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CN113614532A - 沉积用于显微镜检查的生物样品的自动液体处理系统和方法 - Google Patents

沉积用于显微镜检查的生物样品的自动液体处理系统和方法 Download PDF

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CN113614532A
CN113614532A CN201980094204.7A CN201980094204A CN113614532A CN 113614532 A CN113614532 A CN 113614532A CN 201980094204 A CN201980094204 A CN 201980094204A CN 113614532 A CN113614532 A CN 113614532A
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automated liquid
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王兆强
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Yantai Ausbio Laboratories Co ltd
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Yantai Ausbio Laboratories Co ltd
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Abstract

用于处理至少一个显微镜样品载体(1)中的多个样品的自动液体处理系统，显微镜样品载体(1)包括多个样品沉积孔(102)，其中每个样品沉积孔(102)在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面(101)限定，自动液体处理系统包括：适于离心显微镜样品载体(1)的离心机；自动运输装置，其适于将多个样品和/或多种液体转移进和/或转移出所述显微镜样品载体(1)的多个样品沉积孔(102)中的每一个、并且适于运输显微镜样品载体(1)穿过自动液体处理系统，其中自动运输装置被配置为与显微镜样品载体(1)的联接部分(103)联接；用于接收和/或储存多个样品和/或多种液体的一个或多个储存容器。

Description

沉积用于显微镜检查的生物样品的自动液体处理系统和方法
技术领域
本发明涉及用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的自动液体处理系统、以及由自动液体处理系统执行的用于处理沉积在显微镜样品载体上的多个生物样品的多个第一部分的方法。根据本发明的自动液体处理系统和方法适用于高通量显微分析，特别是在细胞学分析领域。
背景技术
细胞学诊断广泛应用于医学的各个分支。它是指分析患者个体细胞的结构、功能和形成，从而得出患者的生理状况并诊断各种疾病或疾病级数。
对于细胞学分析，从患者的体液中获取样品，例如血液、唾液、尿液、上皮涂片或精液，并将其放置在玻璃显微镜载玻片上进行检查。优选地，样品均匀地分布在显微镜载玻片上，从而能够准确地分析样品的每个单个细胞的结构。均匀的样品分布也是有效实现自动化显微镜诊断的关键。显微镜系统通常在完全或交互式用户控制下采用计算机驱动的载物台，以预先编程的方式扫描显微镜载玻片表面。因此，应明确定义感兴趣的(一个或多个)区域的边界，并将其限制在与可用于显微分析的光学技术和时间相称的实际尺寸。
用于细胞学分析的样品沉积的几种实施在现有技术中是已知的。
例如，涂片制备技术经常用于将样品手动沉积到显微镜载体上。这种手动涂片技术相当便宜，但需要一定的能力和技能的从业者。而且，很难获得细胞和细胞类型的均匀分布。特别是大细胞，如单核细胞、其他大白细胞或任何异常大的其他细胞，如癌细胞，往往会被吸引到涂片的末端，即羽毛边缘，因此可能无意中被排除在显微分析之外。
作为手动涂片准备的替代方法，细胞离心机通常用于将生物细胞样品沉积到显微镜载玻片上。在这里，将少量液体样品放置在显微镜载玻片或另一个样品接收表面上，然后进行离心步骤。作用在样品上的离心力甩掉多余的液体并使样品径向扩散，形成一个薄层，覆盖载玻片上的样品区域。这样的处理允许样品中的细胞团块可以部分地分解，并且形成具有最小的不定细胞重叠的薄的样品层。然而，由于作用在载玻片表面的离心力，液体样品向四面八方扩散。因此，细胞离心机设备需要结合废物捕获装置，例如滤纸、真空泵或孔(wells)。因此，细胞离心机的构造是复杂且昂贵。此外，细胞离心机的一个固有问题是每个样品使用一个显微镜载玻片。即使在一个载玻片上有多个沉积点，例如通过对载玻片实施物理屏障，每个离心步骤也只能应用一个样品。此外，由于样品在装载到细胞离心机样品室期间发生沉降，可能会发生由其他相同样品制备的载玻片之间不希望有的不同和差异。因此，必须注意最大限度地减少离心前将样品装载到离心机样品室所需的时间，以及样品体积和排出口覆盖的表面积。相反，细胞离心机的样本容量限制会限制可以检测到的细胞浓度。因此，细胞离心机的准确性可能不足以进行某些细胞学分析，例如检测稀有细胞。
在现有技术中也描述了样品单层打印方法。例如，US2011/0070606描述了一种用于分析来自体液的细胞的系统，包括用于分配包括含有细胞的体液的流体的施加器，所述施加器包括施加器控制器和用于将流体分配到载玻片上的尖端；所述尖端具有位于载玻片上方的位置。
此外，US2016/0202278描述了一种用于处理多种细胞悬液的方法。
尽管在制备用于样品沉积的显微镜载玻片的方法方面取得了上述技术进步，但显微镜载玻片本身的设计并没有从根本上改变。通常，显微镜载玻片是由玻璃制成的，因此是易碎的样品载体。因此，所有上述用于沉积样品的准备方法和装置都需要专门设计以防止显微镜载玻片在受到物理力时破裂，例如在分配样品、离心或其他处理程序期间。此外，玻璃载玻片不容易实现高通量应用，因为很难实现多个载玻片在各种制备模块(即沉积、干燥、固定、染色、漂洗、反应和成像处理)中的自动移动。典型的处理步骤包括改变染色剂和溶剂，通常是通过将一个或多个载玻片从一个处理剂容器中依次提起并将它们降低到不同的处理剂容器中。这样的处理可能导致没有粘附到显微镜载玻片上的细胞丢失，甚至导致处理溶液和最终其他显微镜载玻片的污染。
US4，722，598中已经提出了显微镜载玻片的变型。该文献描述了一种包括多个样品井的诊断显微镜载玻片。该载玻片适于与自动显微镜载物台一起使用。这种显微镜设计允许在单个载玻片中沉积多个样品，但不便于制备样品所需的上述处理步骤。
因此，仍然需要一种改进的方法和系统来提高制备用于显微镜检查的载玻片的效率和准确性，特别是在显微镜样品是含有生物细胞的液体的情况下。理想情况下，这种方法和系统应该允许以自动化、并行的方式处理样品，以实现高通量制备和显微分析。
发明内容
在本发明的第一方面中，通过用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的自动液体处理系统至少部分地解决了上述问题，其中所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积孔在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，所述自动液体处理系统包括：
-离心机，所述离心机适于离心所述显微镜样品载体；
-自动运输装置，所述自动运输装置
适于将多个样品和/或多种液体转移进和/或转移出所述显微镜样品载体的多个样品沉积孔中的每一个，
并且适于运输所述显微镜样品载体穿过所述自动液体处理系统，其中所述自动运输装置被配置为与所述显微镜样品载体的联接部分联接；
-一个或多个储存容器，所述一个或多个储存容器用于接收和/或储存多个样品和/或多种液体。
根据本发明的自动液体处理系统允许处理显微镜样品载体内的多个样品以用于随后的显微镜检查，包括例如样品沉积、染色和洗涤的处理步骤。显微镜样品载体的样品沉积表面彼此物理分离，从而防止在沉积期间样品的任何交叉污染。特别地，合适的样品可以是生物样品，例如生物细胞的悬液。在这种情况下，样品沉积表面适于保持样品的第一部分，例如悬液的生物细胞。沉积在样品沉积表面上的样品的第一部分可以进行显微镜分析，例如使用光学或荧光显微镜，特别是在倒置模式配置中。
所述自动液体处理系统还可以包括第一安装装置，所述第一安装装置适于保持显微镜样品载体以通过所述自动运输装置将多个样品和/或多种液体转移进和/或转移出多个样品沉积孔中的每一个。所述安装装置用于在样品处理期间稳定地保持一个或多个显微镜样品载体。特别地，第一安装装置可适于平行地保持多个显微镜样品载体。这样的布置允许对要沉积在显微镜样品载体中的样品进行高通量处理。
所述自动液体处理系统还可以包括第二安装装置，所述第二安装装置适于保持所述一个或多个显微镜样品载体以在显微镜下检查的多个样品的检查。所述一个或多个显微镜样品载体可借助于所述自动运输装置运送到所述第二安装装置。第二安装装置的提供允许满足显微分析的特定要求，例如适应显微镜的光路的几何形状。特别地，第二安装装置可适于包括用于保持显微镜样品载体的装置，使得显微镜样品载体的样品沉积表面不被第二安装装置覆盖。这允许对沉积在样品沉积表面上的样品进行光学显微分析。例如，仅显微镜样品载体的侧壁、其部分或顶表面可由第二安装装置保持或固定。
自动液体处理系统还可以包括用于在显微镜检查期间保持所述第二安装装置的机动显微镜载物台。重要的是，能够保持一个或多个显微镜样品载体的第二安装装置因此可以由机动显微镜载物台控制。因此，对于高通量并行处理，仅需要一个机动载物台及其控制来将显微镜样品载体正确定位在自动液体处理系统的所有显微镜的光路中。所述机动载物台允许正确调节一个或多个显微镜样品载体，尤其是样品，例如生物细胞，这些样品沉积在显微镜焦平面中的样品沉积表面上。此外，机动载物台允许在显微镜视场内顺序定位一个或多个显微镜样品载体的每个孔。机动载物台还可以精确定位每个孔内的视场。通常，通过精确移动孔，例如在x和/或y方向移动161μm至923μm，可以扫描每个孔的xy平面中的多个视场。这对于大放大倍率的物镜(例如1000倍放大)尤其重要，这样每个孔的整个表面都可以顺序成像。由此，可以对孔中提供的样品进行逐步自动成像。
所述自动液体处理系统可进一步包括图像处理单元。图像处理单元可以包括一个或多个相机成像设备，例如一个或多个CCD、EMCCD或CMOS相机，每个相机联接到一个显微镜的光路中。或者，也可以将两个照相机联接到显微镜上，例如在要获得双色图像的情况下。(一个或多个)相机用于获取视场中感兴趣对象的图像或图像序列。所获取的图像或图像序列可以在由作为自动液体处理系统的一部分的计算机系统提供的成像处理软件中进一步处理。图像处理可以是自动化的，使得软件自动校正激光束强度分布、检测和/或跟踪视场中的微粒(例如生物细胞)，如果微粒在成像前被染色，确定细胞的尺寸分布、确定微粒或部分微粒的染色或染料强度，如果微粒被两种或更多颜色染色，确定每个微粒的不同染色或染料的比率，等等。
所述自动液体处理系统还可以包括机动显微镜载物台，所述机动显微镜载物台包括适于保持所述显微镜样品载体以在显微镜下检查所述多个样品的一个或多个安装部分。通过将机动载物台和安装部分组合在一个组件中，可以降低整个系统的复杂性，尽管与保持第二安装装置(其能够保持多个显微镜样品载体)的机动载物台相比，成本可能更高。显微镜样品载体可以直接转移，例如从离心机转移到机动载物台的安装部分。特别地，安装部分可适于包括用于保持或固定显微镜样品载体的装置，使得显微镜样品载体的样品沉积表面不被安装部分覆盖。如上所述，这允许对沉积在样品沉积表面上的样品进行光学显微分析。
然而，为了并行处理，目前优选使用如上所述的能够保持第二安装装置的机动载物台。
所述自动液体处理系统可进一步包括用于对所述至少一个样品进行显微镜检查的装置，优选一个或多个倒置显微镜。特别地，倒置显微镜适合于对沉积在显微镜样品载体的显微镜沉积表面上的样品进行成像，因为样品，例如生物细胞，沉积在平坦层中。此外，使用倒置显微镜，无需在成像前干燥样品沉积表面，因为该表面直接从下往上成像，从而避免了孔中残留的液体(例如洗涤缓冲液)的干扰信号。此外，与正置显微镜相比，侧壁的高度和显微镜样品载体孔内的上清液并不限制样品的成像，尤其是在更高的放大倍率下。此外，倒置显微镜装置的使用有利于样品分析的自动化，因为它允许显微镜样品载体独立于显微镜模块的位置，在自动液体处理系统中自由移动。
所述第一和/或第二安装装置和/或安装部分可以适于平行地保持多个显微镜样品载体。显微镜样品载体的这种平行排列允许样品的高通量处理。所述平行布置可包括将所述多个显微镜样品载体保持在一个平面内。这有助于样品的显微检查，因为一个或多个显微镜可以对同一焦平面成像。
所述自动液体处理系统可包括显微镜模块，所述显微镜模块包括至少一个机动显微镜载物台，优选如上定义的机动载物台，以及用于对所述至少一个样品进行显微镜检查的装置，优选地一个或多个倒置显微镜。其中所述显微镜模块布置在所述自动液体处理系统内的固定位置。该位置可以由自动液体处理系统的用户预定义到特定的、通常可变的位置。
所述自动运输装置可以适于在x、y和z方向上运输至少一个显微镜样品载体穿过所述自动液体处理系统，并且适于将所述至少一个显微镜样品载体运输到所述显微镜模块，其中所述显微镜模块与所述自动运输装置物理分离。
因此，通过将显微镜模块与自动传送装置物理分离，显微镜模块和自动运输装置之间没有物理接触。因此，自动运输装置不会干扰显微镜模块。这确保自动运输装置和显微镜模块之间不会发生振动/冲击干扰。
所述自动液体处理系统可进一步包括适于在预定温度和/或大气下孵育所述显微镜样品载体的孵育器。孵育器可以联接到第一和/或第二安装装置和/或连接到一个或多个安装部分，以允许在特定的温度和大气条件下孵育显微镜样品载体中的样品。特别地，该孵育器可允许在10℃至50℃、优选20℃至40℃、更优选约37℃的温度范围内孵育显微镜样品载体以及其中的任何样品。温度取决于包含在显微镜样品载体中的生物样品。孵育器还可允许在0至20％之间，优选地2至10％之间，更优选地约5％的CO2浓度下进行孵育。这样的浓度使得包含在适当缓冲液中的生物样品，特别是哺乳动物细胞培养物保持在适当的pH值。
此外，储存容器可以配备有孵育器，该孵育器允许在预定温度和/或大气下孵育储存在储存容器中的样品和/或液体。
自动液体处理系统的离心机可以如专利申请WO2013/117606中所述提供。
具体地，适用于离心显微镜样品载体的离心机可以包括样品载体接受器，其可以围绕旋转轴线R旋转，并且具有在装载过程中可以将显微镜样品载体插入其中的保持部分，并且在卸载过程中可以将显微镜样品载体从所述保持部分移除。样品载体接受器可被实施为用于容纳一个或多个显微镜样品载体。特别地，样品载体接受器可被实施为用于容纳一个显微镜样品载体。
所述一个或多个显微镜样品载体可以基本上平行于旋转轴线R延伸，即，每个显微镜样品载体的孔可以布置在平行于旋转轴线R的轴上。
所述离心机还可包括离心机平台，所述离心机平台被实施为用于设置离心机。离心机平台可以平行于旋转轴线定向。
离心机的旋转轴线可以水平定向。水平轴线允许在一个平台上布置几个离心机模块，其中每个离心机可以单独控制。因此，可以将多个显微镜样品载体彼此单独离心，而不必将它们组合在一个共同的批次中(随机访问处理)。水平轴线两端可旋转固定。因此，与具有仅一端固定的水平旋转轴线的离心机相比，可以处理更大程度的不平衡。
旋转轴线优选偏心地穿过样品载体接受器。
样品载体接受器可以在沿旋转轴线R的方向彼此间隔开的两个支承点处安装到离心机壳体，其中样品载体接受器能够相对于壳体围绕旋转轴线R旋转并且其中所述保持部分设置在支承点之间。
优选地，样品载体接受器的旋转轴线与旋转驱动单元(特别是电动旋转驱动单元)的输出轴的旋转轴线重合。在这种情况下，驱动单元可以直接驱动样品载体接受器，即没有中间的增速或减速传动装置。这不仅进一步减少了所需部件的数量，而且还生产了一种占用空间很小的样品载体离心机，因此它也可以用于实验室中，其中只有用于设置实验室设备的少量空间(仍然)可用。
所述离心机可设置有离心机壳体，所述离心机壳体配备有进入开口，所述进入开口可以通过可移动地安装到离心机壳体上的盖子来关闭和打开。优选地，提供用于通过盖子打开和关闭进入开口的单独的驱动电机，特别是在样品载体接受器与旋转驱动单元的输出轴的上述直接联接的情况下，该单独的驱动电机可以被设置为紧挨着样品载体接受器的旋转驱动电机，而不会占用会增加离心机壳体尺寸的额外空间。例如，用于盖子的驱动电机也可以是电驱动电机，其输出轴可以平行于用于样品载体接受器的旋转驱动单元的输出轴定向。
为了处理以不同时间间隔(其短于单个测试所需的离心持续时间)等待离心的多个样品载体接受器，离心机可以配备多个样品载体接受器，优选地具有平行的旋转轴线，特别优选地每个样品载体接受器具有一个离心机壳体。优选地，可以单独驱动样品载体接受器。
尽管离心机模块实际上也可以基本上以重合的即同轴的旋转轴线布置，但旋转轴线的平行布置是优选的，因为否则，样品载体旋转驱动单元位于连续的样品载体接受器之间，结果模块化构造的样品载体离心机在外观上可能是复杂的。在平行旋转轴线的优选情况下，样品载体接受器可以在非常有限的空间中彼此相邻放置，从而促进它们的自动装载和卸载，以便操作人员不再需要移动要离心的样品载体，而是可以通过自动化设备移动，从而有利地降低样品载体中样品污染的风险。
为了便于样品载体的自动处理和模块化构造的样品载体离心机的特别期望的自动装载和卸载，多个样品载体接受器的旋转轴线可以基本上位于共同的旋转轴线平面中。优选地，样品载体离心机的平台然后平行于旋转轴线平面。
因此，可以想到的是生产一种离心机装置，其中一个或多个样品载体接受器的装载和卸载可以由自动液体处理系统的样品运输装置进行。
所述自动液体处理系统可进一步包括所述至少一个显微镜样品载体。因此，显微镜样品载体可以是自动液体处理系统的组成部分。
所述多个样品沉积孔可以布置成使得所述样品沉积表面基本上在一个平面内。通过将多个样品沉积表面布置在一个平面中，可以对每个样品沉积表面进行自动显微分析。在这种情况下，由于表面基本上在一个平面上，因此只需要对焦点进行微小的调整。因此，可以以快速的方式执行表面扫描和图像获取。
所述多个样品沉积孔以规则图案布置，使得相邻样品沉积表面之间的距离恒定。这种布置允许具有恒定隔开的移液通道的平行自动运输装置可用于将多个样品同时施加到显微镜样品载体上。
样品沉积表面可以是平面。通过使用平面样品沉积表面，可以实现要沉积样品的均匀分布。这种布置是有利的，如果要沉积到样品沉积表面上的样品是生物细胞，其应该沉积在均匀的单层中。
每个样品沉积孔可具有朝向样品沉积表面的锥形形状。通过以锥形形状形成每个孔，可以选择足够小的样品沉积表面的表面积以在显微分析期间用作视场。然而，相对大的顶部开口允许容易地进入孔以进行抽吸和/或分配。样品沉积表面的小表面积也允许仅沉积小样品体积或低浓度的感兴趣对象以用于显微分析，例如低浓度的生物样品的细胞。
所述显微镜样品载体可以部分或全部由不透明材料组成，优选地，其中所述显微镜样品载体的侧壁由不透明的塑料材料组成。这种不透明材料具有低的透光率值，例如对于生物样品的光学显微镜中通常使用的波长(约450nm至650nm)其值低于10％，防止成像期间来自相邻孔的光散射和反射的光学干扰。
样品沉积表面可以由透明材料组成，特别是适用于光和/或荧光显微镜的透明塑料材料。这种透明的，例如塑料材料，对于生物样品的光显微镜中使用的波长(约450nm至650nm)通常具有至少50％的透光率。
在450nm～650nm波长范围内，显微镜沉积表面的透光率值可能高于沉积孔的侧壁的透光率值。如上所述，这减少了光散射问题并确保了高质量的成像。
每个样品沉积表面可以具有在0.5mm2和20mm2之间、优选在1mm2和15mm2之间、最优选在6.6mm2和11.18mm2之间的面积。这些区域允许每个表面有一个或多个视场，这取决于所使用的显微镜物镜。
每个样品沉积孔的体积可以在2μL至700μL之间，优选在5μL至500μL之间，更优选地在20μL至60μL之间。这些体积通常足以处理样品，特别是细胞悬液。根据样品中感兴趣微粒的浓度，例如细胞悬液中的特定细胞类型，可以将样品直接施加到显微镜样品载体中进行离心，或者，可以通过使用梯度密度离心步骤对样品进行预浓缩。
显微镜样品载体可以由合适的塑料材料模制成整体，例如聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、丙烯腈-苯乙烯共聚物、腈-丙烯腈-苯乙烯共聚物、聚苯醚、苯氧基树脂、乙酸丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素等。显微镜样品载体也可以通过增材制造方法制备。显微镜样品载体也可以由玻璃制备。在显微镜沉积表面和孔的侧壁由不同透光率值的材料组成的情况下，显微镜样品载体可以在两种材料注入过程中(例如在增材制造期间)统一地形成。或者，样品沉积表面和侧壁在单独的工艺中形成，并通过超声波焊接、胶合等方法粘合。每个样品沉积孔可以由一个或多个侧壁与样品沉积表面之间形成的角度限定，其中所述角度在70°和110°之间，优选地在80°和100°之间，最优选地大约90°。通常，优选侧壁和样品沉积表面之间的角度尽可能接近90度。该角度通常取决于所应用的制造技术，例如模塑技术。
每个样品沉积表面可以具有在0.5mm2和20mm2之间、优选在1mm2和15mm2之间、更优选在6.6mm2和11.18mm2之间的面积。每个样品沉积表面的厚度可以在0.1mm至0.4mm之间，优选在0.15mm至0.35mm之间，更优选为约0.3mm。
可选地，厚度可为约0.13mm至0.17mm，或约0.17mm至0.19mm或约0.17mm至0.25mm，这与常规盖玻片厚度(例如盖玻片#1.5或#2)相当，特别是厚度可以是大约0.17mm到0.25mm。然而，与约0.3mm的厚度相比，这种较薄的厚度生产成本更高。
优选地，厚度的标准偏差可以小于0.08mm，优选地小于0.05mm，更优选地小于0.01mm。
样品沉积表面可以布置成一排或多排。因此，具有排成一排的移液尖端的普通自动移液系统可用于将样品沉积到样品沉积表面上。
所述自动运输装置可以包括用于接收显微镜样品载体的联接部分的一个或多个凸缘或凹槽的机械臂或机械夹持器。因此，显微镜样品载体可以很容易地在整个系统中转移。
本发明还涉及一种用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的方法，其中所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积孔在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，所述方法由自动液体处理系统执行，所述方法包括：
-通过所述自动液体处理系统的自动输送装置将多个生物样品中的每个生物样品施加到所述多个样品沉积孔中的至少一个样品沉积孔中；
-通过所述自动液体处理系统的离心机，通过施加离心力将多个生物样品的多个第一部分与多个第二部分分离，其中所述多个第一部分沉积在所述多个样品沉积表面上；
-通过所述自动液体处理系统的所述自动运输装置将所述显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统，其中所述自动运输装置被配置为与所述显微镜样品载体的联接部分联接；
根据本发明的方法允许在一个显微镜样品载体上施加多个样品，例如相同或不同来源的样品。特别地，所述样品可以是液体样品，并且优选包括悬液中的生物细胞。样品沉积和部分分离的组合实现了用于显微分析的样品制备的整体高通量处理。特别地，分离步骤允许将样品适当地沉积到样品沉积表面上。在该方法中，样品沉积表面适于容纳样品的多个第一部分，例如细胞悬液的生物细胞。沉积在样品沉积表面上的样品的第一部分可以用显微镜进行分析，例如使用光学或荧光显微镜。此外，在分离步骤之后，如果需要，例如通过随后的抽吸，可以有效地去除多个第二部分，例如诸如缓冲液、染色剂或洗涤液的液体。然而，通常，从孔中移除第二部分的步骤是可选的，特别是在使用倒置显微镜装置检查样品的第一部分的情况下，其中仅对样品沉积表面进行成像，并且在显微镜的光路中有效地排除来自上方的干扰信号。
在分离步骤中，所述多个表面可以处于垂直于旋转轴线的位置。由此，第一部分可以径向且均匀地散布到样品沉积表面上。
多个第一部分可以以均匀层沉积在多个样品沉积表面上。特别地，第一部分可包括细胞，其可沉积在单细胞厚度的均匀层中。这样可以对样品进行精确成像。
一个或多个或全部样品沉积表面和/或所述显微镜样品载体的侧壁的内表面被制备成与生物样品的多个第一部分或第二部分发生特异性反应。因此，第一部分或第二部分不仅通过离心分离，而且还通过与第一部分或第二部分特异性反应的反应表面分离。此外，由于样品沉积表面形成孔的底部，用户可以用与样品反应的试剂或蛋白质(例如抗体)涂覆表面。因此，孔可以用作孵育室，并且可以读取试剂或蛋白质与部分样品的反应，例如使用比色测定。
特别地，样品沉积表面可涂覆有增加生物细胞对表面的粘附的粘附促进剂。粘附促进剂可以提供特别是亲水性表面，例如明胶、氨基烷基硅烷或聚-L-赖氨酸。样品沉积表面和/或显微镜样品载体的侧壁的内表面可替换地或附加地涂覆有与样品的第一部分和/或第二部分反应的抗体。
该方法可进一步包括以下步骤中的至少一个：
-将沉积的多个第一部分固定；
-对沉积的、优选固定的多个第一部分进行染色；
-清洗所述沉积的、优选固定的多个第一部分；
-通过去除上清液任选地干燥染色或洗涤沉积的多个第一部分，
-利用孵育器在预定温度和/或大气下将所述多个样品和/或多个第一部分孵育预定的时间间隔。
所述干燥步骤可以包括离心显微镜样品载体，优选在50至500克的离心力下和/或0.5至5分钟的离心时间。
所述孵育器可允许在10℃至50℃、优选20℃至40℃、更优选约37℃的温度范围内孵育显微镜样品载体以及其中的任何样品。温度取决于包含在显微镜样品载体中的生物样品。孵育器还可允许在0至20％之间，优选地2至10％之间，更优选地约5％的CO2浓度下进行孵育。这样的浓度使得包含在适当缓冲液中的生物样品，特别是哺乳动物细胞培养物保持在适当的pH值。
优选地，干燥步骤包括从显微镜样品孔中抽吸出上清液。抽吸(例如借助于自动输送装置)确保第一部分仍然适当地沉积到样品沉积表面上，同样在第一部分没有强烈地粘附到样品沉积表面的情况下。这对于敏感的生物细胞尤其重要，它们不通过粘附促进剂粘附到样品沉积表面。
该方法可进一步包括以下步骤中的至少一个：
-通过所述自动液体处理系统的自动运输装置将显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统到安装装置，所述安装装置适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查多个生物样品和/或第一部分，优选地到如上文所定义的第二安装装置，更优选地所述安装装置由上文所定义的机动显微镜载物台保持和/或调整位置；
-通过所述自动液体处理系统的所述自动运输装置将所述显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统到机动显微镜载物台，所述机动显微镜载物台还包括一个或多个安装部分，所述一个或多个安装部分适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查所述多个样品；
-对所述多个生物样品和/或多个第一部分进行显微分析，优选地借助于一个或多个倒置显微镜，优选地借助于上述定义的显微镜模块。
因此，该方法可以包括对多个样品和/或第一部分的自动显微分析。因此，自动运输装置可以将显微镜样品载体内的样品运输和定位到安装装置上，例如上文定义的第二安装装置，并且机动显微镜载物台被布置成在一个或多个显微镜，尤其是一个或多个倒置显微镜的光路内保持和调整安装装置。机动显微镜载物台可允许通过在x和y方向上的受控移动沿多个视场扫描每个样品沉积表面。
显微分析可以包括多个样品和/或第一部分的自动图像分析。
该方法可以由如上所述的自动液体处理系统执行。
本发明还涉及一种用于在至少一个显微镜样品载体中培养生物细胞的方法，其中所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积孔在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，所述方法由自动液体处理系统执行，所述方法包括：
-通过所述自动液体处理系统的自动输送装置将多个生物样品中的每个生物样品施加到所述多个样品沉积孔中的至少一个样品沉积孔中；
-通过所述自动液体处理系统的孵育器孵育所述多个生物样品。
根据本发明的方法允许以自动化的方式处理和培养生物细胞。因此，细胞可以直接在显微镜样品载体中孵育，并在下游应用中进行分析，如在显微镜分析中。
生物样品可以通过由自动液体处理系统执行的上游处理方法获得。该方法可进一步包括所述步骤的一个或多个：
-通过自动液体处理系统的离心机在第一离心管中分离生物细胞的第一部分；
-通过自动输送装置从第一离心管中抽吸生物细胞的第一部分；
-通过自动液体处理系统的自动运输装置将生物细胞的第一部分转移到第二离心管中；
-将第二离心管中的生物细胞的第一部分悬浮在适当的缓冲液中；
-通过自动液体处理系统的离心机在第二离心管中分离生物细胞的第二部分；
-通过自动输送装置从第二离心管中抽吸生物细胞的第二部分；
-通过自动液体处理系统的自动运输装置将生物细胞的第二部分转移到显微镜样品载体上。
如上所述，可以通过孵育来处理生物细胞的第二部分。
该方法可进一步包括所述步骤的一个或多个：
-通过所述自动液体处理系统的离心机，通过施加离心力将多个生物样品的多个第一部分与多个第二部分分离，其中所述多个第一部分沉积在所述多个样品沉积表面上；
-将沉积的多个第一部分固定；
-对沉积的、优选固定的多个第一部分进行染色；
-清洗所述沉积的、优选固定的多个第一部分；
-通过去除上清液任选地干燥染色或洗涤沉积的多个第一部分。
如上所述，用于培养生物细胞的方法可以与用于处理在至少一个显微镜样品载体中多个样品的方法相结合。
本发明还涉及上述方法用于生物样品的分离和显微镜检查的用途。
生物样品可以是任何含有生物元素的流体、凝胶或溶液。例如，要从中提取稀有细胞的生物样品可以是来自人或动物的任何体液或细胞组织的分散体。其示例是血液，特别是外周血，例如静脉血或动脉血、淋巴液、尿液、渗出液、漏出液、脊髓液、精液、唾液、来自天然或非天然体腔的液体、骨髓和分散的身体组织。最优选的体液是外周血。所述生物样品可以包括细胞、血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、红细胞、白细胞、淋巴细胞、上皮细胞、干细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、细胞前体、造血干细胞、间充质细胞、基质细胞、血小板、精子、卵子、卵母细胞、微生物、微生物、细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒、细胞器、细胞核、核酸、线粒体、胶束、脂质、蛋白质、蛋白质复合物、细胞碎片、寄生虫、脂肪滴、多细胞生物、孢子、藻类、上述的簇或聚集体，可以进行显微镜分析。
附图说明
下面将参考附图更详细地解释本发明的方面。这些附图表示：
图1a-d：根据本发明的实施例的显微镜样品载体的示意图；
图2a、图2b:根据本发明的实施例的自动液体处理系统的示意图；
图3a-d:根据本发明实施例的离心机的一部分的示意图；
图4a-j:根据本发明实施例的自动液体处理系统的部分的示意图；
图5：根据本发明实施例的显微镜样品载体的样品沉积表面的扫描模式；
图6：根据本发明实施例的方法的工作流程；
图7a-f:根据本发明实施例的自动液体处理系统的部分的示意图。
具体实施方式
在下文，更详细地描述根据本发明的实施例和变型。然而，要强调的是，本发明不限于这些实施例和变型。还提到的是，在下文中仅可以更详细地描述本发明的各个实施例。然而，技术人员将认识到，在本发明的范围内，还可以以不同方式修改或组合与显微镜样品载体、样品捕获架或方法的这些特定实施例相关的特征，并且如果在给定的情况下这些特征似乎是可有可无的，则也可以省略个别特征。
本发明涉及一种用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的自动液体处理系统，以及用于这种处理的由自动液体处理系统执行的方法。
特别地，本发明允许制备生物流体的单细胞厚度的薄层涂片，用于高通量的诊断评估。因此，可以在显微镜载玻片表面上创建高质量、未失真的细胞涂片，具有可用于差异计数和形态学、组织化学、荧光、放射自显影和各种其他类型的生物测试的高细胞数密度。此外，由于样品沉积表面布置为孔的底部，显微镜样品载体的这些井可用作反应容器或器皿，例如用于培养微生物和细胞。
图1a示出了根据本发明的显微镜样品载体(1)的实施例的示意图。在本实施例中，14个样品沉积表面(101，未示出)在一个平面内规则地布置并且进一步地排成一排，即相邻样品沉积表面之间的距离相等。然而，也可以想到的是样品沉积表面布置成多行，例如类似于96-孔系统。此外，在本实施例中，样品沉积表面设置为平坦表面，每个样品沉积表面形成孔(102)的底表面。因此，每个沉积表面与相邻沉积表面物理分离。根据图1a的显微镜样品载体(1)包括联接部分(103)，联接部分(103)设置在由多个孔(102)形成的排的中央，其中联接部分(103)可以与自动移液通道(例如CO-RE)兼容，从而能够在不干扰样品沉积表面的情况下处理显微镜样品载体。然而，也可以想到通过机械臂或夹持器来处理显微镜样品载体的其他方式。
图1b示出了图1a的显微镜样品载体的侧视图。
图1c示出了图1a的显微镜样品载体(1)的俯视图。
图1d示出了图1a的显微镜样品载体(1)的截面图。如图1d所示，孔(102)可以具有从顶表面到形成样品沉积表面的底表面的直线形状。或者，还可以想到的是孔(102)具有朝向底表面的锥形形状。
图2a示出了根据本发明的自动液体处理系统的实施例的示意图的俯视图。在该实施例中，自动液体处理系统包括移液通道模块(201)、离心机模块(202)、适于保持多个显微镜样品载体的第一安装装置(203)、以及用于接收和/或储存一种或多种样品和/或一种或多种液体的储存容器(204)。移液通道模块(201)包括自动运输装置以将多个样本或液体传送进和传送出显微镜样本载体。此外，移液通道模块(201)被布置成包括自动运输装置，其允许显微镜样品载体在整个系统中的运输。不同的组件被定位在平台(205)上，该平台(205)包括具有在x方向上的导轨(206)和在y方向上的导轨(207)的传送部分。移液通道模块(201)的移液通道附接到传送部分，使得可以在x轴线和y轴线上移动。此外，移液通道可以在垂直方向上移动，以穿过平台拾取和运输显微镜样品载体和/或从储存容器中拾取液体或样品。
图2b示出了根据本发明的自动液体处理系统的实施例的另一示意图的俯视图。根据该实施例，除了以上参照图2a提到的元件之外，自动液体处理系统还包括两个倒置显微镜(208)和可在xy平面内可移动的机动显微镜载物台(209)。机动载物台包括用于放置和保持两个显微镜样品载体的第二安装装置(210)。还可以想到的是，第二安装装置可以保持一个显微镜样品载体，或者第二安装装置适于保持三个或更多个显微镜样品载体，从而便于对沉积在多个显微镜样品载体中的多个样品进行平行观察和显微检查。或者，每个显微镜可以包括机动载物台和用于显微镜样品载体的合适的第二安装装置、或者包括安装部分的机动载物台。
图3a-d示出了适于离心显微镜样品载体的离心机(302)的示意图。
如图3a所示，根据该实施例的离心机包括布置在平行旋转轴线上的四个样品载体接受器(312)。每个样品载体接受器(receptacles)(312)连接到旋转驱动单元(未示出)，该旋转驱动单元在操作期间执行样品载体接受器(312)围绕旋转轴线R的旋转。此外，在操作期间，每个样品载体接受器(314)可以由可移动地安装到包围离心机的离心机壳体上的盖子(313)覆盖。每个样品载体接受器适于容纳一个显微镜样品载体。然而，还可以想到的是，离心机中包括少于或多于四个样品载体接受器，和/或样品载体接受器可以容纳两个或更多个显微镜样品载体。
在操作过程中，盖子保护装载到样品载体接受器中的显微镜样品载体中的样品。优选地，提供用于打开和关闭盖子的单独驱动电机。盖子(313)，优选地在其大圆周表面上可以具有至少一个接合结构(314)，优选地具有多个接合结构(314)(例如呈小齿的形式)，其设置在离心机壳体中的对应的接合结构(例如齿轮)可以通过形状锁定啮合驱动以执行打开和关闭运动，以便能够打开或关闭盖子。
在图3b中，示出了在将四个显微镜样品载体(1)装载到四个样品载体接受器(312)的过程中的离心机。在这个实施例中，自动运输装置包括移液通道(311)，移液通道311将显微镜样品载体(1)转移到每个样品载体接受器中，使得在离心过程中显微镜样品载体完全集成到接受器中(如前面的显微镜样品载体所示)。在转移之后，移液通道(311)与显微镜样品载体断开，从而可以开始离心步骤。
图3c示出了离心机模块(302)的示意性俯视图，其中四个显微镜样品载体装载到四个样品载体接受器中。
图3d示出了装载有显微镜样品载体的样品载体接受器的另一实施例。当放置在离心机中时，例如在图3a至图3c所示的离心机中，样品载体接受器沿旋转轴线R旋转，如图所示。
图4a示出了根据本发明实施例的自动液体处理系统的另一视图。根据该实施例，自动液体处理系统包括移液通道模块(401)、两个离心机模块(402)、用于保持多个显微镜样品载体的第一安装装置(403)、以及用于接收和/或储存一种或多种样品和/或一种或多种液体的储存容器(未示出)。移液通道附接到传送部分，使得可以在x轴线和y轴线上移动。如上所述，移液通道可以在垂直方向上移动，以拾取和运输显微镜样品载体穿过平台。此外，自动液体处理系统包括具有四个倒置显微镜(408)的显微镜模块。或者，更少，例如一个或两个倒置显微镜，或更多的显微镜可以包括在自动液体处理系统中。第二安装装置(410)允许同时定位用于成像的显微镜样品载体。在该实施例中，第二安装装置(410)根据显微镜的数量承载四个显微镜样品载体。
图4b示出了图4a的显微镜模块的示意图。四个倒置显微镜(408)附接到壁结构(412)，壁结构(412)集成到框架结构(413)中。第二安装装置(410)安装在机动载物台(409)上，这允许适配器在xy平面中的精确移动。提供光源(414)，以便能够通过一个或多个显微镜检查包含在显微镜样品载体中的内容。在所示的实施例中，四个倒置显微镜(408)中的每一个都可以具有自己的光源(414)。更具体地，当从离心机模块(402)的方向观察时，光源可以定位在显微镜后面。如下面将进一步详细解释的，在显微镜后面提供光源是可能的，因为光源的光束可以在基本上水平方向(x方向)上进入歧管装置的隧道，其中光反射物体(例如棱镜)将光束沿垂直方向(y方向)向下投射到显微镜样品载体，或者更具体地，投射到形成(一个或多个)显微镜样品载体的孔的底表面的样品沉积表面。尽管显微镜模块与自动液体处理系统集成在一起，但并不是整个显微镜模块与自动液体处理系统有任何物理接触。这确保了离心机或其他组件的运动不会发生振动/冲击干扰。显微镜模块和液体处理系统的相对位置可以预先定义和固定，以确保机器人在操作过程中的精度。
图4c和图4d示出了集成到自动液体处理系统中的显微镜模块的示意图，显微镜样品载体被转移到显微镜物镜的视场中之前(图4c)和之后(图4d)。在图4c中，四个显微镜样品载体借助于自动运输装置被定位到第二安装装置(410)中。具体地，如图4c所示，一个移液通道被示为将一个显微镜样品载体放置到第二个安装装置中，而另外三个显微镜样品载体已经被装载。在定位之后，机动载物台允许第二安装装置移动到显微镜的方向，使得四个显微镜样品载体中的每一个都被定位到显微镜的相应物镜上。根据图4d的示例性视图，每个显微镜样品载体最左侧的孔位于每个显微镜单元的顶部。
图4e从另一个俯视透视图示出图4d的显微镜模块。
图4f以从下向上的视角描绘了液体处理系统的显微镜模块。在该示意图中，第二安装装置(410)将四个显微镜样品载体定位在四个倒置显微镜的顶部，每个对显微镜样品载体的中央样品沉积表面之一进行成像。在该实施例中，显微镜透镜的聚焦是通过每个倒置显微镜的机动Z轴线实现的。例如，显微镜单元可以包括用于在z轴线上自动聚焦的装置。然而，还可以想到的是，承载用于显微镜样品载体的第二安装装置的机动载物台可以在z轴线上移动以进行聚焦。
图4g从更详细的侧视图描绘了根据图4f的液体处理系统的显微镜模块。特别是，在该示意图中，可以看到用于歧管装置的可能结构的更多细节。在该实施例中，歧管装置作为框架结构提供，为光束提供(一个或多个)隧道，其中框架结构设置在基本上平行于第二安装装置(410)的平面中。光反射装置设置在每个第一水平隧道的末端，以在向下垂直方向投射水平入射光束。作为示例，该图示出了四个隧道中每个隧道末端的棱镜，该棱镜可能被保护盖覆盖。光反射装置可提供将光聚焦到所需形状或直径的便利方式，这取决于应暴露区域(例如，形成显微镜样品载体的(一个或多个)孔的底表面的单个样品沉积表面)的形状和大小。
此外，图4g还示出了光源不是从上方连接到歧管而是在背面，以使得光束能够基本上水平地进入(如前所述)。实验已经表明，该配置提供了比其他实施例更多的优点。特别地，如果光源从背面进入歧管，则歧管装置的顶部没有可能干扰(一个或多个)机械臂或(一个或多个)夹持器的任何移动的物理元件。因此，可便于将显微镜样品载体装载到第二安装装置中或从第二安装装置卸载，特别是因为(一个或多个)机械臂或(一个或多个)夹持器的移动需要高精度。此外，还示出这种布置中的(一束或多束)光束产生的热量比其他配置中的要少。
图4h是所示实施例的另一俯视图，其中四个倒置显微镜中的每一个对显微镜样品载体的中央样品沉积表面之一进行成像(例如，如图4f和4g)。在该图示中，上述优点，即歧管装置顶部上的自由上部区域变得清晰可见。
图4i和4j示出了根据前述实施例的自动液体处理系统的歧管装置、显微镜(408)和第二安装装置(410)的两个横截面。在这些图示中，可以看到设置在歧管装置内的水平布置的第一隧道(415-1)。在操作期间，光源(414)可以在一端进入第一隧道(415-1)，以使光束基本上以水平方式穿过隧道。在第一隧道(415-1)的另一端，可以设置光反射装置(416)，例如棱镜。在垂直向下方向上，在棱镜(416)之后是垂直布置的第二隧道(415-2)。因此，在操作期间，进入第一隧道(415-1)的光源(414)的光束被棱镜向下反射通过第二隧道(415-2)朝向显微镜样品载体的应该被投射的区域。可以为与第二安装装置并行处理的多个显微镜样品载体中的每一个相应地提供所描述的结构。
图5示出了根据本发明实施例的显微镜样品载体的孔的示例性扫描。根据该实施例，根据方案(即在12x12视场中，遵循“S”图案)顺序扫描1号孔的样品沉积表面。扫描是通过显微镜载物台相应的x-y移动来实现的。然而，其他图案也是可以想到的和可编程的。因此，根据该实施例，在1000倍放大下每个孔总共生成144个图像。当第二安装装置或机动载物台的安装部分装载有一个以上的显微镜样品载体时，并行处理能够同时在所有显微镜样品载体上的相同位置生成孔的图像。
下面，参照图6描述根据本发明的方法。在该方法中，使用根据本发明实施例的显微镜样品载体(1)，其包括多个样品沉积表面(601)，每个样品沉积表面形成孔(602)的底表面。在显微镜样品载体(6)的中央，布置与自动液体处理仪器兼容的联接部分(603)，用于处理显微镜样品载体。
显微镜样品载体可以例如如上面参考图1所解释的那样构造，但是也可以使用根据本发明的显微镜样品载体的其他设计。
在图6的步骤a中，相同来源或不同样品来源的液体悬液(604)中的生物细胞样品被施加到显微镜样本载体的孔中。例如，约500μL的细胞悬液(包括血液样品的富集细胞部分)可用于施加。
在样品施加之后，显微镜样品载体(6)可以在合适的离心力和时间下离心，例如当处理血细胞时，200g离心5分钟，优选样品沉积表面垂直于离心机旋转的垂直轴线。
重要的是要注意，初始离心加速度在确保加速度可以遵循线性或非线性速度方面发挥作用，并且最重要的是，它应该逐渐增加，直到达到目标离心速度，而不是突然运动。
申请人在以仅一秒内达到200g的默认速度设置进行测试时意识到这个问题。由于突然加速，样品孔首先经历向孔边的漂移，并且一旦沉积在孔的底表面处，就不在孔的底部均匀分布，细胞被边缘化。
在测试过程中，申请人随后将加速减慢到约30秒或更长时间，逐渐且稳定的加速，然后细胞的均匀分布不受加速的影响。
因此，样品的第一部分(611)，即样品内的细胞和微栓子，以均匀的层沉淀并沉积在样品沉积表面上，而样品的第二部分(未示出)，特别是液体，保留在孔中作为上清液。离心步骤由此导致样品沉积表面上细胞浓度的增加。离心后，可以通过自动运输装置从孔中去除上清液，抽吸出上清液。
在(可选)步骤b中，显微镜样品载体被干燥，例如通过离心机。离心机的速度和时间可以相应地优化，以获得最佳性能。例如，显微镜样品载体可以在150克离心2分钟。该步骤b是特别可选的，以防上清液已经从孔中去除，如上所述。
在步骤c中，样品的第一部分的细胞被固定。可以使用的固定剂包括用于保护生物样品免于腐烂的化学品，此类固定剂可以阻止样本中发生的生化反应并增加样本的机械强度和稳定性。可以使用各种固定剂，包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、EDTA、表面活性剂、金属盐、金属离子、尿素和氨基化合物。例如，可以在每个样品沉积表面施加2至5μL甲醇，并孵育20-30秒。
在步骤d中，对样品进行染色。当在显微镜或其他成像设备下观察或成像时，对样本进行染色会增加样本的对比度。可以使用罗曼诺夫斯基染色剂、赖特-吉姆萨染色剂、吉姆萨染色剂和/或其他染料或染色剂，包括苏木精和伊红、荧光素、使用抗体、核酸探针和/或金属盐和离子的噻嗪染色剂。例如，可以在每个样品沉积表面加入10μL染色液，并孵育3分钟。
重要的是，由于样品沉积表面在物理上彼此独立，可以施加不同的固定剂和染色来处理每个样品，而不会有交叉污染的风险。这可以通过自动液体处理系统上的多个移液通道同时进行。
例如，一个相同的样品可以被施加到所有12个样品沉积表面，用于不同的下游施加。或者，12个不同的样品(例如来自不同患者)可以施加到显微镜样品载体。
在步骤e中，从孔中去除染色溶液，例如通过自动运输装置抽吸。
在步骤f中，漂洗第一部分样品的染色细胞。漂洗溶液包括例如蒸馏水、缓冲液、水溶液、有机溶剂以及有或无缓冲液的水和有机溶剂的混合物。例如，可以在每个样品沉积表面施加10至20微升超纯水，并孵育1分钟。
洗涤后，可以抽吸出上清液，并且可以将样品干燥，例如通过离心。离心的参数可以相对于样品进行优化。例如，显微镜样品载体可在150克离心2分钟以使样品干燥。通常，由于所有细胞在干燥期间经历相同的渗透压变化，因此需要具有快速的细胞涂片干燥速度，这可以提高整个涂片中细胞形态的均匀性。快速干燥薄层使从薄层中去除溶剂的速度快于细胞对溶剂损失的反应速度。然而，洗涤后抽吸和干燥是可选的步骤，特别是在使用倒置显微镜对沉积样品成像的情况下，因为洗涤溶液不干扰成像。
在步骤g中，显微镜样品载体准备好用于成像或任何进一步的下游处理，如荧光原位杂交。由于细胞样品的边界和每个样品沉积表面的相对空间位置(x轴线、y轴线、z轴线)基本上是固定的，因此可以方便地为带机动载物台的数字显微镜编程成像工作流程，以捕获整个样品区域并实现高通量。
根据本发明的方法以及自动液体处理系统可以使用或包括系统，该系统包括显微镜、用于获取显微镜图像的照相机、具有图像处理软件的计算机系统、离心机、ID阅读器、移液通道、样品储存器、固定剂、染色剂、漂洗液的储存器和控制系统。通常，本文公开的系统和方法使用最少的流体量提供高效、无污染和高度均匀的样本处理。根据本发明的方法可以包括一个或多个固定、染色和漂洗阶段。该系统可以作为一个独立的设备、或作为一个更大的系统中的一个组件来实现，用于准备和检查生物样本。对于许多应用，需要高通量操作和低流体消耗。通过保持高通量，可以有效地处理样本以进行后续检查。通过保持低流体消耗量，减少了处理废物量以及所需的处理试剂量，保持低的操作成本。
图7a至图7f示出了根据本发明的另一实施例的自动化液体处理系统的部件的示意图所示的实施例对应于图4a-图4j所示的实施例，其中替代向后定位的光源(和相应的歧管装置)，光源被布置成使得从上方向歧管装置提供光束。虽然该实施例可能不能完全提供先前描述的特定优点，例如结合图4g，本实施例允许其他益处：例如，可以使用歧管装置的更简化的结构，例如不需要两个隧道和诸如棱镜的光反射装置。此外，在自动液体处理系统内，歧管装置的背面上可以有更多的空间用于其他目的。图7a至图7f的图示与图4a至图4f的图示相对应，其中对应的元件使用与图4a至图4f相同的附图标记。
下文描述了根据本发明的其他示例性方法。
示例1：从全血获得的PBMC培养物的处理及成像
接收全血样本，例如约1.5至2毫升全血，这取决于进一步的处理。
将样品转移到离心管中，通过以150g离心15分钟，然后以400g离心20分钟来分级(fractionated)样品。可以通过自动液体处理系统的自动运输装置转移样品。
通过相机模块手动或优选自动检测包含外周血单核细胞的层(PBMC层)。
PBMC层的体积约为150至200μL，被抽吸出并转移到一个新管中。抽吸和转移可以由自动液体处理系统的自动运输装置执行。
将大约1mL培养基(例如RPMI-1640)添加到新管中(例如从包括在自动液体处理系统中的一个储存容器)并悬浮。
随后，通过在200克下离心10分钟，将PBMC沉淀。
将上清液去除(例如通过自动运输装置)，向管中加入补充有10％胎牛血清的1ml新鲜培养基(RPMI-1640)并悬浮。
抽吸出约50μl重新悬浮的含PBMC的悬液并将其转移到显微镜样品载体的样品沉积孔中。
在这种情况下，自动运输装置连接到移液管尖端，其允许抽吸样品并将其转移到一个或多个显微镜样品载体的一个或多个样品沉积孔中。
随后，自动运输装置将装载有样品的(一个或多个)显微镜样品载体运输到离心机。为了运输，自动运输装置直接连接到显微镜样品载体的联接部分。以200克离心10分钟使细胞沉淀。
然后将显微镜样品载体运送到孵育器中的培养位置(保持在37℃、5％CO2)，从而培养提取的细胞。
示例2：细菌细胞培养物的处理和成像
下面描述了用于提取和培养包含在循环免疫细胞(CIC)中的细菌细胞的方法。CICs可能通过吞噬作用吞噬细菌，或者替代细菌可能与CICs结合。该方法可以通过自动液体处理系统完全自动化。
首先获取全血样本。
将样品转移到离心管中，通过以150g离心15分钟，然后以600g离心20分钟来分级样品。
通过摄像机模块手动或优选地自动检测包含圆形免疫细胞的层(CIC层)。
CIC层的体积约为150至200μL，被抽吸出并转移到一个新管中。
将约1毫升脑心浸出液肉汤(BHI肉汤)添加到新管并悬浮。
在另外的管中，通过将预定量的金黄色葡萄球菌ATCC29213和/或大肠杆菌ATCC25922分别添加到1mlBHI肉汤中来制备细菌滴定标准品。
从每个管中，即包括再悬浮CIC层的管和包括细菌细胞标准品的管，抽吸50μl并放入显微镜样品载体的单独样品沉积孔中。
然后将显微镜样品载体运送到自动液体处理系统的孵育器中的培养位置(在37℃下保持4-6小时)，从而培养提取的细菌细胞和细胞标准品。
随后，将显微镜样品载体运输到离心机，以300克离心15-20分钟，使细菌细胞涂抹在样品沉积表面。
将上清液去除，并将样品在空气中干燥。
施加革兰氏染色法用于目标细菌。
染色后，显微镜样品载体被运送到安装装置以进行显微检查。

Claims (37)

1.一种用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的自动液体处理系统，其特征在于，所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积孔在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，
所述自动液体处理系统包括：
-离心机，所述离心机适于离心所述显微镜样品载体；
-自动运输装置，所述自动运输装置
适于将多个样品和/或多种液体转移进和/或转移出所述显微镜样品载体的多个样品沉积孔中的每一个，
并且适于运输所述显微镜样品载体穿过所述自动液体处理系统，其中所述自动运输装置被配置为与所述显微镜样品载体的联接部分联接；
-一个或多个储存容器，所述一个或多个储存容器用于接收和/或储存所述多个样品和/或所述多种液体。
2.根据权利要求1所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括第一安装装置，所述第一安装装置适于保持至少一个显微镜样品载体以通过所述自动运输装置将所述多个样品和/或所述多种液体转移进和/或转移出所述多个样品沉积孔中的每一个。
3.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括第二安装装置，所述第二安装装置适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查所述多个样品。
4.根据权利要求3所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括用于在显微镜检查期间保持所述第二安装装置的机动显微镜载物台。
5.根据权利要求1或2所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括机动显微镜载物台，所述机动显微镜载物台包括适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查所述多个样品的一个或多个安装部分。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括用于对所述至少一个样品进行显微镜检查的装置，优选一个或多个倒置显微镜。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述第一和/或第二安装装置和/或安装部分适于平行地保持多个显微镜样品载体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括：
显微镜模块，所述显微镜模块包括机动显微镜载物台，优选地如权利要求4或权利要求5或权利要求7所限定的机动载物台，以及用于对所述至少一个样品进行显微镜检查的装置，优选地一个或多个倒置的显微镜，
其中所述显微镜模块布置在所述自动液体处理系统内的固定位置。
9.根据权利要求8所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述自动运输装置适于在x、y和z方向上运输至少一个显微镜样品载体穿过所述自动液体处理系统，并且适于将所述至少一个显微镜样品载体运输到所述显微镜模块，
其中所述显微镜模块与所述自动运输装置物理分离。
10.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，还包括所述至少一个显微镜样品载体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，其中所述多个样品沉积孔布置成使得所述样品沉积表面基本上在一个平面。
12.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述多个样品沉积孔以规则图案布置，使得相邻样品沉积孔之间的距离恒定。
13.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述样品沉积表面是平面。
14.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，每个样品沉积孔具有朝向所述样品沉积表面的锥形形状。
15.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述显微镜样品载体部分或全部由不透明材料组成，优选地，其中所述显微镜样品载体的侧壁由不透明的塑料材料组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，其中所述样品沉积表面由透明材料、优选透明塑料材料组成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，其中每个样品沉积表面的面积在0.5mm2和20mm2之间，优选在1mm2和15mm2之间，更优选在6.6mm2和11.18mm2之间。
18.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，每个样品沉积表面的厚度在0.1mm至0.4mm之间，优选在0.15mm至0.35mm之间，进一步优选为约0.3mm。
19.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，每个样品沉积表面的厚度在0.17mm-0.25mm之间。
20.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，每个样品沉积孔的体积在2μL至700μL之间，优选在5μL至500μL之间，更优选地在20μL至60μL之间。
21.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述样品沉积孔布置在一个或多个排中。
22.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，每个样品沉积孔由一个或多个侧壁与样品沉积表面之间形成的角度限定，其中所述角度在70°和110°之间，优选地在80°和100°之间，最优选地为约90°。
23.根据前述权利要求中任一项所述的自动液体处理系统，其特征在于，所述自动运输装置包括用于接收显微镜样品载体的联接部分的一个或多个凸缘或凹槽的机械臂或机械夹持器。
24.一种用于处理至少一个显微镜样品载体中的多个样品的方法，其特征在于，所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积孔在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，所述方法由自动液体处理系统执行，所述方法包括：
-通过所述自动液体处理系统的自动输送装置将多个生物样品中的每个生物样品施加到所述多个样品沉积孔中的至少一个样品沉积孔中；
-通过所述自动液体处理系统的离心机，通过施加离心力将所述多个生物样品的多个第一部分与多个第二部分分离，其中所述多个第一部分沉积在所述多个样品沉积表面上；
-通过所述自动液体处理系统的所述自动运输装置将所述显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统，其中所述自动运输装置被配置为与所述显微镜样品载体的联接部分联接；
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，在分离步骤中，多个表面处于垂直于旋转轴线的位置。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述多个第一部分以均匀层沉积在所述多个样品沉积表面上。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述多个第一部分包括以单细胞厚度的均匀层沉积的细胞。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其特征在于，一个或多个或全部样品沉积表面和/或所述显微镜样品载体的侧壁的内表面被制备成与生物样品的所述多个第一部分发生特异性反应。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其特征在于，一个或多个或全部样品沉积表面涂覆有增加生物细胞对表面的粘附的粘附促进剂。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其特征在于，还包括由所述自动液体处理系统执行的以下步骤中的至少一个：
-将沉积的所述多个第一部分固定；
-对沉积的、优选固定的所述多个第一部分进行染色；
-清洗沉积的、优选固定的所述多个第一部分；
-通过去除上清液根据需要干燥染色或洗涤沉积的多个第一部分，
-利用孵育器在预定温度和/或气氛下将所述多个样品和/或所述多个第一部分孵育预定的时间间隔。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，干燥步骤包括离心所述显微镜样品载体，优选在50至500克的离心力下和/或0.5至5分钟的离心时间。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其特征在于，干燥步骤包括从所述显微镜样品孔中抽吸出上清液。
33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤中的至少一个：
-通过所述自动液体处理系统的自动运输装置将显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统到安装装置，所述安装装置适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查多个生物样品和/或第一部分，优选地到权利要求3和/或权利要求7所限定的安装装置，更优选地所述安装装置由如权利要求4所限定的机动显微镜载物台保持和/或调整位置；
-通过所述自动液体处理系统的所述自动运输装置将所述显微镜样品载体运输穿过所述自动液体处理系统到机动显微镜载物台，所述机动显微镜载物台包括一个或多个安装部分，所述一个或多个安装部分适于保持所述至少一个显微镜样品载体以在显微镜下检查所述多个样品；
-对所述多个生物样品和/或多个第一部分进行显微分析，优选地借助于一个或多个倒置显微镜，优选地借助于如权利要求8或9所限定的显微镜模块。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的方法，其特征在于，在分离步骤中，所述自动液体处理系统的离心机被加速，通过避免突然的加速运动使得细胞的均匀分布不受影响。
35.一种用于在至少一个显微镜样品载体中培养生物细胞的方法，其特征在于，所述显微镜样品载体包括多个样品沉积孔，其中每个样品沉积井在其侧面由一个或多个侧壁限定并且在其底侧由样品沉积表面限定，所述方法由自动液体处理系统执行，所述方法包括：
-通过所述自动液体处理系统的自动输送装置将多个生物样品中的每个生物样品施加到所述多个样品沉积孔中的至少一个样品沉积孔中；
-通过所述自动液体处理系统的孵育器孵育所述多个生物样品。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的方法，其特征在于，所述自动液体处理系统是如权利要求1至23中任一项所述的系统。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法用于生物细胞的分离和显微镜检查的用途。
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