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CN113260632A - 包含IgA抗体构建体的组合物和方法 - Google Patents

包含IgA抗体构建体的组合物和方法 Download PDF

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CN113260632A CN201980087109.4A CN201980087109A CN113260632A CN 113260632 A CN113260632 A CN 113260632A CN 201980087109 A CN201980087109 A CN 201980087109A CN 113260632 A CN113260632 A CN 113260632A
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珍妮特·亨利卡·威廉明娜·勒森
吉尔特·简·范泰特林
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UMC Utrecht Holding BV
Tiga TX Inc
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Abstract

本文提供了包含IgA恒定区的治疗剂、药物组合物和方法。本文所述的组合物和方法促进包含IgA恒定结构域的抗体构建体与CD47和抗原(例如肿瘤相关抗原，诸如CD20或CD19)的结合。

Description

包含IgA抗体构建体的组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2018年10月29日提交的欧洲专利申请EP18203183.1和2018年10月30日提交的美国临时申请号62/752,641的权益；这些专利申请各自通过引用整体并入本文。
背景技术
靶向肿瘤抗原的IgG同型单克隆抗体已被证明是各种恶性肿瘤的有效治疗方法。多年来，越来越多的靶向不同肿瘤抗原的单克隆抗体已被批准用于癌症治疗。然而，它们的临床功效，特别是在单一疗法中，仍然是不充分的。因此，开发新的具有提高的临床疗效的可替代的抗体疗法具有重要意义。
发明内容
一方面，本文提供了一种抗体构建体，其包含：(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域，(b)CD47结合域，以及(c)抗原结合域，其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述CD47结合域包含第一轻链可变域和第一重链可变域中的至少一个。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含第二轻链可变域和第二重链可变域中的至少一个。在一些实施方案中，所述构建体包含所述第一轻链可变域，并且其中所述第一轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其在SEQ IDNO：13中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-L2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：14中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-L3包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：15中具有最多两个氨基修饰的变体。在一些实施方案中，所述构建体包含所述第一轻链可变域，并且其中所述第一轻链可变域包含与SEQ IDNO：26具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述构建体包含所述第一重链可变域，并且其中所述第一重链可变域包含可变重链互补决定区1(CDR-H1)、可变重链互补决定区2(CDR-H2)和可变重链互补决定区3(CDR-H3),其中所述CDR-H1包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：4中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-H2包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：5中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：6中具有最多两个氨基修饰的变体。
在一些实施方案中，所述构建体包含所述第一重链可变域，并且其中所述第一重链可变域包含可变重链互补决定区1(CDR-H1)、可变重链互补决定区2(CDR-H2)和可变重链互补决定区3(CDR-H3)。
在一些实施方案中，所述构建体包含所述第二轻链可变域，并且其中所述第二轻链可变域包含CDR-L1、CDR L2和CDR-L3，其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：10中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-L2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：11中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-L3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：12中具有最多两个氨基修饰的变体。在一些实施方案中，所述构建体包含所述第二轻链可变域，并且其中所述第二轻链可变域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述构建体包含所述第二重链可变域，并且所述第二重链可变域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中所述CDR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：1中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-H2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：2中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-H3包含SEQID NO：3的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：3中具有最多两个氨基修饰的变体。
在一些实施方案中，所述构建体包含所述第二重链可变域，并且其中所述第二重链可变域包含与SEQ ID NO：22具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体构建体包含以下至少一种，第一多肽，其包含所述第一重链可变域和第二重链可变域，其中所述第二重链可变域的C-末端与所述第一重链可变域的N-末端连接；以及第二多肽，其包含所述第一轻链可变域和第二轻链可变域，其中所述第二轻链可变域的C-末端与所述第一轻链可变域的N-末端连接。
在一些实施方案中，所述第一多肽或所述第二多肽还包含连接所述可变域的连接肽。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：29的序列。在一些实施方案中，第一多肽的所述C-末端与(IgA)重链区连接。在一些实施方案中，所述连接是通过IgA CH1恒定结构域进行的。
在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO：31的序列。在一些实施方案中，抗体构建体包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含以下至少一种；第一多肽，其中所述第一重链可变域的所述C-末端与所述第二重链可变域的所述N-末端连接；或者第二多肽，其中所述第一轻链可变域的所述C-末端与所述第二轻链可变域的所述N-末端连接。
在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：30的序列。在一些实施方案中，第一多肽的C-末端与(IgA)重链区连接。
在一些实施方案中，所述连接是通过IgA CH1恒定结构域进行的。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO：32的序列。在一些实施方案中，抗体构建体包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有单链可变片段(scFv)的第一多肽，其中所述scFV包含与所述第二轻链可变域连接的所述第二重链可变域。在一些实施方案中，构建体包含连接所述可变域的连接肽。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：45的序列。在一些实施方案中，所述第一多肽包含与所述第一轻链可变域连接的scFv；或所述第一重链可变域。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有与第一轻链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：35具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有与第一重链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：33具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有单链可变片段(scFv)的第一多肽，其中所述scFV包含与所述第一轻链可变域连接的所述第一重链可变域。在一些实施方案中，抗体构建体包含连接所述可变域的连接肽。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：45的序列。在一些实施方案中，所述第一多肽包含与所述第二轻链可变域连接的scFv；或所述第二重链可变域。
在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有与所述第二轻链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：36具有90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体构建体包含含有与所述第二重链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：34具有90％同一性的序列。在一些实施方案中，所述IgA重链结构域包含IgA重链恒定结构域。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域是IgA1恒定结构域或其变体。在一些实施方案中，所述IgA1恒定结构域包含IgA1 CH2区域和IgA1 CH3区域或其变体中的至少一个。在一些实施方案中，所述IgA1恒定区还包含IgA1 CH1区域其变体。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域是IgA2恒定结构域或其变体。在一些实施方案中，所述IgA2恒定结构域包含IgA2 CH2区域和IgA2 CH3区域或其变体中的至少一个。在一些实施方案中，所述IgA2恒定区还包含IgA2 CH1区域。
在一些实施方案中，所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个或两个天然存在的糖基化位点。在一些实施方案中，所述构建体缺少至少两个天然存在的糖基化位点，并且其中所述至少两个天然存在的糖基化位点在至少一个IgA CH2区域或IgA CH3区域中。在一些实施方案中，所述至少两个天然存在的糖基化位点是两个天然存在的N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的氨基酸置换或两个残基的取代。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的缺失。
在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的缺失。
在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述构建体表现出更长的循环半衰期。
在一些实施方案中，所述抗体构建体包含与相应的野生型CD47结合域相比对CD47具有较低亲和力的衰减CD47结合域。
在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出降低的聚集。在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体与血清蛋白表现出降低的聚集。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定区包含一个或多个白蛋白结合域。在一些实施方案中，所述抗体构建体比不包含一个或多个白蛋白结合域的相应抗体构建体具有更长的半衰期。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含与选自SEQ ID NO：37-41中任一个的序列具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，构建体还包含铰链区。在一些实施方案中，所述铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
在一些实施方案中，所述铰链区包含人IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，所述铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。在一些实施方案中，抗体构建体还包含轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是λ恒定区。在一些实施方案中，所述轻链恒定区与所述第一轻链可变域或所述第一重链可变域连接。
一方面，本文提供了一种抗体构建体，其包含：(a)免疫球蛋白A(IgA)重链恒定结构域，(b)CD47结合域；以及(c)抗原结合域，其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述CD47结合域包含第一轻链可变域和第一重链可变域。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含第二轻链可变域和第二重链可变域。在一些实施方案中，所述第一轻链可变域是κ型。在一些实施方案中，所述第二轻链可变域是λ型。
在一些实施方案中，所述第一轻链可变域是λ型。在一些实施方案中，所述第二轻链可变域是κ型。在一些实施方案中，所述第一轻链可变域是κ型，其包含SEQ ID NO：16的可变轻链互补决定区1(CDR-L1)氨基酸序列、SEQ ID NO：17的可变轻链互补决定区2(CDR L2)氨基酸序列、SEQ ID NO：18的可变轻链互补决定区3(CDR-L3)氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一轻链可变域包含与SEQ ID NO：27具有90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二轻链可变域是λ型，其包含SEQ ID NO：19的可变轻链互补决定区1(CDR-L1)氨基酸序列、SEQ ID NO：20的可变轻链互补决定区2(CDR L2)氨基酸序列、SEQ ID NO：21的可变轻链互补决定区3(CDR-L3)氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二轻链可变域包含与SEQ ID NO：28具有90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一重链可变域和所述第二重链可变域是相同的。
在一些实施方案中，所述第一重链可变域和所述第二重链可变域包含SEQ ID NO：7的可变重链互补决定区1(CDR-H1)氨基酸序列、SEQ ID NO：8的可变重链互补决定区2(CDR-H2)氨基酸序列、SEQ ID NO：9的可变重链互补决定区3(CDR-H3)氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一重链可变域和所述第二重链可变域包含与SEQ IDNO：24具有90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一轻链可变域还包含κ恒定区。在一些实施方案中，第二轻链可变域还包含λ恒定区。在一些实施方案中，第一轻链可变域还包含λ恒定区。在一些实施方案中，第二轻链可变域还包含κ恒定区。在一些实施方案中，所述κ恒定区包含与SEQ ID NO：42具有95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述λ恒定区包含与SEQ ID NO：43具有95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含IgA CH2区域和IgA CH3区域或其变体中的至少一个。
在一些实施方案中，述IgA重链恒定结构域还包含IgA CH1区域或其变体。在一些实施方案中，所述CD47结合域通过所述IgA CH1结构域与所述IgA恒定结构域连接。在一些实施方案中，所述抗原结合域通过所述IgA CH1结构域与所述IgA恒定结构域连接。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域是IgA1恒定区或其变体。在一些实施方案中，所述IgA1恒定区包含IgA1 CH2区域和IgA1 CH3区域。
在一些实施方案中，所述IgA1恒定区还包含IgA1 CH1区域。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域是IgA2恒定区或其变体。在一些实施方案中，所述IgA2恒定区包含IgA2 CH2区域和IgA2 CH3区域。在一些实施方案中，所述IgA2恒定区还包含IgA2 CH1区域。在一些实施方案中，所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25。
在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，IgA重链恒定结构域缺乏一个、两个或三个天然存在的糖基化位点。在一些实施方案中，所述位点在所述IgA CH2区域或IgACH3区域中的至少一个中。在一些实施方案中，所述构建体缺少两个天然存在的N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含至少一个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的氨基酸置换或至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸置换。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸缺失。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的缺失。
在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定区包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定区包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸置换。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的缺失。在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出更长的循环半衰期。在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出更长的半衰期。在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出降低的聚集。在一些实施方案中，与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体与血清蛋白表现出降低的聚集。
在一些实施方案中，所述IgA重链恒定区包含一个或多个白蛋白结合域。在一些实施方案中，所述抗体构建体比不包含一个或多个白蛋白结合域的相应抗体构建体具有更长的半衰期。在一些实施方案中，IgA重链恒定区还包含铰链区。在一些实施方案中，其中所述铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
在一些实施方案中，所述铰链区包含人IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，所述铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。在一些实施方案中，所述抗体构建体还包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒素剂。在一些实施方案中，所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。在一些实施方案中，所述治疗剂或细胞毒素剂是抗代谢剂、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素或凋亡剂。在一些实施方案中，免疫效应细胞是嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中，当所述抗原结合域也与表达CD47的所述靶细胞结合时，所述抗体构建体仅抑制所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)功能。在一些实施方案中，抗体构建体是双特异性的。在一些实施方案中，所述CD47结合域是Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单域抗体(sdAb)或骆驼VHH结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合域是Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单域抗体(sdAb)或骆驼VHH结构域。
在一些实施方案中，所述IgA重链结构域是两个IgA重链恒定结构域的异二聚体。在一些实施方案中，所述异二聚化是通过杵臼结构偶联、盐桥/静电互补偶联、CrossMab偶联、链交换工程化结构域技术或其组合进行的。在一些实施方案中，所述抗原结合域结合癌细胞或病原体的抗原。在一些实施方案中，所述病原体是细菌、微生物或病毒。
一方面，本文提供了一种抗体构建体，其包含：(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域，(b)CD47结合域以及(c)抗原结合域；其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，其中所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
一方面，本文提供了一种多特异性免疫效应细胞接合分子，其包含：(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；(b)CD47结合域以及(c)抗原结合域，其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上a的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含以上抗体构建体中的任一种，以及药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是显像剂、细胞毒素剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、辅刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、抗细胞因子抗体或其功能性片段、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗牛皮癣剂、甾皮质激素、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药物、抗精神病药物、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
一方面，本文提供了一种分离的核酸，其编码以上任何一方面的抗体构建体。
一方面，本文提供了包含上述分离的核酸的载体。
一方面，本文提供了一种体外细胞，其包含以上公开的分离的核酸。
一方面，本文提供了表达上述任何一方面的抗体构建体的体外细胞。
一方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，其包含向所述受试者施用有效量的包含抗体构建体的组合物，其中所述抗体构建体包含，(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域，(b)CD47结合域；以及(c)抗原结合域，其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
在一些实施方案中，对所述CD47与所述SIRPα结合的所述抑制增加了所述靶细胞的吞噬作用和清除率。在一些实施方案中，所述组合物通过口服、病灶内、静脉内治疗或通过皮下、肌内、动脉内、静脉内、腔内、颅内或腹膜内注射施用。在一些实施方案中，所述组合物每天、每周、每两周、每月、每两个月、每三个月一次、每6个月一次或每12个月一次施用。在一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、胆管癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、宫颈癌、Burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌、甲状腺髓样癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、肺气管癌(pulmonary tract cancer)、肾癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、尿路上皮癌和膀胱癌。
在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，所述方法包含施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是显像剂、化学治疗剂、激酶抑制剂、辅刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、二抗或其抗原结合片段、药物、毒素、酶、细胞毒素剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗牛皮癣剂、甾皮质激素、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药物或抗精神病药物。
一方面，本文提供了一种诱导嗜中性粒细胞介导的对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：使所述靶细胞与有效量的抗体构建体接触，其中所述抗体构建体包含；(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；(b)CD47结合域以及(c)抗原结合域；其中所述IgA重链结构域特异性结合嗜中性粒细胞上的FcαR，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述嗜中性粒细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力，从而诱导所述嗜中性粒细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，所述嗜中性粒细胞介导的免疫应答包括所述靶细胞的吞噬作用或所述靶细胞的裂解。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是癌细胞或病毒细胞。在一些实施方案中，癌细胞是淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述CD47结合域包含所述第一轻链可变域，所述第一轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR-L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含选自表A的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD47结合域包含所述第一重链可变域，所述第一重链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-H1)、可变轻链互补决定区2(CDR-H2)和可变轻链互补决定区3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含选自表A的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合域包含所述第二轻链可变域，所述第二轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR-L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含选自表B的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合域包含所述第二重链可变域，所述第二重链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-H1)、可变轻链互补决定区2(CDR-H2)和可变轻链互补决定区3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含选自表B的氨基酸序列。
附图说明
本公开内容的特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1A-1E示出了本文所述的示例性的抗体构建体。实施例中解释了说明性构建体的制备。图1A示出了示例性的基于IgA恒定结构域支架的二价二聚体构建体(在本文所述的示例性构建体中，举例说明了具有降低的糖基化和/或更好的表达谱的IgA1、IgA2或修饰的IgA2的IgA重链支架(也称为IgA2或IgA3.0))，其特异性由连接到IgA支架的VH和κVL区域确定，其中所述构建体可以结合CD47和抗原呈递细胞上的示例性抗原(在示例性情况下为CD20)。图1B示出了由通用重链以及κ和λ轻链组成的二价异二聚体。特异性仅由κ和λ区的VL区决定，其中一个这样的区域特异性结合CD47，另一个这样的区域特异性结合抗原呈递细胞上的示例性抗原(在示例性情况下为CD20)。图1C示出了基于DVD-IgA2的构建体，一种四价同型二聚体。特异性由两个VH/VL对的组合确定，另外的VH已连接至原始VH，另外的VL已连接至原始VL，它们通过肽接头连接至先前存在的VH和VL。图1D示出了DVD-IgA3.0-scFv_LC，一种四价同型二聚体，其中IgA3.0是针对糖基化和可制造性优化的IgA。特异性是由与原始VL连接的scFv的组合确定的。图1E示出了DVD-IgA3.0-scFv_HC，一种四价同型二聚体。特异性由与原始VH连接的scFv的组合确定。在本文所述的实施方案中，构建体特异性结合抗原呈递细胞上的CD47和抗原(在示例性情况下为CD20、HER2、GD2、间皮素、EGFR等)。在本文图1A-1E中任一图所述的抗体构建体设计中，抗原结合区和CD47结合区可衍生自可商购获得的或以其它方式公开已知的抗体。在一些实施方案中，抗体构建体被设计为具有CD47结合域或区域，该CD47结构域或区域对CD47的结合亲和力低于该构建体中的抗原结合域或区域。
图2A-2K说明了在HEK293-Freestlye(HEK293F)细胞中表达本文所述的IgA抗体构建体所需的最佳重链：轻链比率。X轴显示的是重链编码DNA(HC)和轻链编码DNA(KLC)与pAdvantage–pAdv(Promega)的组合的比率，其总浓度为1ug/mL，体积为2mL。pAdv DNA的量始终等于HC DNA。Y轴示出了针对单个抗体构建体测量的蛋白质浓度。测定了表1和表2中每种双特异性抗体的蛋白质浓度。通过κ-IgA ELISA测定DVD-IgA双特异性抗体#1(图2A)和DVD-IgA双特异性抗体#2(图2B)、DVD-IgA-scFv_LC双特异性抗体#5(图2C)、DVD-IgA-scFv_LC双特异性抗体#6(图2D)、DVD-IgA-scFv_HC双特异性抗体#3(图2E)、DVD-IgA-scFv_HC双特异性抗体#4(图2F)的蛋白质浓度。通过κ/λ-IgAELISA测量了κ-κIgA(图2G-2H)和λ-λIgA(图2I-2J)的蛋白质浓度。对于κ-λIgA的OD415值，因为由于缺乏标准品而无法测量浓度(图2K)。实施例部分3中描述了方法。
图3A-3B示出了本文所述的示例性重组IgA抗体构建体的纯化。图3A示出了示例性双特异性DVD-IgA分子的亲和纯化洗脱图。图3B示出了非还原性SDS-PAGE凝胶上双分子抗体#1和#5在预期分子量下的纯度。该凝胶显示出低水平的非缔合κ轻链(#1为35kDa；#5为50kDa)。实施例部分3中描述了方法。
图4示出了本文描述的(例如，表1中列出的)六个示例性抗体构建体(DVD-IgA)的测量浓度。所有六个双特异性IgA分子均在HEK293F细胞中产生，并通过ELISA测定上清液中的浓度。
图5A-5D示出了流式细胞仪分析和鉴定表达IgA抗体构建体的细胞中的门控策略。图5A示出了基于细胞大小和形状的活细胞群的选择。图5B示出了从活细胞群体中进一步选择单细胞。图5C示出了用抗-IgA PE-标记的抗体染色后对照IgA-阴性细胞的门控策略。图5D示出了通过用抗-IgA PE-标记的抗体染色对IgA阳性细胞的分析和选择。
图6A-6B示出了通过流式细胞术对本文所述的抗体构建体(例如，表1和表2)的结合分析。图6A示出了所使用的SKBR3细胞系的表征。SKBR3 WT和SKBR3-CD20细胞均已被针对CD20(Obi＝阿托珠单抗(Obinituzumab)的互补区)或CD47(克隆2.3D11)的IgA抗体染色。未染色的细胞和二抗仅是对照。图6B示出了双特异性抗体与SKBR3 WT和SKBR3-CD20细胞的结合。图6B中的左图X轴表示抗体，例如单独的抗CD47抗体2.3D11、抗体#1、抗体#2、抗体#3、抗体#4、抗体#5和抗体#6。图6B中的右图X轴表示抗体，例如单独的抗CD20 Obi抗体、抗体#1、抗体#2、抗体#3、抗体#4、抗体#5和抗体#6。在不存在(黑色)或存在CD47阻断抗体(灰色)的情况下，已在SKBR3WT(左图)和SKBR3-CD20(右图)细胞上测试了含有单个双特异性抗体的上清液#1-6。双特异性抗体#2、#3和#5示出了CD47阻断作用，说明CD20的结合可通过另外的CD47结合而增强。
图7A-7B示出了双特异性抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)分析。在PMN ADCC分析中，SKBR3-CD20细胞已用作靶细胞。抗体IgA3.0-Obi和IgA3.0-2.3D11已单独使用或组合使用，并且双特异性IgA抗体#2已并行测试。组合(Obi+2.3D11)和双特异性抗体已使用mIgG1 CD47 PerCP-Cy5.5抗体进行了预阻断。在预阻断CD47时，观察到该组合和双特异性抗体的杀伤力降低。通过双特异性阻断CD47的功能作用增强了CD20依赖性ADCC。图7A展示了使用SKBR3(CD20-/-)WT(上图)或SKBR3 CD20(+)(下图)作为靶细胞的PMN对Obi-IgA和2.3D11-IgA的依赖性ADCC活性。SKBR3 WT和CD20细胞未显示带有IgG1的ADCC。SKBR3WT仅用Obi-IgA不能显示特异性裂解，而2.3D11则诱导ADCC。在SKBR3-CD20(+)细胞中，Obi-IgA与2.3D11-IgA组合进一步诱导了ADCC，在使用mIgG1-抗CD47PerCP-Cy5.5对CD47进行预阻断后，其部分恢复了。在x轴上，抗体浓度以ug/mL给出。图7B展示了在PMN ADCC测定中的SKBR3-CD20(+)细胞，以测试双特异性抗体#2DVD-IgA Obi-2.3D11的ADCC活性。作为对照，已经单独或组合使用了IgA3.0-Obi和IgA3.0-2.3D11。组合(Obi+2.3D11)表现出最高的ADCC，可通过将SKBR3-CD20(+)细胞与mIgG1 CD47 PerCP-Cy5.5抗体预温育来有效地阻断。与组合相比，双特异性抗体#2显示出相似的杀伤效率。通过使用mIgG1抗CD47PerCP-Cy5.5进行的预阻断只能部分减轻这种作用。因此，通过在同一分子双特异性IgA中阻断CD47的功能作用大大增强了CD20依赖性ADCC。
图8A-8D示出了抗体构建体对CD47结合的分析。
图8A示出了红细胞的门控策略。已经选择了CD235a+细胞，并且仅将其作为阴性门对IgA二抗进行门控。CD47对红细胞呈高度阳性。图8B示出了血小板的门控策略。已经选择了CD61+细胞，并且仅将其作为阴性门对IgA二抗进行门控。CD47对血小板呈高度阳性。图8C-8D示出了本文所述的抗体构建体与红细胞(图8C)和血小板(图8D)的结合的流式细胞术分析。图8C示出了对红细胞上的CD47结合的分析表明了双特异性抗体#4(Obi-scFv：2.3D11_HC)对红细胞上的CD47结合的水平较低。对于所有其他双特异性抗体，未观察到与红细胞的结合。图8D证明没有观察到双特异性抗体的血小板结合。
图9示出了描述本文描述的抗体构建体的作用机理的图示。本公开内容的抗体构建体包含抗原结合域、CD47结合域和IgA重链恒定结构域。抗体构建体通过抗原结合域结合靶细胞的抗原、通过CD47结合域结合同一靶细胞上的CD47、通过IgA重链恒定结构域结合免疫效应细胞(例如嗜中性粒细胞)上的Fc受体。与CD47的结合可抑制免疫效应细胞上SIRPα与靶细胞上CD47的相互作用，从而抑制“不吃我的信号”并诱导免疫效应细胞对靶细胞的应答。
具体实施方式
以下描述和实施例详细说明了本公开内容的实施方式。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方式，并且因此可以改变。本领域技术人员将认识到，本公开内容有许多变化和修改，它们被包含在本公开内容的范围内。
所有术语都应被理解为本领域技术人员所理解的。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本公开内容的各种特征，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合来提供。相反，尽管为了清楚起见，本文中可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单个实施方案中实现。
定义
以下定义补充了本领域的那些定义，并且是针对当前申请的，而不应归因于任何相关或不相关的案例，例如，任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的测试实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。相应地，本文使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而不意在限制。
在本申请中，使用的单数包括复数，除非另有明确说明。必须注意的是，除非上下另有明确规定，否则如说明书中所用，单数形式“一(a、an)”及“所述”包括复数个指示物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(诸如“包括(include)”，“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。
说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”的引用是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在至少一些实施方案中，但不一定包括在本公开内容的所有实施方案中。
如本说明书和权利要求书中所使用，词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，诸如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，诸如“have”和“has”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，诸如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，诸如“contains”和“contain”)是包括的或开放式的，且不排除额外的、未述及的要素或方法步骤。预期本说明书中所论述的任何实施方案可关于本公开内容的任何方法或组合物来实施，且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可用于实现本公开内容的方法。
术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，该误差范围部分将取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以指在一个或大于一个标准偏差内。或者，“约”可以指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。在另一个实例中，数量“约10”包括10以及从9到11的任何数量。在又一实例中，相对于参考数值的术语“约”还可以包括与该数值相差±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。替代地，特别是就生物系统或过程而言，该术语“约”可指在数值的一个数量级以内，优选地在5倍之内，更优选地在2倍之内。在说明书和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，“抗原呈递细胞上的抗原”是指与抗原呈递相关的抗原物质，并且可以触发宿主中的免疫应答。例如，抗原是在病原细胞例如癌细胞中产生或过表达的任何抗原物质。抗原是蛋白质、肽或多糖。本文所述的抗原呈递细胞是呈递抗原的细胞，例如以组织相容性分子上的肽形式呈递抗原。癌细胞，例如呈递肿瘤抗原的肿瘤细胞是示例性的抗原呈递细胞。肿瘤抗原是本文所述的构建体中的示例性抗原，其中所述肿瘤抗原在肿瘤细胞中产生。例如，它可能会触发宿主的免疫应答。备选地，出于本公开内容的目的，肿瘤抗原可以是由健康细胞和肿瘤细胞两者表达的蛋白质，但是因为它们识别出某种肿瘤类型或在某种肿瘤类型中过表达，所以它们是合适的治疗靶标。在实施方案中，肿瘤抗原是CD20、GD2、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。在一个实施方案中，肿瘤抗原是EGFRvIII，其是治疗髓样恶性肿瘤(例如胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM))的疗法的靶标。在另一个实施方案中，肿瘤抗原是CD20。在又一个实施方案中，肿瘤抗原是GD2。在又一个实施方案中，肿瘤抗原是间皮素。
如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原特异性结合或对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。抗体可包括例如多克隆的、单克隆的、基因工程化的及其抗原结合片段。抗体可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、杂缀合抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体或四抗体。抗原结合片段可包括，例如，Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rlgG、scFv、hcAbs(重链抗体)、单域抗体、VHH、VNAR、sdAbs或纳米抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由B细胞的单个克隆产生并结合相同表位的抗体。相反，“多克隆抗体”是指由不同的B细胞产生并结合相同抗原的不同表位的抗体群。完整抗体通常由四种多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链包含一个N-末端可变(VH)区和三个C-末端恒定(CH1、CH2和CH3)区，每条轻链包含一个N-末端可变(VL)区和一个C-末端恒定区(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH和VL区具有相似的一般结构，每个区包含四个框架区，其序列相对保守。框架区通过三个互补决定区(CDR)连接。这三个称为CDR1、CDR2和CDR3的CDR形成抗体的“高变区”，负责抗原结合。在本文所述的构建体中，抗体包含IgA重链结构域或形成用于附着CD47结合域和/或抗原结合域的支架的区域。IgA恒定区结构域基于IgA1或IgA2恒定区结构域，在一些情况下，其被进一步修饰以改善糖基化特征、改善可制造性、易于异二聚体形成或定制/选择性Fc受体结合。
如本文所用，“重组抗体”是包含衍生自两个不同物种或两个不同来源的氨基酸序列并包括合成分子的抗体。作为非限制性实例，包含非人CDR和人可变区框架或恒定或Fc区的抗体，具有来自两种不同单克隆抗体的结合域的抗体，或包括一个或多个氨基酸残基的突变以增加或降低生物活性或结合抗体的一部分的抗体。在某些实施方案中，重组抗体由重组DNA分子产生或合成。在某些实施方案中，本文所述的抗体是由一个或多个多核苷酸编码的多肽。
如本文所用，“识别”或“结合”或“选择”是指抗原结合域和抗原之间的缔合或结合。如本文所用，“抗原”是指可以在宿主中触发免疫应答的抗原性物质。抗原性物质可以是可以在宿主中触发免疫应答的分子，诸如辅刺激分子。
如本文所用，“抗体构建体”是指包含抗原结合域和Fc结构域的构建体。
如本文所用，“结合域”是指抗体或非抗体结构域。
如本文所用，“抗原结合域”是指来自抗体或可结合至抗原的非抗体的结合域。抗原结合域可以是肿瘤抗原结合域或可以与抗原呈递细胞上的抗原(诸如分子)结合的结合域。当在给定的缀合物或抗体构建体中存在超过一个的抗原结合域时(例如，第一抗原结合域、第二抗原结合域、第三抗原结合域等)，可对抗原结合域进行编号。同一缀合物或构建体中的不同抗原结合域可靶向相同抗原或不同抗原(例如，可结合肿瘤抗原的第一抗原结合域、可结合抗原呈递细胞(APC抗原)上的分子的第二抗原结合域和可与APC抗原结合的第三抗原结合域)。
如本文所用，“抗体抗原结合域”是指来自可与抗原结合的抗体的结合域。
如本文所用，“Fc结构域”是指来自抗体或可结合至Fc受体的非抗体的Fc结构域。如本文所用，“Fc结构域”和“包含Fc的结构域”可互换使用。
如本文所用，“靶结合域”是指含有来自抗体或来自可结合至抗原的非抗体的抗原结合域的构建体。
如本文所用，天然1-对映体氨基酸的缩写是常规的，并且可为如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天门冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gin)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，He)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；蛋氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。除非另有说明，否则X可表示任何氨基酸。在一些方面，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)。
本文所用的短语“药物上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与例如人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所用的短语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。在可与制剂的其他成份兼容且不对患者有害的意义上，每一载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液以及(21)药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。
抗原可引发免疫应答。抗原可以是蛋白质、多糖、脂质或糖脂，它们可以被免疫细胞(诸如T细胞或B细胞)识别。免疫细胞暴露于一种或多种这些抗原可引起快速的细胞分裂和分化反应，从而导致暴露的T细胞和B细胞克隆的形成。B细胞可以分化为浆细胞，浆细胞又可产生与抗原选择性结合的抗体。
术语“癌症”、“肿瘤”和“增生性疾病”涉及以细胞生长失调为特征的哺乳动物的生理状况。癌症是一组细胞显示不受控制的生长或不想要的生长的一类疾病。癌细胞也可以扩散到其他位置，这可能导致转移的形成。癌细胞在体内的扩散可以例如通过淋巴或血液发生。不受控制的生长、侵袭和转移形成也被称为癌症的恶性特性。这些恶性特性使癌症与良性肿瘤区分开来，良性肿瘤通常不会侵入或转移。
“抗原识别部分”或“抗体识别结构域”是指与抗原特异性结合的分子或分子部分。在一个实施方案中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，并且抗原是肿瘤抗原或感染性疾病抗原。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”、“抗原结合域”或它们的语法同等成分在本文中可互换使用，是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(通常参见Holliger等人，Nat.Biotech，23(9)：1126-1129(2005))。抗体片段理想地包含例如一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于，(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含在茎区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)单链Fv(scFv)，其是由通过合成接头连接的Fv片段的两个结构域(即VL和VH)组成的单价分子，其使得两个结构域能够被合成为一条多肽链(参见，例如，Bird等人，Science，242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)；和Osbourn等人，Nat.Biotechnol，16：778(1998))以及(v)双抗体，其是多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽接头连接至VL的VH，该肽接头太短而不允许相同多肽链上的VH和VL之间的配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间的配对以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚分子。抗体片段是本领域已知的，并在例如美国专利号8,603,950中有更详细的描述。其他抗体片段可包括重链抗体(VHH)的可变片段。
术语“保守氨基酸置换”或“保守突变”是指一个氨基酸被具有共同性质的另一氨基酸替代。定义单个氨基酸之间共同性质的一种功能方法是分析同源生物体相应蛋白质之间氨基酸变化的标准化频率(Schulz，G.E.和Schirmer，R.H，Principles of ProteinStructure，Springer-Verlag，纽约(1979))。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸优先彼此交换，并且因此它们对整体蛋白质结构的影响最相似(Schulz，G.E.和Schirmer，R.H，同上)。保守突变的实例包括上述亚组内氨基酸的氨基酸置换，例如赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而可以保持正电荷；谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，从而可以保持负电荷；丝氨酸取代苏氨酸，从而可保持游离–OH；以及谷氨酰胺取代天冬酰胺，从而可以保持游离的–NH2。备选地或附加地，治疗剂可包含具有至少一个非保守氨基酸置换的参考蛋白的氨基酸序列。
术语“非保守突变”或“非保守氨基酸置换”涉及不同组之间的氨基酸置换，例如赖氨酸取代色氨酸，或苯丙氨酸取代丝氨酸等。在这种情况下，优选非保守氨基酸置换不干扰或抑制治疗剂的生物学活性。非保守氨基酸置换可增强治疗剂的生物学活性，从而使得治疗剂的生物学活性与野生型治疗剂相比增加。
IgA抗体
免疫球蛋白A(IgA)以其抗微生物作用而闻名，并以其二聚体形式大量存在于粘膜部位。作为单体，它是血清中第二大主要存在的抗体。IgA包含两个亚类IgA1和IgA2，它们以类似的亲和力与髓系IgA受体(FcαRI、CD89)结合。在一些实施方案中，IgA抗体具有为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)募集嗜中性粒细胞的卓越能力。在一些实施方案中，IgA抗体需要较低的效应子：靶(E：T)比率。在一些实施方案中，与其他类型的抗体(例如，IgG)相比，IgA抗体降低了肿瘤调理抗体的浓度。通常，癌症治疗性抗体通过直接和间接免疫介导作用的组合起作用。这些作用包括补体激活诱导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。ADCC可通过激活不同的Fc受体表达细胞来介导，包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。在这些表达Fc受体的效应细胞中，巨噬细胞和嗜中性粒细胞表达结合IgA抗体所需的FcαRI，因此可通过ADCP或ADCC杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，IgA抗体-免疫细胞结合后，IgA抗体触发病原细胞诸如肿瘤细胞的免疫细胞介导的(例如嗜中性白细胞介导的)吞噬作用或胞啃作用。杀死肿瘤细胞的这种机制主要是通过与IgA的Fc受体(FcαRI；CD89)相互作用而介导的，其是IgA受体的最佳特征。FcαRI在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞子集和Kupffer细胞上表达，并以中位亲和力结合单体和二聚体IgA亚型。IgA与FcαRI的结合介导效应功能，诸如吞噬作用、氧化爆发、细胞因子释放、抗原呈递和ADCC。在人类中，已区分出两个IgA同型IgA1和IgA2，以及三个同种异型IgA2m(1)、IgA2m(2)和IgA2n。在一些实施方案中，IgA抗体比IgG抗体更有效地触发多形核细胞(PMN)介导的ADCC。
IgA具有两个子集(IgA1和IgA2)，可以单体形式以及二聚体形式和分泌形式生产。在一些实施方案中，IgA抗体可以是单体的。在一些实施方案中，IgA抗体可包含一个或多个IgA1氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA抗体可包含一个或多个IgA2氨基酸序列。在一些实施方案中，IgA抗体可包含一个或多个IgA1氨基酸序列和一个或多个IgA2氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体构建体包含来自IgA抗体的恒定区结构域，所述IgA抗体是IgA1或IgA2抗体。在一些情况下，IgA2抗体是同种异型的IgA2抗体：IgA2m(1)、IgA2(m)2或IgA2n。在一些实施方案中，IgA2m(1)抗体是白种人IgA2m(1)抗体。在一些实施方案中，IgA2m(2)抗体是非洲人IgA2m(2)抗体或亚洲人IgA2m(2)抗体。在一些实施方案中是针对改进的可制造性、有利的糖基化、改进的溶解性或改进的活性(例如选择性Fc受体结合)而修饰的IgA2抗体。本文提供了示例性的基于IgA2的恒定区或在本文所述的抗体构建体中的用途，具有诸如IgA2.0和IgA3.0的此类改进。基于本领域技术人员的知识的进一步这样的修饰在本文所述的构建体的范围内。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含重链恒定区，其包含至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的IgA氨基酸。在一些实施方案中，IgA抗体包含轻链恒定区，其包含至少50、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的IgA氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含重链恒定区，该重链恒定区包含IgA CH3区域、IgA CH2区域或IgA CH1区域中的一个或多个或其任何组合。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含含有IgA CH1区域的轻链区域结构域。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含重链恒定区域，该重链恒定区域包含IgG CH3区域、IgG CH2区域或IgG CH1区域中的一个或多个氨基酸或其任何组合。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含重链恒定区域，该重链恒定区域包含IgA CH3区域、IgA CH2区域和IgA CH1区域或其任何组合。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含重链恒定区域，该重链恒定区域包含IgA CH3区域、IgA CH2区域和IgG CH1区域或其任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含IgG可变区，例如任选地通过使用接头融合或连接至IgA恒定区的轻链可变区。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含IgG重链可变区。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含IgG轻链可变区和IgG重链可变区。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可包含来自人源化抗体的一个或多个结构域。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可包含来自嵌合抗体、鼠抗体、骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体的一个或多个结构域。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可仅包含人抗体的结构域。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可以是双特异性抗体或多特异性抗体构建体。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可以是三特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可以是多特异性抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可以是双特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体在细胞表面共结合CD47和一种或多种抗原。在一些实例中，本文所述的抗体构建体与两种不同抗原的结合是顺序的。例如，构建体与第一抗原的结合首先发生，从而限制了二抗臂探索的空间。因此，第二抗原的局部浓度可以显著增加，这可促进二抗臂的结合。在一些情况下，这样的第一抗原是在抗原呈递细胞上选择性表达或过表达的抗原，而第二抗原是也在抗原呈递细胞上表达的CD47。在一些情况下，构建体以比第一抗原小的结合强度结合第二抗原，从而允许与第一抗原的结合决定细胞特异性。
在一些实施方案中，构建体可包含IgA或其变体的Fc结构域的至少一部分。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含含有CH3、CH2和CH1结构域的重链恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体包含含有CH1的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述构建体诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，构建体诱导多形核嗜中性粒细胞(PMN)介导的肿瘤细胞裂解。在一些实施方案中，所述IgA抗体通过不依赖半胱天冬酶的途径诱导程序性细胞死亡(PCD)。在一些实施方案中，抗体构建体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，IgA抗体诱导由嗜中性粒细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，与相应的IgG抗体相比，本文所述的抗体构建体可具有为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)募集嗜中性粒细胞的卓越能力。在一些实施方案中，IgA抗体可需要较低的效应子：靶(E：T)比率。在一些实施方案中，与其他类型的抗体(例如，IgG)相比，本文所述的抗体构建体可需要较低的肿瘤调理抗体浓度。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体可在IgA抗体-嗜中性粒细胞结合后触发肿瘤细胞的嗜中性粒细胞介导的吞噬作用或胞啃作用。杀死肿瘤细胞的这种机制主要是通过与IgA的Fc受体(FcαRI；CD89)相互作用而介导的，其是IgA受体的最佳特征。FcαRI在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞子集和Kupffer细胞上表达，并以中位亲和力结合单体和二聚体IgA亚型。IgA与FcαRI的结合介导效应功能，诸如吞噬作用、氧化爆发、细胞因子释放、抗原呈递和ADCC。在人类中，已区分出两个IgA同型IgA1和IgA2，以及三个同种异型IgA2m(1)、IgA2m(2)和IgA2n。在一些实施方案中，IgA抗体比IgG抗体更有效地触发多形核细胞(PMN)介导的ADCC。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体不结合B细胞、T细胞、血小板和/或红细胞。例如，在一些实施方案中，IgA抗体可具有低免疫原性。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体是治疗性抗体。在一些实施方案中，本文所述的的抗体构建体可以是重组抗体。在一些实施方案中，在细胞系中制备本文所述的抗体构建体。在一些实施方案中，细胞系是CHO。在一些实施方案中，细胞系是SP20。在一些实施方案中，细胞系是HEK 239细胞系。在一些实施方案中，HEK 293细胞系是HEK293F。
IgA抗体修饰
本文描述的是本文所述的抗体构建体，其在一个或多个IgA恒定区结构域中包含一个或多个氨基酸置换和/或一个或多个氨基酸缺失。
在一些实施方案中，本文所述的基于IgA抗体的构建体的氨基酸编号是根据C-DOMAIN和C-LIKE-DOMAIN的IMGT唯一编号指示(如“IMGT unique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-likedomains.”Dev Comp Immunol，2005；29(3)：185-203中所公开的，其全部内容通过引用结合于本文中)。
在一些实施方案中，构建体在恒定区内包含至少四个糖基化位点的缺失。在一些实施方案中，构建体在抗体的恒定区中包含至少三个N-连接的糖基化位点的缺失。在一些实施方案中，抗体构建体包含在抗体的恒定区中的至少三个N-连接的糖基化位点和在抗体的恒定区中的至少一个O-连接的糖基化位点的缺失。
在一些实施方案中是包含IgA恒定区的抗体构建体，该IgA恒定区包含缺失的尾端片段(tail piece)。在一些实施方案中，所述构建体包含3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4个C-末端氨基酸的缺失。在一些实施方案中，所述构建体包含3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4个C-末端氨基酸的缺失。在一些实施方案中，C-末端氨基酸来自IgA2抗体的氨基酸131-148，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸131-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸147-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸146-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸145-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸144-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸143-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸142-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸141-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸140-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸139-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸138-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸137-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸136-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸135-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸134-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸133-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸132-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸131-148的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸P131-Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA抗体包含C-末端天冬酰胺(N)氨基酸的突变。在一些实施方案中，突变是非保守氨基酸置换。在一些实施方案中，该突变缺失了IgA的C-末端天冬酰胺(N)氨基酸的糖基化位点。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N135的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N135的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N135Q突变，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N45.2的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N45.2的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N45.2G，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，与包含在N45.2氨基酸中没有突变的基于IgA2的恒定区的抗体构建体相比，包含基于IgA2的恒定区的抗体构建体具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含P124的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含P124的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含P124R，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，与包含在P124氨基酸中没有突变的基于IgA2的恒定区的抗体构建体相比，包含基于IgA2的恒定区的抗体构建体具有增加的循环半衰期。在一些实施方案中，与包含在P124氨基酸中没有突变的基于IgA2的恒定区的抗体构建体相比，包含基于IgA2的恒定区的抗体构建体具有增加的稳定性。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含C92的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含C92的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含C92S，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，与在C92氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比，包含基于IgA2的恒定区的抗体构建体具有降低的聚集。在一些实施方案中，与在C92氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比，包含基于IgA2的恒定区的抗体构建体与血清蛋白具有降低的聚集。在一些实施方案中，与在C92氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比，抗体构建体在体外或体内具有降低的聚集。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N120的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N120的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含N120T，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，该IgA2抗体与在N120氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含I121的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含I121的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含I121L，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，该IgA2抗体与在N338氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含T122的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含T122的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含T122S，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，该IgA2抗体与在N339氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含C147的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含C147的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸C147的缺失，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，该IgA2抗体与在C147氨基酸中没有突变的IgA2抗体相比具有降低的聚集。
在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含Y148的突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含Y148的非保守突变，根据IMGT方案编号。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含氨基酸Y148的缺失，根据IMGT方案编号。
在一些实施方案中，IgA抗体包含一个或多个白蛋白结合域。在一些实施方案中，一个或多个白蛋白结合域与IgA恒定区的轻链或重链融合。在一些实施方案中，一个或多个白蛋白结合域与IgA恒定区的重链融合。在一些实施方案中，将一个或多个白蛋白结合域融合至IgA恒定区的重链的CH3区域的C-末端区域。在一些实施方案中，该IgA2抗体与不包含一个或多个白蛋白结合域的IgA2抗体相比具有增加的循环半衰期。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含一个或多个白蛋白结合域，并且循环半衰期在相应IgG抗体的1％、5％或10％之内。在一些实施方案中，抗体构建体包含基于IgA2的恒定区，该恒定区包含一个或多个白蛋白结合域，并且循环半衰期大于相应IgG抗体的循环半衰期。
在一些实施方案中，IgA抗体包含一个或多个在Lohse S等人，Cancer Res.2015；76(2)：403-17；Meyer S等人，mAbs.2016；8(1)：87-98；或Leusen J.等人，MolecularImmunology，2015；68：35-39中描述的突变。
在一些实施方案中，与参考IgA序列相比的一个或多个突变或缺失导致抗体构建体的循环半衰期增加或降低。在一些实施方案中，一个或多个突变或缺失导致抗体构建体的循环半衰期增加。例如，在人类中，一个或多个突变可使抗体构建体的血清半衰期延长至多达21天或更长。此外，在小鼠中，一个或多个突变可使抗体构建体的血清半衰期延长至多达9天或更长。在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期增加到与免疫球蛋白G(IgG)分子相当的水平。在一些实施方案中，一个或多个突变或缺失导致抗体构建体的循环半衰期降低。
在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期延长至少约7天至约30天或更长。在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期延长至少约7天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期延长至多约30天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期延长约7天至约8天、约7天至约9天、约7天至约10天、约7天至约15天、约7天至约20天、约7天至约25天、约7天至约30天、约8天至约9天、约8天至约10天、约8天至约15天、约8天至约20天、约8天至约25天、约8天至约30天、约9天至约10天、约9天至约15天、约9天至约20天、约9天至约25天、约9天至约30天、约10天至约15天、约10天至约20天、约10天至约25天、约10天至约30天、约15天至约20天、约15天至约25天、约15天至约30天、约20天至约25天、约20天至约30天或约25天至约30天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以使抗体构建体的血清半衰期延长约7天、约8天、约9天、约10天、约15天、约20天、约25天或约30天。
在一些实施方案中，抗体构建体表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，与不包含一个或多个突变和/或一个或多个缺失的相应IgA抗体相比，一个或多个突变和/或一个或多个缺失导致抗体构建体的稳定性增加。
在一些实施方案中，抗体构建体表现出降低的聚集。抗体聚集是物理不稳定的更常见表现。由于表位的多样性和/或构象变化，蛋白质聚集体通常具有降低的活性，更重要的是具有更大的免疫原性。已知免疫球蛋白聚集体会导致严重的肾衰竭和过敏样反应，诸如头痛、发烧和发冷。因此，减少抗体治疗剂中的聚集是有利的。此外，根据世界卫生组织(WHO)标准，商业静脉注射免疫球蛋白产品的聚集水平限定为低于5％。在一些实施方案中，一个或多个突变导致降低的聚集。在一些实施方案中，与不包含一个或多个突变和/或一个或多个缺失的相应IgA抗体相比，一个或多个突变和/或一个或多个缺失导致抗体构建体的聚集减少。
在一些实施方案中，本文提供的抗体构建体具有至少约0.1％至至多约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的抗体构建体具有至少约0.1％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的抗体构建体具有至多约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的抗体构建体具有约0.1％至约0.5％、约0.1％至约1％、约0.1％至约2％、约0.1％至约3％、约0.1％至约4％、约0.1％至约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、约2％至约3％、约2％至约4％、约2％至约5％、约3％至约4％、约3％至约5％或约4％至约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的抗体构建体具有约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的聚集水平。
本文公开的治疗性抗体可包含合成氨基酸代替一种或多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基赖氨酸、
N',N'-二苄基赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
CD47和SIRPα
信号调节蛋白α(SIRP-α)是在髓样细胞膜上广泛表达的蛋白。SIRP-α与CD47(分化簇47)相互作用，CD47是一种在体内许多细胞类型中广泛表达的蛋白质。SIRP-α与CD47的相互作用可防止“自身”细胞被吞噬，否则该细胞会被免疫系统识别。已经观察到，在急性髓样白血病和几种实体瘤癌症中，肿瘤细胞上高CD47表达可作为生存的阴性预后因素。侧重破坏CD47和SIRP-α之间相互作用的策略，诸如施用可掩盖CD47或SIRP-α的药物可能是潜在的抗癌疗法。
此外，抑制性受体信号调节蛋白α(SIRPα)或其配体CD47的检查点抑制已被证明在结合IgG1抗癌疗法的临床前模型中非常有效，并且这些CD47-SIRPa相互作用阻断剂中的某些已经在血液学和实体癌的临床试验中进行了测试(www.clinicaltrials.gov标识符：NCT02216409；NCT02678338、NCT02641002；NCT02367196、NCT02890368；NCT02663518、NCT02953509)。SIRPα或多或少选择性地存在于髓样细胞上，并分别通过巨噬细胞和嗜中性粒细胞限制ADCP/ADCC。它普遍表达的配体CD47充当“不要吃我”的信号，并且经常发现在癌细胞上过表达，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用和清除作用。实际上，在临床环境中，已发现癌细胞上CD47的表达水平与对抗癌抗体治疗的临床反应呈负相关。在一些临床前模型中，与靶向不同肿瘤抗原的IgG mAb(包括西妥昔单抗和曲妥珠单抗)结合使用时，CD47-SIRPα阻断已被证明是增强癌症免疫治疗的有希望的靶标。但是，对于针对特定肿瘤抗原的IgA抗体，尚未研究其他CD47-SIRPα检查点抑制的这种增强作用。由于CD47在人细胞中普遍表达，因此广泛抑制CD47可能会呈现不良影响的风险。因此，期望在癌细胞上有效、局部地靶向CD47。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂与CD47具有低亲和力结合；因此，阻止了与癌细胞以外的细胞的不需要的结合。在本文所述的构建体的某些实施方案中，CD47的这种低亲和力结合与对抗原结合细胞上表达的抗原的高亲和力结合相结合，以允许抗原结合决定构建体的细胞特异性。
本文提供了包含IgA恒定区结构域的治疗剂，其中所述治疗剂结合CD47和另外的肿瘤相关抗原，如图1所示。本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗剂量的本文公开的治疗剂。本文还提供了包含本文公开的治疗剂和药学上可接受的载体的药物组合物。
治疗剂
提供了包含本文所述的抗体构建体的治疗剂。
本文描述的实施方案是本文所述的抗体构建体充当免疫效应细胞接合分子。此类免疫效应细胞接合物包含基于本文所述的IgA构建体的免疫球蛋白A(IgA)重链结构域、本文所述的CD47结合域以及在抗原呈递细胞上表达的抗原结合域；其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR从而与所述免疫效应细胞结合，其中所述抗原结合域结合靶抗原呈递细胞上的抗原，其中所述CD47结合结构域抑制靶抗原呈递细胞上表达的CD47与免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，从而允许免疫效应细胞破坏抗原呈递细胞，并且其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力，从而选择性地结合抗原呈递细胞。
一些实施方案中是诱导嗜中性粒细胞介导的对靶抗原呈递细胞的免疫应答的方法，其包含：使所述靶细胞与有效量的抗体构建体接触，其中所述抗体构建体包含免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；CD47结合域以及抗原结合域；
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，其中所述IgA重链结构域特异性结合嗜中性粒细胞上的FcαR从而将所述嗜中性粒细胞募集到靶细胞，其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述嗜中性粒细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，从而促进嗜中性粒细胞对靶细胞的杀伤，并且其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力，从而诱导所述嗜中性粒细胞介导的免疫应答，从而选择性地结合抗原呈递靶细胞。
在一些情况下，靶细胞是呈递肿瘤抗原的癌细胞。在癌症中，有四类常见的肿瘤抗原：(i)对于任何这种类型的病毒肿瘤可以是相同的病毒肿瘤抗原，(ii)对于患者和肿瘤可以是特异性的致癌肿瘤抗原，(iii)在所有个体类型的肿瘤中可以是不同的，但是在由相同病毒引起的不同肿瘤中可以是相同的移植类型的异抗原或肿瘤特异性移植抗原；以及(iv)胚胎抗原。作为发现肿瘤抗原的结果，肿瘤抗原在可以特异性靶向癌症的新的癌症治疗方法的开发中变得重要。这导致针对这些肿瘤抗原的抗体的发展。除了开发用于癌症治疗的针对肿瘤抗原的抗体外，还开发了靶向免疫细胞以增强免疫应答的抗体。
在某些实施方案中，本文公开了包含IgA恒定区的治疗剂。在一些情况下，治疗剂是IgA抗体。IgA恒定区可以是IgA1恒定区。IgA恒定区可以是IgA2恒定区。例如，治疗剂可以是IgA1抗体或IgA2抗体。在一些实施方案中，治疗剂不结合B细胞、T细胞、血小板和/或红细胞。例如，治疗剂具有低免疫原性。
治疗剂可以是双特异性或多特异性抗体。在一些情况下，治疗剂在细胞表面共结合两种抗原。治疗剂可以共结合两种不同的抗原。在一些实例中，治疗剂与两种不同抗原的结合是顺序的。例如，治疗剂与第一抗原的结合首先发生，从而限制了二抗臂探索的空间。因此，第二抗原的局部浓度可以显著增加，这可促进二抗臂的结合。
在一些实施方案中，与结合抗原相比，治疗剂以低亲和力结合CD47。在一些情况下，治疗剂减少癌细胞的CD47结合。例如，治疗剂可抑制人CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用。此外，抑制人CD47和SIRPα之间的相互作用可增加治疗剂的治疗潜力。抑制人CD47和SIRPα之间的相互作用可增加吞噬作用和肿瘤部位癌细胞的清除率。例如，癌细胞可以是IgA调理的癌细胞。治疗剂可以是包含低亲和力CD47臂的IgA双特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的治疗剂对CD47具有低亲和力结合，这阻止了治疗剂与除癌细胞之外的细胞上的CD47结合。在一些情况下，本文所述的治疗剂的低亲和力CD47臂与表达CD47的肿瘤细胞结合。在一些实例中，本文所述的治疗剂的低亲和力CD47臂不与不是肿瘤细胞的表达CD47的细胞结合。治疗剂可以是破坏CD47-SIRPα信号的IgA双特异性抗体。在一些实例中，治疗剂包含与相应的野生型CD47结合抗体相比以较低的结合亲和力(Kd)结合CD47的衰减CD47结合域。
在一些实施方案中，治疗剂以至少约0.01微摩尔(μM)至约999μM或更高的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以至少约0.01μM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以至多约999μM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以约0.01μM至约0.1μM、约0.01μM至约0.5μM、约0.01μM至约1μM、约0.01μM至约5μM、约0.01μM至约10μM、约0.01μM至约50μM、约0.01μM至约100μM、约0.01μM至约200μM、约0.01μM至约300μM、约0.01μM至约500μM、约0.01μM至约999μM、约0.1μM至约0.5μM、约0.1μM至约1μM、约0.1μM至约5μM、约0.1μM至约10μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约200μM、约0.1μM至约300μM、约0.1μM至约500μM、约0.1μM至约999μM、约0.5μM至约1μM、约0.5μM至约5μM、约0.5μM至约10μM、约0.5μM至约50μM、约0.5μM至约100μM、约0.5μM至约200μM、约0.5μM至约300μM、约0.5μM至约500μM、约0.5μM至约999μM、约1μM至约5μM、约1μM至约10μM、约1μM至约50μM、约1μM至约100μM、约1μM至约200μM、约1μM至约300μM、约1μM至约500μM、约1μM至约999μM、约5μM至约10μM、约5μM至约50μM、约5μM至约100μM、约5μM至约200μM、约5μM至约300μM、约5μM至约500μM、约5μM至约999μM、约10μM至约50μM、约10μM至约100μM、约10μM至约200μM、约10μM至约300μM、约10μM至约500μM、约10μM至约999μM、约50μM至约100μM、约50μM至约200μM、约50μM至约300μM、约50μM至约500μM、约50μM至约999μM、约100μM至约200μM、约100μM至约300μM、约100μM至约500μM、约100μM至约999μM、约200μM至约300μM、约200μM至约500μM、约200μM至约999μM、约300μM至约500μM、约300μM至约999μM或约500μM至约999μM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以约0.01μM、约0.1μM、约0.5μM、约1μM、约5μM、约10μM、约50μM、约100μM、约200μM、约300μM、约500μM或约999μM的结合亲和力(Kd)结合CD47。
本文所述的构建体可包含来自已知或重新产生的靶向CD47的抗体或分子的任何CD47结合域。这些CD47结合区可按原样掺入本文所述的构建体中，或者可以在掺入本文所述的构建体之前进一步使其减弱以降低CD47的结合强度。下表A中提供了可用于CD47靶向的抗体的示例性CDR区。
表A：示例性的人类CD47结合重链和轻链CDR。
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
CD47 NYNMH TIYPGNDDTSYNQKFK GGYRAMDY RSSQSIVYSNGNTYLG KVSNRFS FQGSHVPYT
CD47 GYGMS TITSGGTYTYYPDSVKG SLAGNAMDY RASQTISDYLH FASQSIS QNGHGFPRT
CD47 GYTFTNYWIH YTDPRTDYTEYNQKFK GGRVGLGY RSSQNIVQSNGNTYLE KVFHRFS FQGSHVPYT
CD47 GYTFTNYVIH YIYPYNDGILYNEKFKG GGYYVPDY RSRQSIVHTNGNTYLG KVSNRFS FQGSHVPYT
CD47 GYSFTNYYIH YIDPLNGDTTYNQKFKG GGKRAMDY RASQDISNYLN YTSRLYS QQGNTLPWT
CD47 GYTFTNHV IYPYNDGT ARGGYYTYDD QSLVHSNGKTY KVS SQSTHVPYT
在一些实施方案中，治疗剂以约1mM至约1,000毫摩尔(mM)的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以至少约1mM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以至多约1,000mM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以约1mM至约5mM、约1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM至约100mM、约1mM至约200mM、约1mM至约300mM、约1mM至约400mM、约1mM至约500mM、约1mM至约600mM、约1mM至约800mM、约1mM至约1,000mM、约5mM至约10mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM、约5mM至约300mM、约5mM至约400mM、约5mM至约500mM、约5mM至约600mM、约5mM至约800mM、约5mM至约1,000mM、约10mM至约50mM、约10mM至约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约400mM、约10mM至约500mM、约10mM至约600mM、约10mM至约800mM、约10mM至约1,000mM、约50mM至约100mM、约50mM至约200mM、约50mM至约300mM、约50mM至约400mM、约50mM至约500mM、约50mM至约600mM、约50mM至约800mM、约50mM至约1,000mM、约100mM至约200mM、约100mM至约300mM、约100mM至约400mM、约100mM至约500mM、约100mM至约600mM、约100mM至约800mM、约100mM至约1,000mM、约200mM至约300mM、约200mM至约400mM、约200mM至约500mM、约200mM至约600mM、约200mM至约800mM、约200mM至约1,000mM、约300mM至约400mM、约300mM至约500mM、约300mM至约600mM、约300mM至约800mM、约300mM至约1,000mM、约400mM至约500mM、约400mM至约600mM、约400mM至约800mM、约400mM至约1,000mM、约500mM至约600mM、约500mM至约800mM、约500mM至约1,000mM、约600mM至约800mM、约600mM至约1,000mM或约800mM至约1,000mM的结合亲和力(Kd)结合CD47。在一些实施方案中，治疗剂以约1mM、约5mM、约10mM、约50mM、约100mM、约200mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约800mM或约1,000mM的结合亲和力(Kd)结合CD47。
在一些情况下，治疗剂结合肿瘤相关抗原。治疗剂可以是包含高亲和力肿瘤相关抗原臂的IgA双特异性抗体。肿瘤相关抗原可以是CD20。肿瘤相关抗原可以是GD2。肿瘤相关抗原可以是间皮素。肿瘤相关抗原可以选自GD2、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1和CD25。肿瘤相关抗原可以是CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123、VEGF-R2或其任何组合。
本文所述的构建体可包含来自已知或重新产生的抗原靶向抗体或分子的任何抗原结合域。下表B提供了可用于抗原靶向的抗体的示例性CDR区。本领域技术人员将知道利用来自已知来源的合适的抗原结合域来适当地靶向抗原呈递细胞。
表B：示例性的抗原结合重链和轻链CDR。
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
CD20 GYAFSYSW IFPGDGDT ARNVFDGYWLVY KSLLHSNGITY QMS AQNLELPYT
CD20 GYTFTSYN IYPGNGDT ARSTYYGGDWYFNV SSVSY ATS QQWTSNPPT
CD20 GFTFNDYA ISWNSGSI AKDIQYGNYYYGMDV QSVSSY DA QRSNWPIT
CD20 GYAFSYSW IFPGDGDT ARNVFDGYWLVY KSLLHSNGITY QMS AQNLELPYT
CD20 GYTFTSYN IYPGNGDT ARSTYYGGDWYFNV SSVSY ATS QQWTSNPPT
CD20 GFTFNDYA ISWNSGSI AKDIQYGNYYYGMDV QSVSSY DA QRSNWPIT
HER2 GFNIKDTY IYPTNGYT SRWGGDGFYAMDY QDVNTA SAS QQHYTTPPT
HER2 GFTFTDYT VNPNSGGS ARNLGPSFYFDYW QDVSIG SA QQYYIYPYT
HER2 GFNIKDTY IYPTNGYT SRWGGDGFYAMDY QDVNTA SAS QQHYTTPPT
EGFR GFSLTNYG IWSGGNT ARALTYYDYEFAY QSIGTN YAS QQNNNWPTT
EGFR GGSVSSGDYY IYYSGNT VRDRVTGAFDI QDISNY DAS QHFDHLPLA
EGFR GGSISSGDYY IYYSGST ARVSIFGVGTFDY QSVSSY DAS HQYGSTPLT
间皮素 GYSFTGYT ITPYNGAS ARGGYDGRGFDY SSVSY DTS QQWSKHPLT
GD-2 GSSFTGYN IDPYYGGT VSGMEY QSLVHRNGNTY KVS SQSTHVPPLT
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂结合CD20。CD20是33-37kD，几乎在所有正常B细胞和恶性B细胞的表面表达的非糖基化磷蛋白。CD20敲除小鼠表现出几乎正常的表型，表明高水平的冗余。最近，据报道人类CD20缺乏导致T细胞非依赖性抗体应答受损。已经假定CD20起钙通道的作用，并且也存在于脂筏中，即细胞膜中富含胆固醇的微结构域中。CD20跨膜4次，并具有细胞内C-末端和N-末端。CD20的两个区域位于细胞外，形成一个小环和一个大环。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂结合HER2。HER2/neu(人类表皮生长因子受体2/受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2)是人类表皮生长因子家族的一部分。可以证明该蛋白的过表达在癌症例如乳腺癌的进展中起重要作用。HER2/neu蛋白可充当受体酪氨酸激酶，并在与结合伴侣二聚化后自磷酸化。HER2/neu可以激活几种信号通路，包括例如分裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶、磷脂酶C、蛋白激酶C以及信号转导和转录激活因子(STAT)。可以靶向和抑制HER2/neu的抗体的实例可包括曲妥珠单抗和培妥珠单抗。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂结合EGFR。EGFR(表皮生长因子受体)编码人表皮生长因子家族的成员。可导致EGFR过表达或活性过度的突变可能与多种癌症(包括鳞状细胞癌和胶质母细胞瘤)有关。EGFR可作为受体酪氨酸激酶发挥作用，配体结合可触发与结合伴侣的二聚化和自磷酸化。然后，磷酸化的EGFR可以激活几个下游信号传导途径，包括分裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶、磷脂酶Cy、蛋白激酶C以及信号转导和转录激活因子(STAT)。可靶向和抑制EGFR的抗体的实例可包括西妥昔单抗、帕尼单抗(panutumumab)、尼妥珠单抗和扎芦木单抗。EGFR的一种突变变体是EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)。EGFRvIII可能是EGFR基因重排的结果，其中胞外域的外显子2-7缺失。该突变可导致突变受体不能与任何已知配体结合。产生的受体可参与组成型低水平信号传导，并且可与肿瘤进展有关。可靶向EGFRvIII的抗体的实例可以包括AMG595和ABT806。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂结合间皮素。间皮素最初被描述为被K1单克隆抗体识别的抗原，该抗原是在用OVCAR-3人卵巢癌细胞系免疫小鼠后产生的。然后在1996年克隆了间皮素基因。间皮素cDNA包含1884-bp的开放阅读框，并编码69-kDa的前体蛋白(628个氨基酸)。糖基化后，前体在氨基酸288-293处被弗林蛋白酶(furin)切割，产生40-kDa蛋白和从细胞中释放出来的较小的32-kDa片段。这种32kDa脱落的片段称为巨核细胞促进因子(MPF)。40-kDa蛋白在细胞表面被发现并可用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C处理后释放。这种40kDa GPI连接的膜结合蛋白被称为间皮素，因为它是由正常的间皮细胞产生的。由于恶性间皮瘤和卵巢腺癌均来自正常的间皮细胞，因此间皮素与这些恶性疾病相关也就不足为奇了。
间皮素的最常见形式是膜结合的，但发现了两种变体：具有8个氨基酸插入的变体1也是膜结合的。由于缺乏GPI锚定信号序列，因此变体2脱落且可溶。可溶性间皮素蛋白可在卵巢癌患者血清中检测到，可为卵巢癌的诊断和/或监测其与CA125(癌症抗原-125)一起对治疗的反应提供有用的新标记。此外，间皮瘤患者血液和渗出液中可溶性间皮素升高，确定这些液体中的间皮素水平已被美国FDA批准主要用作监测患者反应和进展的工具。
间皮素疑似通过与用于诊断卵巢癌的肿瘤抗原CA125相互作用，在细胞粘附和肿瘤转移中发挥作用。CA125也被称为MUC16。CA125/MUC16是在许多上皮细胞表面表达的I型跨膜蛋白，其可溶性形式可释放到细胞外空间。此外，间皮素与CA125/MUC16的结合通过MMP-7激活促进胰腺癌细胞的运动和侵袭。
间皮素被认为是一种分化抗原，因为其在正常组织中的表达仅限于间皮，但间皮素在多种肿瘤中大量表达，包括间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和肺癌。间皮素可通过免疫组织化学方法在胸膜、心包和腹膜表面的正常间皮细胞上检测到，但在任何重要器官中未检测到。它经常在许多上皮癌中高表达。间皮素在肿瘤中的差异过表达及其在细胞粘附和肿瘤转移中的作用使间皮素成为癌症治疗的合适靶标。
在一些实施方案中，本文所述的治疗剂的抗原结合部分特异于或结合GD2、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2。在一些实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，该单链抗体片段包含靶抗原特异性单克隆抗体的可变结构域轻链(VL)和可变结构域重链(VH)，所述可变结构域轻链和可变结构域重链通过柔性接头诸如甘氨酸-丝氨酸接头或Whitlow接头连接。在实施方案中，scFv是人源化的。在一些实施方案中，治疗剂包含可变域抗体。在一些实施方案中，治疗剂包含来自人、人源化或任何其他非人源IgG抗体的可变域。在一些实施方案中，抗原结合部分可以包含例如从N到C末端、VH-接头-VL或VL-接头-VH定向连接的VH和VL。在一些情况下，抗原结合域识别靶标的表位。
在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD20是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD19是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD38是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对PD-L1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD25是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD33是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对BCMA是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD44是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对α-叶酸受体是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CAIX是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD30是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对ROR1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CEA是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对EGP-2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对EGP-40是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对HER2是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对HER3是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对叶酸结合蛋白是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对GD2是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对GD3是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对IL-13R-a2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对KDR是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对EDB-F是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对间皮素是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD22是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对EGFR是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对MUC-1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对MUC-16是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对MAGE-A1是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对h5T4是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对PSMA是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对TAG-72是特异性的。在又一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对EGFRvIII是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对CD123是特异性的。在又一个实施方案中，本文描述的治疗剂的抗原结合部分对VEGF-R2是特异性的。
作为治疗性单克隆抗体，未改变的IgA具有相对较短的半衰期。这可能是由于体内缺乏与新生儿Fc受体(FcRn)的结合以及重组生产系统中低水平的唾液酸化作用的组合。FcRn受体在维持抗体半衰期中具有确定的作用，并且抗体分子与FcRn的结合减少转化为更短的血清半衰期。此外，IgA比IgG的糖基化程度更高，因此将唾液酸转移为新生寡糖的酶(唾液酸转移酶)受到限制。在体内，无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)比IgG清除IgA的速度更快，因为其唾液酸化水平较低。开发具有延长的血清半衰期的抗体治疗剂是有需要的，其原因有多种，包括但不限于由于血流中的持续循环和改善的施用而改善的治疗效果。
本文提供了包含一个或多个导致药代动力学改善的突变的治疗剂(Lohse S等人，Cancer Res，2016；76(2)：403-17；Meyer S等人，mAbs，2016；8(1)：87-98)。本文提供了包含一个或多个导致药代动力学改善的白蛋白结合域的治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂包含一个或多个突变。该突变可以是保守突变。该突变可以是非保守突变。在一些实施方案中，治疗剂包含一个或多个缺失。在一些实施方案中，治疗剂包含一个或多个白蛋白结合域。突变或缺失可以在IgA恒定区中发现。或者，可以在IgA可变区中发现一个或多个突变和/或一个或多个缺失。一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期增加到与免疫球蛋白G(IgG)分子相当的水平。例如，在人类中，一个或多个突变可将治疗剂的血清半衰期延长至多达21天或更长。此外，在小鼠中，一个或多个突变可将治疗剂的血清半衰期延长至多达9天或更长。
在一些实施方案中，一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期延长至少约7天至约30天或更长。在一些实施方案中，一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期延长至少约7天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期延长至多约30天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期延长约7天至约8天、约7天至约9天、约7天至约10天、约7天至约15天、约7天至约20天、约7天至约25天、约7天至约30天、约8天至约9天、约8天至约10天、约8天至约15天、约8天至约20天、约8天至约25天、约8天至约30天、约9天至约10天、约9天至约15天、约9天至约20天、约9天至约25天、约9天至约30天、约10天至约15天、约10天至约20天、约10天至约25天、约10天至约30天、约15天至约20天、约15天至约25天、约15天至约30天、约20天至约25天、约20天至约30天或约25天至约30天。在一些实施方案中，一个或多个突变可以将治疗剂的血清半衰期延长约7天、约8天、约9天、约10天、约15天、约20天、约25天或约30天。
在一些实施方案中，IgA恒定区在位置166处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可包括用甘氨酸或甘氨酸同源物代替位置166处的天冬酰胺。在一些情况下，位置166处的氨基酸置换延长了治疗剂的血清半衰期，其等于或大于用甘氨酸置换的血清半衰期。该治疗剂的半衰期可比位置166处包含天冬酰胺的相应治疗剂更长。
在一些情况下，IgA恒定区在位置337处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可包括用苏氨酸或苏氨酸同源物代替位置337处的天冬酰胺。在一些实施方案中，位置337处的氨基酸置换延长了治疗剂的血清半衰期，其等于或大于用天冬酰胺置换的血清半衰期。在一些实施方案中，该治疗剂的半衰期比位置337处包含天冬酰胺的相应治疗剂更长。
在一些实施方案中，IgA恒定区在位置338处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可以包括用亮氨酸或亮氨酸同源物代替位置338处的异亮氨酸。在一定情况下，位置338处的氨基酸置换延长了所述治疗剂的血清半衰期，其等于或大于用异亮氨酸置换的血清半衰期。在一些实例中，该治疗剂的半衰期比位置338处包含异亮氨酸的相应治疗剂更长。
在一些实施方案中，IgA恒定区在位置339处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可以包括用丝氨酸或丝氨酸同源物代替位置339处的苏氨酸。在一些情况下，该治疗剂的半衰期比位置339处包含苏氨酸的相应治疗剂更长。
在某些实施方案中，IgA恒定区缺乏一个或多个糖基化位点。在一些情况下，IgA恒定区包含一个或多个白蛋白结合域。在一些情况下，一个或多个白蛋白结合域与所述IgA恒定区的轻链或重链融合。在一些实施方案中，一个或多个白蛋白结合域延长治疗剂的血清半衰期。在一些情况下，该治疗剂的半衰期比不包含一个或多个白蛋白结合域的相应治疗剂更长。
需要开发具有增加的稳定性的抗体治疗剂，因为这可延长治疗剂的保存期，同时保持治疗剂的活性不变。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有与IgG分子相同或更好的稳定性。在一些情况下，通过引入突变来改善治疗剂的稳定性。在一些实施方案中，IgA恒定区在位置221处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可以包括用精氨酸或精氨酸同源物代替位置221处的脯氨酸。在一些实例中，氨基酸替代物比在位置221处包含脯氨酸的相应治疗剂具有更高的所述治疗剂的稳定性。
人抗体的另一个固有的生物物理特性是聚集的倾向。抗体聚集是物理不稳定的更常见表现。由于表位的多样性和/或构象变化，蛋白质聚集体通常具有降低的活性，更重要的是具有更大的免疫原性潜力。已知免疫球蛋白聚集体会导致严重的肾衰竭和过敏样反应，诸如头痛、发烧和发冷。因此，减少抗体治疗剂中的聚集是有利的。此外，根据世界卫生组织(WHO)标准，商业静脉注射免疫球蛋白产品的聚集体含量限制在低于5％。
本文提供了包含减少的聚集的治疗剂。在一些实施方案中，与IgG分子相比，本文提供的治疗剂具有降低的聚集。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有与IgG分子相同或更好的聚集倾向。在一些情况下，通过引入突变来改善治疗剂聚集的倾向。在一些实施方案中，IgA恒定区在位置311处包含突变。该突变可以是非保守突变。例如，该突变可以包括用丝氨酸或丝氨酸同源物代替位置311处的半胱氨酸。在一些实例中，治疗剂比在位置311处包含半胱氨酸的相应治疗剂具有降低的聚集。
在一些情况下，通过引入缺失来改善治疗剂聚集的倾向。在一些情况下，IgA恒定区在位置417处含有缺失。在一些情况下，在位置471处的半胱氨酸的缺失可降低治疗剂聚集的倾向。在一些实例中，该治疗剂比在位置471处不包含缺失的相应治疗剂具有降低的聚集。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有至少约0.1％至至多约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有至少约0.1％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有至多约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有约0.1％至约0.5％、约0.1％至约1％、约0.1％至约2％、约0.1％至约3％、约0.1％至约4％、约0.1％至约5％、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％、约2％至约3％、约2％至约4％、约2％至约5％、约3％至约4％、约3％至约5％或约4％至约5％的聚集水平。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂具有约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的聚集水平。
本文公开的治疗剂可包含合成氨基酸代替一种或多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基赖氨酸、N',N'-二苄基赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
“多特异性抗体”是能够同时结合至少两种具有不同结构的靶标(例如两种不同的抗原、相同抗原上的两个不同表位或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两种具有相同或不同结构的靶标的抗体。化合价指示抗体对单个抗原或表位具有多少结合臂或位点；即单价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着它可以利用与抗原结合的多种相互作用，从而增加与抗原结合的亲和力。特异性表示抗体能够结合多少抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体例如IgA是二价的，因为它具有两种结合臂，但是它是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性、多价抗体是具有超过一个具有不同特异性的结合区的构建体。例如，本文公开的双特异性抗体构建体具有CD47结合区和抗原结合区。
“双特异性抗体”是可以同时结合两种具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有至少一个与例如CD47特异性结合的臂，以及至少一个与由疾病细胞、组织、器官或病原体产生或与之相关的抗原(例如肿瘤相关抗原)特异性结合的其他臂。使用分子工程技术可生产多种双特异性抗体。
如果所施用的量在生理上是显著的，则称以“治疗有效量”来施用本文所述的双特异性抗体构建体或组合物。如果一种试剂的存在导致受体受试者的生理学发生可检测的变化，则该试剂在生理上是显著的。在特定实施方案中，如果本文公开的双特异性抗体构建体的存在引起抗肿瘤反应或减轻感染性疾病状态的体征和症状，则该双特异性抗体构建体在生理上是显著的。在生理上显著的作用也可能是在受体受试者中引发体液和/或细胞免疫应答，导致靶细胞的生长抑制或死亡。
术语“接头”用于表示包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基并且用于连接一个或多个抗原结合部分或可变域的多肽。这样的接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger，P等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J等人，(1994)Structure2：1121-1123)。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
“Fv”或“Fv片段”仅由免疫球蛋白的“单臂”的轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)组成。因此，“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。“双链”Fv片段由紧密的、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。单链Fv种类(scFv)包括免疫球蛋白的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中，其中它们通过连接肽彼此共价连接。通常，在scFv片段中，轻链和重链的可变域以类似于双链Fv种类中的二聚体结构缔合。在单链Fv片段中，可以具有排列在单个多肽链的N-末端的轻链可变域，随后是接头和排列在多肽链的C-末端的重链可变域，或者反之亦然，具有排列在N-末端的重链可变域，排列在C-末端的轻链可变域，且连接肽位于其间。连接肽可以是本领域已知的任何柔性接头，例如由甘氨酸和丝氨酸残基制成。还可以通过将二硫键引入保守的框架区来额外稳定VH和VL结构域之间的结构域缔合(参见Reiter等人，Stabilization of the Fvfragments in recombinant immunotoxins by disulfide bonds engineered intoconserved framework regions，Biochemistry 1994，33，6551-5459)。这种scFv片段也称为二硫键稳定的scFv片段(ds-scFv)。
结合至CD47
结合CD47及其片段的双特异性抗体构建体用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD47的功能活性。举非限制性实例而言，CD47的功能活性包括与SIRPα的相互作用。当存在抗体时的CD47-SIRPα相互作用水平与不存在与本文所述双特异性抗体结合时的CD47-SIRPα相互作用水平相比降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为抗体完全调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD47-SIRPα相互作用。当存在抗体时的CD47-SIRPα相互作用水平与不存在与本文所述双特异性抗体结合时的CD47-SIRPα相互作用水平相比降低小于95％，例如，10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为双特异性抗体部分调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD47-SIRPα相互作用。
本公开内容提供了抗体构建体，其中一个结合区对CD47是特异性的，而另一个结合区对抗原(例如，肿瘤抗原，诸如CD20)是特异性的。在一些实施方案中，所述构建体包括能够结合嗜中性粒细胞上的Fc受体的功能性IgA Fc部分。双特异性抗体的抗原结合区将CD47结合区靶向抗原呈递细胞。IgA Fc部分结合嗜中性粒细胞。CD47臂阻断、抑制或以其他方式减少CD47与SIRPα之间的相互作用，从而诱导嗜中性粒细胞介导的对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，双特异性抗体的抗原结合区包括抗CD20抗体序列或其抗原结合片段。如本文中其他地方所述，用于本文构建体中的抗原结合区可靶向任何抗原。这样的抗原结合区也可从已知抗体中获得，例如，如表B所示。
在一些实施方案中，双特异性构建体中抗原结合区的亲和力增加。在一些实施方案中，双特异性构建体中CD47结合区的亲和力降低。例如，在双特异性抗体中，抗原结合区的亲和力增加，且CD47结合区的亲和力降低。抗原结合区和CD47结合区的结合亲和力的这些差异使得例如可以提高对靶细胞或靶细胞群的选择性。用于本文构建体中的CD47结合区可重新设计，或也可从已知抗体获得，例如如表A所示。
在一些实施方案中，抗原结合区的亲和力增加至少约：2、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，增加是相对于单特异性抗原结合抗体而言的。在一些实施方案中，增加是相对于双特异性抗体中CD47结合区对CD47的结合亲和力而言的。在一些实施方案中，CD47结合区的亲和力降低至少约：2、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，减少是相对于单特异性CD47结合抗体而言的。在一些实施方案中，减少是相对于双特异性抗体中抗原结合区对抗原的结合亲和力而言的。
制备抗体的方法
通用抗体技术
制备针对几乎任何靶抗原的单克隆抗体的技术是本领域众所周知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)和Coligan等人(编著)，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简而言之，单克隆抗体可通过如下获得：向小鼠注射包含抗原的组合物，去除脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物中分离抗体。
可以通过多种完善的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这样的分离技术包括使用蛋白A琼脂糖的亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。例如，参见第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页的Coligan。另外，参见METHODS IN MOLECULARBIOLOGY第10卷，第79-104页(The Humana Press,Inc.1992)中的Baines等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG)”。
在最初产生针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序，然后通过重组技术制备抗体。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化是本领域技术人员众所周知的。使用源自人源化、嵌合或人抗体的抗体组分消除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体是重组蛋白，其中人抗体的可变区已被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替换。当施用于受试者时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。克隆鼠类免疫球蛋白可变域的通用技术公开于例如Orlandi等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.美国86：3833(1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。例如，Leung等人Hybridoma 13：469(1994)，通过将编码鼠LL2的Vκ和VH结构域的DNA序列(一种抗CD22单克隆抗体)与相应的人κ和IgG1恒定区结构域相结合，产生了LL2嵌合体。
人源化抗体
产生人源化单克隆抗体的技术是本领域众所周知的(参见例如Jones等人，Nature321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.美国89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。可以通过将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移到人抗体相应的可变域中来使嵌合或鼠类单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也被人FR序列置换。由于简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常会导致抗体亲和力降低甚至丧失，因此可能需要进行其他修饰才能恢复鼠抗体的原始亲和力。这可通过用其鼠对应物替换FR区中的一个或多个人残基来实现以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体。参见例如Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。通常，与鼠对应物不同并且靠近或接触一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将是用于置换的候选物。
人抗体
使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等人，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。也可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建完整的人抗体，所有这些都是本领域已知的。参见例如，McCafferty等人，Nature348：552-553(1990)。与嵌合或人源化抗体相比，预期此类完全人抗体表现出甚至更少的副作用，并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在一些实施方案中，要求保护的方法和程序可以利用通过这种技术产生的人抗体。
在一种替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可从正常人或表现出特定疾病状态(诸如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)。从患病个体构建人抗体的优点是循环抗体库可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人，(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，总RNA获自循环血淋巴细胞(同上)。从μ、γ和κ链抗体库中克隆重组Fab，并将其插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转换为cDNA，并使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J Mol.Biol.222：581-97)。根据Andris-Widhopf等人(2000年，在PHAGE DISPLAYLABORATORY MANUAL中，Barbas等人(编辑)，第一版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9.1至9.22页)进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化最终的Fab片段，并将其插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。可以通过本领域已知的标准噬菌体展示方法来筛查此类文库(参见例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
噬菌体展示可以多种形式进行，有关其综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。人抗体也可以由体外活化的B细胞产生。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全部内容通过引用并入本文。技术人员将意识到这些技术是示例性的，并且可以利用任何已知的用于制备和筛查人抗体或抗体片段的方法。
在另一个替代方案中，已被遗传工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)公开。此类系统的非限制性实例是来自Abgenix(Fremont，Calif.)的
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(例如Green等人，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23)。在
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和类似动物中，小鼠抗体基因已被灭活并被功能性人抗体基因取代，而其余的小鼠免疫系统则保持完整。
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用种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化，该YAC包含人类IgH和Igλ基因座的部分，包括大部分可变区序列，以及辅助基因和调节序列。人可变区库可用于产生抗体产生的B细胞，其可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的
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将通过正常的免疫反应产生人抗体，这可以通过上述标准技术收获和/或产生。可获得多种
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菌株，每种菌株都能够产生不同种类的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜力，同时保留了正常人抗体的药代动力学特性(Green等人，1999)。本领域技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用
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系统，而是可以利用经过基因工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。
抗体克隆与生产
各种技术，诸如嵌合或人源化抗体的生产，可涉及抗体克隆和构建的过程。感兴趣的抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可以通过多种分子克隆程序获得，诸如RT-PCR、5'-RACE和cDNA文库筛查。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增进行克隆和测序。为了证实其真实性，克隆的VL和VH基因可在细胞培养物中表达为嵌合抗体，如Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.美国，86：3833(1989))所述。基于V基因序列，然后可按照Leung等人的描述设计和构建人源化抗体(Mol.Immunol，32：1413(1995))。
可以通过普通的分子克隆技术，从任何已知的杂交瘤细胞系或产生鼠抗体的转染细胞系制备cDNA(Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第二版(1989))。抗体的Vκ序列可以使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等人(BioTechniques，15：286(1993))描述的扩展引物进行扩增。可以使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或Leung等人(Hybridoma，13：469(1994))描述的退火至鼠IgG恒定区的引物扩增VH序列。可通过如Leung等人(Mol.Immunol，32：1413(1995))描述的长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建人源化的V基因。
可将Vκ的PCR产物亚克隆到一个分期载体中，诸如基于pBR327的分期载体VKpBR，其中包含Ig启动子、信号肽序列和方便的限制性位点。可将VH的PCR产物亚克隆到类似的分期载体中，诸如基于pBluescript的VHpBS。可从VKpBR和VHpBS中切除含有Vκ和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒，并分别连接到适当的表达载体(诸如pKh和pG1g)中(Leung等人，Hybridoma，13：469(1994))。可将表达载体共转染到合适的细胞中，并监测上清液中嵌合、人源化或人抗体的产生。或者，可切除Vκ和VH表达盒并将其亚克隆到单个表达载体中，诸如pdHL2，如Gillies等人，Immunol.Methods 125：191(1989)所述，也显示在Losman等人，Cancer，80：2660(1997)中。
在另一个可替代实施方案中，可以将表达载体转染到已经预先适应于在无血清培养基中进行转染、生长和表达的宿主细胞中。可以使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；将其每一个的实施例部分通过引用并入本文)。这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤细胞系，其用突变的Bcl-EEE基因转染，暴露于甲氨蝶呤以扩增转染的基因序列，并预先适应于无血清细胞系进行蛋白质表达。
抗体片段
可以通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，诸如F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、scFv等。F(ab')2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生，而Fab'片段可通过还原F(ab')2片段的二硫键生成。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等人，1989，Science，246：1274-1281)，以允许快速和容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab'片段。F(ab)2片段可以是通过木瓜蛋白酶消化抗体而产生的。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。制备scFv分子和设计合适的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；Raag和Whitlow，FASEB 9：73-80(1995)以及Bird和Walker，TIBTECH，9：132-137(1991)中。
产生单域抗体(DAB或VHH)的技术在本领域中也是已知的，例如在Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51：253-259)中公开，通过引用结合于此。可以通过标准免疫技术从例如骆驼、羊驼或美洲驼获得单域抗体。(参见，例如Muyldermans等人，TIBS 26：230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281：161-75，2003；Maass等人，J ImmunolMethods 324：13-25，2007)。VHH可具有强大的抗原结合能力，并且可与常规VH-VL对无法实现的新型表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG仅含有约50％骆驼重链IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。可以用已知的抗原(例如TNF-α)免疫羊驼，并可分离出与靶抗原结合并中和靶抗原的VHH(Maass等人，2007)。已经鉴定了扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，其可通过本领域众所周知的标准生物淘选技术用于抗体片段分离(Maass等人，2007)。在一些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可用于要求保护的组合物和方法中。
可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌或编码该片段的DNA的另一宿主中表达来制备抗体片段。可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得抗体片段。这些方法描述于，例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献。另参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，在METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press 1967)和Coligan在第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在当前情况下，结合特异性之一是针对靶标诸如CD47或其任何片段的。第二结合靶标是任何其他抗原，并且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。在WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中公开了类似的程序。
可使用多种本领域公认的技术中的任何一种来制备双特异性抗体，诸如κλ抗体，包括WO 2012/023053中公开的技术，该专利的内容通过引用整体并入本文。
在产生双特异性抗体的其他实施方案中，可以将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定结构域序列连接。融合物优选与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，该结构域包含铰链、CH2区域和CH3区域的至少一部分。优选在至少一个融合物中具有包含存在轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。对于产生双特异性抗体的更多细节，参见例如Suresh等人，Methods inEnzymology，121：210(1986)。
在一些实施方案中，本文的构建体中的一对抗体分子之间的界面可被工程化以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。优选的界面包括IgA抗体恒定结构域的CH3区域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过用较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替较大的氨基酸侧链，在二抗分子的界面上产生了与较大侧链相同或相似大小的补偿“腔”。这提供了一种相比其他不想要的最终产物(诸如同型二聚体)用于提高异二聚体的产量的机制。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术已在文献中描述。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
还已经描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合，将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。该方法也可用于抗体同型二聚体的生产。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头连接至轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，该接头太短以至于不允许同一个链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见，Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
考虑具有超过两种化合价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)。示例性的双特异性抗体可结合两个不同的表位，其中至少一个表位起源于本发明的蛋白抗原。或者，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可与结合白细胞上的触发分子的臂结合，触发分子诸如为T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，从而将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂引导至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和与细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)结合的臂。另一种感兴趣的双特异性抗体结合本文所述的蛋白抗原，并进一步结合组织因子(TF)。
已经使用了几种策略来产生这种双特异性分子，诸如抗体片段的化学交联、强制异源二聚化、杂交瘤技术、经由多肽接头的抗体片段融合以及使用单域抗体。重组DNA技术的可获得性已经导致产生多种双特异性抗体形式(参见，例如，Ridgway JB等人(1996)Protein Eng 9：617-621)。接头和突变经常被引入抗体的不同区域以迫使异二聚体形成或将不同的结合部分连接成单个分子。
化学交联
使用化学交联剂共价连接两种抗体是一种概念上简单的方法。使用双功能试剂缀合通过酶消化从其各自的亲本抗体产生的或通过重组技术产生的抗体片段(Glennie MJ等人，J Exp Med 1992；175：217-225)。产品同质性是该方法的主要局限性，因为必须从同型二聚体中纯化双特异性物质，并且修饰步骤可改变蛋白质的完整性和稳定性。
四源杂交瘤
可通过将两个杂交瘤或一个杂交瘤分别与B淋巴细胞融合来产生四源杂交瘤和三源杂交瘤(triomas)(Suresh MR等人，Methods Enzymol1986；121：210-228)。在这种情况下，两个重链和两个轻链的同时表达导致10个抗体组合的随机组装，而所期望的bsAb仅代表分泌抗体的一小部分。必须结合使用色谱技术纯化bsAb，这会显著降低产量。一个主要的局限性是四源杂交瘤产生啮齿动物来源的bsAb，由于免疫原性问题限制了它们的治疗潜力。
重组双特异性抗体
大多数双特异性抗体形式可通过基因工程技术使用抗体片段(诸如scFv或Fab片段)作为通过多肽接头连接的结构单元而产生。基于连接的抗体片段的形式包括串联scFv(BiTE)、双抗体和串联双抗体(Kipriyanov SM.Methods Mol Biol 2003；207：323-333；Korn T等人，Int J Cancer 2002；100：690-697)。这些结构单元可进一步与产生“IgA样”分子的免疫球蛋白Fc区连接。这些形式包括双抗体-Fc、串联双抗体-Fc、串联双抗体-CH3、(scFv)4-Fc和DVD-Ig(Lu D等人，J Immunol Methods 2003；279：219-232；Lu D等人，JBiol Chem 2005；280：19665-19672；Lu D等人，J Biol Chem 2004；279：2856-2865；Wu C等人，Nat Biotechnol 2007 25：1290-7)。
已经探索了基于迫使两条重链异二聚化的策略。第一种被称为“杵臼结构(knobinto hole)”的方法旨在通过将突变引入CH3结构域以修饰接触界面来迫使两个不同的IgG重链配对(Ridgway JB等人，Protein Eng 1996；9：617-621)。在一条链上引入了具有大侧链的氨基酸，以产生“杵”。相反，大的氨基酸被具有短侧链的氨基酸取代，从而在另一个CH3结构域中形成“臼”。通过共表达这两条重链，与同型二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)相比，观察到超过90％的异二聚体形成(“杵-臼”)。使用基于人IgG和人IgA序列的链交换工程结构域(SEED)人CH3结构域开发了类似的概念(Davis JH等人，2010，PEDS 23：195-202)。这些工程结构域导致异二聚体分子的形成，该异二聚体分子可带有两种不同的特异性。
最近对“杵臼结构”方法进行了改进；“CrossMab”在WO2009/080253A1中已经描述了。该方法除了“杵臼结构”突变外，还涉及一些轻链和重链结构域的交换。
基于单结构域的抗体。骆驼(羊驼和骆驼)和软骨鱼类(铰口鲨)的免疫系统使用与Fc融合的单个V结构域，表明单个结构域可赋予与抗原结合的高亲和力。骆驼、鲨鱼甚至人V结构域代表了抗体的替代品，但它们也可用于bsAb的产生。可将它们重新格式化为经典IgG，其中每条臂都有可能通过其VH或VL结构域结合两个靶标。
本公开内容的双特异性抗体可通过本申请中公开的或本领域已知的任何方法来制备。
双重可变结构域免疫球蛋白
双特异性抗体可包含单独编码的肽或“片段”，其在单个连续链中将包含紧密的三级结构。选择组分肽以在其假定结构中不对称，以便不自我缔合形成同型多聚体，而是以互补方式缔合，采用类似于母体三级结构的稳定复合物。在遗传水平上，这些区段由具有合适限制位点的可互换盒编码。这些标准化的盒通过接头或铰链在合适的表达载体系统中与不同的重组蛋白在C端或N端融合。通过切割具有紧密的三级结构的亲本多肽来获得不具有作为同型二聚体组装能力的多肽片段。然后可在遗传水平上将这些多肽片段融合至一个或多个不同的功能域。这些现在与一个或多个功能域融合的不同多肽区段可例如共表达，导致形成附着于功能域的天然类亲本结构。该亲本结构是通过衍生自原始亲本多肽的多肽区段的二聚化而形成的。所得的多功能构建体将表现为附着于一个或多个功能域的紧凑的三级结构。一旦鉴定出结构的亚结构域，就以这些亚结构域保持完整的方式解剖蛋白质。作为本公开内容的一部分，可制备DNA序列、载体，优选双顺反子载体、载体盒，并且其特征在于它们包含编码氨基酸序列的DNA序列和任选地包含在本发明的多功能多肽中的至少一种另外的(多)肽，以及另外的至少一个，优选单克隆位点，用于插入编码至少一个另外的功能结构域的DNA，或者它们包含编码所述氨基酸序列的DNA序列，以及任选地包含在本发明多功能多肽中的另外的(多)肽和用于克隆编码功能域的DNA序列的合适的限制位点，使得在将编码功能域的DNA序列插入所述限制位点后表达DNA序列时，可以在合适的宿主中形成本发明的多功能多肽。所述载体盒的特征在于，其包含插入的编码所述功能域的DNA序列和用至少一种本发明的载体或载体盒转化的宿主细胞，所述载体或载体盒可用于制备所述双特异性或多功能多肽。宿主细胞可以是哺乳动物，优选人、酵母、昆虫、植物或细菌，优选大肠杆菌细胞。双特异性抗体可通过一种如下方法制备：所述方法包括在合适的培养基中培养至少两种本发明的宿主细胞，所述宿主细胞各自仅产生与至少一个另外的功能结构域连接的所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列中的一种，回收所述氨基酸序列，在轻度变性条件下混合所述氨基酸序列，并允许从所述氨基酸序列体外折叠本发明的多功能多肽。该方法的特征可以在于，与至少一个另外的功能结构域连接的另外的氨基酸序列由不产生所述第一氨基酸序列或第二氨基酸序列的至少一个另外的宿主细胞产生。另外，该方法的特征可以在于，与至少一个另外的功能性结构域连接的至少一个另外的氨基酸序列由产生所述第一氨基酸序列或第二氨基酸序列的本发明的宿主细胞产生。
当本文描述的抗体构建体的第二部分或第一部分包含两个抗体可变域时，这两个抗体可变域可以是彼此关联的VH和VL结构域。然而，还考虑了包含在第二部分或第一部分中的两个抗体可变域可以是彼此关联的两个VH结构域或两个VL区。如果第一部分或第二部分的两个抗体可变域彼此共价结合，则这两个抗体可变域可以被设计为scFv片段，这意味着这两个结构域通过足够长的肽接头彼此分开，以允许这两个结构域之间的分子间结合。在现有技术中，例如在授予的专利EP 623 679B1、美国专利号5,258,498、EP 573 551B1和美国专利号5,525,491中描述了适合于此目的的接头的设计。换言之，双特异性抗体可以是具有总共三个抗体可变域的构建体。一个抗体可变域单独特异性结合，即不与另一个抗体可变域配对(a)通过特异性结合人免疫效应细胞上的效应抗原或靶细胞而与人免疫效应细胞结合，而剩余的两个抗体可变域一起分别通过特异性结合人免疫效应细胞上的效应抗原而特异性结合(b)靶细胞上的靶抗原或人免疫效应细胞。在这种情况下，双特异性抗体中三个抗体可变域的存在具有独特的优势。通常，展现出对靶抗原的期望结合特异性的scFv是已知的并且已被优化，并且省略其两个抗体可变域之一将消除或至少减弱其结合特性。这样的scFv可以组成本文描述的抗体构建体的一部分。特别地，这样的三结构域抗体可以有利地包含完整的scFv作为其效应抗原或靶抗原赋予部分。然后，有效地，这允许通过仅将一个另外的抗体可变域简单地掺入与scFv相同的多肽链中而从所期望的scFv开始形成双特异性抗体，其中掺入的一个另外的抗体可变域具有与scFv不同的抗原结合特异性。双特异性抗体的第一部分和第二部分可以通过合成多肽间隔物部分彼此分开，所述多肽间隔物部分共价地(即，肽)连接第一部分的C-末端与第二部分的N-末端，或第二部分的C-末端与第一部分的N-末端。这样，这些双特异性抗体的部分可以布置为N-(第一部分)-(第二部分)-C或N-(第二部分)-(第一部分)-C。在一些实施方案中，第二特异性的结合位点与重链或轻链的N-或C-末端融合，例如以scFv片段或可变单结构域的形式，产生双特异性的四价分子。通过scFv片段与mAb融合产生的双特异性分子具有极大的柔性。ScFv分子可与mAb的重链或轻链可变域的N-末端连接，也可与C-末端连接，通常不会损害生产率或抗原结合活性。这组双特异性分子还包括DVD-Ig(其中第二VH和VL结构域分别与mAb的重链和轻链融合)、二合一抗体(其中第二特异性被引入IgG分子的天然结合位点)和mAb2分子(其中第二特异性被构建到Fc区的CH3结构域)。所有这些分子的特征是由两个相同的重链的二聚体组装引起的对称性，这是这些链的固有特性。
重链异源二聚化可通过对带电荷的CH3界面进行改造以引入静电操纵效果或使用链交换工程结构域技术(SEEDbody)来实现，其中CH3序列由人IgA和IgG的交替片段组成。与双特异性IgG样分子相反，这些双特异性抗体是二价的，其大小与IgG基本相同。最近应用Fc异二聚化生成三价双特异性分子，将VH和VL结构域融合到工程化重链的C-末端(HA-TF Fc变体)。通过结合两种抗体的可变域，可产生分子量在50–100kDa范围内的双特异性抗体。例如，两个scFv已经通过或多或少的柔性肽接头以串联方向连接(串联scFv、taFv、tascFv)，其可通过另外的scFv进一步延伸，例如产生双特异性或三特异性三体(sctb)。双抗体是由两种抗体的可变域组成的异二聚体分子，所述两种抗体的可变域以VHA-VLB和VHB-VLA顺序(VH-VL方向)或VLA-VHB和VLB-VHA顺序(VL-VH方向)排列。连接一条链内两个结构域的接头约为5个残基，在一个细胞内两条链共表达后，导致头尾组合，从而形成具有两个功能性结合位点的紧密分子。通过引入链间二硫键(dsDb、DART分子)或生成单链衍生物(scDb)，进一步稳定双抗体(Db)形式。通过还原中间接头，ScDb可转化为四价分子，从而导致两条链均二聚化。通过将scFv融合至Fab片段的重链或轻链也已经产生了小的双特异性分子。此外，已经将串联scFv、双抗体和scDb与Fc或CH3结构域融合以产生四价衍生物。而且，scFv可与Fc或CH3结构域结合以生成四价分子，例如，将scFv融合到Fc片段的N和C-末端，或使用杵臼结构方法生成二价scFv-Fc或scFv-CH3分子。用于产生本发明的双特异性抗体的不同方法是对接和锁定方法(dock-and-lock，DNL)。在这里，抗体片段与人cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的同型二聚体对接域(DDD)和A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定固域(AD)融合，从而形成双特异性三价分子。许多已建立的双特异性抗体形式也可与其他蛋白质和成分(例如，药物、毒素、酶和细胞因子)结合，从而实现融合伴侣的双靶向和递送。另外，与血浆蛋白诸如血清白蛋白或白蛋白结合部分的融合可用于延长双特异性抗体的血浆半衰期。双特异性抗体的结构
在一个实例中，双特异性抗体可以是包含第一多肽链的结合蛋白，其中该多肽链包含VD-H1-(X1)n-VD-H2-C-(X2)n，其中VD-H1是第一重链可变域，VD-H2是第二重链可变域，C是恒定结构域，X1代表多肽接头，X2代表IgA Fc区，且n为0或1。在一些实施方案中，结合蛋白中的VD-H1和VD-H2可以是选自鼠重链可变域、人重链可变域、CDR移植的重链可变域和人源化的重链可变域的重链可变域。VD-H1和VD-H2可能够结合不同的抗原。C可以是重链恒定结构域。例如，X1是连接肽。例如，X1是本文列出的接头。在一个实施方案中，X2是IgAFc区。在另一个实施方案中，X2是变体IgA Fc区。在一些实施方案中，VD-H1能够结合CD47，并且VD-H2能够结合抗原。在一些实施方案中，VD-H1能够结合抗原并且VD-H2能够结合CD47。
在一个实例中，双特异性抗体可以是包含第二多肽链的结合蛋白，其中该多肽链包含VD-L1-(X1)n-VD-L2-C-(X2)n，其中VD-L1是第一轻链可变域，VD-L2是第二轻链可变域，C是恒定结构域，X1代表多肽接头，X2代表IgA Fc区，且n为0或1。在一些实施方案中，结合蛋白中的VD-L1和VD-L2可以是选自鼠轻链可变域、人轻链可变域、CDR移植的轻链可变域和人源化的轻链可变域的轻链可变域。VD-L1和VD-L2可能够结合不同的抗原。C可以是重链恒定结构域。例如，X1是连接肽。例如，X1是本文列出的接头。在一个实施方案中，X2是IgAFc区。在另一个实施方案中，X2是变体IgA Fc区。在一些实施方案中，VD-L1能够结合CD47，并且VD-L2能够结合抗原。在一些实施方案中，VD-L1能够结合抗原并且VD-L2能够结合CD47。在一些实施方案中，双特异性抗体构建体同时包含第一多肽链和第二多肽链。本公开内容的双特异性抗体可以是如Jakob 2013中所述的双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)，其通过柔性天然存在的接头结合两个单克隆抗体的靶结合域，从而产生四价IgG样分子。
本发明还提供了一种通过预选CD47的亲本抗体和所期望的抗原(例如CD20)来制备DVD-Ig结合蛋白的方法。一种制备结合两种抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：a)获得结合第一抗原的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合第二抗原的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建第一多肽链的两个拷贝，每个多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一重链可变域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二重链可变域，其可与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；(X2)n是IgA Fc区，d)构建第二多肽链的两个拷贝，每个多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一轻链可变域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合获得的轻链可变域，其可与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其中所述(X1)n存在或不存在；(X2)n不包含IgA Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；以及e)表达所述第一多肽链和第二多肽链的两个拷贝；从而使DVD-Ig结合所述第一抗原(例如，CD47)并产生所述第二抗原(例如，CD20)。抗原结合域和/或CD47结合域的产生：
DVD结合蛋白的可变域可从亲本抗体中获得，包括结合感兴趣的抗原的多克隆抗体和mAb。这些抗体可以是天然存在的，也可以通过重组技术生成，或者可重新设计。可使用本领域已知的多种技术来制备MAb，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。单克隆抗体可通过本文公开的方法制备。
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子的设计使得来自两种不同亲本单克隆抗体的两个不同轻链可变域(VL)通过重组DNA技术直接或通过短接头串联连接，随后是轻链恒定结构域和任选的Fc区。类似地，重链包含串联连接的两个不同的重链可变域(VH)，随后是恒定结构域CH1和Fc区。可变域可使用重组DNA技术从通过本文所述的任何一种方法产生的亲本抗体获得。可变域可以是鼠重链或轻链可变域，CDR、人重链或轻链可变域。第一可变域和第二可变域可以使用重组DNA技术彼此直接连接，通过接头序列连接，或者两个可变域连接。可变域可以结合相同的抗原或可以结合不同的抗原。可使用重组DNA技术将恒定结构域连接至两个连接的可变域。可以将包含连接的重链可变域的序列连接至重链恒定结构域，并且将包含连接的轻链可变域的序列连接至轻链恒定结构域。恒定结构域也可以分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。DVD重链可以进一步连接至IgA Fc区。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区或人Fc区或来自IgA1、IgA2的Fc区。可以将两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽结合以形成DVD-Ig分子。
本发明的“双特异性多价全长结合蛋白”的设计产生双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，其主要组装成期望的“双特异性多价全长结合蛋白”。
DVD分子的构建
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子的设计使得来自两种亲本单克隆抗体的两个不同的轻链可变域(VL)(可以相同或不同)通过重组DNA技术直接或通过短接头串联连接，随后是轻链恒定结构域和任选的IgA Fc区。类似地，重链包含串联连接的两个不同的重链可变域(VH)，随后是恒定结构域CH1和IgA Fc区。
可变域可使用重组DNA技术从通过本文所述的任何一种方法产生的亲本抗体获得。在一个实施方案中，可变域是鼠重链或轻链可变域。在另一个实施方案中，可变域是CDR移植的或人源化的可变重链或轻链结构域。在一个实施方案中，可变域是人的重链或轻链可变域。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术将第一可变域和第二可变域彼此直接连接。在另一个实施方案中，可变域通过接头序列连接。在一个实施方案中，两个可变域连接。三个或更多个可变域也可以直接或通过接头序列连接。可变域可以结合相同的抗原或可以结合不同的抗原。本发明的DVD-Ig分子可包括一个免疫球蛋白可变域和一个非免疫球蛋白可变域，诸如受体的配体结合域或酶的活性域。DVD-Ig分子也可以包含两个或更多个非Ig结构域。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术将恒定结构域连接至两个连接的可变域。在一个实施方案中，将包含连接的重链可变域的序列连接至重链恒定结构域，并且将包含连接的轻链可变域的序列连接至轻链恒定结构域。在一个实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，DVD重链进一步连接至Fc区。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区。
在另一个实施方案中，将两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽结合以形成DVD-Ig分子。
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种来产生。例如，从宿主细胞中表达，其中编码DVD重链和DVD轻链的表达载体通过标准技术被转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中可以表达本发明的DVD蛋白，但DVD蛋白在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的DVD蛋白。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，如Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.美国77：4216-4220，used with a DHFR selectable marker中所述，例如Kaufman，R.J.和Sharp，P.A.(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2和PER.C6细胞。当将编码DVD蛋白的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段足以允许DVD蛋白在宿主细胞中表达或DVD蛋白分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中的时间来生产DVD蛋白。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收DVD蛋白。
在本文所述的构建体中用于DVD蛋白的重组表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体中，DVD重链和轻链基因各自可操作地连接至CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体亦携带DHFR基因，从而使得可对已利用甲胺蝶呤选择/扩增经载体转染的CHO细胞进行选择。培养选择的转化体宿主细胞以允许DVD重链和轻链的表达，并从培养基中回收完整的DVD蛋白。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞，并从培养基中回收DVD蛋白。本发明还提供了一种通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的DVD蛋白来合成本发明的DVD蛋白的方法。该方法可进一步包括从培养基中分离DVD蛋白。
DVD-Ig的一个重要特征是可按照与常规抗体相似的方式生产和纯化DVD-Ig。DVD-Ig的产生导致具有期望的双特异性活性的均质、单一主要产物，而恒定区没有任何序列修饰或任何种类的化学修饰。产生“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其它先前描述的方法不产生单一初级产物，而是导致细胞内或分泌产生具有不同结合位点组合的组装的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白和多价全长结合蛋白的混合物。例如，基于Miller和Presta(PCT公开号WO2001/077342(A1)所述的设计，有16种可能的重链和轻链的组合。因此，与其他15种可能的组合相比，仅6.25％的蛋白质可能处于所期望的活性形式，而不是单一的主要产品或单一的初级产品。使用通常用于大规模生产的标准色谱技术将所需的完全活性形式的蛋白质与非活性和部分活性形式的蛋白质分离仍有待证明。
用于本文所述的构建体的“双特异性多价全长结合蛋白”的设计产生双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，其主要组装成所需的“双特异性多价全长结合蛋白”。
组装且表达的双重可变结构域免疫球蛋白分子的至少50％、至少75％和至少90％是期望的双特异性四价蛋白。本发明的这个方面特别增强了本发明的商业实用性。因此，本发明包括一种在单细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链的方法，从而产生“双特异性四价全长结合蛋白”的单个初级产物。
本文提供在单细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链以产生“双特异性四价全长结合蛋白”的“初级产物”的方法，其中“初级产物”超过所有组装蛋白的50％，包括双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本文提供在单细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链以产生“双特异性四价全长结合蛋白”的单个“初级产物”的方法，其中“初级产物”超过所有组装蛋白的75％，包括双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本文提供在单细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链以产生“双特异性四价全长结合蛋白”的单个“初级产物”的方法，其中“初级产物”超过所有组装蛋白的90％，包括双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
κ-λ体
在一些实施方案中，本文提供了κ-λ抗体形式的双特异性抗体。本文提供的双特异性抗体具有通用的重链、两个轻链——一个κ(K)、一个λ(λ)-各自具有不同的特异性(即两个轻链、两个特异性)。本文提供的方法产生具有特异性结合的分子，其中多样性限于VL区。这些方法通过受控地共表达三个链(一个VH链、两个VL链)并纯化双特异性抗体来产生双特异性抗体。
这种类型的分子由独特的重链多肽的两个拷贝、与恒定的κ结构域融合的第一轻链可变区、与恒定的λ结构域融合的第二轻链可变区组成。每个结合位点均显示出不同的抗原特异性，重链和轻链均对其具有贡献。轻链可变区可以是λ或κ家族的，并且优选分别与λ和κ恒定结构域融合。为了避免产生非天然多肽连接，这是优选的。然而，也可以通过将κ轻链可变域融合至恒定的λ结构域以获得第一特异性，并将λ轻链可变域融合至恒定的κ结构域以获得第二特异性，来获得本发明的双特异性抗体。
该方法的必要步骤是鉴定两个抗体Fv区(每个均由可变轻链和可变重链结构域组成)，它们具有不同的抗原特异性，并且共享相同的重链可变域。已经描述了用于产生单克隆抗体及其片段的许多方法。(参见例如，抗体：实验室手册，Harlow E和Lane D，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，通过引用并入本文)。全人抗体是抗体分子，其中轻链和重链(包括CDR 1和CDR 2)的序列均源自人基因。CDR3区域可以是人类来源的或通过合成方式设计。这样的抗体在本文中称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可通过三源杂交瘤技术制备；人类B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983年Immunol Today 4：72)；以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人，1985年在MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY中，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。可以利用人单克隆抗体并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote等人，1983.Proc NatlAcad Sci美国80：2026-2030)或通过体外用Epstein Barr病毒转化人B细胞(参见Cole等人，1985，在MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY中，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)来产生人单克隆抗体。
单克隆抗体是例如通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫动物而产生的。或者，用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，以使靶抗原表达并与转染细胞的表面缔合。用于产生异种非人类动物的多种技术是本领域众所周知的。例如，参见美国专利号6,075,181和6,150,584，其通过引用整体并入本文。
或者，通过筛查包含与靶抗原结合的抗体或抗原结合域序列的文库来获得抗体。该文库例如在噬菌体中制备为与噬菌体外壳蛋白的蛋白或肽融合体，所述噬菌体外壳蛋白在组装的噬菌体颗粒的表面上表达并且编码包含在噬菌体颗粒内的DNA序列(即，“噬菌体展示文库”)。
然后筛查由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤与靶抗原的反应性。单克隆抗体是例如使用杂交瘤方法制备的，所述杂交瘤方法诸如Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)所描述的那些。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物，以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。
具有相同重链可变域的κ抗体可通过使用抗体文库来产生，其中所有文库成员的重链可变域都相同，因此多样性限于轻链可变域。这样的文库阐述于例如WO 2010/135558中。然而，由于轻链可变域与重可变域组合表达，因此两个结构域均可有助于抗原结合。为了进一步促进该过程，可并行使用包含相同重链可变域和多种λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库，以体外选择针对不同抗原的抗体。这种方法能够鉴定出具有通用重链但携带一个λ轻链可变域和另一个κ轻链可变域的两种抗体，这些可变域可用作构建本发明的完全免疫球蛋白形式的双特异性抗体的结构单元。本发明的双特异性抗体可以是IgA同种型，并且它们的Fc部分可被修饰以便改变与不同Fc受体的结合特性，并且以这种方式修饰抗体的效应子功能及其药物动力学特性。已经描述了许多修饰Fc部分的方法，并且这些方法适用于本发明的抗体(参见例如Strohl，WR Curr Opin Biotechnol 2009(6)：685-91)。
本发明的另一个关键步骤是优化通用的重链和两个不同的轻链在单细胞中的共表达，以允许组装本发明的双特异性抗体。如果所有多肽均以相同的水平表达并同样良好地组装以形成免疫球蛋白分子，则单特异性(同一个轻链)和双特异性(两个不同的轻链)的比例应为50％。
重链和两个轻链的共表达在细胞培养上清液中产生三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得感兴趣的分子。本文所述的方法通过使用与κ或λ轻链恒定结构域特异性相互作用的亲和色谱介质(诸如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和基质(BAC BV，Holland))极大地促进了该纯化程序。这种多步亲和色谱纯化方法是有效的，并且通常适用于本发明的抗体。这与必须针对每种双特异性抗体开发和优化的特异性纯化方法形成鲜明对比，所述双特异性抗体来源于四源杂交瘤或表达抗体混合物的其他细胞系。确实，如果混合物中不同抗体的生化特性相似，则使用标准色谱技术(诸如离子交换色谱)进行分离可能具有挑战性，甚至根本不可能。
三链的共表达导致三种不同抗体的组装：两种单特异性抗体和一种双特异性抗体。假设两种轻链的表达水平和装配率相似，那么它们的理论相对比率应为1：1：2。使用三步亲和色谱法纯化双特异性抗体：(1)蛋白A：捕获IgA(单和双IgA)，(2)κ选择：捕获包含κ轻链的IgA，以及(3)λ选择：捕获包含λ轻链的IgG。κ选择和λ选择是BAC、BV和GE Healthcare开发的亲和色谱介质。
纯化的双特异性抗体的特征如下。通过SDS-PAGE分析每个亲和纯化步骤的流通和洗脱。通过ELISA和表面等离振子共振测定κλ-体的特异性和亲和力。本发明的方法无需进行优化就可以鉴定亚纳摩尔级至纳摩尔级范围内的亲和力的抗体。这不是很明显，因为本文所述抗体文库中的多样性仅限于轻链，而轻链对标准抗体的结合能的贡献较小。
为了避免将获得具有κ和λ型轻链可变域的两种抗体的要求视为对本发明的限制，本文所述的方法允许产生杂交轻链，其中λ可变域可与κ恒定结构域融合，相反，κ可变域可与λ恒定结构域融合。在一些实施方案中，产生双特异性和/或多特异性抗体的方法使用完整的无血清化学确定的过程。这些方法结合了制药业中使用最广泛的哺乳动物细胞系，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。其中描述的方法用于产生半稳定细胞系和稳定细胞系。该方法可用于以小规模(例如在锥形瓶中)和中等规模(例如在25L Wave bag中)制造本发明的双特异性和/或多特异性抗体。该方法也易于适用于大规模生产双特异性和/或多特异性抗体，以及本发明的抗体混合物。
示例性抗体构建体
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；以及第一轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含第一重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-H3；以及第一轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，CD47结合区包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一重链可变序列。
在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第一重链可变序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：23的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，CD47结合区包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO：26的任一氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：26的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，CD47结合区包含SEQ ID NO：23的第一重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：26的第一轻链可变域氨基酸序列序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，CD47结合区包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一重链可变序列。
在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第一重链可变序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：24的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，CD47结合区包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO：27的任一氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：27的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，CD47结合区包含SEQ ID NO：24的第一重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：27中的第一轻链可变域氨基酸序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，抗原结合区包含第二重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗原结合区包含第二重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗原结合区包含第二重链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；以及第二轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，抗原结合区包含第二重链可变域，
在一些实施方案中，抗原结合区包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二重链可变序列。
在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的第二重链可变序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO：22的氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，抗原结合区包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体或其抗原结合片段保留结合抗原的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO：25的任一氨基酸序列中，总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(例如，在FR中)。任选地，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：25的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，抗原结合区包含SEQ ID NO：22的第二重链可变域氨基酸序列和SEQ ID NO：25中的第二轻链可变域氨基酸序列，包括那些序列的翻译后修饰。
一些实施方案中是本文所述的构建体，其中CD47结合区包含来自表A的CDR，并且抗原结合区包含来自表B的CDR。这些CDR和结合区可被文献中已知的其他置换，以实现所期望的结合，从而将免疫效应细胞募集到靶抗原呈递细胞。
示例性DVD Ig抗体
在一些实施方案中，抗体构建体包含多肽，其中第二重链可变域的C-末端连接至第一重链可变域的N-末端。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中第二重链可变域的C-末端与第一重链可变域的N-末端连接的多肽包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽的C-末端与编码IgA恒定重链的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，抗体构建体包含多肽，其中第二轻链可变域的C-末端连接至第一轻链可变域的N-末端。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中第二轻链可变域的C-末端与第一轻链可变域的N-末端连接的多肽包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽的C-末端与编码IgA恒定重链的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一多肽，该第一多肽包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一多肽，该第一多肽包含与第二重链可变域的N-末端连接的第一重链可变域的C-末端。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与第二重链可变域的N-末端连接的第一重链可变域的C-末端的多肽包含与SEQ IDNO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽的C-末端与编码IgA恒定重链的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一多肽，该第一多肽包含与第二轻链可变域的N-末端连接的第一轻链可变域的C-末端。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含与第二轻链可变域的N-末端连接的第一轻链可变域的C-末端的多肽包含与SEQ IDNO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽的C-末端与编码IgA恒定重链的氨基酸序列连接。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一多肽，该第一多肽包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体构建体包含第一多肽，该第一多肽包含与轻链或重链可变域连接的scFv。在一些实施方案中，所述连接是通过连接肽进行的。在一些实施方案中，连接肽包含与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，scFv包含第二重链可变域和第二轻链可变域，并与第一轻链可变域连接。在一些实施方案中，与第一轻链可变域连接的包含scFv的第一多肽(例如，包含第二重链可变域和第二轻链可变域)包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，scFv包含第二重链可变域和第二轻链可变域，并与第一重链可变域连接。在一些实施方案中，与第一重链可变域连接的包含scFv的第一多肽(例如，包含第二重链可变域和第二轻链可变域)包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，scFv包含第一重链可变域和第一轻链可变域，并与第二轻链可变域连接。在一些实施方案中，与第二轻链可变域连接的包含scFv的第一多肽(例如，包含第一重链可变域和第一轻链可变域)包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，scFv包含第一重链可变域和第一轻链可变域，并与第二重链可变域连接。在一些实施方案中，与第二重链可变域连接的包含scFv的第一多肽(例如，包含第一重链可变域和第一轻链可变域)包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
示例性的κλ体
在一些实施方案中，抗体构建体(例如κ-λ体)包含κ型或λ型的第一轻链可变域，以及κ型或λ型的第二轻链可变域。在一些实施方案中，抗体构建体(例如κ-λ体)包含κ型的第一轻链可变域和λ型的第二轻链可变域。在一些实施方案中，抗体构建体(例如κ-λ体)包含λ型的第一轻链可变域和λ型的第二轻链可变域。在一些实施方案中，CD47结合区包含第一轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CD47结合区包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一轻链可变域(VL)。
在一些实施方案中，抗原结合域包含第二轻链可变域，其包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2；(c)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，抗原结合域包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一轻链可变域(VL)。
在一些实施方案中，第一轻链可变域还包含轻链恒定结构域。在一些实施方案中，第二轻链可变域还包含轻链恒定结构域。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是κ型。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是λ型。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是κ型，其包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定结构域是λ型，其包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体构建体包含第一重链可变域和第二重链可变域，其中第一重链可变域和第二重链可变域是相同的。在一些实施方案中，第一重链可变域和第二重链可变域包含选自以下的至少一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，第一重链可变域和第二重链可变域包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，本文的抗体构建体包含IgA重链恒定区。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgA重链恒定区包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
IgA恒定区
在一个实施方案中，本公开内容的双特异性IgA抗体包含完整的IgA重链恒定结构域。在一些实施方案中，IgA重链恒定结构域包含一个或多个修饰以在两个重链之间产生不对称界面。
术语“不对称界面”用于指两个抗体链之间形成的界面(如上文所定义)，诸如第一IgA重链恒定区和第二IgA重链恒定区和/或IgA重链恒定区与其匹配的轻链之间，其中第一链和第二链中的接触残基(包括互补的接触残基)在设计上是不同的。不对称界面可通过杵/臼相互作用和/或盐桥偶联(电荷交换)和/或本领域已知的其他技术产生，例如通过用于将重链与其匹配的轻链偶联的CrossMab方法。“腔”或“臼”是指至少一个氨基酸侧链，该氨基酸侧链从第二多肽的界面凹陷，因此在第一多肽的相邻界面上容纳相应的突起(“杵”)。腔(臼)可以存在于原始界面中，或者可以被合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码腔。为了实现这一点，用编码至少一个“导入”氨基酸残基的DNA替换编码第二多肽界面中至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，所述“导入”氨基酸残基的侧链体积小于原始氨基酸残基。应当理解，可存在多于一个的原始残基和相应的导入残基。被取代的原始残基数量的上限是第二多肽界面中的残基总数。用于形成腔的优选的导入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，最优选丙氨酸。在优选的实施方案中，用于形成突起的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
“原始”氨基酸残基是被“导入*”残基取代的残基，其可具有比原始残基更小或更大的侧链体积。导入的氨基酸残基可以是天然存在或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。
“非天然存在的”氨基酸残基是指不由遗传密码编码但能够与多肽链中相邻的氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，诸如在Eilman等人Enzym，202：301-336(1991)中描述的那些。为了产生这样的非天然存在的氨基酸残基，可使用同上Noren等人的Science244：182(1989)和Eilman等人的方法。简而言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制型tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。在某些实施方案中，本发明的方法涉及替换IgM重链中的至少一个原始氨基酸残基，但可替换超过一个的原始残基。通常，不超过第一多肽或第二多肽的界面中的总残基将包含被替换的原始氨基酸残基。优选的用于替换的原始残基是“掩埋的”。“掩埋的”是指该残基基本上不可接触到溶剂。优选的导入残基不是半胱氨酸，以防止二硫键的可能氧化或错配。突起在腔中是“可定位的”，这意味着突起和腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置以及突起和腔的大小使得突起可位于腔中不会显著干扰界面上第一多肽和第二多肽的正常缔合。由于诸如Tyr、Phe和Trp的突起通常不从界面的轴垂直延伸，而是具有优选的构象，因此突起与相应腔的对齐依赖于基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的结构)对突起/腔对进行建模。这可使用本领域广泛接受的技术来实现，包括分子建模技术，
“原始核酸”是指编码感兴趣的多肽的核酸，其可被“改变”(即，基因工程化或使其突变)以编码突起或腔。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含已经进行了先前改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸是指通过插入、缺失或替换至少一个编码感兴趣的氨基酸残基的密码子来使原始核酸突变。通常，编码原始残基的密码子被编码导入残基的密码子代替。以这种方式对DNA进行遗传修饰的技术已在Mutagenesis：aPractical Approach，M,J.，McPherson编辑，(IRL Press，牛津，英国(1991)中进行了综述，包括例如定点诱变、盒诱变和聚合酶链式反应(PGR)诱变。
突起或腔可通过合成方法“引入”到第一多肽或第二多肽的界面中，所述合成方法例如通过重组技术、体外肽合成、前文描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶或化学偶联或这些技术的一些组合。因此，“引入”的突起或腔是“非天然存在的”或“非天然的”，这意味着它在自然界或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中不存在。
优选地，用于形成突起的导入氨基酸残基具有相对少量的“旋转异构体”(例如约3-6个)。“旋转异构体”是一个氨基酸侧链的能量上有利的构象。各种氨基酸残基的旋转异构体数目
在另一个实施方案中，本发明的多特异性IgA抗体包含完整的天然J链。J链是产生SlgA的关键蛋白，因为它促进IgA的聚合，并且认为这些聚合物中存在J链是它们与SC/plgR亲和所必需的。本文的多特异性IgA抗体可包含I链片段或以其他方式修饰的J链，只要所述片段或修饰的J链保留天然J链的功能，特别是能够使IgA有效聚合并使所述聚合物与分泌组分(SC)/多价(p)IgR结合——关于J链的结构-功能关系的更多细节参见，例如Johansen等人,2001；j.Immunol，167(9)：5185-5192。
为了产生具有两个不同的重链的IgA分子(即，其中结合nnlt中的至少一个是双特异性的)，必须找到一种解决方案将具有两个不同的结合特异性的两个匹配的重链彼此偶联。另外，如果需要轻链来形成结合区，则必须找到一种解决方案将每个重链与其匹配的轻链偶联以提供期望的结合特异性。
可通过某些残基之间的盐桥对电荷切换(也称为电荷交换或电荷反转)和/或通过在两个链之间产生杵-臼相互作用来实现偶联。重链也可通过使用CrossMab技术与其匹配的轻链配对。还可将不同的方法结合起来以获得最佳结果。
杵臼结构技术
为了提高本发明的五聚体或六聚体双特异性结合分子的产率，IgA重链恒定区(例如，CH3结构域)可通过“杵臼”技术来改变，该技术在例如WO 96/027011，Ridgway，J.,B.等人，Protein Eng 9(1996)617-621；以及Merchant，A.M等人，Nat Bioiechnol，16(1998)677-681中用几个实例进行了详细描述。在该方法中，改变两个IgA重链恒定结构域的相互作用表面以增加具有不同结合特异性的两个重链和/或在重链与其匹配的轻链之间的异二聚化。两个重链结构域中的每一个都可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫键的引入使异二聚体稳定(Merchant，AMs et ah，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S.等人，J.Moi.Biol.270(1997)26-35)并提高产量。类似地，匹配的重链和轻链可通过这种技术彼此偶联(Zhu，Z.；Presta，L.G；Zapata，G.；Carter，P.，Remodeling domain interfaces toenhance heterodimer formation，Prof Sci.6：781-788(1997))。
按照这种方法，在双特异性IgA抗体中一条重链的Co.(例如，Ca3)结构域的原始界面与另一条重链的相应结构域的原始界面相交的范围内，氨基酸残基可以被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在界面内产生突起，该突起可定位在另一个IgA重链恒定区中相应结构域的界面内的腔中。类似地，通过用具有较小侧链体积的氨基酸残基替换界面内的氨基酸残基(所述界面具有第一IgA重链恒定区中的相应结构域)，可以改变第二IgA重链，从而在两个重链区之间的界面内产生臼(腔)。
盐桥对电荷切换(电荷交换)
相反的电荷相互吸引，相似的电荷相互排斥。氨基酸分子的电荷与pH有关，并且可以通过pK值来表征，该pK值由α氨基(N)、α羧基(C)和游离氨基酸的侧链确定。当氨基酸是蛋白质或肽的一部分时，局部环境会改变侧链的pH值。
氨基酸分子的电荷特性还可通过等电点(pi)来表征，等电点(pi)是分子总电荷为中性时的pH值。由于氨基酸的侧链彼此不同，因此pi反映了侧链pK的差异。
大多数氨基酸(20个中的15个)的pi均接近6，因此被认为具有中性总电荷。Asp和Glu带负电，His、Lys和Arg带正电。
可将这些突变中的一个或多个或一组突变与一组或多组杵-臼突变组合在一起，以在两个不同的IgA重链之间和/或IgA重链与其匹配的轻链之间提供所期望的不对称界面。
优选地，两个不同的IgA重链恒定区之间的不对称界面由一个IgA重链中的至多8个突变产生，例如1-8、或1-7、或1-6、或1-5、或1-4、或1-3、或1-2个突变，或两个IgA重链中2-10、或2-9、或2-8、或2-7、或2-6、或2-5、或2-4、或2-3个组合突变。
CrossMab技术
如上所述，杵臼结构技术或电荷交换能够实现抗体重链的异二聚化。通过交换双特异性抗体结合单元中一半的抗原结合片段(Fab)内的重链和轻链结构域，可实现轻链及其同源重链的正确结合。交换可作为完整的VH-CH和VL-CL结构域的交换、仅VH和VL结构域的交换或igA抗体的双特异性结合单元中一半内的CA和CL结构域的交换进行。这种“交换”保留了抗原结合亲和力，但使两个臂如此不同，以致轻链错配不再发生。对于进一步的细节，在IgG抗体的情况下，参见，例如，Sehaeffer等人，(2011)Proc Natl AcadSci USA 108(27)：11187-11192。
免疫轭合物
在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂或诊断剂缀合。治疗剂不必相同，但可不同，例如，药物和放射性同位素。例如，可将131I掺入抗体或融合蛋白的酪氨酸和附着于赖氨酸残基的ε氨基的药物中。治疗剂和诊断剂还可以例如连接至还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何这样的已知方法。
可以通过二硫键形成将治疗剂或诊断剂附着在还原的抗体组分的铰链区。或者，可使用异双官能交联剂，诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP)来连接此类试剂。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这种缀合的通用技术在本领域中是众所周知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRCPress 1991)；Upeslacis等人，MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS中的“Modification of Antibodies by Chemical Methods,”，Birch等人(编著)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION中的“Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies”，Ritter等人(编著)，第60-84页(Cambridge UniversityPress，1995年)。或者，治疗剂或诊断剂可通过抗体的Fc区中的碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可用于增加与硫醇基团结合的相同试剂的负载，或者碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
通过抗体碳水化合物部分将肽与抗体组分缀合的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41：832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；和Shih等人，美国专利号5,057,313，其全部内容通过引用并入本文。通用方法包括使具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一种游离胺功能的载体聚合物反应。该反应产生初始的席夫碱(亚胺)键，该键可通过还原成仲胺以形成最终的缀合物而稳定。
如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段，则可以不存在Fc区。然而，可以将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995)，Leung等人，美国专利号6,254,868，通过引用整体并入本文。工程化的碳水化合物部分用于连接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，螯合剂可以连接至抗体、抗体片段或融合蛋白，并用于螯合治疗剂或诊断剂，诸如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(诸如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合方法和使用螯合剂将金属或其他配体连接到蛋白质上的方法是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利号7,563,433，其实施例部分通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾的试剂反应而附着于蛋白质或肽，该长尾可附着有多个用于结合离子的螯合基团。这种尾部可以是聚合物诸如聚赖氨酸、多糖或其它衍生或可衍生的链，所述链具有侧基，其上可结合螯合基团诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。
螯合物可以直接连接至抗体或肽，例如，如美国专利号4,824,659中所公开的，其通过引用整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基DTPA及其单甲基和环己基类似物，可与用于放射成像的一般能量范围为60-4,000keV内的诊断同位素一起使用，所述同位素诸如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br。当与非放射性金属(诸如锰、铁和钆)络合时，相同的螯合物可用于MM。诸如NOTA、DOTA和TETA的大环螯合物可与多种金属和放射性金属一起使用，尤其是分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。通过使环的大小适合感兴趣的金属，可使这种金属螯合物络合物非常稳定。涵盖对于稳定结合核素(诸如RAIT的223Ra)感兴趣的其他环型螯合物，诸如大环聚醚。
最近，已经公开了例如通过F-18与金属或其他原子如铝的反应，在PET扫描技术中使用的18F标记的方法。18F-A1缀合物可以与螯合基团(诸如DOTA、NOTA或NETA)络合，所述螯合基团直接连接抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向的构建体。这样的F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433，其实施例部分通过引用并入本文。
在Johannson等人(2006，AIDS 20：1911-15)中公开了另一种示例性的免疫轭合物，其中发现与阿霉素缀合的P4/D10(抗-gp120)抗体在治疗感染了HIV的细胞中非常有效。
其他治疗剂
在替代实施方案中，可以使用与受试者bsAb、ADC和/或抗体缀合，或者在bsAb、ADC和/或抗体之前、同时或之后分别施用的治疗剂，诸如细胞毒素剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其他药剂。使用的药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷化剂、抗代谢剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂及其组合的药学性质。
使用的示例性药物可包括但不限于：5-氟尿嘧啶、阿法替尼(afatinib)、阿普立定(aplidin)、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环类药物、阿西替尼(axitinib)、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀(bendamustine)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、苔藓抑素(bryostatin)-1、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱、卡铂(carboplatin)、10-羟基喜树碱、卡莫司汀(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、SN-38、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecan)、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼(dasatinib)、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉基阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀、表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)、埃罗替尼、恩替诺特(entinostat)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德(fingolimod)、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdRdO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度(flavopiridol)、福他替尼(fostamatinib)、吉尼替比(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星、艾代拉利司(idelalisib)、异环磷酰胺、伊马替尼(imatinib)、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、亚硝基脲、奥拉帕尼(olaparib)、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼(sorafenib)、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼(sunitinib)、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水溶液形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶芥(uracil mustard)、瓦他拉尼(vatalanib)、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNase)，例如，抗肿瘤核糖核酸酶(onconase)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。在某些实施方案中，抗血管生成剂，可使用诸如血管抑素、baculostatin、血管生成抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤维连接蛋白肽、纤溶酶原活化因子抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、多育曲菌素(proliferin)相关蛋白、羧酰胺三唑、CM101、马力马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A(herbimycin A)、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(罗喹美克(roquinimex))、沙利度胺、己酮可可碱(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、蛇毒解离素(accutin)、血管抑素、西多福韦(cidofovir)、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素(minocycline)。
使用的免疫调节剂可以选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素，诸如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，诸如白介素(IL)；集落刺激因子，诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ；和干细胞生长因子(诸如称为“S1因子”)。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；前列腺素；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒管抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；群落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(ILs)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、试剂盒配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。
使用的放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb和227Th。治疗性的放射性核素优选具有20至6,000keV范围内的衰变能，优选对于俄歇(Auger)发射体在60至200keV范围内，对于β发射体在100-2,500keV范围内，并且对于α发射体在4,000-6,000keV范围内。适用β粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，并且最优选为500-2,500keV。随俄歇发射粒子实质上衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能优选为<1,000keV，更优选为<100keV，并且最优选为<70keV。随着α粒子产生而实质上衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。使用的其他潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rb、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Y b等。一些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可包括光活化剂或染料。荧光组合物诸(如荧光染料)和其它色原体或染料(诸如对可见光敏感的卟啉)已用于通过将适合光引导至病变来检测和治疗病变。在疗法中，这被称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Joni等人(编著)，PHOTODYNAMIC THERAPY OFTUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，单克隆抗体已经与光活化染料偶联以实现光疗。参见Mew等人，J.Immunol(1983)，130：1473；同上，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1986)，83：8744；同上，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。
其他有用的治疗剂可包括寡核苷酸，特别是优选针对癌基因和癌基因产物(例如bcl-2或p53)的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式是siRNA。本领域技术人员将认识到，任何siRNA或干扰RNA物质都可以连接至抗体或其片段以递送至靶组织。针对多种靶标的许多siRNA物质在本领域中是已知的，并且任何此类已知的siRNA可用于要求保护的方法和组合物中。
已知的潜在用途的siRNA物质包括对以下具有特异性的那些：IKK-γ(美国专利号7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利号7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利号7,541,453)；CDC20(美国专利号7,550,572)；转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利号7,576,196)；KRAS(美国专利号7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利号7,579,457)；补体组分3(美国专利号7,582,746)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利号7,592,443)；存活素(美国专利号7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利号7,632,938)；MET原癌基因(美国专利号7,632,939)；淀粉样蛋白β前驱体蛋白(APP)(美国专利号7,635,771)；IGF-1R(美国专利号7,638,621)；ICAM1(美国专利号7,642,349)；补体因子B(美国专利号7,696,344)；p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421)，各参考专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
其它siRNA物质可从已知商业来源获得，诸如Sigma-Aldrich(St Louis，MO)、Invitrogen(Carlsbad，Calif)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，Calif)、Ambion(Austin，Tex)、Dharmacon(Thermo Scientific，Lafayette，Colo)、Promega(Madison，Wis)、Mirus Bio(Madison，Wis)和Qiagen(Valencia，Calif)以及许多其它来源。siRNA物质的其它可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心(StockholmBioinformatics Centre)的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、位于博得研究院(Broad Institute)的RNAi联合shRNA文库(RNAi Consortium shRNA Library)和位于NCBI的探针数据库(Probe database)。例如，NCBI探针数据库中有30852种siRNA。本领域技术人员将认识到，对于任何感兴趣的基因，或者siRNA物质已进行了设计，或者其可容易地使用可公开获得的软件工具进行设计。任何此类siRNA物质均可使用本发明的
Figure BDA0003138165020000961
复合物进行递送。
治疗方法
在一些实施方案中，本文公开了治疗有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗剂量的本文公开的治疗剂或药物组合物。在一些实例中，受试者患有癌症或传染病。在一些情况下，该癌症是与CD20、GD2、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2的表达相关的癌症。
在一些实施方案中，药物组合物或治疗剂通过静脉内、皮肤、皮下或在患处施用。在一些情况下，药物组合物或治疗剂在彼此之间约48小时内以单剂量或分剂量施用。在一些实例中，所述药物组合物或治疗剂诱导针对癌症的更强的免疫活化，通过与非癌组织相比癌细胞数量或体积的减少来测量。
在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD20过表达相关的癌症的受试者施用本文所述的治疗剂或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与GD2过表达相关的癌症的受试者施用本文所述的治疗剂或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与间皮素过表达相关的癌症的受试者施用本文所述的治疗剂或药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1、CD25、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2的过表达相关的癌症的受试者施用修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在其他情况下，癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，癌症是实体瘤或恶性血液病。在一些情况下，癌症是实体瘤。在其他情况下，癌症是恶性血液病。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在一些情况下，癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆管癌(即胆管上皮癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；未知原发性癌症(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；肠胃癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌或胶质母细胞瘤。
“胶质母细胞瘤”或“多形性胶质母细胞瘤”(GBM)是一种侵袭性神经上皮性脑癌。GBM可源自神经胶质型细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞或神经干细胞。已经鉴定出四种胶质母细胞瘤亚型。经典亚型是GBM的大部分，携带表皮生长因子受体(EGFR)基因的额外拷贝数，并且大多数高于表皮生长因子受体(EGFR)的正常表达水平。在一部分案例中，EGFR扩增伴随基因重排，其中最常见的是EGFR变体III(EGFRvIII)。基因TP53(p53)在胶质母细胞瘤中经常发生突变，而在经典亚型中很少发生突变。在TP53(p53)、PDGFRA(编码血小板衍生的生长因子受体A的基因)和IDH1(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)中，proneural亚型的变化率通常很高。间充质亚型的特征是与其他类型相比，NF1、编码神经纤维蛋白1的基因的突变率或其他变化率高，EGFR基因的变化较少，EGFR的表达较少。神经亚型的特征是神经元标志物诸如NEFL、GABRA1、SYT1和SLC12A5的表达。胶质母细胞瘤中还描述了其他遗传改变，其中大多数都聚集在两个途径中，即RB和PI3K/AKT。胶质母细胞瘤在这些途径中的改变分别为68–78％和88％。
在一些情况下，癌症是恶性血液病。在一些情况下，恶性血液病包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，恶性血液病包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些情况下，示例性恶性血液病包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、Waldenstrom巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，恶性血液病包括骨髓性白血病。在一些实施方案中，恶性血液病包括急性髓样白血病(AML)或慢性髓样白血病(CML)。
在一些情况下，本文公开了向患有恶性血液病的受试者施用本文所述的修饰的效应细胞的方法，所述恶性血液病选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、Waldenstrom巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，本文公开了向患有选自AML或CML的恶性血液病的受试者施用修饰的效应细胞的方法。
在其他情况下，本文公开了对由于传染病而感染的受试者施用的方法。传染病可以是细菌、病毒或真菌感染引起的疾病。在其他情况下，示例性病毒病原体包括腺病毒科、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、嗜肝病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科的病毒。示例性致病病毒会导致天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性致病真菌包括念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺曩虫属和葡萄状穗霉属。示例性的致病细菌包括链球菌、假单胞菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、葡萄球菌、螺杆菌、大肠杆菌、立克次体、芽孢杆菌、博德特氏菌、衣原体、螺旋体和沙门氏菌。
双特异性抗体的使用
应当理解，根据本发明的治疗实体的施用将与合适的载体、赋形剂和其它试剂一起施用，所述载体、赋形剂和其它试剂结合到制剂中以提供改进的转移、递送、耐受性等。在所有药物化学家都知道的处方集中可找到许多合适的配方：Remington's PharmaceuticalSciences(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1975))，特别是其中Blaug，Seymour的第87章。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含囊泡(诸如LipofectinTM)的脂质(阳离子或阴离子)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任一种在根据本发明的治疗和疗法中可以适用，条件是制剂中的活性成分未被制剂灭活，并且制剂在生理学上与施用途径相容并可耐受。另参见Baldrick P.“Pharmaceuticalexcipient development：the need for preclinical guidance”，Regul，ToxicolPharmacol，32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization and development of solidprotein pharmaceuticals”，Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman W N“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts”，J PharmSci.89(8)：967-78(2000)，Powell等人，“Compendium of excipients for parenteralformulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)和其中对与药物化学家熟知的制剂、赋形剂和载体有关的附加信息的引用。
包括本发明抗体的本发明的治疗制剂用于治疗或减轻与癌症相关的症状，所述癌症诸如但不限于白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺和支气管癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾和肾盂癌、口腔和咽癌、子宫体癌和/或黑素瘤。本发明还提供治疗或减轻与癌症相关的症状的方法。通过使用标准方法鉴定受试者，例如患有癌症(或处于患癌风险)的人类患者来进行治疗方案。
结合任何已知的用于诊断或治疗特定免疫相关疾病的方法来确定治疗的有效性。免疫相关病症的一种或多种症状的减轻表明该抗体具有临床益处。
筛查具有期望的特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域已知的其他免疫学介导的技术。
针对靶标如CD47、肿瘤相关抗原或其它抗原(或其片段)的抗体可用于本领域已知的与这些靶标的定位和/或定量相关的方法中，例如用于测量这些靶标在合适的生理样品中的水平、用于诊断方法、用于蛋白质成像等)。在给定的实施方案中，对这些靶标或其衍生物、片段、类似物或同源物中的任何一种具有特异性的抗体被用作药理学活性化合物(以下称为“治疗剂”)，这些靶标或其衍生物、片段、类似物或同源物包含衍生抗体的抗原结合结构域。
本发明的抗体可用于使用标准技术诸如免疫亲和、层析或免疫沉淀分离特定靶标。本发明的抗体(或其片段)可诊断性地用于监测组织中的蛋白质水平，作为临床测试程序的一部分，例如，以确定给定治疗方案的功效。通过使抗体与可检测物质偶联(即物理连接)可促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和完全人抗体可以用作治疗剂。此类试剂通常将用于治疗或预防与受试者的给定靶标的异常表达或激活有关的疾病或病理。向受试者施用抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂，并且由于其与靶标的结合而通常具有效果。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标的信号传导功能。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标与它天然结合的内源性配体的结合。例如，抗体与靶标结合并中和或以其他方式抑制CD47和SIRPα之间的相互作用。
本发明的抗体的治疗有效量通常涉及达到治疗目的所需的量。如上所述，这可能是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用在某些情况下干扰靶标的功能。待使用的所需的量还取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还将取决于所施用的抗体从其所施用的其他受试者的自由体积中消耗的速率。作为非限制性实例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的通用范围可以是约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见给药频率的范围可以是，例如，每日两次至每周一次。
本发明的抗体或其片段可以以药物组合物的形式施用以治疗多种疾病和病症。制备此类组合物所涉及的原理和考虑因素，以及组分选择的指导，例如在以下中提供：Remington：The Science And Practice Of Pharmacy，第19版(Alfonso R.Gennaro等人，编辑)Mack Pub.Co，Easton,Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement Concepts，Possibilities，Limitations，以及Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne,Pa.，1994；和Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，第4卷)，1991，M.Dekker，纽约。
当使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白结合结构域的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白序列能力的肽分子。这样的肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见，例如，Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，90：7889-7893(1993))。该制剂还可包含超过一种用于正在治疗的特定适应症需要的活性化合物，优选地是那些具有互补活性但互相没有不利影响的活性化合物。备选地或附加地，该组合物可包含增强其功能的试剂，例如细胞毒素剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量适当组合存在。
活性成分也可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊的微胶囊中，包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包埋在粗乳液中。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过无菌过滤膜过滤来完成。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈定型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3，773，919)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶却能在较短的时间内释放蛋白质。
本发明的抗体可用作检测样品中给定靶标(或其蛋白质片段)存在的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测的标记。抗体是多克隆的，或更优选单克隆的。使用完整的抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体而直接标记探针或抗体，以及通过与被直接标记的另一试剂的反应性而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，并用生物素末端标记DNA探针，以便可以用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。因此，术语“生物样品”的使用包括血液以及血液级分或成分，包括血清、血浆或淋巴液。即，本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的程序记载在例如“ELISA：Theory and Practice：Methods in MolecularBiology”，第42卷，J.R.Crowther(编)Human Press，Totowa，N.J.，1995；“Immunoassay”，E.Diamandis和T.Christopoulus，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1996；以及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”，P.Tijssen，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，1985中。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入受试者。例如，抗体可用放射性标记物标记，所述标记物在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。
药物组合物和剂量
在一些实施方案中，本文公开了在受试者中施用的包含本文公开的治疗剂的药物组合物。
在一些情况下，使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制包含本文所述的治疗剂的药物组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，所述赋形剂和助剂有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。正确的制剂取决于所选的施用途径。本文描述的药物组合物的概述可在以下中找到：例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton,Pa：Mack Publishing Company，1995年)；Hoover，John E.，Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975年；Liberman，H.A.和Lachman,L.主编，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker纽约，N.Y.，1980年；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版，(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
药物组合物任选地以常规方式制造，诸如仅通过举例的方式，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、磨细、乳化、包封、包埋或压制方法。
在某些实施方案中，组合物还可包括一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲剂，诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲剂的加入量应能将组合物的pH值保持在可接受的范围内。
在其他实施方案中，组合物还可以包括一种或多种盐，其量应使组合物的渗透压浓度在可接受的范围内。这些盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯化物、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、硼酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或亚硫酸氢盐阴离子的盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文所述的药物组合物通过任何合适的施用途径施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、颊、舌下或直肠施用途径。在一些情况下，将药物组合物配制成用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)施用。
本文所述的药物组合物被配制成任何合适的剂型，包括但不限于水性口服分散剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、酏剂、浆液剂、悬浮剂等，以供待治疗的个体口服摄取；固体口服剂型、气雾剂、控释制剂、速熔制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂和混合速释和控释制剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制成胶囊剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于IV施用)。在一些情况下，将药物组合物配制成输注剂。在一些情况下，将药物组合物配制成注射剂。
本文所述的药物固体剂型任选地包括本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，例如相容的载体、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
在其他方面，使用标准包衣方法，诸如在Remington's PharmaceuticalSciences，第20版(2000)中描述的那些，在组合物周围提供膜包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且将一些或全部颗粒包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且将一些或全部颗粒微囊化。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)，并且一些或全部颗粒没有被微囊化并且未被包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包括一种或多种抑制微生物活性的防腐剂。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；季铵化合物，诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和氯化十六烷吡啶。
本文所指的“增殖性疾病”是指呈现细胞的过度增殖和细胞基质的更新对包括癌症在内的几种疾病的发病机理具有显著贡献的统一的概念。
如本文所用，“患者”或“受试者”是指被诊断患有或怀疑患有或发展生理状况例如癌症或自身免疫状况或感染的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，术语“患者”是指患癌症的可能性高于平均可能性的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和可受益于本文公开的治疗的其他哺乳动物。示例性的人类患者可以是男性和/或女性。
“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文被称为被诊断患有或怀疑患有例如但不限于增殖性病症诸如癌症的疾病或病症的患者。在一些情况下，癌症是实体瘤或恶性血液病。在一些情况下，癌症是实体瘤。在其他情况下，癌症是恶性血液病。在一些情况下，癌症是转移性癌症。在一些情况下，癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆管癌(即胆管上皮癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；未知原发性癌症(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；肠胃癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，白血病可以是例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓样白血病(CML)。
本文中“施用”是指向患者提供本公开内容的组合物。作为示例而非限制，组合物施用，例如注射，可以通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌内(i.m.)来进行。可以采用一种或多种这样的途径。肠胃外施用可以例如通过弹丸注射或随时间逐渐灌注。备选地，或同时地，可以通过口服途径施用。另外，施用还可以通过手术沉积细胞团或小球，或定位医疗装置来进行。在一个实施方案中，本公开内容的组合物可以包含表达本文描述的核酸序列的工程细胞或宿主细胞，或包含有效治疗或预防增殖性疾病的量的本文描述的至少一种核酸序列的载体。药物组合物可以包含本文所述的靶细胞群，结合一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”及其语法等价物是指获得所期望的药理学和/或生理学作用。在实施方案中，该作用是治疗性的，即，该作用部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良症状。为此，本文描述的方法包括施用“治疗有效量”的包含表达本文描述的核酸序列的宿主细胞的组合物，或包含本文描述的核酸序列的载体。
术语“治疗有效量”、“治疗量”、“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或其语法等价物是指在必要的剂量和时间段内有效达到期望的治疗结果的的量。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本文所述的组合物在个体中引起期望的反应的能力的因素而变化。待施用的本发明组合物的精确量可由医生在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异的情况下确定。
或者，向患者或受试者施用本文所述的一种或多种组合物的药理学和/或生理学作用可以是“预防性的”，即该作用完全或部分预防疾病或其症状。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到期望的预防结果(例如，预防疾病发作)的量。
“消泡剂”减少加工过程中的发泡，该发泡可导致水性分散体的凝结、成品薄膜中的气泡或通常损害加工。示例性的消泡剂包括硅乳液或山梨糖醇酐倍半油酸酯。
“抗氧化剂”包括例如丁基羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠和生育酚。在某些实施方案中，抗氧化剂在需要时增强化学稳定性。
本文所述的制剂可得益于抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇的化合物和其他常规稳定剂。此类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v蛋氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯和其他类肝素，(m)二价阳离子，诸如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘附性质，包括例如海藻酸及其盐；纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如，
Figure BDA0003138165020001071
)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如，
Figure BDA0003138165020001072
)、乙基纤维素(例如，
Figure BDA0003138165020001074
)和微晶纤维素(例如，
Figure BDA0003138165020001073
)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸铝镁；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；交聚维酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖诸如蔗糖(例如，
Figure BDA0003138165020001075
)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨醇、木糖醇(例如，
Figure BDA0003138165020001076
)和乳糖；天然或合成的树胶，诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、印度胶、isapol壳的粘液、聚乙烯吡咯烷酮(例如，
Figure BDA0003138165020001081
CL、
Figure BDA0003138165020001083
CL、
Figure BDA0003138165020001084
XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
Figure BDA0003138165020001082
聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
“载体”或“载体材料”包括药物中任何常用的赋形剂，并应根据与本文公开的化合物诸如依鲁替尼(ibrutinib)和抗癌剂的化合物的相容性以及所需剂型的释放特性而进行选择。示例性的载体材料包括例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。“药物相容的载体材料”可以包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷酸酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖类硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、单甘油酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton,Pa：Mack Publishing Company，1995年)；Hoover，John E.，Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975年；Liberman，H.A.和Lachman,L.主编，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker纽约，N.Y.，1980年；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版，(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或共混方法控制药物扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些试剂也促进包衣或可蚀性骨架制剂的有效性。示例性的扩散促进剂/分散剂包括例如亲水聚合物、电解质、
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60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为
Figure BDA0003138165020001086
)和基于碳水化合物的分散剂，例如羟丙基纤维素(例如HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMCK15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)、非晶纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、具有环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，Pluronics
Figure BDA0003138165020001091
Figure BDA0003138165020001092
和
Figure BDA0003138165020001093
为环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；和泊洛沙明(例如，
Figure BDA0003138165020001094
也称为
Figure BDA0003138165020001095
其是由环氧丙烷和环氧乙烷顺序加成到乙二胺(BASF Corporation，Parsippany，N.J.)得到的四官能嵌段共聚物)、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇(例如聚乙二醇可具有约300至约6000、或约3350至约4000或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨酯-80、海藻酸钠、树胶(诸如黄蓍胶和阿拉伯树胶)、瓜尔胶、黄原酸烷(包括黄原胶(xanthan gum))、糖、纤维素(例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯-80、海藻酸钠、聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。特别适用于脂质体分散体和自乳化分散体的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自蛋的天然磷脂酰胆碱、来自蛋的天然磷脂酰甘油、胆固醇和肉豆蔻酸异丙酯。
一种或多种腐蚀促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可用于本发明的组合物中。
术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的化合物。稀释剂还可用于稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可提供pH值的控制或维持)在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液。在一些实施方案中，稀释剂增加了组合物的体积以促进压缩或产生用于胶囊填充的均匀共混物的足够体积。这类化合物包括，例如，乳糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、右旋糖、微晶纤维素诸如
Figure BDA0003138165020001096
磷酸氢钙、磷酸氢钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，诸如
Figure BDA0003138165020001097
(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、蔗糖基稀释剂、糖粉；一水硫酸钙、二水硫酸钙；三水乳酸钙、葡萄糖结合剂；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
“填充剂”包括化合物诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石粉、硬脂酰富马酸钠、烃诸如矿物油或氢化植物油诸如氢化大豆油
Figure BDA0003138165020001101
高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐诸如铝、钙、镁、锌、硬脂酸、硬脂酸钠、甘油、滑石粉、蜡、
Figure BDA0003138165020001102
硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇诸如CarbowaxTM、油酸钠、苯甲酸钠、甘油二十二烷酸酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅(诸如SyloidTM、
Figure BDA0003138165020001103
)、淀粉诸如玉米淀粉、硅油、表面活性剂等。
“增塑剂”是用于软化微囊化材料或膜涂层以低其脆性的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇诸如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。在一些实施方案中，增塑剂还可充当分散剂或湿润剂。
“增溶剂”包括诸如三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸钠、多库酯钠(sodium doccusate)、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚、二乙二醇单乙醚(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇酯等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等的化合物。
“悬浮剂”包括化合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630))、聚乙二醇(例如聚乙二醇可具有约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、聚山梨酯-80、羟乙基纤维素、海藻酸钠、树胶(诸如黄蓍胶和阿拉伯树胶)、瓜尔胶、黄原酸烷(包括黄原胶)、糖、纤维素(诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)、聚山梨酯-80、海藻酸钠、聚乙氧基脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙氧基脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚维酮等。
“表面活性剂”包括诸如以下的化合物：十二烷基硫酸钠、多库酯钠、Tween 60或80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如
Figure BDA0003138165020001111
(BASF)等。一些其他表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可以包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
“粘度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、Tween 80、维生素ETPGS、铵盐等的化合物。
编码抗体的核酸分子
本公开内容的另一方面涉及编码本文描述的抗体多肽或其抗原结合片段的分离的核酸序列。如本文可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。核酸分子可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。当通过标准技术(包括但不限于碱性/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域众所周知的其它技术)从其它细胞组分或其它污染物(例如，其它细胞核酸或蛋白质)纯化时，核酸分子被“分离”或“呈现为基本纯的”。参见F.Ausubel等人，编辑(1987年)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，纽约。根据本公开内容的至少一些实施方案的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一个优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码抗体的重链可变域的核酸序列。在一些实施方案中，编码第二可变轻链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：49的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第二可变轻链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：52的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一可变轻链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：50的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一可变轻链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：51的核苷酸序列。
在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码抗体的重链多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码第二可变重链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：46的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一可变重链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：47的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码第一可变重链结构域的核酸序列包含SEQ ID NO：48的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在双重可变结构域Ig中编码第一多肽的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：53的核苷酸序列。在一些实施方案中，在双重可变结构域Ig中编码第二多肽的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：55的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在双重可变结构域Ig中编码第一多肽的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：54的核苷酸序列。在一些实施方案中，在双重可变结构域Ig中编码第二多肽的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：56的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码抗体构建体的多肽的分离的核酸包含选自表15和表16的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码IgA重链恒定结构域的分离的核酸选自SEQ ID NO：61-66。在一些实施方案中，编码κ型轻链恒定结构域的分离的核酸包含SEQ ID NO：67或SEQID NO：68的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码λ型轻链恒定结构域的分离的核酸包含SEQ ID NO：69的核苷酸序列。
可使用标准分子生物学技术获得根据本公开内容的至少一些实施方案的核酸分子。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步所述)表达的抗体，由杂交瘤制备的编码抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得DNA片段，这些DNA片段可通过标准重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白质(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段。在本文中使用的术语“可操作地连接”是指将两个DNA片段连接在一起，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子可操作地连接，可将编码VH区的分离DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat，E.A.等人,(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国Department of Health and HumanServices，NIH出版物号91-3242)以及包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgA1或IgA2恒定区。可以将编码VH的DNA与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见，例如，Kabat，E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国Department of Health and Human Services，NIH出版物号91-3242)以及包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了生成scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与另一个编码肽接头的片段可操作连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。
从本公开内容中分离的核酸分子可包括包含开放阅读框(ORF)的核酸分子，其任选地具有一个或多个内含子，例如但不限于，至少一个CDR的至少一个指定部分，如至少一个轻链或至少一条重链的CDR1、CDR2和/或CDR3；核酸分子，其包含本文公开的抗体构建体的编码序列或可变区，例如轻链的可变区和重链的可变区；以及核酸分子，所述核酸分子包含与上述核苷酸序列基本不同的核苷酸序列，但是由于遗传密码的简并性，其仍然至少编码本文所述和/或本领域已知的抗体或其抗原结合片段或抗体的结构域或多肽。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，本领域技术人员将常规产生编码本公开内容的特异性抗体的此类简并核酸变体。参见例如Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本发明中。
本文提供了包含编码抗体的一个或多个结构域的核酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体的重链可变域或轻链可变域的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子既包含编码抗体的重链可变域的核酸序列，又包含编码抗体的轻链可变域的核酸序列。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链可变域的第一核酸序列，第二核酸分子包含编码轻链可变域的第二核酸序列。
在一些实施方案中，重可变域和轻链可变域从一个核酸分子或从两个分离的核酸分子表达为两个分离的多肽。在一些实施方案中，诸如当抗体是scFv时，单个核酸序列编码包含连接在一起的重链可变域和轻链可变域链的单个多肽。
在一些实施方案中，核酸分子是编码本文表1-2中抗体的任何氨基酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸序列与编码本文表12-17中任何氨基酸序列的核酸至少80％相同，例如至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。在一些实施方案中，核酸是与本文提供的任何一个或多个核酸序列杂交的核酸。在一些实施方案中，杂交是在中等条件下进行的。在一些实施方案中，杂交是在高度严格的条件下进行的，诸如：在65℃下至少约6X SSC和1％SDS，在约42℃下用约20％(v/v)甲酰胺在0.1X SSC中第一次洗涤10分钟，然后在65℃下用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤。
可使用本领域常规的重组DNA技术来构建核酸分子。在一些实施方案中，将核酸分子置于适合在所选宿主细胞中表达的表达载体中。
提供了包含编码本文的抗体或抗原结合片段的核酸分子的载体。还提供了包含编码重链和/或轻链的核酸分子的载体。这样的载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一个实施方案中，通过上述方法分别分离出编码轻可变域和重链可变域的核酸。在一个实施方案中，可以将编码轻链可变域和编码重链可变域的分离的核酸插入分开的表达质粒中，或一起插入同一质粒中，只要每一个都在合适的启动子和翻译控制下。在一些实施方案中，重链可变域和轻链可变域表达为单个多肽的一部分，例如当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链可变域的核酸分子，第二载体包含编码轻链可变域的核酸分子。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体以相似的量(诸如相似的摩尔的量或相似的质量的量)转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，将摩尔比或质量比在5：1至1：5之间的第一载体和第二载体转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用的质量比为1：1至1：5。在一些实施方案中，对于编码重链的载体和编码轻链的载体，使用1：2的质量比。在一些实施方案中，选择针对多肽在CHO或CHO衍生细胞或NSO细胞中的表达进行优化的载体。此类载体的示例描述于例如RunningDeer等人，Biotechnol.Prog.20：880-889(2004)中。
一方面，本公开内容提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括施用核酸分子，其中所述核酸分子以基因疗法的方式编码VH、VL、VH的CDR3区域或VL的CDR 3区域或其抗原结合片段，其中所述核酸分子包含本文公开的序列(例如表12-17)。基因疗法是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的疗法。在本发明的该实施方案中，核酸产生其编码的介导预防或治疗作用的蛋白。根据本文的实施方案，可使用本领域可用的任何基因疗法方法。
对于基因疗法方法的一般性综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science260：926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215，可使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编著)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，纽约；和Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression，实验室手册，Stockton Press，纽约。将治疗性抗体递送至合适的细胞可通过基因疗法离体、原位或在体内通过使用本领域已知的任何合适的方法实现，包括通过使用物理DNA转移方法(例如，脂质体或化学处理)或通过使用病毒载体(例如腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指被核酸分子和该细胞的后代或潜在后代转染的特定受试者细胞。这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不同，这是由于在随后的世代中或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中可能发生的突变或环境影响。
其他体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、单纯疱疹I病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统转染。核酸和转染剂任选地与微粒结合。示例性的转染剂包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、季铵两亲分子DOTMA((二油酰基丙基)三甲基溴化铵，由GIBCO-BRL商业化为Lipofectin))(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.美国84，7413-7417；Malone等人，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.美国86 6077-6081)；具有悬垂的三甲基铵头的亲脂性谷氨酸二酯(Ito等人，(1990)Biochem.Biophys.Acta 1023，124-132)；可代谢的母体脂质，诸如阳离子脂质二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS，Transfectam，Promega)和二-棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(DPPES)(J.P.Behr(1986)Tetrahedron Lett.27，5861-5864；J.P.Behr等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.美国86，6982-6986)；可代谢的季铵盐(DOTB、N-(1-[2,3-二油酰氧基]丙基)-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)(Boehringer Mannheim)、聚乙烯亚胺(PEI)、二油酰酯、ChoTB、ChoSC、DOSC)(Leventis等人，(1990)Biochim.Inter.22，235-241)；3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)/3β[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇DC-Col一对一混合物(Gao等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta1065，8-14)，精胺、亚精胺、脂多胺(Behr等人，Bioconjugate Chem，1994，5：382-389)、亲脂性聚赖氨酸(LPLL)(Zhou等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)、[[((1,1,3,3四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙基]二甲基苄基氢氧化铵(DEBDA氢氧化物)与过量的磷脂酰胆碱/胆固醇(Ballas等人，(1988)Biochim.Biophys.Acta 939，8-18)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/DOPE混合物(Pinnaduwage等人，(1989)Biochim.Biophys.Acta 985，33-37)、谷氨酸(TMAG)与DOPE、CTAB、DEBDA、双十二烷基溴化铵(DDAB)以及硬脂胺与磷脂酰乙醇胺混合的亲脂性二酯(Rose等人，(1991)Biotechnique10，520-525)、DDAB/DOPE(TransfectACE，GIBCO BRL)和带有低聚半乳糖的脂质。提高转移效率的示例性转染增强剂包括，例如DEAE-葡聚糖、聚凝胺、溶酶体破坏性肽(Ohmori N I等人，Biochem Biophys Res Commun Jun.27，1997；235(3)：726-9)、软骨素基蛋白聚糖、硫酸化蛋白聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(Pollard H等人，J Biol Chem，1998 273(13)：7507-11)、整联蛋白结合肽CYGGRGDTP、线性右旋糖酐九糖、甘油、连接在寡核苷酸3’-末端核苷间连接处的胆固醇基(Letsinger，R.L.1989Proc Natl Acad Sci USA 86：(17)：6553-6)、溶血磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和1-油酰基溶血磷脂酰胆碱。
在一些情况下，可能需要用将含核酸的载体引导至靶细胞的试剂递送核酸。此类“靶向”分子包括对靶细胞上的细胞表面膜蛋白具有特异性的抗体，或靶细胞上受体的配体。在使用脂质体的情况下，结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白可用于靶向和/或促进摄取。这样的蛋白质的实例包括对特定细胞类型有嗜性的衣壳蛋白质及其片段、对在循环中经历内化的蛋白质的抗体以及靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质。在其他实施方案中，可使用受体介导的内吞作用。诸如在Wu等人，1987或Wagner等人，1990中描述了这样的方法。有关当前已知的基因标记和基因疗法方案的综述，参见Anderson1992。还参见WO 93/25673及其中引用的参考文献。
实施例
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实施例1.基于IgA的抗体构建体诱导肿瘤细胞的吞噬作用
由于阻断CD47-SIRPα相互作用并使巨噬细胞上的FcR结合，CD20-CD47 IgA双特异性抗体构建体能够吞噬肿瘤细胞。在存在不同抗体的情况下，将CD20+CD47+CFSE标记的细胞系与未标记的人类巨噬细胞共温育，并通过流式细胞术评估靶细胞的吞噬作用。相对于同种型对照抗体观察到的基线水平，针对CD47或CD20的抗体诱导明显的吞噬作用。IgA双特异性抗体概括了抗CD47和利妥昔单抗联合治疗的协同作用，并相对于单独用抗CD47治疗，在所检测的细胞系中增加了吞噬作用。
实施例2.双特异性抗体构建体
双重可变结构域IgA免疫球蛋白(DVD-Ig双特异性IgA)
生成了能够结合CD20和CD47的双特异性抗体构建体，其是双重可变结构域IgA免疫球蛋白(DVD-Ig双特异性IgA)。在这些双特异性抗体构建体中，另外的可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)结构域通过短接头(SEQ ID NO：44；SGGGGS)连接在现有IgAVH-VL结构域的顶部。另外的VH结构域连接到预先存在的VH，同样另外的VL连接到预先存在的VL。除了这些双特异性构建体之外，还制备了两种采用scFv形式的单连接双重可变结构域抗体(DVD-IgA scFv)。scFv元件本身通过长接头(SEQ ID NO：45；GGGGSGGGGSGGGGS)将VL连接到VH，而总scFv分子通过短接头(SEQ ID NO：44；SGGGGS)连接到VL或VH。
抗原CD20结合可变域衍生自阿托珠单抗(CD20结合抗体)。CD47结合可变域衍生自5A3M5或2.3D11克隆(均为CD47结合抗体)。所有组合的概述见下表1
使用以下组合，在两个方向上都使用了另外的CD20和CD47可变域的定位：
双重连接的双特异性IgA：
在一个双特异性抗体构建体(双特异性抗体#2)中，位于外部结构域中的另外的VH/VL结构域包含CD20结合部分(即CD20结合可变域)，且预先存在的VH/VL结构域包含aCD47 2.3D11结合部分(即，CD47结合可变域)。
在另一个双特异性抗体构建体(双特异性抗体#1)中，位于外部结构域中的另外的VH/VL结构域包含aCD47 5A3M5结合部分(即CD47结合可变域)，且预先存在的VH/VL结构域包含aCD20结合部分。
scFv-LC单连接的双特异性IgA
双特异性抗体#6具有位于外部结构域中的scFv。scFV包含CD20结合部分，双特异性抗体构建体中预先存在的VH/VL结构域包含aCD472.3D11结合部分。scFv连接至aCD472.3D11结合部分的可变轻链，特别是可变轻链结构域。
双特异性抗体#5具有位于外部结构域中的scFv。scFv包含aCD475A3M5结合部分，并且预先存在的VH/VL结构域包含CD20结合部分。scFv连接至CD20结合部分的可变轻链，特别是可变轻链结构域。
scFv-HC单连接的双特异性IgA
双特异性抗体#4具有位于外部结构域中的scFv。scFv包含CD20结合部分，并且预先存在的VH/VL结构域包含aCD47 2.3D11结合部分。scFv连接至CD 47结合部分(aCD472.3D11结合部分)的可变重链，特别是可变重链结构域。
双特异性抗体#3具有位于外部结构域中的scFv。scFv包含CD47结合部分(aCD475A3M5结合部分)，并且预先存在的VH/VL结构域包含CD20结合部分。scFv连接至CD20结合部分的可变重链，特别是可变重链结构域。
表1列出了DVD-Ig双特异性IgA的特异性和取向。
Figure BDA0003138165020001201
Figure BDA0003138165020001211
κ-λ双特异性抗体
还产生了κ-λ双特异性抗体。在这些抗体中，对任何物质均不具有任何亲和力的重链与κ和λ轻链结合使用，每条κ和λ轻链均在其VL结构域中包含单独的亲和力。因此，双重特异性仅由轻链指导，在这种情况下是C2克隆的CD19，5A3M5克隆的CD47。通用重链的VH区被改造成IgA分子。κ和λ轻链未修饰。使用一组不含任何亲和力或特异性的对照轻链(即所谓的虚拟轻链)来确定单臂亲和力。下表2描述了κ-λ抗体的示例性组合。
表2列出了κ-λIgA双特异性抗体的特异性和组合
Figure BDA0003138165020001212
实施例3.双特异性抗体构建体的产生
IgA双特异性抗体构建体的克隆
DVD-IgA3.0
将由含有SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#1)(将两个VH相互连接)的5A3M3 VH和阿托珠单抗VH组成的片段密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
将由含有SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#2)(将两个VH相互连接)的阿托珠单抗VH和2.3D11 VH组成的片段密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
将由含有SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#1)(将两个VL相互连接)的5A3M3 VL和阿托珠单抗VL组成的片段密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
将由含有SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#2)(将两个VL相互连接)的阿托珠单抗VL和2.3D11 VL组成的片段密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
DVD-IgA scFv_HC
scFv片段由5A3M5 VH组成，该5A3M5 VH通过GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：45)连接至5A3M5 VL并随后通过SGGGGS(SEQ ID NO：44)接头(双特异性抗体#3)连接至阿托珠单抗VH，所述接头将scFv连接至VH，已对该片段进行密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
scFv片段由阿托珠单抗VH组成，该阿托珠单抗VH通过GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：45)连接至阿托珠单抗VL并随后通过SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#4)连接至2.3D11 VH，所述接头将scFv连接至VH，对该片段进行密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
阿托珠单抗VL或VH已克隆到pBluescript II载体中，其中通过HindIII-NotI将VH或VL亚克隆到含有IgA3.0或κ轻链恒定区的pEE14.4载体中。
2.3D11 VL或VH已克隆到pBluescript II载体中，其中通过HindIII-NotI将VH或VL亚克隆到含有IgA3.0或κ轻链恒定区的pEE14.4载体中。
DVD-IgA scFv_LC
scFv片段由5A3M5 VH组成，该5A3M5 VH通过GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：45)连接至5A3M5 VL并随后通过SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#5)连接至阿托珠单抗VL，所述接头将scFv连接至VH，已对该片段进行密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
scFv片段由阿托珠单抗VH组成，该阿托珠单抗VH通过GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：45)连接至阿托珠单抗VL并随后通过SGGGGS接头(SEQ ID NO：44)(双特异性抗体#6)连接至2.3D11 VL，所述接头将scFv连接至VH，对该片段进行密码子优化以用于灰仓鼠细胞中，其在IDT订购为合成DNA(gBlock)，并根据制造商的方案，使用HiFi组件(NEB)将其克隆到包含用HindIII和NotI预消化的IgA3.0恒定区的pEE14.4载体中。
κ-λ抗体
完整的IgA3.0通用重链被密码子优化用于灰仓鼠细胞，其被订购为合成DNA，并根据制造商的方案使用HiFi组件(NEB)将其组装到pcDNA3.4载体中。
完整的5A3M5κ轻链被密码子优化用于灰仓鼠细胞，其被订购为合成DNA，并根据制造商的方案使用HiFi组件(NEB)将其组装到pcDNA3.4载体中。
完整的C2λ轻链被密码子优化用于灰仓鼠细胞，其被订购为合成DNA，并根据制造商的方案使用HiFi组件(NEB)将其组装到pcDNA3.4载体中。
HEK293F细胞的转染
HEK293 Freestyle细胞经过以下修饰转染：使用1：1，33的DNA∶293fectin的比率。结合pAdvantage(Promega)，总浓度为1ug/mL，体积为2mL测定HC：LC DNA(即，编码重链的DNA和编码轻链的DNA)的几种抗体链比率。pAdvantage DNA的量始终等于重链DNA。
在FACS、ADCC、RBC和血小板分析实验中使用的上清液的产生量为4mL，其比例如下：#1(1：1：1)、#2(1：2：1)、#3(1：0,5：1)、#4(1：0,5：1)、#5(1：2：1)、#6(1：2：1)。
收获产生抗体的细胞，以350g离心5分钟，并收集所得上清液。通过0.22um的过滤器澄清上清液中的所有细胞碎片。
ELISA
然后在上述通过ELISA获得的澄清上清液中测定双特异性抗体的浓度，如下所示；
第1天：板涂
用100μL/孔在PBS o/n中，在4℃下用抗体涂覆板。
第2天：ELISA
用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤板3次，每次洗涤后轻轻甩动板。为了阻断板，向每个孔中加入150μL/孔阻断缓冲液，并在室温下温育1小时。轻轻甩动板并添加标准品。根据以下条件在阻断缓冲液中稀释样品，并在室温下温育2小时：标准稀释；100μL/孔及稀释样品；100μL/孔。
甩动板，然后用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。将检测抗体加入阻断缓冲液中；100μL/孔，在室温下温育1小时。甩动板，并用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后甩动板。加入ABTS底物(1片50mg，在50mL ABTS缓冲液中，在黑暗中保存)；100μL/孔，持续±15min。在Bio-Rad分光光度计上在OD 415nm下测量板。
使用的缓冲液是：洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)和阻断缓冲液(PBS，0.05％Tween-20，1％BSA)。使用的PBS；Sigma；D88537。涂层抗体是山羊-抗-人κ；SouthernBiotech；2060-01使用的是1：2000。所用的涂层抗体是山羊-抗-人λ；Southern Biotech；2070-01使用的是1：2000。标准曲线人IgA；BETHYL；p80-102。使用的检测抗体是山羊-抗-人IgA HRP；Southern Biotech；2050-05使用的是1：2000。使用的检测抗体是：山羊-抗-人λHRP；Southern Biotech；2070-05使用的是1：5000。使用MaxiSORP板进行分析；NUNC；439454和BSA；Roche；10735094001。
对于DVD-IgA、DVD-IgA-scFv和κ-κ抗体分子，将山羊-抗-人κ涂层抗体与山羊-抗-人IgA-HRP检测抗体组合使用。对于λ-λ抗体，将山羊-抗-人λ涂层抗体与山羊-抗-人IgA-HRP检测抗体组合使用。对于κ-λ抗体，将山羊-抗-人κ涂层抗体与山羊-抗-人λ-HRP检测抗体组合使用。
通过HiTrapκSelect纯化双特异性抗体
将上清液在PBS中按1：1稀释，然后加入5mL HiTrapκSelect柱(17-5458-12；GEHealthcare)。装满整个样品后，用5倍柱体积(CV)的PBS冲洗柱，然后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸pH2.5)洗脱柱。在预装有中和缓冲液(75uL 1M Tris pH 8.8)的试管中收集1mL馏分。
SDS-PAGE
将每种HiTrapκSelect洗脱液总共15uL加入不含还原剂的5uL 4x加样缓冲液(Bio-Rad)中，并在4-20％的Precast梯度凝胶MiniProtean TGX(Bio-Rad)上运行±1小时。将凝胶在摇杆上的InstantBlue(1SB1L；Expedeon)中染色，直到可见条带为止，然后在摇杆上用水洗涤3次，持续5分钟，然后扫描。
流式细胞术双特异性抗体结合测定
使用标准培养条件，在RPMI-1640培养基(Gibco)中培养SKBR3WT和SKBR3-CD20细胞。在4℃下，将100,000个细胞用Obi-IgA3.0(1ug/mL)或2.3D11-IgA2(1ug/mL)、50uL双特异性抗体上清液染色45分钟，然后在FACS缓冲液(PBS中的1％BSA)中洗涤。二抗用于检测IgA分子，在4℃下使用山羊抗-hIgA RPE F(ab')2(Southern Biotech 2052-09；使用1：150)45分钟，然后在FACS缓冲液中进行洗涤。用mIgG1抗-CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend；克隆CC26C；使用1：20)在4℃下预阻断部分细胞45分钟，然后洗涤。预阻断后，如上所述应用IgA抗体。在BD Canto II上分析样品，并使用FlowJo(BD)分析数据。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
将总共100万个靶细胞用51Cr标记至少3小时，然后在培养基中洗涤。通过在200uL20x稀释液中于4℃温育1小时，然后用培养基洗涤，用mIgG1抗-CD47 PerCp-Cy5.5抗体预阻断一部分(500,000)靶细胞。
使用标准的Ficoll-paque(GE Healthcare)和Histopaque-1119(Sigma Aldrich)从健康供体中分离效应细胞。在以1：1的PBS稀释的血液混合物应用之前，将Histopaque施加到Ficoll层的顶部。在室温下以450g将试管旋转25分钟。将PMN从Histopaque层中分离出来，并在培养基中洗涤。
在存在各种浓度的抗体(Obi-IgA3.0；2.3D11-IgA3.0)或双特异性抗体的原始上清液的情况下，使用总共200,000个PMN与5000个靶细胞(比例为1：40)共培养4小时。作为最小释放，仅取靶细胞和效应细胞，而对于最大释放，靶细胞和效应细胞在5％Triton中共同培养。
实施例4.双特异性抗体的产生和表征
使用标准条件在HEK293F细胞中产生所有10种形式的双特异性抗体，并收集澄清的上清液，通过0.22um过滤器，并在4℃下保存直至使用。通过ELISA评估上清液以确定成功的产生和抗体浓度。所有双特异性分子的生产都是成功的，并产生了足够的浓度用于下游测定。
对于DVD-Ig样双特异性抗体(#1-6)，将原始上清液直接应用于以下细胞：1)天然表达CD47但不表达CD20的SKBR3细胞(CD20-/CD47+)；2)用CD20转导的SKBR3细胞系，作为双阳性(CD20+/CD47+)细胞系。
进行流式细胞术分析以检测细胞表面上的IgA双特异性抗体。
为了确定双特异性抗体对CD47调理作用的效率以及与CD47的额外结合能力是否可增强双特异性抗体的CD20结合，使用了针对CD47的mIgG1阻断抗体(标有PerCP-Cy5.5)分别对CD47分子进行后阻断或预阻断。这是与IgA变体中使用的克隆不同的克隆。还进行了一项对照，以确定双特异性药物对CD20的调理作用，为此使用了IgG1阿托珠单抗。
对于预阻断(通过双特异性抗体确定增强的CD20结合)，使用以下方法：1)将CD47阻断抗体施加到细胞上，将未结合的抗体部分洗去；2)将细胞与双特异性抗体(上清液)一起温育，洗去未结合的双特异性抗体部分；以及3)将细胞与抗IgA-PE一起温育，洗去未结合的抗体部分。固定细胞并通过FACS测量。
对于阻断后(通过双特异性抗体确定CD47调理作用)，使用以下方法：1)将细胞与双特异性抗体(上清液)一起温育，洗去未结合的双特异性抗体部分；以及2)将细胞与抗IgA-PE一起温育，同时将CD47阻断抗体施加到细胞上，洗去未结合的抗体部分。固定细胞并通过FACS测量。已采取的对照是未染色的细胞，仅二抗和二价单特异性抗体。
在SKBR3细胞中，如预期的那样观察到二价单特异性抗体2.3D11的CD47的强结合。使用mIgG1 aCD47抗体的交叉阻断(crossblocking)实验显示，CD47可以成功被阻断，没有观察到双特异性抗体的结合。尽管看到了双特异性#4和#6的结合，但是如阻断后实验所观察到的，它们并没有完全调理细胞上的CD47。
在SKBR3-CD20中，所有双特异性抗体都以高亲和力结合CD20，但不能完全调理细胞。通过用抗CD47 mIgG1进行后阻断测定，CD47分子也未完全被调理。但是，将CD47分子预阻断后再用双特异性抗体染色时，观察到抗体#2、#3和#5的结合减少。如在CD20阴性细胞(SKBR3-WT)上观察到的，这些抗体未显示CD47的结合。这表明通过结合CD47分子，该双特异性抗体能够更好地结合CD20，显示出增强的结合。上面的观察结果表明，可将IgA抗体改造为双特异性抗体，同时结合两个靶标，其中在这些示例中，CD47结合增强CD20结合。
红细胞染色
进行了Histopaque/ficoll分离，以将红细胞与PMN/PBMC分离。血浆、PBMC、ficoll、hitopaque和PMN已被丢弃。剩余的红细胞沉淀在PBS中洗涤，以2400rpm旋转5分钟，然后将沉淀重新悬浮在5mL PBS中。每个样本10uL的量用于用小鼠IgG2b抗-人CD235a-PE(BD；克隆GA-R2；稀释度为1：40)与小鼠IgG1抗人CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend；克隆CC2C6；稀释度为1：20)结合染色，或用双特异性IgA抗体1-6的40uL上清液染色。在FACS缓冲液(PBS中的1％BSA)中完成稀释。在黑暗中于室温温育30分钟，用FACS缓冲液洗去过量的未结合抗体。将40uL加入FACS缓冲液稀释的检测抗体(山羊F(ab)'2抗-人IgA-FITC(SouthernBiotech；稀释度1：100))中，在黑暗中于室温温育30分钟，用FACS缓冲液洗去过量的未结合抗体。通过向沉淀的细胞中添加1％PFA来固定样品。在Canto II(BD)上进行测量，对CD235阳性事件进行门控。
血小板染色
每个样本使用来自肝素/EDTA管的10uL全血用于使用小鼠IgG1抗-人CD61-FITC(Dako；克隆Y2-51；稀释度1：20)与小鼠IgG1抗人CD47 PerCP-Cy5.5(Biolegend；克隆CC2C6；稀释度1：20)结合染色，或用双特异性IgA抗体1-6的40uL上清液染色。在FACS缓冲液(PBS中的1％BSA)中完成稀释。在黑暗中于室温温育30分钟，然后添加0.5uL检测抗体(山羊F(ab)'2抗-人IgA-RPE(Southern Biotech；稀释度为1：50)，并在黑暗中于室温温育30分钟。通过向沉淀的细胞中添加1％PFA来固定样品。在Canto II(BD)上进行测量，并对CD61阳性事件进行门控。
表3列出了可变重链的互补决定区的氨基酸序列
Figure BDA0003138165020001291
表4列出了可变轻链的互补决定区的氨基酸序列
Figure BDA0003138165020001301
表5列出了可变重链(VH)的氨基酸序列。粗体序列是按顺序排列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列。
Figure BDA0003138165020001302
Figure BDA0003138165020001311
表6列出了可变轻链(VL)的氨基酸序列。粗体序列是按顺序排列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列。
Figure BDA0003138165020001312
表7列出了DVD-IgA双特异性可变重链和可变轻链的氨基酸序列。CDR区域为粗体，接头为斜体。
Figure BDA0003138165020001321
Figure BDA0003138165020001331
表8列出了含有连接至可变重链结构域的scFv的多肽的氨基酸序列(DVD-IgAscFv_HC)。CDR区域为粗体，接头为斜体。
Figure BDA0003138165020001332
Figure BDA0003138165020001341
表9列出了含有连接至可变轻链结构域的scFv的多肽的氨基酸序列(DVD-IgAscFv_LC)。CDR区域为粗体，接头为斜体。
Figure BDA0003138165020001342
Figure BDA0003138165020001351
表10列出了示例性IgA恒定区的氨基酸序列
Figure BDA0003138165020001352
Figure BDA0003138165020001361
Figure BDA0003138165020001371
Figure BDA0003138165020001381
表11列出了连接肽的氨基酸序列
Figure BDA0003138165020001382
表12列出了VH区的核苷酸序列
Figure BDA0003138165020001383
Figure BDA0003138165020001391
表13列出了VL区的核苷酸序列
Figure BDA0003138165020001401
Figure BDA0003138165020001411
表14列出了DVD-IgA VH的核苷酸序列
Figure BDA0003138165020001412
Figure BDA0003138165020001421
Figure BDA0003138165020001431
表15列出了包含scFv的多肽的核苷酸序列(DVD-IgA scFv_HC)
Figure BDA0003138165020001432
Figure BDA0003138165020001441
Figure BDA0003138165020001451
表16列出了包含scFv的多肽的核苷酸序列(DVD-IgA scFv_LC)
Figure BDA0003138165020001452
Figure BDA0003138165020001461
Figure BDA0003138165020001471
表17列出了免疫球蛋白恒定区的序列
Figure BDA0003138165020001472
Figure BDA0003138165020001481
Figure BDA0003138165020001491
Figure BDA0003138165020001501
Figure BDA0003138165020001511
Figure BDA0003138165020001521
Figure BDA0003138165020001531
Figure BDA0003138165020001541
Figure BDA0003138165020001551
Figure BDA0003138165020001561
Figure BDA0003138165020001571
虽然本文已经示出并描述了本公开内容的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，在实践本公开内容时，可以采用本文所述实施方案的各种替代方案，或者本文所述的这些实施方案或方面中的一个或多个的组合。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (187)

1.一种抗体构建体，其包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域；
其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域包含第一轻链可变域可变域和第一重链可变域可变域中的至少一个。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域包含第二轻链可变域和第二重链可变域中的至少一个。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第一轻链可变域，并且其中所述第一轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)；
其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：13中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-L2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：14中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-L3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：15中具有最多两个氨基修饰的变体。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第一轻链可变域，并且其中所述第一轻链可变域包含与SEQ ID NO：26具有90％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第一重链可变域，并且其中所述第一重链可变域包含可变重链互补决定区1(CDR-H1)、可变重链互补决定区2(CDR-H2)和可变重链互补决定区3(CDR-H3)；
其中所述CDR-H1包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：4中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-H2包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：5中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：6中具有最多两个氨基修饰的变体。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第一重链可变域，并且其中所述第一重链可变域包含与SEQ ID NO：23具有90％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的抗体构建体，所述构建体包含所述第二轻链可变域，并且其中所述第二轻链可变域包含CDR-L1、CDR L2和CDR-L3；
其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：10中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-L2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：11中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-L3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：12中具有最多两个氨基修饰的变体。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第二轻链可变域，并且其中所述第二轻链可变域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第二重链可变域，并且所述第二重链可变域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
其中所述CDR-H1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：1中具有最多两个氨基修饰的变体，其中所述CDR-H2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：2中具有最多两个氨基修饰的变体，并且其中所述CDR-H3包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其在SEQ ID NO：3中具有最多两个氨基修饰的变体。
11.根据权利要求3-10中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体包含所述第二重链可变域，并且其中所述第二重链可变域包含与SEQ ID NO：22具有90％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求3-11中任一项所述的抗体构建体，其包含以下至少一种：
第一多肽，其包含所述第一重链可变域和第二重链可变域，其中所述第二重链可变域的C-末端与所述第一重链可变域的N-末端连接；以及
第二多肽，其包含所述第一轻链可变域和第二轻链可变域，其中所述第二轻链可变域的C-末端与所述第一轻链可变域的N-末端连接。
13.根据权利要求12所述的抗体构建体，其中所述第一多肽或所述第二多肽还包含连接所述可变域的连接肽。
14.根据权利要求13所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽包含SEQ IDNO：29的序列。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽的所述C-末端与(IgA)重链区连接。
17.根据权利要求16所述的抗体构建体，其中所述连接是通过IgA CH1恒定结构域进行的。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二多肽包含SEQ IDNO：31的序列。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含所述第一多肽和所述第二多肽。
20.根据权利要求3所述的抗体构建体，其包含以下至少一种：
第一多肽，其中所述第一重链可变域的所述C-末端与所述第二重链可变域的所述N-末端连接；或者
第二多肽，其中所述第一轻链可变域的所述C-末端与所述第二轻链可变域的所述N-末端连接。
21.根据权利要求20所述的抗体构建体，其中所述连接是通过连接肽进行的。
22.根据权利要求21所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽包含SEQ IDNO：30的序列。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽的所述C-末端与(IgA)重链区连接。
25.根据权利要求23所述的抗体构建体，其中所述连接是通过IgA CH1恒定结构域进行的。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二多肽包含SEQ IDNO：32的序列。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含所述第一多肽和所述第二多肽。
28.根据权利要求3-11中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含含有单链可变片段(scFv)的第一多肽，其中所述scFV包含与所述第二轻链可变域连接的所述第二重链可变域。
29.根据权利要求28所述的抗体构建体，其包含连接所述可变域的连接肽。
30.根据权利要求29所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：45的序列。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽包含与所述第一轻链可变域连接的scFv；或者
所述第一重链可变域。
32.根据权利要求31所述的抗体构建体，其中所述连接是通过连接肽进行的。
33.根据权利要求32所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的抗体构建体，其包含含有与第一轻链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：35具有至少90％同一性的序列。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的抗体构建体，其包含含有与第一重链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：33具有至少90％同一性的序列。
36.根据权利要求3所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含含有单链可变片段(scFv)的第一多肽，其中所述scFV包含与所述第一轻链可变域连接的所述第一重链可变域。
37.根据权利要求36所述的抗体构建体，其包含连接所述可变域的连接肽。
38.根据权利要求37所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：45的序列。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一多肽包含与所述第二轻链可变域连接的scFv；或者
所述第二重链可变域。
40.根据权利要求39所述的抗体构建体，其中所述连接是通过连接肽进行的。
41.根据权利要求40所述的抗体构建体，其中所述连接肽包含SEQ ID NO：44的序列。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的抗体构建体，其包含含有与所述第二轻链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：36具有90％同一性的序列。
43.根据权利要求39-41中任一项所述的抗体构建体，其包含含有与所述第二重链可变域连接的所述scFV的所述第一多肽，其中所述第一多肽包含与SEQ ID NO：34具有90％同一性的序列。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链结构域包含IgA重链恒定结构域。
45.根据权利要求44所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域是IgA1恒定结构域或其变体。
46.根据权利要求45所述的抗体构建体，其中所述IgA1恒定结构域包含IgA1 CH2区域和IgA1 CH3区域或其变体中的至少一个。
47.根据权利要求46所述的抗体构建体，其中所述IgA1恒定区还包含IgA1 CH1区域其变体。
48.根据权利要求44所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域是IgA2恒定结构域或其变体。
49.根据权利要求48所述的抗体构建体，其中所述IgA2恒定结构域包含IgA2 CH2区域和IgA2 CH3区域或其变体中的至少一个。
50.根据权利要求49所述的抗体构建体，其中所述IgA2恒定区还包含IgA2 CH1区域。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25。
52.根据权利要求44-51中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个或两个天然存在的糖基化位点。
53.根据权利要求52所述的抗体构建体，其中所述构建体缺少至少两个天然存在的糖基化位点，并且其中所述至少两个天然存在的糖基化位点在至少一个IgA CH2区域或IgACH3区域中。
54.根据权利要求53所述的抗体构建体，其中所述至少两个天然存在的糖基化位点是两个天然存在的N-连接的糖基化位点。
55.根据权利要求44-54中任一项所述的构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
56.根据权利要求44-54中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的氨基酸置换或两个残基的置换。
57.根据权利要求44-56中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基。
58.根据权利要求57所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸置换。
59.根据权利要求58所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸置换。
60.根据权利要求57所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸缺失。
61.根据权利要求44-60中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基。
62.根据权利要求61所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸置换。
63.根据权利要求61所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基的缺失。
64.根据权利要求44-63中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基。
65.根据权利要求64所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸置换。
66.根据权利要求65所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的缺失。
67.根据权利要求44-66中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基。
68.根据权利要求67所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸置换。
69.根据权利要求68所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的缺失。
70.根据权利要求44-69中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基。
71.根据权利要求70所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸置换。
72.根据权利要求71所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的缺失。
73.根据权利要求52-72中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述构建体表现出更长的循环半衰期。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体包含与相应的野生型CD47结合域相比对CD47具有较低亲和力的衰减CD47结合域。
75.根据权利要求52-74中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出降低的聚集。
76.根据权利要求52-75中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体与血清蛋白表现出降低的聚集。
77.根据权利要求44-76中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定区包含一个或多个白蛋白结合域。
78.根据权利要求77所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体比不包含一个或多个白蛋白结合域的相应抗体构建体具有更长的半衰期。
79.根据权利要求44-78中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含与选自SEQ ID NO：37-41中任一个的序列具有90％序列同一性的氨基酸序列。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的抗体构建体，其中所述构建体还包含铰链区。
81.根据权利要求80所述的抗体构建体，其中所述铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
82.根据权利要求80或权利要求81所述的抗体构建体，其中所述铰链区包含人IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的抗体构建体，其中所述铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体还包含轻链恒定区。
85.根据权利要求84所述的抗体构建体，其中所述轻链恒定区是κ恒定区。
86.根据权利要求84所述的抗体构建体，其中所述轻链恒定区是λ恒定区。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的抗体构建体，其中所述轻链恒定区与所述第一轻链可变域或所述第一重链可变域连接。
88.一种抗体构建体，其包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链恒定结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域，
其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
89.根据权利要求88所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域包含第一轻链可变域和第一重链可变域。
90.根据权利要求89所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域包含第二轻链可变域和第二重链可变域。
91.根据权利要求90所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域是κ型。
92.根据权利要求91所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域是λ型。
93.根据权利要求90所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域是λ型。
94.根据权利要求93所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域是κ型。
95.根据权利要求91或92所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域是κ型，其包含SEQ ID NO：16的可变轻链互补决定区1(CDR-L1)氨基酸序列、SEQ ID NO：17的可变轻链互补决定区2(CDR L2)氨基酸序列、SEQ ID NO：18的可变轻链互补决定区3(CDR-L3)氨基酸序列。
96.根据权利要求95所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域包含与SEQ ID NO：27具有90％序列同一性的氨基酸序列。
97.根据权利要求92所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域是λ型，其包含SEQID NO：19的可变轻链互补决定区1(CDR-L1)氨基酸序列、SEQ ID NO：20的可变轻链互补决定区2(CDR L2)氨基酸序列、SEQ ID NO：21的可变轻链互补决定区3(CDR-L3)氨基酸序列。
98.根据权利要求97所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域包含与SEQ ID NO：28具有90％序列同一性的氨基酸序列。
99.根据权利要求90-98中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一重链可变域和所述第二重链可变域是相同的。
100.根据权利要求99所述的抗体构建体，其中所述第一重链可变域和所述第二重链可变域包含SEQ ID NO：7的可变重链互补决定区1(CDR-H1)氨基酸序列、SEQ ID NO：8的可变重链互补决定区2(CDR-H2)氨基酸序列、SEQ ID NO：9的可变重链互补决定区3(CDR-H3)氨基酸序列。
101.根据权利要求100所述的抗体构建体，其中所述第一重链可变域和所述第二重链可变域包含与SEQ ID NO：24具有90％序列同一性的氨基酸序列。
102.根据权利要求89-101中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域还包含κ恒定区。
103.根据权利要求90-102中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域还包含λ恒定区。
104.根据权利要求89-101中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一轻链可变域还包含λ恒定区。
105.根据权利要求90-101或权利要求104中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二轻链可变域还包含κ恒定区。
106.根据权利要求102-105中任一项所述的抗体构建体，其中所述κ恒定区包含与SEQID NO：42具有95％序列同一性的氨基酸序列。
107.根据权利要求103-105中任一项所述的抗体构建体，其中所述λ恒定区包含与SEQID NO：43具有95％序列同一性的氨基酸序列。
108.根据权利要求88-107中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含IgA CH2区域和IgA CH3区域或其变体中的至少一个。
109.根据权利要求108所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域还包含IgACH1区域或其变体。
110.根据权利要求109所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域通过所述IgA CH1结构域与所述IgA恒定结构域连接。
111.根据权利要求109-110所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域通过所述IgA CH1结构域与所述IgA恒定结构域连接。
112.根据权利要求88-111中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域是IgA1恒定区或其变体。
113.根据权利要求112所述的抗体构建体，其中所述IgA1恒定区包含IgA1 CH2区域和IgA1 CH3区域。
114.根据权利要求113所述的抗体构建体，其中所述IgA1恒定区还包含IgA1 CH1区域。
115.根据权利要求88-111中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域是IgA2恒定区或其变体。
116.根据权利要求115所述的抗体构建体，其中所述IgA2恒定区包含IgA2 CH2区域和IgA2 CH3区域。
117.根据权利要求116所述的抗体构建体，其中所述IgA2恒定区还包含IgA2 CH1区域。
118.根据权利要求88-117中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25。
119.根据权利要求108-118中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少一个、两个或三个天然存在的糖基化位点。
120.根据权利要求119所述的抗体构建体，其中所述位点在所述IgA CH2区域或IgACH3区域中的至少一个中。
121.根据权利要求119或权利要求120所述的抗体构建体，所述构建体缺少两个天然存在的N-连接的糖基化位点。
122.根据权利要求108-121中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基。
123.根据权利要求122所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含至少一个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的氨基酸置换或至少两个天然存在的天冬酰胺(N)氨基酸残基的置换。
124.根据权利要求108-123中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基。
125.根据权利要求124所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸置换。
126.根据权利要求125所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的非保守氨基酸置换。
127.根据权利要求126所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(C)氨基酸残基的氨基酸缺失。
128.根据权利要求108-127中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的酪氨酸(Y)氨基酸残基。
129.根据权利要求128所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的氨基酸置换。
130.根据权利要求129所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的半胱氨酸(Y)氨基酸残基的缺失。
131.根据权利要求108-130中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基。
132.根据权利要求131所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的氨基酸置换。
133.根据权利要求132所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的苏氨酸(T)氨基酸残基的缺失。
134.根据权利要求108-133中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基。
135.根据权利要求134所述的抗体构建体其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的氨基酸置换。
136.根据权利要求135所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定区包含所述至少一个天然存在的异亮氨酸(I)氨基酸残基的缺失。
137.根据权利要求108-136中任一项所述的抗体构建体，其中与相应的野生型IgA相比，所述IgA重链恒定结构域缺少至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基。
138.根据权利要求137所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定区包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的氨基酸置换。
139.根据权利要求138所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定结构域包含所述至少一个天然存在的脯氨酸(P)氨基酸残基的缺失。
140.根据权利要求119-139中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出更长的循环半衰期。
141.根据权利要求119-140中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出更长的半衰期。
142.根据权利要求119-141中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体表现出降低的聚集。
143.根据权利要求119-142中任一项所述的抗体构建体，其中与包含相应的野生型IgA重链恒定区的相应抗体构建体相比，所述抗体构建体与血清蛋白表现出降低的聚集。
144.根据权利要求1-143中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定区包含一个或多个白蛋白结合域。
145.根据权利要求144所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体比不包含一个或多个白蛋白结合域的相应抗体构建体具有更长的半衰期。
146.根据权利要求88-145中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链恒定区还包含铰链区。
147.根据权利要求146所述的抗体构建体，其中所述铰链区包含IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
148.根据权利要求147所述的抗体构建体，其中所述铰链区包含人IgA铰链氨基酸序列或其变体或片段。
149.根据权利要求147或148所述的抗体构建体，其中所述铰链是IgA1铰链或IgA2铰链或其变体或片段。
150.根据权利要求1-149中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体还包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒素剂。
151.根据权利要求150所述的抗体构建体，其中所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。
152.根据权利要求150所述的抗体构建体，其中所述治疗剂或细胞毒素剂是抗代谢剂、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类抗生素、毒素或凋亡剂。
153.根据权利要求1或权利要求88所述的抗体构建体，其中所述免疫效应细胞是嗜中性粒细胞。
154.根据权利要求1或权利要求88所述的抗体构建体，其中当所述抗原结合域也与表达CD47的所述靶细胞结合时，所述抗体构建体仅抑制所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)功能。
155.根据权利要求1或权利要求88所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体是双特异性的。
156.根据权利要求1或权利要求88所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域是Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单域抗体(sdAb)或骆驼VHH结构域。
157.根据权利要求1或权利要求8所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域是Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单域抗体(sdAb)或骆驼VHH结构域。
158.根据权利要求153-157中任一项所述的抗体构建体，其中所述IgA重链结构域是两个IgA重链恒定结构域的异二聚体。
159.根据权利要求158所述的抗体构建体，其中所述异二聚化是通过杵臼结构偶联、盐桥/静电互补偶联、CrossMab偶联、链交换工程化结构域技术或其组合进行的。
160.根据权利要求153-159中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域结合癌细胞或病原体的抗原。
161.根据权利要求160所述的抗体构建体，其中所述病原体是细菌、微生物或病毒。
162.一种抗体构建体，其包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域；
其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，
其中所述抗原是CD20、GD2、间皮素、CD38、CD19、EGFR、HER2、PD-L1或CD25，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
163.一种多特异性免疫效应细胞接合分子，其包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域；
其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
164.一种药物组合物，其包含
权利要求1-161中任一项所述的抗体构建体，
以及药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。
165.根据权利要求164所述的药物组合物，其进一步包含至少一种另外的治疗剂。
166.根据权利要求165所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是显像剂、细胞毒素剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、辅刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、抗细胞因子抗体或其功能性片段、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗牛皮癣剂、甾皮质激素、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药物、抗精神病药物、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入性类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
167.一种分离的核酸，其编码权利要求1-161中任一项所述的抗体构建体。
168.一种载体，其包含权利要求167所述的分离的核酸。
169.一种体外细胞，其包含权利要求167所述的分离的核酸。
170.一种体外细胞，其表达权利要求1-161中任一项所述的抗体构建体。
171.一种治疗有需要的受试者的方法，其包含向所述受试者施用有效量的包含抗体构建体的组合物，其中所述抗体构建体包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域；
其中所述IgA重链结构域特异性结合免疫效应细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述免疫效应细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力。
172.根据权利要求171所述的方法，其中对所述CD47与所述SIRPα结合的所述抑制增加了所述靶细胞的吞噬作用和清除率。
173.根据权利要求171-172中任一项所述的方法，其中所述组合物通过口服、病灶内、静脉内治疗或通过皮下、肌内、动脉内、静脉内、腔内、颅内或腹膜内注射施用。
174.根据权利要求171-173中任一项所述的方法，其中所述组合物每天、每周、每两周、每月、每两个月、每三个月一次、每6个月一次或每12个月一次施用。
175.根据权利要求171-174中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述癌症选自急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、胆管癌、B细胞白血病、B细胞淋巴瘤、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、宫颈癌、Burkitt淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、神经胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌、甲状腺髓样癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、肺气管癌、肾癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、尿路上皮癌和膀胱癌。
177.根据权利要求171-176中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
178.根据权利要求171-177中任一项所述的方法，其包括施用有效量的至少一种另外的治疗剂。
179.权利要求178的方法，其中所述另外的治疗剂是显像剂、化学治疗剂、激酶抑制剂、辅刺激分子阻断剂、粘附分子阻断剂、二抗或其抗原结合片段、药物、毒素、酶、细胞毒素剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、甲氨蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记物或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉剂、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗治牛皮癣剂、甾皮质激素、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药物或抗精神病药物。
180.一种诱导嗜中性粒细胞介导的对靶细胞的免疫应答的方法，其包括：
使所述靶细胞与有效量的抗体构建体接触，其中所述抗体构建体包含：
(a)免疫球蛋白A(IgA)重链结构域；
(b)CD47结合域；以及
(c)抗原结合域；
其中所述IgA重链结构域特异性结合嗜中性粒细胞上的FcαR，
其中所述CD47结合域抑制靶细胞上表达的CD47与所述嗜中性粒细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)的结合，
其中所述抗原结合域结合所述靶细胞上的抗原，以及
其中与所述CD47相比，所述抗体构建体对所述抗原具有更高的结合亲和力，从而诱导所述嗜中性粒细胞介导的免疫应答。
181.根据权利要求180所述的方法，其中所述嗜中性粒细胞介导的免疫应答包括所述靶细胞的吞噬作用或所述靶细胞的裂解。
182.根据权利要求180-181中任一项所述的方法，其中抗原呈递细胞是癌细胞或病毒细胞。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述癌细胞是淋巴细胞。
184.根据权利要求1-162中任一项所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域包含所述第一轻链可变域，所述第一轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR-L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含选自表A的氨基酸序列。
185.根据权利要求1-162或权利要求184中任一项所述的抗体构建体，其中所述CD47结合域包含所述第一重链可变域，所述第一重链可变域包含可变重链互补决定区1(CDR-H1)、可变重链互补决定区2(CDR-H2)和可变重链互补决定区3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含选自表A的氨基酸序列。
186.根据权利要求1-162或权利要求184-185中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域包含所述第二轻链可变域，所述第二轻链可变域包含可变轻链互补决定区1(CDR-L1)、可变轻链互补决定区2(CDR-L2)和可变轻链互补决定区3(CDR-L3)，其中所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3包含选自表B的氨基酸序列。
187.根据权利要求1-162或权利要求184-186中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原结合域包含所述第二重链可变域，所述第二重链可变域包含可变重链互补决定区1(CDR-H1)、可变重链互补决定区2(CDR-H2)和可变重链互补决定区3(CDR-H3)，其中所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3包含选自表B的氨基酸序列。
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