CN1487997A

CN1487997A - 诱导植物开花的hd3a基因及其应用

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Publication number: CN1487997A
Application number: CNA018222579A
Authority: CN
Inventors: 矢野昌裕; 子; 小岛晶子
Original assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution
Current assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; National Institute of Agrobiological Sciences; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2004-04-07
Also published as: EP1342785B8; EP1342785A1; AU2002224080B2; US7196246B2; DE60142253D1; CA2429679C; EP1342785A4; WO2002042475A1; CA2429679A1; JP2002153283A; EP1342785B1; KR20030051872A; AU2408002A; US20040088763A1; WO2002042475A8

Abstract

本发明通过连锁分析，成功地分离出Hd3a基因。本发明发现植物的开花时间可通过引入Hd3a基因或通过控制其表达来调整。

Description

诱导植物开花的HD3A基因及其应用

技术领域

本发明涉及诱导植物开花的基因，以及用这些基因改变植物的开花时间的方法。改变植物的开花时间的方法对植物品种改良十分有用。

技术背景

一般情况下，水稻的抽穗(开花)在短昼(short-day)时提前而长昼(1ong-day)时延迟。在已知的栽培品种中，通常是那些来自九州岛和日本大陆南部的品种具有较强的光周期敏感性，而来自东北地区或北海道的品种完全丧失了这种敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生长期后有特征性的开花，该植物的抽穗期不随光周期的改变而变化。水稻植物对栽培地点和时间的适应性根据该植物中光周期敏感性的存在而彻底不同。因此，改变水稻的光周期敏感性对于水稻品种改良十分重要。

在常规品种改良项目中，水稻抽穗期通过涉及以下方面的方法来改变：(1)通过杂交选择早熟品种或晚熟品种；和(2)通过辐射和化学试剂进行诱变；等。但是，这类品种改良项目的成功需要较长时间，并存在其它问题，如不能预计后代中突变的程度或方向。

“光周期敏感性基因”是在水稻遗传学领域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名称。已发现多个光周期敏感性基因的存在在突变体和栽培品种中是固有的，还提示光周期敏感性基因存在于，例如，Sel基因座(6号染色体；Yokoo和Fujimaki(1971)Japan.J.Breed.21：35-39)，E1基因座(7号染色体；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51：115-128；Okumoto，Y.et a1.(1992)Jpn.J.Breed.42：415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3号染色体)；Okumoto et al.Japanese Society of Breeding，91st lecture，Japanese Journal ofBreeding 47(Suppl.1)：31)；和其它类似基因座(Yamagata et al.(1986)In Ricegenetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。

当分离出水稻的光周期敏感性基因或由光周期敏感性基因控制的调节水稻抽穗的基因，通过转化方法将该基因引入任意目标水稻品种，将使控制水稻品种的抽穗时间成为可能。此外，不同植物的开花时间可以利用其它植物中对应于这种水稻光周期敏感性基因的基因进行控制。这种育种方法在方便性和可靠性方面与传统方法相比较具有极大优势。

发明内容

本发明是针对上述情况做出的。本发明的目的是提供新的控制植物开花基因。此外，本发明另一目的是用这些基因调节植物的开花时间。

本发明人特别关注于极需开发能改变其抽穗期(开花期)的简便方法的那些水稻，并积极地分离与水稻抽穗相关的基因。

在水稻中，用Nipponbare和Kasalath的杂交后代检测一种量化特性座位(QTL)Hd3a，发现它位于6号染色体的短臂上。此外，用具有Nipponbare遗传背景的Hd3a区(Kasalath的等位基因)近似纯合系进行的分析揭示，Hd3a基因座与短日照条件下促进抽穗的光周期敏感性基因座相同。

为了分离已知其存在但未鉴定出的光周期敏感性基因Hd3a，本发明人首先用P1衍生的人工染色体(PAC)克隆通过连锁分析对Hd3a基因区进行作图。具体地，用基于作图而进行的克隆所必需的大隔离群对Hd3a区进行了连锁分析。首先，使用Hd3a区的隔离群体和限制性片段长度多态性(RFLP)标记物建立连锁图谱，经证实Hd3a位于RELP标记物C764和B174之间的间隔区中(Monna等，the 1999 Annual Meeting of Japanese Society of MolecularBiology)。另外，利用Hd3a两侧的切割扩增多态性序列(CAPS)标记物CP13和CP15，从具有Hd3a区、拟利用子代分析确定其基因型的隔离群体，选出了在染色体上Hd3a的邻接区发生了重组的植株。经鉴定有8个个体在Hd3a和CP13之间发生重组，有2个在Hd3a和CP15之间发生重组。

然后，本发明人利用P1衍生的人工染色体(PAC)克隆对Hd3a基因区进行对比排列。更具体地，从Nipponbare PAC基因组文库选出了3种PAC克隆，它们在Hd3a基因座的邻接区内具有DNA标记物的序列。P0046E09和P0698G05克隆带有位于Hd3a两侧的标记物CP13和CP15的核苷酸序列，从而揭示了这些PAC克隆包含所述Hd3a基因区(图1)。对PAC克隆P0046E09的核苷酸序列分析发现，候选基因组区限定在一个约20kb的区域内。针对该候选区的核苷酸序列进行基因预测和同源性搜索，检测出以下区域，它们显示了与脂转移蛋白的基因，酰基-CoA合成酶基因，和拟南芥的FT基因具有高度同源性。

然后，用Nipponbare和近似纯合系(NIL(Hd3a))以RT-PCR分析这些候选基因的表达，该近似纯合系的Hd3a基因区被Kasalath染色体节段取代。结果证实了全部三种基因的表达，并发现在短日照条件下FT-样基因的转录水平增加(图2)。因此，选择FT-样基因作为潜在的候选基因。

从Kasalath基因组DNA建立粘粒文库。从粘粒文库筛选与FT-样基因区相应的克隆(图1)，并分析FT-样基因区的核苷酸序列。结果发现与Nipponbare的核苷酸序列相比，Kasalath的核苷酸序列中有41个位点发生突变(核苷酸的插入，缺失和取代)(图3)。外显子内的核苷酸取代导致一个氨基酸取代：由天冬酰胺(Kasalath)变成脯氨酸(Nipponbare)(图3)。

接着，本发明人将仅含Kasalath或Nipponbare候选基因区的片段引入一种可转化载体，来转化水稻植物，并分析所得转化体的表型。结果，在引入了这些基因的植物中，发现在短日照条件和长日照条件下都能提前抽穗的植株。但在仅引入了载体的植物中未发现抽穗时间的明显改变(表1)。另还对短日照条件下提前抽穗的转化植物的自花授粉后代进行培育，检查从播种到抽穗所需天数(抽穗期)的差异。结果隔离出比对照植株提早抽穗的植株，所有提早抽穗的植物都含有引入的基因(图4)。类似地，在长日照条件下，对照植物不能达到抽穗阶段，但在上述自花授粉后代中却发现了抽穗植物，它们全部都保留了引入的片段(图4)。

上述结果证实，候选的FT-样基因具有促进水稻抽穗(开花)的功能，结论是这种候选的FT-样基因是Hd3a基因。Hd3a基因广泛分布在植物中，有观点认为它与诱导这些植物开花有关。

最后，本发明人成功地分离出能诱导植物开花的Hd3a基因。本发明人还发现，植物的开花时间可利用这种基因进行改变，因此完成本发明。

更具体地，本发明提供了：

(1)一种编码植物蛋白的DNA，所述蛋白可诱导植物开花，所述DNA选自：

(a)编码含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)编码含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；和

(c)能在严谨条件下与由SEQ ID NO：1，3，23或24的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

(2)(1)的DNA，其中该DNA来自水稻。

(3)一种DNA，其编码与(1)或(2)的DNA的转录产物互补的反义RNA。

(4)一种DNA，其编码具有特异性消化(1)或(2)所述DNA的转录产物的核酶活性的RNA。

(5)一种DNA，其编码能通过在植物细胞中表达而利用共抑制效应来抑制(1)或(2)所述DNA的表达的RNA。

(6)(1)或(2)的DNA，其中所述DNA用来诱导植物开花。

(7)(3)至(5)中任一项的DNA，其中所述DNA用来抑制植物开花。

(8)一种载体，其包含(1)至(5)中任一项的DNA。

(9)一种植物细胞，其引入了(8)的载体。

(10)一种植物转化体，其包含(9)的植物细胞。

(11)(10)的植物转化体，其中所述植物转化体为水稻。

(12)一种植物转化体，其为(10)或(11)的植物转化体的后代或克隆。

(13)(10)至(12)中任一项的植物转化体的育种材料。

(14)一种产生(10)或(11)所述植物转化体的方法，其包括以下步骤：

(a)将(1)或(2)的DNA引入植物细胞，和

(b)从该植物细胞中再生植物。

(15)一种诱导植物开花的方法，其中所述方法包括在该植物体的细胞中表达(1)或(2)的DNA的步骤。

(16)一种抑制植物开花的方法，该方法以抑制植物体的细胞中(1)或(2)的内源DNA的表达为特征。

(17)(16)的方法，其包括在植物体的细胞中表达(3)至(5)任一项的DNA的步骤。

(18)(14)至(17)中任一项的方法，其中所述植物为水稻。

本发明提供了编码Hd3a蛋白的DNA。Kasalath的Hd3a基因组DNA和cDNA的核苷酸序列分别见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：23，这些DNA编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。Nipponbare的Hd3a基因组DNA和cDNA的核苷酸序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：24，它们编码的蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：4。

Hd3a是用Nipponbare和Kasalath的杂交后代检测到的一种量化性状座位(QTL)，经证实该座位位于6号染色体短臂上。通过分析具有Nipponbare遗传背景的Kasalath的Hd3a等位基因近似纯合系，结果表明Hd3a基因座能促进短日照条件下的抽穗。

尽管已知Hd3a是具有促进短日照条件下抽穗的作用的基因，并且它在水稻6号染色体短臂的较宽区域内广泛存在，但该基因本身并未得到鉴定或分离。本发明人经过复杂步骤，最终阐述了Hd3a存在的区域，并首次成功分离了单个基因形式的Hd3a基因。

目前在日本，水稻栽培中一个重要目标是控制水稻的抽穗期。在寒冷地区逃避由于秋季低温的早早到来而引起的低温损害是十分重要的。另一方面，在西南部温暖地区的水稻栽培重点区，为了减少收获过于集中而带来的繁重劳动，也需要提前或延迟抽穗期。

Hd3a具有诱导开花的功能。因此，用Hd3a基因的正义链进行转化能促进水稻抽穗(开花)。另一方面，按照反义方向引入该基因能抑制开花。植物育种中这类转化技术所需时间与通过杂交育种进行的基因转移相比显著缩短。而且，由于转化并不伴有性状的其它改变，这也是有利的。故植物的开花时间可以容易地利用分离的Hd3a基因进行改变。因此，该基因对适应不同地区而进行的水稻品种培育具有影响。而且，植物的抽穗时间多种多样，通过基因重组方式引入Hd3a基因，可培育缺陷该基因的植物新品种，通过用反义DNA或核酶控制该基因的表达，可培育携带该基因的品种。

编码本发明Hd3a蛋白的DNA包括基因组DNA，cDNA，和化学合成的DNA。基因组DNA和cDNA可根据本领域已知的常规方法来制备。更具体地，基因组DNA可以如下制备：(1)从具有Hd3a基因的水稻品种(如Kasalath或Nipponbare)中提取基因组DNA；(2)构建基因组文库(利用载体，如质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)；(3)将该文库铺板；和(4)利用根据编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：1，3，23，或24)制备的探针进行菌落杂交或空斑杂交。或者，可利用特异性针对编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：1，3，23，或24)的引物经PCR来制备基因组DNA。另一方面，cDNA可如下制备：(1)根据从具有Hd3a基因的水稻品种(如Kasalath或Nipponbare)提取的mRNA合成cDNA；(2)通过将该合成的cDNA插入载体，如λZAP来制备cDNA文库；(3)将该cDNA文库铺板；和(4)如上所述进行菌落杂交或空斑杂交。或者，cDNA也可通过PCR来制备。

本发明包括能编码与SEQ ID NO：2或4所示Hd3a蛋白(Kasalath或Nipponbare)功能等价的蛋白的DNA。本文中术语“与Hd3a蛋白功能等价”指目标蛋白具有诱导植物开花的功能。这类DNA优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科(Gramineae)，最优选来自水稻。

这类DNA的实例包括编码含有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的突变体、衍生物、等位基因变体、变体或同系物的那些DNA。

制备能编码含本领域技术人员熟知氨基酸改变的蛋白的DNA的方法包括定点诱变(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directedconstruction of mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154：350-367，1987)。蛋白的氨基酸序列也可由于核苷酸序列的突变而自然突变。编码具有天然Hd3a蛋白的氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、和/或添加的蛋白的DNA也包括在本发明的DNA中，只要它们编码与天然Hd3a蛋白(SEQ ID NO：2或4)功能等价的蛋白。此外，不引起蛋白质中氨基酸序列改变的那些核苷酸序列突变体(简并突变体)也包括在本发明的DNA中。

对一种DNA是否编码能诱导植物开花的蛋白可如下进行评价：将待测DNA引入植物和将该植物培养在能改变光照时间长短的培养箱中；检测从播种到开花(水稻中从播种到抽穗)所需的天数。在任何光周期条件下，如果一种蛋白能使植物与对照植物相比开花提早，就认为该蛋白具有促进开花的功能。由于与参比对照在开花时间上预计有较大差异，故可以在抑制对照植物开花的光周期条件下，特别容易地证实促进开花的功能，例如，对水稻而言，所述条件为长日照条件(14-16h)。

编码与SEQ ID NO：2或4所示Hd3a蛋白功能等价的蛋白的DNA可通过本领域已知方法产生，这些方法包括杂交技术(Southem，E.M.：Journal ofMolecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是说，用Hd3a基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1，3，23或24)或其部分作为探针，用能与Hd3a基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1，3，23或24)特异性杂交的寡核苷酸作为引物，分离出与水稻和其它植物的Hd3a基因高度同源的DNA是本领域的常规技术。这类能编码Hd3a蛋白的功能等价蛋白的DNA可通过杂交技术或PCR技术获得，它们都包括在本发明的DNA中。

用于分离这类DNA的杂交反应优选在严谨条件下进行。本发明的严谨条件包括如下条件：6M尿素，0.4％SDS，和0.5×SSC；和那些产生类似严谨度的条件。能在较高严谨条件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1×SSC下杂交的DNA具有较高的同源性。在这类条件下分离的DNA预计能编码与Hd3a蛋白(SEQ ID NO：2或4)具有较高氨基酸水平同源性的蛋白。本文中高同源性是指，整个氨基酸序列的同一性至少50％或更高，更优选至少70％或更高，更优选至少90％或更高(如至少95％或更高)。

一种氨基酸序列或核苷酸序列与另一种序列的同源性程度可按照Karlin和Altschl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)所述BLAST算法来确定。BLASTN和BLASTX等程序都是根据该算法开发的(Altschul et al.J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。为了根据基于BLAST的BLASTN来分析核苷酸序列，将参数设置为，例如score＝100和word length＝12。另一方面，用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时，所用参数包括score＝50和word length＝3。当使用BLAST和空隙化BLAST程序时，使用每种程序的默认参数。这类分析的特定技术是本领域已知的( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

例如，改变了开花时间的植物转化体可利用本发明的DNA来产生。更具体地，将编码本发明蛋白的DNA插入适当载体；将该载体引入植物细胞；然后使所得的经转化的植物细胞再生。由本发明人分离的Hd3a基因能诱导开花。因此，任意品种的开花时间可通过用该基因转化该品种并表达该基因来进行控制。这种转化比普通的通过杂交进行的基因转移所需的时间短很多。而且，转化不伴有特性的其它改变，这也很有利。

另一方面，开花受抑的植物转化体可利用能抑制编码本发明蛋白的DNA表达的DNA来产生：将该DNA插入适当载体，将载体导入植物细胞，然后使所得已转化的植物细胞再生。术语“抑制编码本发明蛋白的DNA表达”包括抑制基因转录以及抑制蛋白翻译。它不仅包括彻底抑制DNA表达，还包括降低表达水平。

植物中特定内源基因的表达可通过领域内常用的、利用了反义技术的方法来抑制。Ecker等人首次通过瞬时基因表达法证实了经电穿孔导入植物细胞的反义RNA的反义效应(J.R.Ecker和R.W.Dayis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5372(1986))。此后，有报道在烟草和矮牵牛中通过表达反义RNA减少了靶基因的表达(A.R.van der Krol et al.，(1988)Nature 333：866)。如今反义技术已作为抑制植物中靶基因表达的一种成熟手段。

反义核酸抑制靶基因表达需要多种因素，包括：通过形成三链而抑制转录起始；通过在RNA酶形成局部开环结构的位点处形成杂合体而抑制转录；通过与被合成的RNA形成杂合体而抑制转录；通过在内含子与外显子连接处形成杂合体而抑制剪接；通过在剪接体形成位点形成杂合体而抑制剪接；通过与mRNA形成杂合体而抑制mRNA从核到细胞浆的转位；通过在加帽位点或poly A添加位点形成杂合体而抑制剪接；通过在翻译起始因子结合位点形成杂合体而抑制翻译的起始；通过在起始密码子附近的核糖体结合位点形成杂合体而抑制翻译；通过在已翻译区或在mRNA的多体结合位点形成杂合体而抑制肽链延伸；通过在核酸与蛋白相互作用的位点形成杂合体而抑制基因表达。这些因素通过抑制转录、剪接或翻译而抑制靶基因的表达(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(NewBiochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，IdenshiNo Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression of genes)”，NihonSeikagakukai Hen(The Japanese Biochemical Society)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。

本发明的反义序列可通过上述任何机制抑制靶基因的表达。在一个实施方案中，如果将反义序列设计成与所述基因的mRNA 5’端附近的非翻译区互补，它就能有效抑制基因翻译。也有可能使用与编码区或非翻译区在3’侧互补的序列。因此，本发明中使用的反义DNA包括具有针对所述基因非翻译区和翻译区的反义序列的DNA。将所用的反义DNA连接在适当启动子下游，并优选将含有转录终止信号的序列连接在3’侧。将如此制备的DNA通过已知方法转染至目标植物中。优选反义DNA的序列是互补于转化植物的内源基因的序列或其一部分，但它不需要完全互补，只要它能有效抑制基因表达。所转录的RNA优选至少90％，最优选至少95％互补于靶基因的转录产物。为了用反义序列有效抑制靶基因的表达，该反义DNA应至少含有15个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，还更优选至少500个核苷酸。所用反义DNA通常短于5kb，优选短于2.5kb。

编码核酶的DNA也可用于抑制内源基因的表达。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶有很多种，它们具有不同的活性。对核酶作为RNA裂解酶的研究使得能设计出以位点特异性方式裂解RNA的核酶。一部分I组内含子型核酶或包含在RNA酶P中的M1RNA由至少400个核苷酸组成，而其它属于锤头型或发卡型的核酶具有约40个核苷酸的活性结构域(Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，和Enzyme)，35：2191(1990))。

锤头型核酶的自我裂解区在序列G13U14C15中C15的3’侧裂解。U14与第9位的A之间形成核苷酸对被认为对核酶活性是十分重要的。此外，已知当第15位的核苷酸是A或U而不是C时也发生裂解(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.228：225(1988))。如果将核酶的底物结合位点设计成与靶位点的邻近RNA序列互补，则能产生限制酶样RNA裂解性核酶，它识别靶RNA中的序列UC、UU、或UA(M.Koizumi et al.，FEBS Lett.239：285(1988)；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，和Enzyme)，35：2191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.17：7059(1989))。例如，在Hda3基因(SEQ ID NO：1，3，23或24)的编码区中有多个可作为核酶作用目标的位点。

发卡型核酶也可用于本发明。发卡型核酶可在烟草环斑病毒的卫星RNA负链中找到(J.M.Buzayan，Nature 323：349(1986))。该核酶也能以靶特异性方式裂解RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751(1992)；Yo Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemistry和Biology)30：112(1992))。

设计用于裂解目标的核酶可与启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子融合，并与转录终止序列融合，使它能在植物细胞中转录。但如果在所转录的RNA的5’或3’端添加了额外的序列，核酶的活性可能丢失。在这种情况下，可另外安排一个能清理接缝(trimming)的核酶，它能在核酶部分的5’或3’侧顺式清理接缝，从而从含有该核酶的转录RNA上准确切出核酶部分(K.Taira et al.，Protein Eng.3：733(1990)；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4823(1989)；C.A.Grosshands和R.T.Cech，Nucleic Acids Res.19：3875(1991)；K.Taira et al.Nucleic Acid Res.19：5125(1991))。通过随机排列靶基因内的多个位点可以裂解这些结构单位并获得更大效应(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271(1992))。通过利用这类核酶，有可能特异性裂解本发明靶基因的转录产物，从而抑制该基因的表达。

内源基因的表达也可通过用具有与该靶基因序列相同或相似序列的DNA进行转化而进行共抑制。“共抑制”是指将具有与内源靶基因序列相同或相似序列的基因通过转化而导入植物后，该导入基因和内源靶基因的表达都受到抑制的现象。共抑制的详细机制目前尚不明了，但它常见于植物(Curr.Biol.7：R793(1997)，Curr.Biol.6：810(1996))。例如，如果想获得Hd3a基因已被共抑制的植物体，可以用设计成能表达Hd3a基因的载体DNA或具有相似序列的DNA来转化该植物，在所得植物群体中选出与野生型植物相比开花受到抑制的植物。用于共抑制的基因不必与靶基因完全相同，但应有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％(如至少95％)的序列同一性。序列同一性可通过上述方法确定。

此外，本发明内源基因的表达也可通过用具有该靶基因的显性阴性表型(dominant negative phenotype)的基因转化该植物来抑制。具有该靶基因的显性阴性表型的基因是指，表达后能消除或降低该植物固有的野生型内源基因活性的那些基因。

对用于植物细胞转化的载体没有限制，只要该载体能在植物细胞中表达所插入的基因。例如，可以使用含有用于植物细胞中组成型基因表达的启动子(如花椰菜花叶病毒35S启动子)和受外源刺激诱导的启动子的载体。术语“植物细胞”在本文中包括各种形式的植物细胞，如培养细胞悬液，原生质体，叶切片，和愈伤组织。

可通过已知方法将载体导入植物细胞，如聚乙二醇法，电穿孔，农杆菌(Agrobacterium)介导的转移，和粒子轰击。可根据植物细胞的类型用已知方法从已转化的植物细胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.100：1503-1507)。

例如，水稻植物的转化和再生方法包括：(1)用聚乙二醇将基因导入原生质体并再生植物体(适于indica水稻品种)(Datta，S.K.(1995)in“GeneTransfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用电脉冲将基因导入原生质体并再生植物体(适于japonica水稻品种)(Toki et al(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通过粒子轰击将基因直接导入细胞并再生植物体(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9：957-962)；(4)利用农杆菌导入基因并再生植物体(Hiei et al.(1994)Plant J.6：271-282)；等等。这些都是领域内现有方法，都广泛用于本发明所属技术领域。这些方法适用于本发明。

一旦获得了一种转化植物，其中已将本发明的DNA导入了基因组，就有可能通过有性或无性繁殖从该植物体获得后代。或者，可从该植物及其后代或克隆获得育种材料(如种子、果实、穗、块茎、块根、株、愈伤组织、原生质体等)来大规模生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物的后代和克隆，以及从该植物获得的育种材料、其后代或克隆，它们都包括在本发明中。

如上述制备的植物的花期不同于野生型植物。例如，用编码Hd3a蛋白的DNA转化的植物在田间生长条件下花期提前。另一方面，由于导入反义DNA使得编码Hd3a蛋白的DNA的表达受到抑制的那些植物花期延迟。因此，植物开花所需时间可通过控制Hd3a基因的表达来调节。根据本发明，可以容易地控制水稻，这种极具价值的作物的抽穗期，这对于培育能适应特定环境的水稻品种非常有利。

附图说明

图1示Hd3a区及其候选基因组区的详细连锁图谱：

A：用2207个植株的隔离群制备的连锁图谱；

B：位于Hd3a区中的来自Nipponbare的PAC克隆；

C：Hd3a区的邻接区的放大图谱。

线上的实心圆表示CAPS标记物；箭头表示预测的基因区；Rec.显示重组个体重组的大概位置。候选区用方框表示。转化所用DNA片段也显示在图的下部。

图2的照片显示不同光周期条件下培育的水稻中，FT-样基因转录物的量的改变。“S”代表播种后，于长日照条件(16h日照)下培养30天，然后转移至短日照条件(10h日照)下培养0，2，6，和10天的植物的转录物。“L”代表在长日照条件下进一步培养了10天的植物的转录物。“G”代表基因组DNA；“N”代表未用模板而得到的转录物对照。

图3示Hd3a基因的结构。盒子代表翻译区。Nipponbare中不同于Kasalath的序列位置已示于图中。转录起始位点由图左侧的箭头指示。

图4示经转化的水稻植物的自花授粉后代(T1)分别在短日照(A)和长日照(B)条件下达到抽穗所需天数的分布频率。两图中，黑柱代表携有转基因的植物，斜纹柱代表不含转基因的植物。在长日照条件下，即使100天后，都未能在Nipponbare或NIL(Hd3a)中观察到抽穗。

具体实施方式

本发明参照以下实施例举例说明，但不应理解为本发明仅限于此。

[实施例1]高精度连锁分析

用基于图谱进行克隆所必需的大隔离群进行详细的Hd3a区连锁分析。连锁分析的隔离群使用的是Nipponbare与Kasalath杂交之后的回交后代BC3F3代。连锁分析分两步实施。首先，用595株植物的隔离群以及RFLP标记物制备Hd3a连锁图谱。结果证实Hd3a位于RFLP标记物C764和B174之间的区内(Monna等，The 1999 Annual Meeting，Japanese Society of MolecularBiology)。然后，为了进一步提高图谱分辨率，使用大群体进行连锁分析。具体地，从2207株为了分析Hd3a区而隔离的植物中筛选出在Hd3a的邻接区发生了重组的植物，该筛选使用下列的Hd3a侧翼CAPS(切割扩增多态性序列)标记物：CP13(引物[SEQ ID NO：5/5′-GAGTAATTTGCGGTCAGAGTC-3′]和[SEQ ID NO：6/5′-CCAAACAACACATCCTCAG-3′]，限制酶Tai I))；和CP15(引物[SEQ ID NO：7/5’-ACCGCAGGTCTCCTTGTCATT-3′]和[SEQ IDNO：8/5′-GCTATTGCCATCGCCTTGTGT-3′]，限制酶Msp I)。Hd3a基因座的基因型通过对后代的检测来确定。具体地，将筛选出的植物的10株自花授粉后代培养在短日照条件(10h光照)下的温室中，根据每一水稻品系达到抽穗所用天数的差异来确定Hd3a的基因型。通过连锁分析鉴定出8株具有Hd3a与CP13连锁的重组植物，2株具有Hd3a与CP15连锁的重组植物(图1)。

[实施例2]利用P1-衍生的人工染色体(PAC)克隆对Hd3a基因区进行比对

从Nipponbare的PAC基因组文库选出3个PAC克隆(P0037G03，P0046E09，和P0698G05)，它们在Hd3a基因座附近具有DNA标记物1-5A，R778，和CP39的核苷酸序列。通过筛选发现，这3个PAC克隆中，P0046E09和P0698G05具有Hd3a-侧翼标记物CP13和CP15的核苷酸序列，因此它们含有Hd3a基因区(图1)。

[实施例3]通过核苷酸序列分析鉴定候选基因区

为了界定Hd3a的候选基因组区并鉴定该候选基因，分析了PAC克隆P0046E09的核苷酸序列。为此，用超声处理将P0046E09的DNA插入子(包括载体)变成片段，以便制备两个包含DNA插入子的亚文库，其一平均长度为2kb，另一为5kb。从这两类亚文库中随机选出2000个克隆，分析它们的核苷酸序列，用计算机软件Phred/Phrap( http：//bozeman.genome.washington.edu/ index.html)装配。根据连锁分析所鉴定的候选基因区内核苷酸序列的信息，制备新的CAPS(切割扩增多态性序列)标记物来限制候选区。

Hd3a基因与CAPS标记物25-3UL(引物[SEQ ID NO：9/5’-TCAGAACTTCAACACCAAGG-3’]和[SEQ ID NO：10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’]，限制酶Hae III)和CP39(引物[SEQ IDNO：11/5’-GGGAGAATATGTTGCAGTAG-3’]和[SEQ ID NO：12/5’-CAAATGGTAATGGGTCAA-3’]，限制酶Alu I)共隔离。另外还检测出两株重组植物，其一在Hd3a基因与25-5UL(引物[SEQ ID NO：13/5’-CTGTCTCGAAATCGCCTCTG-3’]和[SEQ ID NO：14/5’-TCCAGCACATCACCCACAA-3’]，限制酶Hse III)之间发生了重组，另一在Hd3a与CP59(引物[SEQ ID NO：15/5’-AGCCTCTGCGTCACTGTCATC-3’]和[SEQ ID NO：16/5’-GCAGCAGCAAACTCCCAAAG-3’]，限制酶TthH8I)之间发生了重组(图1)。据此，将候选基因组区界定为近20kb的一个区域。

用GENSCAN( http：//ccR-081.mit.edu/GENSCAN.html)对该候选区的核苷酸序列进行基因预测和相似性检索，结果在该候选基因组区内检测出与编码脂转移蛋白、酰基-CoA合成酶的基因，以及与拟南芥的FT基因具有高度相似性的区域。

[实施例4]Hd3a候选基因的表达分析

对Nipponbare以及近似纯合系(NIL(Hd3a))的候选基因进行RT-PCR，所述NIL(Hd3a)中的Hd3a基因区被Kasalath的染色体片段取代。具体地，收集叶片，提取总RNA，用逆转录酶合成cDNA，然后使用能特异性扩增Hd3a候选基因组区内发现的3个基因的引物进行PCR：(对FT-样基因而言：正义链[SEQ ID NO：9/5’-TCAGAACTTCAACACCAAGG-3’]和反义链[SEQ IDNO：10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’]；对脂转移蛋白的基因而言：正义链[SEQ ID NO：17/5’-GGGGACGTCGGACCTGT-3’]和反义链[SEQ IDNO：18/5’-AGTTGAAGTTTGGGCTGGTCG-3’]；对酰基-CoA合成酶的基因而言：正义链[SEQ ID NO：11/5’-GGGAGAATATGTTGCAGTAG-3’]和反义链[SEQ ID NO：12/5’-CAAATGGTAATGGGTCAA-3’])。用作模板的RNA的量用以下引物对经PCR来评估(正义链[SEQ ID NO：19/5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’]和反义链[SEQ ID NO：20/5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’])，这对引物能扩增肌动蛋白基因中的一个片段。将Nipponbare和NIL(Hd3a)在长日照条件(光照16.0h)下培养30天后，继续在短日照条件(光照10.0h)下培养0，2，6，和10天，或在长日照条件下培养10天。然后，从这些植物收集叶片进行分析。

结果证实，候选基因区以内的所有这三种预测基因都发生表达。FT-样基因的转录物可在短日照条件下培养的植物中检测到，但在长日照条件下培养的植物中未检测到(图2)。在短日照条件下培养的Nipponbare与NIL(Hd3a)的转录量没有显著差异(图2)。脂转移蛋白的基因的转录物仅见于Nipponbare，酰基-CoA合成酶的基因的转录物可见于Nipponbare和NIL(Hd3a)，但表达水平在短日照条件和长日照条件下培养的植物之间没有差异。以上结果表明，FT-样基因可作为利用转化进行功能分析时的有效候选基因，因为它在短日照条件下转录水平增加。

[实施例5]Hd3a候选基因的核苷酸序列分析

由Kasalath的基因组DNA制备粘粒文库，以便筛选对应于Hd3a候选区的克隆H3PZ1-1。更具体地，用Kasalath的基因组DNA以及pPZP2CH-lac载体构建基因组DNA文库。用位于Hd3a邻接区的核苷酸序列25-5UL和CP39，从该文库中选出含有Hd3a候选基因的克隆H3PZ1-1(图1)。对该克隆的核苷酸序列进行分析，并与Nipponbare的Hd3a进行比较，结果证实，Nipponbare的核苷酸序列与Kasalath的相比，有32个位点发生核苷酸取代，有2个位点发生插入(2bp和3bp)，有7个位点发生缺失(1bp-50bp)(图3)。

用于进行cDNA核苷酸序列分析的近似纯合系(NIL(Hd3a))经过短日照条件的培养后，提取RNA，合成cDNA，实施RT-PCR，所用引物对含有从起始密码子到终止密码子的区域(正义链[SEQ ID NO：21/5’-GCTGCCTCTATCACAGTATATT-3’]和反义链[SEQ ID NO：10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’])。将PCR产物克隆并测序。通过5’-RACE确定转录起始位点，结果证实该位点位于预测的转录起始密码子上游152bp处。

分析结果表明，所有突变中，位于外显子内部的突变仅限于N末端侧的一个单-核苷酸取代和一个两-核苷酸取代。后一种取代被证实导致天冬酰胺(Kasalath)变成脯氨酸(Nipponbare)(图3)。

[实施例6]通过转化鉴定候选基因的功能

将来自粘粒克隆H3PZ1-1的仅含有所述候选基因区的8.7kb SpeI片段克隆至载体pPZP2H-lac中(pPZHd3aK)，该载体可利用土壤杆菌进行转化。类似地，将Nipponbare的8.7kb SpeI片段插入pPZP2H-lac中(pPZHd3aN)。用包含这些片段的载体和单独的载体按照Toki的方法(Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21，1997)进行转化。用Nipponbare作为接受转化的水稻品系。结果，用pPZHd3aK进行转化获得了21株潮霉素抗性植株(用单独的载体进行转化获得17株)，用pPZHd3aN进行转化获得20株潮霉素抗性植株(用单独的载体进行转化获得20株)。

在pPZHd3aK的情况中，用CAPS标记物25-5UL通过CAPS分析来确定是否已实现目标区的插入，对pPZHd3aN的情况而言，采用对应于载体的引物M13 Primer RVand TAKARA以及对应于基因的引物[SEQ ID NO：22/5’-CGCTCAGCAACGAGTTTC-3’]进行PCR。结果发现，用pPZHd3aK和pPZHd3aN转化得到的转化体都掺入了候选基因。

及时将这些再生的植物转移至短日照(光照10h)或长日照(光照13.5h)温室中，研究到达抽穗所需的天数。在引入了pPZHd3aK和pPZHd3aN的植物中，短日照或长日照条件下培养后，都发现了抽穗期大大提前的植株(表1)。在仅引入了单独的载体的植物中，没发现抽穗期有明显改变的植株(表1)。

表1

到达抽穗的天数^a

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 未出穗

SD pPZHd3aK 1 2 4 2

单独载体 2 5 3 1

LD pPZHd3aK 1 1 1 1 1 1 1 1 4

单独载体 6

SD pPZHd3aN 1 1 2 3 3

单独载体 2 3 5

LD pPZHd3aN 1 1 2 2 1 1 2

单独载体 1 3 1 5

a：从将转化体转移至土壤中的当日到抽穗日的天数

未抽穗：97天内未能抽穗的植株

SD和LD：分别指短日照培养(光照10.5小时)和长日照(光照13.5小时)培养

pPZHd3aK和pPZHd3aN：分别与Nipponbare和Kasalath的Hd3a基因一起插入的载体另外，对提早抽穗的转化植物(pPZHd3aK)的自花授粉后代进行短日照条件培养，检查达到抽穗期所需天数的分布，发现天数的变化是连续分布的，但比对照植物Nipponbare提早抽穗的植物是散在的，这些植物包含转基因(图4)。

另一方面，将自花授粉后代在长日照条件下进行类似的培养，其中出现与Nipponbare和NIL(Hd3a)截然不同的抽穗植物，Nipponbare和NIL(Hd3a)甚至在100天后都未能抽穗。所有抽穗植物都保留了插入的DNA片段(图4)。

这些结果表明，FT-样基因，即所述候选基因，具有促进短日照条件下抽穗的功能，并且可将该基因确定为Hd3a。预测Kasalath的等位基因的抽穗作用比Nipponbare的更强。但Nipponbare的等位基因也提示能在一定程度上维持该功能。长日照条件下观察到的提早抽穗很可能归因于通过转化新引入的Hd3a基因导致的Hd3a表达水平的升高。

产业实用性

本发明提供了诱导植物开花的基因。本发明使得有可能控制水稻的抽穗期，这对于育种意义重大。水稻植物抽穗期的控制尤其可用于培育适应特定地区和季节的水稻品种。此外，利用本发明的基因培育水稻的方法与传统方法相比的优势在于，可以在较短周期内以较高的可靠性获得目标植物。

序列表

<110>矢耶昌裕(Yano Masahiro)，小岛晶子(Kojima Shoko)

<120>诱导植物开花的HD3A基因及其应用

<130>

<140>

<141>

<150>JP 2000-356839

<151>2000-11-24

<160>24

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>4229

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<223>基因组DNA

<220>

<221>exon

<222>(825)..(1184)

<220>

<221>intron

<222>(1185)..(1346)

<220>

<221>exon

<222>(1347)..(1408)

<220>

<221>intron

<222>(1409)..(1541)

<220>

<221>exon

<222>(1542)..(1582)

<220>

<221>intron

<222>(1583)..(2889)

<220>

<221>exon

<222>(2890)..(3274)

<220>

<221>CDS

<222>(978)..(1184)

<220>

<221>CDS

<222>(1347)..(14 08)

<220>

<221>CDS

<222>(1542)..(1582)

<220>

<221>CDS

<222>(2890)..(3119)

<400>1

gataagttgc ggaaaaacca acaaattagc aacaaatatg agtaaaactt gtatacatgt 60

gtcttcttag cgatttaaaa atcaatgctg aaaataaatt ataataaaat taaaaatctc 120

aagataatct ctaaaatgta gttttaaaat ttaaattttg attgcgactg ataagaaaaa 180

aaaacaaatg atgggaggct atatcaactg tcaaactggc taatttagaa agacgacatc 240

gaattcctac agattggagg cagcaaaaga gagcctgtct ctgccgggtg cgtgcatgat 300

gctcgatcat atcccatctc tcctcacttc atcatcaaca agaacaagag gaactatata 360

gctgcaagat ctagactgaa actactatag caactaactg tactgtagct agattacgct 420

tagctatagc tgctgctgca gctgctgctg catctatctg taaattccaa ctacgacgtc 480

gactgctgca agctagcttg accggctagc tagatagcta gctagctcaa aagagaaagc 540

tttgcgaaat aggagtagct agctagctct agctagggcg ccatcgatgc gtgaccaccg 600

agctcgcctc gtccacacgt acaggaagac gatgcagaaa gcggccggca tgcagtaaac 660

tgaccgagct aagagagaga gagagagatg atattattct tctgcagcta aattaaagtg 720

aaagttggac atggacatgg acatagtaat tttgcatggc catcatcttg ccctcctata 780

taaagcggcc atctcactct caaccacagc tcgatccagc agccctgcac cacacacagt 840

tcagctagca gatcacctag ctagatagct gcctctatca cagtatattt gctccctgca 900

acttgctgct gctgcaatag ctagcagctg cagctagtaa gcaaaactat ataccttcag 960

ggttttttgc aagatcg atg gcc gga agt ggc agg gac agg gac cct ctt 1010

Met Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu

1 5 10

gtg gtt ggt agg gtt gtg ggt gat gtg ctg gac gcg ttc gtc cgg agc 1058

Val Val Gly Arg Val Val Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser

15 20 25

acc aac ctc aag gtc acc tat ggc tcc aag acc gtg tcc aat ggc tgc 1106

Thr Asn Leu Lys Val Thr Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys

30 35 40

gag ctc aag ccg tcc atg gtc acc cac cag cct agg gtc gag gtc ggc 1154

Glu Leu Lys Pro Ser Met Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly

45 50 55

ggc aat gac atg agg aca ttc tac acc ctt gtatgtgagc tctaccatgt 1204

Gly Asn Asp Met Arg Thr Phe Tyr Thr Leu

60 65

gtcgtagttg gttcagagac cagaagttat actttctttc attattatat tgtagaaaat 1264

tttgtttggt acttaaccca agatgacttt aaaatgcatt aatttgatgt ttgtcatggt 1324

tgtttgtggt gtgtacctga ag gtg atg gta gac cca gat gca cca agc cca 1376

Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro

70 75

agt gac cct aac ctt agg gag tat cta cat tg gtaagcacac taatgttaag 1428

Ser Asp Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp

80 85 90

ctagcgcact tgttttcatg caatgatcaa aataatcact gctagctgat ttacatacat 1488

aaccacatct tgactgcatg atgggttgat catcttaatt tgtttgtcca cag g ttg 1545

Leu

gtc act gat att cct ggt act act gca gcg tca ttt g gtcagtatta 1592

Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe

95 100

aacgatcaaa tggtttagat tgatttgatt tcccacttaa atacattgca gtataaaact 1652

aacagaggta aattgtcttt ccatactatt gtttgggggg gggggggggg ggcagtgagt 1712

tgttgagcat tttccctcac tcgcgagccc ccagtttgcc gcattaattc cccatcatcc 1772

ttcaccacca ccaaaaataa aaagtgattt ggagaaggat acgctcctcc aaataatttt 1832

taacaagttc accaccacaa cgaggcaccg ataaccgcca tgagtccacg caccctgcag 1892

ctagtcgtgc caccagcacc acagtttgcc acaccgcgag caatccacgc catcacttgc 1952

cgctgtgagt ccacgatcac acgcctcgat cagccagctg ccatgatatg tcggcttggg 2012

cttggattcc gcaacatacc atgtccccat cgatggcacc acactctaat tcgccaacac 2072

aacactgaag ggatcggacc gggagggcta gctcactcaa gatagtgacg ggatgattcg 2132

atgggaattc catggggaac aaagcacaaa atcatgaaaa tgtccttttc aattccatgg 2192

caaattccta aagcaatact ctctctccat tctataatgt aggttgcaca ctcatttcaa 2252

gattcaactt tcaaaacatt tgactaacga tttgtataat ataaattgaa ttttatttga 2312

tagaaataat attattggat tgatatttca atatactttc atatggttat aattttgtta 2372

ctacaaactt tatagtatat tagaaattat aaataaaaaa ttagttttat agaccgtaca 2432

tgccaagttt gaccatacca taatatgaaa aagagggagt agtaaccttg tttatattgg 2492

caatatatac ttcctccgtt tctaaatatt tgacgctgtt gactttttaa acatgtttga 2552

ccgttcgtct tattaaaaaa taagtaatta ttaattcttt tcctatcatt tgatttattg 2612

ttaaatatat ttttatgcag acatatagtt ttacatattt cataaaagtt tttgaataag 2672

aagaatgatc gtcaaatatt tagaaacgag gggagtatat tgctagtaaa ttttactgta 2732

aagtcatgtt tcttcatgtg tcttttttag aacatttctt cttcatgtgt tccattcaat 2792

tttttcgatc tccaccacca ctaccacagt tgtatgtgta gtagctagct gttgcacatg 2852

ctcatgttaa tctgaatctg ttcatggttt tttgcag gg caa gag gtg atg tgc 2906

Gly Gln Glu Val Met Cys

105

tac gag agc cca agg cca acc atg ggg atc cac cgg ctg gtg ttc gtg 2954

Tyr Glu Ser Pro Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val

110 115 120 125

ctg ttc cag cag ctg ggg cgt cag aca gtg tac gcg ccc ggg tgg cgt 3002

Leu Phe Gln Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg

130 135 140cag aac ttc aac acc aag gac ttc gcc gag ctc tac aac ctc ggc tcg 3050

Gln Asn Phe Asn Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser

145 150 155

ccg gtc gcc gcc gtc tac ttc aac tgc cag cgc gag gcc ggc tcc ggc 3098

Pro Val Ala Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly

160 165 170

ggc agg agg gtc tac aac tag ctaacgatga tcccgatcga tctgctgcat 3149

Gly Arg Arg Val Tyr Asn

175 180

gctcactatc atcatccagc atgctataca ttgcaggttc agacaattga aatgattctc 3209

gacacacaac atatatatga tggtgtaatt aattatgcaa ttaattagct gagcaaggct 3269

aaggtctctc atgaagctag ctttgctcta tatatatata tatatatata tatatatata 3329

tatatatata tatatatata tatatatata tagtgaagtg tgcaataagc tgcaggtata 3389

taagactgga tttaaggagc taattaacta aaccatgcat cacgtatatg tgagatgcag 3449

tcgtgctctt gcatccaagg atacatacag catatgcatg caatattggt atcatatgca 3509

tgcaatattg gtatcatatg cagcggctgc tagctactcc tagaagctat acagcagaat 3569

gtaaacatat atgtgtagca gtacttatac gtagcacatc gatctgcaca tgttggatgt 3629

agcaagaaat tgctatgaaa tataagtaga gatgtgctta atatcaaatg tgtgtcacat 3689

gtgaatctat cagctgggca tatatagtgt ctctttcagg cttccatctc actgtctatc 3749

tcgcccccca ctgaatatat atttcgacag ctgtcgcgtt ccgattcgtc gaaatctctc 3809

gctagcacag tttaaggaca ggtactacgt gctaatgata tgatatgatg gtgaaaggga 3869

ctacagctag ggagtatcaa tcagaaccca tgttttggaa aagctgatac ggatcgatat 3929

tgatcatatg catgcgtaga agaattcatc gtcagaaaac gcgtacgatt ggtcgtatgt 3989

gaaagaagca tatatatcta gatctgtaac tttaaaatcc actctcctat gatcgatcga 4049

catccattg gtgagttata tgttcaaaag catagatcga gatcgtcacg attggtagtg 4109

ggtgatcgat gcagctatac tagctccttt tctctcccaa tcgtcgaaga ttcaggcatt 4169

cacccaatgc tgttgcaggg atataattgt ctctgttatt ttttattctg acattgtata 4229

<210>2

<211>179

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val

1 5 10 15

Val Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser Thr Asn Leu Lys Val

20 25 30

Thr Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser

35 40 45

Met Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asn Asp Met Arg

50 55 60

Thr Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser

65 70 75 80

Asp Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro

85 90 95

Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe Gly Gln Glu Val Met Cys Tyr Glu Ser

100 105 110

Pro Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Gln

115 120 125

Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe

130 135 140

Asn Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser Pro Val Ala

145 150 155 160

Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly Gly Arg Arg

165 170 175

Val Tyr Asn

<210>3

<211>4110

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<223>基因组DNA

<220>

<221>exon

<222>(812)..(1170)

<220>

<221>ihtron

<222>(1171)..(1332)

<220>

<221>exon

<222>(1333)..(1394)

<220>

<221>intron

<222>(1395)..(1527)

<220>

<221>exon

<222>(1528)..(1568)

<220>

<221>intron

<222>(1569)..(2875)

<220>

<221>exon

<222>(2876)..(3260)

<220>

<221>CDS

<222>(964)..(1170)

<220>

<221>CDS

<222>(1333)..(1394)

<220>

<221>CDS

<222>(1528)..(1568)

<220>

<221>CDS

<222>(2876)..(3105)

<400>3

gataagttgc ggaaaaacca acaaattagc aacaaatatg agtaaaactt gtatacatgt 60

gtcttcttag cgatttaaaa atcaatgctg aaaataaatt acaataaaat taaaaatctc 120

aagataatct ctaaaatgta gttttaaaat ttaaattttg attgcgactg ataagaaaaa 180

aaaacaaatg atgggaggct atatcaactg tcaaactggc taatttagaa agacgacatc 240

gaattcctac agattggagg cagcaaaaga gagcccgtct ctgccgggtg cgtgcatgat 300

gctcgatcat atcccatctc tcctcacttc atcatcaaca agaacaagag gaactatata 360

gctgcaagat ctagactgaa actactatag caactaactg tactgtagct agattacgct 420

tagctatagc tgctgctgca tctatctgta aattccaact acgacgtcga ctgctgcaag 480

ctagcttggc cggctagcta gatagctagc tagctcaaaa gagaaagctt tgcgaaatag 540

gagtaactag ctagctctag ctagggcgcc atcgatgcgt gaccaccgag ctcgcctcgt 600

ccacacgtac aggaagacga tgcagaaagc ggccggcatg cagtacactg accgagctaa 660

gagagagaga gagatgatat tattcttctg cagctaaatt aaagtgaaag ttggacatgg 720

acatggacat agtaattttg catggccatc atcttgccct cctatataaa gcggccatct 780

cactctcaac cacagctcga tccagcagcc ctgcaccaca cacagttcag ctagcagatc 840

acctagctag atagctgcct ctatcacagt atatttgctc cctgcaactt gctgctgctg 900

caatagctag cagctgcagc tagtaagcaa aactataaac cttcagggtt ttttgcaaga 960

tcg atg gcc gga agt ggc agg gac agg gac cct ctt gtg gtt ggt agg 1008

Met Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg

1 5 10 15

gtt gtg ggt gat gtg ctg gac gcg ttc gtc cgg agc acc aac ctc aag 1056

Val Val Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser Thr Asn Leu Lys

20 25 30

gtc acc tat ggc tcc aag acc gtg tcc aat ggc tgc gag ctc aag ccg 1104

Val Thr Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro

35 40 45

tcc atg gtc acc cac cag cct agg gtc gag gtc ggc ggc aat gac atg 1152

Ser Met Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asn Asp Met

50 55 60

agg aca ttc tac acc ctt gtatgtgagc tctaccatgt gtcgtagttg 1200

Arg Thr Phe Tyr Thr Leu

65

gtgcagagac cagaagttat actttctttc attattatat tatagaaaaa tttgtttggt 1260

acttaaccca agatgacttt aaaatgcatt aatttgatgt ttgtcatggt tttttgtggt 1320

gtgtacctga ag gtg atg gta gac cca gat gca cca agc cca agt gac cct 1371

Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro

70 75 80

aac ctt agg gag tat cta cat tg gtaagcacac taatgttaag ctagcgcact 1424

Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp

85 90

tgttttcatg caatgatcaa aataatcact gctagctgat ttacatacat aaccacatct 1484

tgactgcatg atgggttgat catcttaatt tgtttgtcca cag g ttg gtc act gat 1540

Leu Val Thr Asp

att cct ggt act act gca gcg tca ttt g gtcagtatta aacgatcaaa 1588

Ile Pro Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe

95 100

tggtttagat tgatttgatt tcccacttaa atacattgca gtataaaact aacagaggta 1648

aattgtcttt ccatactatt gtttgggggg ggggggccag ggggcagtga gttgttgagc 1708

attttccctc actcgcgagc ccccagtttg ccgcattaat tccccatcat ccttcaccac 1768

cacaaaaaaa aaagtgattt ggagaaggat acgctcctcc aaataatttt taacaagttc 1828

accaccacaa cgaggcaccg acaaccgcca tgagtccacg caccctgcag ctagtcgtgc 1888

caccagcacc acagttagcc acaccgcgag caatccacgc catcacttgc cgctgtgagt 1948

ccacgatcac acgcctcgat cagccagctg ccatgatatg tcggcttggg cttggattct 2008

gcaacatacc atgtccccat cgatggcacc acactctaat tcgccaacac aacactgaag 2068

ggatcggatc gggagggcta gctcactcaa gatagtgacg ggatgattcg atgggaattc 2128

catggggaac aaagcacaaa atcattaaaa tgtccttttc aattccatgg caaattccta 2188

aagcaatact ctctctccat tctataatgt aggttgcaca ctcatttcaa gattcaactt 2248

tcaaaacatt tgactaacga tttgtataat ataaattgaa ttttatttga tagaaataat 2308

attattggat tgatatttca atatactttc atatggttat aattttgtta ctacaaactt 2368

tatagtatat tagaaattat aaataaaaaa ttagttttgt agaccgtaca tgccaagttt 2428

gaccatacca tattatgaaa aagagggagt agtaaccttg tttatatttg caatatatac 2488

tccctccgtt tctaaatatc tgacgctgtt gactttttaa acatgtttga ccgttcgtct 2548

tattaaaaaa taagtaatta ttaattcttt tcctatcatt tgatttattg ttaaatatat 2608

ttttatgcag acatatagtt ttacatattt cataaaagtt tttgaataag aagaatgatc 2668

gtcaaatatt tagaaacgag gggagtatat tgctagtaaa ttttactgta aagtcatgtt 2728

tcttcatgtg tcttttttag aacatttctt cttcatgtgt tccaatcaat tttttcgatc 2788

tccaccacca ctaccacagt tgtatgtgta gtagctagct gttgcacatg ctcatgttaa 2848

tctgaatctg tccatggttt tttgcag gg caa gag gtg atg tgc tac gag agc 2901

Gly Gln Glu Val Met Cys Tyr Glu Ser

105 110

cca agg cca acc atg ggg atc cac cgg ctg gtg ttc gtg ctg ttc cag 2949

Pro Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Gln

115 120 125

cag ctg ggg cgt cag aca gtg tac gcg ccc ggg tgg cgt cag aac ttc 2997

Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe

130 135 140

aac acc aag gac ttc gcc gag ctc tac aac ctc ggc tcg ccg gtc gcc 3045

Asn Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser Pro Val Ala

145 150 155 160

gcc gtc tac ttc aac tgc cag cgc gag gca ggc tcc ggc ggc agg agg 3093

Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly Gly Arg Arg

165 170 175

gtc tac ccc tag ctaacgatga tcccgatcga tctgctgcat gctcactatc 3145

Val Tyr Pro

180

atcatccagc atgctataca ttgcaggttc agacaattga aatgattctc gacacacaac 3205

atatatatga tggtgtaatt aattatgcaa ttaaatagct gagcaaggct aaggtctctc 3265

atgaagctag ctttgctcta tatatatata tatatatata tagtgaagtg tgcaataagc 3325

tgcaagtata taagactgga tttaaggagc taattaacta aaccatgcat catgtatatg 3385

tgagatgcag tcgtgctctt gcatccaagg atacatacag catatgcatg caatattggt 3445

atcatatgca gcggctgcta gctactccta gatcaagcta tacagcagaa tgtaaacata 3505

tatgtgtagc agtacttata cgtagcacat cgatctgcac atgttggatg tagcaagaaa 3565

ttgctatgaa atataagtag agatgtgctt aatatcaaat gtgtatcaca tgtgaatcta 3625

tcagctgggc atatatagtg tctctttcag gcttccatct cactgtctat ctcgcccccc 3685

actgaatatg cccagtttaa ggacaggtac tacgtgctga tgatatgata tgatggtgaa 3745

agggactaca gctagggagt atcaatcaga acccatgttt tggaaaagct gatacggatc 3805

gatattgatc atatgcatgc gtagaagaat tcatcgtcag aaaacgcgta cgattggtcg 3865

tatgtgaaag aagcatatat atctagatct gtaactttaa aatccactct cctatgatcg 3925

atcgagcatc cattggtgag ttatatgttc aaaagcatcg atcgagatcg tcacgattgg 3985

tagtgggtga tcgatgcagc tatactagct ccttttctct cccaatcgtc gaagattcag 4045

gcattcagcc aatgctgttg cagggatata attgtctctg ttatttttta ttctgacatt 4105

gtata 4110

<210>4

<211>179

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>4

Met Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val

1 5 10 15

Val Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser Thr Asn Leu Lys Val

20 25 30

Thr Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser

35 40 45

Met Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asn Asp Met Arg

50 55 60

Thr Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser

65 70 75 80

Asp Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro

85 90 95

Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe Gly Gln Glu Val Met Cys Tyr Glu Ser

100 105 110

Pro Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Gln

115 120 125

Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe

130 135 140

Asn Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser Pro Val Ala

145 150 155 160

Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly Gly Arg Arg

165 170 175

Val Tyr Pro

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>5

gagtaatttg cggtcagagt c 21

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>6

ccaaacaaca catcctcag 19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>7

accgcaggtc tccttgtcat t 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>8

gctattgcca tcgccttgtg t 21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>9

tcagaacttc aacaccaagg 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>10

accttagcct tgctcagcta 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>11

gggagaatat gttgcagtag 20<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>12

caaatggtaa tgggtcaa 18

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>13

ctgtctcgaa atcgcctctg 20

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>14

tccagcacat cacccacaa 19

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>15

agcctctgcg tcactgtcat c 21

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>16

gcagcagcaa actcccaaag 20

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>17

ggggacgtcg gacctgt 17

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>18

agttgaagtt tgggctggtc g 21

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>19

tccatcttgg catctctcag 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>20

gtacccgcat caggcatctg 20

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>21

gctgcctcta tcacagtata tt 22

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：人工合成的引物序列

<400>22

cgctcagcaa cgagtttc 18

<210>23

<211>847

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>23

tgcaccacac acagttcagc tagcagatca cctagctaga tagctgcctc tatcacagta 60

tatttgctcc ctgcaacttg ctgctgctgc aatagctagc agctgcagct agtaagcaaa 120

actatatacc ttcagggttt tttgcaagat cgatggccgg aagtggcagg gacagggacc 180

ctcttgtggt tggtagggtt gtgggtgatg tgctggacgc gttcgtccgg agcaccaacc 240

tcaaggtcac ctatggctcc aagaccgtgt ccaatggctg cgagctcaag ccgtccatgg 300

tcacccacca gcctagggtc gaggtcggcg gcaatgacat gaggacattc tacacccttg 360

tgatggtaga cccagatgca ccaagcccaa gtgaccctaa ccttagggag tatctacatt 420

ggttggtcac tgatattcct ggtactactg cagcgtcatt tgggcaagag gtgatgtgct 480

acgagagccc aaggccaacc atggggatcc accggctggt gttcgtgctg ttccagcagc 540

tggggcgtca gacagtgtac gcgcccgggt ggcgtcagaa cttcaacacc aaggacttcg 600

ccgagctcta caacctcggc tcgccggtcg ccgccgtcta cttcaactgc cagcgcgagg 660

ccggctccgg cggcaggagg gtctacaact agctaacgat gatcccgatc gatctgctgc 720

atgctcacta tcatcatcca gcatgctata cattgcaggt tcagacaatt gaaatgattc 780

tcgacacaca acatatatat gatggtgtaa ttaattatgc aattaattag ctgagcaagg 840

ctaaggt 847

<210>24

<211>847

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>24

tgcaccacac acagttcagc tagcagatca cctagctaga tagctgcctc tatcacagta 60

tatttgctcc ctgcaacttg ctgctgctgc aatagctagc agctgcagct agtaagcaaa 120

actataaacc ttcagggttt tttgcaagat cgatggccgg aagtggcagg gacagggacc 180

ctcttgtggt tggtagggtt gtgggtgatg tgctggacgc gttcgtccgg agcaccaacc 240

tcaaggtcac ctatggctcc aagaccgtgt ccaatggctg cgagctcaag ccgtccatgg 300

tcacccacca gcctagggtc gaggtcggcg gcaatgacat gaggacattc tacacccttg 360

tgatggtaga cccagatgca ccaagcccaa gtgaccctaa ccttagggag tatctacatt 420

ggttggtcac tgatattcct ggtactactg cagcgtcatt tgggcaagag gtgatgtgct 480

acgagagccc aaggccaacc atggggatcc accggctggt gttcgtgctg ttccagcagc 540

tggggcgtca gacagtgtac gcgcccgggt ggcgtcagaa cttcaacacc aaggacttcg 600

ccgagctcta caacctcggc tcgccggtcg ccgccgtcta cttcaactgc cagcgcgagg 660

caggctccgg cggcaggagg gtctacccct agctaacgat gatcccgatc gatctgctgc 720

atgctcacta tcatcatcca gcatgctata cattgcaggt tcagacaatt gaaatgattc 780

tcgacacaca acatatatat gatggtgtaa ttaattatgc aattaaatag ctgagcaagg 840

ctaaggt 847

Claims

1.一种编码植物蛋白的DNA，所述蛋白可诱导植物开花，所述DNA选自：

(a)编码含有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)编码含有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；和

(c)能在严谨条件下与由SEQ ID NO：1，3，23或24所示核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

2.权利要求1的DNA，其中该DNA来自水稻。

3.一种DNA，其编码与权利要求1或2所述DNA的转录产物互补的反义RNA。

4.一种DNA，其编码具有特异性消化权利要求1或2所述DNA的转录产物的核酶活性的RNA。

5.一种DNA，其编码能通过在植物细胞中表达而利用共抑制效应来抑制权利要求1或2所述DNA的表达的RNA。

6.权利要求1或2的DNA，其中所述DNA用来诱导植物开花。

7.权利要求3至5中任一项的DNA，其中所述DNA用来抑制植物开花。

8.一种载体，其包含权利要求1至5中任一项的DNA。

9.一种植物细胞，其引入了权利要求8的载体。

10.一种植物转化体，其包含权利要求9的植物细胞。

11.权利要求10的植物转化体，其中所述植物转化体为水稻。

12.一种植物转化体，其为权利要求10或11的植物转化体的后代或克隆。

13.权利要求10至12中任一项的植物转化体的育种材料。

14.一种产生权利要求10或11所述植物转化体的方法，其包括以下步骤：

(a)将权利要求1或2的DNA引入植物细胞，和

(b)从该植物细胞再生植物。

15.一种诱导植物开花的方法，其中所述方法包括在该植物体的细胞中表达权利要求1或2的DNA的步骤。

16.一种抑制植物开花的方法，该方法以抑制植物体的细胞中权利要求1或2的内源DNA的表达为特征。

17.权利要求16的方法，其包括在植物体的细胞中表达权利要求3至5任一项所述DNA的步骤。

18.权利要求14至17中任一项的方法，其中所述植物为水稻。