CN1231590C - 利用脂肪酶的甘油酯的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非常高纯度且高效率地制造2-甘油一酸酯(2-MG)或甘油三酯(TG)、特别是在sn-2位上具有高度不饱和脂肪酸(PUFA)酸根的TG的方法。利用第一1，3位脂肪酶对原料TG进行加醇分解，制造2-MG。再将得到的2-MG利用第二1，3位脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，制造TG。2位的脂肪酸酸根优选为DHA、EPA、ARA的酸根。在此，“第一脂肪酶”是指对1，3位具有选择性、并且进行醇解时对长链的脂肪酸也发生作用的脂肪酶，“第二脂肪酶”是指对1，3位具有选择性、并且当使2-MG与脂肪酸酯或游离脂肪酸发生反应时生成TG的脂肪酶。
Description
技术领域
本发明涉及利用脂肪酶的甘油酯的制造方法。更具体而言，本发明涉及利用脂肪酶的2-甘油一酸酯或甘油三酯、特别是在sn-2位上具有高度不饱和脂肪酸(PUFA)酸根的甘油三酯(TG)的制造方法。
在本发明中，“DHA”是表示二十二碳六烯酸的略称，“EPA”是表示二十碳五烯酸的略称，“ARA”是表示花生四烯酸的略称。另外，当使用DHA浓缩油脂、三DHA-甘油三酯的表示方法时，是作为二十二碳六烯酸酸根的略称来使用的。
另外，“MG”是表示甘油一酸酯的略称，“2-MG”是表示2-甘油一酸酯的略称，“TG”是表示甘油三酯的略称。
此外，“第一脂肪酶”是指对1，3位具有选择性、并且进行醇解时对长链脂肪酸也发生作用的脂肪酶。
“第二脂肪酶”是指对1，3位具有选择性、并且当使2-MG与脂肪酸酯或游离脂肪酸发生反应时生成TG的脂肪酶。
背景技术
利用对1，3位具有特异性的脂肪酶、在TG的1，3位上导入任意的脂肪酸时，一般是使用目的脂肪酸进行酸解、或使用目的脂肪酸酯进行酯交换等方法。但是，在这种情况下必须非常多地使用过量的脂肪酸或脂肪酸酯，并且从概率论的角度出发，由于原来的1，3位的脂肪酸残留下来一部分，所以难以得到高纯度的目的构造类脂物。
而且就脂肪酶来说，根据脂肪酸的碳链长度不同，其活性也有很大的变化，针对于DHA等的长链脂肪酸的活性明显减弱，因此，有可能得不到目的构造类脂物。
另外，在脂肪酶的反应中，可以举出水解反应、酯交换反应、酸解、酯化反应等，但所有的脂肪酶并不是在相同条件下对任何反应都显示出相同程度的活性，而是存在着具有各种各样特性的脂肪酶。例如，如果利用对于酸解具有强活性的1，3-脂肪酶，对1，3位的脂肪酸的置换就很有利，但这种脂肪酶在对DHA等不具有充分活性的情况下，由DHA位于1，3位的TG置换为其它的目的脂肪酸就变得非常困难。当然，如果利用对酸解具有高活性、对DHA活性也很高的脂肪酶可以达到目的，但是这样的脂肪酶难以得到，而且因为极其昂贵，一般不被选择用于工业用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以非常高纯度、高效率制备2-MG或TG、特别是在sn-2位上具有高度不饱和脂肪酸(PUFA)酸根的TG的方法。
本发明以甘油酯的制备方法为要点，其特征在于：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯进行乙醇或甲醇分解，制备2-甘油一酸酯。当2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的原料TG进行乙醇或甲醇分解，从而制备2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG。
当原料TG是含有高度不饱和脂肪酸的油酯、优选为DHA浓缩油脂、EPA浓缩油脂或ARA浓缩油脂时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的油酯、优选为DHA浓缩油脂、EPA浓缩油脂或ARA浓缩油脂进行乙醇或甲醇分解，从而制备2-MG。
当上述的油脂是鱼油时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对鱼油、优选为DHA浓缩鱼油或EPA浓缩鱼油进行乙醇或甲醇分解，从而制备2-MG。
当原料TG是三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对三DHA-TG或三EPA-TG进行乙醇或甲醇分解，从而制备2-MG。
另外，本发明以甘油酯的制备方法为要点，其特征在于：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对上述的2-MG、即原料TG进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
当2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对原料TG进行乙醇或甲醇分解，得到2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
当在1，3位上导入的脂肪酸酸根是碳原子数为8、10或12的中链饱和脂肪酸酸根时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对原料TG进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG、优选为在2位上的脂肪酸酸根是DHA、EPA或ARA酸根的MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入碳原子数为8、10或12的中链饱和脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
当原料TG是含有高度不饱和脂肪酸的油酯、优选为DHA浓缩油脂、EPA浓缩油脂或ARA浓缩油脂时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的油酯、优选为DHA浓缩油脂、EPA浓缩油脂或ARA浓缩油脂进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
上述的油脂是鱼油时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对鱼油、优选为DHA浓缩鱼油或EPA浓缩鱼油进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
原料TG是三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG时，本发明的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对三DHA-TG、三EPA-TG或三ARA-TG进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。
本发明的优选的甘油酯的制备方法的特征是：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对原料TG进行乙醇或甲醇分解，得到2-MG，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的TG。即，本发明是，将脂肪酶的反应分为两个阶段，首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶从TG开始经醇解调制得到2-MG，然后，使用希望导入至1，3位上的脂肪酸的低级烷基酯或游离脂肪酸，在Rhizomucormiehei脂肪酶的作用下，通过2-MG的酯化反应调制得到TG的方法。
本发明人在研究中发现，某种脂肪酶与TG反应，即使在酸解或水解中未得到所期望的结果，但经过醇解，即使DHA等难以使脂肪酶发挥作用的脂肪酸处于1，3位时，大体上也可以完全地将1，3位上的脂肪酸除去，从而得到2-MG。又发现，接着使希望导入1，3位的脂肪酸酯或游离脂肪酸对2-MG作用，可以非常高纯度且高效率地得到目的构造的TG，将这些程序按顺序进行组合，就完成了本发明。
就第一阶段所使用的第一脂肪酶来说，只要是对1，3位具有选择性、并在进行乙醇分解、甲醇分解等的醇解时能对DHA等长碳链的脂肪酸也产生作用，就不特别限制。作为达到此目的可以利用的脂肪酶，可举出南极洲念珠菌属(Candida antarctica)脂肪酶(例如Novozym435[诺和诺德生物工业公司(株)])，并作为优选的例子。
就第二阶段所使用的第二脂肪酶来说，只要是对1，3位具有选择性、并能使2-MG与脂肪酸酯或游离脂肪酸在减压下发生反应、从而生成TG，就不特别限制。作为达到此目的可以利用的脂肪酶，可举出Rhizomucor miehei脂肪酶(例如Lipozyme IM[诺和诺德生物工业公司(株)])，并作为优选的例子。作为脂肪酸酯，可例举出乙酯等的低级烷基酯。
本发明的最优选的制备方法的特征是：首先利用Novozym435对原料TG进行醇解，得到2-MG，再用Lipozyme IM在1，3位上导入脂肪酸酸根，从而得到目的构造的TG。
原料TG优选为含有高度不饱和脂肪酸的油脂，高度不饱和脂肪酸是DHA、EPA或ARA。本发明的方法中所用的原料TG例如为鱼油，优选为DHA浓缩油脂或三DHA-TG、或者、EPA浓缩油脂或三EPA-TG、或者、ARA浓缩油脂或三ARA-TG。本发明的方法中所用的导入到1，3位上的脂肪酸，优选为碳原子数是8、10或12的饱和脂肪酸。
在本发明中，作为原料的TG，在使用只由高度精制的DHA构成的三DHA-TG时，可得到高纯度的X-DHA-X型的TG，而这在现有的酸解和市售脂肪酶的组合中所进行的调制是非常困难的。另外，此时如果选择碳原子数为8～12的中链脂肪酸为导入到1，3位上的脂肪酸，则可以得到具有良好吸收性的含有DHA的TG，如果将其用于婴幼儿的奶粉中，则可以期待得到很好的效果。
此外，也可以同样地调制含有EPA的构造类脂物，得到吸收性高的含有EPA的TG，此时可以得到具备EPA所固有的多种生理活性的食品、医药品。
众所周知，鱼油本身在sn2位上就存在DHA，如果将本发明适用于DHA含量比较高的金枪鱼油或鲣鱼油，则可以得到使吸收性增大、具有良好营养的油脂。另外，如果使用以脱蜡等方法将原料鱼油中的DHA浓度已浓缩的鱼油，还可以得到DHA含量高的目的构造的TG。
将脂肪酶的反应分为两个阶段，在第一阶段，首先从TG开始用南极洲念珠菌属脂肪酶进行醇解，即使DHA等难以发挥脂肪酶作用的脂肪酸处于1，3位上，也可基本上将1，3位上的脂肪酸完全地除去，得到2-MG。
然后，在第二阶段，使用要导入到1，3位上的脂肪酸的低级烷基酯或游离脂肪酸，在Rhizomucor miehei脂肪酶的作用下，进行2-MG的酯化反应，就可以非常高纯度且高效率地得到目的构造的TG。
具体实施方式
用实施例详细说明本发明。这些实施例对本发明不构成任何限定。
实施例1
将1g鲣鱼油、3g乙醇、0.4gNovozym435混合，并在氮气气流、35℃下进行2小时的搅拌。反应后，反应混合物的类脂物组成用Iatroscan测定，其结果为：乙酯69.5％，甘油二酯2.3％，MG28.3％，TG、游离脂肪酸未检出。用薄层色谱法分析的结果，确认MG是2-MG。另外，经用气相色谱法对脂肪酸的组成进行测定后的结果为：相对于原料鲣鱼油的DHA的27.9％，MG的DHA为51.5％。
实施例2
以沙丁鱼油作为原料，为达到将PUFA浓缩的目的，以丙酮作溶媒进行脱蜡，将所得的1g油、3g乙醇、0.4gNovozym435混合，并在氮气气流、35℃下进行3小时的搅拌。反应后，反应混合物的类脂物组成用Iatroscan测定，其结果为：乙酯67.7％，甘油二酯1.9％，MG30.4％，TG、游离脂肪酸未检出。用薄层色谱法分析的结果，确认MG是2-MG。另外，经用气相色谱法对脂肪酸的组成进行测定后的结果为：相对于脱蜡油的DHA的13.0％，MG的DHA为28.8％。
实施例3
将0.184g甘油、0.184g水、0.239g Novozym435混合并搅拌30分钟后，加入1.971g的DHA，在60℃、3～5mmHg的减压下进行一夜的搅拌。将酶过滤分离，反应混合物用硅胶柱进行精制，结果得到1.83g的三DHA-TG(纯度99％、回收率89％)。
将得到的0.102g三DHA-TG、0.306g乙醇和0.046g的Novozym435混合，并在35℃氮气气流中进行4小时的搅拌。将酶过滤分离，甘油酯组分的组成用Iatroscan分析，其结果为：MG为92.7％，甘油二酯为5.35％，TG为1.96％。用薄层色谱法分析的结果，确认MG为100％的2-MG。
实施例4
进行与实施例3同样的操作，从得到的反应混合物开始，将酶过滤分离后残存的乙醇，进行减压蒸馏除去，在全部残留物质中加入0.345g的辛酸乙脂、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在氮气气流、35℃下进行30分钟的搅拌。接着用真空泵将反应容器减压至3～5mmHg，在35℃下继续进行3.5小时的搅拌。将所得的混合物的甘油酯组分的组成用气相色谱法以及银离子柱高速液相色谱仪进行分析，其结果为：2位为DHA、1，3位为辛酸的TG含量是81.4％。
实施例5
进行与实施例3同样的操作，在由所得到的反应混合物经分馏所得的0.040g2-DHA-MG中，加入0.289g的辛酸、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮气气流下进行30分钟的搅拌。接着用真空泵将反应容器减压至3～5mmHg，在35℃下继续进行3.5小时的搅拌。将所得的反应混合物的甘油酯组分的组成用气相色谱法以及银离子柱高速液相色谱仪进行分析，其结果为：2位为DHA、1，3位为辛酸的TG含量是78.8％。
实施例6
将0.184g甘油、0.184g水和0.239g Novozym435混合并搅拌30分钟后，加入1.815gEPA，在60℃、3～5mmHg的减压下进行一夜的搅拌。将酶过滤分离，反应混合物用硅胶柱进行精制，结果得到1.74g的三EPA-TG(纯度99％、回收率92％)。
将得到的0.094g三EPA-TG、0.283g乙醇和0.038g Novozym435混合，并在35℃下进行4小时的搅拌。将酶过滤分离，甘油酯组分的类脂物组成用Iatroscan分析，其结果为：MG为98.5％，甘油二酯为5.35％，TG为0.42％。用薄层色谱法分析的结果，确认MG为100％的2-MG。
实施例7
进行与实施例6同样的操作，从得到的反应混合物开始，将酶过滤分离后残存的乙醇，进行减压蒸馏除去，在全部残留物质中加入0.400g的癸酸乙脂、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮气气流下进行30分钟的搅拌。接着用真空泵将反应容器减压至3～5mmHg，在35℃下继续进行3.5小时的搅拌。将反应后所得的甘油酯组分的组成用气相色谱法以及银离子柱高速液相色谱仪进行分析，其结果为：2位为EPA、1，3位为癸酸的TG的含量是72.7％。
实施例8
进行与实施例6同样的操作，在由所得到的反应混合物经分馏所得的0.037g 2-EPA-MG中，加入0.345g的癸酸、0.010g的水和0.050g的Lipozyme IM，并在35℃、氮气气流下进行30分钟的搅拌。接着用真空泵将反应容器减压至3～5mmHg，在35℃下继续进行3.5小时的搅拌。将反应后所得的甘油酯组分的组成，用气相色谱法以及银离子柱高速液相色谱仪进行分析，其结果为：2位为EPA、1，3位为癸酸的TG的含量是70.6％。
产业上的可利用性
可以提供非常高效率且高纯度地制造目的构造的TG、特别是在sn-2位上具有PUFA的TG的制造方法。
另外，也可提供对作为用于目的构造的TG制造的中间体特别有用的2-MG的制造方法。
Claims (7)
1.一种甘油酯的制备方法，其特征在于：利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯进行乙醇或甲醇分解，制备2-甘油一酸酯。
2.一种甘油酯的制备方法，其特征在于：首先利用南极洲念珠菌属脂肪酶对含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯进行乙醇或甲醇分解，得到2-甘油-酸酯，再利用Rhizomucor miehei脂肪酶在1，3位上导入脂肪酸酸根，得到在2位上具有来自原料甘油三酯的脂肪酸酸根、在1，3位上具有新导入的同一脂肪酸酸根的构造的甘油三酯。
3.如权利要求2所述的甘油酯的制备方法，其特征在于：2位的脂肪酸酸根为DHA、EPA或ARA的酸根。
4.如权利要求3所述的甘油酯的制备方法，其特征在于：导入到1，3位上的脂肪酸酸根是碳原子数为8、10或12的中链饱和脂肪酸酸根。
5.如权利要求2，3，或4所述的甘油酯的制备方法，其特征在于：所述含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯为DHA浓缩油脂、EPA浓缩油脂或ARA浓缩油脂。
6.如权利要求2所述的甘油酯的制备方法，其特征在于：所述含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯为鱼油。
7.如权利要求1或2所述的甘油酯的制备方法，其特征在于：含有高度不饱和脂肪酸的原料甘油三酯为三DHA-甘油三酯、三EPA-甘油三酯或三ARA-甘油三酯。
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