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CN1317296C - 抗hiv融合肽及其制备方法 - Google Patents

抗hiv融合肽及其制备方法 Download PDF

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CN1317296C
CN1317296C CNB2005100341365A CN200510034136A CN1317296C CN 1317296 C CN1317296 C CN 1317296C CN B2005100341365 A CNB2005100341365 A CN B2005100341365A CN 200510034136 A CN200510034136 A CN 200510034136A CN 1317296 C CN1317296 C CN 1317296C
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Abstract

本发明公布了抗HIV融合肽及其制备方法，涉及肽及其制备方法领域。本发明抗HIV融合肽用下通式(I)表示，其中a是乙酰基、9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)其中一种；b为酰氨基或羧基。本发明制备方法为多肽液相合成方法，首先将中间肽在活化试剂作用下偶联，然后脱去保护基团。本发明涉及的抗HIV融合肽副作用小，活性高，合成、纯化简单方便，生产成本低。a-WX1EWDX2X3IX4X5YTSX6IX7X8LIX9X10SX11X12QQX13KNEX14ELX15X16-b (I)。

Description

抗HIV融合肽及其制备方法
发明领域
本发明涉及肽及其制备方法领域，尤其涉及抗HIV肽及其制备方法领域。
背景技术
艾滋病已成为威胁人类健康的主要疾病。目前艾滋病患者主要依靠药物来延长生命。世界上已批准使用的艾滋病药物主要为两大类：HIV逆转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。这两类药物都作用在HIV感染宿主细胞的后期——转录及组合新病毒的过程。由于HIV的高突变率，上述两种抑制剂均出现了耐药性。逆转录酶抑制剂存在与剂量相关的特异性毒性，包括骨髓抑制、呕吐、肝功能异常、外周神经疾病、肌无力及胰腺炎等。蛋白酶抑制剂的毒副作用包括肝功能异常、胃肠不适、肾结石、口周围麻木、脂类异常及意识混乱等。
抑制病毒胞膜与宿主靶细胞膜的融合过程已成为抗HIV感染重要靶点。抑制病毒与靶细胞膜的融合可抑制HIV的感染。HIV与靶细胞融合的过程如下：HIV包被糖蛋白表面gp120亚基与靶细胞上的CD4和辅助受体分子(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)先后发生结合，导致跨膜亚基gp-41的构象发生改变，其N端的融合肽插入到宿主细胞膜内，启动病毒包膜与靶细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程。晶体衍射分析已经证实：HIV病毒与细胞发生融合时，gp-41的核心由6股螺旋束组成，其中N-端和C-端的螺旋排列成3个“发卡结构”，将HIV包膜与细胞膜别在一起。gp-41三聚体可能形成融合孔，使病毒侵入宿主细胞。因此，抑制gp-41的螺旋结构形成就可抑制HIV病毒侵入宿主细胞。
目前，作用于gp-41亚基的多肽类抗HIV病毒融合抑制剂多衍生于gp-41亚基C末端的肽段，由于其结构与HIV病毒gp-41亚基C末端的相似性使其能够与gp-41的C-端肽链竞争性地与N-端融合域的结合，使病毒gp-41的螺旋束不能产生。这样HIV病毒包膜与细胞膜之间的“发卡结构”无法形成，从而使病毒无法侵入。由于融合抑制剂的作用部位在细胞膜，所以不必被释放到细胞内就能发挥作用。而且，疏水性gp-41核心部位氨基酸序列的高度守恒性提示：病毒将不大可能对融合抑制剂产生耐药性。目前常用的作用于gp-41亚基的多肽类抗HIV病毒融合抑制剂T-20由36个氨基酸残基组成，包含疏水性氨基酸的比例较高，溶解性差，在制备过程中存在多肽链的偶联效率低和多肽的纯化率低的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗HIV融合肽。
本发明的另一目的是提供一种抗HIV融合肽制备方法。
本发明抗HIV融合肽用下氨基酸序列式(I)表示：
a-WX1EWDX2X3IX4X5YTSX6X7X8LIX9X10SX11X12QQX13KNEX14ELX15X16-b   (I)
其中a是乙酰基、9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)其中一种，
b为酰氨基或羧基。
上述式(I)中其它字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：S为丝氨酸、W为色氨酸、M为蛋氨酸、E为谷氨酸、T为苏氨酸、R为精氨酸、I为异亮氨酸、N为天门冬酸胺、Y为酪氨酸、K为赖氨酸、Q为谷氨酸胺、L为亮氨酸、D为天门冬氨酸、Nle为正亮氨酸。
X1-16代表天然氨基酸或非天然氨基酸或氨基酸类似物或空缺。
a优选乙酰基；b优选酰胺基。
抗HIV融合肽优选为：
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2(SEQ ID NO.1)，
Ac-WMEWDRKINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.2)，
Ac-W-Nle-EWDRKINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.3)，
Ac-WMEWDRKIENYTKLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.4)，
Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.5)，
Ac-W-Nle-EWDRKIENYTKLIKSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.6)，
Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQEQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.7)，
Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.8)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.9)，
Ac-W-Nle-EWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.10)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKSLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.11)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.12)，
Ac-W-Nle-EWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.13)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEKLIKESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.14)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKELIEKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.15)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.16)，
Ac-W-Nle-EWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.17)，
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-NH2(SEQ ID NO.18)，
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH2SEQ ID NO.19)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.20)，
Ac-W-Nle-EWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.21)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.22)，
Ac-W-Nle-EWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.23)，
Ac-WEEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.24)，
Ac-W-Nle-EWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2(SEQ ID NO.25)，
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2(SEQ ID NO.26)，
Ac-W-Nle-EWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2(SEQ ID NO.27)其中一种。
抗HIV融合肽最好为：
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.16)，
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-NH2(SEQ ID NO.18)，
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2(SEQ ID NO.1)，
Ac-WMEWDRKINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.2)，
Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQEQQEKNEQELK-NH2(SEQIDNO.7)，
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.12)，
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH2(SEQ ID NO.19)，
Ac-WEEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.24)，
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2(SEQ ID NO.26)其中一种。
本发明抗HIV融合肽的制备方法为：将下列中间肽利用液相合成技术，完成全长抗HIV融合肽的合成。其中液相合成技术是肽化学中常用的液相合成技术，可以根据本领域技术人员已知的方法得到液相合成优选的条件。
本发明所述的中间肽为，
中间肽1：Ac-WX1EWDX2X3IX4X5-OH
中间肽2：Fmoc-YTSX6IX7X8LIX9X10S-OH
中间肽3：H-X11X12QQX13KNEX14ELX15X16-NH2
中间肽4：Ac-WX1EWDX2X3IX4X5YTS-OH
中间肽5：H-X6IX9X10SX11X12QQX13K-NH2
中间肽6：Ac-WX1EWDX2X3IX4X5YTSX6IX7X8LI-OH
中间肽7：H-X9X10SX11X12QQX13KNEX14ELX15X16-NH2
其中X1-16代表天然氨基酸或非天然氨基酸或氨基酸类似物或空缺，特别如抗HIV融合肽优选序列。
本发明所述的中间肽可以是N端和侧链保护的多肽片段。氨基用Fomc基团保护，氨基酸残基侧链用标准保护基团如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(Trt)和叔丁氧基羰基(Boc)保护。t-Bu基团是氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的优选侧链保护基团；Trt基团是氨基酸残基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的优选侧链保护基团；Boc基团是氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选侧链保护基团；Pmc是Arg(R)的优选侧链保护基团。
本发明所述的中间肽1最好是：
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH(SEQ IDNO.28)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH(SEQ IDNO.29)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH(SEQ IDNO.30)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(SEQID NO.31)，
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(SEQ ID NO.32)其中一种。
本发明所述的中间肽2最好是：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQID NO.33)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQID NO.34)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.35)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.36)其中一种。
本发明所述的中间肽3最好是：
H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2(SEQ ID NO.37)，
H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.38)，
H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.39)，
H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.40)，
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.41)其中一种。
本发明所述的中间肽4最好是：
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.42)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OH(SEQ ID NO.43)，
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OH(SEQ ID NO.44)其中一种。
本发明所述的中间肽5最好是：
H-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.45)，
H-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.46)，
H-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.47)其中一种。
本发明所述的中间肽6最好是：
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.48)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.49)，
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.50)其中一种。
本发明所述的中间肽7最好是：
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2(SEQ ID NO.51)，
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.52)，
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.53)其中一种。
本发明抗HIV融合肽的常用制备方法为：第一步活化偶联，将中间肽在有机溶剂中溶解后加入活化试剂进行偶联，偶联产物加入甲醇/水溶液搅拌析出后过滤。第二步脱去保护基团，将上述产物加入包含离子捕获剂的TFA溶液，脱去保护基团后于醚中沉淀，过滤后真空干燥。
本发明本发明抗HIV融合肽的制备方法可以首先中间肽1和中间肽2偶合，然后与中间肽3进行液相偶合，或者首先将中间肽2和中间肽3偶合，然后和中间肽1偶合，完成抗HIV融合肽的全长合成。
本发明抗HIV融合肽制备方法可以将中间肽4和中间肽5偶合。
本发明抗HIV融合肽制备方法可以将中间肽6和中间肽7偶合。
上述抗HIV融合肽制备方法中使用的有机溶剂是多肽液相合成领域中常用的溶剂。最好是NMP、DMF或者其混合物。
上述抗HIV融合肽制备方法第一步中，中间体和活化试剂可选用苯并三唑四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和二异丙基乙胺(DIEA)的混合物或2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、HOBt和DIEA的混合物或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、HOBt和DIEA的混合物，最好选用HBTU、HOBt和DIEA的混合物。用量比为1∶1～1∶1.5，较好是1∶1～1∶1.3，最好是1；1～1∶1.2。上述抗HIV融合肽制备方法第一步中，偶联反应时间为3～8小时，较好是3～6小时，最好是3～4小时。
上述抗HIV融合肽制备方法第二步中，离子捕获剂多肽液相合成领域中常用的离子捕获剂。最好使用重蒸苯酚、二巯基乙烷、茴香硫醚、双蒸水其中一种或两种以上混合物。
上述抗HIV融合肽制备方法第二步中，脱去保护基团反应时间为4～10小时，较好是4～8小时，最好是5～7小时。
上述抗HIV融合肽制备方法第二步中，沉淀时使用的醚是异丙醚、乙醚、甲基丁醚其中一种或两种以上混合物。
上述抗HIV融合肽制备方法在室温下进行。
中间肽的合成采用固相合成方法。常用的合成方法如下：a将已经保护的氨基酸负载在树脂上，作为起始物质；b脱去负载树脂上的氨基酸保护基团；c对偶合氨基酸进行活化；d将活化的氨基酸与树脂上脱去保护基团的氨基酸(或者肽链)进行偶联；e用茚三酮法检测氨基酸的偶联效率，如果呈阳性结果，则重复活化氨基酸和偶联过程，如果呈阴性反应，则进行下一步反应；f重复活化、偶合过程直至完成最后一个氨基酸的偶联反应；g将合成的中间肽从树脂上切落。
本发明所述的中间肽合成方法步骤a中使用的树脂为对酸极敏感的树脂，常用有2-氯代三苯甲基氯树脂、Sieber酰胺树脂或者两种混合使用。也可以向专业的多肽合成公司购买已经负载氨基酸的商品树脂。
本发明所述的中间肽合成方法步骤c中使用的活化试剂选用HBTU、HOBT以及DIEA。
本发明所述的中间肽合成方法步骤c中，树脂∶氨基酸(当量比)为1∶2～10，最好是1∶3。氨基酸∶活化试剂(当量比)为1∶1.5，较好是1∶1.3，最好是1∶1.1。
本发明所述的中间肽合成方法步骤c中，偶联反应在常温下进行，反应时间为30分钟至3小时，较好是30分钟小时至2小时，最好是1小时至1.5小时。
本发明所述的中间肽合成方法步骤b中，氨基保护基团Fomc的脱去，在20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液进行。
本发明所述的中间肽合成方法步骤g中，选用1％～2％三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液进行多肽切落。
本发明所述的中间肽合成方法中，氨基保护基团为Ac时，在最后一个氨基酸的偶联反应完成后，除去Fmoc保护基团，于乙酸酐和NMP/DCM(3∶1体积比)的混合溶液进行偶合，然后再将多肽从树脂上切落。
本发明涉及的抗HIV融合肽只作用于gp-41亚基，相对于已经上市的HIV融合抑制剂T-20，其副作用更小，活性更高。抗HIV融合肽疏水性的氨基酸比例的增加，使得其形成的α螺旋结构更为稳定，耐蛋白酶水解的能力及活性增强，溶解性增大，合成、纯化更简单方便，生产成本更低，具有更强的市场竞争能力。
为了更好的理解本发明，下面用本发明抗HIV融合肽药理试验及结果来说明其在制备治疗HIV药物领域中的用途。
抗HIV融合肽采用HIV感染的MT4为活性筛选模型，以HIV-1病毒诱导细胞合胞体的产生作为评价药效的指标。由于MT4细胞表面的CD4受体能够与HIV特异性的结合，因此体外筛选在MT4细胞上进行具有代表性。
采用的活性筛选模型为HIV感染的MT4，以HIV-1病毒诱导细胞合胞体的产生为评价药效的指标。由于MT4细胞表面的CD4受体能够与HIV特异性的结合，因此体外筛选在MT4细胞上进行具有代表性。具体方法如下所述，具体结果见表1。
1.抗HIV融合肽对病毒毒力测定：用10倍稀释8个浓度HIV，在培养液RPMI-1640中观察细胞病变，计算TCID50为10-6。
2.抗HIV融合肽对细胞的毒性测定：将MT4细胞2×105个/mL接种于96孔板中，每孔为0.1mL，分别加入1000×TCID50的HIV病毒100μL，同时设正常细胞对照和病毒对照，然后分别加入2倍稀释5个浓度的样品及AZT 100μL，每个样品浓度均设3个平行孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，72h后在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)。
CPE判定标准：无合胞体形成“-”，无合胞体形成但细胞不规则“±”，有无合胞体形成“+”。
                           表1抗HIV融合肽的抗HIV活性
  顺序   氨基酸序列   分子量   IC50
  123456789   Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2Ac-WMEWDRKINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQEQQEKNEQELK-NH2Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEKNEKELK-NH2Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-NH2Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH2Ac-WEEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2   4289.704303.774365.924437.094437.094536.163562.913637.053665.19   1.21±0.18nm1.15±0.21nm1.02±0.20nm0.85±0.15nm0.45±0.11nm0.75±0.15nm9.89±0.24nm2.50±0.18nm1.91±0.19nm
IC50的判定：(1)只1孔为“+”，另两孔为“-”或“-”与“±”，此药物浓度可视为EC50。(2)3孔分别为“+”、“-”与“±”，此药物浓度可视为EC50。(3)3孔均为“±”，此药物浓度可视为EC50。(4)3孔均为“+”，下一个浓度作用下的3孔均为“-”，两个浓度的中间值可视为IC50。
具体实施方式
以下是本发明的实施例、参考实施例可更详细地说明本发明，但不以融合形式限制本发明。
参考实施例1
制备中间肽1
                                     表2中间肽1片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  12345   Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OHAc-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OHAc-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OHAc-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OHAc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH   2553.072596.142424.932253.732113.50   93％92％95％96％95％   83％85％88％87％90％
1.将Fmoc-Asn(trt)-OH负载于2-氯代三苯甲基氯树脂
将2-氯三苯甲基氯树脂(5g，1.0mmol/g)装入100毫升肽合成容器，用50毫升DCM洗涤后排干二氯甲烷(DCM)。将Fmoc-Asn(trt)-OH 4.48克(7.5mmol，1.5当量)和DIEA1.5ml(8.5mmol，1.7当量)溶于50ml的DCM后加入树脂中。氮气保护下搅动混合物2小时。排干溶剂并用DCM 50ml洗涤。用40毫升MeOH∶DIEA(9∶1体积比)溶液封闭树脂上末端的活性部位，时间为20分钟。排干溶剂，用50ml DCM洗涤3次，用MeOH 50ml洗涤2次，最后用氮气吹干树脂，得到7.1克负载的树脂。将树脂上的Fmoc-氨基酸切落后进行树脂负载定量分析。方法为HPLC外标定量分析法，分析结果显示树脂负载量为0.73mmol/克。
柱：Zabarx C18 4.6×250mm 100A  5μ
流速：1ml/min
检测波长：260nm
流动相：A：0.1％TFA水溶液/乙腈(30/70)
2.合成侧链保护的多肽片段
(1)称取上述方法制备的负载Fmoc-AA-OH的2-氯代三苯甲基氯树脂1.0mmol置于55ml的反应管中(如上述负载量为0.73mmol/克的树脂，应该称取1.37克)。
(2)在多肽合成仪上选择FastMoc 1.0mmol的程序按如下步骤进行肽链的合成。a.用NMP溶胀和洗涤树脂。b.用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团，并用NMP将残留的哌啶洗涤干净。c.将3.0mmol的Fmoc氨基酸，用NMP溶解后加入3.0mmol的HBTU、HOBT以及DIEA的混合溶液进行活化。d.将活化的氨基酸与树脂上脱去Fmoc基团的氨基酸(或者肽链)进行偶联。e.用NMP洗涤树脂，将过量活化试剂除去。f.用茚三酮法检测氨基酸的偶联效率，如果呈阳性结果，则重复c和d两步骤。如果呈阳性反应，则进行下一步反应。g.重复b、c、d、f四步骤至完成最后一个氨基酸的偶联反应。h.用DCM洗涤，并用氮气吹干。
3.由步骤2合成的多肽片段制备中间肽1
(1)将上述的Fmoc-AA1-10-OH的负肽树脂用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团，并用NMP将残留的哌啶洗涤干净。
(2)加入5mmol的吡啶后，在5mmol的乙酸苷和其10倍体积的NMP/DCM(3∶1体积比)的混合溶液进行偶合。
(3)分别用NMP和DCM洗涤树脂，用氮气吹干树脂或真空干燥。
4.肽树脂的切落
切落试剂选用1-2％的TFA的DCM溶液。
(1)将称量的树脂用其2倍体积的1％TFA的DCM溶液洗涤5次，每次3-5分钟。并用含有吡啶(与洗液中的TFA的体积比1∶1)的容器收集洗液。
(2)蒸馏除去2/3的DCM，加入6体积乙醇后并继续蒸馏直至除去DCM(通过蒸馏物的温度增加确定)。
(3)将溶液冷却至5～10℃，于30分钟加入6体积的水至沉淀出AcAA1-10-OH。真空过滤收集固体，并用水(2-3体积)洗涤固体。淤浆在0～5℃搅拌30分钟，通过真空过滤收集固体并干燥至恒重。
参考实施例2
制备中间肽4
合成方法同参考实例1。
                                              表3中间肽4片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  123   Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OHAc-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OHAc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OH   3072.752912.552718.29   90％91％92％   81％85％84％
参考实施例3
制备中间肽6
合成方法同参考实例1。
                                                  表4中间肽6片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  123   Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tht(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-OHAc-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-I1e-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OHAc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH   4049.803798.503658.27   87％90％91％   75％78％80％
参考实施例4
制备中间肽2
具体方法如下，合成的片段见表5。
                                      表5中间肽2片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  1234   Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OHFmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OHFmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OHFmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH   2247.842181.782381.022381.02   90％92％91％93％   82％85％86％88％
1.合成侧链保护的中间肽2片段
(1)称取按实施例1的方法制备的负载Fmoc-AA-OH的2-氯代三苯甲基氯树脂1.0mmol置于55ml的反应管中(如上述负载量为0.73mmol/克的树脂，应该称取1.37克)。
(2)在多肽合成仪上选择FastMoc 1.0mmol的程序按如下步骤进行肽链的合成。a.用NMP溶胀和洗涤树脂。b.用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团，并用NMP将残留的哌啶洗涤干净。c.将3.0mmol的Fmoc氨基酸，用NMP溶解后加入3.0mmol的HBTU、HOBT以及DIEA的混合溶液进行活化。d.将活化的氨基酸与树脂上脱去Fmoc基团的氨基酸(或者肽链)进行偶联。e.用NMP洗涤树脂，将过量活化试剂除去。f.用茚三酮法检测氨基酸的偶联效率，如果呈阳性结果，则重复c和d两步骤。如果呈阳性反应，则进行下一步反应。g.重复b、c、d、f四步骤至完成最后一个氨基酸的偶联反应。h.用DCM洗涤，并用氮气吹干。
2.肽树脂的切落
切落试剂选用1-2％的TFA的DCM溶液。
(1)将称量的树脂用其2倍体积的1％TFA的DCM溶液洗涤5次，每次3-5分钟。并用含有吡啶(与洗液中的TFA的体积比1∶1)的容器收集洗液。
(2)蒸馏除去2/3的DCM，加入6体积乙醇后并继续蒸馏直至除去DCM(通过蒸馏物的温度增加确定)。
(3)将溶液冷却至5～10℃，于30分钟加入6体积的水至沉淀出AcAAl-10-OH。真空过滤收集固体，并用水(2-3体积)洗涤固体。淤浆在0～5℃搅拌30分钟，通过真空过滤收集固体并干燥至恒重。
参考实施例5
制备中间肽3
1.Fmoc-Leu-OH负载于Sieber酰胺树脂的方法
将Sieber酰胺树脂(5.0克，0.6mmol/g)装入100毫升肽合成容器，用50毫升DCM洗涤后排干二氯甲烷(DCM)，再用50ml NMP洗涤后用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团。用NMP洗净残留的哌啶后，将Fmoc-Leu-OH 3.18克(9mmol，3.0当量)、HOBt 1.22克(9mmol，3.0当量)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)2.89克(9mmol，3.0当量)、0.5ml的DIEA溶于50ml的NMP后加入树脂中。室温下，氮气保护下搅动混合物18小时。用NMP洗涤50ml×3，MeOH洗涤50ml×3，乙醚洗涤50ml×3后真空干燥，得5.6克树脂。可以用相同的方法负载其它的氨基酸。此外，也可以在多肽合成仪上采用偶联氨基酸的固定程序直接负载肽链的第一个氨基酸。
将树脂上的Fmoc-氨基酸切落后进行树脂负载定量分析。方法为HPLC外标定量分析法，分析结果显示树脂负载量为0.54mmol/克。
柱：Zabarx C18 4.6×250mm 100A 5μ
流速：1ml/min
检测波长：260nm
流动相：A：0.1％TFA水溶液/乙腈(30/70)
                                          表6中间肽3片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  12345   H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2H-Glr(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2   3187.173337.313165.113022.953044.01   89％87％90％86％89％   78％75％81％79％85％
2.合成侧链保护的中间肽3片段
(1)称取上述方法制备的负载Fmoc-AA-OH的Sieber酰胺树脂1.0mmol置于55ml的反应管中(如上述负载量为0.59mmol/克的Fmoc-Leu-OH的Sieber酰胺树脂，应该称取1.69克)。
(2)在多肽合成仪上选择FastMoc 1.0mmol的程序按如下步骤进行肽链的合成。a.用NMP溶胀和洗涤树脂。b.用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团，并用NMP将残留的哌啶洗涤干净。c.将3.0mmol的Fmoc氨基酸，用NMP溶解后加入3.0mmol的HBTU、HOBT以及DIEA的混合溶液进行活化。d.将活化的氨基酸与树脂上脱去Fmoc基团的氨基酸(或者肽链)进行偶联。e用NMP洗涤树脂，将过量活化试剂除去。f.用茚三酮法检测氨基酸的偶联效率，如果呈阳性结果，则重复c和d两步骤。如果呈阳性反应，则进行下一步反应。g.重复b、c、d、f四步骤至完成最后一个氨基酸的偶联反应。h.用20％的哌啶NMP溶液除去Fmoc基团，并用NMP将残留的哌啶洗涤干净。g.用DCM洗涤，并用氮气吹干。
3.肽树脂的切落
切落试剂选用1-2％的TFA的DCM溶液。
(1)将称量的树脂用其2倍体积的1％TFA的DCM溶液洗涤5次，每次3-5分钟。并用含有吡啶(与洗液中的TFA的体积比1∶1)的容器收集洗液。
(2)蒸馏除去2/3的DCM，加入6体积乙醇后并继续蒸馏直至除去DCM(通过蒸馏物的温度增加确定)。
(3)将溶液冷却至5～10℃，于30分钟加入6体积的水至沉淀出H-AA23-34-NH2。真空过滤收集固体，并用水(2-3体积)洗涤固体。淤浆在0～5℃搅拌30分钟，通过真空过滤收集固体并干燥至恒重。
参考实施例6
制备中间肽5
合成方法同参考实例5。
                                          表7中间肽5片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  123   H-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NH2H-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NHXH-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2   3385.453063.083122.45   88％90％93％   79％82％83％
参考实施例7
制备中间肽7
合成方法同参考实例5，合成的片段见表8。
                                                  表8中间肽7片段
  顺序   氨基酸序列(含保护基团)   分子量   产率   纯度
  123   H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2   3736.573624.483667.54   89％86％89％   75％78％80％
实施例1
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2(SEQ ID NO.1)
分子量：4289.70
产率：95％
纯度：68％。
1.将中间肽2与中间肽3偶合为多肽片段
搅拌下将0.30mmol的中间肽2Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH、0.30mmol的中间肽3H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2，0.36mmol的HOBt溶于8ml的NMP中，冷却下加入0.50mmol的DIEA和0.36mmol的HBTU后室温反应4小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥后用HPLC测定纯度大于75％。
2.中间肽1与步骤1合成的多肽片段偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将上述多肽片段用异丙醚/环己烷(3∶1)混合溶液悬浮，加入哌啶后搅拌20小时，混合物呈泥浆状，过滤。固体用异丙醚洗涤两次，干燥后的固体称重后加入等当量的中间肽1Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH、1.2倍当量的HOBt，溶于8ml的NMP中，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.2倍当量的HBTU后室温反应4小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
3.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将2所得固体冷却下加入用20ml TFA、1.5克重蒸苯酚、0.5ml二巯基乙烷、1.0ml茴香硫醚以及1.0ml双蒸水配成的混合溶液，室温下处理5小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml异丙醚，产生的沉淀过滤异丙醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例2
Ac-WMEWDRKINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.2)
分子量：4303.77
产率：94％
纯度：73％
合成方法同实施例1。
中间肽2为：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH
中间肽3为：
H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2，
中间肽1为：Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH
实施例3
Ac-WMEWDRKIENYTKLIKSLIEESQEQQEKNEQELK-NH2(SEQ ID NO.7)
分子量：4365.92
产率：96％
纯度：71％
合成方法同实施例1。
中间肽2为：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH
中间肽3为；
H-Gln(trt)Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2
中间肽1为：
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH
实施例4
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIKKLIEESQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.12)
分子量：4437.09
产率：93％
纯度：72％
合成方法如下：
1.将中间肽2与中间肽1偶合为多肽片段
将0.30mmol的中间肽2Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH用异丙醚/环己烷(3∶1)混合溶液悬浮，加入哌啶后搅拌20小时，混合物呈泥浆状，过滤。固体用异丙醚洗涤两次，干燥后的固体加入等当量的中间肽1Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH、1.2倍当量的HOBt，溶于8ml的NMP中，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.2倍当量的HBTU后室温反应4小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥，纯度大于75％。
2.步骤1合成的多肽片段与中间肽3偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将上述干燥后的固体称重后加入等当量的中间肽3H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2、1.2倍当量的HOBt，溶于8ml的NMP中，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.2倍当量的HBTU后室温反应4小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
3.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将2所得固体冷却下加入用20ml TFA、1.5克重蒸苯酚、0.5ml二巯基乙烷、1.0ml茴香硫醚以及1.0ml双蒸水配成的混合溶液，室温下处理5小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml异丙醚，产生的沉淀过滤异丙醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例5
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.16)
分子量：4437.09
产率：92％
纯度：75％
合成方法同实施例4。
中间肽1为：
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH
中间肽2为：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH
中间肽3为：
H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2
实施例6
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-NH2(SEQ ID NO.18)
分子量：4536.16
产率：93％
纯度：73％
合成方法同实施例4。
中间肽1为：
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-sp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH
中间肽2为：
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH
中间肽3为：
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
实施例7
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH2(SEQ ID NO.19)
分子量为：3562.91
产率：92％
纯度：81％
合成方法如下：
1.中间肽4与中间肽5偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽4Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-OH和0.30mmol的中间肽5H-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NH2溶于8ml的NMP中后，加入1.2倍当量的HOBt，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.2倍当量的HATU后室温反应4小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、1.5克重蒸苯酚、0.5ml二巯基乙烷、1.0ml茴香硫醚以及1.0ml双蒸水配成的混合溶液，室温下处理5小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml异丙醚，产生的沉淀过滤异丙醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例8
Ac-WEEWDRKIEEYTKLIKSLIEESQEQQEK-NH2(SEQ ID NO.24)
分子量为：3637.05
产率：93％
纯度：83％
合成方法如下：
1.中间肽4与中间肽5偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽4Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OH和0.30mmol的中间肽5H-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)Glu(OtBu)-Lys(Boc)-NH2溶于8ml的DMF中后，加入1.5倍当量的HOBt，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.3倍当量的HBTU后室温反应3小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、5克重蒸苯酚，室温下处理4小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml乙醚，产生的沉淀过滤乙醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例9
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKK-NH2(SEQ ID NO.26)
分子量为：3665.19
产率：91％
纯度：85％
合成方法如下：
1.中间肽4与中间肽5偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽4Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)OH和0.30mmol的中间肽5H-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2溶于4ml DMF和4mlNMP中后，加入1.2倍当量的HOBt，冷却下加入1.1倍当量的DIEA和1.2倍当量的TBTU后室温反应8小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、1.5克重蒸苯酚、0.5ml二巯基乙烷配成的混合溶液，室温下处理7小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml甲基丁醚，产生的沉淀过滤甲基丁醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例10
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2(SEQ ID NO.1)
分子量为：4289.70
产率：86％
纯度：55％
合成方法如下：
1.中间肽6与中间肽7偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽6Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-OH和0.30mmol的中间肽7H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2溶于4ml DMF和4mlNMP中后，加入1倍当量的HOBt，冷却下加入1.1倍当量的DIEA和1.3倍当量的HBTU后室温反应6小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、1.5克重蒸苯酚、2ml双蒸水配成的混合溶液，室温下处理7小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的100ml甲基丁醚和100ml乙醚，产生的沉淀过滤甲基丁醚、乙醚混合液洗涤后收集，真空干燥。
实施例11
Ac-WMEWDRKIEEYTKKIEELIKKSQEQQEKNEKELK-NH2(SEQ ID NO.16)
分子量为：4437.09
产率：89％
纯度：60％
合成方法如下：
1.中间肽6与中间肽7偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽6Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH和0.30mmol的中间肽7H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2
溶于8ml的DMF中后，加入1.5倍当量的HOBt，冷却下加入1.5倍当量的DIEA和1.3倍当量的HBTU后室温反应3小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)搅拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、5克重蒸苯酚，室温下处理7小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的200ml乙醚，产生的沉淀过滤乙醚洗涤后收集，真空干燥。
实施例12
Ac-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK-NH2(SEQ ID NO.18)
分子量为：4536.16
产率：90％
纯度：61％
合成方法如下：
1.中间肽6与中间肽7偶合为侧链保护的抗HIV融合肽
将0.30mmol的中间肽6Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH和0.30mmol的中间肽7H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2溶于8ml的DMF中后，加入1.5倍当量的HOBt，冷却下加入1.2倍当量的DIEA和1.3倍当量的HBTU后室温反应5小时。滴加30ml的甲醇/水(1∶1)拌至浆状。过滤，固体用8ml甲醇/水(1∶1)洗涤2次，真空干燥。
2.除去侧链保护基团制备全长抗HIV融合肽
将1所得固体冷却下加入用20ml TFA、5克重蒸苯酚、1.0ml茴香硫醚，室温下处理8小时。除去侧链保护基团的肽溶液加入冷却的100ml乙醚和100ml异丙醚，产生的沉淀过滤乙醚洗涤后收集，真空干燥。
                          序列表
<110>南方医科大学
<120>抗HIV融合肽及其制备方法
<160>53
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>1
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Leu
<210>2
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>2
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>3
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>3
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>4
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>4
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Ile His
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>5
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>5
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>6
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>6
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>7
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>7
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Lys
<210>8
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>8
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>9
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>9
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>10
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>10
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>11
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>11
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>12
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>12
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                 5                  10                  15
Lys Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>13
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>13
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                 5                  10                  15
Lys Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>14
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>14
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                5                   10                  15
Lys Leu Ile Lys Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>15
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>15
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                5                   10                  15
Glu Leu Ile Glu Lys Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Lys Glu Leu Lys
<210>16
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>16
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys
            20                  25                  30
Glu Leu Lys
<210>17
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>17
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn
            20                  25
Glu Lys Glu Leu Lys
30
<210>18
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>18
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                5                   10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu Glu Glu
            20                  25                  30
Leu Lys Lys
        35
<210>19
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>19
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>20
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>20
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>21
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>21
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>22
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>22
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                 5                  10                  15
Lys Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>23
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>23
Trp Xaa Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Lys
                 5                  10                  15
Lys Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>24
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；肽片断
<400>24
Trp Glu Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Lys
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
            20                  25
<210>25
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>25
Trp Xaa Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys
            20                  25
<210>26
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>26
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys
            20                  25
<210>27
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<222>(2)
<223>Xaa＝Nle
<400>27
Trp Xaa Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys
            20                  25
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>28
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn
                 5                   10
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>29
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Asn Asn
                 5                   10
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>30
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Asn
                 5                   10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>31
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu
                 5                   10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>32
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu
                 5                   10
<210>33
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>33
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser
                 5                   10
<210>34
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>34
Tyr Thr Lys Leu Ile Lys Ser Leu Ile Glu Glu Ser
                 5                   10
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>35
Tyr Thr Lys Lys Ile Lys Lys Leu Ile Glu Glu Ser
                 5                  10
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>36
Tyr Thr Lys Lys Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser
                 5                  10
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>37
Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu
                 5                  10
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>38
Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Lys
                 5                  10
<210>39
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<400>39
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Lys
                 5                   10
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>40
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Glu Leu Lys
                 5                   10
<210>41
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
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<400>41
Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys Lys
                 5                   10
<210>42
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：肽片断
<400>42
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser
                 5                   10
<210>43
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：肽片断
<400>43
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys
                 5                  10
<210>44
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：肽片断
<400>44
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys
                 5                  10
<210>45
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>45
Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
                 5                  10                  15
<210>46
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>人工序列描述：肽片断
<400>46
Leu Ile Lys Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys
                 5                  10                  15
<210>47
<211>15
<212>PRT
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<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>47
Lys Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys
                 5                  10                  15
<210>48
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>48
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
                 5                  10                  15
Ser Leu Ile
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>49
Trp Met Glu Trp Asp Arg Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile
<210>50
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>50
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu
                 5                  10                  15
Glu Leu Ile
<210>51
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>51
Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu
                 5                  10                  15
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>52
Glu Glu Ser Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Glu Leu Lys
                 5                  10                  15
<210>53
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：肽片断
<400>53
Lys Lys Ser Glu Glu Gln Gln Lys Lys Asn Glu Glu Glu Leu Lys lys
                 5                  10                  15

Claims (3)

1、一种抗HIV融合肽的制备方法，包括：(a)将中间肽溶解后加入活化试剂进行偶联，偶联产物在甲醇水溶液析出后过滤；(b)将偶联产物加入包含离子捕获剂的三氟乙酸溶液脱去保护基团，然后于醚中沉淀，过滤后真空干燥，得到下述氨基酸序列的多肽：
a-WX1EWDX2X3IX4X5YTSX6IX7X8LIX9X10SX11X12QQX13KNEX14ELX15X16-b    (I)
通式(I)中氨基酸序列中其它字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：
S为丝氨酸、W为色氨酸、E为谷氨酸、T为苏氨酸、R为精氨酸、I为异亮氨酸、N为天门冬酰胺、Y为酪氨酸、K为赖氨酸、Q为谷氨酰胺、L为亮氨酸、D为天门冬氨酸、M为蛋氨酸；a是乙酰基、9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)其中一种，b为酰氨基或羧基；X1-16代表天然氨基酸或非天然氨基酸或氨基酸类似物或空缺；其中，
所述的中间肽为：
中间肽1：Ac-WX1EWDX2X3IX4X5-OH，
中间肽2：Fmoc-YTSX6IX7X8LIX9X10S-OH，
中间肽3：H-X11X12QQX13KNEX14ELX15X16-NH2；
或者为：
中间肽6：Ac-WX1EWDX2X3IX4X5YTSX6IX7X8LI-OH，
中间肽7：H-X9X10SX11X12QQX13KNEX14ELX15X16-NH2。
2、权利要求1所述的制备方法，其中中间肽1是
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH(SEQ IDNO.36)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-OH(SEQ IDNO.37)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Asn(trt)-OH(SEQ ID NO.38)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(SEQ ID NO.39)，
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(SEQ ID NO.40)其中一种；
中间肽2是
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.41)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.42)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.43)，
Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH(SEQ ID NO.44)其中一种；
中间肽3是
H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2(SEQ ID NO.45)，
H-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.46)，
H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.47)，
H-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.48)，
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.49)其中一种；
其中tBu为叔丁基，trt为三苯甲基。
3、权利要求1所述的制备方法，其中中间肽6是
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Glu(OtBu)-Ile-Asn(trt)-Asn(trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.56)，
Ac-Trp(Boc)-Met-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Arg(pmc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.57)，
Ac-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Ile-OH(SEQ ID NO.58)其中一种；
中间肽7是
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-NH2(SEQ ID NO.59)，
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.60)，
H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Gln(trt)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2(SEQ ID NO.61)其中一种；
其中tBu为叔丁基，trt为三苯甲基。
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