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CN113453708A - 包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的组合物及其使用方法 - Google Patents

包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的组合物及其使用方法 Download PDF

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CN113453708A CN201980092227.4A CN201980092227A CN113453708A CN 113453708 A CN113453708 A CN 113453708A CN 201980092227 A CN201980092227 A CN 201980092227A CN 113453708 A CN113453708 A CN 113453708A
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streptococcus pneumoniae
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protein
multivalent immunogenic
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Y·A·崔
R·费雷罗
何健
L·穆西
T·皮蒂贾拉
J·M·斯金纳
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Abstract

本发明涉及多价免疫原性组合物，其包含一种以上肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型如本文所定义。在一些实施方式中，至少一种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成。在进一步的实施方式中，每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成。还提供了用于在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向所述患者施用本发明的所述多价免疫原性组合物。所述多价免疫原性组合物用于提供针对肺炎链球菌感染和/或由肺炎链球菌引起的肺炎球菌疾病的保护。本发明的组合物还用作治疗方案的一部分，所述治疗方案为已接种用于预防肺炎球菌疾病的多价疫苗的患者提供补充保护。

Description

包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的组合物及其使用方法
技术领域
本发明提供了具有不同多糖-蛋白缀合物的多价免疫原性组合物。每种缀合物由荚膜多糖组成，其由缀合至载体蛋白(优选地CRM197)的不同血清型的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)制备。免疫原性组合物提供针对肺炎球菌疾病的广泛覆盖。
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2019年12月3日，名为24683WOPCT-SEQTXT-03DEC2019，大小为6千字节。
背景技术
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性菌，是婴幼儿侵袭性细菌性疾病(如肺炎、菌血症、脑膜炎和中耳炎)的最常见原因。肺炎球菌被化学连接的多糖包裹，赋予血清型特异性。肺炎球菌的已知血清型超过90种，荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定因素，因为荚膜不仅保护细菌的内表面免受补体的侵害，而且本身的免疫原性也很差。多糖是T细胞依赖性抗原，并且在大多数情况下，不能在MHC分子上加工或呈递以与T细胞相互作用。但是，其能够通过另一种机制刺激免疫系统，该机制涉及B细胞上表面受体的交联。
已获批多年的多价肺炎球菌多糖疫苗已证明在预防成人肺炎球菌疾病方面具有重要价值，尤其是老年人和高危人群。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖应答不佳。肺炎球菌缀合疫苗
Figure BDA0003213826260000011
含有7种最常分离的血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，其当时在幼儿和婴儿中引起侵袭性肺炎球菌疾病，该疫苗于2000年2月首次在美国获得许可。随着
Figure BDA0003213826260000012
在美国的普遍使用，由于
Figure BDA0003213826260000013
中存在的血清型，使得儿童侵袭性肺炎球菌疾病显著减少。参见疾病控制与预防中心，MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005,54(36):893-7。然而，在世界某些区域，
Figure BDA0003213826260000021
的血清型覆盖具有局限性，以及一些证据表明，美国出现了某些新兴血清型(例如，19A及其他)。参见O'Brien等，2004,Am J Epidemiol 159:634-44；Whitney等，2003,N Engl J Med 348:1737-46；Kyaw等，2006,N Engl J Med 354:1455-63；Hicks等，2007,J Infect Dis 196:1346-54；Traore等，2009,Clin Infect Dis 48:S181-S189。
美国专利申请公开号US2006/0228380描述了一种13价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。中国专利申请公开号CN101590224A描述了一种14价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，其包含血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。
其他PCV覆盖了包含在PCV-15(美国公开号2011/0195086)中的血清型7、10、11或13，但是已观察到对一些血清型的免疫干扰(例如，对GSK的PCV-11中的血清性3的保护降低)以及降低了对辉瑞的PCV-13(
Figure BDA0003213826260000022
13)中的血清型6B的应答率。参见Prymula等，2006,Lancet 367:740-48和Kieninger等，Safety and Immunologic Non-inferiority of13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent PneumococcalConjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers，在第48届年度ICAAC/ISDA第46届年度会议上提出，Washington DC,10月25-28日，2008。
当前的多价肺炎球菌疫苗已有效降低与疫苗中存在的那些血清型相关的肺炎球菌疾病的发病率。然而，目前可用的疫苗中不存在的表达血清型的肺炎球菌的流行率一直在增加。因此，需要另外的肺炎球菌疫苗组合物，其可以提供针对当前可用疫苗中不存在的肺炎球菌血清型的保护。
发明内容
本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；和
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含22种不同的多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述多糖由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B制备。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含22种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含23种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述多糖由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B制备。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含23种不同肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述多糖由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B制备。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述多糖由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B制备。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含至多33种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、21、23A、31、34、35F和38。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含至多30种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、23A、35F和38。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含至多33种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、21、23A、31、34、35F和38。
本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含至多30种不同多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、23A、35F和38。
在一些实施方式中，至少一种所述多糖蛋白缀合物由缀合反应形成，所述缀合反应包含非质子性溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。在特定实施方式中，每种所述多糖蛋白缀合物由缀合反应形成，所述缀合反应包含非质子性溶剂，例如，(DMSO)。
还提供了用于在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向所述患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在本发明方法的一些实施方式中，所述患者此前使用多价肺炎球菌疫苗治疗。
本发明的多价免疫原性组合物可以与不同的互补肺炎球菌疫苗一起用作治疗方案的一部分。因此，本发明提供了一种在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向所述患者施用本发明的多价免疫原性组合物，还包括以任何顺序向所述患者施用多价肺炎球菌疫苗。在特定实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含未缀合的荚膜多糖
本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中选择的肺炎链球菌血清型提供与其他选择的血清型的交叉反应性。
附图说明
图1：如通过ECL确定的，用PCV22无佐剂(PCV22无佐剂)或磷酸铝佐剂(PCV22/APA)制剂免疫接种的小鼠免疫前(Pre)、第1剂后(PD1)、第2剂后(PD2)和第3剂后(PD3)的IgG抗体稀释效价。从左到右读取；Pre PCV22无佐剂、Pre PCV22/APA、PD1 PCV22无佐剂、PD1PCV22/APA、PD2 PCV22无佐剂、PD2 PCV22/APA、PD3 PCV22无佐剂和PD3 PCV22/APA。
图2：在PD3时，PCV22/APA与PCV22无佐剂(PCV22无佐剂)相比的ECL稀释效价比率。
图3：用PCV22无佐剂(PCV22无佐剂)或APA(PCV22/APA)制剂免疫接种的小鼠的血清型特异性OPA稀释效价(免疫前、PD1、PD2、PD3)。从左到右读取；Pre PCV22无佐剂、PrePCV22/APA、PD1 PCV22无佐剂、PD1 PCV22/APA、PD2 PCV22无佐剂、PD2 PCV22/APA、PD3PCV22无佐剂和PD3 PCV22/APA。
图4：在PD3时，PCV22/APA与PCV22无佐剂(PCV22无佐剂)相比的OPA稀释效价比率。
图5：PCV22免疫的小鼠被保护免受肺炎链球菌24F的气管内攻击。
图6：如通过ECL确定的，用PCV22无佐剂或PCV22/APA免疫接种的家兔免疫前(Pre)、PD1和PD2的IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。从左到右读取；Pre PCV22无佐剂、Pre PCV22/APA、PD1 PCV22无佐剂、PD1 PCV22/APA、PD2 PCV22无佐剂和PD2 PCV22/APA。
图7：在PD2时，PCV22/APA与PCV22无佐剂相比的ECL GMT比率。误差线表示95％置信区间(CI)。
图8：用PCV22无佐剂或PCV22/APA免疫接种的家兔的血清型特异性OPA稀释效价(免疫前“Pre”和PD2)。误差线表示五只家兔的功能性抗体效价的变化。
图9：如通过ECL确定的，用A)PCV23无佐剂、B)PCV23(DMSO)/APA、C)PCV23(DMSO+Aq)/APA、和D)PCV15/APA+PCV8/APA免疫接种的IRM的免疫前(Pre)、PD1、PD2和PD3的IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。
图10：在使用具有或不具有APA的PCV23接种后，对IRM(每组8-9只)中的ECL抗体应答的比较。符号表示在A)PD1、B)PD2或C)PD3时的比率。GMT比率，误差线表示95％CI。
图11：在使用PCV23(DMSO+Aq)/APA或共同施用PCV15/APA+PCV8/APA接种后，对IRM(每组9只)中的ECL抗体应答的比较。符号表示在A)PD1、B)PD2或C)PD3时的比率。GMT比率，误差线表示95％CI。
图12：在使用PCV23无佐剂、PCV23(DMSO)/APA、PCV23(DMSO+Aq)/APA或PCV15/APA+PCV8/APA免疫后，对IRM(每组8-9只)中激发的ECL抗体应答的比较。A)PD1/Pre、B)PD2/Pre、C)PD3/Pre、D)PD2/PD1和E)PD3/PD2。符号是GMT比率，误差线表示95％CI。
图13：(A)如通过ECL确定的，用使用磷酸铝佐剂制剂的PCV24(PCV24/APA)免疫接种的新西兰白兔的免疫前(Pre)、第1剂后(PD1)和第2剂后(PD2)的IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。(B)使用PCV24/APA免疫接种的NZWR的血清型特异性OPA稀释效价(免疫前和PD2)。误差线表示八只NZWR的功能性抗体效价的变化。
图14：(A)如通过ECL确定的，用使用磷酸铝佐剂制剂的PCV24(PCV24/APA)免疫接种的婴儿恒河猴(IRM)的免疫前(Pre)、第1剂后(PD1)、第2剂后(PD2)和第3剂后(PD3)的IgG抗体稀释效价。误差线表示几何平均效价(GMT)的95％置信区间(CI)。(B)使用PCV24/APA免疫接种的IRM的血清型特异性OPA稀释效价(免疫前和PD3)。误差线表示五只IRM的功能性抗体效价的变化。
具体实施方式
本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎球菌多糖-蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球的血清型如本文所定义。
在一些实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
bb)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
cc)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
dd)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ee)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ff)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
gg)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
hh)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
jj)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
kk)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ll)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
mm)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
nn)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
oo)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
pp)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
qq)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
rr)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ss)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
tt)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
uu)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
vv)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ww)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
xx)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
yy)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
zz)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
aaa)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；和
bbb)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39。
在一些实施方式中，所述多价免疫原性组合物包含选自以下的肺炎球菌血清型：i)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或iii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或iv)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在一个特定实施方式中、本发明的多价免疫原性组合物包含多种肺炎肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含血清型：i)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或iii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。发现所述组合物在小鼠、家兔和/或猴中具有免疫原性，并在所有测试剂量下产生杀死疫苗型细菌菌株的功能性抗体。
本发明的多价免疫原性组合物适用于针对疫苗型肺炎链球菌血清型免疫患者和/或用作具有不同互补肺炎链球菌疫苗治疗方案的一部分。因此，本发明提供了一种在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向所述患者施用本发明的多价免疫原性组合物，还包括以任何顺序向所述患者施用多价肺炎球菌疫苗。在其他实施方式中，将本发明的多价免疫原性组合物施用至此前已使用不同多价肺炎球菌疫苗免疫的患者。
在本发明的实施方式中，在非质子性溶剂如DMSO中使用还原胺化制备来自至少一种肺炎球菌血清型的缀合物。在其他实施方式中，多价免疫原性组合物包含肺炎球菌缀合物，其各自在非质子性溶剂中使用还原胺化制备。使用DMSO溶剂通过直接消耗载体蛋白表面的赖氨酸残基来增强多糖与蛋白的共价结合。共价结合增大对增加包含在DMSO中缀合的多糖抗原的多价免疫原性组合物的多糖蛋白缀合物的稳定性具有直接获益。
I.定义和缩写
如在说明书通篇和所附权利要求中所使用的，应用下述缩写：
APA 磷酸铝佐剂
APC 抗原呈递细胞
CI 置信区间
DMSO 二甲基亚砜
DS 多糖-蛋白原料药
GMC 几何平均浓度
GMT 几何平均效价
HPSEC 高效体积排阻色谱
IM 肌内或肌肉内
IRM 婴儿恒河猴
LOS 脂寡糖
LPS 脂多糖
MALS 多角度光散射
MBC 单价缀合物原料
Mn 数均分子量
MOPA 多重调理吞噬作用测定法
MW 分子量
NMWCO 标称分子量截断值
NZWR 新西兰白兔
OPA 调理吞噬作用测定法
PCV 肺炎球菌缀合物疫苗
PD1 第1剂后
PD2 第2剂后
PD3 第3剂后
PnPs 肺炎球菌多糖
Ps 多糖
PS-20 聚山梨醇酯-20
RI 折射率
UV 紫外线
w/v 重量/体积
为了更容易理解本发明，下面具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文的其他地方特别定义，否则本文中使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
如在说明书通篇和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数引用。
除非上下文清楚地指出了所指示的可能性之一，否则对“或”的引用表示一种或两种可能性。在一些情况下，将“和/或”用于强调一种或两种可能性。
术语“水性溶剂”或“水性条件”当与缀合(如还原胺化)一起使用时，是指使用水作为缀合反应的溶剂。除了不存在有机溶剂之外，水可以含有缓冲剂和其他组分。
术语“非质子溶剂”、“DMSO溶剂”或“DMSO条件”当与缀合(如还原胺化)一起使用时，指使用非质子溶剂或非质子溶剂的组合(或DMSO，如适用)作为缀合反应的溶剂。非质子溶剂可以存在一些水，例如至多1％、2％、5％、10％或20％。
术语“包含”当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，是指包含任何其他组分，如佐剂和赋形剂，或添加一种或多种未具体列举的多糖-蛋白缀合物。当与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由...组成”是指具有那些特定的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物而没有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。“基本上由……组成(consists essentially of)”和诸如“基本上由……组成(consist essentiallyof)”和“基本上由……组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何所列举的要素或要素的组，以及任选地包括与所列举的要素具有相似或不同性质的其他要素，其不会实质上改变指定剂量方案、方法或组合物的基本或新颖性质。
本发明组合物的“有效量”指激发抗体的剂量，该剂量显著降低了在随后攻击期间微生物(例如，肺炎链球菌)感染的可能性或严重性。
如本文所用，短语“用于预防肺炎球菌疾病”指疫苗或免疫原性组合物经一个或多个监管机构(如美国食品和药物管理局)批准，用于预防由任何肺炎链球菌血清型引起的一种或多种疾病，其包括但不限于：一般的肺炎球菌病、肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性菌血症、由肺炎链球菌引起的浸润性疾病和由肺炎链球菌引起的中耳炎。
“多价肺炎球菌疫苗”是包含多于一种活性剂(例如，肺炎球菌荚膜多糖或肺炎球菌多糖蛋白缀合物)的药物制剂，该活性剂对由多于一种肺炎链球菌的血清型引起的疾病或病理状况提供活性免疫。
术语“多糖”意在包括通常用于免疫和细菌疫苗领域的任何抗原性糖要素(或抗原单元)，包括但不限于“糖类”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。
在本发明的疫苗或免疫原性组合物的背景下，术语“无佐剂”指肺炎球菌多糖组合物，包括但不限于PCV8、PCV15、PCV22、PCV23和PCV24，其中所述组合物不包含佐剂。
“PCV8”指含有肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24F和-35B的免疫原性组合物。
“PCV15”指含有肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-14、-18C、-19A、-19F、-22F、-23F和-33F的免疫原性组合物。
“PCV22”指含有肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B的免疫原性组合物。
“PCV23”指含有肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B的免疫原性组合物。
“PCV24”指含有肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B的免疫原性组合物。
“含CpG的核苷酸”、“含CpG的寡核苷酸”、“CpG寡核苷酸”和类似术语是指长度为6-50个核苷酸的核苷酸分子，其包含未甲基化的CpG部分。参见例如，Wang等，2003,Vaccine21:4297。含CpG的寡核苷酸包括使用任何合成的核苷间键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的寡核苷酸。
如本文所定义的，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。免疫佐剂可以增强对单独施用时具有弱免疫原性的抗原的免疫应答，例如，诱导无或弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答、增加对抗原的抗体效价、和/或降低在个体中有效实现免疫应答的抗原的剂量。因此，通常给予佐剂以增强免疫应答，并且其是本领域技术人员所熟知的。
“患者”(在本文中可替代地称为“受试者”)是指能够被肺炎链球菌感染的哺乳动物。在优选的实施方式中，患者是人。可以对患者进行预防或治疗。预防性治疗可提供足够的保护性免疫力，以降低肺炎球菌感染或其影响(例如，肺炎球菌性肺炎)的可能性或严重性。可以进行治疗性治疗以降低肺炎链球菌感染或其临床影响的严重程度或防止其复发。如本文所述，可以使用本发明的多价免疫原性组合物进行预防性治疗。本发明的组合物可以施用给普通人群或肺炎球菌感染风险增加的那些人，例如老年人，或者与老年人同住或照顾老年人的人。
“需要治疗”的人包括以前接触过肺炎链球菌或感染过肺炎链球菌的人，以前接种过肺炎链球菌的人，以及容易感染的人或需要降低感染可能性的任何人，例如免疫功能低下的人、老年人、儿童、成人或健康个体。
“稳定的”多价免疫原性组合物是在冷藏温度(例如，2-8℃或4℃)下观察至少至少1个月、2个月、3个月、6个月、12个月和/或24个月没有明显变化的组合物。另外，“稳定的”组合物包括在包括25℃和37℃的温度下包括1个月、3个月、6个月、12个月和/或24个月的一段时间表现出所需特征的组合物。典型的稳定性合格标准如下所示：下述一个或多个指标的变异性不超过约5％、约10％、约15％或约20％：(a)组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的数均分子量(Mn)，(b)组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的重均分子量(Mw)，(c)组合物中的总多糖浓度，(d)使用本征蛋白荧光光谱法在特定激发波长(例如，280纳米)下测量的组合物的发射最大值，和(e)使用本征蛋白荧光光谱法在特定激发波长下测量的组合物的荧光强度。术语“稳定的”也可以用于指多价免疫原性组合物中的特定肺炎球菌缀合物。在这样的用途中，该术语是指在特定温度下随时间表现出所需性质的缀合物，且这些性质随所示时间和温度的变化不超过约5％、约10％、约15％或约20％。
II.多价免疫原性组合物
本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。下文描述了本发明的多价免疫原性组合物的不同方面和实施方式。
在一个实施方式(实施方式E1)中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：i)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或iii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在实施方式E1的子实施方式中，所述免疫原性组合物不包含任何其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物。
如本文所用，去-O-乙酰化血清型15B(DeOAc15B)肺炎球菌多糖等同于血清型15C的肺炎球菌多糖，并且具有相同的NMR光谱(数据未显示)。如本文所用，去-O-乙酰化血清型15B肺炎球菌多糖和血清型15C的肺炎球菌多糖在每个重复单元的O-乙酰基含量各自在0-5％范围内，或在0-4％范围内，或在0-3％范围内，或在0-2％范围内，或在0-1％范围内，或在0-0.5％范围内，或在0-0.1％范围内，或不含O-乙酰基。在Spencer B.L.等的报告中，15C可以被轻微O-乙酰化(Spencer,B.L.等，Clin.Vac.Immuno.(2017)24(8):1-13)。因此，在本文的多价免疫原性组合物的任何实施方式中，可以使用去-O-乙酰化血清型15B(DeOAc15B)代替血清型15C。去-O-乙酰化的方法是本领域公知的，例如，如在Rajam等，Clinical andVaccine Immunology,2007,14(9):1223–1227中所描述的。
在本发明任何多价免疫原性组合物的某些实施方式中，包括实施方式E1及其任何子实施方式，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
交叉反应性
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6C提供了针对肺炎链球菌的血清型6A和6B的交叉反应性。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6A)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6A提供了针对肺炎链球菌的血清型6B和/或6C的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型6B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型6B提供了针对肺炎链球菌的血清型6A和/或6C的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型15C)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型15C提供了针对肺炎链球菌的血清型15B的交叉保护作用。
在一个实施方式中，本发明提供了多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型(包括血清型15B)的多糖，其中肺炎链球菌的血清型15B提供了针对肺炎链球菌的血清型15C的交叉保护作用。
载体蛋白
在本发明的特定实施方式中，将CRM197用作载体蛋白。CRM197是具有下述氨基酸序列的白喉毒素的无毒性变体(即，类毒素)：
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAETIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYINNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKTTAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVAQSIALSSLMV AQAIPLVGELVDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIHSNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLFFEIKS(SEQ ID NO:1)
在一个实施方式中，CRM197是从在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物中分离得到的。在另一个实施方式中，CRM197依照美国专利号5,614,382中所述的方法重组制备。一般地，CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析的组合进行纯化。在一些实施方式中，CRM197使用Pfenex Expression TechnologyTM(Pfenex Inc.,San Diego,CA)在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中进行制备。
其他合适的载体蛋白质包括另外的灭活细菌毒素如DT(白喉类毒素)或DT的片段B(DTFB)、TT(破伤风毒素)或TT的片段C、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如WO 2004/083251中描述的)、大肠杆菌(E.coli)LT、大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白质如外膜复合物(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见WO 02/091998)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、来自A组或B组链球菌的C5a肽酶、或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D、肺炎球菌溶血素(Kuo等，1995,Infect Immun 63；2706-13)包括以某些形式解毒的ply，例如dPLY-GMBS(参见WO 04/081515)或dPLY-甲醛、PhtX包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(参见WO 01/98334和WO 03/54007)。其他蛋白如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、PorB(来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis))、PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如，EP 0 594 610B)或其免疫功能等价物、合成肽(参见EP0378881和EP0427347)、热休克蛋白(参见WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白质(参见WO 98/58668和EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(参见WO 91/01146)、包含来自多种病原体衍生抗原的多重人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(参见Falugi等，2001,Eur J Immunol 31:3816-3824)，如N19蛋白(参见Baraldoi等，2004,Infect Immun 72:4884-7)，铁摄取蛋白质(参见WO 01/72337)、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(参见WO 00/61761)、和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等，1998,Immunol Lett 64:9)也可以用作载体蛋白质。
可以使用其他DT突变体作为载体蛋白，如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，1973,J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107，以及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins,Ed:Frankel,Maecel Dekker Inc,1992中描述的其他突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变和公开于US 4,709,017或US 4,950,740中的其他突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变和公开于US 5,917,017或美国专利号6,455,673中的其他突变；或公开于US 5,843,711中的片段。这样的DT突变体也可用于制备DTFB变体，其中包含B片段的变体包含表位区域。
在某些实施方式中，载体蛋白选自下组：外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D和CRM197。
在本发明的一些实施方式中，可以将第二载体用于多价免疫原性组合物中的一种或多种多糖蛋白缀合物。第二载体蛋白优选是无毒且无反应性并且可以足够量和纯度获得的蛋白。第二载体蛋白也与肺炎链球菌多糖缀合或结合以增强抗原的免疫原性。载体蛋白应符合标准的缀合程序。在一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的每个荚膜多糖与相同的第二载体蛋白缀合(例如，每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在另一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的荚膜多糖与两个或多个载体蛋白缀合(每个荚膜多糖分子与单个载体蛋白缀合)。在此类实施方式中，相同血清型的每个荚膜多糖通常与相同的载体蛋白缀合。
在本发明的实施方式中，包括实施方式E1及其任何子实施方式，一种或多种(包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种，如适用)多糖血清型与CRM197缀合。在本发明进一步的实施方式中，包括实施方式E1及其任何子实施方式，每种多糖血清型与CRM197缀合。
可以使用本领域公认的方法来完成本发明的多糖-蛋白质缀合物的配制。例如，可以使用生理学上可接受的载剂配制单个肺炎球菌缀合物以制备组合物。此类载剂的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和右旋糖溶液。
在一个优选的实施方式中，疫苗组合物在含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液中配制。
在本发明的一些实施方式中，多价免疫原性组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物和佐剂，所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所述的。增强组合物有效性的合适佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳剂制剂(含或不含其他特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽(下文定义的)细菌细胞壁组分)，如例如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选地含有不同量的MTP-PE)，使用微射流机(microfluidizer)，如型号110Y微射流机(Microfluidics,Newton,MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121、和thr-MDP，微射流成亚微米乳化液或涡旋以生成较大颗粒尺寸的乳剂，(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Corixa,Hamilton,MT)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，其来自美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰化单磷酰脂质A(MPLTM)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁支架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(d)Montanide ISA；
(3)可以使用皂苷佐剂，如Quil A或STIMULONTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA)(参见例如，美国专利号5,057,540)或由其生成的粒子，如ISCOM(通过胆固醇、皂苷、磷脂和两亲蛋白的组合形成的免疫刺激复合物)和(具有与ISCOM基本上相同的结构但不含蛋白)；
(4)细菌脂多糖、合成脂质A类似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，且在美国专利号6,113,918中描述；一种此类AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-β-D-吡喃葡糖苷，其也称为529(以前称为RC529)，其配制为水溶液形式或稳定乳剂；
(5)合成多核苷酸，如含有一个或多个CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；
(6)细胞因子，如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；和
(7)补体，如补体成分C3d的三聚体。
在另一个实施方式中，佐剂是上述佐剂中的2、3种或更多种的混合物，例如SBAS2(还含有3-脱酰化单磷酰脂质A和QS21的水包油乳剂)。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在某些实施方式中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂是本领域众所周知的，并且例如在Harlow,E.和D.Lane(1988；Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)和Nicklas,W.(1992；Aluminumsalts.Research in Immunology 143:489-493)中描述的。铝盐包括但不限于水化氧化铝、水合氧化铝、三水合氧化铝(ATH)、铝的水合物、铝的三水合物、铝胶、Superfos、Amphogel、氢氧化铝(III)、羟基磷酸铝硫酸盐(磷酸铝佐剂(APA))、无定形氧化铝、三水合氧化铝或三羟基铝。
APA是羟基磷酸铝的水混悬液。APA通过将氯化铝和磷酸钠以1:1体积比掺和以沉淀羟基磷酸铝制备。在掺和过程后，用高剪切混合器使材料尺寸减小，以达到单分散粒径分布。随后将产物用生理盐水渗滤且蒸汽灭菌。在一个实施方式中，铝盐的剂量是10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700μg，或者1、1.2、1.5、2、3、5mg或更多。在另一个实施方式中，上文所述的铝盐的剂量是每μg重组蛋白。
在某些实施方式中，商购可得的Al(OH)3(例如，Denmark/Accurate Chemical andScientific Co.,Westbury,NY的Alhydrogel或Superfos)用于以50-200μg蛋白/mg氢氧化铝的比吸附蛋白。在另一个实施方式中，蛋白的吸附依赖于蛋白的pI(等电点pH)和介质的pH。具有更低pI的蛋白比具有更高pI的蛋白质更强地吸附至带正电的铝离子。铝盐可以建立抗原贮库，其经过2-3周的时期缓慢释放，涉及巨噬细胞的非特异性激活和补体激活，和/或刺激先天性免疫机制(可能通过尿酸的刺激)。参见，例如See,e.g.,Lambrecht等，2009,Curr Opin Immunol 21:23。
通常，将单价水性缀合物原料掺和在一起，且对于除了6B外的所有血清型都稀释至目标4μg/mL，所述6B将稀释至目标8μg/mL。一旦稀释，将该批料过滤灭菌，且加入等体积的磷酸铝佐剂至250μg/mL的目标最终铝浓度。佐剂化的(adjuvanted)、配制的批次将填充到一次性使用的0.5mL/剂量小瓶内。
在某些实施方式中，佐剂是含CpG核苷酸序列，例如含CpG寡核苷酸，特别是含CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方式中，佐剂是ODN 1826，其可以从ColeyPharmaceutical Group获得。
关于使用CpG寡核苷酸的方法是本领域众所周知的，并且例如在Sur等，1999,JImmunol.162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med.127:139-58；和Yasuda等，2006,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110。
在替代实施方式中，免疫原性组合物包含如本文所述的多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，例如，在实施方式E1或其任何子实施方式，并且不包含佐剂。
制剂
本发明的组合物可以配制为单剂量小瓶、多剂量小瓶或预充式玻璃或塑料注射器。
在另一个实施方式中，本发明的组合物经口施用，并且因而以适合于经口施用的形式即作为固体或液体制备物进行配制。固体经口制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、丸剂(pellet)等。液体经口制剂包括溶液、混悬液、分散体、乳剂、油等。
用于液体制剂的药学可接受的载体是水或非水溶液、混悬液、乳剂或油。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。油的例子包括动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂肪。
本发明的多价免疫原性组合物可以是等渗、低渗或高渗的。然而，在将其施用时，通常优选用于输注或注射的组合物是基本上等渗的。因此，为了贮存，组合物可以优选是等渗或高渗的。如果组合物为了贮存是高渗的，那么其可以在施用前稀释以变成等渗溶液。
等渗剂可以是离子等渗剂(如盐)或非离子等渗剂(如糖)。离子等渗剂的例子包括但不限于NaCl、CaCl2、KCl和MgCl2。非离子等渗剂的例子包括但不限于甘露醇、山梨糖醇和甘油。
还优选至少一种药学可接受的添加剂是缓冲剂。为了某些目的，例如，当药物组合物意欲用于输注或注射时，通常希望组合物包含缓冲液，其能够将溶液缓冲至在4至10范围中的pH，例如5至9，例如6至8。
缓冲液可以例如选自TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲液。
缓冲剂可以另外例如选自用于肠胃外使用的USP相容的缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。例如，缓冲液可以选自一元酸例如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳酸；二元酸例如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸，多元酸例如柠檬酸和磷酸；和碱例如铵、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS。
肠胃外载剂(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格和不挥发性油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏右旋糖的那些等。实例是无菌液体例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他药学可接受的佐剂。一般而言，水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液、二醇例如丙二醇或聚乙二醇、聚山梨醇酯80(PS-80)、聚山梨醇酯20(PS-20)和泊洛沙姆188(P188)是优选液体载体，特别是用于可注射溶液。油的例子是动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另外的海洋油、或来自乳或蛋的脂质。
本发明的制剂还可以含有表面活性剂。优选表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是PS-20和PS-80；在DOWFAXTM商品名称下销售的，环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，例如线性EO/PO嵌段共聚物；辛苯昔醇，其可以在重复乙氧基(氧基-l,2-乙二基(ethanediyl))基团数目中不同，其中辛苯昔醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别有利的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂例如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三甘醇单月桂基醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。用于包含在乳剂中的优选表面活性剂是PS-80。
可以使用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(PS-80)和辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包含laureth 9加上聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯昔醇。
表面活性剂的优选量(按重量计％)是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如PS-80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(polyoxyethanol)(例如Triton X-100，或在Triton系列中的其他去垢剂)0.001至0.1％，特别是0.005至0.02％；聚氧乙烯醚(例如laureth 9)0.1至20％，优选0.1至10％，且特别是0.1至1％或约0.5％。
在某些实施方式中，组合物基本上由组氨酸(20mM)、盐水(150mM)和0.2％PS-20于pH 5.8下和250μg/mL的APA(磷酸铝佐剂)组成。PS-20的范围可以是从0.005％至0.3％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.025％至0.8％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.05％至0.8％(w/v)。在另一个实施方式中，PS-20的范围可以是从0.05％至0.2％(w/v)。该方法包括在组氨酸、盐水和PS-20中混合至多24种血清型的混合物，然后将这种混合的物质与APA和盐水混合，并添加或不添加抗菌防腐剂。
在特定实施方式中，多价免疫原性组合物包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中多糖蛋白缀合物中的肺炎链球菌的血清型包含本文所述的任何血清型组，并且进一步包含20-80mM组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物还包含0.2％至0.8％w/v聚山梨醇酯20。
多价免疫原性组合物PCV24通过使用非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎链球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B，以及在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.1％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)，每种多糖的血清型为4μg/mL或8μg/mL，总多糖浓度分别为96μg/mL或192μg/mL，以及称为“PCV24无佐剂”。在另一个特定实施方式中，在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mM NaCl和0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中制备多价免疫原性组合物PCV24，每种多糖血清型为4μg/mL，总多糖浓度为96μg/mL，还包含呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL。将其称为“PCV24/APA”。
表面活性剂的选择可能需要针对不同的制剂和原料药进行优化。对于含有15种或更多种血清型的多价疫苗，PS-20和P188是优选的。用于制备缀合物的化学方法的选择也会影响制剂的稳定性。特别地，当用于制备多价组合物中不同多糖蛋白缀合物的缀合反应同时包括水性溶剂和DMSO溶剂时，特定的表面活性剂体系在稳定性方面存在显著差异。单独使用聚山梨酯20或将泊洛沙姆188与多元醇结合使用时，都可以看到多糖蛋白缀合物的稳定性得到改善。
特定去垢剂如何保护生物治疗剂的确切机理知之甚少，无法事先预测。可能的稳定机制包括优先水合作用、优先排斥、生物治疗剂与表面之间的气/液界面竞争、表面张力和/或去垢剂与生物治疗剂直接缔合以掩盖疏水性团块，后者是聚集的种子。
泊洛沙姆也可以用于本发明的组合物中。泊洛沙姆是一种非离子型三嵌段共聚物，由聚氧丙烯(聚环氧丙烷)的中心疏水链与聚氧乙烯(聚环氧乙烷)的两个亲水链相连。泊洛沙姆也以商品名
Figure BDA0003213826260000311
Figure BDA0003213826260000312
闻名。由于聚合物嵌段的长度可以定制，因而存在很多性质略有不同的泊洛沙姆。对于通用名“泊洛沙姆”，这些共聚物通常以字母“P”(泊洛沙姆)命名，后接三位数字，前两位数字x 100表示聚氧丙烯核心的近似分子量，最后一位数字x10表示聚氧乙烯含量的百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol，聚氧乙烯含量为70％的泊洛沙姆)。对于
Figure BDA0003213826260000313
商品名，这些共聚物的编码以字母开头，以定义其在室温下的物理形式(L＝液体、P＝糊剂、F＝薄片(固体))，然后是两位或三位数。数字名称中的第一位数字(三位数字中的两位数字)乘以300表示疏水物的近似分子量；最后一位数字x 10表示聚氧乙烯含量的百分比(例如，
Figure BDA0003213826260000314
Figure BDA0003213826260000315
聚氧丙烯分子量为1,800g/mol，聚氧乙烯含量为10％的)。参见美国专利号3740421。
具有下述通式的泊洛沙姆的实例：
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH，其中a和b嵌段具有以下值：
Figure BDA0003213826260000321
如本文所用，分子量范围是道尔顿(Da)或g/mol。
优选地，泊洛沙姆的分子量通常为1100至17,400Da，7,500至15,000Da，或7,500至10,000Da。泊洛沙姆可选自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。泊洛沙姆在制剂中的终浓度为0.001％至5％重量/体积，或0.025％至1％重量/体积。在某些方面中，多元醇是丙二醇，且终浓度为1％至20％重量/体积。在某些方面中，多元醇是聚乙二醇400，且终浓度为1％至20％重量/体积。
用于本发明制剂的合适多元醇是聚合多元醇，特别是聚醚二醇，包括但不限于丙二醇和聚乙二醇、聚乙二醇单甲基醚。丙二醇的单体分子量范围为～425至～2,700。也可以获得分子量为～200至～35000的聚乙二醇和聚乙二醇单甲醚，包括但不限于PEG200、PEG300、PEG400、PEG1000、PEG MME 550、PEG MME 600、PEG MME 2000、PEG MME 3350和PEGMME4000。优选的聚乙二醇是聚乙二醇400。本发明制剂中多元醇的最终浓度可以为1％至20％重量/体积或6％至20％重量/体积。
制剂还包含pH缓冲盐水溶液。缓冲液可以例如选自Tris、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、L-组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲液。缓冲液能够将溶液缓冲至pH为4至10、5.2至7.5或5.8至7.0的范围。在本发明的某些方面，缓冲液选自磷酸盐、琥珀酸盐、L-组氨酸、MES、MOPS、HEPES、乙酸盐或柠檬酸盐。缓冲液还可以例如选自肠胃外使用的USP兼容缓冲液，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。缓冲液的浓度范围将为从1mM至100mM。缓冲液的浓度范围将为从10mM至80mM。缓冲液的浓度范围将为从1mM至50mM或5mM至50mM。在某些方面中，缓冲液是终浓度5mM至50mM的组氨酸，或终浓度1mM至10mM的琥珀酸。在某些方面中，组氨酸的终浓度为20mM±2mM。
尽管盐溶液(即，含有NaCl的溶液)是优选的，但其他适合制剂的盐包括但不限于CaCl2、KCl和MgCl2及其组合。可以使用非离子等渗剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇和甘油来代替盐。合适的盐范围包括但不限于25mM至500mM或40mM至170mM。在一个方面中，盐水是NaCl，任选地以20mM至170mM的浓度存在。
在一个优选的实施方式中，制剂包含L-组氨酸缓冲液和氯化钠。
在另一个实施方式中，药物组合物以控释系统递送。例如，试剂可以使用静脉内输注、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式来施用。在另一个实施方式中，使用聚合物材料；例如在微球中或在植入物中。
将在每个疫苗剂量中缀合物的量选定为诱导免疫保护性应答且不具有显著不良效应的量。此量能够根据肺炎球菌血清型而改变。在通常情况下，对于基于多糖的缀合物，每个剂量将包含0.08至100μg每种多糖。在本发明的一些实施方式中，每种多糖缀合物的剂量是从0.08至10μg。在进一步的实施方式中，剂量是从1至5μg、从0.4至4μg、从0.4至3μg、从0.4至2μg或从0.4至1μg。在一些实施方式中，一种或多种多糖缀合物的剂量是100、150、200、250、300、400、500或750ng，或者0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90或100μg。
在本发明组合物的一些实施方式中，所有多糖缀合物在组合物中以相同的量存在。在进一步的实施方式中，多糖缀合物在组合物中以不同的量存在(即，至少一种多糖缀合物以不同于组合物中一种或多种其他多糖缀合物的量存在)。
可以通过标准研究确定特定疫苗的最佳成分量，这些标准研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人数据的外推确定人免疫接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量是根据经验确定的。
本发明的组合物还可以包含一种或多种肺炎链球菌蛋白。适于纳入的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。
在某些实施方式中，通过本领域技术人员公知的一种或多种方法(如肠胃外、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内)向受试者施用本发明的组合物，并据此配制。在一个实施方式中，本发明的组合物通过液体制剂的表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射或内呼吸道粘膜注射施用。用于注射的液体制剂包括溶液剂等。
III.制备方法
可以通过本领域技术人员已知的标准技术来制备来自肺炎链球菌的荚膜多糖。例如，可以从细菌中分离多糖，并且可以通过已知方法将多糖尺寸调节到一定程度(参见例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)；并且优选通过使用均质器或化学水解完成的微流化。在一个实施方式中，每种肺炎球菌多糖血清型在基于大豆的培养基中生长。然后通过标准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖。参见例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以使用诸如机械或化学尺寸调节的技术对多糖进行尺寸调节，以降低粘度和/或改善缀合产物的过滤性。可以使用乙酸进行化学水解。机械尺寸调节可使用高压均质剪切进行。
可以将纯化的多糖化学活化以使得多糖能够与载体蛋白反应。纯化的多糖可以连接至接头。一旦被活化或连接到接头，每个荚膜多糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。多糖缀合物可以通过已知的偶联技术制备。
可以将多糖偶联至接头以形成多糖-接头中间体，其中接头的自由末端为酯基。因此，接头是其中至少一个末端是酯基的接头。选择另一个末端，以使其可以与多糖反应形成多糖-接头中间体。
可以使用多糖中的伯胺基团将多糖偶联至接头。在这种情况下，接头通常在两个末端都具有酯基。这允许通过亲核酰基取代使酯基之一与多糖中的伯胺基反应来进行偶联。该反应产生多糖-接头中间体，其中多糖通过酰胺键偶联至接头。因此，接头是双官能接头，其提供用于与多糖中的伯胺基反应的第一酯基和用于与载体分子中的伯胺基反应的第二酯基。典型的接头是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)。
偶联还可以间接发生，即在偶联至接头之前通过用于衍生多糖的另外的接头进行。
在多糖的还原末端使用羰基将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使羰基与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这些实施方式中，另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过还原胺化使伯胺基之一与多糖中的羰基反应而进行。使用与多糖中的羰基反应的伯胺基。酰肼或羟氨基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外接头中间体，其中多糖通过C-N键与另外的接头偶联。
可以使用多糖中的不同基团，特别是羧基，将多糖偶联至另外的接头。该偶联包括两个步骤：(a1)使基团与另外的接头反应；和(a2)使另外的接头的自由末端与接头反应。在这种情况下，所述另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基，从而允许步骤(a1)通过EDAC活化使所述伯胺基之一与多糖中的羧基反应而进行。使用与多糖中的EDAC活化的羧基反应的伯胺基。酰肼基是合适的。相同的伯胺基通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外的接头中间体，其中多糖通过酰胺键与另外的接头偶联。
在一个实施方式中，多糖的化学活化和随后通过还原胺化与载体蛋白的缀合可以通过美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506，美国专利申请公开号2006/0228380、2007/184072、2007/0231340和2007/0184071，和国际专利申请公开号WO2006/110381，WO2008/079653和WO2008/143709中所描述的方法实现。化学反应可以包括通过与将末端羟基氧化成醛的任何氧化剂如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)反应来活化肺炎球菌多糖。反应导致碳水化合物的邻羟基的随机氧化裂解，形成反应性醛基。
通过直接胺化还原胺化至蛋白质的赖氨酰基来偶联至载体蛋白。例如，通过在镍的存在下使活化多糖和载体蛋白的混合物与还原剂例如氰基硼氢化钠反应进行缀合。缀合反应可以在水溶液或二甲基亚砜(DMSO)的存在下进行。参见例如，US2015/0231270、US2011/0195086以及EP 0471177B1。然后通过加入强还原剂(例如硼氢化钠)将未反应的醛封端。
还原胺化涉及两个步骤，(1)多糖的氧化以形成反应性醛，(2)还原在活化多糖与载体蛋白之间形成的亚胺(席夫碱)以形成稳定的胺共轭键。在氧化之前，任选地将多糖尺寸减小。可以采用机械方法(例如，均质化)或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。氧化步骤可涉及与高碘酸盐反应。为了本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语还包括偏高碘酸盐(metaperiodate)(IO4 -)和原高碘酸盐(orthoperiodate)(IO6 -)，并且包括高碘酸盐的各种盐(例如，高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方式中，在偏高碘酸盐的存在下，优选在高碘酸钠(NaIO4)的存在下，氧化荚膜多糖。在另一个实施方式中，在原高碘酸盐存在下，优选在高碘酸存在下，氧化荚膜多糖。
在一个实施方式中，氧化剂是稳定的硝酰基或硝基氧(nitroxide)自由基化合物，例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，在氧化剂存在下选择性氧化伯羟基(如在WO2014/097099中所述的)。在所述反应中，在催化循环中，实际的氧化剂是N-氧代铵盐。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物带有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基氧基)部分。在一个方面中，所述稳定的硝酰基自由基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面中，所述氧化剂是带有N-卤代部分的分子。在一个方面中，所述氧化剂选自N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、N-碘琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪烷-2,4,6-三酮。优选地，所述氧化剂是N-氯代琥珀酰亚胺。
在某些方面中，氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)游离自由基和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为助氧化剂(如在WO2014/097099中所述)。因此，在一个方面中，来自肺炎链球菌的糖缀合物可通过包括以下步骤的方法获得：a)使糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应产生活化的糖；和b)使活化的糖与包含一个或多个胺基的载体蛋白反应(所述方法下文称为“TEMPO/NCS-还原胺化”)。
任选地，通过添加淬灭剂来淬灭氧化反应。淬灭剂可以选自邻二醇、1,2-氨基醇、氨基酸、谷胱甘肽、亚硫酸盐、硫酸氢盐、连二亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐、亚磷酸盐、次磷酸盐或亚磷酸(如甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2二醇或丁-2,3-二醇、抗坏血酸)。
在某些实施方式中，本发明提供了一种利用在非质子溶剂中的缀合反应制备血清型8肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的方法，其中所述缀合反应不使用氰基硼氢化物。在进一步的实施方式中，缀合反应是席夫碱还原或者还原胺化。在进一步的实施方式中，蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。在又一个进一步的实施方式中，蛋白是CRM197。在进一步的实施方式中，缀合反应是还原胺化。在进一步的实施方式中，还原胺化在二甲基亚砜(DMSO)中进行。
在一些实施方式中，缀合前氧化多糖的分子量在30kDa至1,000kDa之间。分子量可以通过体积排阻色谱法(SEC)结合多角度光散射检测器(MALS)和折射率检测器(RI)来计算。在一些实施方式中，多糖的分子量在50kDa至300kDa之间。在一些实施方式中，多糖的分子量在50kDa至1,000kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在70kDa至900kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在100kDa至800kDa之间。在其他实施方式中，多糖的分子量在200kDa至600kDa之间。在进一步的实施方式中，多糖的分子量是100kDa至1,000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；或500kDa至600kDa。
还原胺化的缀合过程的第二步是使用还原剂还原活化多糖和载体蛋白之间的亚胺(席夫碱)键以形成稳定的共轭键(所谓的还原胺化)。合适的还原剂包括氰基硼氢化物(如氰基硼氢化钠)或硼氢化钠。在一个实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠。
在某些实施方式中，还原胺化反应在非质子溶剂(或非质子溶剂的混合物)中进行。在一个实施方式中，还原反应在DMSO(二甲基亚砜)或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。如果冻干，则可以使用DMSO或DMF溶剂重构活化多糖和载体蛋白。在一个实施方式中，非质子溶剂是DMSO。
在还原反应结束时，缀合物中可能残留有未反应的醛基，可以使用合适的封端剂将其封端。在一个实施方式中，该封端剂是硼氢化钠(NaBH4)。合适的替代物包括在Bronsted或路易斯酸存在下的三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠或硼氢化锌，胺硼烷，例如吡啶硼烷，2-吡啶啉硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe’PrN-BH3，苄胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或硼氢化物交换树脂。缀合后(还原反应和任选地加帽)，可以通过本领域技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(相对于多糖-蛋白质缀合物的量富集)。这些技术包括渗滤、浓缩/渗滤操作、切向流过滤、沉淀/洗脱、柱色谱(离子交换色谱、多峰离子交换色谱、DEAE或疏水性相互作用色谱)和深度过滤。在一个实施方式中，糖缀合物通过渗滤或离子交换色谱或体积排阻色谱纯化。
在非质子溶剂中使用还原胺化制备的糖缀合物通常用于多价肺炎球菌缀合物疫苗中。因此，在某些实施方式中，对于不是所有血清型都在非质子溶剂中制备的多价组合物，其余血清型的还原反应是在水性溶剂中进行(例如，选自PBS(磷酸盐缓冲盐水)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、Bis-tris，ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸))、MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、DIPSO(3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙烷-1-磺酸)、MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-羟基丙磺酸))、POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙烷磺酸))、TEA(三乙醇胺)、EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸酸)、N-二甘氨酸，pH在6.0和8.5、7.0和8.0或7.0和7.5之间)。
能够在非质子溶剂中使用还原胺化制备的肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括但不限于肺炎链球菌血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。多糖可以以寡糖形式使用。通过将纯化的多糖片段化(例如，通过水解)方便地形成这些寡糖，通常将其纯化为所需尺寸的片段。
在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备一种或多种下述血清型的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备在多价免疫原性组合物中的每种血清型。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在多价组合物中的一种或多种血清型的多糖缀合至载体蛋白，和在水性溶剂中使用还原胺化将一种或多种血清型的多糖缀合。在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在本发明的多价组合物中的两种或更多种血清型的多糖缀合至载体蛋白。在其他实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化将在本发明多价组合物中的三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种、十九种或更多种、二十种或更多种、二十一种或更多种、二十二种或更多种、二十三种或更多中或者二十四种或更多种血清型的多糖缀合至载体蛋白。在某些实施方式中，使用可以在非质子溶剂或水性溶剂中的其他化学方法，将在本发明的多价组合物中的一种或多种血清型的多糖缀合至载体蛋白。
因此，本发明涉及一种多价免疫原性组合物，其包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，每种缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型是如本文所述的(即，在第II节“多价免疫原性组合物”中)，其中一种或多种多糖蛋白缀合物的多糖与载体蛋白缀合的缀合反应在非质子溶剂中进行。在某些实施方式中，在多价免疫原性组合物中至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的肺炎球菌血清型是在非质子溶剂中制备的。其余血清型使用其他化学方法和/或在水性溶剂中制备。
已确定相对于在水性条件下制备的相同缀合物，在多糖-蛋白质缀合物的还原胺化过程中使用DMSO作为溶剂可导致这些血清型出乎意料的优异稳定性和增强的免疫原性(参见美国专利申请系列号62/463,216和62/555,444)。
在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.02至约0.288mg/mL。在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.03至约0.192mg/mL。在本发明的某些实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.04至约0.192mg/mL。在其他实施方式中，在组合物中的总多糖浓度是从约0.065至约0.096mg/mL、约0.070至约0.080mg/mL、约0.065至约0.080mg/mL、约0.070至约0.085mg/mL、约0.110至约0.128mg/mL、约0.110至约0.175mg/mL、约0.10至约0.175mg/mL、约0.110至约0.170mg/mL、约0.115至约0.15mg/mL、约0.110至约0.15mg/mL、约0.110至约0.125mg/mL、约0.150至约0.170mg/mL、约0.150至约0.165mg/mL、约0.140至约0.170mg/mL、约0.130至约0.170mg/mL、约0.150至约0.175mg/mL、约0.070至约0.170mg/mL、约0.065至约0.175mg/mL或约0.065至约0.180mg/mL。
在本发明的实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的总多糖浓度在37℃下稳定4周或以上、在25℃下稳定4周或以上或在4℃下稳定12周或以上。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中全部肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的平均分子量(Mw)(组合物中所有缀合物的平均值)是从约2,000至约6,500kDa、从约2,500至约6,000kDa、从约3,000至约5,500kDa、从约3,500至约5,000kDa、从约3,500至约4,500kDa、从约3,500至约4,700kDa、从约3,500至约4,600kDa、从约3,500至约4,500kDa、从约3,500至约4,400kDa、从约3,500至约4,300kDa、从约3,500至约4,200kDa、从约3,600至约4,700kDa、从约3,600至约4,600kDa、从约3,600至约4,500kDa、从约3,600至约4,400kDa、从约3,600至约4,300kDa、从约3,600至约4,200kDa、从约3,700至约4,700kDa、从约3,700至约4,600kDa、从约3,700至约4,500kDa、从约3,700至约4,400kDa、从约3,700至约4,300kDa、从约3,700至约4,200kDa、从约3,800至约4,700kDa、从约3,800至约4,600kDa、从约3,800至约4,500kDa、从约3,800至约4,400kDa、从约3,800至约4,300kDa、从约3,800至约4,200kDa、从约3,900至约4,700kDa、从约3,900至约4,600kDa、从约3,900至约4,500kDa、从约3,900至约4,400kDa、从约3,900至约4,300kDa或从约3,900至约4,200kDa。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mw(针对单一血清型)是从约1,000至约10,000kDa、从约1,500至约5,500kDa、从约1,500至约5,600kDa、从约1,500至约5,700kDa、从约1,500至约5,800kDa、从约1,500至约5,900kDa、从约1,500至约6,000kDa、从约1,000至约5,500kDa、从约1,000至约5,000kDa、从约1,000至约4,000kDa、从约1,000至约4,500kDa、从约1,000至约4,000kDa或从约1,000至约3,500kDa。在其他实施方式中，在组合物内来自单一血清型的缀合物的Mw是约1,000kDa、约1,100kDa、约1,200kDa、约1,300kDa、约1,400kDa、约1,500kDa、约1,600kDa、约1,700kDa、约1,800kDa、约1,900kDa、约2,000kDa、约2,100kDa、约2,200kDa、约2,300kDa、约2,400kDa、约2,500kDa、约2,600kDa、约2,700kDa、约2,800kDa、约2,900kDa、约3,000kDa、约3,100kDa、约3,200kDa、约3,300kDa、约3,400kDa、约3,500kDa、约3,600kDa、约3,700kDa、约3,800kDa、约3,900kDa、约4,000kDa、约4,100kDa、约4,200kDa、约4,300kDa、约4,400kDa、约4,500kDa、约4,600kDa、约4,700kDa、约4,800kDa、约4,900kDa、约5,000kDa、约5,100kDa、约5,200kDa、约5,300kDa、约5,400kDa或约5,500kDa。
在本发明的某些实施方式中，在多价免疫原性组合物中的多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的。在某些实施方式中，在非质子溶剂中制备的肺炎链球菌血清型特异性缀合物的百分比(由在非质子溶剂中制备的多糖血清型的数量除以多糖血清型的总数计算得出，其中总数包括在非质子溶剂或质子溶剂中制备的那些)可以大于50％、或大于60％、或大于70％、或大于80％、或大于90％或者是100％。
在本发明的某些实施方式中，在组合物中的血清型3多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，且所述缀合物的Mw是从约1,000至约5,000kDa、或从约1,000至约4,000kDa、或从约1,000至约3,000kDa、或从约1,000至约2,500kDa、或从约1,000至约2,000kDa。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的数均分子量(Mn)(组合物中所有缀合物的平均值)是从约900至约3,000kDa、从约1,000至约3,000kDa、从约1,000至约2,500kDa、从约1,500至约2,500kDa、从约1,800至约2,500kDa、从约1,900至约2,500kDa或从约2,000至约2,500kDa。
在本发明的某些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，在组合物中的每种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mn(针对单一血清型)是从约700至约7,000kDa、从约1,000至约6,000kDa、从约1,000至约5,000kDa、从约1,000至约4,000kDa、从约1,000至约3,000kDa、从约900至约5,500kDa、从约900至约5,000kDa、从约900至约4,500kDa、从约900至约4,000kDa、从约900至约3,500kDa或从约900至约3,000kDa。
在本发明的实施方式中，在组合物中肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的Mw和/或Mn在37℃下稳定4周或以上、在25℃下稳定4周或以上和/或在4℃下稳定12周或以上。
在本发明的实施方式中，使用HPSEC UV/MALS/RI确定多糖浓度、Mw和/或Mn。
在本发明的一些实施方式中，其中在多价免疫原性组合物中的一种或多种或全部多糖-蛋白缀合物是在非质子溶剂中制备的，使用本征蛋白荧光光谱法在280纳米(nm)的激发波长下测量的组合物的最大发射从约335nm至约342nm。在一些实施方式中，在37℃下放置至少1周，最大发射保持在从约335nm至约342nm，且荧光强度是稳定的。在一些实施方式中，在37℃下放置1周，最大发射保持在从约335nm至约342nm，且荧光强度是稳定的。
在一些实施方式中，在DMSO中使用还原胺化制备在多价组合物中的所有肺炎球菌多糖缀合物。在某些子实施方式中，包含均使用DMSO制备的多糖缀合物的多价组合物不包含佐剂。
不希望受到任何理论的束缚，使用在DMSO中制备的糖缀合物观察到免疫原性增强的一种可能的机制包括碳水化合物(荚膜多糖)与载体蛋白表面上赖氨酸残基之间的键数量增加，这将导致蛋白与多糖之间产生附加的连接点，以赋予稳定性并抵抗肽碳水化合物键的化学解聚或破坏。参见例如，Hsieh,Characterization of Saccharide-CRM197Conjugate Vaccines in Brown F,Corbel M,Griffiths E(eds):Physico-ChemicalProcedures for the Characterization of Vaccines.Dev.Biol.Basel,Karger,2000,vol 103,pp.93-104。在DMSO溶剂中的缀合过程中产生增加的多糖-蛋白键的另一个益处是能够为成功地将肽-碳水化合物呈递给T细胞提供更多机会。通过在DMSO溶剂中缀合观察到免疫原性增强的另一种可能的机制可能是由于CRM197在有机溶剂中变性，这暴露了用于多糖连接的其他赖氨酸，使得在APC表面上糖肽呈递的机会增加，从而对不同肽表位产生T细胞依赖性应答。See Avci等，2011,Nature Medicine 17:1602-1610.。
在缀合物中产生变性的CRM197的有机溶剂中缀合的另一个益处是能够减少针对天然CRM197表位的抗体的免疫干扰。在DMSO溶剂中的缀合过程中产生的增加的多糖-蛋白连接的另一个益处是能够形成较大尺寸的多糖蛋白缀合物，从而增强免疫原性。据信本发明的组合物在激发人应答方面提供了显著的优势。
在某些实施方式中，缀合反应通过还原胺化进行，其中使用镍可提高缀合反应的效率，并有助于去除游离氰化物。已知过渡金属可与氰化物形成稳定的络合物，并且已知可以改善蛋白氨基和甲醛与氰基硼氢化钠的还原甲基化(S Gidley等，Biochem J.1982,203:331-334等，Jentoft等，Anal Biochem.1980,106:186-190)。通过络合残留的抑制性氰化物，镍的添加会增加缀合过程中蛋白的消耗，并导致形成更大的、可能更具免疫原性的缀合物。
氰基硼氢化钠试剂批次中起始氰化物含量的差异也会导致缀合性能不一致，从而导致可变的产品属性(如缀合物尺寸和缀合物Ps与CRM197的比率)。镍的添加通过络合氰化物减少了缀合不一致，消除了氰基硼氢化钠批次之间的差异。
适宜的替代化学方法包括用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸酯(CDAP)活化糖以形成氰酸酯。因此，活化的糖可以直接或通过间隔子(接头)基团与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔子可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化的多糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如，使用GMBS)或卤代乙酰化的载体蛋白(例如，使用碘乙酰亚胺(例如，盐酸碘乙乙酰胺)或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯或SIAB、或SIA或SBAP))反应后获得的硫醚键与载体偶联。优选地，将氰酸酯(任选地通过CDAP化学方法制得)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且使用碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学方法经由蛋白载体上的羧基将氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。在国际专利申请公开号WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/29094；以及Chu等，1983,Infect.Immunity 40:245-256中描述了这样的缀合物。
其他适宜的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。在国际专利申请公开号WO 98/42721中描述了许多。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应形成(参见Bethell等，1979,J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等，1981,J.Chromatogr.218:509-18)，然后与蛋白反应形成氨基甲酸酯键。这可能涉及将端基还原为伯羟基，任选地伯羟基的保护/脱保护，伯羟基与CDI反应形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。
荚膜多糖与载体蛋白缀合后，通过多种技术中的一种或多种纯化多糖-蛋白缀合物(相对于多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术的实例是本领域技术人员熟知的，并且包括浓缩/渗滤操作、超滤、沉淀/洗脱、柱色谱和深度过滤。参见例如，美国专利号6,146,902。
在将单个糖缀合纯化后，将其复合以配制本发明的免疫原性组合物。将通过单独的方法和原料制备的这些肺炎球菌缀合物配制成单剂量制剂。
表征本发明的糖缀合物的一种替代方法是通过载体蛋白(例如，CRM197)中变得与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为一系列缀合的赖氨酸(缀合度)。由于与多糖的共价键合，对载体蛋白进行赖氨酸修饰的证据可以使用本领域技术人员已知的常规方法通过氨基酸分析获得。与用于产生缀合物材料的载体蛋白起始材料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数量减少。在一个优选的实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为2至15之间、2至13之间、2至10之间、2至8之间、2至6之间、2至5之间、2至4之间、3至15之间、3至13之间、3至10之间、3至8之间、3至6之间、3至5之间、3至4之间、5至15之间、5至10之间、8至15之间、8至12之间、10至15之间或10至12之间。在一个实施方式中，本发明糖缀合物的缀合度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15。在一个优选的实施方式中，本发明糖缀合物的缀合度为4至7之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。
本发明组合物的糖缀合物还可以通过多糖与载体蛋白的比率(Ps:Pr)(重量/重量)来表征。在一些实施方式中，组合物的糖缀合物中多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至3.0之间(例如，约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9或约3.0)。在其他实施方式中，多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5至2.5之间、0.5至1.5之间、0.8至2.5之间、0.5至1.0之间、1.0至1.5之间、1.0至2.0之间、0.8至2.4之间、0.8至2.3之间、0.8至2.2之间、0.8至2.1之间、0.8至2.0之间、0.8至1.9之间、0.8至1.8之间、0.8至1.7之间、0.8至1.6之间、0.8至1.5之间、0.8至1.4之间、0.8至1.3之间、0.9至2.4之间、0.9至2.3之间、0.9至2.2之间、0.9至2.1之间、0.9至2.0之间、0.9至1.9之间、0.9至1.8之间、0.9至1.7之间、0.9至1.6之间、0.9至1.5之间、0.9至1.4之间、0.9至1.3之间、0.9至1.2之间、1.0至2.4之间、1.0至2.3之间、1.0至2.2之间、1.0至2.1之间、1.0至2.0之间、1.0至1.9之间、1.0至1.8之间、1.0至1.7之间、1.0至1.6之间、1.0至1.5之间、1.0至1.4之间、1.0至1.3之间或1.0至1.2之间。在进一步的实施方式中，多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.8至1.2之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM197。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可包含未与载体蛋白共价缀合但仍存在于糖缀合物组合物中的游离糖。游离糖可以与糖缀合物非共价关联(即，非共价结合，吸附或捕获于其中或与之捕获)。
在特定实施方式中，对于血清型15A缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型15A，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定实施方式中，对于血清型15C缀合，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型15C，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定实施方式中，对于血清型33F缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.0至约2.0、从约1.25至约1.75或从约1.3至约1.7。在其他实施方式中，对于血清型33F，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。
在特定实施方式中，对于血清型35B缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约1.25至约2.25、从约1.25至约2.0或从约1.3至约1.8。在其他实施方式中，对于血清型35B，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约1.2、1.3、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。
在特定实施方式中，对于血清型24F缀合物，糖与载体蛋白的比率(w/w)为从约0.5至约1.5、从约0.75至约1.25或从约0.8至约1.0。在其他实施方式中，对于血清型24F，糖与载体蛋白的比率(w/w)为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。
在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约25％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约20％的游离多糖。在一个优选的实施方式中，与多糖总量相比，糖缀合物包含少于约15％的游离多糖。
IV.使用方法
本发明的实施方式还包括一种或多种本文所述的多价免疫原性组合物(i)用于，(ii)作为药物或组合物用于，或者(iii)制备药物用于：(a)疗法(例如，人体的)；(b)药物；(c)抑制肺炎链球菌感染；(d)诱导针对肺炎链球菌的免疫应答或保护性免疫应答；(e)预防肺炎链球菌感染；(f)防止肺炎链球菌感染复发；(g)减少与肺炎链球菌感染有关的病理症状的进展、发病或严重程度，包括预防相关的并发症，如脑损伤、听力丧失和癫痫发作；(h)降低肺炎链球菌感染的可能性，或(i)治疗、预防或延迟一种或多种肺炎球菌疾病的发作、严重程度或进展，包括但不限于：肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌菌血症、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎。在这些用途中，本发明的多价肺炎球菌多糖-缀合物组合物可以任选地与一种或多种佐剂联用，或不使用佐剂。
因此，本发明提供了用于预防性治疗(即，保护)肺炎链球菌感染或肺炎链球菌疾病的方法，包括向需要治疗的患者施用一种或多种本发明的多价免疫原性肺炎球菌多糖-蛋白缀合物组合物。
本发明的组合物和制剂可以用于保护或治疗易于感染(例如，肺炎球菌感染)的人，通过经全身性或粘膜途径施用此类组合物或制剂的方式。
在一个实施方式中，本发明提供了一种诱导对肺炎链球菌的免疫应答的方法，包括向患者施用免疫学有效量的本发明的多价免疫原性组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了一种针对肺炎球菌感染接种人的方法，包括向人施用免疫学有效量的本发明的多价免疫原性组合物的步骤。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于(1)在人类患者中诱导免疫应答，(2)在人类患者中诱导保护性免疫应答，(3)针对肺炎链球菌感染免疫接种人类患者，或(4)在人类患者中降低肺炎链球菌感染的可能性的方法，所述方法包括向患者施用本发明的多价免疫原性组合物(即，本文所述的任何多价免疫原性组合物，如在第II节标题“多价免疫原性组合物”中所述的多价免疫原性组合物，如上所述)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于在婴儿(年龄小于1岁)、学步幼儿(约12至24个月)或幼儿(约2至5岁)中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在6周至17岁患者中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在6个月至17岁患者中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在18岁及以上的成人中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在50岁及以上的成人中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在65岁及以上的成人中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于预防由一种或多种以下肺炎链球菌菌株引起的肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
在上述方法的一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或者血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在上述方法的另一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型由以下组成，血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或血清型：1、3、4、5、6A、6B、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在上述方法的一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或者血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在上述方法的另一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型由以下组成，血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在上述方法的一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌血清型包含血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。在上述方法的另一个实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型由以下组成，血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B，或血清型：。
已经发现，包含血清型6A的肺炎球菌缀合物疫苗可以提供针对血清型6C的一些交叉保护作用(Cooper等，Vaccine 29(2011)7207–7211)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型6C，但取而代之包含血清型6A或血清型6A和6B的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含血清型6A、6B和6C的肺炎球菌缀合物。
在上述方法的特定实施方式中，所述多价免疫原性组合物包含肺炎球菌缀合物，其包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；和
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
在上述方法的其他实施方式中，所述组合物包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，其中所述肺炎链球菌的血清型包含血清型：i)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或iii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；或iv)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
还已发现，包含血清型10A的肺炎球菌缀合物疫苗可以针对血清型39提供一些交叉保护作用(参见WO 2017/085586)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型10A，但取而代之的是包含血清型39的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含肺炎球菌血清型10A和39的缀合物。在上述方法的特定实施方式中，肺炎链球菌的血清型包含选自下组的一组的血清型：
bb)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
cc)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
dd)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ee)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ff)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
gg)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
hh)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
jj)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
kk)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ll)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
mm)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
nn)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
oo)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
pp)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
qq)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
rr)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ss)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
tt)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
uu)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
vv)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ww)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
xx)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
yy)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
zz)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
aaa)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；和
bbb)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39。
还已发现，包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型15B荚膜多糖的免疫原性缀合物可以针对血清型15C和/或血清型15A提供一些交叉保护作用(参见WO 2015/110942)。因此，在上述方法的一些实施方式中，本发明还提供了不包含血清型15C(或去-O-乙酰化15B)，但取而代之的是包含血清型15B(即，基本上未被去-O-乙酰化的血清型15B多糖)的多价免疫原性组合物的用途。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌血清型15B和15C(或去-O-乙酰化15B)的缀合物。
本发明的组合物可用于在此前已接受多价肺炎球菌疫苗的患者中提供针对肺炎链球菌的补充保护的方法。在这种用途中，本发明的组合物可以提供针对患者先前未接种过的特定肺炎链球菌血清型的保护，可以提供针对患者先前已经接种过的肺炎链球菌血清型的附加保护，或者可以提供针对患者先前未接种过的肺炎链球菌血清型和患者先前已接种过的肺炎链球菌血清型两者的保护。
因此，本发明提供了在患者中诱导针对肺炎链球菌的免疫应答、接种疫苗或诱导保护性免疫应答的方法，所述方法包括向患者施用多价免疫原性组合物，所述组合物包含多价肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中所述患者此前已针对肺炎链球菌进行过免疫接种。在本发明这一方面的实施方式中，多价免疫原性组合物可以是本文所述的任何多价免疫原性组合物。在本发明方法的特定实施方式中，向此前已使用多价肺炎球菌疫苗治疗的患者施用多价免疫原性组合物。多价免疫原性疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法的特定实施方式中，患者此前已使用多价肺炎球菌疫苗进行了治疗，所述疫苗适用于预防由选自下组一组血清型中的一种或多种肺炎链球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
i.4、6B、9V、14、18C、19F和23F；
ii.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F和19A；
iii.1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F；
iv.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F和33F；
v.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20；和
vi.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F和15B。
在上述方法的特定实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含多种多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含未缀合至载体蛋白的多种肺炎链球菌荚膜多糖。
在上述方法的其他实施方式中，患者此前已使用
Figure BDA0003213826260000581
13(肺炎球菌13价缀合物疫苗[白喉CRM197蛋白]，Pfizer,Inc.,Philadelphia,PA,USA)治疗。
在上述方法的其他实施方式中，患者此前已使用
Figure BDA0003213826260000582
Figure BDA0003213826260000583
23(多价肺炎球菌疫苗，Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)治疗。
在上述方法更进一步的实施方式中，患者此前已使用SYNFLORIXTM(肺炎球菌多糖缀合物疫苗(吸附的)，GlaxoSmithKline Biologicals s.a.,Rixensart,Belgium)治疗。
在上述方法的实施方式中，根据由医学专业人员(例如，医师)提供的治疗方案，在患者接受多价肺炎球菌疫苗之后的任何时间，向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在特定实施方式中，在患者已接受多价肺炎球菌疫苗后从1个月至5年向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，或者从1个月至1年、从1个月至2年、从1个月至3年、从1个月至4年、从1个月至6个月、从2个月至6个月、从2个月至1年、从1年至5年、从6个月至5年、从6个月至4年、从6个月至3年、从6个月至2年、从6个月至1年、从1年至4年、从1年至3年或从1年至2年。在进一步的实施方式中，在患者已接受多价肺炎球菌疫苗后约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约1.25年、约1.5年、约1.75年、约2年、约2.25年、约2.5年、约2.75年、约3年、约3.25年、约3.5年、约3.75年、约4年、约4.25年、约4.5年、约4.75年或约5年向患者施用多价免疫原性组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了一种用于(1)在人类患者中诱导免疫应答，(2)在人类患者中诱导保护性免疫应答，(3)针对肺炎链球菌感染向人类患者免疫接种，或(4)在人类患者中降低肺炎链球菌感染的可能性的方法，所述方法包括以任何顺序向患者施用本发明的多价免疫原性组合物和施用多价肺炎球菌疫苗。例如，先向患者施用多价肺炎球菌疫苗，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。或者，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再向患者施用多价肺炎球菌疫苗。多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的肺炎球菌疾病的任何疫苗。
在上述方法的特定实施方式中，使用本发明的多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗对患者进行治疗，所述疫苗用于预防由选自下组的一组血清型的一种或多种肺炎链球菌血清型引起的肺炎球菌疾病：
i.4、6B、9V、14、18C、19F和23F；
ii.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F和19A；
iii.1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F；
iv.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F和33F；
v.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20；和
vi.4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、6A、7F、19A、22F、33F、8、10A、11A、12F和15B。
在上述方法的特定实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含肺炎球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、3、5、7F、19A、22F、33F、2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F和20A的荚膜多糖。
在上述方法的特定实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含多种多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖。在其他实施方式中，所述多价肺炎球菌疫苗包含未缀合至载体蛋白的多种肺炎链球菌荚膜多糖。
在上述方法的其他实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用
Figure BDA0003213826260000601
13(肺炎球菌13价缀合物疫苗[白喉CRM197蛋白]，Pfizer,Inc.,Philadelphia,PA,USA)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用
Figure BDA0003213826260000602
13，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用
Figure BDA0003213826260000603
13。
在上述方法的其他实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用
Figure BDA0003213826260000604
23(多价肺炎球菌疫苗，Merck&Co.,Inc.,Kenilworth,NJ,USA)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用
Figure BDA0003213826260000605
23，后向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用
Figure BDA0003213826260000606
23。
在上述方法更进一步的实施方式中，以任何顺序，使用本发明的多价免疫原性组合物和使用SYNFLORIXTM(肺炎球菌多糖缀合物疫苗(吸附的)，GlaxoSmithKlineBiologicals s.a.,Rixensart,Belgium)对患者进行治疗。在一个实施方式中，先向患者施用SYNFLORIXTM，再向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。在一个替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用SYNFLORIXTM。
在上述方法的一些实施方式中，多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗是并行(concurrently)施用的。如本文所用，“并行施用”不限于两种组合物同时施用，还包括以任何顺序一个接一个地施用。在一些实施方式中，多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗通过肌内或皮下施用向不同解剖部位(例如，两个不同手臂)施用。
在上述方法的一些实施方式中，本发明的多价免疫原性组合物和多价肺炎球菌疫苗的施用之间的时间量是从约4周至约1年。在替代实施方式中，时间量是从约1个月至约5年。
在一个实施方式中，先向患者施用多价肺炎球菌疫苗，再施用本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，先向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，再施用多价肺炎球菌疫苗。
还提供了一种在患者中针对肺炎链球菌诱导免疫应答、免疫接种或诱导保护性免疫应答的方法，包括：
(1)向患者施用本发明的多价免疫原性组合物，
(2)等待过去预定的时间量，和
(3)向患者施用多价肺炎球菌疫苗。
在这种方法中，多价免疫原性组合物可以包含本文所示的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的任何组合，和多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的疾病的任何疫苗。
还提供了一种在患者中针对肺炎链球菌诱导免疫应答、免疫接种或诱导保护性免疫应答的方法，包括：
(1)向患者施用多价肺炎球菌疫苗，
(2)等待过去预定的时间量，和
(3)向患者施用本发明的多价免疫原性组合物。
在这种方法中，多价免疫原性组合物可以包含本文所示的肺炎链球菌多糖蛋白的任何组合，和多价肺炎球菌疫苗可以是用于预防由一种以上肺炎链球菌的血清型引起的疾病的任何疫苗。
在上述方法的一些实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含多种肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。在替代实施方式中，多价肺炎球菌疫苗包含不与载体蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜多糖。
在本发明方法的任何实施方式中(即，本文所述的任何方法)，该方法还可以包括向患者施用一个或多个其他剂量的本发明的多价免疫原性组合物。在这种方法中，在接受第一剂本发明的多价免疫原性组合物之前，患者可以已接受多价肺炎球菌疫苗(如上文所述)，或者在接受本发明的多价免疫原性组合物之前患者可以未针对肺炎链球菌进行过免疫接种。因此，在一个实施方式中，向已接受过用于预防由肺炎链球菌引起的肺炎球菌疾病的多价肺炎球菌疫苗的患者施用两剂或更多剂本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，向此前未使用过用于预防肺炎球菌疾病的任何疫苗进行治疗的患者施用两剂或更多剂本发明的多价免疫原性组合物。
在上述方法的实施方式中，两剂或更多剂是相同的本发明的多价免疫原性组合物。在替代实施方式中，两剂或更多剂是不同的本发明的多价免疫原性组合物。
在任何这些方法的特定实施方式中，向患者施用两剂、三剂或四剂本发明的多价免疫原性组合物。在特定实施方式中，患者是免疫功能低下的(例如，在干细胞移植后采用免疫抑制方案)。
在一些实施方式中，每剂本发明的多价免疫原性组合物的施用之间的时间量是从约4周至约1年。在替代实施方式中，每剂本发明的多价免疫原性组合物的施用之间的时间量是从约1个月至约5年。
在本发明任何方法的实施方式中，使用一种或多种本发明的组合物治疗的患者是人。在某些实施方式中，人患者是婴儿(约6周至12个月)。在某些实施方式中，人患者是学步儿童(约12至24个月)或幼儿(约2至5岁)。本发明的组合物也适用于年龄较大的儿童、青少年和成人(例如18至45岁、18至50岁、18至55岁、18至60岁或18至65岁)。在本发明任何方法的其他实施方式中，患者的年龄是约2岁至约18岁。在本发明任何方法进一步的实施方式中，患者的年龄是18岁或以上。
在本发明方法的其他实施方式中，患者是婴儿，并且向婴儿施用1剂、2剂或3剂本发明的多价免疫原性组合物。每剂施用之间的时间量可能会有所不同，但给药方案的一个实例包括在2个月大时施用1剂，然后在4个月大时再施用1剂和最后在6个月大时最后施用1剂。在婴儿中施用方案的另一个实例是在2个月大时施用1剂，然后在3个月大时再施用1剂。在婴儿中施用方案的另一个实例是在2个月大时施用1剂，然后在3个月大时再施用1剂和最后在6个月大时最后施用1剂。在其他实施方式中，当婴儿是学步幼儿时，婴儿患者可以接受另外的“强化”剂量的本发明的多价免疫原性组合物。例如，婴儿在2个月大时给药，然后在4个月大时再施用1剂，最后在6个月大时最后施用1剂，然后，当婴儿达到学步幼儿年龄时，在11至15个月大时施用另外的“强化”剂量的本发明的多价免疫原性组合物。
在一个实施方式中，婴儿施用2剂本发明的多价免疫原性组合物。
在一个实施方式中，婴儿施用3剂本发明的多价免疫原性组合物。
在一个实施方式中，患者施用3剂本发明的多价免疫原性组合物，其中第1剂和第2剂在2至10个月大之间施用，第3剂在11至15个月大之间施用。
在一个实施方式中，患者施用4剂本发明的多价免疫原性组合物，其中第1剂在2个月大时施用，第2剂在4个月大时施用，第3剂在6个月大时施用和第4剂在11至15个月大之间施用。
在本发明方法的其他实施方式中，人类患者是老年人。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是50岁或以上。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是55岁或以上。在本发明任何方法的一些实施方式中，患者的年龄是60岁或以上。在本发明任何方法另外进一步的实施方式中，患者的年龄是65岁或以上。在本发明任何方法的其他实施方式中，患者的年龄是70岁或以上。
在本发明任何方法的一些实施方式中，使用本发明免疫原性组合物治疗的患者是免疫功能低下的。
在本发明任何方法的一些实施方式中，多价免疫原性组合物与流感疫苗随附(concomitantly)施用。在某些实施方式中，流感疫苗是“高级流感疫苗”，是针对老年人(例如，年龄在65岁或以上的人)的高剂量流感疫苗。
本发明提供了一种在患者中针对肺炎球菌感染诱导保护性免疫应答的方法，包括向患者施用免疫学有效量的任何本文所述的多价免疫原性肺炎球菌多糖-蛋白缀合物组合物的步骤。可以通过标准研究确定特定疫苗(即，多价免疫原性组合物)的最佳成分量，这些标准研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，通过从动物研究到人数据的外推确定人免疫接种的剂量。在另一个实施方式中，剂量是根据经验确定的。
本发明的方法可用于预防和/或减少由微生物(例如，肺炎链球菌)引起的原发性临床综合征，包括侵入性感染(脑膜炎、肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。
本发明组合物的施用可以包括以下一种或多种：通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，鼻内施用可用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效地预防肺炎球菌的鼻咽运输，因而可以在早期减轻感染)。在特定的实施方式中，通过肌内或皮下施用向患者施用本发明的组合物。
为了描述和公开可能与本发明结合使用的方法和材料，本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。
已经参考附图描述了本发明的不同实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且在不背离所附权利要求书中所限定的本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以在其中进行各种改变和修改。
下列实施例说明但不限制本发明。
实施例
实施例1
肺炎链球菌荚膜多糖的制备
培养肺炎球菌的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Chase，1967，Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域众所周知的。参见，例如，欧洲专利号EP 0 497 524B1。下文所述的方法通常遵循欧洲专利号EP0 497524B1中所述的方法，并且通常适用于所有肺炎球菌血清型。
血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F和35B的肺炎球菌菌株分离株从默克培养物保藏中心(Merck CultureCollection)获得。血清型23B菌株从疾病控制和预防中心以及阿拉巴马大学伯明翰分校获得。血清型24F菌株从默克培养物保藏中心和阿拉巴马大学伯明翰分校获得。如果需要，可以使用特定的抗血清根据Quelling反应区分亚型。参见例如，美国专利号5,847,112。通过在琼脂平板上分两个阶段连续铺板来进一步克隆分离所获得的分离株，琼脂平板由无动物成分的培养基组成，所述培养基含有大豆蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖而不含血红素(hemin)。对于血清型7F，所使用的琼脂平板还含有血红素。使用含有大豆蛋白胨、酵母提取物、HEPES、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钾、葡萄糖和甘油的无动物成分培养基在液体培养中进一步扩增每种血清型的克隆分离株以制备预主细胞库(pre-master cell bank)。
每种血清型的肺炎球菌多糖的产生由细胞扩增和分批生产发酵组成，然后在下游纯化前进行化学灭活。使用装有预先消毒的无动物成分的生长培养基的摇瓶或培养瓶扩增来自各种血清型的解冻的细胞库小瓶，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，HEPES，氯化钠，碳酸氢钠，磷酸钾和葡萄糖。细胞扩增培养物在密封的摇瓶或培养瓶中生长，以在温度和搅拌控制下最小化气体交换。在这些血清型的细胞扩增过程中，控制温度、pH、压力和搅拌。气流覆盖也得到控制，因为不使用鼓泡(sparging)。在达到指定的培养密度后(通过600nm的光密度测量)，将一部分细胞扩增培养物转移至含有预先灭菌的无动物成分的生长培养基的生产发酵罐中，所述培养基含有大豆蛋白胨或大豆蛋白胨超滤液，酵母提取物或酵母提取物超滤液，氯化钠，磷酸钾和葡萄糖。控制温度、pH、压力和搅拌。气流覆盖也得到控制，因为不使用鼓泡。
当葡萄糖几乎耗尽时，通过添加化学灭活剂苯酚终止分批发酵。加入纯苯酚至终浓度为0.8-1.2％，以灭活细胞并从细胞壁释放荚膜多糖。初级(primary)灭活发生在发酵罐中指定的时间内，其中继续控制温度和搅拌。在初级灭活后，将批料转移到另一个容器中，其中在受控的温度和搅拌下持续另外的指定时间以完全灭活。这可以通过微生物铺板技术或通过验证苯酚浓度和指定的时间来确认。然后纯化灭活的培养基(broth)。
实施例2
肺炎球菌多糖的纯化
肺炎球菌多糖的纯化由多次离心、深度过滤、浓缩/渗滤操作和沉淀步骤组成。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
用阳离子聚合物(如BPA-1000、
Figure BDA0003213826260000661
(Baker Hughes Inc.,Houston,TX)、Spectrum 8160、聚(乙烯亚胺)和Millipore pDADMAC)将来自肺炎链球菌的发酵罐培养物的灭活培养基絮凝。阳离子聚合物与杂质蛋白、核酸和细胞碎片结合。在絮凝步骤和老化阶段之后，通过离心和多次深度过滤步骤除去絮凝的固体。浓缩澄清的培养基，并使用100kDa至500kDa MWCO(分子量截留值)过滤器进行渗滤。渗滤是使用Tris，MgCl2缓冲液和磷酸钠缓冲液完成的。渗滤去除了残留的核酸和蛋白质。
通过用变性的醇和/或异丙醇使醋酸钠和苯酚中的多糖再沉淀，可以进一步去除杂质。在苯酚沉淀步骤中，将磷酸钠盐水缓冲液中的醋酸钠和苯酚(液化酚或固体酚)装入渗滤过的渗余物(retentate)中。然后分两个阶段进行多糖的酒精分馏。在第一阶段中，将低百分比的乙醇添加到制剂中，以沉淀细胞碎片和其他不需要的杂质，而粗多糖保留在溶液中。经由离心和之后的深度过滤步骤除去杂质。然后通过向批料中添加另外的异丙醇或变性醇从溶液中回收多糖。通过离心回收沉淀的多糖沉淀，将其研磨并干燥为粉末，并在-70℃下冷冻保存。
实施例3
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型1缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM197分别冻干，然后重新溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。然后将重新溶解的多糖和CRM197溶液合并，并按照以下说明进行缀合。在最终0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低Ps分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为250巴(bar)/通过5次。
将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行15小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2.5mg Ps/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197材料分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖和CRM197溶液共混，以达到1.0g Ps/L的多糖浓度和1.5的多糖与CRM197的质量比。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，添加硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)，并在22℃下孵育1小时。将该批料在约4℃下稀释到含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠中。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。在约4℃下使用300kD NMWCO透析盒，将批料用150mM氯化钠、0.05％(w/v)聚山梨醇酯20进行透析，持续3天。
最终过滤和产品贮存
将批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例4
使用水性缀合制备用于PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型1缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为250巴/通过5次，以使尺寸减小至目标分子质量。随后，将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行15小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.5进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为6.9g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将聚山梨醇酯20添加到渗余物批料中至浓度0.05％(w/v)，然后将批料以0.2微米过滤。
用另外含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例5
使用水性缀合制备用于PCV22多价研究的血清型1缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质压力和通过均质器的次数控制为250巴/通过5次，以使尺寸减小至目标分子质量。随后，将尺寸减小的多糖浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。通过添加100mM偏高碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行15小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.5进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为6.9g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将聚山梨醇酯20添加到渗余物批料中至浓度0.05％(w/v)，然后将批料以0.2微米过滤。
用另外含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例6
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型3缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为810巴/6次，接着为900巴/3次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行12小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2.5mg Ps/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.25g Ps/L和多糖与CRM197质量比为1.35。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例7
使用水性缀合制备用于PCV22和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型3缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为380巴/5次，以使尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行12小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 6.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.6进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为4.1g/L和150mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合在10℃下进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将批料以0.2微米过滤。
用另外的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例8
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型4缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终以0.2微米过滤之前，通过渗滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为300巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖溶液调节至50℃，并用乙酸钠缓冲液调节pH 4.1，以使得多糖部分地去缩酮化。然后，将多糖溶液冷却至22℃，随后活化。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，随后用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度5.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为2.0。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。使用300kDa NMWCO透析盒，将批料在约4℃下用150mM氯化钠、0.05％(w/v)聚山梨醇酯20透析3天。
最终过滤和产品贮存
将批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例9
使用水性缀合制备用于PCV23(DMSO+Aq)和PCV22多价研究的血清型4缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为300巴/5次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖溶液调节至50℃，并用乙酸钠缓冲液调节pH 4.1，以使得多糖部分地去缩酮化。然后，将多糖溶液冷却至22℃，随后活化。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，以及与缓冲多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.5进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为8.3g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。然后，将批料以0.2微米过滤。
用另外的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例10
用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型5缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终以0.2微米过滤之前，通过渗滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为600巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖溶液调整至4℃，并使用乙酸钠缓冲液调节pH 4.1，以使得因活化所致的多糖尺寸减小降至最低。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在4℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM乙酸钠(pH 4.1)进行渗滤，然后使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液用氯化钠标记(spike)至浓度20mM。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.0g Ps/L以及多糖与CRM197的质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
稀释和中和
在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。使用300kDa NMWCO透析盒，将批料在约4℃下用150mM氯化钠、0.05％(w/v)聚山梨醇酯20透析3天。
最终过滤和产品贮存
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例11
使用水性缀合制备用于PCV22和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型5缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为600巴/5次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖溶液调整至4℃，并使用乙酸钠缓冲液调节pH 4.1，以使得因活化所致的多糖尺寸减小降至最低。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在4℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流渗滤膜将活化产物用10mM乙酸钠(pH 4.1)渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 6.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197与缓冲多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.4进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为3.8g/L和150mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行96小时，以使得多糖和蛋白的消耗最大化。
纯化和中和
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜在2-8℃下使用300mM碳酸氢钠(pH 9.3)对批料进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料用1.5M磷酸钾(pH 6.0)中和。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将聚山梨醇酯20添加至渗余物批料中至浓度为0.05％(w/v)，然后将批料以0.2微米过滤。
用另外含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例12
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)和PCV22多价研究的血清型6A
将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制各步骤内的多个工艺参数，如pH、温度、浓度和时间，以得到具有所需属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/5次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.5g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.4。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠以及约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例13
使用DMSO缀合制备用于PCV 23(DMSO)和PCV 23(DMSO/Aq)多价研究的血清型6B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.85g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.35。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例14
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型6B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/5次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.75g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.35。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例15
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型7F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为150巴/7次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖调节至4℃，并用乙酸钠缓冲液调节至pH 5，以使得因活化所致的多糖尺寸减小最小化。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在4℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.6g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例16
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型7F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为150巴/7次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖调节至4℃，并用乙酸钠缓冲液调节至pH 5，以使得因活化所致的多糖尺寸减小最小化。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在4℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.04g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例17
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型8缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为600巴/6次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度4.5g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。混合后，在22℃下进行缀合反应。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例18
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型9V缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为230巴/5.5次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行6小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.3。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例19
使用水性缀合制备用于PCV22多价研究的血清型9V缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为100巴/5次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行6小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.7进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为10.0g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将聚山梨醇酯20添加到渗余物批料中至浓度0.05％(w/v)，然后将批料以0.2微米过滤。
用另外含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例20
使用水性缀合制备用于PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型9V缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为100巴/5次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行6小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.7进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为10.0g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将聚山梨醇酯20添加到渗余物批料中至浓度0.05％(w/v)，然后将批料以0.2微米过滤。
用另外含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例21
使用DMSO缀合制备用于PCV23多价研究的血清型10A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为615巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.5g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.6。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜使用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例22
使用DMSO缀合物制备用于PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型10A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为600巴/5次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.4g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.6。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤，然后使用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例23
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型10A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为600巴/5次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.8g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.75。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例X
使用DMSO缀合制备用于PCV24多价研究的血清型11A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为800巴/8次。将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合物CRMl97
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液渗滤，并以0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Ps/mL、蔗糖浓度1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.3g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠以及约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例24
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型12F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在80℃下孵育155分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)以减小溶解的多糖尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.7g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.8。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例25
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型12F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在90℃下孵育60分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)以减小溶解的多糖尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例26
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型14缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终以0.2微米过滤之前，通过渗滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/6次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.8g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。在约4℃下使用300kDa MWCO透析盒，将批料使用150mM氯化钠、0.05％聚山梨醇酯20进行透析，持续22.5小时。
最终过滤和产品贮存
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例27
使用水性缀合制备用于PCV22和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型14缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/6次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比1.0进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为3.8g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行72小时，以使得多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。然后，将批料以0.2微米过滤。
用另外的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液将批料的多糖浓度调节至1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例28
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型15A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为210巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行20小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解于等体积DMSO中，将其预加热至34℃。将多糖溶液外加氯化钠至25mM的浓度。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度5.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为2.0。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在34℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在34℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例29
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型15A缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为200巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行20小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解于等体积DMSO中，将其预加热至34℃。将多糖溶液外加氯化钠至25mM的浓度。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度5.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为2.0。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在34℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例30
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型15C缀合物
将来源于肺炎链球菌血清型15B的多糖溶解，尺寸化至目标分子质量，通过弱碱水解以释放O-乙酰基，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小、碱水解和氧化
将纯化的血清型15B肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为300巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
将多糖溶液加热至60℃并添加碳酸氢钠(pH 9)缓冲液至终浓度50mM。将批料在60℃下混合孵育13小时，以释放O-乙酰基。添加磷酸钾(pH 6)缓冲液至终浓度为136mM，以中和pH并将溶液冷却至环境温度。然后将溶液浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用水进行渗滤。
将多糖溶液调节至22℃，并使用乙酸钠缓冲液调节至pH 5，以使得因活化所致的多糖尺寸减小降至最低。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.75。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例31
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型15C缀合物
将来源于肺炎链球菌血清型15B的多糖溶解，尺寸化至目标分子质量，通过弱碱水解以释放O-乙酰基，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小、碱水解和氧化
将纯化的血清型15B肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为300巴/5次。将尺寸减小的多糖溶液加热至60℃，并添加碳酸氢钠(pH 9.4)缓冲液至终浓度为50mM。将批料在60℃下混合孵育12小时，以释放O-乙酰基。添加磷酸钾(pH 6)缓冲液至终浓度为150mM，以中和pH并将溶液冷却至环境温度。然后将溶液浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用水进行渗滤。
将多糖溶液调节至22℃，并使用乙酸钠缓冲液调节至pH 5，以使得因活化所致的多糖尺寸减小降至最低。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.2g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.75。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例32
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型18C缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在90℃下孵育160分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)减小溶解多糖的尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.49g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例33
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型18C缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在90℃下孵育160分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)减小溶解多糖的尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.49g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例34
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型19A缀合物
将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.22微米过滤。将多糖浓度，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行20小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.8g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.33。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例35
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型19A缀合物
将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.22微米过滤。将多糖浓度，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行20小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度3.8g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.33。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例36
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)、PCV23(DMSO+Aq)和PCV22多价研究的血清型19F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为150巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后，将多糖调节至4℃，并用乙酸钠缓冲液调节至pH 5，以使得因活化所致的多糖尺寸减小最小化。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在4℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.2。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。将渗余物批料以0.2微米过滤，然后在22℃下孵育4.5天。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜使用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例37
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型22F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为810巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.3g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例38
使用水性缀合制备用于PCV22和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型22F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为350巴/5次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比为0.6进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为7.5g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行120小时，以使多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。
将批料以0.2微米过滤，并用另外的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液调节至多糖浓度为1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例39
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)、PCV23(DMSO+Aq)和PCV22多价研究的血清型23B缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为400巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度5.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例40
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型23F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为400巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行5小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.1g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.25。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例41
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型23F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为400巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行4小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.1g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.25。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育3小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例42
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型24F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在80℃下孵育150分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)减小溶解多糖的尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2mg Pr/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液外加氯化钠至浓度为10mM。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.4g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例43
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型24F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。通过酸水解(通过将乙酸添加至200mM，在80℃下孵育150分钟，然后通过添加低温磷酸钾(pH 7)缓冲液至400mM进行中和)减小溶解多糖的尺寸。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以2mg Pr/mL、蔗糖浓度为10％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液外加氯化钠至浓度为25mM。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度1.4g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.5。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例44
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)多价研究的血清型33F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化，以降低Ps的分子质量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为510巴/5次。
将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度2.5g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为1.75。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。添加氰基硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在22℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例45
使用水性缀合制备用于PCV22和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型33F缀合物
将多糖溶解，减小尺寸，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后，在反应混合物中利用氯化镍使纯化的CRM197缀合至活化多糖，以及在最终0.2微米过滤前通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖尺寸减小和氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶解在水中，并进行0.45微米过滤。将溶解的多糖均质化以降低分子量。将均质化压力和通过均质器的次数控制为350巴/4次，以将尺寸减小至目标分子质量。然后，将尺寸减小的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将氧化的多糖溶液与水和1.5M磷酸钾(pH 7.0)混合。选择缓冲液pH，以在缀合反应期间改善活化多糖的稳定性。将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197以0.2微米过滤，并与缓冲的多糖溶液以多糖与CRM197质量比0.7进行组合。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。多糖和磷酸盐的浓度分别为6.5g/L和100mM。选择多糖浓度以控制所得缀合物的尺寸。然后将溶液以0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍添加至约2mM。添加氰基硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)。缀合进行96小时，以使得多糖和蛋白的消耗最大化。
使用硼氢化钠还原
缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将批料在2-8℃下用100mM磷酸钾(pH 7.0)进行渗滤。随后，将渗余物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过添加1.2M碳酸氢钠(pH 9.4)调节pH。添加硼氢化钠(1摩尔/摩尔多糖重复单元)。随后添加1.5M磷酸钾(pH 6.0)。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)进行渗滤。将批料以0.2微米过滤，并用另外的含10mM L-组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)缓冲液调节至多糖浓度为1.0g/L。将批料分配成等分试样，并在≤-60℃下冷冻。
实施例46
使用DMSO缀合制备用于PCV23(DMSO)和PCV23(DMSO+Aq)多价研究的血清型35B缀合物
将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液外加氯化钠至终浓度为20mM。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度6.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为3.0。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。在34℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在34℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例47
使用DMSO缀合制备用于PCV22多价研究的血清型35B缀合物
将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。控制每个步骤中的多个过程参数，如pH、温度、浓度和时间，以产生具有期望属性的缀合物。
多糖氧化
将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶解在水中，并以0.45微米过滤。将溶解的多糖浓缩，并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜使用水进行渗滤。
然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至22℃和pH 5，以最小化由于活化引起的多糖尺寸减小。添加100mM偏过碘酸钠溶液来引发多糖活化。氧化反应在22℃下进行2小时。
使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将活化的产物用10mM磷酸钾(pH 6.4)进行渗滤，然后用水进行渗滤。超滤在2-8℃下进行。
多糖缀合至CRM197
将如前所述(WO 2012/173876A1)通过在荧光假单胞菌中表达而获得的纯化CRM197使用5kDa NMWCO切向流超滤膜用2mM磷酸盐(pH 7.2)缓冲液进行渗滤，并进行0.2微米过滤。
以6mg Ps/mL、蔗糖浓度5％w/v配制活化多糖用于冻干。以6mg Pr/mL、蔗糖浓度为1％w/v配制CRM197用于冻干。
将配制的Ps和CRM197溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM197物质分别再溶解在等体积的DMSO中。将多糖溶液外加氯化钠至终浓度20mM。将多糖与CRM197溶液掺合，以得到多糖浓度6.0g Ps/L以及多糖与CRM197质量比为3.0。选择此质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM197的比率。在34℃下进行缀合。
使用硼氢化钠还原
在缀合反应后添加硼氢化钠(2摩尔/摩尔多糖重复单元)，并在34℃下孵育1小时。在约4℃下，将批料稀释至150mM氯化钠和约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20中。然后，添加磷酸钾缓冲液来中和pH。将批料浓缩，并在约4℃下使用30kD NMWCO切向流超滤膜使用150mM氯化钠、25mM磷酸钾(pH 7)进行渗滤。
最终过滤和产品贮存
然后，将批料浓缩，并在4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜用含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20进行渗滤。
将渗余物批料以0.2微米过滤(使用0.5微米预过滤器)，然后用另外的含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH 7.0)和0.015％(w/v)聚山梨醇酯20稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。
实施例Y
使用DMSO缀合制备用于PCV24多价研究的血清型
使用与此前实施例中描述的方法类似的方法制备用于PCV24研究的缀合物。对于每种血清型，将多糖溶解，以化学方式活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化多糖和纯化的CRM197分别冻干并重新溶解在DMSO中。然后如下文所述，将重新溶解的多糖与CRM197溶液组合并缀合。在最终0.2微米过滤前，通过超滤纯化所得缀合物。
控制各步骤内的多个工艺参数，如pH、温度、浓度和时间，以得到具有所需属性的缀合物。与此前实施例的差异可以包括：均质化压力和通过次数、氧化时间、用于冻干的多糖和蔗糖浓度、缀合期间的多糖浓度、多糖与CRM197质量比以及缀合反应中的盐浓度。
实施例48
肺炎球菌缀合物疫苗的制剂
将利用如上文实施例中所述的不同化学物质制备的个体肺炎球菌多糖-蛋白缀合物用于配制8-、15-、22-、23-和24-价肺炎球菌缀合物疫苗。
PCV8/APA疫苗药品通过使用在非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-23B、-24F和-35B)制备，以及在20mM L-组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl 0.1％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)和呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL(作为佐剂)中配制，每种多糖血清型为4μg/mL，总多糖浓度为32μg/mL。
PCV15/APA疫苗药品通过使用在非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-6A、-6B、-7F、-9V、-18C、-19A、-19F、-23F)制备，以及对于-1、-3、-4、-5、-14、-22F和-33F型使用在质子性溶剂(也称为水性化学反应)中的还原胺化，以及在20mM L-组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl 0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)和呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL(作为佐剂)中配制，每种多糖血清型为4μg/mL(除了6B为8μg/mL)，总多糖浓度为64μg/mL。
用于免疫小鼠和家兔的PCV22疫苗药品通过使用在质子和非质子性溶剂(DMSO/水性“Aq”)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-9V、-10A、-12F,-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B)制备，以及在20mM L-组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl和0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中配制，每种多糖血清型为0.8μg/mL(除了6B为1.6μg/mL)，总多糖浓度为18.4μg/mL，称为PCV22无佐剂或无佐剂(unadj)。在另一个特定实施方式中，使用呈磷酸铝佐剂形式的50μg[Al]/mL(作为佐剂)制备制剂，称为PCV22/APA。
PCV23疫苗药品通过使用在非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B)制备，以及在20mM L-组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl和0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中配制，每种多糖血清型为4μg/mL，总多糖浓度为92μg/mL，称为PCV23无佐剂。在另一个特定实施方式中，用呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL(作为佐剂)制备制剂，称为PCV23/APA。在另一个实施方式中，PCV23疫苗药品通过使用在质子性溶剂(亦称为水性化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-1、-3、-4、-5、-9V、-14、-22F和-33F)以及使用在非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)型(-6A、-6B、-7F、-8、-10A、-12F、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-23B、-23F、-24F和-35B)制备。疫苗药品在20mM L-组氨酸(pH 5.8)和150mM NaCl和0.1％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)和0.01％羧甲基纤维素(CMC)中配制，每种多糖血清型为4μg/mL(除了6B为8μg/mL)，总多糖浓度为96μg/mL，以及用呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL(作为佐剂)制备，称为PCV23(DMSO+Aq)/APA。
多价免疫原性组合物PCV24通过使用在非质子性溶剂(亦称为DMSO化学反应)中的还原胺化将CRM197蛋白分别缀合至肺炎球菌多糖(PnPs)血清型-1、-3、-4、-5、-6A、-6B、-7F、-8、-9V、-10A、-11A、-12F、-14、-15A、-15C、-18C、-19A、-19F、-22F、-23B、-23F、-24F、-33F和-35B制备，以及在20mM L-组氨酸(pH5.8)、150mM NaCl和0.1％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中配制，每种多糖血清型为4μg/mL或8μg/mL，总多糖浓度分别为96μg/mL或192μg/mL，以及称为“PCV24无佐剂”。在另一个特定实施方式中，在20mM L-组氨酸pH 5.8、150mMNaCl和0.2％w/v聚山梨醇酯-20(PS-20)中制备多价免疫原性组合物PCV24，每种多糖血清型为4μg/mL，总多糖浓度为96μg/mL，其还包含呈磷酸铝佐剂形式的250μg[Al]/mL。将其称为“PCV24/APA”。
获得单个血清型的目标浓度所需的散装(bulk)缀合物的所需体积基于批料体积和单个散装多糖浓度的浓度计算。将单独的缀合物添加到组氨酸、氯化钠和聚山梨醇酯-20(PS-20)的溶液中以产生2X-4X缀合物混合物。使用磁力搅拌棒混合含有缀合物混合物的制剂容器，无菌过滤到另一个容器中。将无菌过滤的2x-4x混合物添加到另一个含有磷酸铝佐剂的容器中，或用盐水稀释以达到所需的目标总多糖、赋形剂和APA佐剂(如果需要)浓度。然后，将制剂灌装到玻璃药瓶或注射中，并在2-8℃下贮存。
实施例49
PCV22在小鼠中的免疫原性和功能性抗体
在第0天、第14天和第28天，使用0.1mL的22价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV22/APA或PCV22无佐剂)免疫雌性幼Balb/c小鼠(6-8周龄，n＝10只/组)。每次免疫接种时，PCV22的剂量为每种肺炎球菌多糖(1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B)0.08μg和6B为0.16μg，并且所有均缀合至CRM197无佐剂，或使用5μg磷酸铝佐剂(APA)。由经过培训的动物护理人员至少每天观察小鼠是否有任何疾病或痛苦的迹象。疫苗制剂在小鼠中被认为是安全且耐受性良好的，因为没有发现与疫苗相关的不良反应。在第52天，小鼠用肺炎链球菌血清型24F进行气管内攻击。将肺炎链球菌的指数期培养物离心、洗涤并混悬在无菌PBS中。在攻击前，用异氟烷麻醉小鼠。将含105cfu肺炎链球菌的0.1mL PBS放入由门牙直立悬挂的小鼠的喉咙中。轻柔地向外拉动舌头和并覆盖鼻孔来诱导细菌的吸入。每天对小鼠进行称重，以及如果体重减轻超过初始体重的20％，则将小鼠安乐死。24小时、48小时和72小时时收集血液，以评估菌血症。由经过培训的动物护理人员至少每天两次观察小鼠是否有任何疾病或痛苦迹象。所有动物实验均严格遵照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animalsof the National Institutes of Health)中的建议进行。由机构动物护理和使用委员会(Merck&Co.,Inc)批准小鼠实验方案。
使用多重电化学发光(ECL)测定法评估小鼠血清的IgG免疫原性。基于Marchese等[3]所述的人类测定研发了将该测定用于小鼠血清，使用由MesoScale Discovery(MesoScale Diagnostics子公司，LLC,Gaithersburg,MD)开发的技术，其利用电化学刺激时发光的SULFO-TAGTM标记。使用SULFO-TAGTM标记的抗小鼠IgG作为二抗来检测小鼠血清样品。基于此前在www.vaccine.uab.edu所述方案和由阿拉巴马大学(UAB)研究基金会拥有且许可的
Figure BDA0003213826260001411
3软件[1,2]，通过多重调理吞噬作用测定(MOPA)确定功能性抗体。
将各组小鼠血清合并，并在多重电化学发光测定中进行检测，以确定抗体效价。用疫苗免疫接种1、2和3次后，PCV22在小鼠中对所有血清型均产生了抗体效价(图1)。如通过IgG效价所证实的，PCV22显示出与血清型15B的交叉反应性(图1)。与无佐剂的PCV22相比，在PD2(数据未显示)和PD3(图2)时，在小鼠中用APA配制的PCV22具有更高的免疫原性。
将各组小鼠血清合并，并在多重调理吞噬作用测定(MOPA)中进行检测，以确定功能性抗体效价。用疫苗免疫接种3次后，PCV22在杀死疫苗型细菌血清型小鼠中产生了功能性抗体效价(图3)。与无佐剂的PCV22相比，在PD2(数据未显示)和PD3(图4)时，用APA配制的PCV22具有更高的功能性抗体效价，与IgG效价相似(图2)。
PCV22免疫的小鼠被保护而免受肺炎链球菌24F的气管内攻击(图5)。Mantel Cox对数秩检验表明，与天然组(数据未显示)相比，PCV22无佐剂(PCV无佐剂)和PCV22/APA组均受到显著保护，而免受攻击(P<0.0001)。同样，两个PCV22免疫小鼠组几乎没有菌血症，其与天然组(数据未显示)相比显著减少。
实施例50
PCV22在家兔中的免疫原性和功能性抗体
在第0天和第14天(对侧)，使用0.1mL的22价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV22/APA或PCV22无佐剂)肌内(IM)免疫成年新西兰白兔(NZWR，n＝5只/组)。每次免疫接种时，PCV22的剂量为每种肺炎球菌多糖(1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B)0.08μg和6B为0.16μg，并且所有均缀合至CRM197，无佐剂或使用5μgAPA制剂。在研究开始前(免疫前)以及在第14天(PD1)和第28天(PD2)时收集血清。由经过培训的动物护理人员至少每天观察NZWR是否有任何疾病或痛苦的迹象。疫苗制剂在NZWR中被认为是安全且耐受性良好的，因为没有发现与疫苗相关的不良事件。所有动物实验均严格遵照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(Guide for Care and Use ofLaboratory Animals of the National Institutes of Health)中的建议进行。由机构动物护理和使用委员会(Merck&Co.,Inc和Covance(Denver,PA))批准NZWR实验方案。
使用多重电化学发光(ECL)测定评价家兔血清的IgG免疫原性。基于Marchese等[3]所述的人类测定研发了将该测定用于家兔血清，使用由MesoScale Discovery(MesoScaleDiagnostics子公司，LLC,Gaithersburg,MD)开发的技术，其利用电化学刺激时发光的SULFO-TAGTM标记。使用SULFO-TAGTM标记的抗家兔IgG作为二抗来检测NZWR血清样品。基于此前在www.vaccine.uab.edu所述方案和由阿拉巴马大学(UAB)研究基金会拥有且许可的
Figure BDA0003213826260001421
3软件[1,2]，通过多重调理吞噬作用测定(MOPA)确定功能性抗体。
在多重电化学发光测定中单独检测家兔血清，以确定抗体效价。接种疫苗后，针对所有血清型在家兔内PCV22均产生抗体效价(图6)。使用PCV22免疫接种家兔还产生结合至血清型15B多糖的抗体(图6)。在家兔中APA与PCV22结合无任何获益，因为在PD2时免疫原性与(血清型1)PCV22无佐剂相当或更低(图7)。
在多重调理吞噬作用测定(MOPA)中分别对家兔血清进行了检测，以确定功能性抗体效价。使用疫苗免疫2次后，PCV22在杀死疫苗型细菌性血清型家兔中产生了功能性抗体效价(图8)。与用APA制剂的PCV22相比，在PD1时PCV22无佐剂针对血清型4的功能性抗体效价更高(数据未显示)，以及在PD2时，血清型1、3和4更高。与PCV22无佐剂相比，在PD1(数据未显示)和PD2时，用APA制剂的PCV22针对大多数血清型不具有更高的功能性抗体效价(图8)。
实施例51
PCV23在婴儿恒河猴中的免疫原性
在第0天、第28天和第56天，使用0.1mL的23价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV23)肌内免疫婴儿恒河猴(IRM，2-3月龄，n＝8-9只/组)。每次免疫接种时，将PCV23以9.6μg总肺炎球菌多糖(1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B为0.4μg，6B为0.8μg，且所有均缀合至CRM197)给药，其是无佐剂的或使用25μg磷酸铝佐剂(APA)配制。将另一组IRM用0.1mL PCV15肌内免疫。按照与上述相同的时间表，在一个股四头肌中，将PCV15以6.4μg总肺炎球菌多糖(每次免疫接种，1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F为0.4μg，6B为0.8μg，且所有均缀合至CRM197，使用25μg APA)给药，在另一个股四头肌中，将0.1mL PCV8(每次免疫接种，8、10A、12F、15A、15C、23B、24F和35B为0.4μg，且所有均缀合至CRM197，使用25μg APA)给药。在研究开始前(免疫前，第0天)以及在第14天(PD1)、第28天、第42天(PD2)、第56天和第70天(PD3)时收集血清。由经过培训的动物护理人员至少每天观察IRM是否有任何疾病或痛苦的迹象。所有动物实验均严格遵照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(Guide for Care and Use of LaboratoryAnimals of the National Institutes of Health)中的建议进行。由机构动物护理和使用委员会(Merck&Co.,Inc和New Iberia Research Center)批准实验方案。
使用多重电化学发光(ECL)测定评价恒河猴血清的IgG免疫原性。基于Marchese等和Skinner等[3,4]所述的人类测定研发了将该测定用于恒河猴血清，使用由MesoScaleDiscovery(MesoScale Diagnostics子公司，LLC,Gaithersburg,MD)开发的技术，其利用电化学刺激时发光的SULFO-TAGTM标记。使用SULFO-TAGTM标记的抗人IgG作为二抗来检测恒河猴血清样品。
对于所有评价的PCV23疫苗制剂，将IRM用PCV23免疫接种产生了针对所有血清型的抗体效价(图9A-9D)。还注意到，如在ECL中所证实的，含有多糖缀合物15A-CRM197和15C-CRM197的PCV23还提供了与15B的交叉反应性(图9A-9D)。在IRM中使用1剂疫苗的PCV23具有免疫原性(图9A-9D)。
在PD1时，与PCV23无佐剂相比，PCV23(DMSO)/APA制剂针对血清型22F具有更高的免疫原性，而在PD1时，与PCV23无佐剂相比，PCV23(DMSO+Aq)/APA针对血清型1和血清型15C具有更高的免疫原性(图10A)。在PD2时，与PCV23无佐剂相比，PCV23(DMSO)/APA制剂针对血清型18C具有更的免疫原性(图10B)。在PD2时，与PCV23无佐剂相比，PCV23(DMSO+Aq)/APA针对血清型(1、3、4、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、15C、18C、19F、22F和23F)具有更高的免疫原性(图10B)。在PD3时，与PCV23无佐剂相比，PCV23(DMSO+Aq)/APA针对血清型1、4和9V具有更高的免疫原性(图10C)。
在不同肢体中接种PCV23(DMSO+Aq)/APA或共同施用PCV15/APA+PCV8/APA的IRM在PD1时未显示出很多免疫原性差异，但血清型10A除外，其在共同施用组中具有更高的免疫原性(图11A)。然而，与共同施用PCV15/APA+PCV8/APA相比，在PD2时接种PCV23(DMSO+Aq)/APA的IRM针对大部分血清型1、3、4、5、7F、8、9V、14、15A、15B、15C、18C、19F、22F、23B和23F的免疫原性更高(图11B)。在PD3时两种疫苗之间不存在免疫原性差异(图11C)。
当评价抗体强化作用时，针对所有血清型与免疫前的血清相比，在PD1时所有PCV产生了初始免疫应答，但用PCV23(DMSO+Aq)/APA免疫的IRM的血清型23B除外(图12A)。针对所有血清型与免疫前的血清相比，在PD2和PD3时所有评价的PCV产生了显著较高的抗体效价(图12B和图12C)。针对所有血清型与PD1相比，第2剂PCV增加了PD2的抗体效价，但在使用PCV23无佐剂、PCV23(DMSO)/APA和PCV15/APA+PCV8/APA免疫的IRM中的血清型3和血清型1除外(图12D)。第3剂PCV强化了大部分血清型的抗体效价，但在使用PCV23(DMSO+Aq)/APA免疫的IRM除外(PD3时与PD2时相比降低)，表明在PD2时PCV23(DMSO+Aq)/APA免疫的IRM达到最大抗体应答(图12E)。
实施例Z PCV24在新西兰白兔和婴儿恒河猴中的免疫原性
在第0天和第14天，使用0.1mL的24价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV24)肌内免疫新西兰白兔(NZWR，n＝8只/组)。每次免疫接种时，将PCV24以9.6μg总肺炎球菌多糖(1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B为0.4μg，且均缀合至CRM197)给药，其使用磷酸铝佐剂(APA，25μg)配制。在研究开始前(免疫前，第0天)以及第14天(PD1)和第28天(PD2)时收集血清。由经过培训的动物护理人员至少每天观察NZWR是否有任何疾病或痛苦的迹象。
在第0天、第28天和第56天，使用0.1mL的24价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV24)肌内免疫婴儿恒河猴(IRM，2-3月龄，n＝5只/组)。每次免疫接种时，将PCV24以9.6μg总肺炎球菌多糖(1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、deOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B为0.4μg，且均缀合至CRM197)给药，其使用磷酸铝佐剂(APA，25μg)配制。在研究开始前(免疫前，第0天)以及第14天(PD1)、第28天、第42天(PD2)和第70天(PD3)时收集血清。由经过培训的动物护理人员至少每天观察IRM是否有任何疾病或痛苦的迹象。所有动物实验均严格遵照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(Guide for Care andUse of Laboratory Animals of the National Institutes of Health)中的建议进行。由机构动物护理和使用委员会(Merck&Co.,Inc和New Iberia Research Center)批准实验方案。
使用多重电化学发光(ECL)测定评价恒河猴血清的IgG免疫原性。基于Marchese等和Skinner等[3,4]所述的人类测定研发了将该测定用于恒河猴血清，使用由MesoScaleDiscovery(MesoScale Diagnostics子公司，LLC,Gaithersburg,MD)开发的技术，其利用电化学刺激时发光的SULFO-TAGTM标记。使用SULFO-TAGTM标记的抗人IgG作为二抗来检测恒河猴血清样品和使用SULFO-TAGTM标记的抗家兔IgG来检测新西兰白兔样品。
基于此前在www.vaccine.uab.edu所述方案和由阿拉巴马大学(UAB)研究基金会拥有且许可的
Figure BDA0003213826260001461
3软件[1,2]，通过多重调理吞噬作用测定(MOPA)确定功能性抗体。
将NZWR用PCV24免疫在疫苗中产生了针对所有血清型的抗体效价(图13A)。还注意到，如在ECL中所证实的，含有多糖缀合物15A-CRM197、deOAc15B-CRM197、6A-CRM197、6B-CRM197的PCV24还提供了与15B和6C的交叉反应性(图13A)。
在多重调理吞噬作用测定(MOPA)中分别对NZWR血清进行了检测，以确定功能性抗体效价。PCV24在杀死所有疫苗型细菌血清型NZWR中产生了功能性抗体效价(图13B)。
将IRM用PCV24免疫在疫苗中产生了针对所有血清型的抗体效价(图14A)。还注意到，如在ECL中所证实的，含有多糖缀合物15A-CRM197、deOAc15B-CRM197、6A-CRM197、6B-CRM197的PCV24还提供了与15B和6C的交叉反应性(图14A)。
在多重调理吞噬作用测定(MOPA)中分别检测了IRM血清，以确定功能性抗体效价。PCV24在杀死疫苗型细菌性血清型IRM中产生了功能性抗体效价(图14B)，但33F除外，其在ECL中亦具有较低的PD3/预结合抗体效价。然而，当在新西兰白兔中评价PCV24/APA时，PD233F OPA效价比免疫前效价高58倍以上(图13B)。
参考文献
1.Caro-Aguilar I,Indrawati L,Kaufhold RM,Gaunt C,Zhang Y,Nawrocki DK等，Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharideconjugate vaccine(PCV15)based on vaccine dose,route of immunization and mousestrain.Vaccine 2017Feb 07；35(6):865-72.
2.Burton RL,Nahm MH.Development and validation of afourfoldmultiplexed opsonization assay(MOPA4)for pneumococcal antibodies.Clin VaccineImmunol 2006Sep；13(9):1004-9.
3.Marchese RD,Puchalski D,Miller P,Antonello J,Hammond O,Green T,Rubinstein LJ,Caulfield MJ,Sikkema D.Optimization and validation of amultiplex,electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitationof immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in humanserum.Clin Vaccine Immunol.2009Mar；16(3):387-96.
4.Skinner,J.M.,等，Pre-clinical evaluation of a 15-valent pneumococcalconjugate vaccine(PCV15-CRM197)in an infant-rhesus monkey immunogenicitymodel.Vaccine,2011.29(48):p.8870-8876.
实施例52
材料和方法
游离多糖的测试
缀合物样品中的游离多糖(即未与CRM197缀合的多糖)是通过首先将游离蛋白和缀合物与脱氧胆酸盐(DOC)和盐酸沉淀而测定的。然后滤出沉淀物，并通过HPSEC/UV/MALS/RI分析滤液中游离多糖的浓度。游离多糖计算为通过HPSEC/UV/MALS/RI测量的总多糖的百分比。
游离蛋白的测试
通过胶束电动色谱(MEKC)模式下的毛细管电泳分离缀合物样品中的游离多糖、多糖-CRM197缀合物和游离CRM197。简而言之，将样品与含有25mM硼酸盐、100mM SDS，pH 9.3的MEKC运行缓冲液混合，并在预处理的裸露石英毛细管中分离。在200nm处监测分离，并用CRM197标准曲线对游离CRM197进行定量。游离蛋白结果报告为通过HPSEC/UV/MALS/RI方法测定的总蛋白含量的百分比。
使用HPSEC/UV/MALS/RI测定分析缀合物的分子量和浓度
注入缀合物样品，并通过高效体积排阻色谱法(HPSEC)进行分离。检测是通过串联的紫外线(UV)、多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器完成的。使用消光系数由UV280计算蛋白浓度。使用dn/dc因子(这是溶液折射率的变化，溶质浓度的变化以mL/g表示)从RI信号(由蛋白质和多糖共同贡献)中反卷积多糖浓度。样品的平均分子量通过Astra软件(Wyatt Technology Corporation,Santa Barbara,CA)使用整个样品峰上测得的浓度和光散射信息进行计算。多分散分子的分子量平均值有多种形式。例如，数均分子量Mn，重均分子量Mw和z均分子量Mz(Molecules,2015,20,10313-10341)。除非另有说明，否则在整个说明书中使用的术语分子量是重均分子量。
测定缀合蛋白中赖氨酸的消耗，以衡量多糖和载体蛋白之间共价连接的数量
Waters AccQ-Tag氨基酸分析(AAA)用于测量缀合物样品中的缀合程度。在Eldex工作站中使用气相酸水解法水解样品，以将载体蛋白分解成其组分氨基酸。游离氨基酸使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化。然后使用UPLC在C18色谱柱上进行紫外检测，分析衍生样品。使用赖氨酸以外的代表性氨基酸获得平均蛋白质浓度。缀合过程中赖氨酸的消耗量(即，赖氨酸损失)由缀合物中赖氨酸的平均测得量与起始蛋白中预期赖氨酸的量之差确定。
Figure IDA0003213826340000011
Figure IDA0003213826340000021
Figure IDA0003213826340000031

Claims (34)

1.一种多价免疫原性组合物，其包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：
a)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
b)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
c)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
d)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
e)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
f)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、DeOAc15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
g)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
h)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
i)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
j)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
k)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
l)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
m)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
n)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
o)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
p)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
q)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
r)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
s)1、3、4、5、6A、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
t)1、3、4、5、6B、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
u)1、3、4、5、6C、7F、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
v)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
w)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
x)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
y)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
z)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
aa)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B；
bb)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
cc)1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
dd)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ee)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ff)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
gg)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、deO-15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
hh)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ii)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
jj)1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
kk)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ll)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
mm)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
nn)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
oo)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
pp)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
qq)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
rr)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ss)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
tt)1、3、4、5、6A、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
uu)1、3、4、5、6B、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
vv)1、3、4、5、6C、7F、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
ww)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
xx)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
yy)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
zz)1、3、4、5、6A、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；
aaa)1、3、4、5、6B、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39；和
bbb)1、3、4、5、6C、7F、8、9V、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F、35B和39。
2.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不包含具有来自任何其他肺炎链球菌血清型的多糖的多糖蛋白缀合物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多价免疫原性组合物，其中至少一种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的多价免疫原性组合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的多价免疫原性组合物，其中所述非质子性溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述载体蛋白选自以下：外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素、白喉类毒素、蛋白D和CRM197。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM197。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物不包含佐剂。
10.一种用于在人类患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用权利要求1至9中任一项所述的多价免疫原性组合物。
11.一种用于在人类患者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向患者施用权利要求1至9中任一项所述的多价免疫原性组合物。
12.一种在人类患者中诱导针对肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，其包括向患者施用权利要求1至9中任一项所述的多价免疫原性组合物。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述患者此前使用多价肺炎球菌疫苗治疗过。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述患者是6周至17岁的年龄。
15.一种用于在6周至17岁年龄的患者中预防肺炎球菌肺炎和/或侵袭性肺炎球菌疾病的方法，其包括向6周至17岁年龄的患者施用权利要求1的多价免疫原性组合物。
16.一种多价免疫原性组合物，其包含23种不同的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
17.根据权利要求16所述的多价免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不包含具有来自任何其他肺炎链球菌血清型的多糖的多糖蛋白缀合物。
18.根据权利要求16所述的多价免疫原性组合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成，其中所述非质子性溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
19.根据权利要求16所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物包含佐剂。
20.一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
21.根据权利要求20所述的多价免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不包含具有来自任何其他肺炎链球菌血清型的多糖的多糖蛋白缀合物。
22.根据权利要求20所述的多价免疫原性组合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成，其中所述非质子性溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
23.根据权利要求20所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物包含佐剂。
24.一种多价免疫原性组合物，其包含24种不同的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中每种不同的多糖蛋白缀合物包含分别来自肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B的多糖，且其中所述载体蛋白是CRM197。
25.根据权利要求24所述的多价免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物不包含具有来自任何其他肺炎链球菌血清型的多糖的多糖蛋白缀合物。
26.根据权利要求24所述的多价免疫原性组合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成，其中所述非质子性溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
27.根据权利要求24所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物包含佐剂。
28.一种多价免疫原性组合物，其包含至多30种不同的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述至多30种多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15C、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
29.根据权利要求28所述的多价免疫原性组合物，其中所述至多30种多糖蛋白缀合物还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、23A、35F和38。
30.一种多价免疫原性组合物，其包含至多30种不同的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物，其中每种所述缀合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型的多糖，且其中所述至多30种多糖蛋白缀合物包含选自以下的一组肺炎链球菌血清型的多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B。
31.根据权利要求30所述的多价免疫原性组合物，其中所述至多30种多糖蛋白缀合物还包含选自以下的一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的肺炎链球菌血清型：7C、9N、16F、23A、35F和38。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM197。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中每种所述多糖蛋白缀合物由包含非质子性溶剂的缀合反应形成，其中所述非质子性溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的多价免疫原性组合物，其中所述组合物包含佐剂。
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