CN113924115A

CN113924115A - 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法

Info

Publication number: CN113924115A
Application number: CN202080026983.XA
Authority: CN
Inventors: 中井弘之; 塞缪尔·黄; 琪·阿达
Original assignee: Oregon Health Science University
Current assignee: Oregon Health Science University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2022-01-11
Also published as: EP3917566A4; KR20210130158A; CA3128230A1; EP3917566A1; WO2020160508A1; US20230119163A1; WO2020160508A8; US11459558B2; US20230193315A1; JP2022523719A; US20230287404A1; AU2020216480A1; US20210348160A1; US12084653B2; US12084654B2; US20230287405A1

Abstract

本发明公开了进行转录依赖性定向进化(TRADE)的方法和使用此类方法选择的新型AAV衣壳。本发明还提供了新型AAV衣壳突变体。TRADE技术被用于鉴定在静脉施用后介导脑中的神经元转导的新型AAV载体。TRADE在体内的应用导致鉴定出在施用新型AAV衣壳后在脑中可以比AAV9更有效、更特异性地转导神经元的新型AAV衣壳。TRADE技术可用于鉴定靶向各种细胞群的AAV衣壳。

Description

用于AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院/国立神经疾病和中风研究所授予的批准号NS088399的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本公开内容涉及用于基因递送的病毒载体。更具体地，本公开内容涉及转录依赖性定向进化的方法和通过使用该方法选择的腺相关病毒(“AAV”)载体。

背景技术

重组腺相关病毒(“AAV”)载体是最有希望用于体内基因递送的载体之一。由于从人类和非人灵长类动物组织中分离出许多天然存在的新血清型和亚型，因此AAV载体的用途得到了扩展。Gao等人,J Virol 78,6381-6388(2004)和Gao等人,Proc Natl Acad SciUSA 99,11854-11859(2002)。在新鉴定的AAV分离株中，AAV血清型8(AAV8)和AAV血清型9(AAV9)受到关注，因为源自于这两种血清型的AAV载体可以在全身施用后以高效率转导多种器官，包括肝、心脏、骨骼肌和中枢神经系统。Ghosh等人,Mol Ther 15,750-755(2007)；Pacak等人,Circ Res 99,3-9(2006)；Inagaki等人,Mol Ther 14,45-53(2006)；Zhu等人,Circulation 112,2650-2659(2005)；Wang等人,Nat Biotechnol 23,321-328(2005)；Nakai等人,J Virol 79,214-224(2005)；和Foust等人,Nature Biotechnol 23,321-328(2009)。AAV8和AAV9载体的这种强力转导归因于这些细胞类型的强烈趋向性、载体的有效细胞摄取和/或细胞中病毒粒子壳的快速脱壳。Thomas等人,J Virol 78,3110-3122(2004)。此外，具有更好性能的衣壳工程化的AAV载体的出现显著拓展了AAV作为载体工具包的实用性。Asokan等人，Mol Ther 20,699-708(2012)。

使用AAV介导的基因治疗的概念验证已在许多人类疾病的临床前动物模型中得到证实。I/II期临床研究显示了针对治疗血友病B(Nathwani等人,N Engl J Med 71,1994-2004(2014))、脂蛋白脂肪酶缺乏症(Carpentier等人,J Clin Endocrinol Metab 97，1635-1644(2012))、莱伯氏先天性黑蒙症(Jacobson等人,Arch Ophthalmol 130,9-24(2012)以及Pierce和Bennett,Cold Spring Harb Perspect Med 5,a017285(2015))和其他(Mingozzi和High,Nat Rev Genet 12,341-355(2011)以及Wang等人,Nat Rev DrugDiscov 18,358-378(2019)中综述的)的有希望的结果。

尽管有这种希望，但人体研究也揭示了AAV介导的基因治疗中的意外问题和潜在挑战。Manno等人,Nat Med 12,342-347(2006)。此外，尽管我们对AAV生物学和衣壳表型关系的理解取得了快速进展(Adachi等人,Nat Commun 5,3075,(2014)；Grimm等人,Hum GeneTher 28,1075-1086,(2017)；和Ogden等人,Science 366,1139-1143,(2019))，对于临床AAV载体，仍有许多我们无法合理设计的期望特性。

为此，已采用高通量筛选方法来鉴定具有此类期望表型的新型AAV衣壳。特别是，体内AAV文库选择策略的发展产生了能够高效转导先前难驾驭的细胞类型的多种设计的AAV变体(Kotterman和Schaffer,Nat Rev Genet 15,445-451(2014)以及Grimm等人,MolTher 23,1819-1831(2015)中综述的)。

体内文库选择(第一代)的最早尝试依赖于从解剖组织中回收载体基因组DNA。从理论上讲，这种策略会导致回收有效的AAV变体以及介导载体介导的转基因表达所需的一些步骤但不是所有步骤的AAV变体(图1)。因此，筛选合成的AAV变体的多样化文库可能会导致作为完全无效的基因治疗载体的AAV变体的高背景回收。此外，针对特定细胞类型需要进一步处理，例如荧光激活细胞分选或激光捕获显微切割。尽管如此，已经有一些成功地采用这种技术的报告。Excoffon等人,Proc Natl Acad Sci USA 106,3865-3870(2009)；Grimm等人,J Virol 82,5887-5911(2008)；Lisowski等人,Nature 506,382-386(2014)；和Dalkara等人,Sci Transl Med 5,189ra176(2013)。然而，2016年Deverman等人的一项具有里程碑意义的研究表明通过使用Cre-依赖性选择策略(第二代)可以极大地改进这个过程。Deverman等人,Nat Biotechnol 34,204-209(2016)。Cre-依赖性文库选择利用Cre重组酶作用于双链DNA而不是单链DNA的选择性能力，以倒置包含引物结合序列的载体基因组DNA。该序列的倒置允许方向选择性PCR特异性扩增由AAV变体递送至细胞的病毒DNA，这些病毒DNA能够经历转导后期，在该阶段从单链AAV基因组形成双链DNA。此外，使用Cre驱动线有助于以细胞类型特异性方式选择性表达Cre重组酶，从而允许选择有效转导的新型AAV变体。事实上，使用Cre-依赖性选择使作者能够开发一种AAV9变体AAV-PHP.B，在C57BL/6J小鼠全身施用后，其转导能力是亲代AAV9的40倍。Deverman等人,Nat Biotechnol 34,204-209(2016)。不幸的是，最近变得清楚的是，AAV-PHP.B在小鼠中表现出的增强并没有转化至非人灵长类动物的环境(Matsuzaki等人2018和Hordeaux等人2019)。令人惊讶的是，这种增强甚至没有扩展到所有常用的小鼠品系(Matsuzaki等人2018和Hordeaux等人2019)。因此，通过在灵长类动物模型中进行AAV文库选择实验，对加速临床相关AAV载体的开发具有强推动力。然而，与已经建立了过多细胞类型特异性转基因Cre驱动系的小鼠中的AAV变体选择不同，Cre依赖性选择在临床相关的大型动物(包括非人灵长类动物)中是难以驾驭的，因为Cre转基因动物不是可方便获得的。

因此，我们寻求开发下一代选择策略(第3代)，该选择策略具有与Cre-依赖性选择提供的相似或更好的选择严格性且不需要Cre重组酶。为了实现这一目标，我们开发了转录依赖性定向进化(TRAnscription-dependent Directed Evolution)系统，即TRADE。在转录依赖性选择中，我们将AAV cap基因表达为由细胞类型特异性增强子-启动子驱动的非编码反义mRNA。通过RT-PCR回收这种反义转录物允许在特定细胞类型中以载体介导的mRNA表达水平严格回收AAV cap基因且无需使用Cre重组酶。靶向不同细胞类型仅需要将不同细胞类型特异性增强子-启动子克隆到质粒构建体中。因此，TRADE是可应用于多种环境的高度灵活的系统，包括用于开发用于临床基因治疗的增强型AAV载体的非人灵长类动物环境。请注意，相同的原理可用于有义方向上表达AAV cap基因。然而，有义链方法导致免疫原性衣壳蛋白在靶细胞中表达，因此不如TRADE系统采用的反义链方法理想。

发明内容

本公开提供了称为转录依赖性定向进化(“TRADE”)的下一代定向进化策略，其在细胞类型特异性或遍在mRNA表达水平上对AAV衣壳转导进行选择。本文描述的方法提供了与基于Cre重组的AAV靶向进化(“CREATE”)相比的以下优势，是文献中报道的AAV衣壳定向进化的最现代方法。Deverman等人,Nat Biotech 34,204-209(2016)。首先，CREATE系统需要Cre表达，这可以通过外源递送的Cre表达或使用Cre转基因动物来实现。相比之下，TRADE系统不需要Cre转基因动物；因此，它可以应用于源自于任何动物物种的动物和培养的细胞，并且可以很容易地适应大型动物，包括非人灵长类动物。其次，在CREATE系统中在AAV病毒基因组从单链DNA到双链DNA的转换水平上应用细胞类型特异性选择，与CREATE系统不同，TRADE允许在AAV基因组转录水平上的细胞类型特异性选择。因此，TRADE系统可以提供比CREATE系统更大的选择压力。第三，可以将多种定向进化方案(例如，神经元特异性、星形胶质细胞特异性、少突胶质细胞特异性和小胶质细胞特异性)整合到一个AAV衣壳文库中，并且可以在单个动物中对靶向每种细胞类型的AAV载体进行选择。第四，任何细胞类型特异性或组织/器官特异性增强子/启动子或遍在增强子/启动子都可以很容易地用于AAV衣壳定向进化，旨在鉴定具有增强效力的细胞类型特异性或遍在新型AAV衣壳。第五，TRADE方法不仅限于Dependoparvovirus属，包括已用于基因传递的常见AAV，还可以更广泛地应用于细小病毒科，包括除AAV之外的Bocaparvoviruses属和Erythroparvoviruses属(例如，博卡病毒)，更广泛地应用于DNA病毒。

本公开还提供了新型AAV衣壳突变体。TRADE技术被用于鉴定在静脉施用后介导脑中的神经元转导的新型AAV载体。TRADE在C57BL/6J小鼠和恒河猴中的应用导致鉴定出在静脉施用后可以比AAV9更有效和更特异性地转导小鼠和非人灵长类动物脑中的神经元的新AAV衣壳。此外，我们确定了新型AAV衣壳，它可以比AAV9好5到18倍地转导存在于肺中并且可能是神经元起源的一个或多个未定义的细胞群。

本公开还提供了防止AAV衣壳基因的反义mRNA剪接的方法。从AAV cap基因开放阅读框(“ORF”)转录的反义前体mRNA可以被剪接，制作截短的mRNA种类。据我们所知，这是以前从未报道过的新发现。这种剪接有可能阻碍AAV cap ORF全长反义mRNA的有效回收，当cap ORF的宽区域被诱变时，这对于TRADE是必不可少的。本公开内容提供了防止cap基因的反义mRNA剪接的新策略。

本文描述的TRADE系统使用反义mRNA来回收衣壳序列信息，使用有义链mRNA的TRADE(即，有义链TRADE)使用相同的原理也是可行的。然而，应该指出的是，有义链TRADE方法导致免疫原性衣壳蛋白在靶细胞中表达，因此可能不如反义链方法理想。

附图说明

图1用于AAV衣壳定向进化的体内文库选择策略概述。AAV载体介导的转导是一个多步骤的过程，需要病毒体克服细胞外屏障，结合靶细胞上的受体，通过内吞作用进入细胞，逃离核内体，运输到细胞核，脱壳，实现双链DNA构型，最后经历转录/翻译。最早的体内文库选择策略(第一代)从组织样本中回收了所有载体基因组DNA。从理论上讲，这种策略将回收有效的AAV变体，以及介导载体介导的转基因表达所需的一些步骤但不是所有步骤的AAV变体。此外，该策略还可以从不进入细胞且停留在细胞外基质中的AAV载体颗粒中回收AAV载体基因组DNA。因此，筛选合成的AAV变体的多样化文库将导致作为完全无效的基因治疗载体的AAV变体的相对较高的背景回收。此外，关注特定细胞类型需要进一步处理，例如荧光激活细胞分选(FACS)或激光捕获显微切割(LCM)。第二代文库选择(第2代)通过利用仅那些能够实现转导的双链DNA阶段的AAV变体的Cre依赖性回收显著提高了选择严格性。此外，用细胞类型特异性增强子-启动子驱动Cre表达允许靶向特定细胞类型，同时保留处理大量组织样本的益处。第三代文库选择(第3代)进一步建立在通过使用AAV变体的转录依赖性回收的AAV定向进化技术的基础上，这些AAV变体能够从细胞类型特异性增强子-启动子介导转基因mRNA表达且无需Cre表达。

图2 TRADE原则。(A)TRADE构型(AAV-TRADE)中的AAV载体基因组的图。细胞类型特异性增强子-启动子以反义方向放置，以驱动AAV cap基因转录表达为反义mRNA。源自于猿猴病毒40(SV40)基因组的多腺苷酸化信号(pA)以反义方向置于AAV基因组内含子内，以终止反义AAV cap基因mRNA转录。eGFP开放阅读框(ORF)可以如图所示放置，以作为报告子或促进FACS对转导细胞的富集；然而，这样的标记基因对于TRADE并不是绝对必要的。遍在启动子(如CAG启动子)也可用于TRADE中代替细胞类型特异性增强子-启动子，以鉴定可以转导多种细胞类型的AAV衣壳。细胞类型特异性增强子-启动子可以放置在AAV cap基因ORF的上游，以在有义方向(即有义链TRADE)上驱动AAV cap基因mRNA转录物的表达。然而，这种方法对于TRADE可能并不理想，因为AAV衣壳蛋白会在靶细胞中表达，这可能会在定向进化过程中导致不期望的生物学结果。(B)在HEK293细胞中制备AAV载体期间，在腺病毒辅助功能存在的情况下，AAV2病毒p40启动子驱动cap基因表达(正向转录)并且细胞类型特异性转录物被抑制，从而导致成功制备包含AAV-TRADE载体基因组的重组AAV载体。在转导特定细胞类型后，细胞类型特异性增强子-启动子被激活，以驱动eGFP和反义cap mRNA序列的表达，而p40启动子的转录活性在转导的细胞中由于缺乏腺病毒辅助功能而保持无活性。整个cap基因ORF可以通过使用以细胞类型特异性方式表达的反义cap基因mRNA作为模板的逆转录(RT)-PCR进行回收。我们已经观察到，即使存在由于HEK293细胞中人突触蛋白I基因(hSynI)增强子-启动子的泄漏表达而表达的反义mRNA转录物，也可以以高水平成功制备重组AAV载体。我们还观察到，即使我们使用驱动反义AAV cap mRNA转录物的高水平表达的CAG启动子，也可以以高滴度成功地制备重组AAV载体。

图3靶向脑神经元的TRADE系统的验证。(A)AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE载体基因组的图。(B)为了验证TRADE系统，将该AAV载体基因组作为单链DNA基因组包装到AAV-PHP.B衣壳中，并将所得AAV载体以每只小鼠3×10¹¹个载体基因组(vg)的剂量静脉注射到两只8周大的C57BL/6J小鼠体内。注射后12天收获脑组织。来自一只动物的脑组织用4％多聚甲醛固定，用于免疫荧光显微镜检查，来自另一只动物的脑组织未固定，用于AAV载体基因组DNA和RNA的分子分析。(C)用抗GFP抗体染色的脑切片的免疫荧光显微镜图像证实了细胞类型特异性增强子-启动子驱动的转录物的表达。(D)在神经元中特异性观察到hSynI增强子-启动子驱动的GFP表达(抗HuC/D+)。(E)RT-PCR用于回收全长cap ORF序列(RT+)。RT-，无逆转录酶对照；Plas，使用包含AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE载体基因组序列的质粒模板通过DNA-PCR获得的阳性对照；NT，无模板PCR照。(F)RT-PCR产物的Sanger测序显示了hSynI增强子-启动子表达的反义转录物中MVM内含子的预期剪接(SEQ ID NO:190)。外显子-外显子接头(junction)以灰色突出显示。(G)Sanger测序证实了PHP.B肽的插入(以灰色突出显示)(SEQID NO:191)。

图4 AAV9 cap ORF反义mRNA的剪接。两个细胞系HEK293和Neuro2a用含有或不含有GFP报告基因的含有TRADE构型中的AAV9 cap ORF的质粒转染。它们在图中分别表示为“GFP TRADE”和“TRADE”。转染后3天收获细胞，提取RNA，并使用一组扩增全长cap ORF序列的PCR引物进行RT-PCR。我们没有回收到预期的2.4kb大小的扩增子，如阳性对照(PC)泳道所示，我们一致地回收到约0.7kb的扩增子。这些RT-PCR产物的Sanger测序鉴定出与图5所示的AAV9 cap ORF的1.7kb区域的剪接一致的截断。PC，使用包含AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE载体基因组序列的质粒模板的阳性对照；NC，无模板PCR对照。

图5在源自于AAV9cap基因的反义mRNA中鉴定的内含子(SEQ ID NO:192)。当AAV-PHP.Bcap基因序列在HEK293细胞或Neuro2a细胞中在神经元特异性人突触蛋白I(hSynI)增强子-启动子控制下以反义方向被转录时，鉴定了剪接事件与隐蔽的剪接供体和剪接受体位点(也请参考图6)。带下划线的序列表示在AAV9 cap ORF内发现的内含子。在小鼠脑神经元中未观察到这种剪接事件。应该注意的是(1)尽管hSynI增强子-启动子已被用作神经元特异性元件，但已证明其可以驱动HEK293细胞中的渗漏表达；(2)用于内含子剪接实验的AAV9 cap ORF序列在C端附近具有以下沉默突变：gaaccccgccccattggcacGCgTtacCTGACTCGTAATCTGTAA(SEQ ID NO:1)。内含子序列标有下划线，已引入内含子中以创建MluI(ACGCGT)识别位点的沉默突变以大写字母表示。

图6具有以反义方向存在于AAV cap ORF中的外显子-内含子接头的共同特征的隐蔽的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)位点。使用多序列比对程序(SEQ ID NO 223-316)比对源自于122个天然存在的AAV毒株(血清型和变体)的cap基因的核苷酸序列。在AAV9 capORF衍生的反义mRNA中鉴定的外显子-内含子接头用实线表示。剪接受体区域中的虚线表示AAV cap ORF中假定的剪接受体位点，其不含有从序列保守性所预期的位置处的剪接受体AG/TC序列。剪接供体区域中的虚线表示AAV3 cap ORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接供体位点(请参阅图7)。GT/CA剪接供体位点和AG/TC剪接受体基序，随后一串T，是外显子-内含子接头的共同特征，并且在许多AAV毒株中都非常保守。在AAV1 cap ORF中也已经鉴定了在此图中显示的AAV9 cap ORF中已鉴定的剪接供体位点和剪接受体位点。对于AAV1、AAV3、AAV5和AAV9以外的血清型，目前正在研究AAV cap ORF的反义mRNA中的剪接事件。突出显示的变体是常见的AAV血清型。

图7源自于AAV3 cap基因的反义mRNA中鉴定的内含子。pAAV3-hnLSP-MCS-TRADE2是携带具有MVM内含子(hnLSP)的置于肝特异性增强子-启动子下的野生型AAV3 cap ORF的质粒。AAV3 cap ORF的核苷酸序列与自然鉴定的AAV3的核苷酸序列相同。HepG2细胞，人肝癌细胞系用质粒pAAV3-hnLSP-MCS-TRADE2转染。然后通过RT-PCR分析源自于AAV3 cap ORF的反义mRNA。两种截短的RT-PCR产物的序列在PCR产物的平端TOPO克隆之后通过Sanger测序被确定，这显示了在反义AAV3 cap ORF内发现的内含子(图A和图B，SEQ ID NO:193)。内含子序列是带下划线的小写字母。发现最上游的剪接供体位点距离AAV9 cap ORF中鉴定的剪接供体位点仅3bp，如图6中的虚线所示。发现最下游的剪接受体位点位于AAV9 cap ORF的剪接受体位点上游约80bp。请注意，也已在AAV1 cap ORF中鉴定了在AAV3 cap ORF中鉴定的所有剪接供体位点和剪接受体位点。

图8。AAV cap ORF中存在的其他隐蔽的剪接受体位点。(A和B)使用多序列比对程序比对源自于122个天然存在的AAV毒株(血清型和变体)的cap基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:317-420)。AAV3 cap ORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接受体位点处的外显子-内含子接头用实线表示。图A中的虚线表示实验确定的剪接受体位点附近的替代的假定的剪接受体位点。AG/TC剪接受体位点，随后一串T，是剪接受体位点处的外显子-内含子接头的共同特征，并且在许多AAV毒株中都非常保守。AAV3 cap ORF被突出显示。也已经在AAV1 cap ORF中鉴定了图A和图B中显示的AAV3 cap ORF中鉴定的剪接受体位点。至于AAV5 cap ORF，在反义mRNA转录中的任何位点处都没有观察到剪接事件。对于AAV1、AAV3、AAV5和AAV9以外的血清型，目前正在研究AAV cap ORF的反义mRNA中的剪接事件。

图9 AAV cap ORF中存在的其他潜在剪接供体位点。使用多序列比对程序比对源自于122个天然存在的AAV毒株(血清型和变体)的cap基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:421-461)。在AAV3 cap ORF衍生的反义mRNA中鉴定的剪接供体位点处的外显子-内含子接头用实线表示。该位置的GT/CA剪接供体共有序列被仅一半的AAV毒株保留。在AAV1 cap ORF中已鉴定该剪接供体位点。

图10在AAV1 cap ORF中鉴定的剪接供体和剪接受体位点。显示了AAV1 cap ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO:194)。通过hSynI增强子-启动子在人胚胎肾(HEK)293细胞或Neuro2a细胞中以反义方向表达AAV1 cap ORF。然后通过RT-PCR分析源自于AAV1 cap ORF的反义mRNA。RT-PCR产物的序列在PCR产物的平端TOPO克隆之后通过Sanger测序确定，这显示了AAV1 cap ORF内发现的内含子。在反义AAV1 cap mRNA中鉴定的外显子-内含子接头以AG/TC表示剪接供体位点，以GT/CA表示剪接受体位点。大写的AG/TC和GT/CA分别是内含子5’端和3’端的两个共有核苷酸。由于剪接发生在ORF的反义mRNA中，内含子序列位于上述序列中以各种组合的CT(剪接受体)和AC(剪接供体)之间。没有示出关于观察到的剪接供体和受体组合的详细信息。以粗体表示的外显子-内含子接头(CT或AC)处的两个保守核苷酸是不同AAV血清型中的高度保守的那些核苷酸。带下划线的外显子-内含子连接处(CT或AC)的两个保守核苷酸是也已在反义AAV3或AAV9 cap mRNA转录物中鉴定的那些核苷酸。

图11 AAV9 cap ORF的剪接抑制诱变。在AAV9 cap ORF中的剪接受体(SA)位点和/或剪接供体(SD)位点周围引入沉默突变，以抑制在反义mRNA转录物上观察到的剪接。来自天然序列(SEQ ID NO:195，SEQ ID NO:196)剪出的内含子用下划线表示。AAV9NS1基因组(SEQ ID NO:197)在SA位点周围具有一组突变，而AAV9NS2基因组(SEQ ID NO:198)在SD位点周围具有一组突变。AAV9NS3基因组具有两组突变。右边的数字表示相对于AAV9 cap ORF的第一个核苷酸的核苷酸位置。

图12在剪接供体和/或受体位点周围引入的突变有效地抑制了源自于AAV9 capORF的反义mRNA的剪接。Neuro2a细胞用含有AAV9 cap ORF和各种潜在的TRADE构型中的剪接抑制突变(NS1-3的质粒转染。转染后3天收获RNA，并使用可以回收全长cap ORF序列的一组PCR引物进行RT-PCR。与图4中看到的结果形成鲜明对比，成功回收了全长扩增子。NS1，具有密码子修饰的剪接受体的AAV9-TRADE载体基因组。NS2，具有密码子修饰剪接供体的AAV9-TRADE载体基因组。NS3，具有密码子修饰的剪接受体和剪接供体的AAV9-TRADE载体基因组。PC，使用包含AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE载体基因组序列的质粒模板的阳性对照；NC，无模板PCR对照。

图13应用TRADE鉴定在全身AAV载体注射后对于脑神经元转导增强的AAV变体的研究设计。(A)AAV9-N272A-hSynI-GFP-TRADE-PepLib载体基因组的图。hSynI增强子-启动子用于驱动神经元中的特异性表达。肝脱靶AAV9-N272A cap(PCT/US2017/068050)作为AAV文库生成平台。由(NNK)₈编码且侧翼为甘氨酸-丝氨酸连接子(linker)(SEQ ID NO:2)的随机8氨基酸肽替代AAV9-N272A cap序列(SEQ ID NO:222)的Q588。(B)质粒文库用于使用三重转染方案生成AAV库。该文库通过PEG沉淀和两轮CsCl超速离心进行纯化，然后以3×10¹¹vg/小鼠的剂量通过尾静脉注射。注射后12天收获脑组织。使用TRIzol回收RNA，并使用RT-PCR回收包含肽插入的cap片段，随后包含肽插入的cap片段被克隆回AAV载体质粒骨架。在C57BL/6J小鼠中重复3轮选择。同时，使用2.7×10¹²vg/kg的剂量在恒河猴中进行单轮选择。

图14通过AAV RNA Barcode-Seq验证小鼠和非人灵长类动物中26种新型AAV衣壳的神经元转导。(A)双链(ds)AAV-hSynI-GFP-BC载体的图谱。一对两个12个核苷酸长的DNA条码(VBCx-L和VBCx-R)置于人类突触蛋白I(hSynI)基因增强子-启动子下。这两种病毒条码(VBC)可以在hSynI增强子-启动子有活性的细胞(即神经元)中特异性表达为转录物。(B)在C57BL/6J和BALB/cJ小鼠中由TRADE鉴定的26种新型AAV变体HN1至HN26(小鼠中鉴定的5种变体和非人灵长类动物中鉴定的21种变体)和3种对照AAV衣壳(AAV9、AAV9-N272A和AAV-PHP.B)的神经元转导。包含由TRADE鉴定的26种新型AAV变体(由TRADE在小鼠中鉴定的5个变体和由TRADE在非人灵长类动物中鉴定的21个变体)的带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BC文库(dsAAV-hSynI-GFP-BCLib)和对照AAV衣壳(AAV9、AAV9-N272A和AAV-PHP.B)以每只小鼠5×10¹¹vg的剂量静脉注射到三只成年雄性C57BL/6J小鼠和三只成年雄性BALB/cJ小鼠中。注射后两周，收获各种组织并通过AAVRNA Barcode-Seq针对AAV载体基因组转录水平上的转导分析各种组织。转导水平表示为相对于参考对照AAV9的表型差异(PD)值。HN1至HN26变体的AAV衣壳氨基酸序列信息见表3。(C)恒河猴的海马体中26个新型AAV变体和3个对照AAV衣壳的神经元转导。将相同的带DNA/RNA条码的AAV文库以2×10¹³vg/kg的剂量静脉注射到一只幼年雄性恒河猴体内。注射后两周，收获了不同的脑区域，并通过AAVRNABarcode-Seq针对转导分析不同的脑区域。(D)在用于图C的单只恒河猴的12个不同脑区域中通过AAVRNA Barcode-Seq分析3种TRADE变体HN1、HN2和HN3以及AAV-PHP.B的相对神经元转导效率。在图B、图C和图D中，虚线表示AAV9的PD值(即1.0)。

图15使用传统的eGFP报告载体和组织学定量验证小鼠中AAV9-N272A-HN1的增强神经元转导。我们制备了包含hSynI增强子-启动子(dsAAV-hSynI-eGFP)控制下的表达eGFP的自我互补AAV基因组的AAV9、AAV-PHP.B和AAV9-N272A-HN1载体。将纯化的载体以3×10¹¹vg/小鼠的剂量通过尾静脉施用至8周大雄性C57BL/6J或BALB/cJ小鼠(n＝4只小鼠/载体/小鼠品系)体内。注射后三周，小鼠经心脏灌注4％多聚甲醛，并对脑组织进行免疫组织化学处理。(A)自互补hSynI-eGFP载体基因组的图。(B)用抗GFP抗体染色的矢状切片的代表性瓷砖式扫描图像。(C)基于四个脑区域中表达eGFP和NeuN的细胞的自动计数的(B)中的神经元转导的定量。(D)(B)和(C)中自动计数过程的验证。显示了来自视皮质的代表性20×共聚焦图像。比例尺＝100m。(E)基于盲观察者对表达eGFP和NeuN的细胞的手动计数的(D)中的神经元转导的定量。误差棒代表平均值+/-SEM。***p<0.001。

图16使用已附加表位的eGFP报告载体验证恒河猴中相对于AAV9的增强的AAV9-N272A-HN1转导。(A)用于该研究的AAV-CAG-nlsGFP载体。我们制备了4个AAV载体：AAV9-CAG-FLAGnlsGFP-BCLib、AAV9-CAG-HAnlsGFP-BCLib、AAV9-N272A-HN1-CAG-FLAGnlsGFP-BCLib和AAV9-N272A-HN1-CAG-HanlsGFP-BCLib。nlsGFP(带有源自于SV40大T抗原的核定位信号的eGFP)在N端用FLAG标签或HA标签进行标记。每个载体都是带DNA/RNA条码的文库，其包含9种不同的带DNA/RNA条码的病毒克隆的约1:1混合物；但是，本研究中未使用此特征。图A中描绘的上半部分的两个载体以1:1比例混合以制成AAV文库1(AAVLib1)，下半部分的两个载体以1:1比例混合以制成AAV文库2(AAVLib2)。在该实验方案中，AAVLib1和AAVLib2各自包含1:1比例的表达带有已附加表位的nlsGFP的AAV9载体和AAV9-N272A-HN1载体，但衣壳-表位关系被倒置，以避免下游分析中的潜在抗体偏差。(B)来自一只接受AAVLib的动物的代表性大图拼接式扫描的(tile-scanned)脑部分。每个AAV文库以3×10¹³vg/kg的剂量静脉注射到幼年恒河猴体内。注射后3周收获组织，将其切成4毫米厚片，在4％多聚甲醛中进行固定，并用抗GFP、抗FLAG和抗HA抗体进行免疫组织化学分析。eGFP表达表明细胞被AAV9或AAV9-N272A-HN1或两者转导。FLAG染色表明AAV9衣壳介导转导，而HA染色表明AAV9-N272A-HN1介导转导。右上插图，运动皮质；右下插图，硬膜。该实验表明，与AAV9相比，AAV9-N272A-HN1比AAV9好几倍地转导脑细胞，具有强神经元趋向性。因此，就神经元转导而言，AAV9-N272A-HN1介导比AAV9高得多的神经元转导。

图17在小鼠和恒河猴种在全身递送后AAV9-N272A-HN1向主要外周器官的生物分布。我们使用AAVDNA Barcode-Seq确定由dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库(图A、图B和图C)中包含的每个AAV衣壳递送的每个外周器官中的AAV载体基因组DNA的相对丰度。正如前面所解释的，在施用dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库后从各种组织中提取包含小鼠和非人灵长类动物中通过TRADE鉴定的26个AAV变体的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库以及对照AAV9、AAV9-N272A和AAV-PHP.BDNA(见表3)，并对其进行AAV DNA Barcode-Seq分析。我们还使用AAVRNABarcode-Seq确定图16A(图D)中描述的静脉注射有ssAAV-CAG-nlsGFP-BCLib文库的恒河猴的每个外周器官中与AAV9相比的相对转导效率。(A)在C57BL/6J小鼠、BALB/cJ小鼠和恒河猴中AAV9-N272A、AAV-PHP.B和TRADE变体相对于AAV9向肝的生物分布。(B)在C57BL/6J小鼠和BALB/cJ小鼠(n＝3只小鼠/品系)中AAV9-N272A-HN1的向除肝外的主要外周器官的生物分布。(C)基于dsAAV-hSynI-GFP-BC分析，在恒河猴(n＝1)中AAV9-N272A-HN1的向除肝外的主要外周器官的生物分布。对于该实验，对从如图14D所示的注射有dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库的一只恒河猴收集的样本进行AAVDNA Barcode-Seq分析。(D)基于ssAAV-CAG-nlsGFP-BC分析，在恒河猴中AAV9-N272A-HN1向肝以外的主要外周器官的生物分布(n＝2)。对于该实验，对从如图16A所示的注射有ssAAV-GAG-nlsGFP-BCLib载体的恒河猴收集的样品进行AAV RNA Barcode-Seq分析。误差棒代表平均值+/-SEM。与AAV9衣壳相比，AAV9-N272A-HN1衣壳以较低程度转导外周器官。

图18在小鼠全身施用后AAV9-N272A-HN1具有高度亲神经性。在强遍在CAG启动子控制下表达nlsGFP的AAV9和AAV9-N272A-HN1载体以3×10¹¹vg/小鼠的剂量静脉注射到8周大雄性BALB/cJ小鼠中。注射后12天收获组织，并通过用抗GFP和抗NeuN抗体的免疫染色分析组织。(A)本研究中使用的单链(ss)AAV-CAG-nlsGFP载体基因组的图。(B)来自用AAV9-N272A-HN1-CAG-nlsGFP转导的小鼠大脑皮层的代表性图像。绝大多数用AAV9-N272A-HN1-CAG-nlsGFP转导的细胞对神经元标记NeuN也呈阳性。比例尺＝100m。(C)AAV9和AAV9-N272A-HN1衣壳的神经元特异性。通过将双阳性细胞(eGFP+/NeuN+)的数量除以GFP+细胞的总数来确定神经元特异性的定量。与AAV9(56％)相比，AAV9-N272A-HN1对神经元具有高度特异性(96％)。

具体实施方式

在一些实施方案中，本公开提供了一种TRADE系统，其允许使用以细胞类型特异性或遍在方式表达的cap ORF的反义mRNA的AAV衣壳的定向进化。这样的系统不需要Cre转基因动物。因此，它可以应用于大型动物包括非人灵长类动物的细胞类型特异性AAV衣壳进化，对于这些动物，Cre转基因品系是不容易获得的。任何细胞类型特异性或组织/器官特异性增强子/启动子或遍在增强子/启动子都可以很容易地应用于所述系统且无需转基因。细胞类型特异性选择在mRNA水平给出。在某些实施方案中，多个定向进化方案可以组合成一个定向进化方案。例如，可以在单个动物中同时进行基于细胞类型特异性转基因mRNA表达的神经元特异性AAV衣壳、星形胶质细胞特异性AAV衣壳、少突胶质细胞特异性AAV衣壳和小胶质细胞特异性AAV衣壳的选择。

在一些实施方案中，本公开提供了一种有义链TRADE系统，该系统允许使用能够在靶细胞中表达AAV衣壳蛋白的细胞类型特异性或遍在方式表达的cap ORF的mRNA的AAV衣壳的定向进化。有义链TRADE与本文提供有数据的反义链TRADE具有相同的优势，因为它不需要Cre转基因动物，在mRNA水平上给出细胞类型特异性选择，并且能够组合多种定向进化方案进入单个动物中完成的定向进化轮。然而，可能的缺点是免疫原性AAV衣壳蛋白可能不可避免地在靶细胞中持续表达，这可能会导致衣壳选择过程中出现不期望的结果。

在一些实施方案中，本公开内容还提供了新型AAV衣壳。在某些实施方案中，这些新型AAV衣壳在C57BL/6J小鼠中在静脉注射后比AAV9好几倍地转导脑神经元。在某些实施方案中，新型AAV衣壳在C57BL/6J小鼠中在静脉注射后比AAV9好高达8倍地转导。神经元转导水平与AAV9相比可极大大提高，尽管它们可能无法达到AAVPHP.B获得的水平。在某些实施方案中，新型AAV衣壳可以比AAVPHP.B更有效地转导脑神经元。

在一些实施方案中，本公开提供了新型AAV衣壳，其在BALB/cJ小鼠中在静脉注射后可比AAV9好几倍地转导脑神经元。在某些实施方案中，新型AAV衣壳在BALB/cJ小鼠中在静脉注射后可以比AAV9好高达7倍地转导脑神经元。转导水平远高于AAVPHP.B。

在一些实施方案中，本公开提供了新型AAV衣壳，其在恒河猴中在静脉注射后可以比AAV9好几倍地转导脑神经元。在某些实施方案中，在恒河猴中在静脉注射后新型AAV衣壳可以比AAV9好高达4倍地转导脑神经元。这些转导水平好于AAVPHP.B。

在一些实施方案中，本公开内容提供了AAV衣壳，其可以比AAV9好几倍地转导具有神经元细胞标志物表达的肺细胞。在某些实施方案中，AAV衣壳可以比AAV9好高达17倍地转导此类细胞。

在一些实施方案中，新型AAV衣壳表现出肝脱靶表型。

在一些实施方案中，本公开提供了在以反义方向表达时不被剪接的密码子修饰的AAV cap序列。我们观察到未修饰的AAV cap ORF在以反义方向(例如，AAV1、AAV3和AAV9)表达时会被剪接。相反，本公开中描述的一些密码子修饰的AAV cap ORF没有被剪接。基于我们对假定的剪接供体位点和剪接受体位点的了解，设计这种非剪接版本的AAV cap ORF成为可能。当cap基因的突变发生在cap ORF的广泛区域时，使用这种非剪接cap ORF可用于使用TRADE系统的定向进化。

如本文所用，术语“AAV载体”是指包含或源自于AAV组分并且适合感染哺乳动物细胞，包括人类细胞；多种组织类型中的任一种，例如脑、心脏、肺、骨骼肌、肝、肾、脾或胰腺，无论是体外的还是体内的。术语“AAV载体”可用于指包含至少编码目的蛋白质的核酸分子的AAV型病毒颗粒(或病毒粒子)。

此外，本文公开的AAV可源自于包括血清型的组合(例如，“假型”AAV)的各种血清型，或源自于各种基因组(例如，单链或自互补)。在特定实施方案中，本文公开的AAV载体可包含所需蛋白质或蛋白质变体。如本文所用，“变体”是指被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可具有“非保守性”变化，例如用色氨酸替代甘氨酸。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入，或两者都有。

本文提供了编码本公开的蛋白质的核苷酸序列，例如多核苷酸。本公开的核苷酸可由RNA或DNA组成。本公开还包括在序列上与本文公开的多核苷酸互补的那些多核苷酸。

由于遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸序列可以编码本公开的蛋白质。此外，产生编码与本文公开的蛋白质相同或基本相同的蛋白质的替代多核苷酸序列完全在本领域技术人员的技能范围内。这些变体或替代的多核苷酸序列在本公开的范围内。如本文所用，提及“基本上相同的序列”是指编码不消除由本公开的多核苷酸编码的多肽的可检测性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的一个或多个序列。

本公开还包括本文公开的多核苷酸和多肽的变体。变体序列包括序列的一个或多个肽或核苷酸已被取代、删除和/或插入的那些序列。

本公开的多核苷酸和多肽序列也可以根据与本文所述的某些多核苷酸和多肽的特定同一性和/或相似性来定义。序列同一性通常大于60％，优选大于75％，更优选大于80％，甚至更优选大于90％，并且可以大于95％。序列的同一性和/或相似性可以是与本文公开的序列相比49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％,64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。除非另有说明，如本文所用，两个序列的序列同一性和/或相似性百分比可以使用Karlin和Altschul(1990)，修改为Karlin和Altschul(1993)的算法确定。这样的算法被合并到Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12，执行BLAST搜索以获得具有所需序列同一性百分比的序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如Altschul等人(1997)所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。

如本文所公开的制备AAV载体的方法是本领域众所周知的，包括例如使用包装细胞、辅助病毒或质粒和/或杆状病毒系统的方法。参见例如amulski等人,J.Virology 63,3822(1989)；Xiao等人,J.Virology 72,2224(1998)；Inoue等人,J.Virology 72,7024(1998)；WO1998/022607；和WO2005/072364。

制备假型AAV载体的方法(参见，例如，WO00/28004)也是已知的，以及AAV载体的各种修饰或制剂以降低它们在体内施用时的免疫原性(参见，例如，WO01/23001；WO00/73316；WO04/112727；WO05/005610；和WO99/06562)也是已知的。在一些实施方案中，AAV载体可以从各种血清型的AAV制备或衍生，各种血清型的AAV可以混合在一起或与其他类型的病毒混合以产生嵌合(例如，假型)AAV病毒。

在特定实施方案中，AAV载体可以是人血清型AAV载体。在此类实施方案中，人AAV可源自于任何已知血清型，例如源自于血清型1-11例如源自于AAV1、AAV2、AAV4、AAV6或AAV9中的任何一种。

本文公开的AAV载体可以包括编码目的蛋白质的核酸。在各种实施方案中，所述核酸还可以包括一个或多个调控序列，允许目的蛋白质表达和在一些实施方案中分泌，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(“IRES”)、编码蛋白质转导结构域(“PTD”)的序列、2A肽等。因此，在一些实施方案中，所述核酸可包含与编码序列可操作地连接以引起或改善目的蛋白质在感染细胞中表达的启动子区。例如，这样的启动子可以是遍在的、细胞或组织特异性的、强的、弱的、受调节的、嵌合的等，以允许在受感染的组织中有效和稳定地产生蛋白质。启动子可以与编码的蛋白质同源，也可以是异源的，尽管在公开的方法中通常使用的启动子在人细胞中是有功能的。受调控的启动子的实例包括但不限于含有Tet开/关元件的启动子、雷帕霉素诱导型启动子、它莫西芬诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。可以使用的其他启动子包括对诸如肾、脾和胰腺的组织具有组织特异性的启动子。遍在启动子的实例包括病毒启动子，特别是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等，以及细胞启动子，例如磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和β-肌动蛋白启动子。

在本文公开的AAV载体的一些实施方案中，一种或多种反馈元件可用于抑制目的蛋白质的过度表达。例如，AAV载体的一些实施方案可以包括一个或多个靶向外源转录物的siRNA序列。在其他实施方案中，AAV载体可包括一种或多种可被抑制性转录因子识别的其他启动子。在各种实施方案中，本文公开的AAV载体可以包含构建体，该构建体可以产生可以将目的蛋白质的表达水平维持在生理水平的体内平衡的反馈回路。

在本文公开的AAV载体的一些实施方案中，基因组编辑机制可用于以位点特异性方式遗传修饰细胞基因组DNA或mRNA转录物。Komor等人，Cell 168,20-36(2017)；和Katrekar等人，Nature Methods 16：239-242，2019。例如，AAV载体的一些实施方案可以包括CRISPR相关酶，例如Cas9、DNA碱基编辑器、RNA编辑酶和/或向导RNA(gRNA)以位点特异性方式修饰细胞中的核酸。此外，AAV载体可包含用于基因组编辑的同源修复模板(HDR)。

在各种实施方案中，本文公开的AAV载体可包含核酸，该核酸可包含允许所编码蛋白质分泌的前导序列。在一些实施方案中，目的转基因与编码分泌信号肽的序列(通常位于分泌多肽的N-末端)的融合可以允许以可以从转导的细胞分泌的形式产生治疗性蛋白质。这种信号肽的例子包括白蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽。

如本文所述，通过非侵入性技术通过某些AAV载体例如具有AAV9序列的非AAV9载体的外周施用，可在脑、心脏、肺、骨骼肌、肾、脾或胰腺中实现目的治疗性蛋白质的有效和长期表达。这种外周施用可以包括不需要直接注射到脑、心脏、肺、骨骼肌、肾、脾或胰腺中的任何施用途径。更具体地，外周施用可包括全身注射，例如肌肉内、血管内(例如静脉内)、腹膜内、动脉内或皮下注射。在一些实施方案中，外周施用还可以包括口服施用(参见例如WO96/40954)、使用植入物递送(参见例如WO01/91803)或通过呼吸系统滴注施用，例如使用喷雾剂、气雾剂或任何其他适当的制剂。

在各种实施方案中，AAV载体的所需剂量可由技术人员例如，根据疾病状况、受试者、治疗方案等进行调整。在一些实施方案中，每剂量施用10⁵至10¹²个病毒基因组，例如10⁶至10¹¹、10⁷至10¹¹、或10⁸至10¹¹。在其他实施方案中，用于实现治疗效果的示例性剂量可以包括至少约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰或10¹¹病毒基因组或更多的病毒滴度。病毒滴度也可以用转导单位表示，其可以由本领域技术人员容易地计算出。

在各种实施方案中，本文公开的AAV载体可以以任何合适的形式施用，例如，以液体溶液或悬浮液的形式，以适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，以凝胶形式或以乳液形式。载体可以与任何合适的药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、稀释剂等一起配制。例如，对于注射，合适的载体或稀释剂可以是等渗溶液、缓冲液、无菌和无热原的水，或者，例如，无菌且无热原的磷酸盐缓冲盐溶液。对于吸入，载体可以是颗粒形式的。

载体可以以“治疗有效”量施用，例如足以减轻(例如，减少、降低)与疾病状态相关的至少一种症状或提供改善受试者的病况的量。在一些实施方案中，可以进行重复施用，例如使用相同或不同的外周施用途径和/或相同的载体或不同的载体。

实施例

以下示例仅用于说明。根据本公开，本领域技术人员将认识到，无需过度实验即可实现所公开主题的这些示例和其他实施方案的变体。

我们在C57BL/6J小鼠和恒河猴中应用了TRADE系统，以鉴定在全身递送后有效转导脑神经元的新型AAV衣壳。TRADE系统利用包含侧翼为ITR序列的重叠双顺反子AAV基因组的质粒构建体(图2A)。在有义方向上，AAV2 p40启动子驱动AAV cap基因表达以促进病毒颗粒的有效制备(图2B)。在反义方向，细胞类型特异性增强子-启动子(例如人突触蛋白I(hSynI)增强子-启动子)驱动转录物的表达，该转录物编码GFP和反义cap序列，终止于嵌入AAV2基因组中存在的内含子中的多腺苷酸化信号(poly A)(图2B)。利用TRADE构建体作为克隆骨架，我们生成了基于肝脱靶AAV9-N272A(PCT/US2017/068050)cap基因平台的AAV文库，该平台包含在带有AAV9衣壳中的Q588位置处取代的甘氨酸-丝氨酸连接子(5’-GGGS；3’-GGGGS)的随机8聚体肽。通过RT-PCR从脑组织中回收衣壳序列作为反义cap ORF mRNA，在特定细胞类型(例如神经元)中进行体内选择。这种方法确保回收的序列仅源自于能够介导我们的目的受感染细胞中RNA表达的AAV变体。当使用hSynI增强子-启动子时，只能挽回能够转导神经元的AAV衣壳序列，从而能够对AAV衣壳进行神经元特异性选择。

我们首先测试了TRADE系统使用AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE载体从细胞类型特异性反义mRNA中回收AAV cap基因序列的能力(图3)。hSynI增强子-启动子驱动的GFP表达盒以TRADE构型被纳入包含AAV-PHP.B衣壳基因的AAV载体基因组中(图3A)。该载体基因组被包装到AAV-PHP.B衣壳中，所得AAV载体被静脉注射到两只8周大的雄性C57BL/6J小鼠体内(图3B)。注射后十二天，收获脑组织。通过免疫荧光显微镜分析用4％多聚甲醛固定的组织。未固定的组织用于RNA提取和RT-PCR分析。我们证实eGFP仅在神经元中表达(图3C和图3D)，表明从cap基因转录的反义mRNA以细胞类型特异性方式表达。我们通过RT-PCR有效地回收了cap基因的反义mRNA(图3E)。反义mRNA特有的剪接点的Sanger测序证实RT-PCR产物确实源自于hSynI增强子-启动子驱动的反义mRNA(图3F)。此外，Sanger测序证实了PHP.B肽插入的序列(图3F)。总之，这些观察结果确立了TRADE系统从AAV载体转导的脑神经元中表达的hSynI增强子-启动子驱动的反义mRNA中成功回收AAV cap序列的能力。

随着TRADE系统的成功建立，我们进行了两次AAV衣壳定向进化实验；一次使用了8周大的雄性C57BL/6J小鼠，另一次使用了一只8个月大的雄性恒河猴。我们制备了AAV9-N272A-hSynI-GFP-TRADE-Lib文库，该文库由在Q588的位置具有GGGS(N₈)GGGGS(SEQ IDNO:2)肽插入的AAV9衍生的突变衣壳组成，其中N₈代表由(NNK)₈编码的随机8聚体肽。对于肽插入，用每个肽序列替换Q588。AAV文库的多样性至少为10⁷。在小鼠定向进化实验中，我们通过尾静脉以每只小鼠3×10¹¹载体基因组(vg)的剂量输注AAV文库。对于第二轮选择，我们使用两只小鼠以1×10¹²、1×10¹¹、1×10¹⁰或1×10⁹载体基因组(vg)的剂量注射AAV文库。对于第三轮选择，我们使用两只小鼠以1×10¹¹vg的剂量注射AAV文库。我们在注射后十二天收获脑组织，并将它们分成三个区域，即大脑、小脑和脑干。只有大脑样本用于定向进化实验。我们从大脑中提取总RNA，使用oligo dT引物反转录RNA，并通过一对cap基因特异性PCR引物扩增包括侧翼区域的肽区域。然后使用RT-PCR产物创建下一个AAV9-N272A-hSynI-TRADE-Lib质粒文库，随后将其用于产生下一个AAV9-N272A-hSynI-TRADE-Lib病毒文库。对于第二轮选择和第三轮选择，我们包装了没有GFP ORF的AAV9-N272A-hSynI-TRADE-Lib基因组。在非人灵长类动物定向进化实验中，我们通过隐静脉以每千克2.0×10¹²vg的剂量输注AAV9-N272A-hSynI-GFP-TRADE-Lib文库。注射后12天，收获全脑并使用脑模具对其进行切片，用RNAlater(Thermo Fisher Scientific)进行处理，并进行冷冻保存。然后从以下脑区域提取总RNA：额皮质、枕叶皮质区、小脑(浦肯野和颗粒层)、髓质、脑桥、额皮质、下丘脑、丘脑、扣带回、尾状核、硬膜、海马和视前区。我们以与上述相同的方式通过RT-PCR挽回肽序列，除了我们执行嵌套PCR以获得足够用于下游Illumina和Sanger测序程序的PCR产物。对于某些样品，我们将第一次PCR产物直接克隆到质粒骨架中，无需对Sanger测序进行嵌套PCR。在小鼠的三轮选择(表1)和非人灵长类动物的一轮选择之后，我们确定了许多插入AAV9衣壳的潜在转导增强肽(表2)。然后，我们生成了带条码的AAV文库，并利用Nakai实验室先前开发的DNA/RNA Barcode-Seq技术(Adachi等人Nat Commun 5,3075(2014)；和PCT/US2017/068050)比较在两种常用小鼠品系(C57BL/6J和BALB/cJ)和一只恒河猴中静脉施用后26种选定的新型AAV变体的转导效率、趋向性/生物分布和药代动力学(表3)。结果，我们发现：(1)由TRADE技术鉴定的一些新型变体，特别是AAV9-N272A-TTNLAKNS(HN1)和AAV9-N272A-QQNGTRPS(HN2)，在C57BL/6J小鼠的脑中表现比AAV9好高达8倍(图14B和图14C)。对于HNx名称，请参阅表3。(2)如Hordeaux等人(Hordeaux等人2018)先前报道的那样，AAV-PHP.B仅以与AAV9相当或低于AAV9的水平转导BALB/cJ小鼠的脑(图14B和图14C)，证明了针对AAV-PHP.B的强力嗜神经性增强的小鼠品系依赖性。(3)相比之下，AAV9-N272A-TTNLAKNS(HN1)和AAV9-N272A-QQNGTRPS(HN2)在BALB/cJ小鼠中保留了强力神经元转导，显示出比AAV9好7倍的转导(图14B)。(4)在恒河猴中，许多新型AAV突变体在某些脑区域表现出增强的神经元转导，比AAV9高达4倍，而AAV-PHP.B类似于或低于AAV9转导非人灵长类动物的脑。特别是，AAV9-N272A-TTNLAKNS(HN1)在多个脑区域中最好地转导非人灵长类动物的脑(图14C和图14D)。(5)包括HN1、HN2和HN3的所有AAV9-N272A衍生变体在小鼠和恒河猴中都显示出不同程度的肝脱靶特性(图17A)。(6)在小鼠中AAV9-N272A-TTNLAKNS(HN1)和AAV9-N272A-QQNGTRPS(HN2)可以比AAV9好高达17倍地转导在肺中具有hSynI增强子-启动子转录活性的细胞(图17B、表4和表6)。(7)AAV9-N272A-TTNLAKNS(HN1)显示出与AAV9相比程度较小的载体基因组向外周器官的传播(图17C和图17D)。AAV Barcode-Seq数据总结在表4至表9中。表4至表9中呈现的代表性数据也在图14和图17中以图表示出。

表1 hSynI-TRA1系统使用靶向小鼠脑神经元的AAV9-N272N-GGGS(N₈)GGGGS文库鉴定的肽序列。

该表列出了三轮选择中的每一轮之后AAV9-N272A上的肽插入。括号中的数字表示三轮选择后鉴定的总共69个肽中每个肽的频率。没有编号的肽只被发现一次。通过Sanger测序确定肽区域的序列。实际的肽序列是侧翼为甘氨酸-丝氨酸连接子的随机八肽，使得Q588位置被GGGS(N₈)GGGGS取代。

例如，

“-TNHQSAGGGSTTNLAKNSGGGGSAQAQTG-”用TTNLAKNS代表和

“-TNHQSAGGGSQQNGTRPSGGGGSAQAQTG-”用QQNGTRPS代表。

表2通过hSynI-TRADE系统使用靶向恒河猴脑神经元的AAV9-N272A-GGGS(N₈)GGGGS文库鉴定的肽序列。

通过Illumina测序或Sanger测序确定肽区域的序列。实际的肽序列是侧翼为甘氨酸-丝氨酸连接子的随机八肽，使得Q588位置被GGGS(N₈)GGGGS取代。这些肽是从额皮质、枕叶皮质区、下丘脑和丘脑中回收的。

表3用于每个AAV毒株的表型确定的带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库中包含的29个AAV衣壳的列表。

新型AAV9-hSynI-TRADE衍生的衣壳变体是从小鼠中的三轮选择(表1)和恒河猴中的一轮选择(表2)后鉴定的那些变体中选出的。每个回收的AAV变体都被分配了一个缩写，HNx。构建了包含带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库，使得每个AAV变体包装表达AAV变体特异性RNA条码的独特的dsAAV-hSynI-GFP-BC病毒基因组。此表中列出了每个变体(包括关键参考变体)的唯一AAV条码克隆数量。

表4在C57BL/6J小鼠中静脉施用后TRADE鉴定的AAV变体的脑神经元转导效率和生物分布。

包含26种由TRADE鉴定的新型AAV变体的带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BC文库(dsAAV-hSynI-GFP-BCLib)和对照AAV衣壳以每只小鼠5×10¹¹vg的剂量静脉注射到3只C57BL/6J小鼠中(对于文库，请参见表3)。注射后两周，各种组织被收集并分析，通过AAVRNA Barcode-Seq分析脑转导，通过AAV DNA Barcode-Seq分析向外周器官的生物分布各种组织。所有值均使用AAV9的值进行归一化(AAV9＝1.0)。

表5在C57BL/6J小鼠中静脉施用后TRADE鉴定的AAV变体的药代动力学特征。

对从注射了1×10¹³vg/kg带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库的小鼠获得的血液样本进行AAV DNA Barcode-Seq分析(见表3，n＝2)。所有值均使用AAV9的值进行归一化(AAV9＝1.0)。所有值都归一化为AAV9(AAV9＝1.0)。

表6在BALB/cJ小鼠中静脉施用后TRADE鉴定的AAV变体的脑神经元转导效率和生物分布。

包含26种由TRADE鉴定的新型AAV变体的带DNA/RNA条码dsAAV-hSynI-GFP-BC文库(dsAAV-hSynI-GFP-BCLib)和对照AAV衣壳以每只小鼠5×10¹¹vg剂量静脉注射到3只BALB/cJ小鼠中(对于文库，请参见表3)。注射后两周，各种组织被收集并分析，通过AAV RNABarcode-Seq分析脑转导以及通过AAVDNA Barcode-Seq分析向外周器官的生物分布。所有值均使用AAV9的值进行归一化(AAV9＝1.0)。

表7由AAVhSynI-RNA Barcode-Seq分析确定的静脉施用后一只恒河猴的不同脑区中的hSynI-TRADE衍生的AAV变体的转导效率

对从静脉注射了2.0×10¹³vg/kg表达在hSynI增强子-启动子控制下的RNA条码的带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库的一只恒河猴(n＝1)的不同脑区提取的RNA进行AAV RNA Barcode-Seq分析。所有值均使用AAV9的值进行归一化(AAV9＝1.0)。

表8在恒河猴中静脉施用后hSynI-TRADE衍生的AAV变体的药代动力学特征。

对从注射了2×10¹³vg/kg带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库(与表7中相同的动物)的一只恒河猴获得的血液样本进行AAV DNA Barcode-Seq分析。所有值均使用AAV9的值进行归一化(AAV9＝1.0)。

表9由AAVDNA Barcode-Seq分析确定的静脉施用后hSynI-TRADE衍生的AAV变体向恒河猴外周组织的生物分布

对从静脉注射2×10¹³vg/kg带DNA/RNA条码的dsAAV-hSynI-GFP-BCLib文库的一只恒河猴(n＝1，与表7中所示的动物相同)的各种外周组织提取的DNA进行AAV DNA Barcode-Seq分析。所有值均归一化为AAV9(AAV9＝1.0)。

表9在反义AAV cap ORF转录物中鉴定的剪接供体和剪接受体位点。

在反义AAV cap mRNA中鉴定的外显子-内含子接头周围的十个核苷酸与接头一起在中心处存在。带下划线的字母代表内含子序列。没有下划线的字母代表外显子序列。数字表示AAVcap ORF的核苷酸位置。SD，剪接供体；SA，剪接受体。请注意，AAV1的SEQ ID NO:199和AAV3的SEQ ID NO:199在序列比对上是彼此对应。同样地，AAV1的SEQ ID NO:213和AAV3的SEQ ID NO:213在序列比对上彼此对应。

在实验过程中，当AAV9 cap基因ORF在HEK293细胞或Neuro2a细胞中以反义方向表达时，大多数反义AAV9 cap基因mRNA衍生的RT-PCR产物被截短约1.7kb(图4)，尽管从AAV-PHP.B-hSynI-GFP-TRADE转导的小鼠脑组织中回收的RNA并非如此(图3)。截短的RT-PCR产物的测序显示AAV9 cap ORF内缺少1694bp长的区域(图5)。不受任何特定理论的束缚，基于该观察：我们可以鉴定具有外显子-内含子接头的共同特征的PCR产物中的剪接供体位点和剪接受体位点，截断似乎是由剪接事件引起的。有趣的是，序列比对研究表明，具有外显子-内含子连接共同特征的隐蔽的剪接供体位点和剪接受体位点也可以在许多天然AAV血清型中与AAV9 cap基因中鉴定的剪接供体位点和剪接受体位点相对应的区域中被鉴定出并且它们是高度保守的(图6)。这表明剪接可能发生在不仅AAV9而且许多其他AAV毒株的capORF衍生的反义mRNA中。迄今为止，我们已经发现，当AAV3 cap ORF衍生的反义mRNA在HepG2细胞中的人类肝特异性启动子(LSP)控制下被表达时，AAV3 cap ORF衍生的反义mRNA上会发生剪接。尽管尚未完成完整的表征，但使用反义mRNA特异性RT引物进行的初步RT-PCR产生了截短的RT-PCR产物以及全长非剪接产物。两个截短的RT-PCR产物的测序分析显示反义mRNA上存在多个剪接事件(图7)。测序比对研究鉴定了其他的潜在剪接供体位点和剪接受体位点(图8和图9)。当反义mRNA在HEK293细胞或Neuro2a细胞中被hSynI增强子-启动子转录时，我们还发现源自于AAV1 cap ORF的反义mRNA中的剪接事件(图10)。许多已鉴定的剪接供体位点(GT/CA)和剪接受体位点(AG/TC)在不同血清型中高度保守，表明这些位点在AAV血清型中也用作剪接供体位点和剪接受体位点的可能性，该可能性有待进一步研究。事实上，我们发现AAV1、AAV3和AAV9 cap ORF的反义mRNA转录物的剪接使用了几个常见的剪接供体位点和剪接受体位点(图10)。迄今为止，我们还没有发现AAV5 cap ORF的反义mRNA转录物的剪接。对于AAV1、AAV3、AAV5和AAV9以外的血清型，尚未研究AAV cap ORF的反义mRNA中的剪接事件。

cap ORF衍生的反义mRNA的潜在剪接在科学上是有趣的，但当需要从反义mRNA中回收全长cap ORF序列时，可能会阻碍TRADE系统。为了克服这个潜在的问题，我们引入了很可能破坏外显子-内含子接头和分支点的保守序列的沉默突变。为了证明这种方法的原理，我们在质粒pAAV9-N272A-PHP.B-hSyn1-GFP-TRADE中包含的AAV9 cap ORF中引入了沉默突变，该突变破坏了剪接受体(SA)共有序列(pAAV9NS1构建体)、剪接供体(SD)共有序列(pAAV9NS2构建体)，以及剪接受体和供体共有序列(pAAV9NS3构建体)。请注意，NS链代表“非剪接”。我们用来破坏这些共有序列的方法如下所述。

我们对用于人类细胞表达的AAV cap ORF序列进行密码子优化。

为了鉴定源自于cap ORF的反义mRNA上的潜在剪接供体位点和剪接受体位点，我们基于我们的实验和生物信息学观察(即，图5、图6、图7、图8、图9和图10)开发并使用了我们专有的反义mRNA上的潜在剪接供体位点和剪接受体位点数据库。

我们通过使用密码子优化的序列改变至少一个核苷酸来破坏GT(剪接供体)和/或AG(剪接受体)共有序列。如果密码子优化序列不适用，我们使用可以破坏共有序列的替代核苷酸。

我们通过基于密码子优化序列引入沉默突变来去除剪接受体位点上游的一串T。如果密码子优化序列不足以破坏一串T，我们使用替代核苷酸。

我们还尽可能避免外显子末端的G。

使用可以预测分支点的几种程序(例如，Human Splicing Finder(Desmet,Hamroun等人2009))，我们鉴定潜在的分支点并用密码子优化的序列替换它们。如果通过这种方法可获得的核苷酸变化程度不够，我们会引入替代核苷酸来破坏潜在的分支点。

使用这种方法，我们创建了AAV9NS1(SA，被破坏)、AAV9NS2(SD，被破坏)和AAV9NS3(SD和SA，被破坏)cap ORF(图9)。我们通过瞬时质粒转染在Neuro2a细胞中在hSynI增强子-启动子控制下以反义方向表达这些ORF，并通过RT-PCR分析反义转录物。该实验表明在所有NS1、NS2和NS3 cap ORF中剪接可以被有效抑制(图10)。应该注意的是，即使在cap ORF衍生的反义mRNA上发生剪接，仍然可能通过RT-PCR从前体mRNA中回收cap ORF的相对较小的肽插入区域。

本文所述的TRADE方法使用反义mRNA进行病毒蛋白质进化，以建立原理论证并显示该方法到实践的成功简化。只要可以产生病毒并且在定向进化过程中病毒蛋白在靶细胞中的潜在表达不妨碍新型衣壳的成功进化，TRADE系统也可以在有义方向上利用mRNA。

与核酸剪接和AAV相关的其他信息可以在Desmet等人,Nucleic Acids Res 37,e67(2009)；Matsuzaki等人,Neurosci Lett 665,182-188(2018)；和Hordeaux等人,MolTher 26,664-668(2018)中找到。

本公开中引用的所有参考文献均通过引用整体并入。

序列表

<110> 俄勒冈健康与科学大学

中井弘之

塞缪尔·黄

琪·阿达

<120> 用于AAV衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法

<130> 46569/702

<150> PCT/US2020/016273

<151> 2020-01-31

<150> US 62/799603

<151> 2019-01-31

<160> 463

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 内含子

<222> (1)..(27)

<400> 1

gaaccccgcc ccattggcac gcgttacctg actcgtaatc tgtaa 45

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 肽

<222> (5)..(12)

<223> 任何氨基酸

<400> 2

Gly Gly Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 3

Ala Asp Lys Pro Pro Gly Leu Ser

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 4

Ala Gly Glu Asp Gly Ser Ser Arg

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 5

Ala Leu Gly Thr Ala Thr Gln Arg

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 6

Ala Leu Asn Thr Ala Leu Val Glu

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 7

Ala Met Val Arg Leu Thr His Asn

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 8

Ala Ser Arg Asp Pro Ser Ala Thr

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 9

Asp Ala Asn Asp Ala Arg Gln Arg

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 10

Asp Leu Ala Arg Met Ala Ala Ala

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 11

Asp Gln Gly Ser Ile Thr Ala His

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 12

Asp Arg Thr Pro Gly Val Asn Val

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 13

Asp Thr Asp Thr Leu Ser Pro Gly

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 14

Glu Glu Asp Ala Gln Leu Leu Ile

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 15

Glu Lys Leu Asn Asp Trp Pro Thr

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 16

Glu Leu Asn Ser Ala Arg Gln Val

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 17

Glu Leu Gln Ser Phe Ala Gly Leu

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 18

Glu Asn Lys Ser Ala Pro Leu Pro

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 19

Glu Arg Thr Ala Val Lys Gly Asn

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 20

Gly Gly Ile Gln Thr Val Val Thr

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 21

Gly Gly Ser Pro Leu Ala His Pro

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 22

Gly Gly Thr Ala Ala Gln Gly Val

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 23

Gly Lys Met Ala Ser Gly Ser Leu

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 24

Gly Lys Gln Pro Val Gln Pro Tyr

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 25

Gly Asn Pro His Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 26

Gly Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 27

Gly Gln Arg Gly Leu Pro Ile Ala

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 28

Gly Arg Glu Pro Arg Arg Leu His

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 29

Gly Thr Pro Gln Thr Thr Lys Glu

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 30

Gly Val Thr Glu Arg Pro Asn Arg

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 31

His Leu Gly Asp Asn Leu Ala Arg

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 32

His Pro Gly Ser Gly Ala Gly Pro

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 33

His Gln Val Thr Ser Ser Gly Ala

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 34

His Val Gly Ser Gln Met His Ala

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<400> 35

Ile Gly Xaa Thr Val Pro Met Gln

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 36

Lys Phe Thr Arg Asp Gly Pro Tyr

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 37

Lys Gly Pro Ala Glu Gln Gly His

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 38

Leu Ala His Ser Pro Arg Leu Trp

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 39

Leu Glu Arg Asn Arg Asp Ser Asp

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 40

Leu Glu Thr His Thr Ser Leu Thr

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 41

Leu His Asp Gly Lys Tyr Ser Thr

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 42

Leu Lys Ala Thr Gly Arg Gly Lys

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 43

Leu Leu Pro Gly Ser Ala Asp Gly

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 44

Leu Leu Val Thr Ala Arg Ser His

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 45

Leu Pro Glu Val Glu Pro Thr Asn

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 46

Leu Pro Trp Glu Asn Ser Ser Gln

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 47

Leu Gln Arg Asn Ser Asp Ala Asn

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 48

Leu Gln Ser Ala Pro Arg Ala Thr

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 49

Met Leu Gly Ser Gln Val Pro Thr

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 50

Met Ser Gly Gln Gly Tyr Gln Ala

1 5

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 51

Asn Pro Gly Arg Asp Phe Arg Asp

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 52

Asn Gln Pro Ser Asp Tyr Val Ser

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 53

Asn Ser Val Gly Ser Ala Asp Lys

1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 54

Asn Val Gln Arg Thr Gln Arg Gly

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 55

Pro Ala Gln Leu Asn Gly Pro Arg

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 56

Pro Glu Arg Glu Arg Leu Pro Arg

1 5

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 57

Pro Gly Asn Gly Ser His Thr Met

1 5

<210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 58

Pro Ile Pro Gly Thr Pro Gln Pro

1 5

<210> 59

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 59

Pro Met Ser Val Pro Ala Ser Asn

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 60

Pro Arg Pro Thr Val Val Gly Thr

1 5

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 61

Pro Arg Thr Asn Arg Gly Pro Glu

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 62

Pro Val Ala Asn Pro Thr Thr Ala

1 5

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 63

Pro Val Leu Gly Gly Pro Pro Lys

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 64

Gln Gly Ser Arg Gln Gly Ser Ser

1 5

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 65

Gln Met Ala Glu Thr Pro Ile Ser

1 5

<210> 66

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 66

Gln Met Leu Gly Ile Gly Arg Ser

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 67

Gln Ser Gly Asp Ser Ala Leu Asn

1 5

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 68

Arg Ala Gly Leu Thr Ser Ser Glu

1 5

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 69

Arg Leu Asp Asn Thr Gly Val Gly

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 70

Arg Met Pro Gly Lys Pro Tyr Ser

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 71

Arg Val Ala Gly Ala Ser Gln Pro

1 5

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 72

Arg Val Glu Ser Ser Gln Leu Glu

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 73

Ser Ala Arg Thr Gly Ala Ser Glu

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 74

Ser Glu Arg Asn Arg Ala Ser Met

1 5

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 75

Ser Ile Asp Val Arg Met Ala Ala

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 76

Ser Arg Asp Gly His Ile Leu Arg

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 77

Ser Arg Gln Val Val Leu Pro Gly

1 5

<210> 78

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 78

Ser Ser Arg Gly Tyr Thr Ser Thr

1 5

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 79

Ser Ser Val Val Ser Gln Gly Pro

1 5

<210> 80

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 80

Ser Val Ala Glu Ser Gly Arg Glu

1 5

<210> 81

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 81

Thr Ala Leu Thr Ala Asn Thr Gln

1 5

<210> 82

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 82

Thr Glu Ser Ser Val Gly Asn Leu

1 5

<210> 83

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 83

Thr Gly Arg Glu Gly Ala Asn Leu

1 5

<210> 84

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 84

Thr Leu Ser Glu Pro Pro Lys Lys

1 5

<210> 85

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 85

Thr Asn Ala Val Ser Gly Lys Ser

1 5

<210> 86

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 86

Thr Arg Ala Pro Thr Ile His Leu

1 5

<210> 87

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 87

Thr Arg Glu Ser Thr Asp Arg Gly

1 5

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 88

Thr Val Ala Ala Ala Pro Asn Leu

1 5

<210> 89

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 89

Thr Tyr His Asn Asn Thr Pro Arg

1 5

<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 90

Val Ser Asn Ser Thr Arg Thr Ser

1 5

<210> 91

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 91

Val Thr Leu Gln Ile Asp Thr Lys

1 5

<210> 92

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 92

Trp Met Ser Arg Pro Gly Pro Thr

1 5

<210> 93

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 93

Trp Pro Tyr Arg Gly Leu Thr Gln

1 5

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 94

Trp Arg Arg Gln Gly Ser Arg Ala

1 5

<210> 95

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 95

Tyr Ala Gln Arg Phe Ala Lys Met

1 5

<210> 96

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 96

Tyr Asn Ser Pro Arg Gln Thr Val

1 5

<210> 97

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 97

Ala Pro Thr Asn Phe Ala His Pro

1 5

<210> 98

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 98

Ala Gln Thr Asn Leu Ala Ala Gly

1 5

<210> 99

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 99

Ala Ser Leu Pro Asn Leu Gly Gln

1 5

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 100

Asp Tyr Met His Asn Thr Gly Leu

1 5

<210> 101

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 101

Asp Tyr Met His Thr Thr Gly Leu

1 5

<210> 102

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 102

Glu Arg Asn Ala Trp His Ala Gly

1 5

<210> 103

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 103

Glu Thr Gln Ala Thr Pro Met Pro

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 104

Glu Trp Glu Asp Ser Ala Arg Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 105

Phe Thr Gly Asp Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 106

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 106

Phe Thr Asn Arg Thr Ser Thr Thr

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 107

Gly Asp Tyr Thr Val Gln Arg Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 108

Gly Gly Leu Arg Thr Asp Tyr Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 109

Gly Pro Gln Glu Gly Ser Glu Arg

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 110

Gly Ser Asn His Thr Gln Ser Leu

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 111

His Asp Arg Asp Thr Arg Gln Ala

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 112

Leu Asp Gln Asn Arg Arg Pro Gln

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 113

Leu Glu Gln Gln Arg Gly Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

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Leu Gly Gly Asn Ala Gln Gly Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 115

Leu Leu Val Thr Thr Arg Ser His

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

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<400> 116

Leu Val Thr Asn Thr Thr Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

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Met Glu Ser Gln Arg Ala Asn Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 118

Met Ile Ser Gln Thr Leu Met Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 119

Met Met Ser Gln Ser Leu Arg Ala

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 120

Asn Asn Val Gln Ser Ala Leu Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 121

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 122

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 123

Pro Arg Phe Asn Asn Ser Ser Leu

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 126

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 130

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 132

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 133

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 134

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 135

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 136

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 137

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 138

Ser Arg Met Gly Glu Thr Pro Gln

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 139

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 140

Thr Gly Asn Ser Pro Glu Gln Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 141

Thr His Ser Gln Gly Arg Leu Ala

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 142

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 143

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 144

Thr Arg Met Asp Glu Arg Ser Pro

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 145

Thr Thr Ala Thr Thr Ser Ile Thr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 146

Val Val Gln Gly Glu Gln Lys Arg

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 147

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 148

Trp Ser Gln Asp Ala Val Lys Gly

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 149

Trp Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 150

Ala Gly Ala Ala Tyr Thr Pro Ala

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 151

Ala Pro Ser Val Ser Arg Glu Lys

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 152

Asp Tyr Met His Lys Thr Gly Leu

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 153

Gly Gly Met Asn Glu Thr Thr Arg

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 154

Gly Gly Ser Ala Phe Val Thr Gly

1 5

<210> 155

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 155

Gly Asn Ser His Thr Gly Ser Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 156

Asn Ser Ala Arg Thr Gln Leu Ser

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 157

Pro Leu Thr Ile Leu Asn Arg His

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 158

Gln Gly Thr Arg Thr Asn Pro Pro

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 159

Gln Ser Ser Ala Met Pro Arg Asn

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 160

Ser His Asn Ser Gln Pro Val Ala

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 161

Thr Ala Gln Gly Ala Ala Phe Arg

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 162

Thr Pro Gly Leu Asn Asn Ala Arg

1 5

<210> 163

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 163

Thr Ser Leu Gly Thr Pro Glu Ala

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 164

Thr Thr Asn Leu Ala Lys Asn Ser

1 5

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 165

Trp Ser Pro Asp Ala Val Glu Gly

1 5

<210> 166

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(7)

<400> 166

Trp Thr Gly Gly Arg His Leu

1 5

<210> 167

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 167

Ala Val Ala Gly Asp Arg Leu Leu

1 5

<210> 168

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 168

Asp Leu Leu Thr Arg Ser Val Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 169

Glu Trp Lys Thr Gln Leu Ala Leu

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 170

Gly Asn Ile Asn Val Val Pro His

1 5

<210> 171

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 171

Gly Ser Pro Ala Ala Ser Ser Trp

1 5

<210> 172

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 172

Lys His Ser Leu Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 173

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 173

Lys Pro Val Ser Thr Asp Thr Phe

1 5

<210> 174

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 174

Leu Asp Arg Ser Gly Ser Thr Gly

1 5

<210> 175

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 175

Leu Gly Ala Gln Asn His Val Val

1 5

<210> 176

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 176

Leu Met Ala Thr Asp Tyr Gly Pro

1 5

<210> 177

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 177

Leu Arg Ala Thr Asp Tyr Gly Pro

1 5

<210> 178

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 178

Met Glu Arg Thr Glu Pro Leu Gly

1 5

<210> 179

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 179

Asn Asp Gly Leu Arg Leu His Leu

1 5

<210> 180

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 180

Asn Leu Ser Ala His Ser His Ala

1 5

<210> 181

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 181

Asn Leu Ser Ala His Ser His Asp

1 5

<210> 182

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 182

Arg Ala Leu Asp Leu Val Thr Arg

1 5

<210> 183

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 183

Ser Ala Gly Met Ala Arg Asn Ser

1 5

<210> 184

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 184

Ser Gly Gln Arg Val Gly Ser Ala

1 5

<210> 185

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 185

Ser Gly Gln Arg Val Gly Ser Asp

1 5

<210> 186

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 186

Thr Gly Arg Pro Glu Gln Pro Lys

1 5

<210> 187

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 187

Thr His Ser Pro Ile Lys Leu Pro

1 5

<210> 188

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 188

Thr Gln Phe Ser Gln Ala Gln Arg

1 5

<210> 189

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(8)

<400> 189

Val Gly Asp Ser Ala Asn Leu Arg

1 5

<210> 190

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 190

cgagccaacc 10

<210> 191

<211> 27

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 191

caaaccctgg ccgtgccctt caaggca 27

<210> 192

<211> 2211

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 192

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60

gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120

aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180

aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300

caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480

aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540

tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600

cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660

gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780

tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960

caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020

acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080

gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140

acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260

cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320

gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380

ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440

ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500

tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560

ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620

ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680

accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740

gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800

atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860

aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920

aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980

gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040

gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100

tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160

tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211

<210> 193

<211> 2211

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 193

atggctgctg acggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctttctga aggcattcgt 60

gagtggtggg ctctgaaacc tggagtccct caacccaaag cgaaccaaca acaccaggac 120

aaccgtcggg gtcttgtgct tccgggttac aaatacctcg gacccggtaa cggactcgac 180

aaaggagagc cggtcaacga ggcggacgcg gcagccctcg aacacgacaa agcttacgac 240

cagcagctca aggccggtga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc ttcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc ttggcagagc agtcttccag 360

gccaaaaaga ggatccttga gcctcttggt ctggttgagg aagcagctaa aacggctcct 420

ggaaagaaga ggcctgtaga tcagtctcct caggaaccgg actcatcatc tggtgttggc 480

aaatcgggca aacagcctgc cagaaaaaga ctaaatttcg gtcagactgg cgactcagag 540

tcagtcccag accctcaacc tctcggagaa ccaccagcag cccccacaag tttgggatct 600

aatacaatgg cttcaggcgg tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg tgccgatgga 660

gtgggtaatt cctcaggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctgggcga cagagtcatc 720

accaccagca ccagaacctg ggccctgccc acttacaaca accatctcta caagcaaatc 780

tccagccaat caggagcttc aaacgacaac cactactttg gctacagcac cccttggggg 840

tattttgact ttaacagatt ccactgccac ttctcaccac gtgactggca gcgactcatt 900

aacaacaact ggggattccg gcccaagaaa ctcagcttca agctcttcaa catccaagtt 960

aaagaggtca cgcagaacga tggcacgacg actattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020

caagtgttta cggactcgga gtatcagctc ccgtacgtgc tcgggtcggc gcaccaaggc 1080

tgtctcccgc cgtttccagc ggacgtcttc atggtccctc agtatggata cctcaccctg 1140

aacaacggaa gtcaagcggt gggacgctca tccttttact gcctggagta cttcccttcg 1200

cagatgctaa ggactggaaa taacttccaa ttcagctata ccttcgagga tgtacctttt 1260

cacagcagct acgctcacag ccagagtttg gatcgcttga tgaatcctct tattgatcag 1320

tatctgtact acctgaacag aacgcaagga acaacctctg gaacaaccaa ccaatcacgg 1380

ctgcttttta gccaggctgg gcctcagtct atgtctttgc aggccagaaa ttggctacct 1440

gggccctgct accggcaaca gagactttca aagactgcta acgacaacaa caacagtaac 1500

tttccttgga cagcggccag caaatatcat ctcaatggcc gcgactcgct ggtgaatcca 1560

ggaccagcta tggccagtca caaggacgat gaagaaaaat ttttccctat gcacggcaat 1620

ctaatatttg gcaaagaagg gacaacggca agtaacgcag aattagataa tgtaatgatt 1680

acggatgaag aagagattcg taccaccaat cctgtggcaa cagagcagta tggaactgtg 1740

gcaaataact tgcagagctc aaatacagct cccacgacta gaactgtcaa tgatcagggg 1800

gccttacctg gcatggtgtg gcaagatcgt gacgtgtacc ttcaaggacc tatctgggca 1860

aagattcctc acacggatgg acactttcat ccttctcctc tgatgggagg ctttggactg 1920

aaacatccgc ctcctcaaat catgatcaaa aatactccgg taccggcaaa tcctccgacg 1980

actttcagcc cggccaagtt tgcttcattt atcactcagt actccactgg acaggtcagc 2040

gtggaaattg agtgggagct acagaaagaa aacagcaaac gttggaatcc agagattcag 2100

tacacttcca actacaacaa gtctgttaat gtggacttta ctgtagacac taatggtgtt 2160

tatagtgaac ctcgccctat tggaacccgg tatctcacac gaaacttgta a 2211

<210> 194

<211> 41

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 194

gcaagaaagg ccagcagccc gccagaaaga gactcaattt c 41

<210> 195

<211> 131

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 195

cgggtattgg caaatcgggt gcacagcccg ctaaaaagag actcaatttc ggtcagactg 60

gcgacacaga gtcagtccca gaccctcaac caatcggaga acctcccgca gccccctcag 120

gtgtgggatc t 131

<210> 196

<211> 63

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 196

actgaaggtg tatatagtga accccgcccc attggcacca gatacctgac tcgtaatctg 60

taa 63

<210> 197

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子修饰的AAV9

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(131)

<400> 197

cgggtattgg caaatcgggt gcacagcctg ccaagaagcg cctgaacttt ggccagaccg 60

gcgacacaga gagcgttccg gaccctcaac caatcggaga acctcccgca gccccctcag 120

gtgtgggatc t 131

<210> 198

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子修饰的AAV9

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(63)

<400> 198

actgaaggtg tatatagtga accccgccca atcgggacaa gatatctgac aagaaacctg 60

taa 63

<210> 199

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 199

cttaccagca 10

<210> 200

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 200

tttaccttca 10

<210> 201

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 201

tataccttcg 10

<210> 202

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 202

attacctgaa 10

<210> 203

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 203

gctacctgga 10

<210> 204

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 204

tttacctgga 10

<210> 205

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 205

attacctggc 10

<210> 206

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 206

cttacctggc 10

<210> 207

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 207

tgtacctgca 10

<210> 208

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 208

gttaccttac 10

<210> 209

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 209

gatacctgac 10

<210> 210

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 210

cttacccgtc 10

<210> 211

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 211

ctcacacgaa 10

<210> 212

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 212

agcgtctgca 10

<210> 213

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 213

ggctcctgga 10

<210> 214

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 214

gcccgctaaa 10

<210> 215

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 215

tcaccctgaa 10

<210> 216

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 216

actgcctgga 10

<210> 217

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 217

actacctgaa 10

<210> 218

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 218

cgtttctaaa 10

<210> 219

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 219

aaacactgca 10

<210> 220

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 220

gggagctgca 10

<210> 221

<211> 736

<212> PRT

<213> 腺相关病毒

<400> 221

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 222

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(736)

<400> 222

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Ala

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

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Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

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Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

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675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

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Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 223

<211> 41

<212> DNA

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gcaagaaagg ccagcagccc gccagaaaga gactcaattt c 41

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<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 224

gcaagaaagg ccagcagccc gccggaaaga gactcaattt c 41

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<211> 41

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 225

gcaagaaagg ccagcagccc gctagaaaga gactgaactt t 41

<210> 226

<211> 41

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

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gcaagaaggg ccagcagccc gccagaaaga gactcaattt c 41

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gcaagaaagg ccagcggccc gctaaaaaga gactgaactt t 41

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gcaagaaagg ccagcagccc gctaaaaaga gactgaactt t 41

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<213> 腺相关病毒

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tgtttactct gagcctcgcc ccattggcac tcgttacccc acccgtaatc tgtaa 55

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<400> 273

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aacttattct gagcctcgcc ccattggtac tcgttacctc acccgtaatc tgtaa 55

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<400> 282

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<400> 284

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<400> 301

tgtgtattca gagcctcgcc ccattggcac cacatacctg actcgtaatc tgtaa 55

<210> 302

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 302

cgtgtactca gagcctcgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgtaa 55

<210> 303

<211> 56

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 303

tgtgtattca gagcctcgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgtaat 56

<210> 304

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 304

tgtgtattca gagccttgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgtaa 55

<210> 305

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 305

tgtttatagt gaacctcgcc ctattggaac ccggtatctc acacgaaact tgtga 55

<210> 306

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 306

tgtttatagt gaacctcgcc ctattggaac ccggtatctc acacgaaact tgtaa 55

<210> 307

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 307

tgtttattct gaaccccgcc ctattggcac tcgttacctt acccggaact tgtaa 55

<210> 308

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 308

tgtatatagt gaaccccgcc ccattggcac cagatacctg actcgtaatc tgtaa 55

<210> 309

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 309

gaagtataca gagccgcggg ttattggctc tcgttatttg actaatcatt tgtaa 55

<210> 310

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 310

caactaccac gaactccggg ctattgggtc ccgtttcctc acccaccact tgtaa 55

<210> 311

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 311

gaaatacact gagcctaggg ctatcggtac ccgctacctc acccaccacc tgtaa 55

<210> 312

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 312

agcctacaaa gagcccaggg ccattggatc ccgatacctc accaaccacc tctag 55

<210> 313

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 313

atcctattcc gaacctcgtc ccatcggtac ccgttacctt accaaacctc tgtaa 55

<210> 314

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 314

ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt acccgacccc tttaa 55

<210> 315

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 315

cgaatacaga accaccagag ccatcggaac ccgatacctc acccgacccc tttaa 55

<210> 316

<211> 55

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 316

tggatatgta gaagatagat tgattggaac cagatatcta actcaaaatc tgtaa 55

<210> 317

<211> 106

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 317

ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaaggc gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

gtagagccgt caccacagcg ttcccccgac tcctccacgg gcatcg 106

<210> 318

<211> 105

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 318

ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaagct gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

gtagaccgtc acctcagcgt tcccccgact cctccacggg catcg 105

<210> 319

<211> 106

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 319

ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaaggc gctaagacgg ctcctgcaaa gaagagaccg 60

gtagagccgt cacctcagcg ttcccccgac tcctccacgg gcatcg 106

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<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 320

ctcgaacctc tcggtctggc tgaggaagct gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

gtagaaccgt cacctcagcg ttcccccgac tcctccacgg gcatcg 106

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<400> 321

ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaagct gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

gtagaaccgt cacctcagcg ttcccccgac tcctccacgg gcatcg 106

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ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaagct gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

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ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaagcg gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

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atagaatccc ccgactcctc cacgggcatc g 91

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<213> 腺相关病毒

<400> 329

ctcgaacctc tcggtctggt tgaggaaggc gctaagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

gtagagccat caccccagcg ttctccagac tccactacgg gcatcg 106

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atagactctc cagactcctc cacgggcatc g 91

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tagagcactc tcctgtggag ccagactcct cctcgggaac cg 102

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<213> 腺相关病毒

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<212> DNA

<213> 腺相关病毒

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<400> 347

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<213> 腺相关病毒

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<211> 103

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<213> 腺相关病毒

<400> 353

cttgaacctc tgggcttggt tggggagcct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

gtagagcact ctcctgtgga gccagactcc tcctcgggaa ccg 103

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<400> 354

cttgaacctc tgggcttggt tgaggagcct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

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cttgaacctc tgggcctggt tgaggagcct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

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<211> 103

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cttgaacctc tgggcctggt tgagggacct gttaagacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

gtagagcact ctcctgcgga gccagactcc tcctcgggaa ccg 103

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<211> 103

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<213> 腺相关病毒

<400> 357

cttgaacctc tgggcctggt tgaggaacct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

gtagagcact ctcctgtgga gccagactgg tggtgcccaa ccg 103

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<211> 103

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 358

cttgaacctc tgggcctggt tgaggagcct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagagaccg 60

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<213> 腺相关病毒

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<213> 腺相关病毒

<400> 361

cttgaacctc tgggcctggt tgaggaacct gttaaaacgg ctccgggaaa aaagaggccg 60

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<211> 103

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<400> 362

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<211> 103

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<213> 腺相关病毒

<400> 363

cttgagcctc ttggtctggt tgaggaagca gctaaaacgg ctcctggaaa gaagaggcct 60

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<211> 103

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<400> 364

cttgagcctc tgggtctggt tgaggaagcg gctaagacgg ctcctggaaa aaagagacct 60

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<211> 103

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 365

ctcgagcctc ttggtctggt tgaggaagct gttaagacgg ctcctggaaa aaagagacct 60

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<210> 366

<211> 103

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 366

cttgaacctc ttggtctggt tgaggaagcg gctaagacgg ctcctggaaa gaagaggcct 60

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<213> 腺相关病毒

<400> 367

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<400> 368

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ttagagtcac cacaagagcc cgactcctcc tcaggaatcg 100

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<211> 100

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 369

ctcgaacctc tgggcctggt tgaagaaggt gctaaaacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

ttagagtcac cacaagagcc cgactcctcc tcgggcatcg 100

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ttagaaaaga ctccaaatcg gccgaccaac ccggactctg ggaaggcccc g 111

<210> 371

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<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 371

cttgaacctc ttggtctggt tgagcaagcg ggtgagacgg ctcctggaaa gaagagaccg 60

ttgattgatc cccccagcag cccgactcct ccacgggtat cg 102

<210> 372

<211> 106

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 372

ctcgaacctc ttggcctggt tgagacgccg gataaaacgg cgcctgcggc aaaaaagagg 60

cctctagagc agagtcctca agagccagac tcctcgagcg gagttg 106

<210> 373

<211> 103

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 373

ctcgaaccct ttggtctggt ggaagactca aagacggctc cgaccggaga caagcggaaa 60

ggcgaagacg aacctcgttt gcccgacact tcttcacaga ctc 103

<210> 374

<211> 97

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 374

ctcgaacctt ttggcctggt tgaagagggt gctaagacgg cccctaccgg aaagcggata 60

gacgaccact ttccaaaaag aaagaaggct cggaccg 97

<210> 375

<211> 88

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 375

ttagagccat ttggcctagt agaagatcct gtcaacacgg cacctgcaaa aaaaaataca 60

gggaagctta ctgaccatta cccggtag 88

<210> 376

<211> 57

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 376

cagcgtagat cgtgtgggag ctgcagaagg agaacagcaa gcgcaggaac ccagaat 57

<210> 377

<211> 60

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cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aagcgctgga acccagagat 60

<210> 378

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 378

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aagcgctgga gcccagagat 60

<210> 379

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

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cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aagtgctgga acccagagat 60

<210> 380

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 380

cagcgtggaa atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aagcgctggg acccggagat 60

<210> 381

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 381

cagcgtggaa atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga acccagagat 60

<210> 382

<211> 61

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 382

ccagcgtgga aatcgagtgg gagctgcaga aggagaacag caaacgttgg aacccagaga 60

t 61

<210> 383

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 383

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aagcgatgga acccagaaat 60

<210> 384

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 384

cagcgtggaa atcgaatggg agctgcagaa agaaaacagc aagcgctgga acccagagat 60

<210> 385

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 385

cagcgtggaa attgaatggg agctgcagaa agagaacagc aagcgctgga acccagagat 60

<210> 386

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 386

cagcgtggaa attgaatggg agctgcagaa agaaaacagc aaacgctgga acccagagat 60

<210> 387

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 387

cagcgtggag attgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aagcgctgga atcccgagat 60

<210> 388

<211> 60

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<213> 腺相关病毒

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cagcgtggaa attgaatggg agctgcagaa ggaaaacagc aagcgctgga accccgagat 60

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<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 389

cagcgtggaa attgaatggg agctacagaa ggaaaacagc aagcgctgga accccgagat 60

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<211> 60

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<213> 腺相关病毒

<400> 391

cagcgtggaa atcgagtggg agctgcagaa agaaaacagc aaacgctgga atccagagat 60

<210> 392

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 392

cagcgtggag atcgagtggg aactgcagaa agaaaacagc aaacactgga atccagagat 60

<210> 393

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 393

cagcgtggag atcgagtggg aactgcagaa agagaacagc aaacgctgga atccagagat 60

<210> 394

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 394

cagcgtggag atcgagtggg aactgcagaa agaaaacagc aaacgctgga atccagagat 60

<210> 395

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 395

cagcgtggaa atcgagtggg agctgcagaa agaaaacagc aagcgctgga acccagaaat 60

<210> 396

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 396

gagtgtggaa attgaatggg agctgcagaa agaaaacagc aagcgctgga atcccgaagt 60

<210> 397

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 397

gagcgtggag attgaatggg agctgcagaa agaaaacagc aaacgctgga atcccgaagt 60

<210> 398

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 398

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aaacgctgga atcccgaaat 60

<210> 399

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 399

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga atcccgaaat 60

<210> 400

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 400

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga atcccgagat 60

<210> 401

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 401

cagcgtggag atcgagtggg agctacagaa ggagaacagc aaacgctgga atcccgagat 60

<210> 402

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 402

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga accccgagat 60

<210> 403

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 403

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggaggacagc aaacgctgga accccgagat 60

<210> 404

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 404

cagcgtagag atcgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga acccgagat 59

<210> 405

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 405

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa agagaacagc aaacgctgga atcccgaaat 60

<210> 406

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 406

cagcgtggag attgagtggg agctgcagaa ggagaacagc aaacgctgga accccgagat 60

<210> 407

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 407

cagcgtggag attgagtggg agctgcggaa ggagaacagc aaacgctgga accccgagat 60

<210> 408

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 408

cagcgtggaa attgagtggg agctacagaa agaaaacagc aaacgttgga atccagagat 60

<210> 409

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 409

cagcgtggaa atagagtggg agctgcagaa agaaaacagc aaacgctgga acccagaaat 60

<210> 410

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 410

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aagcgctgga acccggagat 60

<210> 411

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 411

cagcgtggag atcgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aagcgtggaa cccggagat 59

<210> 412

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 412

cagcgtggag attgagtggg agctgcagaa ggaaaacagc aagcgctgga acccggagat 60

<210> 413

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 413

cgctgttcag attgaatggg aaatcgaaaa ggaacgctcc aaacgctgga atcctgaagt 60

<210> 414

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 414

cgctgttcag attgaatggg aaatcgaaaa ggaacgctcc aaacgccgga atcctgaagt 60

<210> 415

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 415

tgccgttcag atcgactggg aaattcagaa ggagcattcc aaacgctgga atcccgaagt 60

<210> 416

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 416

gtcggtgcag attgactggg agatccagaa ggagcggtcc aaacgctgga accccgaggt 60

<210> 417

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 417

ggctgtcaaa atagaatggg aaatccagaa ggagcggtcc aagagatgga acccagaggt 60

<210> 418

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 418

caccgtcgaa atcttttggg aactcaagaa ggaaacctcc aagcgctgga accccgaaat 60

<210> 419

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 419

caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc aagaggtgga acccagagat 60

<210> 420

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 420

caccgtggag atggaatggg agctcaaaaa ggaaaactcc aagaggtgga acccagagat 60

<210> 421

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 421

tacagtagag atggtgtggg agctgagaaa agagaattca aagagatgga acccagaaat 60

<210> 422

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 422

ggagccttac ctggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcctatttg 59

<210> 423

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 423

ggagccttac ctggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 424

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 424

ggagccttac ctggtatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 425

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 425

ggagccttac ctggcatggt ctggcagaac cgagacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 426

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 426

ggggccttac ctggtatggt ctggcaaaac cgggacgtgt acctgcaggg ccccatctg 59

<210> 427

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 427

ggagccttac ctggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcctatctg 59

<210> 428

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 428

ggggccttac ccggtatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 429

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 429

ggagttattc ctggtatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg ccctatttg 59

<210> 430

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 430

ggggtgattc ccggcatggt gtggcagaat agagacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 431

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 431

ggggctctgc ccggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt acctgcaggg tcccatctg 59

<210> 432

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 432

ggggctctgc ccggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt gcctgcaggg tcccatctg 59

<210> 433

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 433

ggagcactgc ctggcatggt ctggcagaac cgggacgtgt atctgcaggg tcccatctg 59

<210> 434

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 434

ggagcattac ctggcatggt gtggcaagat agagacgtgt acctgcaggg tcccatttg 59

<210> 435

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 435

ggagcattac ctggcatggt gtggcaaggt agagacgtgt acctgcaggg tcccatttg 59

<210> 436

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 436

ggagccttac ctggaatggt gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttg 59

<210> 437

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 437

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagatgtgt accttcaggg gcccatctg 59

<210> 438

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 438

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagacgtgt acctgcaggg gcccatctg 59

<210> 439

<211> 58

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 439

ggcgttcttc caggcatggt gtggcaggac agagacgtgt acctgcaggg gccatctg 58

<210> 440

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 440

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagacgtgt acctgcaggg gcctatctg 59

<210> 441

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 441

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagacgtgc acctgcaggg gcctatctg 59

<210> 442

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 442

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaagac agagacgtgt acctgcaggg gcctatttg 59

<210> 443

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 443

ggcgttcttc caggcatggt cgggcaagac agagacgtgt acctgcaggg gcctacttg 59

<210> 444

<211> 58

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 444

ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagacgtgt acctgcgggg cccatctg 58

<210> 445

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 445

ggagcgttac ctggtatggt gtggcaggat cgagacgtgt acctgcaggg acccatttg 59

<210> 446

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 446

ggagcgttac ctggcatggt gtggcaggat cgagacgtgt acctgcaggg acccatttg 59

<210> 447

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 447

ggagcgttac ctggtatggt gtggcaggat cgagatgtgt accttcaggg acccatttg 59

<210> 448

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 448

ggagcattac ctggtatggt gtggcaggat cgagacgtgt acctgcaggg acccatttg 59

<210> 449

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 449

ggagcattac ctggtatggt gtggcaggat cgagacgtgt acctgcgggg acccatttg 59

<210> 450

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 450

ggggccttac ctggcatggt gtggcaagat cgtgacgtgt accttcaagg acctatctg 59

<210> 451

<211> 58

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 451

ggagcgttac ctggtatggt gtggcaggat cgagacgtgt actgcaggga cccatttg 58

<210> 452

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 452

ggaatcttac ctggaatggt gtggcaggac cgcgatgtct atcttcaagg tcccatttg 59

<210> 453

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 453

ggaatacttc cgggtatggt ttggcaggac agagatgtgt acctgcaagg acccatttg 59

<210> 454

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 454

ggagtgcttc ctggcatggt gtggcaaaac agagacattt actaccaagg gccaatttg 59

<210> 455

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 455

ggagtgctgc ctggcatggt gtggcaaaac agagacattt actaccaagg gccaatttg 59

<210> 456

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 456

ggaattgttc ccggaatggt ctggcaaaac agagacatct actaccaggg ccctatttg 59

<210> 457

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 457

ggagccgtgc ctggaatggt gtggcaaaac agagacattt actaccaggg tcccatttg 59

<210> 458

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 458

ggcgtgtacc cgggaatggt gtggcaggac agagacattt actaccaagg gcccatttg 59

<210> 459

<211> 60

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 459

ggggcgcttc ccgggatggt gtggcaaaac agagacattt accctacagg gacccatttg 60

<210> 460

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 460

gaaatcgtgc ccggcagcgt gtggatggag agggacgtgt acctccaagg acccatctg 59

<210> 461

<211> 58

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 461

gaagtgcttc ctggcagcgt atggatggag agggacgtgt acctccagga cccatctg 58

<210> 462

<211> 59

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 462

ggagctttac caggaatggt ttggcagaac agggatatat atctgcaggg acctattgg 59

<210> 463

<211> 10

<212> DNA

<213> 腺相关病毒

<400> 463

gggagctaca 10

Claims

1.一种核酸，包括：

侧翼为ITR序列的细小病毒科基因组，其中，所述细小病毒科基因组包含细小病毒科内含子、细小病毒科cap基因和第一方向上的第一多腺苷酸化信号；

在腺病毒辅助功能存在情况下驱动细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第一启动子；

相对于所述第一方向是反义的第二方向上的第二启动子和第二多腺苷酸化信号，其中，所述第二多腺苷酸化信号位于引起所述细小病毒科cap基因的反义mRNA转录终止的位置。

2.如权利要求1所述的核酸，其中，所述第二启动子是细胞类型特异性启动子。

3.如权利要求1所述的核酸，其中，所述第二启动子是遍在启动子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科基因组是包含AAV内含子和AAV cap基因的AAV基因组。

5.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是野生型AAV cap基因。

6.如权利要求5所述的核酸，其中，所述AAV cap基因序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其他天然AAV分离株cap基因序列。

7.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是工程化的AAV cap基因。

8.如权利要求4所述的核酸，其中，所述AAV cap基因是文库的多种AAV cap基因之一。

9.包含多个权利要求4所述的核酸的核酸文库，其中，所述核酸包含多个独特的AAVcap基因序列。

10.如权利要求9所述的核酸文库，其中，所述核酸文库包含大于约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸个独特的AAV cap基因序列。

11.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，进一步包含所述第二方向上的目的基因。

12.如权利要求4-8或11中任一项所述的核酸，其中，所述第二多腺苷酸化信号位于所述AAV内含子内。

13.如权利要求4-8或11中任一项所述的核酸，其中，所述第二多腺苷酸化信号被定位为使得所述cap基因在所述第一方向上被正确翻译成全长衣壳蛋白并且所述cap基因被正确转录为包含全长AAV cap基因编码序列的反义mRNA。

14.一种用于鉴定具有cap基因序列的AAV载体的方法，所述载体当与具有不同cap基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所述方法包括：

通过将权利要求9或10所述的核酸文库引入AAV包装细胞系，从所述包装细胞系中回收第一轮AAV TRADE载体文库，制备第一轮AAV TRADE载体文库；

用第一轮AAV TRADE载体文库注射一只或多只动物；

回收在所述动物的所述目的组织的细胞中富集的AAV载体的cap基因序列；

制备包含富集的AAV载体的回收的cap基因序列的第二轮AAV TRADE核酸文库，并将该文库引入AAV包装细胞系，并从所述包装细胞系中回收第二轮AAV TRADE载体文库；

通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAV TRADE载体文库并回收所述动物的所述目的组织的细胞中富集的cap基因序列，进行第二轮富集；和

在所述第一轮富集之后、在所述第二轮富集之后以及在任何后续轮富集之后鉴定富集的AAV cap基因序列。

15.一种用于制备AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库的方法，包括：

将权利要求4-8或11-13中任一项所述的核酸或权利要求9或10所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库。

16.一种用于确定AAV载体的新型cap基因序列的方法，所述载体具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，包括：

根据权利要求14所述的方法鉴定AAV载体；

回收包含cap基因序列的反义mRNA；和

确定新型cap基因序列。

17.如权利要求16所述的方法，其中，使用RT-PCR回收所述反义mRNA。

18.如权利要求16或17所述的方法，还包括确定cap基因序列的步骤。

19.一种包含权利要求4-8或11-13中任一项所述的核酸的AAV载体。

20.一种核酸，包括：

在腺病毒辅助功能存在情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第一启动子；和

在没有腺病毒辅助功能情况下驱动所述细小病毒科cap基因表达的所述第一方向上的第二启动子。

21.如权利要求20所示的核酸，其中，所述第二启动子是细胞类型特异性启动子。

22.如权利要求20所述的核酸，其中，所述第二启动子是遍在启动子。

23.如权利要求20-22中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是野生型AAV cap基因。

24.如权利要求23所述的核酸，其中，所述AAV cap基因序列是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其他天然AAV分离株cap基因序列。

25.如权利要求20-22中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是工程化的AAV cap基因。

26.如权利要求20-25中任一项所述的核酸，其中，所述细小病毒科cap基因是文库的多种AAV cap基因之一。

27.一种包含多个权利要求20所述的核酸的核酸文库，其中，所述核酸包含多个独特的细小病毒科cap基因序列。

28.如权利要求27所述的核酸文库，其中，所述核酸文库包含大于约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸个独特的AAV cap基因序列。

29.如权利要求20-26中任一项所述的核酸，还包含目的基因。

30.一种用于鉴定具有cap基因序列的AAV载体的方法，所述载体当与具有不同cap基因序列的至少一种其他AAV载体相比时具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，所述方法包括：

通过将权利要求27或28的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系中回收第一轮AAV TRADE载体文库，制备所述第一轮AAV TRADE载体文库；

用所述第一轮AAV TRADE载体文库注射一只或多只动物；

制备包括回收的富集AAV载体的cap基因序列的第二轮AAV TRADE核酸文库，将该文库引入AAV包装细胞系，并从所述包装细胞系中回收所述第二轮AAV TRADE载体文库；

通过向一只或多只动物注射所述第二轮AAV TRADE载体文库并回收在所述动物的所述目的组织的细胞中富集的cap基因序列，进行第二轮富集；和

在第一轮富集之后、在第二轮富集之后以及在任何后续轮富集之后鉴定富集的AAVcap基因序列。

31.一种制备AAV TRADE载体或AAV TRADE载体文库的方法，包括：

将权利要求23-26或29种任一项所述的核酸或权利要求27或28所述的核酸文库引入AAV包装细胞系并从所述包装细胞系回收所述AAV TRADE载体或所述AAV TRADE载体文库。

32.一种用于确定AAV载体的新型cap基因序列的方法，所述载体具有增强的转导来自目的组织的细胞的能力，包括：

按照权利要求30所述的方法鉴定所述AAV载体；

回收包含cap基因序列的有义mRNA；和

确定新型cap基因序列。

33.如权利要求32所述的方法，其中，使用RT-PCR回收所述有义mRNA。

34.如权利要求32或33所述的方法，还包括确定cap基因序列的步骤。

35.一种包含权利要求23-26或29中任一项所述的核酸的AAV载体。

36.如权利要求1-8或11-13中任一项所述的核酸，还包含第二方向上抑制突变的至少一个mRNA剪接。

37.如权利要求36所述的核酸，其中，所述抑制突变的至少一种mRNA剪接包括位于剪接供体和/或剪接受体位点的十个核苷酸内的一个或多个核苷酸的改变。

38.如权利要求36或37所述的核酸，其中，所述改变不改变由AAV cap基因编码的氨基酸序列。

39.一种AAV cap ORF序列，包含剪接供体位点处的外显子-内含子接头中的一个或多个以下突变：

AAV1 VP1 cap ORF 1009-CTTAC(接头)CAGCA-1018*(SEQ ID NO:199)

AAV3 VP1 cap ORF 1006-CTTAC(接头)CAGCA-1015*(SEQ ID NO:199)

AAV1 VP1 cap ORF 1228-TTTAC(接头)CTTCA-1237(SEQ ID NO:200)

AAV3 VP1 cap ORF 1237-TATAC(接头)CTTCG-1246(SEQ ID NO:201)

AAV1 VP1 cap ORF 1331-ATTAC(接头)CTGAA-1340(SEQ ID NO:202)

AAV1 VP1 cap ORF 1434-GCTAC(接头)CTGGA-1443(SEQ ID NO:203)

AAV1 VP1 cap ORF 1502-TTTAC(接头)CTGGA-1510(SEQ ID NO:204)

AAV1 VP1 cap ORF 1803-ATTAC(接头)CTGGC-1812(SEQ ID NO:205)

AAV3 VP1 cap ORF 1803-CTTAC(接头)CTGGC-1812(SEQ ID NO:206)

AAV1 VP1 cap ORF 1835-TGTAC(接头)CTGCA-1844(SEQ ID NO:207)

AAV1 VP1 cap ORF 2189-GTTAC(接头)CTTAC-2198(SEQ ID NO:208)

AAV9 VP1 cap ORF 2189-GATAC(接头)CTGAC-2198(SEQ ID NO:209)

AAV1 VP1 cap ORF 2194-CTTAC(接头)CCGTC-2203(SEQ ID NO:210)

AAV3 VP1 cap ORF 2194-CTAC(接头)ACGAA-2203(SEQ ID NO:211)。

(*虽然核苷酸编号不同，但它们是序列比对中AAV cap ORF的对应核苷酸。)

40.一种AAV cap ORF序列，包含剪接供体位点处的外显子-内含子接头中的一个或多个以下突变：

AAV1 VP1 cap ORF 305-AGCGT(接头)CTGCA-314(SEQ ID NO:212)

AAV1 VP1 cap ORF 414-GGCTC(接头)CTGGA-423(SEQ ID NO:213)

AAV3 VP1 cap ORF 414-GGCTC(接头)CTGGA-423(SEQ ID NO:213)

AAV1 VP1 cap ORF 495-GCCCG(接头)CTAAA-504(SEQ ID NO:214)

AAV9 VP1 cap ORF 495-GCCCG(接头)CTAAA-504(SEQ ID NO:214)

AAV3 VP1 cap ORF 1133-TCACC(接头)CTGAA-1142(SEQ ID NO:215)

AAV1 VP1 cap ORF 1181-ACTGC(接头)CTGGA-1190(SEQ ID NO:216)

AAV1 VP1 cap ORF 1331-ATTAC(接头)CTGAA-1340**(SEQ ID NO:202)

AAV3 VP1 cap ORF 1328-ACTAC(接头)CTGAA-1337**(SEQ ID NO:217)

AAV1 VP1 cap ORF 1464-CGTTT(接头)CTAAA-1473(SEQ ID NO:218)

AAV1 VP1 cap ORF 1653-AAACA(接头)CTGCA-1662(SEQ ID NO:219)

AAV1 VP1 cap ORF 2054-GGGAG(接头)CTGCA-2063(SEQ ID NO:220)

AAV3 VP1 cap ORF 2054-GGGAG(接头)CTACA-2063(SEQ ID NO:463)

(**尽管核苷酸编号不同，但它们是序列比对中AAVcap ORF的相应核苷酸。)

41.一种AAV cap ORF序列，包含剪接供体或剪接受体位点处的外显子-内含子接头中的一个或多个以下突变：

剪接供体

AAV1 VP1 cap ORF 1009-CTTAC(接头)CAGCA-1018*(SEQ ID NO:199)

AAV3 VP1 cap ORF 1006-CTTAC(接头)CAGCA-1015*(SEQ ID NO:199)

AAV1 VP1 cap ORF 1228-TTTAC(接头)CTTCA-1237(SEQ ID NO:200)

AAV3 VP1 cap ORF 1237-TATAC(接头)CTTCG-1246(SEQ ID NO:201)

AAV1 VP1 cap ORF 1331-ATTAC(接头)CTGAA-1340(SEQ ID NO:202)

AAV1 VP1 cap ORF 1434-GCTAC(接头)CTGGA-1443(SEQ ID NO:203)

AAV1 VP1 cap ORF 1502-TTTAC(接头)CTGGA-1510(SEQ ID NO:204)

AAV1 VP1 cap ORF 1803-ATTAC(接头)CTGGC-1812(SEQ ID NO:205)

AAV3 VP1 cap ORF 1803-CTTAC(接头)CTGGC-1812(SEQ ID NO:206)

AAV1 VP1 cap ORF 1835-TGTAC(接头)CTGCA-1844(SEQ ID NO:207)

AAV1 VP1 cap ORF 2189-GTTAC(接头)CTTAC-2198(SEQ ID NO:208)

AAV9 VP1 cap ORF 2189-GATAC(接头)CTGAC-2198(SEQ ID NO:209)

AAV1 VP1 cap ORF 2194-CTTAC(接头)CCGTC-2203(SEQ ID NO:210)

AAV3 VP1 cap ORF 2194-CTCAC(接头)ACGAA-2203(SEQ ID NO:211)

剪接受体

AAV1 VP1 cap ORF 305-AGCGT(接头)CTGCA-314(SEQ ID NO:212)

AAV1 VP1 cap ORF 414-GGCTC(接头)CTGGA-423(SEQ ID NO:213)

AAV3 VP1 cap ORF 414-GGCTC(接头)CTGGA-423(SEQ ID NO:213)

AAV1 VP1 cap ORF 495-GCCCG(接头)CTAAA-504(SEQ ID NO:214)

AAV9 VP1 cap ORF 495-GCCCG(接头)CTAAA-504(SEQ ID NO:214)

AAV3 VP1 cap ORF 1133-TCACC(接头)CTGAA-1142(SEQ ID NO:215)

AAV1 VP1 cap ORF 1181-ACTGC(接头)CTGGA-1190(SEQ ID NO:216)

AAV1 VP1 cap ORF 1331-ATTAC(接头)CTGAA-1340**(SEQ ID NO:202)

AAV3 VP1 cap ORF 1328-ACTAC(接头)CTGAA-1337**(SEQ ID NO:217)

AAV1 VP1 cap ORF 1464-CGTTT(接头)CTAAA-1473(SEQ ID NO:218)

AAV1 VP1 cap ORF 1653-AAACA(接头)CTGCA-1662(SEQ ID NO:219)

AAV1 VP1 cap ORF 2054-GGGAG(接头)CTGCA-2063(SEQ ID NO:220)

AAV3 VP1 cap ORF 2054-GGGAG(接头)CTACA-2063(SEQ ID NO:463)。