CN113304281B - PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及癌症治疗技术领域，具体公开了PD‑1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，所述PD‑1siRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中通过PD‑1siRNA联合氯喹，诱导癌细胞发生凋亡的发生，抑制肿瘤细胞增殖。

Description

PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及癌症治疗技术领域，具体涉及PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大恶性肿瘤，仅次于肺癌和乳腺癌，死亡率较高。手术加化疗仍然是结直肠癌的主要治疗方法，但一方面，晚期结直肠癌患者无法接受手术治疗；另一方面，化疗耐受性普遍，结直肠癌患者的生存期并未得到明显改善。近年来，随着精准医学和靶向治疗的出现，寻找有效的分子靶点和联合用药策略已成为改善结直肠癌患者预后的有效途径。

氯喹(Chloroquine,CQ)是一种广泛的抗疟疾类药物，研究发现，氯喹可以抑制细胞自噬，并且激活免疫系统，具有很好的抗肿瘤潜力。近年来，研究发现，氯喹可以显著抑制肺癌、肝癌、胰腺癌等癌细胞的增殖与存活，但其对结直肠癌细胞凋亡的影响尚不清楚。

程序性死亡受体(PD-1)是免疫抑制受体，通过与其配体程序性死亡受体配体(PD-L1)结合，来调控T细胞的活化，并且抑制肿瘤细胞增殖和存活，诱导肿瘤细胞凋亡。活化的CD4+、CD8+和自然杀伤细胞(NK)在抗肿瘤中发挥着重要作用，其中最主要的是CD8+的T淋巴细胞，当机体罹患癌症时，肿瘤细胞中PD-L1高表达，与CD8+的T淋巴细胞上的PD-1结合，抑制CD8+T淋巴细胞活性，导致机体免疫细胞无法识别及杀死肿瘤细胞。

但是，迄今为止，氯喹与PD-1siRNA的联合应用治疗结直肠癌尚未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用。

进一步地，所述PD-1siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备直肠癌细胞凋亡剂。

进一步地，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备结肠癌肿瘤体积抑制剂。

进一步地，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备免疫细胞活性促进剂。

进一步地，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备结肠癌细胞增殖抑制剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过氯喹联合PD-1siRNA促进结直肠癌细胞凋亡以及增强免疫细胞活性，达到治疗结直肠癌的目的，为临床治疗结直肠癌提供了新的方向；

2、本发明中的氯喹能够诱导癌细胞凋亡，通过诱导线粒体凋亡途径蛋白改变，诱导癌细胞发生凋亡的发生，抑制肿瘤细胞增殖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26存活和增殖的影响；

其中，图1A表示不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26活力的影响；

图1B表示不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26增殖率的影响；

图2为本发明中氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡的影响；

其中，图a表示氯喹浓度为0时对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡的影响；

图b表示氯喹浓度为160μM时对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡的影响；

图c表示氯喹浓度为320μM时对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡的影响；

图d表示氯喹浓度为480μM时对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡的影响；

图3为本发明中不同浓度氯喹作用于小鼠结直肠癌细胞CT26后，线粒体凋亡信号通路相关蛋白改变以及PD-L1蛋白的Western blotting结果，其中线粒体凋亡信号通路相关蛋白为Bax,Bcl-2,Cyto-c；

图4为氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌肿瘤体积和质量的影响，其中，PBS为空白对照组，Scr为RNA空载组，CQ为氯喹组，siPD1为单独siPD-1治疗组，CQ+siPD1为氯喹联合siPD-1RNA组；

其中，图4A表示氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌肿瘤体积影响直观图；

图4B表示氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌肿瘤质量影响；

图5为氯喹联合siPD-1RNA治疗小鼠结直肠癌模型后，肿瘤中凋亡相关蛋白和迁移相关蛋白以及PD-1蛋白的影响；

图5A-B共同表示氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌模型中肿瘤中凋亡相关蛋白和迁移相关蛋白以及PD-1蛋白表达量的影响；

图6为氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌模型中免疫相关蛋白的影响；

其中，图6A表示氯喹联合siPD-1RNA治疗小鼠结直肠癌模型后，免疫相关蛋白的胶图；

图6B表示氯喹联合siPD-1RNA治疗对小鼠结直肠癌模型中免疫相关蛋白密度的影响；

图7为氯喹联合siPD-1RNA治疗小鼠结直肠癌模型后，小鼠脾细胞中免疫相关细胞的改变；

其中，第一行表示不同处理(PBS组、Scr组、CQ组、siPD-1组和CQ+siPD-1组)治疗小鼠结直肠癌模型后，小鼠脾细胞中免疫相关细胞CD4的改变；

第二行表示不同处理(PBS组、Scr组、CQ组、siPD-1组和CQ+siPD-1组)治疗小鼠结直肠癌模型后，小鼠脾细胞中免疫相关细胞CD8的改变；

第三行表示不同处理(PBS组、Scr组、CQ组、siPD-1组和CQ+siPD-1组)治疗小鼠结直肠癌模型后，小鼠脾细胞中免疫相关细胞NK1.1的改变。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

实施例1提供了PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，具体过程如下：

一、不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26存活和增殖的影响

(1)将处于对数生长期的小鼠结直肠癌细胞CT26首先弃去培养瓶中培养液，然后加入PBS轻轻冲洗细胞，3ml/次，共两次，以去除死细胞和残留培养液。之后加入1ml 0.25％胰蛋白酶，摇晃培养瓶以确保细胞充分与胰蛋白酶结合，置于培养箱消化1～2分钟。CT26细胞一般消化30秒。消化后取出培养瓶显微镜下观察，细胞由梭形变圆形或肉眼观呈流沙状时，轻轻拍打培养瓶侧壁让细胞脱落，然后立即加入2～3ml DMEM培养液中和胰酶以终止消化。离心，加3ml培养基垂悬，吸取10μl用牛鲍计数板计数，以每孔1.2x10⁴(用于研究存活率)、0.5x10⁴(用于研究增值率)个铺于96孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度氯喹(存活率：0、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM、480μM增殖率：0、10μM、30μM、60μM)。镜下观察细胞死亡有趋势(存活率)或每24h检测一次，连续检测5天(增值率)，每孔加入10μl CCK8检测试剂，孵育2h后用酶标仪在450nm处检测吸光度值。

如图1中可以看出：经过不同浓度氯喹处理后，小鼠结直肠癌细胞CT26存活率和增值率逐渐下降，说明氯喹可以抑制结直肠癌细胞CT26的存活和增殖，并呈现显著的时间和剂量依赖性。

(2)流式细胞术检测不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡率的影响

将处于对数生长期的细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁长满后设计实验组加药处理氯喹浓度分别为0、160μM、320μM、480μM，镜下观察细胞形态发生改变后，收集细胞，加入Annexin V-FITC/PI荧光染料，每组设置双染组，另外单独收集空白对照组细胞调电压、单染FITC和单染PI组条补偿，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

如图2中可以看出：不同浓度氯喹可以显著促进小鼠结直肠癌细胞CT26的凋亡。

(3)不同浓度氯喹对小鼠结直肠癌细胞CT26后，线粒体凋亡信号通路相关蛋白、凋亡相关蛋白、迁移相关蛋白以及PD-L1蛋白改变的Western blotting结果

氯喹浓度分别为0、160μM、320μM、480μM作用于小鼠结直肠癌细胞CT26，待细胞作用完成后收集细胞，加入细胞裂解液裂解，收集蛋白。用BCA法测量蛋白浓度，用酶标仪在570nm处检测吸光度值，绘制标准蛋白曲线，R2>0.999时带入求得蛋白浓度。根据蛋白浓度计算出上样体积，利用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒进行电泳、转膜、封闭并根据所需分子量的大小切膜，加入相应的一抗4℃过夜，第二天回收一抗，洗膜并加入相应的二抗在摇床上封1h后洗膜进行曝光。

如图3中可以看出：氯喹通过激活线粒体凋亡信号通路以及凋亡相关蛋白促进小鼠结直肠癌细胞CT26凋亡，且其通过抑制迁移相关蛋白的表达抑制结直肠癌细胞的迁移，但其PD-L1蛋白表达并未有明显变化，说明氯喹并不能影响PD-L1的表达。

二、动物实验

(1)在BALB/c小鼠(雌性)的右侧皮下接种CT26细胞(1×10⁶/只)，接种一周后，将小鼠随机分为五组，PBS组、Scr组、CQ组、siPD-1组、CQ+siPD-1组。接种低七天和第十四天时，Scr组、siPD-1组和CQ+siPD-1组，分别进行瘤内注射菌种(4x10⁵ CFU/100μL PBS)两次，其余组每天给予腹腔注射，CQ(50mg/kg)。

所述PD-1siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1：

GATCCGGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGTTCAAGAGACTGGACGGGT

TGGCTCAAACCTTTTTTGGAAA

结果如图4所示，氯喹联合siPD-1RNA抑制了体内结肠癌的生长。

氯喹联合siPD-1RNA治疗小鼠结直肠癌模型后，肿瘤中凋亡相关蛋白和迁移相关蛋白以及PD-1蛋白的改变、免疫相关蛋白的改变。

(2)荷瘤小鼠治疗周期结束后，取皮下瘤，称取0.1g加入600μl蛋白裂解液进行裂解，提取组织蛋白进行Western blotting检测。

荷瘤小鼠治疗周期结束后，分离小鼠脾细胞，并加入红细胞裂解液将细胞重悬于PBS中并计数，每个实验组取约2x10⁶个细胞，重悬在200μ的PBS中，加入相应的荧光染料标记的抗体(CD3/FITC，CD4/PE，CD8/APC和NK1.1/FITC)在4℃孵育30分钟流式细胞仪分析荧光强度。

由图5可以看出，氯喹联合siPD-1RNA可以进一步促进结直肠癌细胞凋亡，抑制其迁移，并抑制PD-1的表达。

由图6可以看出，氯喹联合siPD-1RNA可以促进淋巴细胞中CD4,CD8蛋白的表达，达到治疗结直肠癌的目的。

由图7可以看出，氯喹联合siPD-1RNA可以增加小鼠脾细胞中CD4，CD8，NK细胞的比例，达到治疗结直肠癌的效果。

上述结果说明，氯喹联合siPD-1RNA可以进一步促进结直肠癌细胞凋亡，并且可以增强免疫细胞活性，达到治疗结直肠癌的目的。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 新乡医学院

<120> PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 沙门氏菌

<400> 1

gatccgggtt tgagccaacc cgtccagttc aagagactgg acgggttggc tcaaaccttt 60

tttggaaa 68

Claims (5)

1.PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述PD-1siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备直肠癌细胞凋亡剂。

3.如权利要求1所述PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备直肠癌肿瘤体积抑制剂。

4.根据权利要求1所述PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备免疫细胞活性促进剂。

5.根据权利要求1所述的PD-1siRNA联合氯喹在制备治疗直肠癌药物中的应用，其特征在于，所述PD-1siRNA联合氯喹能够用于制备直肠癌细胞增殖抑制剂。