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CN1133563A - 在免疫和中枢神经系统(cns)治疗中有用的新的三肽 - Google Patents

在免疫和中枢神经系统(cns)治疗中有用的新的三肽 Download PDF

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CN1133563A
CN1133563A CN94193916A CN94193916A CN1133563A CN 1133563 A CN1133563 A CN 1133563A CN 94193916 A CN94193916 A CN 94193916A CN 94193916 A CN94193916 A CN 94193916A CN 1133563 A CN1133563 A CN 1133563A
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G·戈斯坦
P·森巴加默思
J·I·柯尼格
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IMMUNOBIOLOGY RESEARCH INST Inc
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Abstract

本发明提供能调节哺乳类免疫和/或神经系统细胞的功能的一些三肽，包含这些肽的药物成分及其应用方法。

Description

在免疫和中枢神经系统(CNS)治疗中有用的新的三肽
发明领域
本申请主要涉及在免疫和中枢神经系统治疗中有用的肽类的领域，更具体地说是涉及在生物学上有活性的新的肽类。
发明背景
免疫调节蛋白胸腺生成素已从牛和人的胸腺中分离到。另外，模仿胸腺生成素的生物活性的小肽已化学合成。请见，例如，美国专利4,505,853和相应的欧洲(EP)申请号146,266。
有关这样的蛋白和合成的肽现在已经发表有大批文章和专利。美国专利4,190,646号公开了五肽胸腺生成素是胸腺生成素的活性部位并具有精-赖-天冬-缬-酪序列SEQ ID NO：1，以及在这个五肽的氨基末端/或羧基末端被各种基团取代的肽组合物。
已知胸腺生成素是调节胆碱能的神经肌肉传递的[G.Goldstein，和W.W.Hoffman，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，31：453-459(1968)；和G.Goldstein，Nature，247：11-14(1974)]。胸腺生成素，及胸腺生成素受体(TPR)存在于大脑之内，所以胸腺生成素几乎一定涉及到脑的功能。
最近，胸腺生成素已被确定为一种紧张一诱导的改变的拮抗剂，显示紧张-保护的活性[V.Klusa等，Regulatory Peptides，27：355-365(1990)]。
在此领域中仍然需要另外一种作为诊断试剂用的肽，和/或作为治疗剂用的肽，以便在人类和其他哺乳动物中治疗包括那些与年龄和各种身体条件有关的在内的免疫系统的机能不良，以及治疗中枢神经系统功能紊乱用的肽。
发明概要
本发明提供了新的三肽类，它在生物学上是有活性的，在论断学上是有用的并具有治疗免疫紊乱和中枢神经系统紊乱的用途。这些肽类特别稳定并易被吸收，因此通过口服途径用药仍是有效的。
因此，本发明一方面提供新的R-X-Y-Z-R1通式的肽类，式中R，X，Y，Z和R1在下面详细叙述中加以限定。这些肽类具有调节免疫和/或中枢神经系统的用途。
本发明另一方面提供通过液相合成，固相合成或酶合成制备上述的肽的方法。
本发明还有一方面提供了药剂的组合物，该组合物包括一种或多种上述已鉴定的肽，连同一种在药剂上可接受的载体。
本发明的另一方面，提供了对涉及免疫系统的各种混乱和缺失的治疗方法，特别是由于衰老引起的胸腺逐渐萎缩。本发明还提供对中枢神经系统的紊乱，包括精神病学的紊乱，例如焦虑症和抑郁症的治疗方法以及对慢性感染，免疫缺陷和紧张的治疗方法。这些方法包括对患者施用有效剂量的本发明的一种药剂组合物。本发明的优点和其他方面公开在包含本发明的优选实施方案的实施例详细描述中。
附图简述
图1.是一张说明在大鼠(Y坐标)中胰岛素一诱导的低血糖对血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度(pg/ml)的影响图。X坐标是表示腹膜内施用胰岛素的剂量(IU/kg)。
图2.是一张说明本发明的一个肽乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基对胰岛素-诱导的ACTH分泌的影响图，特别将口服剂量(圆圈表示)对皮下注射剂量(三角形表示)作为比较。Y坐标是在血浆中胰岛素诱导的ACTH(pg/ml)，X坐标是肽的剂量(mg/kg)。
图3.是一张说明服用乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁酰胺(IRI695)的大鼠以在例11中所叙述的焦虑症的兴奋的阳性迷宫(Elevated Plus Maze)试验作可评定标准，对群居性紧张而生的行动反应下降图。Y坐标是面对张开臂度过时间的百分率，X坐标是在有与没有紧张和有与没有肽的预处理条件下的各组受试大鼠。
图4.像所报告的那样，在大鼠中(每个时间点N＝4只大鼠)经过一次单一的口服药物后，以肽的血浆中平均(±S.D)浓度描绘乙酰基-精-脯-天冬-异丁酰胺在大鼠中的药物动力学图。Y坐标是肽以ng/ml所表示的浓度，X坐标是经过一剂后以分钟所表示的时间。所报告的剂量是5mg/kg(空的圆圈)，50mg/kg(空的三角形)和300mg/kg(空的正方形)。
发明的详述
本发明提供了一种通式为R-X-Y-Z-NHR1的肽。式中R是H，一个较低级的烷基，或一个较低级链烯基。X是L型或D型的精氨酸(Arg)或脱氨基精氨酸。Y是一种D型或L型脯氨酸，脱氢脯氨酸或羟基脯氨酸。Z是一个D型或L型的一个氨基酸，这一个氨基酸选自丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，β-天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸；以及R1是一个选自具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基或链烯基，它可任选由一芳基或取代芳基或3-7碳原子的环亚甲基所取代，取代芳基上的取代基或为卤素，或为具有1至6个碳原子的烷基或链烯基。
令人惊奇的是，发明者们已发现这些含有代替的酰胺基团的三肽其性能表现类似于4个或5个长的胸腺生成素肽类似物。因此，本发明的三肽类能够调节和影响哺乳动物的免疫系统。他们也可能调节中枢神经系统。
特别优选的是下列的肽类：
乙酰基-精-脯-天冬-异丁酰胺
乙酰基-精-脯-苏-异丁酰胺
乙酰基-精-脯-丝-异丁酰胺
乙酰基-精-脯-缬-异丁酰胺
己酰-精-脯-天冬-异丁酰胺
精-脯-天冬-甲酰胺
精-脯-谷-异丙酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-甲酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-异丙酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-苯乙基酰胺
甲酰基-精-脯-天冬-甲酰胺
己酰-精-脯-天冬-甲酰胺，以及
脱氨-精-脯-天冬-异丁酰胺
贯穿这个公开内容，组成肽的氨基酸和在他们的制备中所用的一定材料都为方便用缩写而被认知。氨基酸大多以三个字母缩写已为大家所熟知。这里要规定的是，一个较低级烷基被规定为一个具有1到10个碳原子(C1-C10)的烷基，也就是一个通式为CnH2n+1的化合物，式中n为1到10之间的整数。类似地，一个较低级链烯基这里被规定为一个具有1到10个碳原子之间的链烯基，也就是通式为
Figure A9419391600111
的化合物，式中n是0到9之间的整数。
本发明的肽类一般可用下面已知的技术制备。合适的话，本发明的多肽的合成产物也可以按照Merrifield在J.A.C.S，85：2149-2154(1963)中所叙述的固相合成法制备。这个技术是众所了解的并且也是一个肽类制备的普通方法。固相合成法包括把保护完全的氨基酸逐步加入到以共价键与固体树脂颗粒相联结的一个增长的肽链上。采用这种方法，试剂和副产物可用过滤法除掉，因此，消除了纯化中间产物的必需性。这个方法的总的概念是依据链的第一个氨基酸以共价键与一个固体多聚物的联结而来的。接着把保护完全的氨基酸加入，一次加一个(逐步策略)或以一个组加入(片段策略)，直到期望的序列被安装好。最后，有保护的肽从固体树脂支持体上脱下，并把保护基团除去。
所述氨基酸可与任何合适的多聚体如一个树脂连接起来。但树脂必须含有一个功能基团，以使第一个保护完全的氨基酸能与此功能基团通过一个共价键牢固地联结。适用于这个目的有各种多聚物，例如纤维素，聚乙烯醇，聚甲基异丁烯酸和聚苯乙烯。适用的树脂能从商业上得到，并为本领域中那些技术人员所熟知。可用于这样合成中的合适保护基团包括叔-丁基氧碳酰(Boc)，苯甲基(Bzl)，叔-戊基氧碳酰(Aoc)，甲苯磺酰基(Tos)，磷(位)-溴苯甲氧碳酰(Brz)，2，6-二氧苄(BzlCl2)，和苯甲氧碳酰(Z或CBZ)。另外的保护基在上面引用的Merrifield，以及在J.F.W.McOmie，“有机化学中的保护基”，plenum出版社，纽约，1973，被认知。这些问题的二方面文本在这里都被编入参考文献中。
本发明的肽制备的一般方法包括开始时把保护完全的羧基末端的氨基酸连接到树脂上。连接以后，过滤树脂，清洗并把在羧基末端的氨基酸的α-氨基上的保护基(最好是叔丁基氧碳酰)除去。这个保护基的除去必须发生，当然，不能使氨基酸与树脂间的链断裂。把第二个氨基，必要时，把侧链被保护的氨基酸，当时就连接到树脂上氨基酸的自由α-氨基上。通过连接在树脂上第一个氨基酸的氨基与第二个氨基酸的自由羧基间以酰胺键的形成发生这种连接。继续地用氨基酸重复这个一连串事件直到所有的氨基酸都被连接到树脂上。最后，被保护的肽从树脂上裂开，并除去保护基团以显露期望的肽。常用于从树脂上分离开肽的裂开技术和除去保护基团的技术取决于选用的树脂和保护基团而定，并为那些精通肽合成领域的人们所通晓。
在Bodanszky等的“肽的合成，第二版(John Wiley和Son：1976)中叙述了另一种肽合成的技术。例如，采用标准的液态肽合成方法学，包括采用形成酰胺键的化学法和酶法，用逐个，或用一组氨基酸或肽片段连接，也可以合成本发明的肽类。[请见，例如，H.D.Jakubke，肽类，分析，合成，生物学科学出版社，(纽约，1987)，p.103-165；J.D.Glass ibid pp.167-184；和欧洲专利0324659A2，酶的肽合成方法]。这些液态合成法为本领域中人们所熟知。
用本领域中那些技术人员所知的其它技术也可以生产这个发明的肽类，例如，遗传工程技术。请见，例如，Sambrook等，分子克隆，一本实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)。
这个发明也公开了这些肽类的酸加成盐或碱加成盐用作诊断试剂和/或治疗剂。能与这些肽形成盐的酸类包括，但不限于，无机酸，例如氢氯酸，氢溴酸，过氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸，磷酸，等等。有机酸也可被用作形成本发明的盐，例如，甲酸，乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，顺式丁烯二酸，延胡索酸，柠檬酸，琥珀酰胺酸，磷氨基苯甲酸，肉桂酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，等等。
与具有酸性部分的那些肽类能够形成盐的碱类的一个并非全部的目录包括无机碱类，像氢氧化钠，氢氧化铵，氢氧化钾，等等。这样用途的有机碱包括，但没有限制到那里，单，二，和三烷基和芳基胺(例如，三乙胺，二异丙基胺，甲胺，二甲胺)以及任意选择之替代物的乙醇胺(例如乙醇胺，二乙醇胺)。
本发明的肽类有足够的生物有效性，可对哺乳动物和人类免疫和/或中枢神经系统具有多种调节效应。明确的说，本发明的肽类具有像在下面例11中所述通过药物动力学研究所指出那样大约有50到100分钟的一个排除半衰期。
这些肽和含有这些肽的组合物意外地显示出对哺乳动物免疫和/或中枢神经系统多种调节效应，例如，这个发明的肽类对自体免疫紊乱以及特征为免疫系统混乱的其他疾患提供了处理治疗。由于受实验的肽类的免疫调节物的特性，所以他们在人类，和有可能在其他动物的治疗方面是治疗上是有用的，因为他们能影响哺乳类的免疫系统中的改变。
本发明的肽类也可以作为有用的焦虑症治疗剂。例如，用本发明一个肽对一个病人进行预治疗，可以降低介导紧张反应的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的水平。此外，用提高正反应迷宫试验测定啮齿类中焦虑症的动物模型，用本发明的肽类对大鼠进行预处理，已经观察到其对群居的紧张状态的行动反应的下降。这个试验在本领域中已被很好建立起来，作为鉴定有潜力的抗焦虑化合物类别的方法，而且已常在大鼠中用作研究对群居的紧张状态的行动反应。[请见Pich，E.M.等，Psychoneuroendocrinology，18：495-507(1993)；Pellow，S.等，J.Neurosci.Neth，14：149-167(1985)]。因此，本发明的肽类，作为抗抑郁治疗是有用的，而且同样，对其他紧张状态引起的紊乱的治疗也是有用的。
同样，按照本发明所说的肽类也可用于减少年龄对免疫系统的影响。当胸腺随着年龄萎缩时，一个胸腺衍生的多肽，胸腺生成素的水平，减少了，因而作为结果，紧张状态诱导的CRF水平，促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质类固醇相应地增加了。因此，服用本发明的肽类，它具有与胸腺生成素相同的生物活性，能帮助减轻涉及免疫系统功能不足或免疫系统没有功能的衰老的作用。
当一个病人在有慢性感染或免疫系统缺陷而服用肽时，这些肽类也能作免疫刺激剂的用途。免疫缺陷可能由于癌或其治疗，包括爱滋病，单纯疱疹性病毒，其他病毒等病毒感染的结果所造成。
此外，在治疗大外科手术中的应激或与其他外伤，例如烧伤相联系的应激，肽是有用的。
本发明还提供了含有上述肽类的一个或多个或其酸或碱加成的盐类的药物组合物。主体肽类或含有肽类或他们的酸或碱的盐类的药物组合物一般认为在对细胞免疫有一个问题时，特别是在免疫上有缺损时是有用的。本发明的药物组合物在调节中枢神经系统的不平衡中也是有用的。
本发明提供了一种对一个治疗对象由于免疫系统和/或中枢神经系统的紊乱而产生疾病的治疗方法，方法包括给所说治疗对象服用这个发明的至少一个肽或药剂组合物的一个治疗上的有效量。这里所用的术语“治疗上的有效量”是指治疗上面所提疾病有效的一个剂量。
为配制本发明的药剂组合物，把这个发明的一个肽在熟悉的掺合物中作为活性组成成分按照常规药剂的合成技术与药剂载体结合。这个载体将随着服用期望的制剂方式，例如，口服，舌下含，直肠，鼻子滴或肠胃道外，可采取多种多样形式。现在，优选的方式是口服。
在制备以优选的口服剂量形式的组合物中可以应用任何常规的药用介质。含有，例如，水，油，酒精，增味剂，防腐剂，染色剂，等等的介质可以用于口服液体制剂(例如悬浮液，酏剂和溶液)。像淀粉，糖，稀释剂，颗粒形成剂，润滑剂，结合剂，分裂剂，等等的载体可以常用以制备口服固体物(例如，粉，胶囊，和片剂)。也可以采用控释形式。由于他们在服用上方便，所以片剂和胶囊是口服剂量单位方式的最具优点的代表，在那种情形中显然是应用了固体的药剂用载体。如果希望的话，采用标准的技术操作，片剂也可包有糖衣的或包有肠溶衣的。
制备不经肠胃道的产品，载体将常包含经灭菌的水，虽然也包括其它重要的组分，例如助溶或防腐目的的组分，也可以制备可注射的悬液，在这样的情况中，也应用适用的液体载体，悬浮剂，等等。
本发明的三肽，当以不经肠胃道地以大约大于0.03mg/kg体重至30mg/kg体重的量给药时，一般都是有效的。一个优选的量大约是在0.3mg/kg。当口服时，本发明的三肽，以约0.5mg/kg体重至约50mg/kg体重之间的剂量一般是有效的。一个优选的剂量约在3mg/kg。这个水平的活性促使这些肽类特别好适应于口服片剂大小的药剂处方。上述剂量以不同周期给人口服也是可能的，例如，从每日用药到一星期至少二次。目前优选的剂量周期是每星期三次。然而，最后，剂量治疗方案将取决于病人的身体体质和被治疗的疾病的持续时间，例如，对病毒病，治疗将根据疾病的时间选择。对慢性的紊乱，例如，紧张病，HIV，等等，外治疗方案将随着病症持续时间而定。
下面提出的实施例解释本发明没有具体明确限定发明到哪里。在实施例中以及整个说明书，大部分都用重量除非另有说明。除了上述的缩写以外，在实施例中都应用下列的缩写。TFA：为三氟乙酸；HOAc为乙酸；CH2Cl2为二氯甲烷；CH3CN为乙腈；DMF为二甲基甲酰胺；NH4OAc为乙酸铵；NH4OH为氢氧化铵；n-PrOH为正-丙醇；n-BuOH为正丁醇；pyr为吡啶；DCC为二环己基碳二亚胺；HOBt为1-羟基苯并三唑；DMAP为二甲基氨吡啶；HF为氟化氢；TCA为三氯醋酸；BHA为二苯甲基胺；p-MBHA为对-甲基二苯甲基胺；DIC为二异丙基碳二亚胺，NMM为正-甲基吗啉以及MeOH为甲醇。其他的标准缩写能通过参考“The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，vol 1和2，由E.Gross和J.Meienhofer编，科学出版社(New York1987)和“IUPAC-IUB生化试剂命名委员会”J.Biol.Chem.245：6489-6497(1970)和J.Biol.Chem.250：3215-3216(1975)等书而认知。
这些实施例叙述了制备本发明的肽类的优选方法。这些实施例只是说明但不限制本发明的范围。实施例1-己酰-精-脯-天冬-NH-异丁基的合成
A.N-异丁基氨甲基树脂的制备
取Mirrifield树脂(20克，Cl/g的1.06mmol)用异丁基氨(200ml)在45℃处理72小时。把三角瓶在旋转蒸发仪于大气压力下通过慢慢旋转而进行搅动，经过72小时后，多余的异丁基胺用过滤除去，并用CH2Cl2(3×100ml)，二甲基甲酰胺(3×100ml)，CH2Cl2(3×100ml)，MeOH(3×100ml)，CH2Cl2(3×100ml)以及无水乙醚(3×100ml)清洗，生成的树脂在减压下进行干燥(20.5克)。
B.己酰-精-脯-天冬-NH-异丁基的固相合成
用固相通过逐步连接的方法合成上面所提及的肽。合成开始用3mmol N-异丁基氨甲基树脂(3g，树脂的1mmol/g)。所有的氨基酸在他们α-氨基都用叔丁基氧碳酰(Boc)保护。精氨酸的侧链胍基用甲苯磺酰基保护。天冬氨酸的侧链羧基团用一个苯甲基(Bzl)保护。所有的连接都用二异丙基碳二亚胺-1羟基苯并三唑方法按着下面所给的方案完成：步骤  试剂                                      时间(分钟)1.    CH2Cl2清洗                             3×1分钟2.    40％三氟乙酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚    1×5分钟3.    40％三氟乙酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚    1×25分钟4.    CH2Cl2清洗                             3×1分钟5.    在CH2Cl2中的10％正-甲基吗啉            2×5分钟6.    CH2Cl2清洗                             3×1分钟7.    二甲基甲酰胺清洗                          2×1分钟8.    叔丁基氧碳酰-氨基酸(9mol)和在             1×3分钟
  二甲基甲酰胺中的1-羟基苯并三唑(3mmol)9.    把二异丙基碳二亚胺(9mmol)加到             1×180分钟
  上述液中并振摇10.   如果需要，通过4-9步重新连接11.   二甲基甲酰胺清洗                          3×1分钟
随着精氨酸的N端的叔丁基氧碳酰(Boc)基的除去与中和，形成的肽-树脂用存在有一羧基苯并三唑(12mmol)和二异丙基碳二亚胺(12mmol)的己烯酸(1.5ml，12mmol)连接。然后把树脂用二甲基甲酰胺(3×50ml)和CH2Cl2(3×50ml)清洗，最后在真空烘箱30℃干燥(4.46g)。
把肽从树脂载体上分二批(2.23g/批)切割下来，用在无水的液体HF(45ml)，对-甲酚(1.4ml)，对-甲苯硫酚(1.4ml)，和二甲基硫醚(1.4ml)中搅动，在0℃一小时，在20℃三小时。在减压下经过除去过剩的HF以后，把树脂-肽混合物用无水二乙基乙醚(3×200ml)提取。弃去乙醚提取液。然后把切割下的肽用30％乙酸(3×100ml)提取。在减压下经过除去溶剂以后，得到的残余物，溶解于水(50ml)中并冷冻干燥(1.1克)。把这个固体溶解于30％醋酸(2×20ml)中并通过一个Amberlite IRA-68(乙酸盐型)离子交换柱(60g，1.6meq/ml，2.73cm(内径)×18cm长)以30％乙酸流速为60ml/hr洗脱。合并恰当的部分并冷冻干燥(930mg)。
用一支Vydac218TP1022柱(22×250mm)通过制备的逆相-高压液相色谱纯化肽粗品。应用的流动相表示如下：
    A＝0.1％三氟乙酸/H2O
    B＝0.1％三氟乙酸/CH3CN-H2O4∶1v/v
采用从5％B到20％B的线性梯度60分钟内以15ml/分的流速。合并有关部分并在减压下除去溶剂。含水的残留物进行冰冻干燥以生成最终产物(515mg)。
在Merck F-254硅板(5×10cm)上以下列溶剂系统(v/v)：
Rf(1)＝0.47(1-BuOH∶HOAc∶H2O，4∶1∶1)
Rf(2)＝0.68(1-BuOH∶HOAc∶EtOAc∶H2O，1∶1∶1∶1)
    Rf(3)＝0.83(1-BuOH∶HOAc∶Pyr∶H2O，5∶4∶4∶2)完成薄层层析(TLC)
氨基酸分析(AAA)：
    精氨酸1.04(1)，脯氨酸1.00(1)，天冬氨酸0.97(1)
液相色谱-质谱分析(LC-MS)：
    [MH+]在m/z＝540a.m.u.(Mol.wt(分子量)539.69)，式中MH+代表一个正电荷质子；m/z是质量/电荷；而a.m.u.为原子量单位。
实施例2-乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基的合成
用实施例1中所述的固相法合成上述乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基。把保护的氨基酸顺次加入到N-异丁基氨甲基树脂(3.4g，3.2mmol)上。在除去精氨酸的N末端Boc基和中和以后，把形成的肽-树脂用在含有4-二甲基氨吡啶(120mg)的CH2Cl2(70ml)中的乙酸酐(8ml)内放30分钟使乙酰化。然后用DMF(3×50ml)和CH2Cl2(3×50ml)清洗树脂，最后在一个真空烘箱中在30℃烘干。
用液体氟化氢把肽从固体载体上切割下来并象实施例1所叙述那样用逆相高压液相层析(RP-HPLC)进行纯化。
薄层层析：Rf(1)＝0.36，Rf(2)＝0.62，Rf(3)＝0.81
氨基酸分析：精0.99(1)，脯0.97(1)，天冬1.05(1)
液相层析-质谱分析：[NH+]在m/z＝484a.m.u(分子量483.57)。
实施例3乙酰基-精氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-NH-异丁基的液相合成
A.叔丁基氧碳酰(Boc)-天冬氨酸-氧苯甲基(OBzl)-NH-异丁基
把N-甲基吗啉(2.2ml，20mmol)和异丁基氯甲酸脂(2.6ml，2ommol)于-15℃加到在乙酸乙酯中的一个Boc-Asp(天冬氨酸)-(OBzl)-OH(6.46g，20mmol)溶液中。在-15℃经过1个10分钟的活化作用时间后加入异丁基氨(2.0ml，20mmol)。反应混合液在-15℃搅动30分钟，然后任其温暖到室温。在室温搅动2小时后，反应混合液用一5％碳酸钠溶液(100ml)骤冷。把清楚分层液转移到分液漏斗中，有机层连续地用5％碳酸钠溶液(2×50ml)，水(3×50ml)，5％柠檬酸(2×50ml)和水(3×50ml)清洗。有机溶液在无水硫酸钠上使干燥并减压浓缩使给出白色固体。产量6.05g(理论值的79.9％)。
B.HCl精(氧苯甲基)-NH-异丁基
把5N HCl-乙酸乙酯(20ml)加到在乙酸乙酯(20ml)中一个BoC-Asp(CBzl)-NH-异丁基溶液中。把溶液搅动40分钟并减压浓缩使给出产物，像一个油状物的HCl·Asp(OBzl)-NH-异丁基。在氢氧化钾小球上把产物真空干燥过夜。
C.Z-精-脯-天冬(氧苯甲基)-NH-异丁基
在0℃把0.5M 1-羧基苯并三唑/二甲基甲酰胺(10ml)和0.5M二环己基碳二亚胺/二氯甲烷(10ml)加到在二甲基甲酰胺(20ml)中的一个Z-精(HCl)-脯-OH(2.21g，5mmol)的溶液中。在0℃经过搅动30分钟后，再把在二甲基甲酰胺(20ml)中的一个HCl天冬(氧苯甲基)-NH-异丁基(1.57g，5mmol)和N-甲基吗啉(1.1ml，10mmol)溶液加入。反应混合液在0℃搅动2小时，在室温搅动过夜。把沉淀的双环己基脲过滤除去，滤液减压浓缩使给出Z-精-脯-天冬(氧苯甲基)-NH-异丁基粗制产品的固体(2.84g，84％)。
D.乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基
把Z-精-脯-天冬(氧苯甲基)-NH-异丁基(2.84g)在乙酸(100ml)中溶解并加入10％钯催化剂(2.7g)。把这个溶液使经受氢气的45个磅/平方英寸绝对压力而使之氢化。反应用薄层层析检查，并经过24小时以后把催化剂过滤除去。减压除去溶剂使给出油样的产物精-脯-天冬-NH-异丁基。把此产物在冰醋酸(10ml)中溶解并用乙酸酐以5份(每份1ml)处理使之乙酰化。在搅拌4小时后反应用加入水(5ml)而被淬火，减压下除去溶剂。残留物在水(40ml)中溶解并冰冻干燥。
肽的粗品用制备用的逆相-高压液相层析法依照实施例1中所叙述的方法进行纯化。产物冻干至恒重(180mg)。
薄层层析：Rf(1)＝0.36，Rf(2)＝0.60，Rf(3)＝0.70
氨基酸分析：精氨酸0.99(1)，脯氨酸1.01(1)，天冬氨酸1.01(1)
液相层析-质谱分析：[NH+]在m/z＝484a.m.u.(分子量483.57)。实施例4乙酰基-精-脯-丝-NH-异丁基的合成
用异丁基胺与叔丁基氧碳酰-丝(氧苯甲基)-OH连接继之按在实施例3A描述的方法制备叔丁基氧碳酰-丝(氧苯甲基)-NH-异丁基。用HCl-乙酸乙酯把其保护基脱去，形成的肽的氢氧酸盐在真空中干燥。
按照在实施例3C中所叙述的方法完成乙酰基-精-脯-OH与HCl·丝(氧苯甲基)-NH-异丁基的连接。保护过的三肽，乙酰基-精-脯-丝(氧苯甲基)-NH-异丁基按照在实施例中3D所叙述的方法，使受催化的氢化作用以除去苯甲基。用逆相高压液相层析把肽的粗品：乙酰基-精-脯-丝-NH-异丁基纯化。
薄层层析：Rf(1)＝0.38，Rf(2)＝0.40，Rf(3)＝0.64
氨基酸分析：精氨酸0.98(1)，脯氨酸1.02(1)，在肽水解条件下，丝氨酸遭受降解因而不能检出。
液相色谱-质谱分析：[MH+]在m/z＝456a.m.u.(分子量(455.56)。
实施例5-乙酰基-精-脯-苏-NH-异丁基的合成
像在实施例4中所叙述那样，用苏氨酸代替第3位置上的丝氨酸合成肽乙酰基-精-脯-苏-NH-异丁基。这个肽的特征如下：
薄层层析：Rf(1)＝0.4.Rf(2)＝0.64，Rf(3)＝0.77
氨基酸分析：精氨酸1.01(1)，脯氨酸0.99(1)，在肽的水解条件下，苏氨酸遭受降解，因而不能被检出。
液相色谱-质谱分析：[MH+]在质量/电荷＝470原子量单位(分子量：469.59)。
实施例6-乙酰基-精-脯-天冬-NH-苯乙基的合成
用苯乙基胺与叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)-OH相连接并按实施例3A中所描述的方法制备叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)-NH-苯乙基。用4N HCl-二噁烷脱去这个肽的保护基并把此肽形成的氢氯酸盐在NaOH球状物中真空干燥过夜。
把乙酰基-精-脯-OH与HCl-天冬(氧苯甲基)-NH-苯乙基，按照实施例3C所描述的方法完成连接。被保护的三肽，乙酰基-精-脯-天冬(氧苯甲基)-NH-苯乙基使经受催化的氢化作用，按实施例3D所述的方法脱去苯甲基基团。粗品肽，乙酰基-精-脯-天冬-NH-苯乙基用逆相高压液相色谱法纯化。
薄层层析：Rf(1)＝0.32，Rf(2)＝0.60，Rf(3)＝0.75
氨基酸分析：精氨酸0.98(1)，脯氨酸1.01(1)，天冬氨酸
             1.02(1)
液相色谱-质谱分析：
    [MH+]在m/z＝532a.m.u.(分子量：531.62)。
实施例7-乙酰基-精-脯-缬-NH-异丁基的合成
用固相方法合成乙酰基-精-脯-缬-NH-异丁基，该法如在实施例1B所述那样，包括把保护的氨基酸逐个加到一个增长的并以共价键与一个固体树脂颗粒相连接的肽链上。
合成用4.5mmol N-异丁基氨甲基树脂(4.5g，1mmol/g树脂)开始。所有氨基酸都在它们的α-氨基基团上用一个叔丁基氧碳酰基团保护。用α-氯苯甲氧碳酰基团去保护精氨酸的ε-胺侧链。用二异丙基碳化二亚胺-1羟基苯并三唑方法并按照下列的方案完成连接。步骤  试剂                                       时间(分钟)1.    CH2Cl2清洗                              3×1分钟2.    40％三氟醋酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚     1×5分钟3.    40％三氟醋酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚     1×25分钟4.    CH2Cl2清洗                              3×1分钟5.    在CH2Cl2中的10％ N-甲基吗啉             2×5分钟6.    CH2Cl2清洗                              3×1分钟7.    二甲基甲酰胺清洗                           2×1分钟8.    叔丁基氧碳酰-氨基酸(13.5mmol)和在          1×3分钟
  二甲基甲酰胺中的1-羟基苯并三唑(13.5mmol)9.    把二异丙基碳化二亚胺(13.5mmol)             1×180分钟
  加到上述液中并振摇10.    如果需要，重复4-9步重新连接11.    二甲基甲酰胺清洗                             3×1分钟
在精氨酸N末端叔丁基氧碳酰除去后和经过中和作用之后，形成的肽-树脂用在含有4-二甲基氨吡啶(120mg)的二氧甲烷(70ml)中的乙酸酐(10ml)处理30分钟使之乙酰化。然后，树脂用二甲基甲酰胺(3×50ml)和二氯甲烷(3×50ml)清洗，最后在一真空烘箱30C中干燥(6.8g)。
这个被保护的肽-树脂，在存在有对-甲酚，对-硫甲酚和二甲硫作为净化剂条件下用液体氟化氢处理，并一直搅拌，在0℃1小时，在20℃3小时。多余的氟化氢用真空去除，残留物用乙醚处理以除去净化剂产物。肽用30％乙酸(3×50ml)提取，溶剂在真空中蒸发并把产物冻干(1.05g)。
粗品肽开始在Amberlite IRA-68离子-交换柱上纯化，进一步纯化在一个制备用的C18柱上通过几次逆相高压液相层析洗脱而被完成。所用的溶剂为：含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水(缓冲液A)和含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(CH3CN-H2O)(4∶1)(缓冲液B)。采用0-50％B从开始到120分钟的线性梯度，随特定洗脱而定。收集含有肽的相应部份，把溶剂在真空中蒸发，产物乙酰基-精-脯-缬-NH-异丁基、三氟乙酸冻干。这个肽的三氟乙酸盐用离子交换柱改换成乙酸盐型。
完成薄层层析是在Merck F-254板(5×10cm)上和下列溶剂系统(v/v)中：
    Rf(1)＝0.43(1-BuOH∶HOAc∶H2O，4∶1∶1)
    Rf(2)＝0.68(1-BuOH∶HOAc∶EtOAc∶H2O，1∶1∶1∶1)
    Rf(3)＝0.86(1-BuOH∶HOAc∶Pyr∶H2O，5∶4∶4∶2)
氨基酸分析(AAA)：
    精氨酸1.20(1)，脯氨酸1.17(1)，缬氨酸0.64(1)
液相色谱-质谱分析(LC-MS)：
    [MH+]在m/z＝468.5a.m.u.观察的分子量＝467.5(理论上的分子量＝467.62)。MH+，m/z和a.m.u.的定义与上同。
实施例8-脱氨基-精-脯-天冬-NH-异丁基的固相合成
上面所说的肽是根据R.B.Merrifield在J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)所述的固相方法合成的。合成的固相方法包括把被保护的氨基酸逐个加到增长的并以共价键与一个固体树脂颗粒相连接的肽链上。
合成开始用4mmol N-异丁基氨甲基树脂(4g，1mmol/g树脂)。所有的氨基酸在它们的氨基基团都用一个叔丁基氧碳酰基团保护。苯甲基基团用于天冬氨酸的β-羧基基团的保护。所有的连接完成都是用二异丙基碳化二亚胺-1-羟基苯并三唑方法和按下述方案：步骤  试剂                                          时间(分钟)1.    二氯甲烷清洗                                  3×1分钟2.    40％三氟乙酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚        1×5分钟3.    40％三氟乙酸-在CH2Cl2中的10％苯甲醚        1×25分钟4.    CH2Cl2清洗                                 3×1分钟5.    在CH2Cl2中的N-甲基吗啉                     2×5分钟6.    CH2Cl2清洗                                 3×1分钟7.    二甲基甲酰胺清洗                              2×1分钟8.    叔丁基氧碳酰-氨基酸(12mmol)和在               1×3分钟
  二甲基甲酰胺中的1-羟基苯并三唑(12mmol)9.    把二异丙基碳化二亚胺加到上述液中并振摇        1×180分钟10.   如果需要，用重复4-9步重新连接11.   二甲基甲酰胺清洗                              3×1分钟
把被保护的氨基酸衍生物，叔丁基氧碳酰-天冬氨酸(氧苯甲基)-OH，叔丁基氧碳酰-脯氨酸-OH，和叔丁基氧碳酰-5-氨基戊酸，按照上述的方案顺序地加到N-异丁基氨甲基树脂中。经过5-氨基戊酸的N末端叔丁基氧碳酰基团的除去和中和作用之后，形成的肽-树脂用3，5-二甲基-1-吡唑甲醛亚胺硝酸盐(12g)和在二甲基甲酰胺中的二异丙基乙基胺(5ml)处理3小时。然后把树脂用二甲基甲酰胺(3×60ml)和CH2Cl2(3×60ml)清洗，最后在真空烘箱30℃干燥(6.97g)。
把被保护的肽-树脂(3.38g)在有对-甲酚，对-硫甲酚和二甲硫作为净化剂存在时用液体氟化氢处理，并一直搅动在0℃1小时，20℃3小时。用真空法除去多余的氟化氢，其残留物用乙醚处理除去净化剂产物。用30％乙酸(3×150ml)提取肽，溶剂在真空中蒸发并把产物冻干。把粗品肽在30％乙酸中溶解，并通过一个AmberliteIRA-68(乙酸盐型)离子交换柱(60g，1.6meq/ml，2.73cm id×18cm长)，以30％乙酸水溶液流速为60ml/h洗脱。把适当部份合并并进行冻干。
把粗品肽溶于0.1％三氟乙酸/H2O中并用一个Vydac218TP1022柱(22×250mm)通过制备用的逆相-高压液相色谱进行纯化。采用的流动相如下面所示：
    A＝0.1％三氟乙酸/H2O
    B＝0.1％三氟乙酸/CH3CN-H2O4∶1v/v
应用由0％B到10％B在100分钟内以流速为15ml/分的一个线性梯度。各部份用高压液相色谱分析，并将那些含有纯肽的部份合并，并在减压下除去有机溶剂。把残留物在水溶解并通过一个离子交换柱改变成乙酸盐型后而进行冻干(185mg)。
薄层层析(TLC)是在Merck F-254板(5×10cm)上完成，采用下列溶剂系统(v/v)：
    Rf(1)＝0.25(1-BuOH∶HOAc∶H2O，4∶1∶1)
    Rf(2)＝0.49(1-BuOH∶HOAc∶EtOAc∶H2O，1∶1∶1∶1)
    Rf(3)＝0.80(1-BuOH∶Pyr∶HOAc∶H2O，5∶4∶4∶2)
氨基酸分析(AAA)：
    脯氨酸1.00(1)，天冬氨酸0.66(1)
液相色谱-质谱分析(LC-MS)：
    [MH+]在m/z＝427a.m.u.观察的分子量＝426(理论上的分子量＝426.26)。MH+代表一个正电荷质子，m/z是质量/电荷，a.m.u是原子质量单位。
实施例9-神经肌肉的测定
这个测定是对一个肽影响神经肌肉传递的能力的量度。在推理上由于肽与烟碱乙酰胆碱受体的相互作用使肽具有此能力。胸腺生成素和Thymopentin已知对神经肌肉传递有抑制影响。
A.在小鼠中进行的测定
把要测试的肽的各种剂量在磷酸缓冲盐水中溶解，并以口服施用于体重25-30克重的雌性小鼠(CDI品系)。按照G.Goldstein等J.Neurol.Neurosura Psychiat31，453-459(1968)，方法修改的方法进行肌电图描记测定，在那个测定中，肽口服后48小时后完成的测定比文献中所述24小时后测定为好。小鼠用10％氨基甲酸乙酯溶液0.5毫升对小鼠进行麻醉。神经用Grass S-48刺激器和一个Grass SIU-5A刺激分离装置(Grass，医学仪器，Quincy，MA)进行刺激，并用一个Tektronix贮存示波器-5111与一个5A21N鉴别放大器和一个5B10N时间基板(Tektronix，Beaverton，OR)相连接，记录肌电图描记器的反应。
用超大的神经刺激，每秒冲动30，肌肉动作电位十分之一高度被表示为一个开始的百分率。用Dunnett′s双尾t检验计算对照与试验的化合物间试验的统计差异的p值。用要试验的肽在神经肌肉测定得到的结果，描述在下面表1中。
                         表1
       序列                         mg/kg    p值(1)乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基               1      0.004
                                      1      0.000
                                      1      0.000
                                     0.1     0.000
                                     0.1     0.006乙酰基-精-脯-苏-NH-异丁基                 1      0.000
                                      1      0.001乙酰基-精-脯-丝-NH-异丁基                 1      0.000
                                      1      0.001己酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基              0.1     0.000
                                     0.1     0.000乙酰基-精-脯-天冬-NH-苯乙基               1      0.000
                                      1      0.001
(1)p值是度量减少神经肌肉传递的能力。p值低表明一个肽能减少神经肌肉传递的，因此是有活性的。
B.在大鼠中进行的测定
把要测试的肽的各种剂量在磷酸缓冲液生理盐水中溶解并以口服方式给体重250-300克重的雌性大鼠(CDI品系)服药。按照G.Goldstein等J.Neurol.Neurosura Psychiat.，31，453-459(1968)，的方法所修改的进行肌电图描记测定，修改之处在于每个肽口服后48小时完成测定而非如在文献中所述的口服24小时。大鼠用1ml 40％氨基甲酸乙酯溶液进行麻醉。用一个Grass S-48刺激器和一个Grass SIU-5A刺激分离装置(Grass医学仪器，Quincy，MA)刺激神经，用一个Tektronix贮存示波器5111与一个5A21N鉴别放大器，并再与5B10N时间基板(Tektronix，Beaverton，OR)相连接的装置记录肌电图描记器的反应。用超大的神经刺激，每秒20次冲动，肌肉动作电位十分之一的高度，被表示作为一个开始的百分率。用Dunnett′s双尾t检验计算对照与试验的化合物之间试验的统计差异的p值。
四个试验是以这个化合物的1mg/kg剂量完成的。用乙酰基-精-脯-缬-NH-异丁基在神经肌肉测定中得到的结果，在下面表II中表示。
                    表2
       序列                 剂量(mg/kg)        p值乙酰基-精-脯-缬-NH-异丁基            1           ＜0.001
用脱氨基-精-脯-天冬-NH-异丁基在神经肌肉测定中得到的结果用大写字母“P”表示，并被展示在下面表Ⅲ中。乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基的P值以低位的“p”表示，也包括在表中作为比较。
                     表Ⅲ
序列              mg/kg(PO)     P值     P值脱氨基-精-脯-天冬         3        0.000   0.000-NH-异丁基                3        0.013   0.003
                      3        0.000   0.000
                      1        0.000   0.002
                      1        0.000   0.000
                      1        0.000   0.000
                      0.5      0.096   0.165
                      0.5      0.000   0.009
                      0.5      0.310   0.010
                      0.25     0.000   0.002
                      0.25     0.667   0.012
                      0.25     0.000   0.000
                      0.125    0.151   0.536
                      0.125    0.605   0.612
                      0.125    0.001   0.013
实施例10-胰岛素刺激试验
血浆葡萄糖的浓度通过神经的和激素的多种机制被保持在一个生理调定点。来自胰腺的胰岛素和胰高血糖素是分别地使血液葡萄糖水平降低和升高的主要激素。然而，几个其它的激素包括生长激素，肾上腺素，肾上腺的糖皮质激素在糖调节中也起重要的作用。存在于大脑的下丘脑区域内的神经细胞感知到葡萄糖浓度从正常的调定点偏离。在感知到血中葡萄糖水平下降时，这些细胞便激活在大脑中非特异性性神经通道，导致其他下丘脑细胞的激动从而产生41-氨基酸肽，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)和9-氨基酸肽，精氨酸加压素(VP)。这些下丘脑因子由大脑分泌进入一个特异性的下丘脑-垂体门脉的毛细管网络并由血液以真正的内分泌方式带入垂体腺的前叶。在垂体前叶中，这些激素以高度亲和性与位于垂体的促皮质激素细胞的受体相结合。受促肾上腺皮质激素释放因子和/或加压素激动的受体使细胞去极化，增加钙的流入并增加促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌而进入外周血液。ACTH，如其名称所示，刺激肾上腺皮质合成和释放最初的糖皮质激素，皮质醇(在人类)，皮质酮(在啮齿动物)。这些激素随后起作用以增加血浆中葡萄糖的浓度。
因此，胰岛素施用于一个正常受试者，或者是人类，或者是啮齿动物，都能被用作刺激引发测试以决定受试者对一个应激的反应。应激在这里被指定为：由于外源胰岛素致使受试者的正常糖调节机制发生不能受控制的混乱。这样的一种应激诱导在试验上对确定包括改善紧急情况在内的补偿机制是有用的。另外，这样的一种刺激引发测试在确定药理学试剂在调节应激-诱导的内分泌变化和在由这些变化而生的紊乱上的有效性是有用的。
A.胰岛素对促肾上腺皮质激素分泌的作用
为确定一个药剂是否能变更应激反应，这应激反应本身必须被鉴定。为完成这个目的，取成熟的雄性Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiver，Kingston，NY)，用增加胰岛素[Humulin，E1i Lilly Co.]从0.05到5IU/kg范围的剂量或用生理盐水在禁食一夜之后进行腹膜内用药。经过用胰岛素药后30分钟，把动物断头杀死并收集躯干血液装入内含400ml 10％EDTA保存在4℃的聚丙烯离心管中。用离心方法把血浆分离并在-80℃贮存直至用于ACTH测定为止。用抗血清[IgG公司，Nashville，TN]和125I-标记的ACTH[ICN公司，Costa，Mesa，CA]系由Nicholson等Clin.Chem.30：259-265，(1984)所叙述那样用放射免疫测定法确定血浆中ACTH的浓度。
图1表示的是，在雄性大鼠中胰岛素诱导的低血糖对ACTH的分泌的影响。在实验动物中，服用生理盐水赋形剂(“O”)的对ACTH的基础水平没有影响(血浆ACTH水平-42.1±4.2pg/ml)。在胰岛素试验的最低剂量(0.05IU/kg)ACTH水平没有上升。在0.1IU/kg剂量上，血浆的ACTH浓度明显地大于以赋形剂处理的对照，高一些剂量则产生同量大一些ACTH反应，在5IU/kg剂量上开始达到平台。根据这些资料，选择0.5IU/kg剂量作进一步实验研究；因为它能产生一个易被放射免疫测定法检测到的大幅度的ACTH反应，但又不是一个最大的反应。如果应用一个高一些胰岛素剂量，被临近反应的平台，会对测定任一由胰岛素诱导的应激效应的随后的变更造成困难，而用0.5IU/kg剂量是位在剂量反应曲线最倾斜部份上，使其较容易地测知在ACTH分泌反应中显著的变更。
B.本发明的一个肽对胰岛素-诱导的ACTH分泌的影响
如上面说明那样，胰岛素的施用能被用作一个刺激引发试验去确定一个有机体对应激刺激如何反应和对这反应如何被处理。在图1中所表示的是，在大鼠施用胰岛素促使血浆中ACTH浓度的增加。进行下面的实验说明这种反应可用本发明的肽，例如，乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丁基(此后用“这个肽”表示)进行处理。
在这些试验中用成熟雄性Sprague-Dawley大鼠。禁食一夜之后，把肽或生理盐水通过管道喂饲法口服或皮下注射给药到本试验的受试者。肽的剂量范围通过口服途径的为0.1mg/kg到10mg/kg，通过皮下途径的为0.03到3.0mg/kg。48小时以后，所有的动物都用胰岛素(0.5IU/kg)处理，再30分钟后把动物通过断头杀死。如上述相同，在4℃收集躯干血放入内含400μl 100％EDTA的聚丙烯离心管中。通过离心把血浆分离开并在-80℃中贮存直至用以确定ACTH为止；用抗血清[IgG公司]和125I-标记的ACTH[ICN公司]按上面所引的如Nicholson等所描述的放射免疫测定方法对ACTH浓度进行测定。
在用生理盐水通过管饲法口服或皮下注射进行预处理动物中，在腹膜内施用0.5IU/kg胰岛素使血浆中的ACTH浓度从16.8±0.8pg/ml上升到接近200pg/ml(图2)。通过皮下途径以0.1mg/kg的剂量施用该肽使ACTH对胰岛素反应有一个小的抑制。在胰岛素前48小时用药时，显著抑制胰岛素诱导的ACTH分泌的阈值剂量是皮下给药0.3mg/kg。该肽在1.0和3.0mg/kg的皮下剂量也抑制ACTH反应。这个肽通过口的管饲法给药(p.o.)也抑制ACTH对胰岛素的反应。该肽在1mg/kg p.o对胰岛素-诱导ACTH分泌只有较小的影响。这个肽的较高剂量(3.0和10.0mg/kg)，使ACTH对胰岛素反应的量上更显著的下降。
因此，这些试验说明，本发明的肽，有抑制应激诱导ACTH分泌的能力。从图2明显看出，这个肽通过口的服用或皮下途径给药，在这个刺激引发试验中都是有效的。另一方面，通过皮下途径用药的最小有效剂量比用口的管饲法途径的剂量低10倍，这也说明胃肠的吸收屏障已被这个肽通过。
实施例11-在对群体性紧张的行为反应的减少
对群体性冲突的紧张的行为反应(定居者/入侵者示例)(E.M.Pich等，Psychoneuroendocrinology 18：495-507，(1993)用在成熟的Wistar大鼠焦虑症的振奋阳性迷宫试验[S.Pellow等，J.Neurosci.Meth.，14：149-167，(1985)]评估。实验小组先用乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺5mg/kg或一种赋形剂(对照)以口服给药进行预处理二天，群体的对抗由一只实验的大鼠入侵到一只爱打架的雄性定居者的家园开始。分成这样的群，把大鼠安置在一个新的笼子中10分钟，没有群体的相互作用(没有紧张)，或在群体上是被打败的并在定居大鼠前暴露30分钟(群体紧张)经过群体衡突之后，立即把动物个别地安置在面对一个闭合的臂的中央平台上经5分钟的试验。这5分钟试验提供计算机自动装置测定二者全面的活动性(张开臂和闭合臂进入数)和在迷宫的张开臂和闭合臂前停留时间。
应激过的大鼠在张开臂前停留时间显著地少而喜欢在闭合臂前限定的空间里。如图3所示，先前用赋形剂进行预处理两天受过紧张的各大鼠在张开臂前停留时间显著地少(P＝0.008)，而先前用肽进行预处理二天的各大鼠没有显示出这种因于紧张的行为变化。他们表现出与不受过紧张的大鼠没有显著的不同(P＝0.199)；而且比接受赋形剂对照，可比较地受过紧张的各大鼠在张开臂前停留更显著地多的时间(P＝0.041)。因此，乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺，5mg/kg口服，阻断了由于群体紧张所产生的产生焦虑样行为的变化。
实施例12-在大鼠中乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺的药物动力学
各大鼠给以一个单一的口服的给以乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺肽的溶液(注射用灭菌水，美国药典(WFI)在5，50或300mg/kg)的上述肽的剂量。血样从大鼠剂量后在几个时间点上进行收集。像前面由J.Crowther等Anal.Chem.，66：2356-2361(7月，1994)已经描述那样，随着从血浆中提取后用液相色谱-电喷洒、质谱分析确定血浆中肽的水平。
在各大鼠中，经过一个单一的口服5，50，或300mg/kg的给药以后，肽很快地被吸收在血浆中浓度分别地到22，314，和1294ng/ml的平均高峰(Cmax)，如在图4中所示那样。相应的时间(Tmax)为剂量后30到60分钟。清除半衰期(T1/2)为51到99分钟。在大鼠中，肽的Camx和在曲线下的面积(AUC)值被发现与肽剂量成比例，说明乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺的药物动力学是线性的。
实施例13-乙酰基-精-脯-天冬-NH-甲基的合成
按照在实施例3A中所叙述的方法用甲酰胺与叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)连接制备叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)-NH-甲基。用4M HCl-二噁烷把它的保护基除去并把肽的氢氯酸盐在真空中干燥。
依照在实施例3C中所叙述的方法用HCl-天冬(氧苯甲基)-NH-甲基完成与乙酰基-精-脯-OH的连接。把保护的三肽，乙酰基-精-脯-天冬(氧苯甲基)-NH-甲基经受催化的氢化作用依照在实施例3D中叙述的方法除去苯甲基基团。粗品肽，乙酰基-精-脯-天冬-NH-甲基通过逆相高压液相色谱法纯化。
薄层层析：
    Rf(1)＝0.26，Rf(2)＝0.53，Rf(3)＝0.87
氨基酸分析：
    精氨酸1.02(1)，脯氨酸0.98(1)，天冬氨酸0.74(1)
液相色谱-质谱分析：
    [MH+]在m/z＝442.9a.m.u.(分子量441.49)
当在实施例9的神经肌肉分析中测验时，在一个1mg/kg的剂量，则这个肽的p值为＜0.001。相反，肽乙酰基-精-脯-天冬-NH2的p值(剂量在1mg/kg)为0.150。
用最后一个测量数对最初一个测量数的比例的两样本t测验(双尾)，完成了对照对试验的化合物组间的比较。
实施例14-乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丙基的合成
依照在实施例3A中叙述的方法，用异丙基胺与叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)-OH相连接制备叔丁基氧碳酰-天冬(氧苯甲基)-NH-异丙基。此肽用4M HCl-二噁烷去保护并把此肽的氢氯酸盐在真空中干燥。
依照在实施例3C中所叙述的方法完成乙酰基-精-脯-OH与HCl天冬(氧苯甲基)-NH-异丙基的连接。依照在实施例3D所叙述的方法，把被保护的三肽，乙酰基-精-脯-天冬-(氧苯甲基)-NH-异丙基经受催化的氢化作用以除去苯甲基基团。粗品肽，乙酰基-精-脯-天冬-NH-异丙基通过逆相-高压液相色谱法纯化。
薄层分析：
    Rf(1)＝0.14，Rf(2)＝0.40，Rf(3)＝0.65
氨基酸分析：
    精氨酸1.00(1)，脯氨酸1.00(1)，天冬氨酸1.01(1)
液相色谱-质谱分析：
    [MH+]在m/z＝471a.m.u.(分子量470.56)
当以实施例9的神经肌肉分析试验时，在剂量为1mg/kg时，则这个肽的p值是＜0.001。
本发明的很多修改和变动被包括于上述被鉴定的申请书中并希望对本领域中的技术人员是明白的。对本发明的成分与过程的这样的更改与变换相信是被包括在附录在这里的权利要求书的范围中。
序列表(1)一般信息：
(i)申请者：免疫生物研究所，公司，
           Goldstein，Gideon
           Shenbagamurthi，Ponniah
           Koenig，James I.
(ii)发明的题目：在免疫和中枢神经系统治疗中有用的新的
                三肽。
(iii)序列数：1
(iv)通讯地址：
    (A)收信A：Howson和Howson
    (B)街道：Spring House Corporate Cntr，P.O.Box
             457
    (C)城市：Spring House
    (D)州：Pennsylvania
    (E)国家：美国
    (F)邮编：19477
(v)计算机可读的类型
    (A)媒体类型：软磁盘
    (B)计算机：IBM PC兼容的
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn释放#1.0文本#1.25
(vi)现申请表资料
    (A)申请号：
    (B)编入日期：
    (C)分类：
(vii)先前的申请表资料
    (A)申请号：US08/112,413
    (B)编入日期：8月26日，1993
(viii)业务代理人/代理入信息
    (A)姓名：Bak，Mary E.
    (B)注册号：31215
    (C)参考摘要号：IRI42APCT
(ix)电信交流信息
    (A)电话：215-540-9206
    (B)电传：215-540-5818(2)SEQ ID NO：1的信息：精-赖-天冬-缬-酪
(i)序列特征：
    (A)长度：5个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：不清楚
(ii)分子类型：肽
(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1
    精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸
    1                             5

Claims (10)

1.由通式R-X-Y-Z-NHR1组成的一种三肽，在式中：X是D或L型的精氨酸或脱氨的精氨酸；R是氢，一个较低级的烷基或一个较低级链烷酰基；Y是一个D型或L型的脯氨酸，脱氢的脯氨酸，或羟基-脯氨酸；Z是一个D型或L型的一个氨基酸，该氨基酸选自丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，天门冬酰胺，β-天冬氨酸，缬氨酸或异亮氨酸；和R1是一个选自具有1至6个碳原子的直链或支链的烷基或链烯基，它可任选由一芳基或取代芳基或3-7碳原子的环亚甲基所取代，取代芳基上的取代基或为卤素，或为具有1至6个碳原子的烷基或链烯基。
2.按照权利要求1的三肽选自
乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-苏-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-丝-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-缬-异丁基酰胺
己酰-精-脯-天冬-异丁基酰胺
精-脯-天冬-甲酰胺
精-脯-谷-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-甲酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-苯乙基酰胺
甲酰-精-脯-天冬-甲酰胺
己酰-精-脯-天冬-甲酰胺，和
脱氨-精-脯-天冬-异丁基酰胺。
3.一种药物组合物，它包括在一种药剂中含治疗有效量的至少一种三肽，该三肽由通式R-X-Y-Z-NHR1组成，在式中：X是D型或L型精氨酸或脱氨精氨酸；R是氢，一个较低级的烷基或一个较低级的链烷酰基；Y是一个D型或L型脯氨酸，脱氢-脯氨酸或羟基脯氨酸；Z是一个D型或L型氨基酸，该氨基酸选自丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，β-天冬氨酸，缬氨酸，或异亮氨酸；和R1是一个选自具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基或链烯基，它可任选由一芳基或取代芳基或3-7碳原子的环亚甲基所取代，取代芳基上的取代基或为卤素，或为具有1-6个碳原子的烷基或链烯基。
4.制备一种具有通式R-X-Y-Z-NHR1的三肽的一个方法，在式中：X是D型或L型精氨酸或脱氨精氨酸；R是H，一个较低级的烷基，或一个较低级的链烷酰基；Y是一个D型或L型脯氨酸，去氢脯氨酸或羟基脯氨酸；Z是一个D型或L型的一个氨基酸，这一个氨基酸选自丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，β-天冬氨酸，缬氨酸或异亮氨酸；和R1是一个选自具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基或链烯基，它可任选由一芳基或取代芳基或3-7碳原子的环亚甲基所取代，取代芳基上的取代基或为卤素，或为具有1-6个碳原子的烷基或链烯基；
所说的方法包括固相合成。
5.按照权利要求4的方法，其中所说的三肽是选自：
乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-苏-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-丝-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-缬-异丁基酰胺
己酰-精-脯-天冬-异丁基酰胺
精-脯-天冬-甲酰胺
精-脯-谷-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-甲酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-苯乙基酰胺
甲酰-精-脯-天冬-甲酰胺
己酰-精-脯-天冬-甲酰胺，和
脱氨-精-脯-天冬-异丁基酰胺。
6.制备一个具有通式R-X-Y-Z-NHR1的三肽的方法，在式中：X是D型或L型精氨酸或脱氨精氨酸；R是H，一个较低级的烷基，或一个较低级的链烷酰基；Y是一个D型或L型脯氨酸，去氢脯氨酸，或羟基脯氨酸；Z是一个D型或L型的一个氨基酸，该一个氨基酸选自，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，β-天冬氨酸，缬氨酸或异亮氨酸；和R1是一个选自具有1-6个碳原子的直链或支链的烷基或链烯基，它可任选由一芳基或取代芳基或3-7碳原子的环亚甲基所取代，取代芳基上的取代基或为卤素，或为具有1-6个碳原子的烷基或链烯基；所说的方法包括液相合成。
7.按照权利要求6的方法，其中所说的三肽选自：
乙酰基-精-脯-天冬-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-苏-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-丝-异丁基酰胺
乙酰基-精-脯-缬-异丁基酰胺
己酰-精-脯-天冬-异丁基酰胺
精-脯-天冬-甲酰胺
精-脯-谷-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-甲酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-异丙基酰胺
乙酰基-精-脯-天冬-苯乙基酰胺
甲酰-精-脯-天冬-甲酰胺
己酰-精-脯-天冬-甲酰胺，和
脱氨-精-脯-天冬-异丁基酰胺。
8.权利要求1的一种肽或其药用盐，在制备适于调节有免疫系统紊乱患者的免疫系统的组合物中的应用。
9.权利要求1的一种肽或其药用盐，在制备适于调节患有紧张症、焦虑症或抑郁症病的患者的神经系统的组合物中的应用。
10.一种论断试剂，它包括权利要求1的一种肽或其药用盐。
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