叔丁基二碳酸酯保护该胺得到叔丁氧羰基保护的衍生物(4)；(iv)在两大气压的氢气下，应用阮内镍在饱和乙醇溶液中还原该腈得到单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。

11、权利要求7的方法，其中单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)有包括下列步骤的方法得到：(i)在相转移条件下，对席夫碱(5)进行烷基化得到单烷基化产品(6)；(ii)用1N盐酸脱保护(6)，然后用二叔丁基二碳酸酯保护得到叔丁氧羰基保护的胺(4)；和(iii)用阮内镍还原(4)得到单叔丁氧羰基保护的二胺(B′)。

12、权利要求7的方法，其中应用在二氯甲烷中的三氟乙酸除去(C′)中的叔丁氧羰基得到(D′)。

13、权利要求7的方法，其中还原(D′)的步骤包括：用硼烷-四氢呋喃配合物处理(D′)，接着用盐酸处理得到三胺盐酸盐(E′)。

14、权利要求7的方法，其中应用乙腈和碳酸钾进行中间体(E′)的五烷基化。

15、权利要求7的方法，其中应用在二甲基甲酰胺中的溴叔丁基乙酸酯和碳酸钠进行中间体(E′)的五烷基化。

16、权利要求7的方法，其中应用硅胶柱色谱纯化(F′)。

17、权利要求7的方法，其中应用三氟乙酸脱保护(F′)的羧酸得到五乙酸衍生物(G′)。

18、权利要求7的方法，其中在两大气压氢气下，在水中用钯/碳还原(G′)中的硝基得到(H′)。

19、权利要求7的方法，其中把(H′)转变成MX-DTPA的步骤包括：通过硫光气把胺(H′)转变成瓦状异硫氰酸酯基团。

20、权利要求14的方法，其中把(H′)转变成MX-DTPA的步骤包括：(i)把硫光气加入到含有五乙酸衍生物(H′)的氯仿和水的双相混合物中；(ii)快速搅拌该混合物2小时；(iii)减压除去溶剂得到残余物；(iv)用反相硅胶纯化残余物；和(v)用含有1％乙酸的25％乙腈水溶液洗脱。

21、权利要求19的方法，其中应用二氯甲烷和三乙胺把(H′)转变成MX-DTPA。

22、权利要求19的方法，其中应用乙腈和碳酸氢钠或碳酸钠把(H′)转变成DX-DTPA。

23、按照权利要求7所述方法制备的MX-DTPA组合物。

24、应用MX-DTPA以产生抗体螯合剂的改进方法，其中的改进包括：应用按照权利要求7制备的MX-DTPA。

25、基本上含纯净异构体的MX-DTPA组合物。

26、应用权利要求25的MX-DTPA组合物产生放射标记的MX-DTPA的方法。

27、制备CHx-DTPA的方法，包括：

(a)把N-叔丁氧羰基-对硝基-L-苯丙氨酸(A)与单保护的二胺(B″)偶联形成化合物(C″)；

(b)除去(C″)中的氨基保护基团形成TFA-盐(D″)；

(c)还原(D″)得到(E″)；

(d)对(E″)进行五烷基化得到(F″)；

(e)除去(F″)中的氨保护基团得到三氟乙酸盐(G″)；

(f)还原(G″)中的硝基得到三氟乙酸盐(H″)；

和(g)转变(H″)中的氨基得到CHx-DTPA。

28、权利要求27的方法，其中单保护的二胺(B″)为顺式。

29、权利要求27的方法，其中单保护的二胺(B″)为反式。

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