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CN1468258A - 胰高血糖素样肽-1类似物 - Google Patents

胰高血糖素样肽-1类似物 Download PDF

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CN1468258A CNA018112137A CN01811213A CN1468258A CN 1468258 A CN1468258 A CN 1468258A CN A018112137 A CNA018112137 A CN A018112137A CN 01811213 A CN01811213 A CN 01811213A CN 1468258 A CN1468258 A CN 1468258A
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Abstract

本发明公开的是在下列一或多个位点进行了修饰的胰高血糖素样肽－1(GLP－1)化合物，其中这些位点是11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37位。也公开了处理这些GLP－1化合物的方法。

Description

胰高血糖素样肽-1类似物
本申请要求2000年6月16日提交的美国临时申请60/212,171，及2000年10月13日提交的美国临时申请60/240,349的益处。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一个含有37个氨基酸的、可对食物摄入作出应答的肽，是由肠L-细胞分泌的。已经发现胰高血糖素样肽-1可刺激胰岛素分泌(促胰岛素活性)，从而引起细胞对葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平下降(见如Mojsov，S.，Int.J.PeptideProtein Research，40：333-343(1992))。然而，GLP-1(1-37)活性很低，所以人们的注意力集中在截短的类似物上，例如比GLP-1具有更强生物学活性的GLP化合物。其例子包括GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH及Ser34-GLP-1(7-37)OH。由于他们具有刺激胰岛素分泌的能力，GLP化合物显示出作为在糖尿病、肥胖症和相关状况的治疗剂方面的巨大潜力。
GLP-1化合物至少能以两种不同形式存在。第一种形式是生理活性的，并在生理pH(7.4)下可迅速溶解在水溶液中。相反，第二种形式具有很少或没有促胰岛素活性，且基本上不溶于pH7.4的水中。偏巧当将GLP-1水溶液搅动、暴露于疏水表面或具有大的空气/水界面时很容易形成非活性形式。转化为不溶形式的趋势使得商业用量的活性GLP-1化合物的生产复杂化了。在大批量生产过程中，利用泵来进行混合操作或连续操作是很普遍的，并且这些操作可引起搅动、空气/水界面和/或与疏水表面接触，从而形成不溶形式。在贮存中或对患者给药后也可能转化为非活性形式，这进一步将利用这些化合物作为药物复杂化了。因此，对较现有GLP-1化合物不易转化为不溶形式的生物活性GLP-1类似物需求很大。
现在已经发现，相对于GLP-1(7-37)OH，在位点11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37中的一或多个位点进行了修饰的多种GLP-1类似物在聚集倾向方面显示出很大的下降。
这样的多种类似物保留有GLP-1受体活化作用，这与已知的GLP-1化合物如GLP-1(7-37)OH和Val8-GLP-1(7-37)OH相当或在某些方面要强。例如，Val8-Glu22-GLP(7-37)OH的聚集时间比GLP-1(7-37)OH长20倍以上，并且其GLP-1受体活化作用要比GLP-1(7-37)OH约高25％。在这些发现的基础上，本发明公开了新颖的GLP-1化合物和利用新颖的GLP-1化合物进行的治疗方法。
本发明的一个实施方案是具有式I(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的多肽：His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Ala-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-R式I(SEQ ID NO：1)
其中：
Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；
Xaa11是：Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；
Xaa12是：His，Trp，Phe，或Tyr；
Xaa16是：Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，GLu，
      或Ala；
Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；
Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；
Xaa24是：Glu，His，Ala，或Lys；
Xaa26是：Asp，Lys，Glu，或His；
Xaa27是：Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；
Xaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；
Xaa33是：Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；
Xaa34是：Glu，Lys，或Asp；
Xaa35是：Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，
      His，或Glu；
Xaa36是：Arg，Glu，或His；
R是：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
     -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除。
前提是多肽不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，或Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala11-Glp-1(7-37)OH，Ala11-Glp-1(7-36)NH2，Ala16-G1p-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Ala27-Glp-1(7-37)OH，Ala27-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，Glu27-Glp-1(7-36)NH2，Ala33-Glp-1(7-37)OH，或Ala33-Glp-1(7-36)NH2。
本发明的另一个实施方案是具有式II(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的多肽：His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa35-Arg-R
       式II(SEQ ID NO：2)
其中：
Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；
Xaa12是：His，Trp，Phe，或Tyr；
Xaa16是：Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，
      或Ala；
Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；
Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；
Xaa26是：Asp，Lys，Glu，或His；
Xaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；
Xaa35是：Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，
      His，或Glu；
R是：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
     -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除。前提是多肽不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-GLP(7-37)OH，或Ala16-Glp-1(7-36)NH2。
本发明的另一个实施方案是具有式III(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的多肽：His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
   式III(SEQ ID NO：3)其中：Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa27是：Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或LysXaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Ris：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
 -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除。
前提是多肽不含有GLP-1(7-37)(OH)或GLP-1(7-36)-NH2序列，以及前提是多肽不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，或Glu27-Glp-1(7-36)NH2。
本发明的另一个实施方案是具有式IV(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的多肽：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R(SEQ ID NO：4)
其中：
Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸或α-甲基组氨酸；
Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸。优选地，Xaa8是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸；
Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸。
R是-NH2或Gly(OH)。
本发明的另一实施方案是第8位具有除丙氨酸之外的氨基酸及第22位具有除甘氨酸之外的氨基酸的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)化合物。
本发明的另一实施方案是在需要GLP-1受体刺激的受试者中刺激GLP-1受体的方法。此方法包括对受试者给药以有效剂量的此处描述的GLP-1化合物或含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽。
而本发明的另一实施方案是此处描述的GLP-1化合物或含有SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽，它可在需要GLP-1受体刺激的受试者中用于刺激GLP-1受体。
本发明中的GLP-1化合物保留有GLP-1受体活化能力，此外，相对于其他GLP-1化合物，他们具有降低的聚集趋势。这样，就可对这些化合物溶液进行搅动而使转化为不溶的非活性形式的量最少。这一优点大大简化了生产过程。此外，我们期望在对患者给药后很少或不发生体内聚集，从而提高活力并减少副作用。此外，这些GLP-1化合物可抵抗二氨基肽酶IV降解并与锌结合，因此我们相信它们可提供更长的体内作用时间。
图1展示了Val8-Glu22-
GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：5)，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ
ID NO：6)，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：7)和Val8-
Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列。
图2展示了Gly8-Glu22-
GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：9)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ
ID NO：10)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：11)和
Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列。
图3展示了Val8-Glu30-
GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：13)，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ
ID NO：14)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：15)，和
Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列。
图4展示了Val8-Glu22-
Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：17)和Val8-Lys22-Glu23-GLP-
1(7-37)OH(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列。
GLP-1化合物是含有约25-39个天然或非天然氨基酸的多肽。它与GLP-1(7-37)OH具有充分的同源性，因此显示促胰岛素活性。非天然氨基酸的实例包括α-甲基氨基酸(如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(如2-氨基组氨酸，β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸或α-甲基组氨酸)、侧链中含有一额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及侧链中的羧酸官能团由磺酸基团取代了的氨基酸(如半胱磺酸)。然而，除非此处特别提出，本发明中的GLP-1化合物优选仅仅包含天然氨基酸。
GLP-1化合物一般包括含有GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-37)OH类似物、GLP-1(7-37)OH片段或GLP-1(7-37)OH类似物片段的氨基酸序列的多肽。GLP-1(7-37)OH含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列：7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly(SEQ ID NO：19)
按照本领域中的习惯，GLP-1(7-37)OH的氨基末端定为第7位残基，而羧基末端定为第37位残基。对多肽中的其他氨基酸依次进行编号，如SEQ ID NO：19中所示。例如，第12位为苯丙氨酸而第22位为甘氨酸。在没有特别指出的情况下，C-末端一般是传统羧基形式。
“GLP-1片段”是在GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH类似物的N-末端或C-末端截掉一或多个氨基酸后得到的多肽。用于描述GLP-1(7-37)OH的术语涵盖GLP-1片段。例如，GLP-1(9-36)OH表示在N-末端截掉2个氨基酸和在C-末端截掉1个氨基酸后得到的GLP-1。此片段中的氨基酸是用与GLP-1(7-37)OH中对应氨基酸的数字来表示的。例如，GLP-1(9-36)OH中的N-末端谷氨酸在第9位；第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸，这与GLP-1(7-37)OH相同。
“GLP-1化合物”也包括在GLP-1(7-37)OH或其片段的N-末端和/或C-末端添加一或多个氨基酸后得到的多肽。这类GLP-1化合物含有的氨基酸最多可达约39个。“延长的”GLP-1化合物中的氨基酸是用与GLP-1(7-37)OH中对应氨基酸的数字来表示的。例如，通过在GLP-1(7-37)OH的N-末端添加两个氨基酸得到的GLP-1化合物的N-末端氨基酸在第5位；而通过在GLP-1(7-37)OH的C-末端添加一个氨基酸得到的GLP-1化合物的C-末端氨基酸在第38位；因此，与GLP-1(7-37)OH中的序号相同，在这两类“延长的”GLP-1化合物中第12位是苯丙氨酸；而第22位是甘氨酸。“延长的”GLP-1化合物的1-6位氨基酸优选与GLP-1(7-37)OH中相应的氨基酸相同，或是对GLP-1(7-37)OH中相应氨基酸的保守取代。“延长的”GLP-1化合物的第38-45位氨基酸优选的与胰高血糖素或exendin-4中相应的氨基酸相同，或是对胰高血糖素或exendin-4中相应氨基酸的保守取代。
“GLP-1类似物”与GLP-1(7-37)OH或其片段具有充分的同源性，从而这些类似物也具有促胰岛素活性。优选地，GLP-1类似物包含有GLP-1(7-37)OH或其片段的氨基酸序列，对其进行修饰，这样其氨基酸序列中有1、2、3、4或5个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段中相应位置上的氨基酸不同。在此处用来命名GLP-1化合物的命名法中，取代氨基酸及其位置与母结构相同。例如，Glu22-GLP-1(7-37)OH表示一个GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第22位甘氨酸由谷氨酸取代；Val8-G1u22-GLP-1(7-37)OH表示一个GLP-1化合物，其中GLP-1(7-37)OH正常的第8位丙氨酸和第22位甘氨酸分别由缬氨酸和谷氨酸取代。
一般来讲，GLP-1化合物的N-末端不进行取代，但可进行烷基化或酰基化作用(优选的是C1-C20)。正如在GLP-1(7-37)OH中一样，C末端也不进行取代，但也可与-NH2、-NHR或-NRR′进行酰胺化或与-OR″进行酯化。R和R′是独立的，可为烷基或酰基(优选C1-C20)。R”是烷基(C1-C20)。GLP-1(7-36)-NH2是“酰胺化GLP化合物”的一个例子。优选地，本发明中的GLP-1化合物具有不为-NH2取代或为-NH2取代的C-末端。
本发明中，优选的GLP-1化合物包括GLP-1类似物或GLP-1类似物的片段，其中这些类似物或其片段的主链含有除第8位丙氨酸(8位类似物)外的其他氨基酸。主链的第7位也可包括L-组氨酸、D-组氨酸或以修饰过的形式存在的组氨酸如脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸或α-甲基组氨酸。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些第8位类似物优选的含有在11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位上进行的一或多个额外改变。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些第8位类似物更优选含有在12、16、22、23、26、30、35和37位上进行的一或多个额外改变。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些第8位类似物甚至更优选含有在22、23、27、30和37位上进行的一或多个额外改变。
与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些类似物也优选含有6个或少于6个改变。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些类似物更优选含有5个或少于5个改变或含有4个或少于4个改变。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些类似物甚至更优选的含有3个或少于3个改变。与天然GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相比，这些类似物最优选含有2个或少于2个改变。
已经发现，这些取代降低了GLP-1化合物聚集并产生不溶形式的倾向。利用如实施例3中描述的聚集检验来进行检测可发现，本发明中的GLP-1化合物的聚集速度一般来讲要较GLP-1(7-37)OH至少慢5倍，优选至少慢20倍，更优选至少要慢40倍，更优选至少要慢约50倍，甚至更优选至少要慢约60倍，以及甚至更优选至少要慢约65倍。优选地，此处描述的GLP-1化合物是GLP-1(7-36)NH2或GLP-1(7-37)OH的类似物。
在一个优选的实施方案中，本发明中的GLP-1化合物第22位上的氨基酸具有一个侧链，此侧链含有至少两个碳原子和一个极性或带电的官能团。含有亚甲基和羧基碳的天冬氨酸包括在内。更优选的，第22位氨基酸的侧链是一含有2-6个碳原子和一个带电官能团，如羧酸、胺、胍基或磺酸基的直链或支链烷基。因此，第22位氨基酸的优选实例包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸。当第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸时，第8位氨基酸优选为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，而更优选是缬氨酸或甘氨酸。侧链具有磺酸基的氨基酸的实例是半胱磺酸(-NH-CH(CH2SO3)-CO-，缩写为“Cya”)。当第22位是磺酸如半胱磺酸时，第8位优选为甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，而更优选为缬氨酸或甘氨酸。
在另一优选的实施方案中，第8位的氨基酸优选的是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，更优选是缬氨酸或甘氨酸，而30位是谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或组氨酸，更优选的为谷氨酸。
在另一优选的实施方案中，第8位氨基酸优选的是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，更优选为缬氨酸或甘氨酸，而第37位是组氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，而更优选的是组氨酸。
在另一优选实施方案中，第8位氨基酸优选的是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，更优选的为缬氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更优选的是谷氨酸或赖氨酸，而第23位是赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和组氨酸，更优选的是赖氨酸或谷氨酸。
在另一优选实施方案中，第8位氨基酸优选的是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸，更优选的为缬氨酸或甘氨酸，而第22位是谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或精氨酸，更优选的是谷氨酸或赖氨酸，而第27位是丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸，更优选的是丙氨酸。
在另一优选实施方案中，本发明中的GLP-1组合物的第8位氨基酸和选自11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位及37位氨基酸的1、2或3个氨基酸与天然的GLP-1(7-37)OH中相应位置的氨基酸不同。
在另一优选实施方案中，除第8位氨基酸之外，本发明中的GLP-1化合物中选自11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位及37位氨基酸的1或2个氨基酸与原始的GLP-1(7-37)OH中相应位置的氨基酸不同。
正如上文所描述的，在含有与GLP-1(7-37)或GLP-1(7-37)的片段相应位置上的氨基酸不同的8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位氨基酸之外，本发明中的GLP-1化合物也可以含有其他的氨基酸。GLP化合物中，除与GLP-1(7-37)OH相应位置上的氨基酸不同的8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36和37位氨基酸之外的氨基酸优选为保守取代的氨基酸，而更优选的是高度保守取代的氨基酸。
优选地，除与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段相应位置上的氨基酸不同的第8位和第22位氨基酸外，本发明中的GLP-1化合物含有0、1、2或3个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH相应位置上的氨基酸不同。在一个实例中，除第8和22位氨基酸之外，在GLP-1化合物第7、21和27位的1或多个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-37)OH片段相应位置上的氨基酸不同。
优选地，仅仅第7、8和22位氨基酸与GLP-1(7-37)OH(或其片段)相应位置上的氨基酸不同。我们期望，通过利用此处所述的合适的氨基酸来取代已知的、具有生物活力的GLP-1化合物中第22位甘氨酸和优选第8位丙氨酸来制备具有降低的聚集特性的GLP-1化合物。在Hoffman等的美国专利NO.5,977,071和Buckeley等的美国专利NO.5,545,618，Adelhorst，et al.，J.Biol。Chem.269：6275(1994)中公开有已知的、具有生物活性的GLP-1化合物，在此处对其全文引用作为参考。
“保守取代”是指利用另一个与被取代氨基酸具有相同净电荷和具有大约相同大小和形状的氨基酸来取代此氨基酸。当它们侧链上的碳原子和杂原子总数相差不超过4个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸大致上是大小相同的。当它们侧链上的分支数目相差不超过1个时，它们大致具有相同的形状。侧链上具有苯基或取代苯基的氨基酸可认为是大小和形状相同的。下面列出的是氨基酸的5个组。利用同一组中的一个氨基酸取代此组中的另一个氨基酸可导致保守取代：
组I：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱磺酸，以及具有C1-C4脂肪族侧链或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链或单支链)的非天然氨基酸。
组II：谷氨酸、天冬氨酸及具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(无分支或一个分支点)的非天然氨基酸。
组III：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸及具有酰胺或胍基取代的C1-C4芳香族侧链(无分支或一个分支点)的非天然氨基酸。
组IV：谷氨酰胺、天冬酰胺及具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(无分支或一个分支点)的非天然氨基酸。
组V：苯丙氨酸、苯甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
除非特别指明，保守取代优选的通过天然氨基酸来进行。
“高度保守取代”是指利用另一个与被取代氨基酸在侧链上具有相同的官能团并具有几乎相同大小和形状的氨基酸来取代此氨基酸。当它们侧链上的碳原子和杂原子总数相差不超过2个时，具有脂肪族氨基酸或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸大致上是大小相同的。当它们侧链上具有相同的分支数目时，它们大致具有相同的形状。高度保守取代的实例包括缬氨酸取代亮氨酸、苏氨酸取代丝氨酸、天冬氨酸取代谷氨酸，苯甘氨酸取代苯丙氨酸。非高度保守取代的实例包括丙氨酸取代缬氨酸、丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
本发明中的GLP-1化合物的一个实例是含有SEQ ID NO：1中的氨基酸序列的多肽。在一优选实例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa22是Glu或Lys及Xaa23是Glu或Lys外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。在另一实例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa30是Glu外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。另一实例中，除Xaa8是Gly或Val、Xaa37是His外，此GLP-1化合物是GLP-1(7-37)OH。
本发明中的GLP-1化合物的另一个实例是含有SEQ ID NO：4中的氨基酸序列的多肽。在一优选实例中，Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸，Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸，优选地，Xaa8是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸；R是-NH2或Gly(OH)，而Xaa22是SEQ ID NO：4中的赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸。在更优选的实例中，Xaa7是L-组氨酸，Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，Xaa22是赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，而R是Gly(OH)。作为选择，SEQ ID NO：4中的Xaa7、Xaa8和R与上文所描述的相同，而Xaa22是具有侧链的氨基酸，其中此侧链包含有磺酸基如半胱磺酸。
在本发明的GLP-1化合物的另一实例中，当第22位氨基酸具有C1-C2烷基侧链、C1-C2羟基化烷基侧链或C1-C2硫醇化的烷基链(如半胱磺酸)时，第8位氨基酸不是D-氨基酸，并且不含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或β-丙氨酸侧链。在本发明的GLP-1化合物的一个优选实例中，当第22位氨基酸具有C1-C4烷基侧链、C1-C4羟基化烷基侧链或C1-C4硫醇化烷基链(如半胱磺酸)时，第8位氨基酸不是D-氨基酸，并且不含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或β-丙氨酸侧链。
在本发明的GLP-1化合物的另一实例中，第8位氨基酸是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸或色氨酸；而第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或组氨酸。
本发明的GLP-1化合物的具体实例包括Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：20)，Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：21)，Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：22)，Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：23)，Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：24)，Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQID NO：5)，Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：6)，Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：7)，Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：8)，Val8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：25)，Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：9)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：10)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：11)，Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：12)，Gly8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：26)，Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ IDNO：27)，Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：28)，Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：29)，Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：30)，Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：31)，Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：32)，Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：33)，Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：34)，Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：35)，Val8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：36)，Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：37)，Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：38)，Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：39)，Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ IDNO：40)and Gly8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO：41)，Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：42)，Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：43)，Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：44)，Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：45)，Val8-His35-GLP-l(7-37)OH(SEQ ID NO：46)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：47)，Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：48)，Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：49)，Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：50)，Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：51)，Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：52)，Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：53).
正如此处所用到的，术语‘GLP-1’化合物也包括药学上可接受的、此处所描述的化合物的盐。本发明中的GLP-1化合物可含有充足的酸性、碱性官能团或两者兼具，并因此与多种无机碱、无机酸和有机酸进行反应形成盐。通常用于形成酸加成盐的酸是无机酸，如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，和有机酸如对甲苯磺酸、甲烷磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。这些盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁烯-1，4-二酸盐、己烯-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。
GLP-1化合物可用于治疗具有多种疾病和状况的患者。我们相信，GLP-1化合物，包括本发明中的这些化合物在内，可通过作用于称为‘GLP-1受体’(见Thorrens的美国专利NO.6,670,360)来发挥他们的生物学效用。因此，可利用本发明中的GLP-1化合物来治疗患有可对GLP-1受体刺激和/或对GLP-1化合物给药作出有益应答的疾病或状况的患者。这些患者被称作“需要利用GLP-1化合物进行治疗”或“需要GLP-1受体刺激”。这样的患者包括患有胰岛素非依赖型糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、卒中(见Efendic的WO 00/16979)、心肌梗塞(见Efendic的WO 98/08531)、肥胖症(见Efendic的WO98/19698)、手术后分解代谢改变(见Efendic的美国专利.NO 6,006,753)、功能性消化不良和肠激惹综合征(见Efendic的WO99/64060)的患者。也包括需要利用GLP-1化合物进行预防性处理的患者，如具有发生胰岛素非依赖型糖尿病危险性的患者(见WO00/07617)。葡萄糖耐受异常或空腹葡萄糖异常的受试者、体重超出相对于患者身高和体格来讲的正常体重25％的受试者、进行了部分胰切除手术的受试者、双亲中有一或多个患有胰岛素非依赖型糖尿病的受试者、患有妊娠期糖尿病的受试者及患有急或慢性胰腺炎的受试者具有患胰岛素非依赖型糖尿病的危险性。
GLP-1化合物的‘有效量’是指对需要GLP-1受体刺激的患者给药时，在不造成不能接受的副作用的条件下，能够产生所需治疗和/或预防效果的量。‘所需的治疗效果’包括下列的一或多个方面：1)与疾病和状况相关的症状的改善；2)延缓与疾病或状况相关的症状的出现；3)与没有进行治疗的情况相比寿命增加；以及4)相对于没有进行治疗的情况具有更高的生活质量。例如，用于治疗糖尿病的GLP-1化合物的‘有效量’指与没有进行治疗的情况相比，能对血糖浓度进行更大程度上的控制，从而延缓糖尿病并发症如视网膜病变、神经病或肾病出现的量。用于预防糖尿病的GLP-1化合物的‘有效量’指与没有进行治疗的情况相比，能延缓升高的血糖水平出现的量，而血糖水平升高是需要用抗高血糖药物如磺脲类、噻唑烷二酮、胰岛素和/或氯苯呱哌嗪来进行治疗的。
对患者给药以GLP-1化合物的‘有效量’也依赖于疾病的类型和严重程度，以及依赖于患者的特点，如一般的健康程度、年龄、性别、体重和对药物的耐受程度。在这些因素和其他的影响因素基础之上，本领域技术人员就能确定适当的剂量。一般情况下，对成年人来讲，GLP-1化合物的有效治疗量约为0.01-1000mg/天。优选地，此剂量为约0.1-100mg/天，更优选的是约1.0-10mg/天。
本发明的GLP-1化合物可进行如口服给药、经鼻给药、吸入或肠胃外给药。肠胃外给药包括，如全身给药，例如经肌内、静脉内、皮下或腹膜内注射。可将GLP-1化合物与作为药物组合物一部分的药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂联合给药以治疗上述疾病。如果进行肠胃外给药，那此药物组合物可以溶液，或以GLP-1悬浮液，或以与二价金属阳离子进行复合的GLP-1化合物悬浮液形式存在。适当的药物载体可含有惰性成分，这些惰性成分不与肽或肽衍生物相互作用。可应用标准的药物制剂技术，如在Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所描述的技术。用于肠胃外给药的适当的药物载体包括，如无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含有约0.9mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸缓冲液、Hank’s溶液、Ringer’s乳酸盐等。适当的赋形剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。
‘受试者’指哺乳动物，优选人，但也可以是动物，如宠物(如狗、猫、等)、饲养动物(如牛、绵羊、猪、马等)以及实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
本发明中的GLP-1化合物可与适当的二价金属阳离子进行复合。一般情况下，GLP-1化合物的二价金属复合物在生理pH附近是不溶于水的。因此，这些复合物可用于以悬浮液的形式进行皮下给药，其在体内展示了降低的释放率，从而延长了化合物的作用时间。适当的二价金属阳离子的实例包括Zn++、Mn++、Fe++、Ca++、Co++、Cd++、Ni++等，优选的是Zn++。
为了获得本发明中的GLP-1化合物与二价金属阳离子形成的复合物，在金属盐存在的条件下将GLP-1溶解在适当的缓冲液中。在环境温度下对此混合物进行孵育来使复合体进行沉淀。适当的缓冲液是那些可以维持混合物的pH约为3.0-9.0且不干扰复合反应的缓冲液。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和Goode’s缓冲液，如HEPES、Tris和Tris乙酸盐。适当的金属盐是其中的金属可用于复合作用的金属盐。适当的锌盐的实例包括氯化锌、乙酸锌、氧化锌和硫酸锌。优选地，提供的二价金属阳离子盐如氯化锌是过量的，其摩尔比最多可达对每个GLP-1化合物分子提供约50个二价金属阳离子分子。
‘促胰岛素活性’指对升高的血糖水平做出应答，刺激胰岛素的分泌，从而细胞对血糖的摄取和血清葡萄糖水平下降。可利用本领域中已知的方法对促胰岛素活性进行检测，这些方法包括利用体内实验和体外检测来测定GLP-1受体结合活力或受体活化，如Gelfand等的EP619,322和美国专利No.5,120,712分别描述的利用胰岛细胞或胰岛素瘤细胞进行检测。这些文献的全部内容在此处引用作为参考。
可利用固相肽合成技术的标准方法来制备本发明中的GLP-1化合物。肽合成仪可从如位于Foster City的Applied Biosystems商业购得。用于固相合成的试剂可从如Midwest Biotech(Fishers，IN)商业购得。利用固相肽合成仪，可按照生产说明书来阻断干扰基团、保护要进行反应的氨基酸、偶合、去偶合及对未反应的氨基酸进行加帽。
一般来讲，在室温下，在惰性溶剂如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯啉或二氯甲烷中，在偶合试剂如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑及碱如二异丙基乙胺存在的条件下，树脂上生长中肽链上的α-N-氨基甲酰基保护的氨基酸和N-末端氨基酸进行偶合。利用试剂如三氟乙酸或哌啶从生成的肽树脂中去除α-N-氨基甲酰基保护基团，并通过将下一个所需的N-末端保护了的氨基酸添加到肽链上来重复偶合反应。适当的胺保护基团在本领域中是众所周知的，并且在如Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley和sons，1991中有描述，此处全文引用作为参考。其实例包括叔丁氧羰基(tBoc)和芴基甲氧羰基(Fmoc)。
利用进行了适当的侧链保护的叔丁氧羰基或芴基甲氧羰基-α-氨基酸，也可按照标准的自动化固相合成规程来合成肽段。合成完成后，从固相支持物上将肽段切掉，同时利用标准的氟化氢法对侧链进行去保护反应。随后，在Vydac C18色谱柱中、利用0.1％三氟乙酸(TFA)中的乙腈梯度进行反相色谱对粗肽进一步纯化。为了去除乙腈，需要对含有0.1％TFA、乙腈和水的溶液进行冷冻干燥，从而得到肽段。通过分析反相色谱来检验其纯度。肽段的成分可利用质谱来进行检验。在中性pH下可将肽段溶解在水相缓冲液中。
本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例并没有以任何方式限制本发明。
实施例1-利用固相t-Boc化学制备本发明中的GLP-1化合物
将约0.5-0.6g(0.38-0.45mmol)Boc Gly-PAM树脂置于标准的60ml反应容器中，在Applied Biosystems ABI430A肽合成仪上进行双偶合。从Midwest Biotech(Fishers，IN)购得下列侧链保护的氨基酸(BOC氨基酸的2mmol cartridge)并用于合成：Arg-甲苯磺酰基(TOS)、Asp-δ-环己基酯(CHXL)、Glu-δ-环己基酯(CHXL)、His-苄氧基甲基(BOM)、Lys-2-氯苄氧羰基(2Cl-Z)、Met-亚砜(O)、Ser-O-苄基醚(Obzl)、Thr-O-苄基醚(Obzl)、Trp-甲酰(CHO)和Tyr-2-溴苄氧羰基(2Br-Z)及Boc Gly PAM。三氟乙酸(TFA)、二异丙基乙胺(DIEA)、溶于DMF中的0.5M羟基苯并三唑(HOBt)及溶于二氯甲烷中的0.5M二环己基碳亚胺(DCC)是从PE-AppliedBiosystems(Foster City，CA)购得的。二甲基甲酰胺(DMF-Burdickand Jackson)和二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)购自Mays ChemicalCo.(Indianapolis，IN)。
标准双偶合是利用对称的酸酐或HOBt酯来进行的，这两种试剂都是利用DCC来制得的。第二组双偶合(没有进行TFA去保护)是利用Trp31、Thr13和Thr11进行的。在合成完成时，去除N-末端Boc基团，利用溶于DMF中的20％哌啶处理肽基树脂以对Trp侧链进行去甲酰基。利用DCM洗涤后，将树脂转移到TEFLON反应容器中并真空干燥。
对含有Met的类似物来讲，需要利用TFA/10％二甲亚砜(DMS)/2％浓缩盐酸来进行树脂上还原。将反应容器附于HF(氢氟酸)仪器(Perninsula Laboratories)上进行切割。加入1ml m-甲酚/g树脂并将10ml HF(购自AGA，Indianapolis，IN)冷凝到预冷过的容器中。甲硫氨酸存在时要添加1ml DMS/g树脂。冰浴中搅拌反应1小时并真空去除HF。残余物悬浮于乙醚中，对固体物进行过滤，并用乙醚冲洗。将肽提取到乙酸水溶液中，将其进行冷冻干燥或者直接移入反相色谱柱中。
利用缓冲液A(0.1％三氟乙酸水溶液，B：0.1％TFA乙腈溶液)，在2.2×25cm VYDAC C18柱上进行纯化。在280nm(4.0)下利用UV进行检测，用20-90％的B缓冲液在HPLC(Waters)上进行120分钟的梯度洗脱，流速10ml/min，并收集1min的级分。将适当的级分合并、冰冻并冻干。利用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI质谱对干燥产品进行分析。
实施例2-利用固相F-Moc化学制备本发明中的GLP-1化合物
在9 6孔反应板中的每个孔内加入约114mg(50mmol)FMOC Gly WANG树脂(购自NovaBiochem，LaJolla，CA)，并利用Advanced ChemTech396肽合成仪进行双偶合。具有C-末端酰胺的类似物是利用75mg(50μm)Rink Avmide AM树脂(NovaBiochem，LaJolla，CA)进行制备的。
以下FMOC氨基酸购自Advanced ChemTech(Louisville，KY)、NovaBiochem(LaJolla，CA)和Midwest Biotech(Fishers，IN)：Arg-2，2，4，6，7-五甲基二羟基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、Asn-三苯甲基(Trt)、Asp-β-叔丁酯(tBu)、Glu-δ-叔丁酯(tBu)、Gln-三苯甲基(Trt)、His-三苯甲基(Trt)、Lys-叔丁氧羰基(Boc)、Ser-叔丁酯(OtBu)、Thr-叔丁酯(OtBu)、Trp-叔丁氧羰基(Boc)、Tyr-叔丁酯(OtBu)。
溶剂二甲基甲酰胺(DMF-Burdick and Jackson)、N-甲基吡咯烷酮(NMP-Burdick and Jackson)、二氯甲烷(DCM-Mallinkrodt)购自Mays Chemical Co.(Indianapolis，IN)。
羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二异丙基乙胺(DIEA)及哌啶(Pip)购自Aldrich Chemical Co(Milwaukee，WI)。
将所有氨基酸溶解在0.45M HOBt的NMP溶液中，利用20％Pip/DMF进行20分钟去保护反应，然后进行50分钟DIC/HOBt活化的偶合反应。在去保护和偶合后，利用DMF洗涤每个树脂。最后一个偶合和去保护反应后，利用DCM洗涤肽基树脂并在反应板中进行真空干燥。
在适当集中反应/切割板之后，将2ml K试剂添加到每个孔中，切割反应混合2小时[K试剂＝0.75gm苯酚、0.5ml苯硫基甲烷、0.25ml乙硫醇、0.5ml水/10ml三氟乙酸(TFA)，所有这些试剂都购自AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI]。将TFA滤液添加到40ml乙醚中，将沉淀物在2000rpm下离心2分钟。轻轻倒出上清液，片状沉淀物重新悬浮在40ml乙醚中，重新离心，重新倾倒上清液，在氮气中干燥，然后进行真空干燥。
将每种产物0.3-0.6mg溶于1ml 0.1％TFA/乙腈(CAN)溶液中，取20ul进行HPLC分析[0.46×15cm METASIL AQ C18柱，流速1ml/min，45℃，214nm(0.2)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％CAN。梯度＝50％B-90％B，洗脱时间30分钟]。
利用缓冲液A(0.1％三氟乙酸水溶液，B：0.1％TFA乙腈溶液)，在2.2×25cm VYDAC C18柱上进行纯化。在280nm(4.0)下利用UV进行检测，用20-90％的B缓冲液在HPLC(Waters)进行120分钟的梯度洗脱，流速10ml/min，并收集1min的级分。将适当的级分合并、冰冻并冻干。利用HPLC(0.46×15cm METASIL AQ C18)和MALDI质谱对干燥后的产品进行分析。
实施例3-GLP聚集检测
对本发明中的GLP肽在溶液中聚集的可能性进行分析。一般情况下，在升高的温度下，在适当的缓冲液中，对肽溶液进行搅拌，同时记录其在350nm的浊度作为时间的函数。测量开始聚集的时间来对给定的GLP-1分子在这些特殊强调的条件下的聚集进行定量。
程序：
首先在碱性条件下(pH10.5)将GLP-1化合物溶解30分钟，这样就可将已经聚集的物质也溶解掉。然后将溶液pH调节到7.4并过滤。具体地，将4mg冷冻干燥的GLP-1化合物溶解在3ml 10mM磷酸盐/10ml柠檬酸盐中。将pH调节为10.0-10.5，并维持30分钟。利用盐酸将此溶液pH调节到7.4并利用适当的过滤器，如Millex GV注射滤器(Millipore Corporation，Bedford，MA)进行过滤。然后将此溶液在10mM柠檬酸盐、10mM磷酸盐、150mMNaCl中，稀释为含有0.3mg/ml蛋白的最终样品，并调节为pH7.4-7.5。在37℃的石英杯中孵育此样品。利用AVIV 14DS UV-VIS型分光光度计(Lakewood，NJ)，在350nm下每隔5分钟测定溶液的浊度。在测定前30秒和测定中要利用购自Starna Cells，Inc.(Atascadero，CA)的磁力搅拌棒对溶液进行搅拌。在35)nm处的OD值增加说明有GLP-肽聚集。按照Drake的方法(Arvinte T，Cudd A，and Drake AF.(1993)J.Bio.Chem.268，6415-6422)。开始聚集的时间大约在生长前和生长相的曲线交叉点上。
在实验间要用苛性肥皂溶液(如Contrad-70)清洗石英杯。
表1中的实验结果报告了本发明中的多个GLP-1化合物聚集所需的时间，这些时间是以小时为单位给出的。我们可以看出，相对于以前领域中已知的GLP-1化合物，本发明中的化合物表现出延长的聚集时间。
实施例4-利用本发明中的GLP-1化合物进行的GLP-1受体活化作用
本发明中的GLP-1化合物活化GLP-1受体的能力是利用体内检测，如在Gelfand等的EP619,322和美国专利No.5,120,712中分别描述的方法进行测定。这些参考文献的全部内容在此引用作为参考。相对于GLP-1(7-37)OH的活性，这些化合物的活性在表1中有报告。从这些结果中可以看出，本发明中的GLP-1化合物的活性通常与GLP-1(7-37)OH的活性相同或比GLP-1(7-37)OH的活性高。
                                      表1
                                    以小时表示的     GLP-1受体
GLP-1化合物                          聚集时间        活化
GLP-1(7-37)OH                         1                1.0
Val8-GLP-1(7-37)OH                   0.9±0.2         0.47
                                      (n＝6)
Gly8-His11-GLP-1(7-37)OH            9*              0.282
Val8-Ala11-GLP-1(7-37)OH            10               0.021
Val8-Lys11-GLP-1(7-37)OH            13               0.001
Val8-Tyr12-GLP-1(7-37)OH            6                0.81
Val8-Glu16-GLP-1(7-37)OH            12               0.047
Val8-Ala16-GLP-1(7-37)OH            16               0.112
Val8-Tyr16-GLP-1(7-37)OH            5                1.175
Val8-Lys20-GLP-1(7-37)OH            5                0.33
Gln22-GLP-1(7-37)OH                  7                0.42
Val8-Ala22-GLP-1(7-37)OH            19               0.56
Val8-Ser22-GLP-1(7-37)OH            22               0.50
Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH            ＞90             0.40
Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH            72          1.29
Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH            100，54     0.58
Val8-Pro22-GLP-1(7-37)OH            ＞75        0.01
Val8-His22-GLP-1(7-37)OH            ＞75        0.14
Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2          24         0.53
Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2          ＞65       1.0
Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH            19         1.07
Val8-G1u23-GLP-1(7-36)OH            65         0.28
Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH            ＞45       0.18
Val8-His24-GLP-1(7-37)OH            3          0.007
Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH            22         0.02
Ala8-His26-GLP-1(7-37)OH            ＞24       0.8
Ala8-Glu26-GLP-1(7-37)OH            ＞24       0.7
Val8-His27-GLP-1(7-37)OH            10         0.37
Val8-A1a27-GLP-1(7-37)OH            2          0.47
Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH            ＞40       0.29
Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH            30         0.29
Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH           ＞45         0.15
Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH           8            0.19
Val8-His30-GLP-1(7-37)OH           13           0.19
Val8-Glu33-GLP-1(7-37)OH           ＞70         0.039
Val8-Ala33-GLP-1(7-37)OH           20           0.1
Val8-Gly33-GLP-1(7-37)OH           9            0.01
Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH           ＞40*       0.17
Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH           14           0.094
Val8-His35-GLP-1(7-37)OH           ＞45，30     0.41
Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH           63           0.15
Val8-Glu36-GLP-1(7-37)OH           ＞45         0.11
Val8-His36-GLP-1(7-37)OH           8            0.22
Val8-His37-GLP-1(7-37)OH           ＞40         0.33
Val8-Leu16-Glu26-GLP-1(7-37)OH    ＞20         0.23
Val8-Lys22-Glu30-GLP-1(7-37)OH    4            0.37
Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH    ＞30         0.35
Val8-Glu22-Gln23-GLP-1(7-37)OH    ＞20         0.47
Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH     ＞45         1.02
Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH     ＞65         1.43
Val8-Lys33-Val34-GLP-1(7-37)OH      22          0.08
Val8-Lys33-Asn34-GLP-1(7-37)OH     ＞48         0.09
Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH     27           0.34
Val8-Gly36-Pro37-GLP-1(7-37)NH2   2            0.53
*聚集时间是在30℃下测定的。
实施例5-GLP-1化合物的锌沉淀
如实施例1或2中所述制备各个GLP-1化合物。在pH10.5下，将3mg冷冻干燥过的各个GLP分子溶解在3ml 0.1M HEPES缓冲液中。随后利用0.2N NaOH将此溶液的pH值调节为10.0和10.5。在环境温度下，搅拌此溶液30分钟，随后用0.2N HCl调节其pH为7.4。利用适当的注射滤器，如Millex GV注射滤器(Millipore Corporation，Bedford，MA)对此溶液进行过滤，利用分光光度计，如Beckman DU640在280nm下测定其吸光度，以此估计GLP-1化合物的浓度。随后，将溶解在pH7.4的HEPES缓冲液中的蛋白的浓度调节为200uM。
在ELISA平板(如Falcom MicrotestTM96)中，将过滤后的GLP-1溶液(100μl)利用100μl含有多种氯化锌水平的、pH7.4的0.1M HEPES缓冲液稀释，这样就得到了200μl含有多种氯化锌水平和100μM GLP-1化合物的溶液。将这些溶液在环境温度(22℃)下孵育18小时，随后进行离心，例如利用具有微量反应板适配器的Jouan CR412离心机进行离心。随后将离心后的150ul上清液转移到UV可读的ELISA微量滴定板(如Costar UV滴定板)中，并在微量滴定板阅读器(如MolecularDevices SPECTRAmax PLUS，SOFTmax PRO)上测定OD280。实验结果如表2所示。A280值是从两次独立实验得到的。
表2
 Zn/GLP-1摩尔比  GLP-1(7-37)OHA280  Gly8GLP-1(7-37)OHA280  Val8GLP-1(7-37)OHA280  Gln22-GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Glu22GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Ala22GLP-1(7-37)OHA280
 0  0.337  0.32  0.3  0.290  0.295  0.289
 0.3  0.318  0.166  0.27  0.390  0.291  0.202
 0.5  0.329  0.151  0.26  0.123  0.292  0.107
 0.7  0.253  0.156  0.124  0.076  0.293  0.104
 1  0.148  0.119  0.06  0.074  0.26  0.110
 2  0.092  0.089  0.025  0.095  0.078  0.110
 3  0.081  0.085  0.021  0.095  0.052  0.104
 5  0.074  0.078  0.019  0.097  0.035  0.119
表2(续)
 Zn/GLP-1摩尔比  Val8-Ser22-GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Phe22-GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Pro22-GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OHA280  Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OHA280
 0  0.2855  0.31  0.2595  0.299  0.288
 0.3  0.2805  0.1485  0.2455  0.0825  0.2785
 0.5  0.2665  0.1165  0.2325  0.0905  0.2845
 0.7  0.1825  0.1015  0.219  0.1195  0.287
 1  0.149  0.1265  0.1905  0.1225  0.291
 2  0.0935  0.092  0.1695  0.1675  0.184
 3  0.101  0.061  0.1615  0.1475  0.1485
 5  0.0615  0.00795  0.171  0.142  0.1675
这些结果表明，仅仅需要很少量的锌就可与这些稀释液中的GLP-1化合物的很大部分进行复合并使这些化合物沉淀下来。
等同方案
虽然本发明是参考其优选的实施方案的来特别展示和描述，但本领域中的熟练技术人员应该明白，在不偏离所附权利要求所规定的精神和范围基础上，在形式和细节上可对其进行多种变化。本领域中的熟练技术人员仅利用常规实验就可识别和确定此处特别描述的、本发明的特定实施方案的多种等同方案。这样的等同方案也包括在权利要求的范围之内。
序列表<110>伊莱利利公司<120>胰高血糖素样肽-1类似物<130>X-13989<160>53<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>变体<222>(5)..(5)<223>第5位的Xaa是Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；<220><221>变体<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>变体<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，或Ala；<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>变体<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>变体<222>(18)..(18)<223>第18位的Xaa是Glu，His，Ala，或Lys；<220><221>变体<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>变体<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>变体<222>(25)..(25)<223>第25位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>变体<223>第27位的Xaa是Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；<220><221>变体<222>(28)..(28)<223>第28位的Xaa是Glu，Lys，或Asp；<220><221>变体<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，
 Gly，Pro，His，或Glu；<220><221>变体<222>(30)..(30)<223>第30位的Xaa是Arg，Glu，或His；<220><221>变体<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除<400>1His Xaa Glu Gly Xaa Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Phe Ile Ala Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        20                  25                  30<210>2<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>变体<222>(6)..(6)<223>第6位的Xaa是His，Trp，Phe，或Tyr；<220><221>变体<222>(10)..(10)<223>第10位的Xaa是Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，
 Glu，或Ala；<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>变体<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>变体<222>(20)..(20)<223>第20位的Xaa是Asp，Lys，Glu，或His；<220><221>变体<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<220><221>变体<222>(29)..(29)<223>第29位的Xaa是Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，
  Gly，Pro，His，or Glu；<220><221>变体<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除<400>2His Xaa Glu Gly Thr Xaa Thr Ser Asp Xaa Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Xaa Arg Xaa
        20                  25                  30<210>3<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>变体<223>第16位的Xaa是Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，或Cys；<220><221>变体<222>(17)..(17)<223>第17位的Xaa是  His，Asp，Lys，Glu，或Gln；<220><221>变体<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；<220><221>变体<222>(24)..(24)<223>第24位的Xaa是Ala，Glu，Asp，Ser，或His；<221>变体<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，
 Phe，His，-NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或is deleted.<400>3His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Xaa Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
        20                  25                  30<210>4<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是L-组氨酸，D-组氨酸，脱氨基-组氨酸，2氨基-组氨酸
 β-羟基-组氨酸，高组氨酸，α-氟甲基-组氨酸或α-甲基-组氨酸；<220><221>变体<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是Asp，Glu，Gln，Asp，Lys，Arg，或Cys；<220><221>变体<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是-NH2或Gly.<400>4Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
        20                  25                  30<210>5<211>31<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>5His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>6<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>6His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>7His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>8<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>8His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                   25                   30<210>9<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>9His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>10His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>11<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>11His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>12<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>12His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>13<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>13His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>14<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>14His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>15<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>15His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>16<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>16His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>17<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>17His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>18<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>18His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>19<211>31<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>20<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>20His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>21<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>21His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>22<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>22His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>23<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>23His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>24<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>24His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>25<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>25His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Len Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>26<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>26His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>27<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>27His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>28<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>28His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>29<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>29His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>30<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>30His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>31<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>31His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>32<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>32His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>33<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>33His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>34<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>34His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>35<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>35His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>36<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>36His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>37<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>37His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>38<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>38His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asp1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>39<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>39His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Arg1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>40<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>40His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>41<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<220><221>变体<222>(16)..(16)<223>第16位的Xaa是半胱磺酸<400>41His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
        20                  25                  30<210>42<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>42His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>43<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>43His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>44<211>31<212>PRT<213>人工序列<223>合成构建体<400>44His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>45<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>45His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>46<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>46His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys His Arg Gly
        20                  25                  30<210>47<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>47His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>48<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>48His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Lys Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>49<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>49His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>50<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>50His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Ala Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>51<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>51His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser SerTyr Leu Glu Gly1               5                   10                 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Gly Lys Arg Gly
        20                  25                  30<210>52<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>52His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30<210>53<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成构建体<400>53His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                   10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His
        20                  25                  30

Claims (45)

1.一种含有式I(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的GLP-1化合物：
His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa26-Xaa27-Phe-
Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-R
            式I(SEQ ID NO：1)
其中：
Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；
Xaa11是：Asp，Glu，Arg，Thr，Ala，Lys，或His；
Xaa12是：His，Trp，Phe，或Tyr；
Xaa16是：Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，
      或Ala；
Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；
Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；
Xaa24是：Glu，His，Ala，或Lys；
Xaa26是：Asp，Lys，Glu，或His；
Xaa27是：Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或Lys；
Xaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；
Xaa33是：Asp，Arg，Val，Lys，Ala，Gly，或Glu；
Xaa34是：Glu，Lys，或Asp；
Xaa35是：Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，
      His，或Glu；
Xaa36是：Arg，Glu，或His；
R是：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
     -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除，前提是该GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是该GLP-1化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，或Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala11-Glp-1(7-37)OH，Ala11-Glp-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Ala27-Glp-1(7-37)OH，Ala27-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，Glu27-Glp-1(7-36)NH2，Ala33-Glp-1(7-37)OH，或Ala33-Glp-1(7-36)NH2。
2.一种含有式II(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的GLP-1化合物：His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa35-Arg-R式II(SEQ ID NO：2)
其中：
Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；
Xaa12是：His，Trp，Phe，或Tyr；
Xaa16是：Leu，Ser，Thr，Trp，His，Phe，Asp，Val，Glu，
      或Ala；
Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Ash，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；
Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；
Xaa26是：Asp，Lys，Glu，或His；
Xaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；
Xaa35是：Thr，Ser，Lys，Arg，Trp，Tyr，Phe，Asp，Gly，Pro，
      His，或Glu；
R是：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
     -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除，前提是该GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是该GLP-1化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-3 6)NH2，Ala16-GLP(7-37)OH，或Ala16-Glp-1(7-36)NH2。
3.一种含有式III(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列的GLP-1化合物：His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
        式III(SEQ ID NO：3)其中：Xaa8是：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，或Thr；Xaa22是：Gly，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Arg，Cys，或半胱磺酸；Xaa23是：His，Asp，Lys，Glu，或Gln；Xaa27是：Ala，Glu，His，Phe，Tyr，Trp，Arg，或LysXaa30是：Ala，Glu，Asp，Ser，或His；Ris：Lys，Arg，Thr，Ser，Glu，Asp，Trp，Tyr，Phe，His，
 -NH2，Gly，Gly-Pro，或Gly-Pro-NH2，或被删除，
前提是该GLP-1化合物不含有GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)-NH2的序列，以及前提是该化合物不是Gly8-GLP-1(7-37)OH，Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，Val8-GLP-1(7-36)NH2，Leu8-GLP-1(7-37)OH，Leu8-GLP-1(7-36)NH2，Ile8-GLP-1(7-37)OH，Ile8-GLP-1(7-36)NH2，Ser8-GLP-1(7-37)OH，Ser8-GLP-1(7-36)NH2，Thr8-GLP-1(7-37)OH，Thr8-GLP-1(7-36)NH2，Ala16-Glp-1(7-37)OH，Ala16-Glp-1(7-36)NH2，Glu27-Glp-1(7-37)OH，或Glu27-Glp-1(7-36)NH2。
4.权利要求1、2或3的任一项的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物中不超过6个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相应位置上的氨基酸不同。
5.权利要求4的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物中不超过5个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相应位置上的氨基酸不同。
6.权利要求5的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物中不超过4个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相应位置上的氨基酸不同。
7.权利要求6的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物中不超过3个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相应位置上的氨基酸不同。
8.权利要求7的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物中不超过2个氨基酸与GLP-1(7-37)OH或GLP-1(7-36)NH2中相应位置上的氨基酸不同。
9.权利要求1-8的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸。
10.权利要求4-8的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，并且Xaa30是丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或组氨酸。
11.权利要求10的GLP-1化合物，其中Xaa30是谷氨酸。
12.权利要求4-8的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，并且Xaa37是组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸或赖氨酸。
13.权利要求1 2的GLP-1化合物，其中Xaa37是组氨酸。
14.权利要求4-8的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，并且Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸。
15.权利要求14的GLP-1化合物，其中Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。
16.权利要求15的GLP-1化合物，其中Xaa22是谷氨酸。
17.权利要求4-7的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，Xaa22是谷氨酸或赖氨酸，并且Xaa23是谷氨酸或赖氨酸。
18.权利要求4-7的任一项的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，Xaa22是谷氨酸，并且Xaa27是丙氨酸。
19.一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)化合物，其氨基酸序列的第8位不是丙氨酸，第22位不是甘氨酸。
20.权利要求19的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，该GLP-1化合物含有不超过3个与GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相应位置上的氨基酸不同的氨基酸。
21.权利要求20的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，该GLP-1化合物含有不超过2个与GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相应位置上的氨基酸不同的氨基酸。
22.权利要求21的GLP-1化合物，其中除第8位和第22位氨基酸之外，该GLP-1化合物含有不超过1个与GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相应位置上的氨基酸不同的氨基酸。
23.权利要求20-22的任一项的GLP-1化合物，其中与GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相应位置上的氨基酸不同的氨基酸是对GLP-1(7-37)OH、GLP-1(7-36)NH2或其片段相应位置上的氨基酸的保守取代。
24.权利要求19-23的任一项的GLP-1化合物，其中第22位氨基酸的侧链含有至少两个碳原子和一个极性或带电官能团。
25.权利要求19-23的任一项的GLP-1化合物，其中：
a)第8位氨基酸是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸或色氨酸；及
b)第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或组氨酸。
26.权利要求19-23的任一项的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)化合物，其中第22位氨基酸具有直链或支链烷基侧链，该侧链含有2-6个碳原子并且被带电官能团取代。
27.权利要求26的GLP-1化合物，其中第22位氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。
28.权利要求19-23的任一项的GLP-1化合物，其中第8位氨基酸是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸。
29.权利要求28的GLP-1化合物，其中第8位氨基酸是甘氨酸或缬氨酸。
30.权利要求19-23的任一项的GLP-1化合物，该GLP-1化合物的第22位氨基酸具有含有磺酸基的侧链。
31.权利要求29的GLP-1化合物，其中具有侧链的氨基酸是半胱磺酸，并且其中第8位氨基酸不是丙氨酸。
32.含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的GLP-1化合物：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R(SEQ ID NO：4)
其中：
Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基组氨酸和α-甲基组氨酸；
Xaa8是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸；
Xaa22是天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或半胱磺酸；以及
R是NH2或Gly(OH)。
33.权利要求32的GLP-1化合物，其中Xaa8是甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
34.权利要求33的GLP-1化合物，其中Xaa22是赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸。
35.权利要求34的GLP-1化合物，其中Xaa7是L-组氨酸，Xaa8是甘氨酸或缬氨酸，并且R是Gly(OH)。
36.权利要求34的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物选自a)Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：5)；b)Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：6)；c)Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：7)；和d)Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：8)。
37.权利要求34的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物选自a)Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：9)；b)Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：10)；c)Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：11)；和d)Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(SEQ ID NO：12)。
38.权利要求1-37的任一项的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物与二价金属阳离子复合。
39.权利要求38的GLP-1化合物，其中该GLP-1化合物与二价锌阳离子复合。
40.一种对有需要的受试者进行GLP-1受体刺激的方法，该方法包括给予受试者有效量的权利要求1-39中任一项的GLP-1化合物的步骤。
41.权利要求40的方法，其中受试者正在接受对胰岛素非依赖型糖尿病的治疗。
42.权利要求41的方法，其中受试者正在接受对胰岛素非依赖型糖尿病的预防性处理。
43.权利要求40的方法，其中受试者正在接受对肥胖症、卒中、心肌梗塞、手术后分解代谢改变或肠激惹综合征的治疗。
44.权利要求1-39的任一项所要求保扩的GLP-1化合物在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病的药物中的用途。
45.权利要求1-39的任一项所要求保护的GLP-1化合物在制备用于治疗肥胖症、卒中、心肌梗塞、手术后分解代谢改变或肠激惹综合征的药物中的用途。
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