CN112941039A

CN112941039A - 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用

Info

Publication number: CN112941039A
Application number: CN202110140752.8A
Authority: CN
Inventors: 吴俊华; 魏继武; 张海林; 张永辉; 吴俊艺; 刘淑雯; 马丁
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-06-11
Also published as: WO2022160475A1

Abstract

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种新型类囊泡溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开了：病毒Ad5sPVRCD137L感染能表达特定膜蛋白VSV‑G的细胞，然后利用离心挤压/剪切的方法将这些细胞通过膜孔从而形成囊泡，制造由类囊泡包裹的溶瘤病毒，类囊泡的外表面在制备过程中保留了细胞表面的膜蛋白VSV‑G。所制备的新型类囊泡溶瘤病毒可以通过膜蛋白VSV‑G实现重靶向，增加病毒的基因转导效率，而且能逃避抗病毒抗体的中和作用，还能提高病毒产量，病毒所表达的可溶性融合蛋白sPVRCD137L可以发挥阻断免疫检测点和活化免疫共刺激的双重功能。该新型类囊泡溶瘤病毒能显著活化抗肿瘤免疫并最终显著延长小鼠生存。

Description

一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其是肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，每年都有数百万的人死于癌症。许多数病人在诊断时已经处于中晚期从而失去外科手术治疗的机会，传统的放疗化疗，并没有给肿瘤带来突破性的进展，即使小分子靶向药物，也面临着短期内复发的巨大挑战。

近十年来，抗肿瘤免疫治疗临床研究不断出现的令人振奋的结果，给肿瘤患者重新带来了希望。同时阻断免疫负性调控和激活共刺激通路是被证明为有效的治疗肿瘤的方法，至今已有多个免疫检查点阻断剂被批准为用于临床肿瘤治疗的药物。TIGIT(T cellimmunoglobulin and immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif[ITIM]domain)是近年来发现的另外一个表达在淋巴细胞上的免疫检查点调控分子，参与对活化的T细胞及NK细胞的负性调控。阻断TIGIT从而恢复CD226的免疫共刺激通路，是一个巧妙而且有效的抗肿瘤免疫策略。

如何在肿瘤局部有效诱导I型干扰素介导的免疫活化、增强肿瘤微环境免疫细胞的浸润，可以使肿瘤对靶向免疫检查点的治疗更加敏感，这也许是解决免疫检查点治疗普适性(有效率)不高的有效手段之一。然而，如何解决免疫检查点治疗“脱靶”效应这一问题呢？

病毒作为外来侵入颗粒，能够有效激活机体的天然免疫和适应性免疫。随着溶瘤病毒T-Vec在2015年底被FDA批准上市，溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗受到越来越多的关注。溶瘤病毒免疫疗法是否可以使肿瘤对靶向免疫检查点的治疗更加敏感，从而解决免疫检查点治疗普适性(有效率)不高这一问题(免疫检查点治疗遇到的第1个问题)。

另外，得益于溶瘤病毒在肿瘤细胞具有选择性复制的优势，利用表达免疫检查点阻断剂的溶瘤腺病毒在肿瘤局部复制的同时，使得免疫活化最大限度被局限在肿瘤的局部微环境，有效避免阻断免疫检查点“脱靶”而造成其它正常组织的“误伤”(免疫检查点治疗遇到的第2个问题)。

目前，缺乏一种同时具有阻断免疫检查点和激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒。

另外，虽然溶瘤腺病毒在肿瘤局部表达肿瘤免疫治疗蛋白的策略有巨大的优势，然而腺病毒的native tropism限制了溶瘤腺病毒的应用。Ad5通过病毒的fiber knob与靶细胞膜上的CAR(the coxsackie and adenovirus receptor)结合进入细胞。大量研究表明，Ad5对细胞表面低表达CAR的肿瘤感染效率差，这也限制了溶瘤腺病毒Ad5介导的肿瘤基因治疗的临床疗效，又由于大部分肿瘤细胞低表达CAR，因此开发增强腺病毒对CAR低表达肿瘤细胞感染效率的方法至关重要。除此之外，人体中广泛存在的腺病毒中和抗体也是限制腺病毒疗法临床疗效的重要因素。

现已有方法用于提高Ad5对CAR低表达细胞的感染效率。第一种方法是使用共价键修饰Ad5的衣壳，主要方式是通过在Ad5衣壳上附加人造的polymers，这些polymer包括polyethylene glycol(PEG),polyactic glycolic acid(PLGA),Polyethyleneimine(PEI)或lipids。第二种方法是通过对Ad5的基因改造实现腺病毒的重靶向，如：在Ad5 fiberknob domain的HI loop区插入Arg-Gly-Asp(RGD)多肽的Ad5-RGD；Ad5和Ad35的fiber嵌合型Ad5/35。这些方式确实能在一定程度上增加病毒感染的效率，但操作上相对繁琐。

近年来人造囊泡技术替代天然外泌体技术用来装载药物。人造囊泡技术能克服天然外泌体产量低的问题，人造囊泡技术目前仅仅用于包裹药物实现靶向投送，目前为止使用其包裹病毒还未见有报道。而且，大家普遍认为该技术不太可能用于包裹病毒这么大的治疗实体。

因此，本发明希望通过我们的研究实现突破，构建表达sPVRCD137L的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L，并结合离心挤压/剪切制备类囊泡的技术来包裹复制型溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L，从而制备出EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L。这样一来，所制备的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L不仅可以通过溶瘤腺病毒表达可溶性蛋白sPVRCD137L，该蛋白的一端是可以结合TIGIT的PVR蛋白，另一端是可以结合CD137的CD137L蛋白，sPVRCD137L在与TIGIT结合之后能阻断PVR-TIGIT免疫检测点通路；sPVRCD137L在与CD137结合之后能活化CD137介导的免疫共刺激通路。

而且包裹病毒的类囊泡上还引入了VSV-G蛋白，能够实现病毒的重靶向，新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L能够感染裸病毒本身不能感染或者低感染的细胞，不仅如此，制备的EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L还能够抵抗抗病毒中和抗体。那么这种新型的溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在体内外是不是能展示出出乎我们预料的性能呢？

发明内容

本发明中，我们展示使用离心挤压/剪切的方法制备类囊泡来包裹溶瘤病毒，从而制备出类囊泡病毒。具体来说，使用表达特定蛋白Vesicular stomatitis Indiana virusG protein(VSV-G)的293T细胞(293T-VSV-G细胞)，用复制型溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L感染293T-VSV-G细胞，利用离心挤压/剪切制备类囊泡技术，制造出类囊泡包裹的病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L。我们把离心挤压/剪切制备类囊泡技术所制备的病毒称为类囊泡病毒。

本发明所公开的制备新型类囊泡病毒的方法其关键性的技术特征为：感染了病毒的细胞通过离心挤压/剪切的方式依次通过孔径由大到小的滤膜。这个挤压的步骤能够使得病毒表面包裹上一层类似于胞外囊泡的膜。只要滤膜的孔径大小选择的合适，所有的感染了病毒之后的细胞都能提供这种挤压的方式制备获得类囊泡病毒。

也正是因为经过挤压之后病毒表面包裹上一层类似于胞外囊泡的膜，这样的膜是来自于细胞的，因此如果原先细胞的膜上有胞外膜蛋白，经过离心挤压/剪切步骤之后的类囊泡的膜上也能镶嵌有这样的胞外膜蛋白。这样一来我们就可以选择最终出现在类囊泡的膜上的蛋白：让细胞在感染病毒之前就已经可以表达所需要的胞外膜蛋白。

本发明后面的实施例展示出本方法过程简单、原理明了，因此能够由实施例展示的结果来支持我们在权利要求部分的权利要求。

用类囊泡技术包裹病毒制备的新型类囊泡病毒具有以下突出的实质性特点和显著进步：

1、类囊泡技术包裹病毒过程中，这些包裹病毒的类囊泡外膜上会引入我们期望引入、可以带来靶向性的蛋白VSV-G。这些类囊泡外膜上的靶向性的蛋白VSV-G能够实现病毒的重靶向，VSV-G能够靶向大多数的肿瘤细胞。

2、制备出的新型类囊泡病毒还能够逃避抗病毒中和抗体。病毒在使用之后，正常情况下体内会产生抗体，其中极有可能有中和抗体(能够阻止病毒再次感染的抗体)产生。尤其是，有些病毒在该病毒治疗之前有可能我们就接触过或者感染过，已经产生了中和抗体。无论哪种情况，中和抗体的产生似乎是不可避免的。那么，问题就来了，要想有好的治疗效果，那么就要有较长的治疗窗口期。而用类囊泡技术制备类囊泡病毒，由于有类囊泡膜的存在，改变了中和抗体可能的作用机会，延长了治疗的窗口期，从而能显著提升治疗效果。

3、类囊泡技术制备类囊泡病毒的简单，类囊泡技术制备类囊泡病毒的产率与传统方法相比提高了数倍，相应的制备成本也得到了显著的降低。

4、新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L对多种不同的CAR低表达的肿瘤细胞感染效率高；

5、新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L对多种肿瘤细胞的溶瘤能力；

6、新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在肿瘤细胞和组织中的sPVRCD137L的表达量高，而且持续稳定，能够确保病毒的抗肿瘤治疗效果；

7、新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L能够抵抗Ad5抗体的中和，延长病毒治疗窗口，并且持续表达sPVRCD137L。

8、新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L具有显著的抗肿瘤免疫活化作用，能显著延长小鼠的生存期，具有显著的肿瘤治疗效果。

附图说明

图1.CAR的表达与Ad5-GFP感染效率的关系。构建了表达GFP的非复制型腺病毒Ad5-GFP，用Ad5-GFP感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞72小时后，细胞用于荧光显微镜观察分析或者流式分析。a.相同数量的293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞使用单克隆抗体anti-CAR-PE染色后用于流式分析各个细胞株CAR的表达水平；isotype为使用同源的IgG-PE抗体处理细胞，作为对照。

b.腺病毒Ad5-GFP的基因组结构示意图。c.Ad5-GFP病毒感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT细胞72h后典型的荧光照片，柱状图为流式统计GFP阳性细胞比率，以293T感染效率为100％分别计算Ad5在其他各组细胞株中的感染效率。d.Ad5-GFP病毒感染悬浮细胞H22/K562/Jurkat后流式分析典型散点图，柱状图为流式结果统计图。数据呈现为mean±SD.***P＜0.001.

图2带有VSV-G的新型类囊泡病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的制备。离心挤压/剪切装置的示意图。将悬于液体中的细胞装入注射器后，施加离心力(5000转每分钟)，活塞会挤压下方的注射器中的液体，液体连同细胞会被挤压/剪切通过带有不同孔径的PCTE膜，在细胞通过这些PCTE膜孔时会产生囊泡。通过由大尺寸到小尺寸的膜孔的挤压通过，最后能够产生纳米囊泡。

图3溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L的基因组结构示意图

图4EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L感染效率的对比**：p<0.01图5EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L复制能力的对比ns：无显著性差异

图6EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L溶瘤能力的对比**：p<0.01

图7EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L表达soluble PVRCD137L能力的对比**：p<0.01

图8EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L在H22腹水癌模型上对小鼠存活期的影响对比**：p<0.01

图9EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L在B16小鼠实体瘤模型上对小鼠存活期的影响对比*：p<0.05，ns：无显著性差异

图10EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L在CT26小鼠实体瘤模型上对小鼠存活期的影响对比*：p<0.05

具体实施方式

实施例部分所涉及到的所有实验材料和方法

1、细胞系和细胞培养方法

人肝细胞癌细胞系HCC-LM3和鼠肝细胞癌细胞系H22购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库并通过STR鉴定和支原体检测。鼠肝细胞癌细胞系Hepa1-6人胚胎肾细胞系293T，人T细胞白血病细胞系Jurkat，人慢性粒细胞白血病细胞系K562，人肺泡腺癌细胞系A549，小鼠黑色素瘤B16-F10，Lewis结肠癌细胞系CT26.WT来自美国ATCC公司。293T-VSV-G是工程化的表达VSV-G的293T细胞系。Jurkat K562和H22使用含10％胎牛血清2mM谷氨酰胺,100units/mL青霉素,和0.1mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养。HCC-LM3 Hepa1-6A549B16-F10和293使用含10％胎牛血清2mM谷氨酰胺,100units/mL青霉素,和0.1mg/mL链霉素的DMEM培养基培养。所有细胞培养都是在37℃含5％二氧化碳的恒温细胞培养箱中培养。

293T-VSV-G细胞系构建

表达VSV-G的真核表达质粒pCMV-VSV-G(金斯瑞合成与构建)、表达REV的真核表达载体pCMV-REV(金斯瑞合成与构建)、表达gag-pol慢病毒骨架蛋白的真核质粒pCMV-gag-pol(金斯瑞合成与构建)和表达慢病毒基因组携带有VSV-G基因的真核表达质粒pCMV-CAG-VSV-G-2A-puro(金斯瑞合成与构建)共同转染293T细胞，72小时后收集上清，使用0.45微米的针头滤器过滤。使用病毒上清感染293T细胞，48小时后使用含有1微克每毫升的嘌呤霉素维持培养。CAG-VSV-G-2A-PURO序列如SEQ ID NO:11所示。

2、重组腺病毒Ad5sPVRCD137L的构建

(1)可溶性蛋白sPVRCD137L的基因克隆以及携载sPVRCD137L基因的腺病毒穿梭质粒的构建

小鼠PVR和CD137L属于膜蛋白，其结构依次是:N端信号肽-胞外区-跨膜区-胞内区C端。PVR与TIGIT结合的功能单位是胞外区，CD137L与CD137结合的功能单位也是胞外区，所以sPVRCD137L将PVR的胞外区与CD137L的胞外区进行融合，中间使用连接肽GGGSGGGSGGGS连接，N端保留信号肽。

可溶性蛋白sPVRCD137L的基因克隆：分别设计合成引物PVR-F、PVR-R、CD137L-F、CD137L-R；使用PVR-F和PVR-R引物，以小鼠肝癌细胞Hep1-6的cDNA为模板扩增得到片段EXO-PVR；使用CD137L-F和CD137L-R引物，以小鼠肝癌细胞Hep1-6的cDNA为模板扩增得到片段EXO-CD137L；体外合成Linker DNA；引物PVR-R和CD137L-F分别有16bp左右与linker序列5’和3’完全一致。使用PCR技术以PVR-R和CD137L-F为引物，将EXO-PVR、linker、EXO-CD137L片段按设计拼接，完成sPVRCD137L基因克隆。sPVRCD137L、EXO-PVR、EXO-CD137L、Linker和信号肽(CD33)的蛋白序列如序列表SEQ ID NO:1-5所示；sPVRCD137L、EXO-PVR、EXO-CD137L和Linker的DNA序列如序列表SEQ ID NO:6-10所示。基因模板构建相关引物如表1所示：

表1

携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒Ad5sPVRCD137LShuttle-sPVRCD137L载体的构建：合成sPVRCD137L的全长序列，并且在C端加上HIS标签序列，然后使用Infusion技术将含有HIS标签的sPVRCD137L片段与Ad5sPVRCD137LShuttle(pZD55)连接。具体步骤：首先使用限制性内切酶BglII对Ad5sPVRCD137LShuttle(pZD55)线性化，纯化后片段按照sPVRCD137L：Ad5sPVRCD137LShuttle的2:1比例使用Infusion试剂盒(clontech lab.Inc.)进行连接，后经转化扩增验证获得携载sPVRCD137L基因的腺病毒穿梭质粒Ad5sPVRCD137LShuttle-sPVRCD137L。

1.2.1.2Ad5sPVRCD137L病毒构建(质粒构建、病毒拯救与扩增)

A.Ad5sPVRCD137L全长质粒构建：将构建好的穿梭载体Ad5sPVRCD137LShuttle-sPVRCD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5sPVRCD137L全长质粒。

B.Ad5sPVRCD137L病毒拯救：Ad5sPVRCD137L全长质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1μg/well转染293T细胞，5％CO₂、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。

C.病毒扩增：取病毒种液50μl加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO₂ 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。

Ad5sPVRCD137L腺病毒扩增与纯化使用293T-VSV细胞，用MOI是5的病毒感染细胞72小时，收集细胞后反复冻融4000×g离心20min去除细胞碎片，收集上清即为病毒悬液；病毒的纯化使用碘克沙醇密度梯度离心。病毒滴度测定，使用293T细胞接种96-Wells板，10000cells/well；将病毒10倍稀释；100ul/Well，培养4天，使用荧光显微镜观察，有绿色荧光细胞孔定义为阳性，每个阳性孔计为0.1，将所所有阳性孔相加为S。病毒TCID50＝10² ^+(S/10-0.5)/ml,

pfu/ml＝0.7×TCID50/ml。

3、新型类囊泡溶瘤腺病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的制作

使用293T-VSV-G细胞接种6个10cm²的培养皿(1×10⁷cells/plate)，过夜培养后接种5×10⁷pfu的Ad5sPVRCD137L病毒，继续培养72h,收集细胞去除细胞培养上清，使用30mlDMEM重悬。

将细胞悬液使用图2所示的离心挤压/剪切装置挤压细胞3次通过10μm的polycarbonate track-etched(PCTE)膜(Whatman)；收集的液体再使用图2所示的离心挤压/剪切装置挤压细胞3次通过5μm的polycarbonate track-etched(PCTE)膜(Whatman)；收集的液体再使用图2所示的离心挤压/剪切装置挤压/剪切细胞3次通过1μm的polycarbonate track-etched(PCTE)膜(Whatman)。收集挤压后的病毒悬液，将病毒悬液加入带有15％20％和40％碘克沙醇(iodixanol)垫层的离心管中，100000×g离心90min，分别收集15％与20％位之间和20％与40％iodixanol之间的病带。使用5％甘油、1mM MgCl2、150mM NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.6)的透析液透析2次,测定病毒滴度后分装保存至-80℃冰箱。

4、病毒感染效率检测

病毒感染效率检测首先使用1×10⁵cells/well待检测细胞接种24-well板，按照指定病毒量加入相应的病毒，37℃5％CO2培养48小时，荧光显微镜观察拍照；收集细胞，流式统计GFP阳性细胞比率，以Ad5sPVRCD137L病毒感染293T GFP阳性细胞比率为1，计算其它细胞病毒的感染效率。

5、中和试验

腺病毒中和抗体由王世兵(浙江理工大学)馈赠腺病毒免疫兔血清。VSV-G中和抗体来自经验证的志愿者血清。动物实验腹水样品处理分别使用400×g和12000×g转速离心10min去除细胞和细胞碎片。中和试验用血清和腹水都使用56℃灭活处理30min。293T接种24well-plate(1×10⁵cells/well)，37℃培养4h后，使用100ul含1×10⁵pfu病毒的DMEM与指定稀释度中和血清或腹水37℃共孵育30min，将病毒抗体混合液加入提前接种293T细胞(1×10⁵cells/well)的24孔板37℃培养1小时，去除病毒上清，加入完全培养基继续48h后观察荧光，流式统计GFP阳性细胞比率，以未使用抗体处理组的GFP阳性细胞比率为100％计算各处理组抗体中和比率。

6、MTT细胞活力分析

使用待检测细胞株接种于96-well plate每孔1万个细胞37℃培养4小时，按指定病毒量加入相应病毒，4小时后去除病毒悬液，更换完全培养基继续培养72小时。每孔100ulMTT稀释液(1mg/ml)，继续培养4小时。去除上清，加异丙醇150ul，震荡15min，使用570波长检测吸光度。以未处理细胞培养孔吸光度为细胞活力100％计算其它处理组细胞力。

7、Q-PCR检测virus的复制功能

使用MOI为5的病毒Ad5sPVRCD137L或EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L接种Hepa1-6、B16/F10、CT26.WT和H22细胞处理后分别在6h，24h，36h，48h，60h，72h收细胞，使用基因组提取试剂盒(天根生化)提取总DNA。使用PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix，以定量后的shuttle-Ad5sPVRCD137L质粒为标准品，以Q-E1A F和Q-EIA R为引物，定量PCR检测病毒各时间点基因组copies。各处理组分别以其6h病毒拷贝数为1,分别计算各时间的病毒拷贝增加倍数。

8、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)的定量检测

可溶性PVRCD137L的含量测定：使用2μg/ml的Anti-His-tag单克隆抗体(购于南京金斯瑞生物科技有限公司，南京，中国)包被ELISA 96孔板。加100μl的细胞上清或腹水37℃孵育2小时；使用含0.1％的吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗去未结合的可溶性蛋白，加检测抗体兔抗鼠PVR单克隆抗体37℃孵育1小时；PBS-T清洗5遍，加入100μl生物素标记的山羊抗兔IgG抗体和HRP标记得亲和素稀释液，室温孵育1小时。PBS-T清洗10遍后加入底物TMB常温反应30分钟，加50μl终止液(2N硫酸)，使用酶标仪检测OD450。

其他蛋白的ELISA检测采用上述类似的方法。

9、流式细胞术分析腹水中免疫细胞亚群检测

按照实验方案抽取小鼠腹水，离心400×g 5分钟收集细胞，使用PBS洗两遍。按照细胞标志物组合在室温避光条件下孵育抗体30min。PBS洗两遍使用500μl PBS重悬，使用流式细胞仪检测分析。T细胞使用CD3-APC、CD4-FITC和CD8-PerCP-Cy^TM5.5标记的CD3+CD4+或CD3+CD8+的两个T细胞亚群。NK细胞使用CD3-APC和NK1.1-FITC标记的CD3-NK1.1+的细胞。PD-L1阳性细胞使用CD274 PE标记。CD3 APC,CD8a PerCP-Cy^TM5.5,CD4 FITC,NK1.1 FITCand CD274 PE(购于BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)。

肿瘤细胞表面CAR的表达检测

每种细胞系通过离心的方法收集100万细胞，使用PBS洗2遍。使用anti-CAR-PE抗体室温孵育30min(避光)。使用PBS洗2遍，重悬于500μl的PBS中。使用流式细胞仪检测分析。

10、IFN-γ酶联斑点检测(IFN-γEILSpot assay)腹水中活化淋巴细胞检测

IFN-γEILSpot检测板的准备：按照Mouse IFN-γEILSpot PLUS kit(购于3321-2AW-Plus；Mabtech,Nacka Strand,Sweden)说明书要求准备IFN-γEILSpot检测板。按照实验方案指定时间点抽取小鼠腹水，通过离心的方法去出腹水收集腹水中细胞。使用PBS洗两遍后使用胎盘蓝染色后计数。准备1×10⁶cells/ml的细胞悬液。按照每孔200μl体积把细胞悬液加入提前准备的IFN-γEILSpot检测板。放置于37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中过夜培养20小时。去除细胞悬液，按照说明书要求处理并显色。使用ELISpot读板机进行检测分析。

实施例1腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低

CAR(the coxsackie and adenovirus receptor)是腺病毒Ad5感染细胞的主要受体。早期研究已证明腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低。^13,19我们通过流式分析发现293T、A549、HCC-LM3和Hepa1-6细胞使用anti-CAR-PE染色后，与isotype处理组相比荧光强度显著增加，说明293T、A549、HCC-LM3和Hepa1-6细胞表面CAR高表达(图1a)；而B16-F10、CT26.WT和H22细胞表面使用CAR抗体染色后，与isotype处理组相比荧光强度无明显变化；说明这些细胞株不表达CAR；而K562和Jurkat细胞使用CAR抗体染色后，与isotype处理组相比荧光强度仅少量增加，远低于293T等细胞株，说明这些细胞株低表达CAR(图1a)。接下来，为了验证CAR的表达与Ad5感染效率之间的关系，我们构建了表达GFP的非复制型腺病毒Ad5-GFP，(图1b)，使用MOI为1的Ad5-GFP处理293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT和H22细胞，72h后发现，CAR高表达的293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6细胞有50％-60％的细胞被Ad5-GFP感染并表达GFP，这几株细胞之间Ad5-GFP的感染效率无显著差异；然而CAR低表达的贴壁细胞B16-F10、CT26.WT、H22被Ad5-GFP感染的效率低于5％，极显著的低于293T等CAR高表达细胞株(P＜0.001)(图1c，d)。悬浮细胞株K562和Jurkat在使用MOI为100的Ad5-GFP病毒感染72h，K562和Jurkat分别只有8.26％±0.64％和12.08％±0.81％的细胞被感染，极显著的低于MOI为1的Ad5-GFP病毒对293T的感染效率(52.3％±2.61％)(P＜0.001)(图1d)。以上结果证明，腺病毒Ad5对细胞的感染效率与细胞表面表达CAR的量相关，腺病毒Ad5对CAR高表达的细胞感染效率高，腺病毒Ad5对CAR低表达的细胞感染效率低。

图1.CAR的表达与Ad5-GFP感染效率的关系。构建了表达GFP的非复制型腺病毒Ad5-GFP，用Ad5-GFP感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞72小时后，细胞用于荧光显微镜观察分析或者流式分析。a.相同数量的293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT、H22、K562和Jurkat细胞使用单克隆抗体anti-CAR-PE染色后用于流式分析各个细胞株CAR的表达水平；isotype为使用同源的IgG-PE抗体处理细胞，作为对照。b.腺病毒Ad5-GFP的基因组结构示意图。c.Ad5-GFP病毒感染293T、A549、HCC-LM3、Hepa1-6、B16-F10、CT26.WT细胞72h后典型的荧光照片，柱状图为流式统计GFP阳性细胞比率，以293T感染效率为100％分别计算Ad5在其他各组细胞株中的感染效率。d.Ad5-GFP病毒感染悬浮细胞H22/K562/Jurkat后流式分析典型散点图，柱状图为流式结果统计图。数据呈现为mean±SD.***P＜0.001.

实施例2类囊泡技术用于制备带有VSV-G的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L

Vesicular stomatitis Indiana virus G protein(VSV-G)能够介导病毒进入迄今为止所测试的所有细胞类型，被广泛用于基因转导和基因治疗²⁶。本研究希望借助类囊泡技术技术，利用VSV-G对细胞的广嗜性，实现Ad5的重靶向，增加Ad5对CAR低表达细胞系的感染效率。

首先我们构建了表达VSV-G的293T细胞(293T-VSV-G)，使用MOI为5的Ad5sPVRCD137L感染293T-VSV-G细胞，37℃培养72h后收集细胞，收集的细胞分成两部分，一部分使用传统方案冻融3次后，碘克沙醇密度梯度离心纯化病毒；另一部份制作带有VSV-G的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L，通过反复离心挤压依次通过孔径10μm、5μm、1μm polycarbonate膜，使用15％，20％，40％碘克沙醇密度梯度离心，收集20％-40％密度梯度之间的组分。

我们使用DLS方法(Zetasizer，马尔文)对裸露的Ad5和新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L进行表征分析。裸露病毒Ad5大小为60-90nm；而新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的直径在100-200nm之间，大小与细胞外囊泡类似，由此可见由于病毒外面裹了一层双层膜，所以比裸露病毒Ad5要大。

我们又采用常规ELISA的方法对病毒颗粒新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L的VSV-G蛋白进行了检测(Anti-VSV-G tag抗体，ab3861)，确认病毒颗粒新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L含有VSV-G蛋白。

为了进一步研究类囊泡技术方法对病毒回收产量的影响，我们检测了类囊泡技术方法的病毒回收产量以及传统冻融方案的病毒回收产量，发现与传统冻融方案比，类囊泡技术方法能够将病毒产量提高8.4±1.43倍(P<0.01)。

以上结果表明，类囊泡技术可以装载腺病毒，该技术制备的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L其外层包裹有一层类囊泡膜，因此其尺寸要比裸露的病毒大一些；EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L上存在VSV-G蛋白；并且使用该技术制备病毒，病毒的回收产量显著增多。

图2带有VSV-G的新型类囊泡病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的制备。离心挤压/剪切装置的示意图。将悬于液体中的细胞装入注射器后，施加离心力，活塞会挤压下方的注射器中的液体，液体连同细胞会被挤压/剪切通过带有不同孔径的PCTE膜，在细胞通过这些PCTE膜孔时会产生囊泡。通过由大尺寸到小尺寸的膜孔的挤压通过，最后能够产生纳米囊泡。

实施例3EM/VSV-G技术制备的EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在体外具有更高的感染效率、表达分泌soluble PVRCD137L的能力和溶瘤能力

溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L是一个表达soluble PVRCD137L的溶瘤腺病毒Ad5(命名为Ad5sPVRCD137L)，溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L的基因组结构示意图如图3所示。溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L对CAR低表达肿瘤类型的低感染率严重限制了Ad5sPVRCD137L的转化应用。我们将EM/VSV-G技术应用到溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L上，期望通过EM/VSV-G技术显著增加其对CAR低表达肿瘤细胞系的感染效率，提升溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L的治疗效应和扩展其应用范围。溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L经过EM/VSV-G技术制备所获得的病毒我们命名为EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L。

图3溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L的基因组结构示意图

与Ad5sPVRCD137L病毒(简写为Ad5PC)相比，EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L(简写为EM/VSV-G Ad5PC)对CAR低表达肿瘤细胞系的感染效率极显著的提高，在K562、Jurkat、B16/F10、CT26.WT和H22细胞株上分别提高到了3.2±0.38、4.1±0.47、5.3±0.71、3.6±0.43和9.8±1.12(图4)。

图4EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L感染效率的对比**：p<0.01

我们又在不同细胞株中对比了EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L和Ad5sPVRCD137L的复制效率，发现EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L和Ad5sPVRCD137L在K562、Jurkat、B16/F10、CT26.WT和H22细胞株上复制效率无显著差异(图5)。结果说明这种EM/VSV-G技术只增加病毒感染效率并不影响病毒复制。

图5EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L复制能力的对比ns：无显著性差异

接下来我们又分析了病毒MOI值在50时，EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L和Ad5sPVRCD137L在K562、Jurkat、B16/F10、CT26.WT和H22细胞株上的溶瘤作用，结果显示EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L的溶瘤效应显著增加(图6)，也许是由于EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L感染效率显著高于Ad5sPVRCD137L，虽然病毒复制效率无增加但进入细胞病毒量会显著增加。

图6EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L溶瘤能力的对比**：p<0.01

接下来我们用相同病毒滴度(MOI值为10)的EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L和Ad5sPVRCD137L感染细胞，然后常规Elisa法检测病毒感染的细胞上清中分泌的可溶性PVRCD137L的含量，结果表明，与Ad5sPVRCD137L相比，K562、Jurkat、B16/F10、CT26.WT和H22细胞的培养基上清中soluble PVRCD137L的表达，在EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L感染之后，呈现极显著的提高(图7)。

总的来说，利用EM/VSV-G技术制备的EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L能够提高溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L在低CAR表达细胞株中感染效率，增加溶瘤作用和soluble PVRCD137L的表达量，这些体外研究结果提示我们这种离心挤压/剪切的EM/VSV-G技术也许能够提高溶瘤腺病毒Ad5sPVRCD137L在体内的抗肿瘤作用。

实施例4EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L诱导更强的抗肿瘤作用，极显著的延长小鼠生存期。

我们使用H22细胞系建立了小鼠腹水瘤模型、使用B16和CT26细胞系建立了小鼠实体瘤模型，研究EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在活体内的抗肿瘤作用。H22细胞系建立了小鼠腹水瘤模型：0天时腹腔注射5×10⁶的H22细胞，在第3、9、15、21天，每只小鼠腹腔注射5×10⁸pfu的病毒，观察存活情况。B16和CT26细胞系建立了小鼠实体瘤模型：0天时皮下注射5×10⁶的B16或者CT26细胞，在第11、14、17、20天，每只小鼠瘤内注射5×10⁸pfu的病毒，观察存活情况。

小鼠腹水瘤模型结果发现EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组和Ad5sPVRCD137L处理组与saline对照组相比，小鼠生存期显著延长，EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L与Ad5sPVRCD137L组各有4只和1只小鼠被治愈，分别占40％和10％(图8)；EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组与Ad5sPVRCD137L处理组相比，小鼠生存期也极显著延长(图8)。

B16小鼠实体瘤模型结果发现EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组与saline对照组相比，虽然没有小鼠被治愈，但小鼠生存期显著延长(图9)；Ad5sPVRCD137L处理组与saline对照组相比，小鼠生存期有所延长(图9)；EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组与Ad5sPVRCD137L处理组相比，小鼠生存期也显著延长(图9)。

同样的在CT26小鼠实体瘤模型结果发现EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组和Ad5sPVRCD137L处理组与saline对照组相比，虽然没有小鼠被治愈，但小鼠生存期显著延长(图10)；EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L处理组与Ad5sPVRCD137L处理组相比，小鼠生存期也显著延长(图10)。

综上所述，用类囊泡技术包裹病毒制备的新型类囊泡病毒具有以下突出的实质性特点和显著进步：

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种新型类囊泡溶瘤病毒及其在制备抗肿瘤药物上的应用

<130> 20210201-2

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 1

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly

20 25 30

Asp Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val

35 40 45

Thr His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser

50 55 60

Met Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys

65 70 75 80

Arg Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala

85 90 95

Ser Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr

100 105 110

Cys Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp

115 120 125

Leu Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val

130 135 140

Gln Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly

145 150 155 160

Gly Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met

165 170 175

Pro Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val

180 185 190

Thr Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn

195 200 205

Val Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu

210 215 220

Thr Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly

225 230 235 240

Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys

245 250 255

Asp Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr

260 265 270

Met Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu

275 280 285

Ile Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val

290 295 300

Thr Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys

305 310 315 320

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

325 330 335

Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala

340 345 350

Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln

355 360 365

Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser

370 375 380

Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser

385 390 395 400

Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu

405 410 415

Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu

420 425 430

Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser

435 440 445

Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala

450 455 460

Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp

465 470 475 480

Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser

485 490 495

Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp

500 505 510

Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val

515 520 525

Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu His His His His His His

530 535 540

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 2

Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr

20 25 30

His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met

35 40 45

Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg

50 55 60

Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser

65 70 75 80

Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu

100 105 110

Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln

115 120 125

Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly

130 135 140

Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro

145 150 155 160

Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr

165 170 175

Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val

180 185 190

Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr

195 200 205

Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr

210 215 220

Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp

225 230 235 240

Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met

245 250 255

Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile

260 265 270

Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr

275 280 285

Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys

290 295 300

<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 3

Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn

1 5 10 15

Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr

20 25 30

Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala

35 40 45

Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly

50 55 60

Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu

65 70 75 80

Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val

100 105 110

Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu

115 120 125

Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val

130 135 140

Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu

145 150 155 160

Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg

165 170 175

Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu

180 185 190

Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu

195 200

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 5

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met

<210> 6

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 6

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat ggacgtcgtc 60

gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac 120

ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt 180

gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa 240

cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg 300

ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag 360

ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag 420

gttcagaagg tccagctcac tggagagcca gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg 480

ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc 540

caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc actgtcacca gcctctggat attggtgccc 600

tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag 660

cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg tactaccccc cagaggtatc catctctggc 720

tatgataaca actggtacct tggccagaat gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc 780

aacccagagc ccacaggcta taattggagc acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct 840

gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta 900

atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa 960

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggcgct cacaatcacc 1020

acctcgccca acctgggtac ccgagagaat aatgcagacc aggtcacccc tgtttcccac 1080

attggctgcc ccaacactac acaacagggc tctcctgtgt tcgccaagct actggctaaa 1140

aaccaagcat cgttgtgcaa tacaactctg aactggcaca gccaagatgg agctgggagc 1200

tcatacctat ctcaaggtct gaggtacgaa gaagacaaaa aggagttggt ggtagacagt 1260

cccgggctct actacgtatt tttggaactg aagctcagtc caacattcac aaacacaggc 1320

cacaaggtgc agggctgggt ctctcttgtt ttgcaagcaa agcctcaggt agatgacttt 1380

gacaacttgg ccctgacagt ggaactgttc ccttgctcca tggagaacaa gttagtggac 1440

cgttcctgga gtcaactgtt gctcctgaag gctggccacc gcctcagtgt gggtctgagg 1500

gcttatctgc atggagccca ggatgcatac agagactggg agctgtctta tcccaacacc 1560

accagctttg gactctttct tgtgaaaccc gacaacccat gggaa 1605

<210> 7

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 7

gacgtcgtcg tgcaggcgcc cacccaggtg cccggcttct tgggcgactc cgtgacgctg 60

ccctgctacc tacaggtgcc caacatggag gtgacgcatg tgtcacagct gacttgggcg 120

cggcatggtg aatctggcag catggccgtc ttccaccaaa cgcagggccc cagctattcg 180

gagtccaaac ggctggaatt cgtggcagcc agactgggcg cggagctgcg gaatgcctcg 240

ctgaggatgt tcgggttgcg cgtagaggat gaaggcaact acacctgcct gttcgtcacg 300

ttcccgcagg gcagcaggag cgtggatatc tggctccgag tgcttgccaa gccccagaac 360

acagctgagg ttcagaaggt ccagctcact ggagagccag tgcccatggc ccgctgcgtc 420

tccacagggg gtcgcccgcc agcccaaatc acctggcact cagacctggg cgggatgccc 480

aatacgagcc aggtgccagg gttcctgtct ggcacagtca ctgtcaccag cctctggata 540

ttggtgccct caagccaggt ggacggcaag aatgtgacct gcaaggtgga gcacgagagc 600

tttgagaagc ctcagctgct gactgtgaac ctcaccgtgt actacccccc agaggtatcc 660

atctctggct atgataacaa ctggtacctt ggccagaatg aggccaccct gacctgcgat 720

gctcgcagca acccagagcc cacaggctat aattggagca cgaccatggg tcccctgcca 780

ccctttgctg tggcccaggg cgcccagctc ctgatccgtc ctgtggacaa accaatcaac 840

acaactttaa tctgcaacgt caccaatgcc ctaggagctc gccaggcaga actgaccgtc 900

caggtcaaa 909

<210> 8

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 8

gcgctcacaa tcaccacctc gcccaacctg ggtacccgag agaataatgc agaccaggtc 60

acccctgttt cccacattgg ctgccccaac actacacaac agggctctcc tgtgttcgcc 120

aagctactgg ctaaaaacca agcatcgttg tgcaatacaa ctctgaactg gcacagccaa 180

gatggagctg ggagctcata cctatctcaa ggtctgaggt acgaagaaga caaaaaggag 240

ttggtggtag acagtcccgg gctctactac gtatttttgg aactgaagct cagtccaaca 300

ttcacaaaca caggccacaa ggtgcagggc tgggtctctc ttgttttgca agcaaagcct 360

caggtagatg actttgacaa cttggccctg acagtggaac tgttcccttg ctccatggag 420

aacaagttag tggaccgttc ctggagtcaa ctgttgctcc tgaaggctgg ccaccgcctc 480

agtgtgggtc tgagggctta tctgcatgga gcccaggatg catacagaga ctgggagctg 540

tcttatccca acaccaccag ctttggactc tttcttgtga aacccgacaa cccatgggaa 600

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 9

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 10

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat g 51

<210> 11

<211> 3136

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 11

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240

taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300

acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360

gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420

gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480

gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540

ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660

gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720

ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780

ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840

cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900

ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattgccacc atgaagtgcc ttttgtactt 960

agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata gtttttccac acaaccaaaa 1020

aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc ccgtcaagct cagatttaaa 1080

ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa atgcccaaga gtcacaaggc 1140

tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg gtcactactt gtgatttccg 1200

ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc ttcactccat ctgtagaaca 1260

atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg ctgaatccag gcttccctcc 1320

tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca gtgattgtcc aggtgactcc 1380

tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt gattcacagt tcatcaacgg 1440

aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct acaacctggc attctgacta 1500

taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg gacatcacct tcttctcaga 1560

ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg ttcagaagta actactttgc 1620

ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc aagcattggg gagtcagact 1680

cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc tttgctgcag ccagattccc 1740

tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag acctcagtgg atgtaagtct 1800

aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc caagaaacct ggagcaaaat 1860

cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat cttgctccta aaaacccagg 1920

aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa tactttgaga ccagatacat 1980

cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc ggaatgatca gtggaactac 2040

cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa gacgtggaaa ttggacccaa 2100

tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta tacatgattg gacatggtat 2160

gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg ttcgaacatc ctcacattca 2220

agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt tttggtgata ctgggctatc 2280

caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt tggaaaagct ctattgcctc 2340

ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg gttctccgag ttggtatcca 2400

tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt tatacagaca tagagatgaa 2460

ccgacttgga aagagcggcg ccaccaactt cagcctgctg aagcaggccg gcgacgtgga 2520

ggagaacccc ggccccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 2580

cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 2640

caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 2700

gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgcgg ccgtggcggt 2760

ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 2820

ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 2880

gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca 2940

gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 3000

ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 3060

cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg 3120

caagcccggt gcctga 3136

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 12

caccaccacc accaccac 18

<210> 13

<211> 538

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 13

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120

ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300

cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 360

ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 420

aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 480

taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatc 538

<210> 14

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 14

atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60

gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120

cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180

gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240

ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300

cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360

gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420

gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480

cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540

atgtttgtct acagtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct 600

gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct 660

gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc taacacacct 720

cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt gagagttggt 780

gggcgtcgcc aggctgtgga atgtatcgag gacttgctta acgagcctgg gcaacctttg 840

gacttgagct gtaaacgccc caggccataa 870

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> A人工序列(.)

<400> 15

gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

<210> 16

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 16

ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 60

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 120

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 180

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 240

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctgccac 297

<210> 17

<211> 3739

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 17

cacctatcga taagcttggg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 60

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 120

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 180

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 240

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 300

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 360

gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 420

gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 480

attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 540

agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 600

ccgactctag aggatccgcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 660

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 720

agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 780

agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 840

gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 900

acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 960

tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 1020

aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 1080

tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 1140

aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 1200

ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 1260

acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 1320

gcatggacga gctgtacaag gctagcgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg 1380

tggaggagaa tcccggccct accggaatga gacatattat ctgccacgga ggtgttatta 1440

ccgaagaaat ggccgccagt cttttggacc agctgatcga agaggtactg gctgataatc 1500

ttccacctcc tagccatttt gaaccaccta cccttcacga actgtatgat ttagacgtga 1560

cggcccccga agatcccaac gaggaggcgg tttcgcagat ttttcccgac tctgtaatgt 1620

tggcggtgca ggaagggatt gacttactca cttttccgcc ggcgcccggt tctccggagc 1680

cgcctcacct ttcccggcag cccgagcagc cggagcagag agccttgggt ccggtttcta 1740

tgccaaacct tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca 1800

gtgacgacga ggatgaagag ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc 1860

acggttgcag gtcttgtcat tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt 1920

cgctttgcta tatgaggacc tgtggcatgt ttgtctacag tcctgtgtct gaacctgagc 1980

ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg 2040

ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt ctagagaatg caatagtagt acggatagct 2100

gtgactccgg tccttctaac acacctcctg agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca 2160

ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact 2220

tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact tgagctgtaa acgccccagg ccataacacc 2280

tatcgataag cttgggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 2340

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 2400

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca 2460

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 2520

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 2580

tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 2640

ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 2700

ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 2760

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg 2820

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccga 2880

ctctagagga tccgccacca tgaccggtat gtgggtccgg caggtaccct ggtcattcac 2940

ttgggctgtg ctgcagttga gctggcaatc agggtggctt ctagaggtcc ccaatgggcc 3000

ctggaggtcc ctcaccttct acccagcctg gctcacagtg tcagagggag caaatgccac 3060

cttcacctgc agcttgtcca actggtcgga ggatcttatg ctgaactgga accgcctgag 3120

tcccagcaac cagactgaaa aacaggccgc cttctgtaat ggtttgagcc aacccgtcca 3180

ggatgcccgc ttccagatca tacagctgcc caacaggcat gacttccaca tgaacatcct 3240

tgacacacgg cgcaatgaca gtggcatcta cctctgtggg gccatctccc tgcaccccaa 3300

ggcaaaaatc gaggagagcc ctggagcaga gctcgtggta acagagagaa tcctggagac 3360

ctcaacaaga tatcccagcc cctcgcccaa accagaaggc cggtttcaag gcatggtcca 3420

ccaccaccac caccaccact aactcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 3480

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3540

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3600

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3660

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 3720

ggaaagaacc agctgccac 3739

<210> 18

<211> 1687

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 18

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120

ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300

cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 360

ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 420

aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 480

taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 540

ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgactct agaggatccg 600

ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 660

tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 720

cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 780

ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 840

tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 900

tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 960

ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1020

ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1080

agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1140

tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 1200

accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 1260

tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 1320

agtaatggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc agatatccag 1380

cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 1440

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 1500

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 1560

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 1620

aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 1680

ccagctg 1687

<210> 19

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 19

atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60

gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120

ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180

atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240

gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300

ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360

ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420

gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480

gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540

acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600

gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660

ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720

aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780

tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840

acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900

caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960

cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020

tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080

ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140

gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200

tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260

ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320

tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380

tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440

gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500

tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536

<210> 20

<211> 511

<212> PRT

<213> 人工序列(.)

<400> 20

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn

20 25 30

Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp

35 40 45

His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser

50 55 60

His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp

65 70 75 80

Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His

85 90 95

Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln

115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln

130 135 140

Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu

180 185 190

Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys

225 230 235 240

Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala

245 250 255

Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly

260 265 270

Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile

275 280 285

Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp

290 295 300

Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn

325 330 335

Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala

340 345 350

Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr

355 360 365

Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile

370 375 380

Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu

385 390 395 400

Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser

405 410 415

Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln

420 425 430

Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys

435 440 445

Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser

450 455 460

Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu

465 470 475 480

Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys

485 490 495

Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

500 505 510

<210> 21

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 21

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240

taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300

acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360

gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420

gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480

gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540

ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660

gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720

ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780

ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840

cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900

ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 934

<210> 22

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(.)

<400> 22

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gcggccgtgg cggtctggac cacgccggag 240

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggagtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420

agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480

gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540

gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600

Claims

1.一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L，其特征为：所述新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L为能表达可溶性蛋白PVRCD137L的腺病毒的外面包裹了类囊泡，而且所述的类囊泡的膜上有VSV-G蛋白；所述VSV-G蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:19所述，所述VSV-G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所述；所述可溶性蛋白PVRCD137L的DNA序列如SEQ IDNO:6所述，所述可溶性的PVRCD137L的蛋白序列如SEQ ID NO:1所述。

2.如权利要求1所述的一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L，其特征为：所述VSV-G蛋白，能够实现肿瘤细胞的靶向；而且由于类囊泡纳米囊泡的存在，所述新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L能够不被抗腺病毒的中和抗体所作用，具有显著延长的给药窗口期；所述新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L能够更加持续的表达可溶性的PVRCD137L、去持续阻断PVR/TIGIT免疫检测点通路、活化CD137免疫共刺激通路。

3.如权利要求1所述的一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L，其特征为通过以下方法制备获得：

(1)制备细胞外膜上镶嵌VSV-G蛋白的细胞，我们将此细胞命名为VSV-G细胞；

(2)腺病毒Ad5sPVRCD137L感染VSV-G细胞，所述腺病毒Ad5sPVRCD137L是能表达可溶性的PVRCD137L的腺病毒；

(3)使用培养基、PBS或者其他缓冲液重悬收集的感染腺病毒之后的VSV-G细胞，将细胞悬液利用离心挤压剪切的方法挤压细胞剪切通过孔径为10μm、5μm、1μm的膜滤纸；

(4)收集离心挤压剪切后的病毒悬液，通过密度梯度离心的方法富集和收集类囊泡包裹的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L，所述的新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L由类囊泡包裹，而且包裹的类囊泡膜上有VSV-G蛋白，能够实现靶向。

4.如权利要求1所述的一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在制备抗肿瘤药物中的应用，这些肿瘤包括但不限于肝癌、肾癌、白血病、肺癌、黑色素瘤和结直肠癌等肿瘤。

5.如权利要求1所述的一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，这些肿瘤包括但不限于肝癌、肾癌、白血病、肺癌、黑色素瘤和结直肠癌等肿瘤。

6.如权利要求1所述的一种新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-G Ad5sPVRCD137L在制备肿瘤阻断PVR/TIGIT免疫检测点通路与活化CD137通路药物中的应用，这些肿瘤包括但不限于肝癌、肾癌、白血病、肺癌、黑色素瘤和结直肠癌等肿瘤，新型类囊泡溶瘤病毒EM/VSV-GAd5sPVRCD137L可以感染肿瘤细胞并复制和表达可溶性的PVRCD137L，所表达的PVRCD137L与TIGIT结合从而阻断PVR/TIGIT免疫检测点通路，所表达的PVRCD137L与CD137结合从而活化CD137免疫共刺激通路。