CN113789357A - 组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，本方法以蛹虫草菌和抗生链霉菌为出发菌株，经分别试管斜面培养、悬浮液培养、诱变、组合种子培养、发酵培养、发酵液高速离心、大孔树脂纯化、重结晶等技术及超临界CO₂流体干燥技术和全自动控制技术相结合，在多者协同作用下进行蛹虫草菌和抗生链霉菌组合发酵产虫草素和喷司他丁化合物，实现了虫草素和喷司他丁化合物同时进行非化学合成、非蛹虫草提取的生物合成；利用本发明技术组合发酵生产虫草素和喷司他丁化合物，其反应条件温和、操作相对简单、产品成本低、收率高、纯度高、残溶低、能耗低、产能大、环境污染小，适宜工业化规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。

Description

组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法

技术领域

本发明属于生物代谢合成和纯化技术领域，具体涉及一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法。

背景技术

虫草素又称冬虫夏草素、虫草菌素、蛹虫草菌素，别名3′－脱氧腺苷，化学式为C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量为251.25；是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。

20世纪50年代，野生蛹虫草在吉林长白山一带被发现，研究证实其成分功效远超野生冬虫夏草，故而命名北冬虫夏草；1951年，德国科学家Cunningham等首次发现蛹虫草核心成分“虫草素”，发现其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性；之后的数十年，学术界深入开展了大量对于虫草素的研究；1997年，美国已将虫草素用于三期临床实验，用于治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者；2017年，中科院王成树教授在Cell子刊Cell ChemicalBiology在线发表了关于虫草素的最新研究成果：该项研究完整解析了虫草素在蛹虫草(Cordycepsmilitaris)中的生物合成机理，同时首次发现蛹虫草能够合成抗癌药物—喷司他丁，该化合物被用来保护所合成虫草素的结构稳定性。

研究结果表明，虫草素具有肺肾的保护性、抗三高、抗肿瘤、神经保护性、抗炎、抗氧化和免疫调节等生物活性。因此，虫草素在抗衰老、保健、新药研制等领域备受学者关注。

喷司他丁，本品为白色结晶，分子式：C₁₁H₁₆N₄O₄分子量：268.27；最早由Woo等在1974年从Streptomycesantiboticus培养液中分离得到。

Pentostatin是一种嘌呤核苷酸类似物抗生素，从蛹虫草菌发酵液和细菌链霉菌抗生素中分离出来。喷司他丁也称为2'-脱氧共福霉素，结合并抑制腺嘌呤脱氨酶(ADA)，一种对嘌呤代谢必不可少的酶；ADA活性在淋巴系统细胞中最大，其中T细胞的活性高于B细胞，而T细胞恶性肿瘤的ADA活性高于B细胞恶性肿瘤。Pentostatin对ADA的抑制似乎导致细胞内dATP水平升高，这可能通过抑制核糖核苷酸还原酶来阻断DNA合成。该药剂还可以抑制RNA合成，并可以选择性地消耗CD26+淋巴细胞。

美国Nipent公司研发出喷司他丁冻干粉注射剂，对急性及慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤及毛细胞白血病有效；对抗干扰素的病人使用本品仍非常有效。细胞白血病患者无论有无脾切除或以往是否接受a-干扰素治疗，使用本品后完全缓解率(CR)达33％～92％。几乎所有患者经本品治疗2个疗程后，可见外周血细胞计数改善，最明显的改善平均在治疗4个月左右。所有CR的患者平均6年保持稳定，不需再治疗。对B细胞性慢性淋巴细胞白细胞病地完全缓解率仅为4％，部分缓解率为15％～27％。

专利号202110749628.1《一种蛹虫草药物组合物在制备用于预防和/或治疗新冠及抗呼吸道病毒制剂中的应用》，公开了虫草素与喷司他丁组物预防和治疗新冠及抗呼吸道病毒的应用实验。实验随机抽选4个新冠病毒核酸持续阳性病人(每天咽拭子核酸检测阳性大于14天)，用生理盐水200mL稀释浓缩的蛹虫草提取液，使得蛹虫草提取液中含虫草素5ug/mL和喷司他丁2ug/mL。使用扬州强健医疗器材有限公司生产的A型鼻部冲洗器清洗鼻腔，每日3次。对照组随机抽选2例新冠病毒核酸持续阳性患者用生理盐水洗鼻，每日3次。蛹虫草提取液洗鼻后48-72小时后取得病毒核酸检测转阴出院的临床效果，生理盐水洗鼻后病毒核酸检测转阴时间>14天。是该发明的实施例六中蛹虫草提取液(含虫草素和喷司他丁)洗鼻治疗快速清除新冠病毒作用临床试验结果。临床试验证实含虫草素和喷司他丁的蛹虫草提取液洗鼻能有效清除鼻咽部新冠病毒。经蛹虫草提取液和虫草素+喷司他丁联用处理的细胞，其上清液中的病毒滴度分别为(2.12±0.55)×105PFU/mL和(0.5±0.167)×105PFU/mL，即，蛹虫草提取液的病毒清除率为98.6％，虫草素+喷司他丁联用的病毒清除率为99.9％。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，该组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法可以很好地解决上述问题。

为达到上述要求，本发明采取的技术方案是：提供一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，该组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法包括以下步骤：

S1：蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S2：抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S3：分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

S4：菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

S5：紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

S6：常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8d，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用；

S7：液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

S8：液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种；

S9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S10：一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.5～1vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。

S11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S12：二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；

S13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

S14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵5～7天的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.6～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1.4vvm/min；

S16：发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液；

S17：将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

S18：将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

S19：将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

S20：将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

S21：将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

S22：将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

S23：将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

S24：将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

S25：将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

S26：将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

S27:分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍的丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

S28:分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

S29:分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

S30：将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

S31：将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S32：将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

S33：将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

S34：将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

S35：将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S36：将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

S37：将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

S38：将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

S39：将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

S40：将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

S41：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

S42：将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

S43：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

S44：将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

S45：将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

S46:将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

S47：分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

S48：将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

该组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法具有的优点如下：

1)本发明生产的虫草素和喷司他丁，采用了非蛹虫草提取工艺和非化学合成工艺，为虫草素和喷司他丁工业化生产开辟了一条全新的工艺路线。

2)本发明生产虫草素和喷司他丁的工艺，由于不从蛹虫草中提取虫草素和喷司他丁，节约了大量资源，解决了虫草素和喷司他丁提取原料不足的难题。

3)本发明利用虫草素与喷司他丁之间“保护者—被保护者”(protector-protégé)的嘌呤代谢机制，同时生产虫草素和喷司他丁的工艺，生产成本不足从蛹虫草中提取纯化虫草素和喷司他丁单位成本的二分之一，所以产品成本低。

4)本发明设计了8套全自动控制的一级种子发酵罐、8套全自动控制的二级种子发酵罐、3套全自动控制的培养基配制罐、3套全自动控制的培养基补料罐和10套全自动控制的工艺发酵罐以满足循环生产需要，单台工业发酵罐对应相应的单台二级种子发酵罐，单台二级种子发酵罐对应相应的单台一级种子发酵罐，10套发酵系统连续循环发酵。所以，利用本方法生产虫草素和喷司他丁化合物，具有产能大、连续化生产的优点。

5)在本发明制备虫草素和喷司他丁的方法中，采用现代化的全自动控制技术，对培养基配制、培养基充装量、温度控制、通风量控制、发酵时间控制、各罐自动清洗、自动控制灭菌等，保证了产品质量、提高了产品收率、优化节约了能耗、节约了大量的劳动力。

6)本发明在制备虫草素和喷司他丁发酵液工艺中，蛹虫草菌和抗生链霉菌利用紫外线照射菌株诱变、ARTP(常压室温等离子体)诱变，在悬浮液培养基中添加诱导子和在培养基中添加L-苯丙氨酸、花生四烯酸等前体物质，获得更高产的虫草素和喷司他丁化合物，发酵液中虫草素产率达到了3.5g/L以上、喷司他丁产率达到了100mg/L以上。

7)本发明采用膜分离和膜浓缩装置，除产生部分固体废物外，其排放的污水可用于植物灌溉，避免了大量的污染水排放，减少了环境污染。

8)本发明采用MVR蒸发器或全电蒸发器真空浓缩或膜浓缩、自动刮刀离心机脱溶、回收溶剂，提高了溶剂回收率，溶剂回收率达到90％以上，且大大地降低了产品能耗及空气的污染。

9)本发明采用集中联动控制动力、蒸汽、冷却水、无菌空气供应，利用自动控制技术依据10套发酵生产系统循环发酵的时间差，自动控制分配动力、蒸汽、冷却水、无菌空气使用时间和供应量，提高了设备的利用率，既减少了设备购置费用，又降低了设备能耗。

10)本发明将虫草素或喷司他丁结晶步骤产生的结晶母液浸膏，送入上柱液配制罐与粗品滤饼合并后制作上柱液，将结晶母液浸膏中较高的虫草素或喷司他丁，重新用大孔树脂吸附、洗脱和重结晶，增加了98％以上虫草素或喷司他丁产量。

11)本发明制备虫草素或喷司他丁化合物，采用超临界CO₂流体装置同时进行干燥、脱残溶和灭菌，产品溶剂残留低、色泽均匀，且卫生指标符合相关标准。

12)本方法以蛹虫草菌和抗生链霉菌为出发菌株，经分别诱变、试管斜面培养，组合种子培养、发酵培养、发酵液高速离心、膜过滤、膜浓缩、离心萃取分离、萃取脱色、大孔树脂纯化、重结晶等技术及超临界CO₂流体干燥技术和全自动控制技术相结合，在多者协同作用下进行蛹虫草菌和抗生链霉菌组合发酵产虫草素和喷司他丁化合物，实现了虫草素和喷司他丁化合物同时进行非化学合成、非蛹虫草提取的生物合成；利用本发明技术组合发酵生产虫草素和喷司他丁化合物，其反应条件温和、操作相对简单、产品成本低、收率高、纯度高、残溶低、能耗低、产能大、环境污染小，适宜工业化规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本申请作进一步地详细说明。

在以下描述中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”、“示例”等等的引用表明如此描述的实施例或示例可以包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度，但并非每个实施例或示例都必然包括特定特征、结构、特性、性质、元素或限度。另外，重复使用短语“根据本申请的一个实施例”虽然有可能是指代相同实施例，但并非必然指代相同的实施例。

为简单起见，以下描述中省略了本领域技术人员公知的某些技术特征。

根据本申请的一个实施例，提供一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，包括以下步骤：

S1：蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S2：抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S3：分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

S4：菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

S5：紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

S6：常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8d，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用；

S7：液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

S8：液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种；

S9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S10：一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.5～1vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。

S11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S12：二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；

S13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

S14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵5～7天的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.6～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1.4vvm/min；

S16：发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液；

S17：将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

S18：将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

S19：将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

S20：将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

S21：将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

S22：将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

S23：将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

S24：将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

S25：将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

S26：将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

S27:分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍的丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

S28:分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

S29:分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

S30：将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

S31：将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S32：将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

S33：将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

S34：将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

S35：将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S36：将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

S37：将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

S38：将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

S39：将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

S40：将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

S41：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

S42：将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

S43：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

S44：将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

S45：将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

S46:将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

S47：分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

S48：将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

所述蛹虫草菌株及抗生链霉菌株的分离和诱变和保藏方法如下：

蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养；待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养；定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液；采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中；15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波；上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用。

菌种的制备与工业发酵方法如下：

液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min,2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

虫草素和喷司他丁纯化步骤如下：

将制得的子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10mg/L；将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15mg/L；将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法步骤如下：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

步骤a中，所述乙醇为体积分数75％；

步骤c中，所述蛹虫草马铃薯培养基包括：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH6.5～7，所述抗生链霉菌培养基包括：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH6.5～7；

步骤e中，所述紫外线照射时间分别为0min、0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、5min；

步骤f中，所述ISP2培养基30℃培养6～8d；

步骤a～f中，所述抗生链霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.1349。

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

步骤i中，所述蛹虫草马铃薯培养基(PDA改)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH6.5～7；所述抗生链霉菌培养基(PDA改)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH6.5～7；

步骤ii中，所述接种后于28℃摇床培养5～7天左右，转速为120转/分钟；

步骤iv中，所述发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；

步骤vii中，所述优化培养基配方：蔗糖90g、细豆柏25～30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉18g、L-苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、氯化钠3～5g、硫酸镁0.5～1g、苯甲酸钠0.02mg、花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、醋酸锌40g、蒸馏水1000mL，PH7；

步骤i、iii、v、viii中，所述灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

步骤ix中，所述接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；所述发酵时间为240h；

步骤x中，所述发酵液PH低于6.2时，开始通氨，100h前PH6.3～6.5，100h后PH在6.2～6.3，放罐前8h停止通氨；所述补液标准为根据发酵液的残糖值补入总糖，在发酵100h前残糖值控制在8.0～9.0％，在发酵后100h～150h残糖值控制在7.0～8.0％，150h至放罐前6h，残糖值控制在5.0％。

虫草素和喷司他丁纯化方法：

N1、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

N 2、将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

N 3、将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

N 4、将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

N 5、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

N 6、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

N 7、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

N 8、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

N 9、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

N 10、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

N 11、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

N 12、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

N 13、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

N 14、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

N 15、将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

N 16、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

N 17、将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

N 18、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

N 19、将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

N 20、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

N 21、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

N 22、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

N 23、将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

N 24、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

N 25、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

N 26、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

N 27、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

N 28、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

N 29、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

N 30、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

N 31、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，

N 32、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

步骤N2中，所述的粗滤设备为自动刮刀离心机或袋式过滤机或板框式压滤机；所述产能为4000L/h；

步骤N3中，所述所述膜超滤机组为全自动控制超滤机组，产能为4000L/h；

步骤N4中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N5中，所述膜纳滤浓缩机组为全自动控制纳滤浓缩机组，产能为4000L/h；

步骤N6中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N7中，所述溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯溶剂；所述溶剂萃取温度为40～60℃；

步骤N9中，所述液-液离心萃取设备为CTL350-N，产能1000～3000L/h；

步骤N10中，所述絮凝剂为ZTC1+1天然澄清剂；所述絮凝沉淀温度为60～80℃；所述沉淀时间为4～6h；

步骤N11中，所述脱色剂为活性白土或活性碳；

步骤N9、N10、N12、N16、N20、N24、N29、N31中，所述浓缩器为MVR蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩机组；所述MVR蒸发器或全电蒸发器浓缩温度为55～60℃；真空度为0.07～0.085Mpa；所述该设备产能为500～4000L/h；

步骤N13中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N14中，所述溶剂为体积分数30～60％、PH4～6乙醇或甲醇；所述上柱液溶质浓度为5～12g/L；

步骤N15中，所述大孔树脂系统为全自动控制大孔树脂柱系统；所述大孔树脂为D001或HD-8或711或ML-7大孔树脂；大孔树脂吸附流速2～3BV；洗脱溶剂为体积分数30-60％的乙醇；洗脱液流速3～5BV；

步骤N18中，所述上柱液溶质浓度5～15g/L；

步骤N19中，所述大孔树脂为HZ202或D201或D241或D261；所述吸附流速为3～4BV/h；洗脱液分别用去离子水、PH4～6、体积分数85～95％乙醇或甲醇；所述去离子水洗脱流速为2～3BV/h；所述乙醇或甲醇梯度洗脱流速为3～5BV/h；

步骤N22中，所述结晶溶剂为体积分数30～60％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N24中，所述析晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述析晶温度为40～50℃→-15℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N26中，所述结晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇或丙酮；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N28中，所述母液浸膏为虫草素含量≥50％以上的结晶母液浸膏；

步骤N29、N30中，所述超临界干燥装置为200L双萃双分电加热全自动控制的超临界干燥装置；超临界干燥并脱残溶压力为20～30Mpa、干燥温度为40～60℃、CO₂流量为1500～4500L/h、干燥时间为360～480min；

步骤N31中，所述批量V型混合机为V-1000；批量混合时间为30～60min。

根据本申请的一个实施例，该组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法的包括以下步骤：

蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；ARTP(常压室温等离子体)诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天。待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用。

菌种的制备与工业发酵方法如下：

液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种。按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

虫草素和喷司他丁纯化步骤如下：

将制得的子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10mg/L；将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15mg/L；将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

在本发明的一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法中蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法步骤如下：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、ARTP(常压室温等离子体)诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天。待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

步骤a中，所述乙醇为体积分数75％；

步骤c中，所述紫外线照射时间分别为0min、0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、5min；

步骤c中，所述蛹虫草马铃薯培养基(PDA改)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH6.5～7。所述抗生链霉菌培养基(PDA改)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH6.5～7。

步骤e中，所述恒温培养箱中培养时间为3～7天；

步骤a～e中，所述蛹虫草菌取至东北产一株高产、优质、早熟的蛹虫草子实体；所述抗生链霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.1349。

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种。

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液；

步骤i中，所述的蛹虫草菌液体摇瓶菌种培养基配方为(单位为克/升)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g，花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、蒸馏水1000mL，PH6.5～7；抗生链霉菌液体摇瓶菌种培养基配方为(单位为克/升)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH6.5～7。

步骤ii中，所述摇床培养温度为28℃，转速为120转/分钟；

步骤iii中，所述蛹虫草马铃薯培养基(PDA改)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH6.5～7。所述抗生链霉菌培养基(PDA改)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH6.5～7。

步骤iv、vi中，所述的发酵罐为全自动控制的种子发酵罐；所述接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7～7.2条件下发酵培养18h，0～9h种子罐转速120r/min、通风量0.8～1.4vvm/min，9h以后，种子罐转速180r/min、通风量0.8～1.4vvm/min；

步骤vii中，所述步骤vii中，所述优化培养基配方：蔗糖90g、细豆柏25～30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉18g、L-苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、氯化钠3～5g、硫酸镁0.5～1g、苯甲酸钠0.02mg、花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、醋酸锌40g、蒸馏水1000mL，PH7；所述以上物料采用真空物料输送机输至种子培养基配制罐中；

步骤ix、中，所述发酵罐为全自动控制的发酵罐；所述接种量为1～2％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7～7.4条件下发酵培养；搅拌转速130r/min、通风量0.6～1.2vvm/min，16h以后，发酵罐转速150r/min、通风量0.8～1.4vvm/min；

步骤ix中，所述单罐发酵时间为240h；

步骤i、iii、v、viii中，所述灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

步骤x中，当发酵液PH低于6.2时，开始通氨，100h前PH6.3～6.5，100h后PH在6.2～6.3，放罐前8h停止通氨；所述补液标准为根据发酵液的残糖值补入总糖，在发酵100h前残糖值控制在8.0～9％，在发酵后100h～150h残糖值控制在7～8％，150h至放罐前6h，残糖值控制在5％。

虫草素和喷司他丁纯化方法：

虫草素和喷司他丁纯化方法：

(1)、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

(2)、将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

(3)、将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

(4)、将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

(5)、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

(6)、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

(7)、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

(8)、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

(9)、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

(10)、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀4～6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

(11)、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

(12)、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

(13)、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

(14)、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

(15)、将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(16)、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

(17)、将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

(18)、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

(19)、将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(20)、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

(21)、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

(22)、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

(23)、将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

(24)、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

(25)、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

(26)、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

(27)、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

(28)、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

(29)、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

(30)、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

(31)、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

(32)、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

步骤(2)中，所述的粗滤设备为自动刮刀离心机或袋式过滤机或板框式压滤机；

步骤(3)中，所述全自动控制膜超滤机组为膜分离设备；产能4000L/h；

步骤(4)中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤(5)中，所述全自动控制膜纳滤浓缩机组为膜浓缩设备；产能4000L/h；

步骤(6)中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤(7)中，所述亲脂溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；所述萃取温度为40～50℃；

步骤(10中)，所述絮凝剂为ZTC1+1天然澄清剂；所述絮凝沉淀温度为60～80℃；所述沉淀时间为4～6h；

步骤(11)中，所述萃取溶剂为丙酮；所述脱色材料为活性碳或活性白土；

步骤(14)中，所述上柱液为体积分数30～60％乙醇；所述上柱液溶质浓度5～10g/L；

步骤(15)中，所述大孔树脂为D001或HD-8或711或ML-7；大孔树脂吸附流速2～3BV；洗脱溶剂为体积分数30-60％的乙醇；洗脱液流速3～5BV；

步骤(18)中，所述上柱液为体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

步骤(19)中，所述大孔树脂为HZ202或D201或D241或D261；所述吸附流速为3～4BV/h；洗脱液分别用去离子水、PH4～6、体积分数70～80％乙醇或甲醇；所述去离子水洗脱流速为2～3BV/h；所述乙醇或甲醇洗脱流，洗脱速为3～5BV/h；

步骤(2)、(4)、(6)、(9)、(10)、(13)、(17)、(21)、(23)、(25)、(27)中，所述所述全自动刮刀离心机型号为PGZ-1000～1800；

步骤(9)、(10)、(12)、(16)、(20)、(23)、(25)、(27)中，所述浓缩器为全自动控制的1000L～4000L/h的MVR蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩器；所述MVR蒸发器或全电蒸发器浓缩温度为60℃；真空度为0.07～0.085Mpa；

步骤(21)中，所述的1号结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；所述结晶溶剂为体积分数30～60％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；

步骤(23)中，所述析晶溶解溶剂为体积分数80～95％乙醇或甲醇或丙酮；所述冷冻结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；所述每次搅拌时间10～30min；结晶温度为40～50℃→-20℃；每次结晶时间为12～24h；

步骤(25)中，所述的2号结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；所述结晶溶剂为体积分数70～80％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；

步骤(28)、(29)中，所述超临界干燥装置为200～400L双萃双分电加热全自动控制的超临界干燥装置；超临界干燥并脱残溶压力为20～30Mpa、温度为40～60℃、CO₂流量为1500～4500L/h、干燥时间为360～480min；

步骤(30)中，所述批量V型混合机为V-1000；批量混合时间为30～60min。

实施例1

蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、ARTP(常压室温等离子体)诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天。待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种。

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

虫草素和喷司他丁纯化方法：

(1)、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

(2)、将制得的发酵液压入袋式过滤机过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

(3)、将滤液泵入4000L/h全自动控制膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

(4)、将过滤后的浓液用PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

(5)、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入4000L/h全自动控制膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

(6)、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

(7)、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的二氯甲烷溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

(8)、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

(9)、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

(10)、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀4～6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

(11)、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3～6倍丙酮溶剂，加0.02～0.05倍干滤饼体积的活性白土，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

(12)、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入1000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

(13)、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

(14)、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

(15)、将制得的上柱液泵入1号全自动控制D001大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(16)、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入2000～4000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

(17)、将制得的虫草素粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

(18)、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

(19)、将制得的上柱液泵入2号全自动控制HD-8大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(20)、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入2000～4000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

(21)、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

(22)、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用体积分数30～60％乙醇溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

(23)、将制得的虫草素母液，泵入1000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

(24)、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

(25)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

(26)、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用体积分数70～80％的甲醇溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

(27)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全自动MVR蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

(28)、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

(29)、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末641.08kg和≥50％低品位虫草素粉末2112.06kg；

(30)、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置2号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末19.86kg；

(31)、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

(32)、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量1000L的V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

实施例2

蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、ARTP(常压室温等离子体)诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天。待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种。

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

虫草素和喷司他丁纯化方法：

(1)、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

(2)、将制得的发酵液压入板框式压滤机过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

(3)、将滤液泵入4000L/h全自动控制膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

(4)、将过滤后的浓液用PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

(5)、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入4000L/h全自动控制膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

(6)、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

(7)、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的乙酸乙酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

(8)、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

(9)、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

(10)、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀4～6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

(11)、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3～6倍丙酮溶剂，加0.02～0.05倍干滤饼体积的活性炭，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

(12)、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入1000L/h全电蒸发器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

(13)、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

(14)、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

(15)、将制得的上柱液泵入1号全自动控制HD-8大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(16)、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入2000～4000L/h全电蒸发器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

(17)、将制得的虫草素粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

(18)、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

(19)、将制得的上柱液泵入2号全自动控制HD-8大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(20)、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入2000～4000L/h全电蒸发器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

(21)、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

(22)、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用体积分数30～60％甲醇溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

(23)、将制得的虫草素母液，泵入1000L/h全电蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

(24)、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

(25)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全电蒸发器蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

(26)、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用体积分数70～80％的丙酮溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

(27)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全电蒸发器浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

(28)、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

(29)、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末641.32kg和≥50％低品位虫草素粉末2112.32kg；

(30)、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置2号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末20.01kg；

(31)、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

(32)、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

实施例3

蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养。定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液。采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中。15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波。上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、ARTP(常压室温等离子体)诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天。待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH7。起始PH值为5.0。共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种。

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液。

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

虫草素和喷司他丁纯化方法：

(1)、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

(2)、将制得的发酵液压入PZG-180自动刮刀离心机离心，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

(3)、将滤液泵入4000L/h全自动控制膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

(4)、将过滤后的浓液用PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

(5)、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入4000L/h全自动控制膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

(6)、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

(7)、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的二氯甲烷溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

(8)、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

(9)、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

(10)、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀4～6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

(11)、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3～6倍丙酮溶剂，加0.02～0.05倍干滤饼体积的活性炭，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

(12)、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入1000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

(13)、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

(14)、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

(15)、将制得的上柱液泵入1号全自动控制ML-7大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(16)、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入2000～4000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

(17)、将制得的虫草素粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

(18)、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

(19)、将制得的上柱液泵入2号全自动控制D201或D241大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

(20)、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入1000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

(21)、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

(22)、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用体积分数30～60％乙醇溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

(23)、将制得的虫草素母液，泵入1000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

(24)、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

(25)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

(26)、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用体积分数70～80％的丙酮溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

(27)、将制得的喷司他丁母液，泵入1000L/h全自动控制膜浓缩机组浓缩、PZG-100自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

(28)、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

(29)、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末642.44kg和≥50％低品位虫草素粉末2113.13kg；

(30)、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置2号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末20.41kg；

(31)、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

(32)、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

实施例4

虫草素或喷司他丁产物的检测和鉴定

1、诱变结果的评价方法

⑴、TLC初步评价

用微量进样器分别定量吸取5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl的0.35mg/L虫草素或喷司他丁点样于活化后的硅胶G板上,展开后取出晾干,用乙酸酐蒸气熏0.5h，取出,160℃烘0.5h,260nm或280紫外检视,数码相机照相,于凝胶成像仪上经quantityone摄像,totallab扫描分析得虫草素或喷司他丁显色斑光吸收值,考察进样量与显色斑光吸收值的关系,绘制虫草素或喷司他丁标准曲线。将各诱变菌株的发酵样品、虫草素或喷司他丁(高、低剂量)定量点于同一硅胶板上,同法展开后通过totallab测算样品中的含量来计算总的虫草素或喷司他丁的类物质的含量。

⑵、HPLC-UV评价

①、虫草素HPLC-UV评价

利用HPLC建立虫草素标准曲线：称取虫草素标准品0.85mg，用甲醇：水(体积比为：25：75)溶解，定溶至10mL。高效液相色谱(HPLC)测定，C18色谱柱(250mm×4.6mm)，紫外检测波长260nm，流动相甲醇(25mL)：水(75mL)，流速1.0mL/min,进样量5μL。柱温：室温；单点绘制标准曲线。将实施例一至实施例三所制备的虫草素样品和虫草素标准品，用高效液相仪进行检测，具有相同的出峰时间。

②、喷司他丁HPLC-UV评价

利用HPLC建立喷司他丁标准曲线：称取喷司他丁标准品0.85mg，用甲醇/乙腈/10mmol/L乙酸铵(pH7.6)(2.5/2.5/95,v/v/v)溶解，定溶至10mL。高效液相色谱(HPLC)测定，色谱条件为：色谱柱为Hyper-silODS2柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为甲醇/乙腈/10mmol/L乙酸铵(pH7.6)(2.5/2.5/95,v/v/v),流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；柱温为40℃：进样量为10μL。单点绘制标准曲线。将实施例一至实施例三所制备的喷司他丁样品和喷司他丁标准品，用高效液相仪进行检测，具有相同的出峰时间。

⑶、虫草素或喷司他丁含量计算公式：

发酵液中虫草素或喷司他丁的含量(mg/L)＝甲醇中虫草素或喷司他丁的含量(mg/mL)溶解提取物所用甲醇的体积(mL)10⁶/提取时所取发酵液的体积(m L)。

对实施例1至3所得虫草素或喷司他丁进行紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振分析，并与虫草素或喷司他丁标准样品对比，结果相同，由此可见本发明制备的虫草素或喷司他丁图谱与购置的标准品图谱高度一致。

以上所述实施例仅表示本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明保护范围。因此本发明的保护范围应该以所述权利要求为准。

Claims (10)

1.一种组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S2：抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCC No.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

S3：分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

S4：菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

S5：紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

S6：常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8d，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用；

S7：液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

S8：液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种；

S9：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S10：一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.5～1vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液。

S11：按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S12：二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；

S13：分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

S14：将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

S15：单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵5～7天的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.6～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1.4vvm/min；

S16：发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液；

S17：将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

S18：将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

S19：将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

S20：将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

S21：将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

S22：将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

S23：将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

S24：将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

S25：将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

S26：将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

S27:分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍的丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

S28:分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

S29:分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

S30：将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

S31：将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S32：将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

S33：将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

S34：将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

S35：将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

S36：将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

S37：将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

S38：将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

S39：将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

S40：将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

S41：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

S42：将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

S43：将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

S44：将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

S45：将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

S46:将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

S47：分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品。

S48：将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

2.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述蛹虫草菌株及抗生链霉菌株的分离和诱变和保藏方法如下：

蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCCNo.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养；待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养；定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液；采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中；15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波；上在红光背景下操作,避免光修复。经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复。根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选。选择产量最高的菌株进行保藏，供后续培养使用。

3.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述菌种的制备与工业发酵方法如下：

液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min,2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.5～1vvm/min，发酵培养后收集种子液，按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.7，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

4.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述虫草素和喷司他丁纯化步骤如下：

将制得的子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；将水相泵入絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，沉淀3～6h,经袋式过滤机过滤、2号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10mg/L；将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15mg/L；将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

5.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于，所述蛹虫草菌株和抗生链霉菌的分离、诱变和保藏方法步骤如下：

a、蛹虫草菌培养：选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体，用75％的酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

b、抗生链霉菌培养：取一株保藏编号为：CGMCC No.1349抗生链霉菌，在28℃～30℃下静置培养5～7天，待培养基表面出现抗生链霉菌落时，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养，待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯；

c、分别将蛹虫草菌培养基和抗生链霉菌培养基，置于28℃～30℃恒温培养箱中培养，定时观察，将新长出的菌丝用接种针依次转接到新的培养基上，每株菌纯化2～3次后转接到试管斜面上保藏各两支；

d、菌悬液的制备：分别取几支培养一周的优势菌株斜面,分别加入的含协留异烟麟的生理盐水,接着用接种环将斜面上的菌体刮下,摇晃均匀后,将混合液倒入无菌三角瓶中,置于恒温摇床上耐而振荡而,振荡完后通过层无菌擦镜纸的漏斗过滤得到菌株的单孢子悬浮液，采用血球计数器进行孢子计数,调整孢子浓度约为10⁶个/ml；

e、紫外线诱变：分别取制备好的蛹虫草菌和抗生链霉菌单孢子悬液5ml到直径9mm的无菌平皿中，15瓦紫外灯打开预热而,以稳定光波，将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上,离灯管一定距离,打开皿盖,边搅拌边照射,力求使细胞均匀吸收紫外线光波，上在红光背景下操作,避免光修复，经过紫外诱变后的菌体立即转入无菌试管内,浸入冰水中30min,以抑制酶活性,抑制修复，根据延迟现象的原理,将照射后经过冰浴的菌悬液加入到PDA培养基中进行后培养,以提高突变率；

f、常压室温等离子体诱变：分别将紫外线诱变后的蛹虫草菌和抗生链霉菌合适浓度的孢子悬液取10μL涂匀在灭过菌的诱变杯上，然后在最佳条件下诱变，诱变后将诱变杯放入2mL的离心管中，加入1mL无菌超纯水，振荡1min后涂在ISP2培养基上，30℃培养6～8天，待菌落长到直径约0.5cm，观察菌落的颜色、纹路和性状与对照相比产生明差异性变化的菌落，进行筛选，选择产量最高的菌株进行低温保藏，供后续培养使用。

6.根据权利要求5所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：

步骤a中，所述乙醇为体积分数75％；

步骤c中，所述蛹虫草马铃薯培养基包括：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH6.5～7，所述抗生链霉菌培养基包括：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH 6.5～7；

步骤e中，所述紫外线照射时间分别为0min、0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、5min；

步骤f中，所述ISP2培养基30℃培养6～8d；

步骤a～f中，所述抗生链霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1349。

7.根据权利要求1所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：

菌种的制备与工业发酵方法：

i、液体摇瓶菌种培养基配方为PDA，PH 7，起始PH值为5.0，共配制250ml,分装250mL三角瓶,每瓶30ml,121℃灭菌30分钟后冷却至室温待用；

ii、液体摇瓶菌种的制备：分别将蛹虫草菌或抗生链霉菌液体培养基分装于500ml三角瓶中，每瓶加培养液200ml，用12层纱布外加一层牛皮纸封口，13-30分钟灭菌后，将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上，接种后于28℃摇床培养5～7天左右，待形成均匀小球后即可用于接种，

iii、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别泵入1～8号500L一级种子培养罐，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

iv、一级种子培养：一级种子培养罐灭菌完成后，将罐内培养基温度降到28℃～30℃时，再将三角瓶发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号500L一级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，

v、按配方标准配制种子培养基，将种子培养基分别装入1～8号1000L二级种子发酵罐内，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

vi、二级种子培养：二级种子培养罐灭菌完成后，将温度降到25℃～28℃时，将发酵5～7天的一级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～8号1000L二级种子发酵罐中，用种子培养基进行种子培养，接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液，

vii、分批按配方将培养基物料准确称量后装入40000L×3培养基配制罐内，按照配方泵入纯净水搅拌30min；

viii、将发酵培养基分批泵入1～10号100000L发酵单罐或1～3号培养基补液罐内，装罐系数0.75，用实罐蒸汽灭菌法灭菌，灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

ix、单罐灭菌完成后，将罐内培养基用冷冻水降温到28℃，再将1～8号发酵18h的二级种子发酵液通过无菌接种系统分别接种到1～10号100000L发酵罐进行发酵培养，接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

x、发酵期内应根据培养基量标准实时补液；当培养基补料达标后且发酵时间达标后，发酵结束，制得子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液。

8.根据权利要求7所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：

步骤i中，所述蛹虫草马铃薯培养基(PDA改)：葡萄糖20～30g、蛋白胨5～8g、20％马铃薯浸出液200ml，硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、酵母粉4～6g、蒸馏水1000mL，PH 6.5～7；所述抗生链霉菌培养基(PDA改)：葡萄糖4～6g、酵母粉4～6g、麦芽浸膏粉8～10g、硫酸铵3～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸镁1～2g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH 6.5～7；

步骤ii中，所述接种后于28℃摇床培养5～7天左右，转速为120转/分钟；

步骤iv中，所述发酵温度28～30℃，罐压0.10Mpa，pH为7.2条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速100r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min；

步骤vi中，所述接种量为1～5％，发酵温度25～28℃，罐压0.10Mpa，pH为7条件下发酵培养5～7天，0～2天种子罐转速120r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，2天以后，种子罐转速150r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，发酵培养后收集种子液；

步骤vii中，所述优化培养基配方：蔗糖90g、细豆柏25～30g、蛋白胨10g、酵母浸出粉18g、L-苯丙氨酸0.3mg、乙酸钠0.05mg、氯化钠3～5g、硫酸镁0.5～1g、苯甲酸钠0.02mg、花生四烯酸0.1mg、肉桂酸0.05mg、醋酸锌40g、蒸馏水1000mL，PH 7；

步骤i、iii、v、viii中，所述灭菌温度≥121℃、灭菌时间≥30min；

步骤ix中，所述接种量为1～5％，发酵温度28℃，罐压0.03Mpa，pH为7条件下发酵培养120h，搅拌转速130r/min、通气量0.8～1.4vvm/min，180h以后，发酵罐转速100r/min、通气量1vvm/min；所述发酵时间为240h；

步骤x中，所述发酵液PH低于6.2时，开始通氨，100h前PH6.3～6.5，100h后PH在6.2～6.3，放罐前8h停止通氨；所述补液标准为根据发酵液的残糖值补入总糖，在发酵100h前残糖值控制在8.0～9.0％，在发酵后100h～150h残糖值控制在7.0～8.0％，150h至放罐前6h，残糖值控制在5.0％；

9.根据权利要求7所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：

虫草素和喷司他丁纯化方法：

N1、将制得的菌丝体、子实体与虫草素和喷司他丁发酵混合液，压入1～2号40000L发酵液暂存罐内；

N2、将制得的发酵液压入粗滤设备过滤，制得菌丝体、子实体滤饼和滤液；

N3、将滤液泵入膜超滤机组进行超滤，滤除发酵液杂质，制得虫草素和喷司他丁混合粗液；

N4、将过滤后的浓液用自动刮刀离心机离心脱溶，制得子实体等废弃物；

N5、将制得的虫草素和喷司他丁混合粗液，泵入膜纳滤浓缩机组进行浓缩，制得虫草素和喷司他丁混合浓液和废水；

N6、将制得虫草素和喷司他丁混合浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶，制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A；

N7、将制得虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A，送入1号萃取釜，用虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量3倍的亲酯溶剂，再泵入虫草素和喷司他丁混合粗品滤饼A重量6倍去离子水萃取2～3次，收集合并萃取液；

N8、将萃取液进行液-液离心萃取，分离有机相和水相,制得含有喷司他丁的有机相和含有虫草素的水相；

N9、将有机相经袋式过滤机过滤，滤液经1号浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂，制得喷司他丁粗品干滤饼A；

N10、将水相泵入6000L絮凝沉淀罐内，加入絮凝剂搅拌10～30min，再沉淀6h，经袋式过滤机过滤，滤液经2号浓缩器浓缩、浓液离心机脱溶、回收溶剂，制得虫草素粗品干滤饼A；

N11、分别将虫草素粗品干滤饼A和喷司他丁粗品干滤饼A，送入2号或3号3000L的萃取釜，分别用干滤饼重量3倍丙酮溶剂，加0.03倍干滤饼重量的脱色剂，在温度40～60℃下萃取脱色2～3次，经过滤，合并萃取液，分别制得虫草素和喷司他丁萃取液；

N12、分别将虫草素萃取液和喷司他丁萃取液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，分别制得虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液；

N13、分别将虫草素粗品浓缩液和喷司他丁粗品浓缩液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收溶剂，分别制得虫草素粗品滤饼B和喷司他丁粗品滤饼B；

N14、将虫草素粗品滤饼B与结晶后的虫草素母液滤饼合并，装入1号上柱液配制罐内，用体积分数30～60％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～10g/L；

N15、将制得的上柱液泵全自动控制大孔树脂柱系统吸附，吸附流速2～3BV；再用体积分数30-60％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

N16、将吸附流出液和洗脱液，分别泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得虫草素粗品浓液；

N17、将制得的虫草素粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得虫草素粗品滤饼；

N18、将喷司他丁粗品滤饼与结晶后的喷司他丁母液干滤饼A、B合并，装入2号上柱液配制罐内，用体积分数70～80％乙醇溶解制作上柱液；上柱液溶质浓度5～15g/L；

N19、将制得的上柱液泵入2号大孔树脂柱系统吸附，上柱液流速2～3BV；再用去离子水、体积分数70-80％乙醇洗脱；洗脱液流速3～5BV；分别收集吸附流出液和洗脱液；

N20、将2号大孔树脂柱系统吸附流出液和洗脱液，泵入浓缩器浓缩、回收溶剂，制得制得喷司他丁粗品浓液；

N21、将制得的喷司他丁粗品浓液，泵入自动刮刀离心机离心脱溶、回收乙醇溶剂，制得喷司他丁粗品滤饼；

N22、将制得的虫草素滤饼，送入1号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶、过滤晶体，制得虫草素湿态晶体和母液；

N23、将制得的虫草素母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得虫草素母液干滤饼；

N24、将制得的喷司他丁粗品滤饼，送入冷冻结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下析晶，过滤晶体，制得喷司他丁粗晶和喷司他丁母液；

N25、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼A；

N26、将制得的喷司他丁粗晶，送入2号结晶釜内，用溶剂溶解，在低温下重结晶，过滤晶体，制得喷司他丁湿态晶体和母液；

N27、将制得的喷司他丁母液，泵入浓缩器浓缩、离心脱溶、回收溶剂、制得喷司他丁母液干滤饼B；

N28、将喷司他丁母液干滤饼B与喷司他丁粗品滤饼合并制作上柱液；

N29、将制得的虫草素湿态晶体、虫草素母液干滤饼，送入超临界CO2干燥装置1号干燥釜内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末；

N30、将制得的喷司他丁湿态晶体，送入超临界CO2干燥装置内脱溶、干燥、灭菌，制得含量≥98％喷司他丁晶体粉末；

N31、分别将制得的≥98％虫草素晶体粉末和低含量的虫草素粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％虫草素晶体粉末产品和低含量的虫草素粉末产品，

N32、将制得的≥98％喷司他丁晶体粉末，送入批量V型混合机进行批量混合，制得≥98％喷司他丁晶体粉末产品。

10.根据权利要求9所述的组合发酵产虫草素和喷司他丁的工业化制备方法，其特征在于：

步骤N2中，所述的粗滤设备为自动刮刀离心机或袋式过滤机或板框式压滤机；所述产能为4000L/h；

步骤N3中，所述所述膜超滤机组为全自动控制超滤机组，产能为4000L/h；

步骤N4中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N5中，所述膜纳滤浓缩机组为全自动控制纳滤浓缩机组，产能为4000L/h；

步骤N6中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N7中，所述溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯溶剂；所述溶剂萃取温度为40～60℃；

步骤N9中，所述液-液离心萃取设备为CTL350-N，产能1000～3000L/h；

步骤N10中，所述絮凝剂为ZTC 1+1天然澄清剂；所述絮凝沉淀温度为60～80℃；所述沉淀时间为4～6h；

步骤N11中，所述脱色剂为活性白土或活性碳；

步骤N9、N10、N12、N16、N20、N24、N29、N31中，所述浓缩器为MVR蒸发器或全电蒸发器或膜浓缩机组；所述MVR蒸发器或全电蒸发器浓缩温度为55～60℃；真空度为0.07～0.085Mpa；所述该设备产能为500～4000L/h；

步骤N13中，所述自动刮刀离心机型号为PGZ-1000；

步骤N14中，所述溶剂为体积分数30～60％、PH4～6乙醇或甲醇；所述上柱液溶质浓度为5～12g/L；

步骤N15中，所述大孔树脂系统为全自动控制大孔树脂柱系统；所述大孔树脂为D001或HD-8或711或ML-7大孔树脂；大孔树脂吸附流速2～3BV；洗脱溶剂为体积分数30-60％的乙醇；洗脱液流速3～5BV；

步骤N18中，所述上柱液溶质浓度5～15g/L；

步骤N19中，所述大孔树脂为HZ202或D201或D241或D261；所述吸附流速为3～4BV/h；洗脱液分别用去离子水、PH4～6、体积分数85～95％乙醇或甲醇；所述去离子水洗脱流速为2～3BV/h；所述乙醇或甲醇梯度洗脱流速为3～5BV/h；

步骤N22中，所述结晶溶剂为体积分数30～60％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N24中，所述析晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇；每次搅拌时间10～30min；所述析晶温度为40～50℃→-15℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N26中，所述结晶溶剂为体积分数75～85％乙醇或甲醇或丙酮；每次搅拌时间10～30min；所述结晶温度为40～50℃→5℃；每次结晶时间为12～24h；所述结晶釜为全自动控制的8000L结晶釜；

步骤N28中，所述母液浸膏为虫草素含量≥50％以上的结晶母液浸膏；

步骤N29、N30中，所述超临界干燥装置为200L双萃双分电加热全自动控制的超临界干燥装置；超临界干燥并脱残溶压力为20～30Mpa、干燥温度为40～60℃、CO₂流量为1500～4500L/h、干燥时间为360～480min；

步骤N31中，所述批量V型混合机为V-1000；批量混合时间为30～60min。