CN112912112A

CN112912112A - 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途

Info

Publication number: CN112912112A
Application number: CN201980070613.3A
Authority: CN
Inventors: L.K.蔡; T.范登德里斯奇
Original assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB
Current assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-06-04
Also published as: JP7529286B2; EP3870237A1; WO2020084162A1; JP2022505877A; US20210403948A1

Abstract

本发明涉及能够增强基因的肝特异性表达的核酸调节元件、采用这些调节元件的方法以及这些元件的用途。还公开了包含这些核酸调节元件的表达盒及载体。本发明尤其可用于使用基因疗法、更尤其是肝导向基因疗法的应用、以及用于接种目的。

Description

肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途

技术领域

本发明涉及能够增强基因的肝特异性表达的核酸调节元件、采用这些调节元件的方法以及其用途。本发明还包括包含这些调节元件的表达盒、载体以及药物组合物。本发明尤其可用于使用基因疗法、更尤其是肝导向基因疗法的应用、以及用于接种目的。

背景技术

从临床试验中持续涌现出令人信服的证据，即基因疗法在患有许多各种不同疾病的患者中产生疗效。特别是，肝导向基因疗法是获得被分泌到循环中的因子的持续肝细胞特异性表达的有前途的方式。实际上，许多获得性、复杂的遗传疾病(肝病(从狭义说)以及不会直接导致肝病但主要在身体其他地方显现出来的一些遗传性异常，例如血友病A或B、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症或抗胰蛋白酶缺乏)与肝中的改变的基因表达相关联。另外，肝常常会遭受病原体(诸如肝炎病毒)感染。最后，由于药物治疗及化疗、药物或酒精滥用，肝可经历恶性转化并引起肝癌(肝细胞性肝癌)或功能上退化。因此，有很大且不断增长的兴趣来使用基因疗法以表达肝中的功能基因以替换所需蛋白质或例如通过RNA干扰或显性负性抑制蛋白质来阻挡改变的或不需要的基因产物的表达，或恢复退化的肝中的肝细胞功能。还可以使用肝导向基因疗法来表达抗病毒化合物，诸如可以抑制乙型肝炎病毒复制的融合到乙型肝炎病毒核心蛋白质的C末端的VP22蛋白质(即，基于VP22融合蛋白质的显性负性突变体)、可以抑制丙型肝炎病毒复制的ISG56及IFITM1、以及可以抑制乙型肝炎病毒复制的干扰素诱导MyD88蛋白质。用免疫调节细胞因子对肝细胞进行转导可以用于诱导针对例如病毒性肝炎或肝肿瘤的免疫应答，或抑制对基因传递载体或转基因的免疫应答。转基因传递至肝的另一应用是用于DNA接种。抗原表达的最优化在DNA疫苗载体设计中是重要的考虑因素。显然，可以通过使用优化启动子以及多腺苷酸化(polyA)序列来提高转基因表达。然而，在一些情况下，例如为了表达在超表达时诱导细胞死亡的抗原，可能会需要使DNA疫苗最优化以产生降低的转基因表达。组织特异性也被视为重要的。载体设计的其他方面也可以影响疫苗的功效。提高DNA接种的功效的合理方法将会使以下方面最优化：(i)载体主链DNA序列；(ii)转基因序列；(iii)刺激序列的共表达；(iv)用于载体的传递系统；以及(v)载体对于合适免疫刺激的靶向(如在Garmory等人2003中所回顾)。可以通过DNA的操纵以包括某些序列来进一步修饰DNA疫苗载体的主链以增强免疫原性，使得DNA本身将具有佐剂效果。DNA疫苗载体包含许多CpG基序(由两侧为两个5'嘌呤以及两个3'嘧啶的未甲基化CpG二核苷酸组成)，这些CpG基序总体上诱导细胞因子产生的Th1样模式，并且被认为会导致常常在DNA接种之后看到的强CTL应答。可以通过将CpG基序掺入质粒的DNA主链中来提高对DNA疫苗载体的应答。可替换地，可以通过刺激分子或细胞因子的共表达或通过使用定位或分泌信号或配体以将抗原引导至适用于免疫调节的位点来调节或增强免疫应答。最后，已经研究了施用DNA疫苗的各种途径，包括肌肉、皮内、皮下、静脉内、腹膜内、口服、阴道、鼻内、以及最近以来的无创传递至皮肤。

将转基因传递至肝的努力集中在衍生自腺病毒、逆转录病毒、慢病毒以及腺相关病毒(AAV)的载体以及质粒上。腺相关病毒(AAV)载体到目前为止是用于肝导向基因疗法的最有前途的基因传递载体。AAV载体具有有利的安全特性并能够实现持续的转基因表达。进一步，已经从人类以及非人类灵长类动物分离出几种免疫学上不同的AAV血清型，并且它们会诱导最小的免疫应答，这使得AAV载体非常适合于肝导向基因疗法。AAV载体的主要局限在于载体颗粒的包装容量有限(即，大约4.7kb)，从而限制了用以获得功能载体的转基因表达盒的大小。

然而，仍然存在关于一些基因传递方法的功效及安全性的担忧。主要限制因素为：不足的和/或短暂的转基因表达水平，以及转基因在不需要的细胞类型中的不恰当表达。通常在基因疗法临床试验中使用较高的载体剂量以提高疗效。然而，在MHC I类环境下，这常常会触发针对由转导细胞、尤其是肝细胞所显示的载体衣壳抗原的T细胞介导的免疫应答。这有助于消除基因修饰的细胞以及肝毒性，从而导致短期基因表达。此外，抗原呈递细胞(APC)中的无意转基因表达会增加针对基因修饰的肝细胞和和/或治疗性转基因产物的意外免疫应答的风险。因此，需要产生改善的基因疗法载体，其允许使用较低且较安全的载体剂量，这些载体剂量使治疗性基因的持续肝细胞特异性表达成为可能。更有效的载体的可用性也将会缓解生产需求。

传统的载体设计方法依赖于任意试错方法，转录增强子借以与启动子组合以提高表达水平。尽管这种做法有时可能会有效，但是它常常会导致非生产性组合，其导致所关注的基因的表达水平不太高或未提高和和/或组织特异性丧失。此外，这些传统方法未考虑到将进化保守调节基序包括到表达模块中的重要性，这对于临床转化是密切相关的。

依赖于修改后的距离差分矩阵(DDM)—多维排列(MDS)策略的计算方法(DeBleser等人2007，Genome Biol 8，R83)已经证明了可用于与肝(WO 2009/130208)以及心脏(WO2011/051450)中的强健组织特异性表达相关联的进化保守转录因子结合位点(TFBS)基序的聚簇的计算机(in silico)识别。已经示出了这些肝特异性调节元件中的一者(尤其是丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)增强子)与合成密码子优化功能亢进FIX转基因(即，PaduaR338L)的组合能显著提高FIX表达及活性(WO 2014/064277)。

本发明的目的是进一步提高肝导向基因疗法的功效以及安全性。

发明内容

本发明人已经依赖计算方法将与本文所限定的高表达的肝特异性基因相关联的进化上保守的转录因子结合位点(TFBS)基序识别为核酸调节元件。这需要几个连续的计算步骤：(1)基于使用正常人类组织所获得的RNAseq(RNA测序)表达数据来识别高表达的肝特异性基因；(2)使用公开的数据库来提取对应的启动子序列；(3)采用计算方法来识别转录因子结合位点(TFBS)基序的聚簇；(4)针对TFBS的进化上保守的聚簇(即，CRE)筛选高表达的基因的基因组环境。随后在体内证实获得高效基因表达的这些调节元件。本文所识别的核酸调节元件允许在基因疗法中使用更低且因此更安全的载体剂量，同时使疗效最大化。

因此，本发明提供以下方面：

方面1、一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段；其中所述核酸调节元件包括至少SP1以及EP300的转录因子结合位点(TFBS)。

方面2、根据方面1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:12组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段，其中所述核酸调节元件还包括HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS、HDAC2的TFBS、JUND的TFBS、FOSL2的TFBS、ZBTB7A的TFBS、CEBPD的TFBS以及RXRA的TFBS。

方面3、根据方面1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:13组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段；其中所述核酸调节元件还包括POLR2A的TFBS、MYBL2的TFBS、FOXA1的TFBS、FOXA2的TFBS、ARID3A的TFBS、POLR2A的TFBS以及HEY1的TFBS。

方面4、根据方面1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16以及SEQ ID NO:20组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段；其中所述核酸调节元件还包括HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS以及HNF 4A的TFBS。

方面5、根据方面1至4中任一项所述的核酸调节元件，其中所述功能片段包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25个连续核苷酸，并且其中所述功能片段包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选至少5个。

方面6、一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其在严格条件下与根据方面1至5中任一项所述的核酸调节元件或其互补物杂交。

方面7、根据方面1至6中任一项所述的核酸调节元件，具有600个核苷酸、优选500个核苷酸、更优选400个核苷酸、甚至更优选300个核苷酸的最大长度。

方面8、一种核酸表达盒，包括至少一个根据方面1至7中任一项所述的核酸调节元件，所述至少一个核酸调节元件可操作地连接至启动子以及转基因。

方面9、根据方面8所述的核酸表达盒，还包括至少一个、优选三个不同于根据方面1至4中任一项所述的核酸调节元件的肝特异性调节元件，优选地其中所述至少一个、优选三个肝特异性调节元件包括SEQ ID NO:22或与所述序列具有至少95％同一性的序列。

方面10、根据方面9所述的核酸表达盒，包括：核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列；以及至少一个、优选三个核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:22或与所述序列具有至少95％同一性的序列。

方面11、根据方面8至10中任一项所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码治疗性蛋白质或免疫原性蛋白质。

方面12、根据方面11所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码凝血因子IX(FIX)，优选地其中所述转基因是密码子优化凝血因子FIX，或其中所述凝血因子FIX包含超激活突变，优选地其中所述超激活突变对应于R338L氨基酸取代，更优选地其中编码凝血因子FIX的所述转基因具有如SEQ ID NO:25所定义的核酸序列。

方面13、根据方面11所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码凝血因子VIII(FVIII)，优选地其中所述转基因是密码子优化凝血因子FVIII，或其中所述凝血因子VIII具有B结构域的缺失，优选地其中所述FVIII的所述B结构域由SEQ ID NO:54所定义的接头替换，更优选地其中编码凝血因子VIII的所述转基因具有SEQ ID NO:26所定义的核酸序列。

方面14、根据方面8至13中任一项所述的核酸表达盒，其中所述启动子为肝特异性启动子、优选为衍生自甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子的启动子、更优选为SEQ ID NO:27所定义的甲状腺素运载蛋白基因的最小启动子(TTRmin)。

方面15、根据方面14所述的核酸表达盒，还包括肝特异性调节元件，其包括SEQ IDNO:24，由此包括如SEQ ID NO:28所定义的TTRe以及TTRm核酸的组合。

方面16、根据方面8至15中任一项所述的核酸表达盒，还包括小鼠微小病毒(MVM)内含子，优选SEQ ID NO:29所定义的MVM内含子。

方面17、根据方面8至16中任一项所述的核酸表达盒，还包括转录终止信号，其衍生自牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)、优选SEQ ID NO:30所定义的BGHpA。

方面18、一种载体，包括根据方面1至7中任一项所述的核酸调节元件或根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒，所述载体优选为病毒载体，更优选为衍生自腺相关病毒(AAV)的载体，甚至更优选为自互补AAV载体。

方面19、根据方面18所述的载体，具有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:44，优选SEQ ID NO:38。

方面20、一种药物组合物，包括根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒或根据方面18或19所述的载体、以及药学上可接受的载体。

方面21、根据方面1至7中任一项所述的核酸调节元件、根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒、根据方面18或19所述的载体或根据方面20所述的药物组合物，其用于基因疗法、优选肝导向基因疗法，或用于接种疗法、优选预防接种。

方面22、根据方面21所述的使用的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物，其中所述基因疗法用于治疗血友病A或血友病B。

方面23、一种用于在肝细胞中表达转基因产物的体外或离体方法，包括：

—将根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒或根据方面18或19所述的载体引入所述肝细胞中；

—在所述肝细胞中表达所述转基因产物。

方面24、根据方面1至7中任一项所述的核酸调节元件、根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒或根据方面18至19中任一项所述的载体，其用于增强转基因的肝特异性基因表达，优选地其中所述使用是体外使用。

方面25、一种用于增强转基因的肝特异性基因表达的方法，包括使用根据方面1至7中任一项所述的核酸调节元件、根据方面8至17中任一项所述的核酸表达盒或根据方面18或19中任一项所述的载体。

附图说明

图1：AAVsc构建体的示意图。AAVsc-HS-CRE-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:33-53)(A)、AAVsc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQID NO:31)(B)以及AAVsc-3xSERP-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:32)(C)的设计。SERP：丝氨酸蛋白酶抑制剂；TTRm：最小甲状腺素运载蛋白；TTRen h：TTR增强子；MVM：小鼠微小病毒内含子；hFIXcoPadua：密码子优化人类FIX Padua R338L；bghpolyA：衍生自牛生长激素的多腺苷酸化信号。所使用的所有构建体两侧有AAV反向末端重复序列。

图2：利用含有HS-CRE的构建体与没有HS-CRE的对照所获得的转基因表达水平的全面体内比较。成年C57BL/6雄性小鼠以水动力方式被转染AAVsc-HS-CRE1-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:33)、AAVsc-HS-CRE2-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQID NO:34)、AAVsc-HS-CRE3-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:35)、AAVsc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQID NO:36)、AAVsc-HS-CRE5-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:37)、AAVsc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:38)、AAVsc-HS-CRE7-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:39)、AAVsc-HS-CRE8-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:40)、AAVsc-HS-CRE9-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:41)、AAVsc-HS-CRE10-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:42)、AAVsc-HS-CRE11-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:43)、AAVsc-HS-CRE12-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:44)、AAVsc-HS-CRE13-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:45)、AAVsc-HS-CRE14-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:46)、AAVsc-HS-CRE15-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:47)、AAVsc-HS-CRE16-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:48)、AAVsc-HS-CRE17-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:49)、AAVsc-HS-CRE18-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:50)、AAVsc-HS-CRE19-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:51)、AAVsc-HS-CRE20-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:52)、AAVsc-HS-CRE21-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:53)，其分别被缩写为HS-CRE1、HS-CRE2、HS-CRE3、HS-CRE4、HS-CRE5、HS-CRE6、HS-CRE7、HS-CRE8、HS-CRE9、HS-CRE10、HS-CRE11、HS-CRE12、HS-CRE13、HS-CRE14、HS-CRE15、HS-CRE16、HS-CRE17、HS-CRE18、HS-CRE19、HS-CRE20以及HS-CRE21。作为对照，使用AAVsc-3XSERP-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ IDNO:32)以及AAVsc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:31)，其分别表示为3XSERP-TTRenh-TTRmin以及TTRenh-TTRmin。在转染后1天(组A)以及2天(组B)，使用人类FIX特异性ELISA来量化血浆中的转基因产物(即，人类FIX-Padua)的产生。

图3：成年C57BL/6小鼠中的FIX水平(测量为ng/ml小鼠血浆)的比较，这些小鼠通过尾静脉被注射以1X10⁹载体基因组(vg)(A)或5x10⁹ vg(B)AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA或AAV9sc-SERP3X-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA载体，其分别以缩略形式表示为HS-CRE4、HS-CRE6、无HS-CRE以及3XSERP。在注射后的连续天数将血液采集到柠檬酸盐缓冲液中，并且通过ELISA测量柠檬酸盐血浆中的hFIX抗原的浓度。

发明详述

如本文所用，单数形式“一”、“一个”以及“该”包括单数及复数指示物，除非上下文另外明确指示。

如本文所用的术语“包括”与“包含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的且不排除另外的、未列举的构件、元件或方法步骤。这些术语还涵盖“由……组成”以及“基本上由……组成”，其在专利术语中享有明确的含义。

通过端点对数值范围的列举包括被纳入相应范围内的所有数值及分数、以及所列举的端点。

如在本文中当提及诸如参数、数量、时距等等之类的可测值时所使用的术语“约”或“大约”意在包括指定值的以及来自指定值的变化，诸如指定值的以及来自指定值的+/-10％或更少、优选+/-5％或更少、更优选+/-1％或更少、以及仍更优选+/-0.1％或更少的变化，在这个范围内这些变化适合在所公开的发明中发挥作用。应理解，修饰语“约”所涉及的值本身也具体地且优选地所公开。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(诸如一组构件中的一个或多个构件或至少一个构件)本质上是明确的，但是通过进一步例证，该术语尤其包括对所述构件中的任一个或对所述构件中的任何两个或更多个(诸如，所述构件中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等，以及直到所有所述构件)的涉及。在另一示例中，“一个或多个”或“至少一个”可以指1、2、3、4、5、6、7或更多。

为了解释本发明的上下文，包括了在本文中对本发明的背景的论述。这不应被视为承认所涉及的任何材料是从任一权利要求的优先权日期开始在任何国家出版、已知或作为公知常识的一部分。

在该整个公开内容中，通过识别引用来参考各种出版物、专利以及已出版的专利说明书。在本说明书中引用的所有文献均以引用的方式全文并入本文中。具体而言，在本文中具体涉及的这些文献的教导内容或章节以引用的方式并入。

除非另外定义，用于公开本发明的所有术语，包括技术及科学术语，均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步引导，包括了术语定义以更好地理解本发明的教导内容。当关于本发明的特定方面或本发明的特定实施方案定义具体术语时，这种含义意在适用于该整个说明书，即也适用于本发明的其他方面或实施方案的上下文中，除非另外定义。

在下面的段落中，更详细地定义本发明的不同方面或实施方案。如此定义的每一方面或实施方案均可以与任何其他方面或实施方案组合，除非明确地作出相反指示。具体而言，被指示为优选的或有利的任何特征均可以与被指示为优选的或有利的任何其他特征组合。

在该整个说明书中对“一个实施方案”、“实施方案”的涉及是指关于该实施方案所述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在该整个说明书中的各个地方中短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”的出现并不一定全部涉及同一实施方案，而是可能涉及同一实施方案。此外，可以在一个或多个实施方案中以任何适当的方式组合特定特征、结构或特性，这些方式对于本领域的技术人员在阅读本公开之后将显而易见。此外，虽然本文所述的一些实施方案包括一些特征但不包括其他实施方案中所包括的其他特征，但是如本领域的技术人员所理解的那样，不同实施方案的特征的组合意在处于本发明的范围内并形成不同的实施方案。例如，在随附权利要求中，所要求保护的实施方案中的任一个均可以用于任何组合中。

本文所提供的术语或定义是用于帮助理解本发明。除非在本文具体地定义，本文所使用的所有术语具有与本发明所属领域的技术人员所定义的相同的含义。对于本领域的定义及术语，从业者尤其关注：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，冷泉港出版社，纽约Plainsview(1989)；以及Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(增刊47)，John Wiley&Sons，纽约(1999)。

在一方面，本发明涉及一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成(即，调节元件可以例如另外包括用于克隆目的的序列，但是所指示的序列构成调节元件的基本部分，例如它们不形成诸如启动子之类的较大调节区域的一部分)或由以下组成：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21组成的组的序列；或与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段(即，选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21组成的组的序列或与所述序列中的任一者具有高百分率序列同一性并仍执行所述调节元件的功能(即，提高表达)的序列的功能片段)。

如本文所用的“核酸调节元件”或“调节元件”，也被称为“CRE”(顺式调节元件)、“CRM”(顺式调节模块)或“HS-CRE”(肝细胞特异性顺式调节元件)，是指能够调节和/或控制基因的转录、尤其是基因的组织特异性转录的转录控制元件、尤其是非编码顺式作用转录控制元件。调节元件包括至少一个转录因子结合位点(TFBS)、更特别地组织特异性转录因子的至少一个结合位点、最特别地肝特异性转录因子的至少一个结合位点。通常，当与来自单独启动子而无调节元件的基因的转录相比时，如本文所用的调节元件提高或增强启动子驱动的基因表达。因此，调节元件特别包括增强子序列，但是应理解，增强转录的调节元件并不限于典型远端上游增强子序列，而是可以出现在它们所调节的基因的任何距离处。实际上，在本领域中已知，调节转录的序列可以位于它们在体内所调节的基因的上游(例如，在启动子区域中)或下游(例如，在3'UTR中)，并且可以位于基因的紧邻区域或较远区域中。值得注意的是，尽管如本文所公开的调节元件通常包括天然存在的序列，但是这种调节元件的组合(部分)或调节元件的多个拷贝(即，包括非天然存在的序列的调节元件)本身也被设想为调节元件。如本文所用的调节元件可包括参与转录控制的较大序列的一部分，例如启动子序列的一部分。然而，调节元件单独通常不足以启动转录，而是为此需要启动子。本文所公开的调节元件被提供为核酸分子，即分离的核酸或分离的核酸分子。因此，所述核酸调节元件具有仅为天然存在的基因组序列的一小部分，并且因此不是天然存在的，而是从所述天然存在的基因组序列分离出的序列。

如本文所用的术语“核酸”通常是指基本上由核苷酸构成的任何长度的低聚物或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单元通常包括杂环碱基、糖基以及至少一个(例如，一个、两个或三个)磷酸基，包括修饰或取代的磷酸基。杂环碱基尤其可包括广泛分布于天然存在的核酸中的例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)以及尿嘧啶(U)的嘌呤及嘧啶碱基、其他天然存在的碱基(例如，黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及经化学或生物化学修饰的(例如，甲基化的)非天然或衍生出来的碱基。糖基尤其可以包括戊糖(呋喃戊糖)基，例如优选地在天然存在的核酸中常见的核糖和和/或2-脱氧核糖、或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基、以及修饰的或取代的糖基。如本文所用的核酸可包括天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物。修饰的核苷酸可包括修饰的杂环碱基、修饰的糖部分、修饰的磷酸基或其组合。可以引入磷酸基或糖的修饰以提高稳定性、抗酶降解性或某一其他有用性质。术语“核酸”进一步优选地包括DNA、RNA以及DNA/RNA杂交分子，具体包括hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸以及合成的(例如化学合成的)DNA、RNA或DNA/RNA杂合物。核酸可以是天然存在的，例如在自然中存在的或从自然中分离出的；或可以是非天然存在的，例如重组体，即通过重组DNA技术产生，和和/或部分地或全部地、化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链的、部分双链的、或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。另外，核酸可以是环状的或线性的。

如本文所用，“转录因子结合位点”、“转录因子结合序列”或“TFBS”是指转录因子结合的核酸区域的序列。TFBS的非限制性示例包括以下蛋白质及因子的结合位点：E盒结合蛋白质E47及E12；CCAAT/增强子结合蛋白质(也被称为CEB/P、C/EPB或CEPB)；肝细胞核因子1同源盒A(也被称为HNF-1A、HNF1、IDDM20、LFB1、MODY3、TCF-1或TCF)；干扰素调节因子1(也被称为IRF1、IRF-1或MAR)；淋巴增强子结合因子1(也被称为LEF1、LEF-1、TCF10、TCF1ALPHA或TCF7L3)；叉头盒蛋白质O4(也被称为FOXO4、AFX、AFX1或MLLT7)；叉头盒蛋白质O1(也被称为横纹肌肉瘤中的叉头、FOXO1、FKH1、FKHR或FOXO1A)。可以在诸如

之类的数据库中发现转录因子结合位点。

本文所公开的序列可以是能够控制体内肝特异性基因的转录、尤其是控制以下基因的转录的调节元件的序列的一部分：白蛋白(也被称为ALB)、载脂蛋白(apolipoprotein)A2(也被称为ApoA2)、载脂蛋白C2(也被称为ApoC2)、载脂蛋白C1(也被称为ApoC1)、载脂蛋白A1(也被称为ApoA1)、载脂蛋白C3(也被称为ApoC3、APOCIII)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin，也被称为TTR)、视黄醛结合蛋白质4(也被称为RBP4)、细胞色素P450 2E1(也被称为CYP2E1)、α-1-酸性糖蛋白1(也被称为血清粘蛋白(orosomucoid)1或ORM1)。

因此，在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自ALB调节元件的序列，这些ALB调节元件即为控制体内ALB基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自APOA2调节元件的序列，这些APOA2调节元件即为控制体内APOA2基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:3以及SEQID NO:4或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自TTR调节元件的序列，这些TTR调节元件即为控制体内TTR基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:5或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自APOC1调节元件的序列，这些APOC1调节元件即为控制体内APOC1基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自RBP4调节元件的序列，这些RBP4调节元件即为控制体内RBP4基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自APOC3调节元件的序列，这些APOC3调节元件即为控制体内APOC3基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自CYP2E1调节元件的序列，这些CYP2E1调节元件即为控制体内CYP2E1基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:19或其功能片段的调节元件。在实施方案中，本文所公开的核酸调节元件包括来自ORM1调节元件的序列，这些ORM1调节元件即为控制体内ORM1基因的表达的调节元件，例如包括如在本文中其他地方所述的SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或其功能片段的调节元件。

包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的核酸调节元件包括SP1的TFBS以及EP300的TFBS。

包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12的核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS、HDAC2的TFBS、JUND的TFBS、FOSL2的TFBS、ZBTB7A的TFBS、CEBPD的TFBS以及RXRA的TFBS。

包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:13的核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、POLR2A的TFBS、MYBL2的TFBS、FOXA1的TFBS、FOXA2的TFBS、ARID3A的TFBS、POLR2A的TFBS以及HEY1的TFBS。

包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16以及SEQ ID NO:20的核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS以及HNF 4A的TFBS。

如本文所用，术语“序列同一性”以及“相同序列”等等是指两个聚合物分子之间(例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子之间)的序列同一性或相似性的程度。序列比对以及序列同一性的确定可以例如使用最初由Altschul等人1990(J Mol Biol 215:403-10)所述的基本局部比对搜索工具(BLAST)(诸如由Tatusova及Madden 1999(FEMS MicrobiolLett 174:247-250)所述的“Blast 2序列”算法)来完成。通常，在序列的整个长度上计算百分率序列同一性。如本文所用，术语“基本上相同”表示至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。

如在本申请中所用的术语“功能片段”是指本文所公开的调节元件序列的保留调节肝特异性表达的能力的片段，即它们仍可以赋予组织特异性并且它们能够以与它们从其中所衍生的序列相同的方式(尽管可能不在相同的程度上)调节(转)基因的表达。功能片段可优选地包括来自它们从其中所衍生的序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350或至少400个连续核苷酸。还优选地，功能片段可包括存在于它们从其中所衍生的序列中的转录因子结合位点(TFBS)中的至少1个、更优选至少2个、至少3个或至少4个、甚至更优选至少5个或全部。

如在本申请中所用的术语“肝特异性表达”是指与其他(即，非肝)组织或细胞相比，在肝、肝组织或肝细胞中的(转)基因(如RNA和和/或多肽)的优先或显著表达。根据特定实施方案，(转)基因表达的至少50％、更特别地至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％发生在肝组织或肝细胞内。根据特定实施方案，肝特异性表达需要使得表达的基因产物没有“泄漏”到除了肝以外的其他器官或组织，诸如肺、肌肉、脑、肾和/或脾。

上述情况经适当修改后也适用于肝细胞特异性表达以及肝母细胞特异性表达，其可被视为肝特异性表达的特定形式。在该整个申请中，在表达的上下文中提到肝特异性的情况下，也明确地设想了肝细胞特异性表达以及肝母细胞特异性表达。

如本文所用，术语“肝细胞”包括主要占据肝脏的细胞并且主要包括肝细胞、卵圆细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)以及胆管细胞(形成胆管的上皮细胞)。

如本文所用，术语“肝细胞”是指从祖肝母细胞分化使得能够在合适条件下表达肝特异性表型的细胞。术语“肝细胞”还指去分化的肝细胞。该术语包括体内细胞以及离体培养的细胞，无论这种细胞是原代细胞还是传代细胞。

如本文所用，术语“肝母细胞”是指分化产生肝细胞、卵圆细胞或胆管细胞的中胚层中的胚细胞。该术语包括体内细胞以及离体培养的细胞，无论这种细胞是原代细胞还是传代细胞。

在实施方案中，本发明涉及用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下序列的功能片段、基本上由以下序列的功能片段组成或由以下序列的功能片段组成：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21组成的组的序列；与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。本文所识别的调节元件的所述“功能片段”被定义为包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，和和/或被定义为包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的转录因子结合位点(TFBS)中的至少1个、优选至少5个、更优选全部。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20组成的组的序列；与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段。本文所识别的调节元件的所述“功能片段”被定义为包括SP1的TFBS以及EP300的TFBS，和和/或包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，和和/或被定义为包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选至少5个、更优选全部。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13组成的组的序列；与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段。本文所识别的调节元件的所述“功能片段”被定义为包括至少SP1的TFBS以及EP300的TFBS，和和/或被定义为包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，和和/或被定义为包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选全部。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQID NO:12组成的组的序列；或与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段，其中所述核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS、HDAC2的TFBS、JUND的TFBS、FOSL2的TFBS、ZBTB7A的TFBS、CEBPD的TFBS以及RXRA的TFBS；并且其中所述功能片段包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，并且其中所述功能片段包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选至少5个、更优选至少10个或至少15个。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:13组成的组的序列；或与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段，其中所述核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、POLR2A的TFBS、MYBL2的TFBS、FOXA1的TFBS、FOXA2的TFBS、ARID3A的TFBS、POLR2A的TFBS以及HEY1的TFBS；并且其中所述功能片段包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，并且其中所述功能片段包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选至少5个、更优选至少10个或至少15个。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16以及SEQ ID NO:20组成的组的序列；或与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或其功能片段，其中所述核酸调节元件包括SP1的TFBS、EP300的TFBS、HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS以及HNF 4A的TFBS；并且其中所述功能片段包括来自所述功能片段从其中所衍生的序列的至少20、优选至少25、更优选至少50、至少100、至少200或至少250个连续核苷酸，并且其中所述功能片段包括存在于所述功能片段从其中所衍生的序列中的TFBS中的至少1个、优选至少5个、更优选至少10个或至少15个。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:6组成的组的序列；或与SEQ ID NO:6具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或如本文所述的其功能片段。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:4组成的组的序列；或与SEQ ID NO:4具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或如本文所述的其功能片段。

在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由SEQ ID NO:12组成的组的序列；或与SEQ ID NO:12具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列；或如本文所述的其功能片段。

还可以通过组合两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)本文所公开的相同或不同序列或如本文所述的其功能片段来制作包括人工序列的核酸调节元件。

因此，在某些实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括至少两个序列，所述至少两个序列选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列、或其功能片段组成的组，优选地选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:13、或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列、或如本文所述的其功能片段组成的组，更优选地选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列、或如本文其他地方所述的其功能片段组成的组。

例如，本文公开了包括SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:12、基本上由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:12组成或由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQID NO:12组成的核酸调节元件；包括SEQ ID NO:6的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)、基本上由SEQ ID NO:6的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成或由SEQ IDNO:6的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成的核酸调节元件；包括SEQ ID NO:4的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)、基本上由SEQ ID NO:4的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成或由SEQ ID NO:4的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成的核酸调节元件；或包括SEQ ID NO:12的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)、基本上由SEQ ID NO:12的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成或由SEQ ID NO:12的2、3、4或5个重复序列(例如串联重复序列)组成的核酸调节元件。还可以通过组合一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)本文所公开的序列或如本文所述的其功能片段与本领域已知的一个或多个肝特异性调节元件来制作包括人工序列的核酸调节元件。已知肝特异性调节元件的非限制性示例公开于WO2009/130208、WO 2016/146757或WO01/98482中，这些文献以引用的方式全文并入本文中。

用于与本文所公开的核酸调节元件组合的肝特异性调节元件的特别优选的示例为衍生自SERPINA1基因启动子的核酸调节元件，更特别地为包括如SEQ ID NO:22中所定义的序列、与所述序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％(诸如96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段的调节元件。由如SEQ ID NO:22中所定义的序列组成的肝特异性调节元件在本文被称为“丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子”、“SerpEnh”或“Serp”。

因此，在某些实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括序列SEQ ID NO:22、与所述序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％(诸如96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段、以及至少一个或两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)相同或不同序列，所述至少一个或两个或更多个相同或不同序列选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQID NO:13或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自SEQ ID NO:6或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段；甚至更优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:4以及SEQ ID NO:12或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自SEQ ID NO:6或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段。

在特定实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:22、更特别地SEQ ID NO:22(Serp)的3个重复序列(例如串联重复序列)及SEQ ID NO:6。在更特定的实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:6、基本上由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:6组成或由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:6组成。

在特定实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:22、更特别地SEQ ID NO:22(Serp)的3个重复序列(例如串联重复序列)及SEQ ID NO:4。在更特定的实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:4、基本上由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:4组成或由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:4组成。

在特定实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:22、更特别地SEQ ID NO:22(Serp)的3个重复序列(例如串联重复序列)及SEQ ID NO:12。在更特定的实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:12、基本上由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ ID NO:12组成或由SEQ ID NO:23(3xSerp)及SEQ IDNO:12组成。

用于与本文所公开的核酸调节元件组合的肝特异性调节元件的另一特别优选的示例为“TTR增强子”、“TTRe”或“TTREnh”，更特别地为包括如SEQ ID NO:24中所定义的序列、与所述序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％(诸如96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段的调节元件。因此，在某些实施方案中，提供了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括序列SEQ ID NO:24、与所述序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％(诸如96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段、以及至少一个或两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个)相同或不同序列，所述至少一个或两个或更多个相同或不同序列选自由SEQID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自SEQ ID NO:6或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段；甚至更优选选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:12或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组；更优选选自SEQ ID NO:6或与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段。

用于与本文所公开的核酸调节元件组合的肝特异性调节元件的另一特别优选的示例为如WO 01/98482(其以引用的方式并入本文中)中所述的包括“肝基因座控制元件”的调节元件，更特别地为包括如SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58中所定义的序列、与所述序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％(诸如96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段的调节元件。

用于与本文所公开的核酸调节元件组合的肝特异性调节元件的另一特别优选的示例为包括丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(例如SEQ ID NO:22)的至少一个、优选三个串联重复序列的调节元件，诸如包括SEQ ID NO:23(3xSerp)以及如SEQ ID NO:24所定义的甲状腺素运载蛋白增强子(TTRe)的调节元件。包括丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子的至少一个、优选三个串联重复序列以及TTRe的肝特异性调节元件的示例描述于WO 2016/146757中，其以引用的方式全文并入本文中。

本领域已知的一个或多个肝特异性调节元件可以位于本文所公开的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)核酸调节元件的上游或下游。优选地，本文所公开的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)核酸调节元件或如本文所述的其功能片段位于本领域已知的一个或多个肝特异性调节元件的上游。

包括人工序列的核酸调节元件的特定示例包括通过重排本文所公开的序列中存在的转录因子结合位点(TFBS)而获得的调节元件。所述重排可包括改变TFBS的顺序和和/或改变一个或多个TFBS相对于其他TFBS的位置和和/或改变TFBS中的一个或多个的拷贝数。例如，本文还公开了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括ATF3、AR1D3A、2BTB7A、BHLHE40、CEBPB、CEBPD、CHD2、CTCF、EP300、ELF1、EZH2、ESRRA、FOXA1、FOXA2、FOSL2、HEY1、GATA2、GABPA、HEY1、HDAC2、HNF 4A、HNF 4G、HSF1、JUN、JUND、MAFF、MAFK、MAX、MYBL2、MBD4、MAZ、MXI1、MYC、NF1C、NR2C2、NR2F2、POLR2A、PO12、p300、PPARGC1A、RAD21、RXR5、RXRA、RCOR1、REST、SMC3、SUZ12、SHC3、SP1、SRF、SREBP1、SIN3AK20、TAF1、TCF7L2、TBP、TEAD4、TBP、TCF12、TCF4、USF1、USF2、YY1、ZBTB7A和和/或ZBTB33的结合位点。在其他示例中，这些核酸调节元件包括所述TFBS中的一个或多个的至少两个(诸如2、3、4或更多个)拷贝。

如果调节元件被提供为单链核酸，例如当使用单链AAV载体时，互补物链被视为等于所公开的序列。因此，本文还公开了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：本文所述的序列、尤其是选自由SEQ ID NO:6、SEQID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组的序列的互补物。

本文还公开了用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其在严格条件下与本文所述的核酸调节元件杂交、尤其是与包括以下、基本上由以下组成或由以下组成的核酸调节元件或其互补物杂交：选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、与这些序列中的任一者具有至少90％、优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列或如本文所述的其功能片段组成的组的序列。所述核酸调节元件不需要具有与它们所杂交的序列相等的长度。在优选实施方案中，所述杂交核酸调节元件的大小与其所杂交的序列不会相差大于25％长度、特别地20％长度、更特别地15％长度、最特别地10％长度。

措辞“在严格条件下杂交”是指在温度及盐浓度的限定条件下核酸分子与靶核酸分子杂交的能力。通常，严格的杂交条件为不超过天然双链体的熔融温度(Tm)以下25℃至30℃(例如，20℃、15℃、10℃或5℃)。计算Tm的方法在本领域众所周知。作为非限制性示例，用于实现严格杂交的典型盐及温度条件为：在65℃下，1x SSC，0.5％SDS。缩写词SSC是指核酸杂交溶液中所使用的缓冲剂。一升20x(二十倍浓缩)储备SSC缓冲溶液(pH7.0)包含175.3g氯化钠以及88.2g柠檬酸钠。用于实现杂交的典型时间长度为12小时。

优选地，如本文所述的调节元件虽然仅具有有限的长度，但是具有完整的功能。这允许它们用于载体或核酸表达盒中而不会过分地限制它们的有效负载能力。因此，在实施方案中，本文所公开的调节元件是600个核苷酸或更少、500个核苷酸或更少、400个核苷酸或更少、300个核苷酸或更少、250个核苷酸或更少、200个核苷酸或更少、190个核苷酸或更少或180个核苷酸或更少、优选500个核苷酸或更少、更优选300个核苷酸或更少的核酸。

然而，应理解，所公开的核酸调节元件保留调节活性(即，关于特异性和和/或转录活性)并且因此它们特别地具有的最小长度为SEQ ID NO:1至21所定义的调节元件的相应序列的20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、160个核苷酸、170个核苷酸或所有核苷酸。

在某些实施方案中，本发明提供了用于增强肝特异性基因表达的600个核苷酸或更少、500个核苷酸或更少、400个核苷酸或更少、300个核苷酸或更少、250个核苷酸或更少、200个核苷酸或更少、190个核苷酸或更少或180个核苷酸或更少、优选500个核苷酸或更少、更优选300个核苷酸或更少的核酸调节元件，其包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21组成的组的序列、与这些序列中的任一者具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％(诸如95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列、或如本文所述的其功能片段。本文所公开的核酸调节元件可以用于核酸表达盒中。因此，在一方面，本发明提供了如本文所述的核酸调节元件在核酸表达盒中的使用。

在一方面，本发明提供了核酸表达盒，其包括如本文所述的核酸调节元件，该核酸调节元件可操作地连接至启动子。在实施方案中，核酸表达盒不包含转基因。这种核酸表达盒可用于驱动内源基因的表达。在优选实施方案中，核酸表达盒包括如本文所述的核酸调节元件，该核酸调节元件可操作地连接至启动子以及转基因。

如本文所用，术语“核酸表达盒”是指包括在一种或多种所需细胞类型、组织或器官中引导(转)基因表达的一个或多个转录控制元件(诸如但不限于启动子、增强子和/或调节元件、多腺苷酸化序列以及内含子)的核酸分子。通常，它们还包含转基因，但是还设想了核酸表达盒在其中插入有该核酸表达盒的细胞中引导内源基因的表达。

如本文所用的术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于彼此进行排列，使得这些元件在功能上连接并能够彼此相互作用。这些元件可包括但不限于启动子、增强子和/或调节元件、多腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子、以及待表达的所关注的基因(即，转基因)的编码序列。当被适当地定向或可操作地连接时，核酸序列元件一起作用以调整彼此的活性，并且最终可影响转基因的表达水平。所谓调整是指提高、降低或维持特定元件的活性水平。每一元件相对于其他元件的位置可以表示为每一元件的5'末端及3'末端，并且任何特定元件之间的距离均可以通过介于元件之间的核苷酸或碱基对的数量来引用。如技术人员所理解的，可操作地连接暗指功能活性，并非一定与天然位置连接有关。实际上，当用于核酸表达盒中时，调节元件通常位于紧邻启动子的上游处(尽管通常是如此，但是绝对不应被解释为限制或排除在核酸表达盒内的位置)，但是在体内无需是这种情况。例如，天然存在于基因下游的调节元件序列(其影响该基因的转录)能够以与当位于启动子上游时相同的方式发挥作用。因此，根据具体实施方案，调节元件的调节或增强效果与位置无关。

在特定实施方案中，核酸表达盒包括一个如本文所述的核酸调节元件或如本文所述的其功能片段。在替代性实施方案中，核酸表达盒包括两个或更多个(诸如，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)如本文所述的核酸调节元件或如本文所述的其功能片段，即它们模块化地组合以增强它们的调节(和/或增强)效果。在另一些替代性实施方案中，核酸表达盒包括：至少一个如本文所述的核酸调节元件或如本文所述的其功能片段；以及至少一个本领域中已知的肝特异性核酸调节元件或如本文所述的其功能片段。在进一步的实施方案中，两个或更多个核酸调节元件或如本文所述的其功能片段中的至少两个是相同的或基本上相同的。在更进一步的实施方案中，两个或更多个调节元件或如本文所述的其功能片段的全部是相同的或基本上相同的。相同或基本上相同的核酸调节元件或如本文所述的其功能片段的拷贝可被提供为核酸表达盒中的串联重复序列。在进一步的替代性实施方案中，两个或更多个核酸调节元件或如本文所述的其功能片段中的至少两个彼此不同。核酸表达盒还可包括相同及基本上相同的核酸调节元件或如本文所述的其功能片段与不同核酸调节元件或如本文所述的其功能片段的组合。

例如，核酸表达盒可包括包含SEQ ID NO:6的核酸调节元件以及包含SEQ ID NO:22(SERP)的核酸调节元件；核酸表达盒可包括包含SEQ ID NO:6的核酸调节元件以及2、3或4个包含SEQ ID NO:22(SERP)的核酸调节元件；核酸表达盒可包括2、3或4个包含SEQ IDNO:6的核酸调节元件以及包含SEQ ID NO:22(SERP)的核酸调节元件；核酸表达盒可包括2、3或4个包含SEQ ID NO:6的核酸调节元件以及2、3或4个包含SEQ ID NO:22(SERP)的核酸调节元件。类似地，核酸表达盒可包括2、3或4个包含SEQ ID NO:6的核酸调节元件以及包含SEQ ID NO:23(3xSERP)的核酸调节元件。

如本申请中所用，术语“启动子”是指直接或间接调节其可操作地连接的对应核酸编码序列(例如转基因或内源基因)的转录的核酸序列。启动子可单独发挥作用以调节转录或可与一个或多个其他调节序列(例如增强子或沉默子、或调节元件)合作发挥作用。在本申请的上下文中，启动子通常可操作地连接至如本文所公开的调节元件以调节(转)基因的转录。当如本文所述的调节元件可操作地连接至启动子及转基因二者时，调节元件可以(1)赋予转基因显著程度的体内肝特异性表达(和/或在肝母细胞、肝细胞、卵圆细胞、胆管细胞、肝干细胞或体外肝衍生的细胞系中特异性表达)和/或(2)可以提高转基因在肝中和/或在肝母细胞、肝细胞、卵圆细胞、肝干细胞或胆管细胞(体内)或在从其衍生的细胞系(体外)中的表达水平。

启动子可以是同源的(即，来自与将要被转染核酸表达盒的动物、尤其是哺乳动物相同的物种)或异源的(即，来自除了将要被转染表达盒的动物、尤其是哺乳动物的物种之外的来源)。照此，启动子的来源可以是任何病毒、任何单细胞原核生物或真核生物、任何脊椎生物或无脊椎生物或任何植物，或者甚至可以是合成启动子(即，具有非天然存在的序列)，只要启动子与本文所述的调节元件组合发挥作用。在优选实施方案中，启动子是哺乳动物启动子、尤其是鼠科或人类启动子。

启动子可以是诱导型或组成型启动子。

本文所公开的核酸调节元件中的肝特异性TFBS的富集原则上允许调节元件引导甚至由本身不具有肝特异性的启动子的肝特异性表达。因此，本文所公开的调节元件可以与其天然启动子以及另一启动子结合用于核酸表达盒中。优选地，本文所公开的核酸表达盒包括肝特异性启动子。这将提高肝特异性和/或避免其他组织中表达的泄漏。在肝特异性基因启动子数据库(LSPD，http://rulai.cshl.edu/LSPD/)中提供了肝特异性启动子的非限制性示例，其包括例如白蛋白(ALB)启动子、载脂蛋白A2(APOA2)启动子、甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子、载脂蛋白C1(APOC1)启动子、视黄醛结合蛋白质4(RBP4)启动子、载脂蛋白C3(APOC3)启动子、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)启动子、α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)启动子、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(SERPINA1)启动子、载脂蛋白A1(APOA1)启动子、互补物因子B(CFB)启动子、己酮糖激酶(KHK)启动子、血液结合素(HPX)启动子、烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)启动子、(肝)羧酸酯酶1(CES1)启动子、蛋白质C(PROC)启动子、载脂蛋白C3(APOC3)启动子、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2(MASP2)启动子、铁调素抗微生物肽(HAMP)启动子、丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂C类(抗凝血酶)成员1(SERPINC1)启动子、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子。

在特别优选的实施方案中，启动子是哺乳动物肝特异性启动子、尤其是鼠科或人类肝特异性启动子。

在优选实施方案中，启动子来自甲状腺素运载蛋白基因、尤其是鼠科或人类甲状腺素运载蛋白基因，诸如如SEQ ID NO:27所定义的最小甲状腺素运载蛋白启动子(TTRm)。

在特定实施方案中，如果如本文所教导的用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件与TTRe增强子(例如，如SEQ ID NO:24所定义)组合，则启动子优选为TTRm(例如，如SEQID NO:27所定义)，并且TTRe与TTRm核酸组件的组合优选如SEQ ID NO:28所述。因此，在特定实施方案中，启动子是甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子，由此包括如SEQ ID NO:28所定义的TTRe与TTRm核酸的组合。

在特定实施方案中，如果如本文所教导的用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件与如WO 01/98482(其以引用的方式并入本文中)中所述的“肝基因座控制元件”组合、更特别地与包括如SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所定义的序列的调节元件组合，则启动子优选为AAT启动子。

此外，启动子不需要是核酸表达盒中的转基因的启动子，尽管转基因可以从其自己的启动子进行转录。

为了使核酸表达盒的长度最小，可将调节元件连接至最小启动子或本文所述启动子的缩短形式。如本文所用的“最小启动子”(也被称为基础启动子或核心启动子)是全尺寸启动子的一部分，其仍能够驱动表达但缺少有助于调节(例如，组织特异性)表达的序列的至少一部分。该定义涵盖了：已经删除了(组织特异性)调节元件的启动子，该启动子能够驱动基因的表达但已经丧失了其以组织特异性方式表达该基因的能力；以及已经删除了(组织特异性)调节元件的启动子，该启动子能够驱动(可能降低的)基因的表达但未必已经丧失其以组织特异性方式表达该基因的能力。优选地，本文所公开的核酸表达盒中所包含的启动子的长度为1000个核苷酸或更少、900个核苷酸或更少、800个核苷酸或更少、700个核苷酸或更少、600个核苷酸或更少、500个核苷酸或更少、400个核苷酸或更少、300个核苷酸或更少或250个核苷酸或更少。

如本文所用的术语“转基因”是指编码将要在被引入核酸序列的细胞中表达的多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。然而，转基因还可以被表示为RNA，通常用于控制(例如，降低)被插入核酸序列的细胞中的特定多肽的量。这些RNA分子包括但不限于gRNA、shRNA、circRNA、siRNA、反义RNA等等。如何将核酸序列引入细胞中对本发明不是关键的，例如可以通过基因组中的整合或作为游离质粒来引入。值得注意的是，可将转基因的表达局限在被引入核酸序列的细胞的子集。术语“转基因”意在包括(1)细胞中非天然存在的核酸序列(即，异源核酸序列)；(2)作为引入了核酸序列的细胞中天然存在的核酸序列的突变形式的核酸序列；(3)用于增加引入了核酸序列的细胞中天然存在的相同(即，同源)或类似核酸序列的额外拷贝的核酸序列；或(4)沉默的天然存在的或同源的核酸序列，其表达在其中引入了核酸序列的细胞中被诱导。

转基因可以与启动子(和/或例如在其中核酸表达盒用于基因疗法的情况下，与被引入转基因的动物、尤其是哺乳动物)同源或异源。

转基因可以是密码子优化的。

转基因可以是全长cDNA或基因组DNA序列，或其具有至少某一生物活性的任何片段、亚基或突变体。具体而言，转基因可以是小基因，即缺少其内含子序列中的一部分、大部分或全部的基因序列。因此，转基因任选地可包含内含子序列。任选地，转基因可以是杂合核酸序列，即由同源和/或异源cDNA和/或基因组DNA片段构成的核酸序列。所谓‘突变形式’是指包含一个或多个不同于野生型或天然存在的序列的核苷酸的核酸序列，即突变核酸序列包含一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入。核苷酸取代、缺失和/或插入可以产生基因产物(即，例如蛋白质或核酸)，该基因产物在其氨基酸/核酸序列方面不同于野生型氨基酸/核酸序列。这种突变体的制备在本领域中众所周知。在一些情况下，转基因还可以包括编码前导肽或信号序列的序列，使得转基因产物将从细胞分泌。

本文所述核酸表达盒中可包含的转基因通常编码基因产物，诸如RNA或多肽(蛋白质)。

在实施方案中，转基因编码治疗性蛋白质或免疫原性蛋白质。

在实施方案中，转基因编码治疗性蛋白质。治疗性蛋白质的非限制性示例包括因子VIII、因子IX、因子VII、因子VIIa、因子X、血管性血友病因子、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、C1酯酶抑制剂(C1-INH)、溶酶体酶、溶酶体酶艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)、红细胞生成素(EPO)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、角化细胞生长因子(KGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、afamin(AFM)、α1-抗胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、ATP7b、鸟氨酸转氨甲酰酶、苯丙氨酸羟化酶、脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白、低密度脂蛋白受体(LDL-R)、白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酯酶、基于VP22融合蛋白的显性负性突变体、ISG56、IFITM1、编码抗体的干扰素可诱导的MyD88蛋白质转基因、纳米抗体、抗病毒显性负性蛋白质、以及其片段、亚基或突变体等等。

在实施方案中，转基因编码免疫原性蛋白质。免疫原性蛋白质的非限制性示例包括衍生自病原体的表位以及抗原，如甲型、乙型或丙型肝炎表面抗原蛋白质。

如本文所用，术语“免疫原性”是指能够引发免疫应答的物质或组合物。

在某些实施方案中，转基因编码FIX。术语“凝血因子IX”具有如本领域中已知的含义。凝血因子IX的同义词为“FIX”或“克雷司马斯因子(Christmas factor)”或“F9”，并且可以互换地使用。具体而言，术语“凝血因子IX”包括由如Genbank登录号NM_000133中所定义的mRNA序列编码的人类蛋白质。优选地，所述FIX是突变FIX，其与野生型FIX相比为活性过度的或功能亢进的。修饰人类凝血因子的功能活性可以通过生物工程来完成，例如通过引入点突变。通过该方法，报道了活性过度的R338A变体，其在体外活化部分凝血活酶时间试验(APPT)(Chang等人，1998)中与野生型人类FIX相比显示出3倍增加的凝血活性并在转染了突变FIX基因的血友病B小鼠中显示出2至6倍更高的特异性活性(Schuettrumpf等人，2005)。已经描述了具有甚至更高凝血活性的其他示例性FIX点突变体或结构域交换突变体：FIX，其EGF-1结构域用来自FVII的EGF-1结构域单独替换或联合以下突变体：R338A点突变(Brunetti-Pierri等人，2009)；V86A/E277A/R338A三突变体(Lin等人，2010)；Y259F、K265T和/或Y345T单、双或三突变体(Milanov等人，2012)；以及G190V点突变体(Kao等人，2010)；所有文献均以引用的方式并入本文中。其他示例性FIX变体包括因子IXdalcinonacog alfa(“CB 2679d/ISU304”)(Catalyst Biosciences公司)。

在特别优选的实施方案中，FIX突变体是由Simioni等人于2009年描述并被命名为“因子IX Padua”突变体，其引起X连锁血栓形成倾向。所述突变体因子IX是活性过度的并携带R338L氨基酸取代。在本发明的实施方案中，FIX转基因编码人类FIX蛋白质，优选地FIX转基因编码人类FIX蛋白质的Padua突变体。在实施方案中，FIX转基因编码具有如SEQ ID NO:25所述序列的人类FIX蛋白质的Padua突变体(co-FIX-R338L)。

在某些实施方案中，转基因编码FVIII。术语“凝血因子VIII”具有如本领域中已知的含义。凝血因子VIII的同义词为“FVIII”或“抗血友病因子”或“AHF”，并且可以在本文中互换地使用。术语“凝血因子VIII”包括例如具有如Uniprot登录号P00451中所定义的氨基酸序列的人类蛋白质。优选地，所述FVIII是其中B结构域缺失的FVIII(即，B结构域缺失的FVIII，在本文中也被称为BDD FVIII或FVIII B)。术语“B结构域缺失的FVIII”包括例如但不限于其中整个或一部分B结构域缺失的FVIII突变体以及其中B结构域被接头替换的FVIII突变体。B结构域缺失FVIII的非限制性示例描述于Ward等人(2011)、WO 2011/005968以及McIntosh等人(2013)中，这些文献以引用的方式具体地并入本文中。在某些实施方案中，所述FVIII是B结构域缺失的FVIII，其中B结构域被具有以下序列的接头替换：SFSQNPPVLTRHQR(SEQ ID NO:54)(即，如Ward等人(2011)中所定义的SQ FVIII)。在某些实施方案中，所述FVIII具有SEQ ID NO:26(即，密码子优化的B结构域缺失的人类FVIII或hFVIIIcopt)，还如WO 2011/0059中所公开，该文献以引用的方式具体地并入本文中。

其他序列也可以包含在本文所公开的核酸表达盒中，通常用于进一步提高或稳定化转基因产物的表达(例如，内含子和/或多腺苷酸化序列)。

任何内含子均可以用于本文所述的表达盒中。术语“内含子”包括足够大以能够被核剪接装置识别并剪接的整个内含子的任何部分。通常，短的功能性内含子序列是优选的，以便保持表达盒的尺寸尽可能小，这有助于表达盒的构建及操作。在一些实施方案中，从编码蛋白质的基因获得内含子，该蛋白质通过表达盒内的编码序列进行编码。内含子可以位于编码序列的5'、编码序列的3'或编码序列内。将内含子定位在编码序列的5'的优点是使内含子干扰多腺苷酸化信号的功能的可能性最小化。在实施方案中，本文所公开的核酸表达盒还包括内含子。合适内含子的非限制性示例为小鼠微小病毒(MVM)内含子、β球蛋白内含子(βIVS-II)、因子IX(FIX)内含子A、猿猴病毒40(SV40)小t内含子以及β肌动蛋白内含子。优选地，内含子为小鼠微小病毒(MVM)内含子，更优选为如SEQ ID NO:29所定义的MVM内含子。

引导多腺苷酸尾的合成的任何多腺苷酸化信号均可用于本文所述的表达盒中，其示例对于本领域的技术人员是熟知的。示例性多腺苷酸化信号包括但不限于衍生自猿猴病毒40(SV40)晚期基因的多腺苷酸序列、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号、最小兔子β球蛋白(mRBG)基因、以及如Levitt等人(1989，Genes Dev 3:1019-1025)中所述的合成多腺苷酸(SPA)位点。优选地，多腺苷酸化信号是牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号(SEQ ID NO:30)。

在特定实施方案中，公开了核酸表达盒，其包括：

—肝特异性核酸调节元件，其包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或如本文所述的其功能片段；

—如SEQ ID NO:24所定义的甲状腺素运载蛋白增强子(TTRe)；

—肝特异性TTRm启动子(例如，由SEQ ID NO:27定义)；以及

—转基因；

优选地其中TTRe与TTRm核酸的组合由SEQ ID NO:28定义。

在特定实施方案中，公开了核酸表达盒，其包括：

—如SEQ ID NO:24所定义的甲状腺素运载蛋白增强子(TTRe)；

—肝特异性TTRm启动子(例如，由SEQ ID NO:27定义)；以及

—内含子、优选MVM内含子(例如，如由SEQ ID NO:29定义)；以及

—转基因，优选地其中所述转基因编码凝血因子IX(FIX)，优选地其中所述转基因是密码子优化的凝血因子FIX，或其中所述凝血因子FIX包含超激活突变，优选地其中所述超激活突变对应于R338L氨基酸取代，更优选地其中编码凝血因子FIX的所述转基因具有如SEQ ID NO:25所定义的核酸序列；或其中所述转基因编码凝血因子VIII(FVIII)，优选地其中所述转基因是密码子优化的凝血因子FVIII，或其中所述凝血因子VIII具有B结构域的缺失，优选地其中所述FVIII的所述B结构域被SEQ ID NO:54所定义的接头替换，更优选地其中编码凝血因子VIII的所述转基因具有SEQ ID NO:26所定义的核酸序列；

优选地其中TTRe与TTRm核酸的组合由SEQ ID NO:28定义。

本文所公开的核酸调节元件以及核酸表达盒可以照此使用，或者通常，它们可以是核酸载体的一部分。因此，另一方面涉及如本文所述的核酸调节元件或如本文所述的核酸表达盒在载体、尤其是核酸载体中的使用。

在一方面，本发明还提供了载体，其包括如本文所公开的核酸调节元件。在进一步的实施方案中，载体包括如本文所公开的核酸表达盒。

如本申请中所用的术语“载体”是指核酸分子(例如，双链DNA)，其中可被插入另一核酸分子(插入的核酸分子)，诸如但不限于cDNA分子。载体用于将插入的核酸分子运输到合适的宿主细胞中。载体可包含允许转录插入的核酸分子并任选地将转录本翻译成多肽的必要元件。插入的核酸分子可衍生自宿主细胞，或可衍生自不同的细胞或生物体。一旦在宿主细胞中，载体便可独立于宿主染色体DNA或与宿主染色体DNA同时进行复制，并且可以产生载体及其插入的核酸分子的多个拷贝。载体可以是游离(episomal)载体(即，其不整合到宿主细胞的基因组中)，或可以是整合到宿主细胞基因组中的载体。因此，术语‘载体’还可以被定义为有助于将基因传送至靶细胞中的基因传递载体。该定义包括非病毒及病毒载体。非病毒载体包括但不限于阳离子脂质、脂质体、纳米颗粒、PEG、PEI、质粒载体(例如，pUC载体、bluescript载体(pBS)以及pBR322或其缺乏细菌序列(微环)的衍生物、基于转座子的载体(例如，PiggyBac(PB)载体或睡美人(SB)载体)等等。病毒载体衍生自病毒，并且包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒载体等等。通常而非必要地，病毒载体由于已经丧失了在给定细胞中繁殖的能力而是复制缺陷型的，这是因为对复制必不可少的病毒基因已经从病毒载体清除。然而，一些病毒载体也可以适应于具体地在例如癌细胞的给定细胞中复制，并且通常用于触发(癌)细胞特异性(瘤细胞)溶解。病毒体是包括病毒及非病毒元件的载体的非限制性示例，具体而言，它们将脂质体与未激活的HIV或流感病毒组合在一起(Yamada等人，2003)。另一示例包括与阳离子脂质混合的病毒载体。

在优选实施方案中，载体是病毒载体，诸如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体，更优选为AAV载体。

AAV载体优选用作自互补双链AAV载体(scAAV)以便克服AAV转导(即，单链至双链AAV转换)中的限制性步骤中的一者(McCarty，2001，2003；Nathwani等人，2002，2006，2011；Wu等人，2008)，但是在本文中也包括了单链AAV载体(ssAAV)的使用。

已经分离并表征了AAV的不同血清型，例如AAV血清型2、AAV血清型5、AAV血清型8以及AAV血清型9，并且在本文中设想了所有AAV血清型。AAV血清型9(AAV9)理想地适合于在肝中实现高效转导。因此，在某些实施方案中，载体是AAV9载体，更特别地为自互补AAV9载体(scAAV9)。可替换地，可以采用影响肝转导功效的工程化AAV衣壳，，包括通过分子进化及选择所获得的这种，如由Grimm等人(2008)或Lisowski等人(2014)所述。

在其他实施方案中，载体为非病毒载体，优选为质粒、微环或基于转座子的载体。优选地，所述基于转座子的载体衍生自睡美人(SB)或PiggyBac(PB)。优选的SB转座子已经描述于Ivics等人(1997)中并且其活性过度的形式(包括SB100X)如Mates等人(2009)中所述。基于PiggyBac的转座子为安全的载体，因为它们不会提高致瘤风险。此外，使用这些载体的肝导向基因疗法显示出诱导对载体中所包括的转基因、尤其是hFIX或hFVIII转基因的免疫耐受。

基于转座子的载体优选与编码转座酶的载体组合施用以用于基因疗法。例如，衍生自PiggyBac的基于转座子的载体可以与野生型PiggyBac转座酶(Pbase)或小鼠密码子优化PiggyBac转座酶(mPBase)一起施用。优选地，所述转座酶是活性过度的转座酶，例如如Yusa等人(2011)中所述的包含七个氨基酸取代(I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N570S)的活性过度的PB(hyPB)转座酶，该文献以引用的方式具体地并入本文中。

转座子/转座酶构建体可以通过水动力注射或使用非病毒纳米颗粒转染肝细胞来传递。

在另一些其他实施方案中，载体包括病毒及非病毒元件。

在具体实施方案中，提供了以下载体：AAVsc-HS-CRE1-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:33)、AAVsc-HS-CRE2-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:34)、AAVsc-HS-CRE3-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQID NO:35)、AAVsc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:36)、AAVsc-HS-CRE5-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:37)、AAVsc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:38)、AAVsc-HS-CRE7-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:39)、AAVsc-HS-CRE8-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:40)、AAVsc-HS-CRE9-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:41)、AAVsc-HS-CRE10-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:42)、AAVsc-HS-CRE11-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:43)、AAVsc-HS-CRE12-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:44)、AAVsc-HS-CRE13-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:45)、AAVsc-HS-CRE14-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:46)、AAVsc-HS-CRE15-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:47)、AAVsc-HS-CRE16-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:48)、AAVsc-HS-CRE17-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:49)、AAVsc-HS-CRE18-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:50)、AAVsc-HS-CRE19-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:51)、AAVsc-HS-CRE20-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:52)、AAVsc-HS-CRE21-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ ID NO:53)。

因此，在特定实施方案中，载体具有如SEQ ID NO:38、36、44、33、37、41、43、45、46、48或52中所述的序列，优选如SEQ ID NO:38、36、44、33、37或45中所述的序列，更优选如SEQID NO:38、36或44中所述的序列，甚至更优选如SEQ ID NO:38中所述的序列。

在另一方面，本发明涉及本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物，其用于药物中。

更具体而言，本文所公开的核酸表达盒及载体可以用于例如表达在肝中正常表达并使用的蛋白质(即，结构蛋白质)或表达在肝中表达并随后被输出至血流以传输至身体其他部分的蛋白质(即，分泌性蛋白质)。例如，本文所公开的表达盒及载体可以用于表达治疗量的基因产物(诸如多肽，尤其是治疗性蛋白质或RNA)以用于治疗目的，尤其是用于基因疗法。通常，基因产物由表达盒或载体内的转基因编码，尽管原则上还可以提高内源基因的表达以用于治疗目的。

因此，在特定实施方案中，本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物可以用于基因疗法、尤其是肝导向基因疗法中。

本文还公开了本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物在制备用于基因疗法、尤其是肝导向基因疗法的药物中的用途。

基因疗法方案旨在在体外、而且尤其是在体内实现靶细胞中的治疗性基因产物表达，其已经在本领域中被广泛地描述。这些包括但不限于质粒DNA(裸露的或在脂质体中)的肌内注射、间质内注射、在气道中滴注、应用至内皮、肝内实质、以及静脉或动脉内施用(例如，肝内动脉、肝内静脉)。已经开发了各种装置来提高DNA对靶细胞的可用性。简单的方法是使靶细胞与包含DNA的导管或可植入材料物理接触。另一方法是使用无针喷射式注射装置，其在高压下将液柱直接发射到靶组织中。这些传递范例也可以用于传递病毒载体。靶向基因传递的另一方法是使用由蛋白质或合成配体组成的分子缀合物，所述蛋白质或合成配体与核酸结合剂或DNA结合剂连接以使核酸特异性靶向细胞(Cristiano等人，1993a&b)。

根据特定实施方案，设想将如本文所述的核酸表达盒及载体用于肝细胞的基因疗法(即，肝导向基因疗法)。根据另一特定实施方案，将调节元件、表达盒或载体用于体内基因疗法、尤其是肝导向基因疗法。根据又一特定实施方案，用于基因疗法、尤其是肝导向基因疗法的方法以治疗血友病、尤其是治疗血友病B或血友病A。

使用离体及体内两种程序将基因传送至哺乳动物的肝细胞中。离体方法需要收获肝细胞、使用长期表达载体进行体外转导以及将经转导的肝细胞再次引入门脉循环中(Kay等人，1992；Chowdhury等人，1991)。通过将DNA或病毒载体注射到肝实质、肝动脉或门静脉中以及通过转录靶向来完成体内靶向(Kuriyama等人1991；Kistner等人1996)。最近的方法还包括裸露DNA的门脉内传递(Budker等人，1996)以及水动力尾静脉转染(Liu等人，1999；Zhang等人，1999)。

本文还公开了将本文所公开的核酸调节元件、核酸表达盒或载体用于在体内或在体外在肝细胞中表达蛋白质，更特别地通过使用如本文所述的核酸表达盒或载体在体外或在体内转染或转导肝细胞。根据另一方面，提供了用于在肝细胞中表达蛋白质的方法，其包括以下步骤：例如通过转染或转导将如本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒或载体引入肝细胞中；以及在肝细胞中表达转基因蛋白质产物。这些方法可以在体外、离体以及在体内执行。

另一方面提供了如本文所教导的核酸调节元件、核酸表达盒或载体用于增强转基因的肝特异性基因表达，优选地其中所述使用是体外使用。另一方面提供了如本文所教导的核酸调节元件、核酸表达盒或载体用于增强由转基因编码的蛋白质或多肽的肝特异性表达，优选地其中所述使用是体外使用。

另一方面提供了使用如本文所教导的核酸调节元件、核酸表达盒或载体来增强转基因的肝特异性基因表达的方法。

另一方面提供了使用如本文所教导的核酸调节元件、核酸表达盒或载体来增强由转基因编码的蛋白质或多肽的肝特异性表达的方法。

还提供了用于有需要的受试者的基因疗法的体内方法，其包括以下步骤：将包含编码治疗性蛋白质的转基因的核酸表达盒引入受试者的肝中；以及在肝中表达治疗量的治疗性蛋白质。根据进一步的实施方案，该方法包括以下步骤：将包括核酸表达盒的载体引入受试者的肝中，该核酸表达盒包含编码治疗性蛋白质的转基因；以及在肝中表达治疗量的治疗性蛋白质。

还可以通过体外或离体程序来执行肝细胞的非病毒转染或病毒载体介导的转导。体外方法需要体外转染或转导肝细胞(例如，先前从受试者收获的肝细胞)、肝细胞系或从例如诱导多能干细胞或胚细胞分化的肝细胞。离体方法需要从受试者收获肝细胞、体外转染或转导、以及任选地将经转染的肝细胞再次引入受试者中。

本文还公开了用于产生治疗性蛋白质的体外或离体方法，所述方法包括：

—使用本文所公开的核酸表达盒或载体转染或转导肝细胞、优选肝细胞系，其中核酸表达盒或载体包括本文所公开的核酸调节元件，该核酸调节元件可操作地连接至启动子以及转基因，其中该转基因编码治疗性蛋白质；

—在适合于表达肝细胞中的转基因的条件下培养肝细胞；以及

—从肝细胞或培养基收获治疗性蛋白质。

本文所公开的用于在肝细胞、更特别地在肝细胞系中表达转基因产物的体外用途及方法可尤其适用于治疗性蛋白质，如蛋白质替换疗法中所用的治疗剂(例如，因子VIII、因子IX、因子VIIa)的的重组产生。本文所公开的核酸调节元件的使用允许增强转基因的肝特异性表达，这有利地提高了转基因产物、更特别地治疗性蛋白质的产量。

技术人员应理解，本文所公开的核酸调节元件、核酸表达盒及载体的用途具有超出基因疗法的含义，例如将干细胞诱导分化成肝原性细胞、用于肝中蛋白质的过度表达的转基因模型等。

转基因产物可以是多肽、尤其是治疗性蛋白质，例如因子VIII、因子IX、因子VII或因子VIIa、因子X、α-葡萄糖苷酶(可分泌的GAA)、血管性血友病因子、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、C1酯酶抑制剂(C1-INH)、溶酶体酶、溶酶体酶艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)、红细胞生成素(EPO)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、角化细胞生长因子(KGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、afamin(AFM)、α1-抗胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酸酶、ATP7b、鸟氨酸转氨甲酰酶、苯丙氨酸羟化酶、脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白、低密度脂蛋白受体(LDL-R)、白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酯酶、编码抗体的转基因、纳米抗体、抗病毒显性负性蛋白质、以及其片段、亚基或突变体。可替换地，转基因产物可以是RNA，诸如siRNA。

可受益于使用本文所述核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物的基因疗法的示例性疾病及病症为肝疾病及病症，诸如肝炎感染、血友病(包括血友病A及B)、糖原储存障碍(GSD)如Pompe(例如，GSD II、GSD III以及GSD IVall)、(非酒精性)脂肪肝(NAFLD)、溶酶体贮积症、亨特氏综合征、苯丙酮尿症(PKU)、遗传性血管性水肿(HAE)、肝硬化、肝片吸虫病、酒精性肝病、肝癌(包括原发性肝癌(例如，肝细胞癌和/或胆管癌、血管肉瘤或血管内皮瘤)以及肝转移)、胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、肝小叶中心坏死、Budd–Chiari综合征、血色素沉着症、威尔逊氏病、甲状腺素运载蛋白相关的遗传性淀粉样变、吉尔伯特综合征、以及儿科肝疾病及病症(诸如胆道闭锁、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、Alagille综合征以及进行性家族性肝内胆汁淤积症)。

“肝片吸虫病”是指由片吸虫属的肝吸虫、主要由肝片吸虫引起的肝的寄生虫感染。“肝炎”是指肝的炎症，并且可以由各种病毒引起(病毒性肝炎)，而且可以由一些肝毒素(例如，酒精性肝炎)、自身免疫(自身免疫性肝炎)或遗传性条件引起。所谓“酒精性肝病”在本文中是指饮酒过量的任何肝表现，包括脂肪肝、酒精性肝炎以及肝硬化。在本文中还使用诸如“药物诱导的”或“毒性”肝疾病之类的相似术语来指由各种药物以及环境化学药品引起的病症范围。“脂肪肝”(或肝脂质沉着症)在本文中是指其中甘油三酯脂肪的大空泡在肝细胞中累积的可逆状况。“非酒精性脂肪肝”表示除了其他方面之外还与肥胖症以及代谢综合征相关联的疾病谱。脂肪肝可引起炎性疾病(即，脂肪性肝炎)并最终引起肝硬化。“肝硬化”表示在由于各种原因(包括例如病毒性肝炎、饮酒过量以及其他形式的肝毒性)已经死亡的肝细胞的位置中形成纤维组织(纤维化)。肝硬化可引起慢性肝功能衰竭。“原发性肝癌”最常见地表现为“肝细胞癌”和/或“胆管癌”，较罕见的形式包括肝的血管肉瘤以及“血管内皮瘤”。许多肝恶性肿瘤是从胃肠道或诸如肾、肺、乳腺或前列腺之类的其他器官中的原发性癌转移的继发性损害。“原发性胆汁性肝硬化”是指毛细胆管的严重自身免疫疾病。“原发性硬化性胆管炎”是指胆管的严重慢性炎性疾病，其被认为是起源于自身免疫。“肝小叶中心坏死”可由肠毒素泄露到血液循环中引起。例如，已经显示回肠中的沙门氏菌毒素对肝细胞造成严重损伤。“Budd–Chiari综合征”表示由肝静脉堵塞引起的临床现象，其在一些情况下可引起肝硬化。对肝造成损伤的遗传性疾病包括涉及铁在身体中的累积的“血色素沉着症”以及使身体保留铜的“威尔逊氏病”。肝损伤也是“α-1抗胰蛋白酶缺乏症”以及“糖原储存病II型”的临床特征。在“甲状腺素运载蛋白相关的遗传性淀粉样变”中，肝产生突变的甲状腺素运载蛋白，其具有严重的神经组织退化和/或心脏病的影响。“吉尔伯特综合征”是指胆红素代谢的遗传紊乱，其可引起轻度黄疸病。

根据非常具体的实施方案，由核酸表达盒或载体中的转基因编码的治疗性蛋白质是因子IX，并且方法是用于治疗血友病B的方法。通过经由基因疗法在肝中表达因子IX，可以治疗血友病B(Snyder等人，1999)。根据另一非常具体的实施方案，由核酸表达盒或载体中的转基因编码的治疗性蛋白质是因子VIII，并且方法是用于治疗血友病A的方法。

除非作出不同注释，术语“受试者”或“患者”可互换地使用并且是指动物、优选脊椎动物、更优选哺乳动物，并且具体包括人类患者以及非人类哺乳动物，例如小鼠。优选患者或受试者是人类受试者。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗性处理以及预防性或防护性措施，其中目的是防止或减缓(减轻)不希望的生理变化或病症，诸如增殖性疾病(例如癌症)的发展或传播。有利或所需的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病的范围缩减、疾病的稳定化(即，无恶化)状态、疾病进展的延迟或放慢、疾病状态的改善或缓和、以及减轻(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是无法检测的。“治疗”还可以表示与不接受治疗时的预期存活期相比延长存活期。

如本文所用，诸如“需要治疗的受试者”的短语包括诸如哺乳动物受试者之类的受试者，其将受益于给定病况(诸如血友病B或血友病A)的治疗。这些受试者通常包括但不限于已经被诊断为具有该病况的那些受试者、容易患有或形成所述病况的那些受试者和/或其中要预防该病况的那些受试者。

术语“治疗有效量”是指能够在受试者中有效治疗给定病况(即，获得所需局部或全身效应及行为表现)的化合物或药物组合物的量。因此，该术语是指研究员、兽医、医学博士或其他临床医生所探寻的在组织、系统、动物或人类中诱出生物或药物应答的化合物或药物组合物的量，该生物或药物应答包括正被治疗的疾病或病症的症状的减轻。具体而言，这些术语是指以单剂量或多剂量的方式预防、治愈、改善或至少降低与给定病况(诸如如果转基因所编码的治疗性蛋白质是因子IX或VIII，则该状况为血友病)相关联的临床损伤、症状或并发症所需的根据本发明的化合物或药物组合物的量。

在特定实施方案中，如果转基因所编码的治疗性蛋白质是因子IX，则该术语意味着血浆中因子IX的水平等于或高于至少约1％生理活性(即，10mU/ml(毫单位每毫升)血浆)的治疗浓度，可以通过将根据本文所述实施方案中的任一者的载体转导或转染至受试者中来获得受试者中的至少5％生理活性或50mU/ml血浆、至少10％生理活性或100mU/ml血浆、至少15％生理活性或150mU/ml、至少20％生理活性或200mU/ml血浆、至少25％生理活性或250mU/ml血浆、至少30％生理活性或300mU/ml血浆、至少35％生理活性或350mU/ml、至少40％生理活性或400mU/ml、至少45％生理活性或400mU/ml、至少45％生理活性或450mU/ml、至少50％生理活性或500mU/ml、至少65％生理活性或650mU/ml、至少70％生理活性或700mU/ml、至少75％生理活性或750mU/ml、至少80％生理活性或800mU/ml、至少85％生理活性或850mU/ml、至少95％生理活性或950mU/ml、或至少100％生理活性或1000mU/ml。由于本发明的核酸表达盒以及载体的效率非常高，甚至可以通过施用相对低剂量的载体来获得受试者中的这种高治疗水平的因子IX。

在另一特定实施方案中，如果转基因所编码的治疗性蛋白质是因子VIII，则该术语意味着等于或高于10mU/ml(毫单位每毫升)血浆、50mU/ml血浆、100mU/ml血浆、150mU/ml血浆、200mU/ml血浆、250mU/ml血浆、300mU/ml血浆、350mU/ml血浆、400mU/ml血浆、450mU/ml血浆、500mU/ml血浆、550mU/ml血浆、600mU/ml血浆、650mU/ml血浆、750mU/ml血浆、800mU/ml血浆、850mU/ml血浆、900mU/ml血浆、950mU/ml血浆或更高的治疗浓度的血浆中因子VIII的低谷水平可以通过将本文所公开的载体中的任一者转导或转染至受试者中来获得。由于本文所公开的载体以及核酸表达盒的效率非常高，甚至可以通过施用相对低剂量的载体来获得受试者中的这种高治疗水平的因子VIII。

在特定实施方案中，如果转基因编码因子IX或因子VIII，则可以以低于6x 10¹³vg/kg(病毒基因组每千克)的剂量将根据本文所定义的实施方案中任一者的载体转导至受试者中，以在受试者中获得100mU/ml血浆或更高的治疗因子IX水平。例如，可以以低于5x10¹¹vg/kg的剂量获得受试者中的300mU/ml血浆或更高的因子IX水平。对于血友病疗法，例如可以通过评估受试者中的血友病引起的出血来测量治疗功效。在体外试验(诸如但不限于，体外活化部分凝血活酶时间试验(APPT)、试验因子IX显色活性试验)中，还可以获得凝血时间、因子IX或人类因子VIII特异性ELISA。当然可以使用本领域中已知的用于评估治疗功效的任何其他试验。

本发明的核酸表达盒、载体或药物组合物可以单独使用或与任何已知血友病疗法(诸如重组或纯化凝血因子的施用)联合使用。因此，本发明的核酸表达盒、载体或药物组合物可以单独施用或与一种或多种活性化合物联合施用。后者可以在所述药剂的施用之前、之后或与其同时施用。

本发明的另一目的是药物制剂，其包括治疗有效量的如本文所定义的核酸表达盒或表达载体以及药学上可接受的载体(即，一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等)。药物组合物可以以试剂盒的形式提供。如本文所用的术语“药学上可接受的”符合本领域，并且是指与药物组合物的其他成分相容且不会对其接受者有害。如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指诸如盐酸盐、硫酸盐以及磷酸盐之类的无机酸加成盐或诸如醋酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐以及柠檬酸盐之类的有机酸加成盐。药学上可接受的金属盐的示例为诸如钠盐以及钾盐之类的碱金属盐、诸如镁盐以及钙盐之类的碱土金属盐、铝盐以及锌盐。药学上可接受的铵盐的示例为铵盐以及四甲基铵盐。药学上可接受的有机胺加成盐的示例为具有吗啉以及哌啶的盐。药学上可接受的氨基酸加成盐的示例为具有赖氨酸、甘氨酸以及苯基丙氨酸的盐。根据本发明的药物组合物可以例如以药丸、药片、涂漆药片、糖衣药片、颗粒、硬及软胶囊、水、酒精或油溶液、糖浆、乳剂或混悬液形式口服给药，或例如以栓剂形式直肠给药。还可以不经肠道给药，例如以注射或输液溶液的形式皮下、肌内或静脉内给药。其他合适的给药形式例如为例如以软膏、酊剂、喷雾或透皮治疗系统形式经皮或局部给药，或以鼻用喷雾或气溶胶混合物或例如微囊剂、植入物或杆状物形式吸入给药。药物组合物可以采用本身对于本领域技术人员已知的方式来制备。为此目的，使如本文所定义的核酸表达盒或表达载体、一种或多种固态或液态药学上可接受的赋形剂以及如果需要的话联合其他药物活性化合物成为合适的给药形式或剂量形式，然后其可在人类医学或兽医医学中用作药物。

根据另一方面，提供了药物组合物，其包括核酸表达盒以及药学上可接受的载体，该核酸表达盒包含编码治疗性蛋白质的转基因。根据另一实施方案，药物组合物包括包含核酸表达盒的载体、以及药学上可接受的载体，该核酸表达盒包含编码治疗性蛋白质的转基因。根据进一步的特定实施方案，转基因编码因子IX并且药物组合物是用于治疗血友病B，或者转基因编码因子VIII并且药物组合物是用于治疗血友病A。

还设想了如本文所公开的核酸表达盒、其调节元件以及载体组分在制备用于治疗血友病、优选血友病B或血友病A的药物组合物中的用途。

在替代性示例中，本文所公开的表达盒及载体可用于表达免疫量的基因产物(诸如多肽、尤其是免疫原性蛋白质或RNA)以用于接种目的。

在实施方案中，药物组合物可以是疫苗。疫苗可进一步包括一种或多种佐剂以增强免疫应答。合适的佐剂包括例如但不限于皂角甙、诸如氢氧化铝之类的矿物凝胶、诸如溶血卵磷脂之类的表面活性物质、普郎尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌以及合成佐剂QS-21。任选地，疫苗可进一步包括一个或多个免疫刺激性分子。免疫刺激性分子的非限制性示例包括：具有免疫刺激、免疫增强以及促炎性活性的各种细胞因子、淋巴因子以及趋化因子，诸如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如，粒细胞-巨噬细胞(GM)集落刺激因子(CSF))；以及其他免疫刺激性分子，诸如巨噬细胞发炎因子、Flt3配体、B7.1、B7.2等等。

在实施方案中，本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物可以用作疫苗，更特别地用作预防性疫苗。

本文还公开了本文所述的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物在制备疫苗、尤其是制备预防性疫苗中的用途。

本文还公开了对需要接种的受试者进行接种、尤其是预防接种的方法，其包括：

—将本文所述的核酸表达盒、载体或药物组合物引入受试者中、尤其是引入受试者的肝中，其中核酸表达盒、载体或药物组合物包括本文所述的核酸调节元件，该核酸调节元件可操作地连接至启动子以及转基因；以及

—在受试者中、尤其是在受试者的肝中表达免疫有效量的转基因产物。

如本文所用的“免疫有效量”是指能够有效增强受试者对随后暴露于(转)基因所编码的免疫原作出的免疫应答的(转)基因产物的量。可以例如通过测量中和分泌性抗体和/或血清抗体的量(例如通过噬菌斑中和、互补物结合、酶联免疫吸附测定或微量中和试验)来确定诱导免疫力的水平。

通常，当使用如本文所教导的表达盒或载体(即，具有至少一个肝特异性核酸调节元件，其包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或如本文其他地方所述的其功能片段)时所表达的(转)基因产物的量高于使用相同表达盒或载体但其中不具有至少一个如本文所教导的肝特异性核酸调节元件(例如，包括TTRe和/或Serp)时所表达的(转)基因产物的量。更具体而言，本文的表达是通过不具有至少一个如本文所教导的肝特异性核酸调节元件但包括3xSerp的相同核酸表达盒或载体获得的表达的约1.1倍至约1.5倍；或者是通过不具有至少一个如本文所教导的肝特异性核酸调节元件(例如，包括TTRe和/或Serp)的相同核酸表达盒或载体获得的表达的约2倍至约6倍。此外，较高的表达保持对肝的特异性。此外，本文所述的表达盒及载体在延长的时间段引导治疗量的基因产物表达。通常，设想治疗性表达持续至少20天、至少50天、至少100天、至少200天，并且在一些情况下持续300天或更多。可以通过任何本领域认可的方式(诸如通过基于抗体的试验，例如蛋白免疫印迹法或ELISA试验)来测量基因产物(例如，多肽)的表达，例如以评价是否实现了基因产物的治疗性表达。还可以在生物测定中测量基因产物的表达，该生物测定检测基因产物的酶或生物活性。

应理解，尽管在本文已经针对根据本发明的方法及应用论述了特定实施方案、具体构造及配置以及材料，但是在不背离本发明的范围及精神的条件下，可作出形式及细节上的各种变化或修改。

提供以下实施例以更好地例示特定实施方案，并且这些实施例不应被视为限制本申请。本申请仅由权利要求限制。

实施例

实施例1：肝特异性调节元件的识别

材料及方法

使用计算方法将与本文所定义的高表达的肝特异性基因相关联的进化上保守的转录因子结合位点(TFBS)基序识别为核酸调节元件。这需要几个连续的计算步骤：(1)基于使用正常人类组织所获得的RNAseq(RNA测序)表达数据来识别高表达的肝特异性基因；基于顶级肝表达基因的RNAseq的mRNA表达水平如下(单位为任意单位)：ALB(46017,49)；APOA2(21859,94)；TTR(9551,38)；APOC1(9505,84)；APOA1(9277,21)；RBP4(8322,91)；APOC3(8105,76)；CYP2E1(5932,55)；ORM1(5860,23)；(2)使用公开的数据库来提取对应的启动子序列；(3)采用计算方法来识别转录因子结合位点(TFBS)基序的聚簇；(4)针对TFBS的进化上保守的聚簇(即，CRE)筛选高表达的基因的基因组环境。

结果

RNA序列(RNAseq)分析产生了高表达的肝细胞特异性基因的详细列表。基于这些表达数据，对这些高表达的基因的启动子实施上述计算方法，从而产生21个肝特异性顺式调节序列(SEQ ID NO:1至21)的识别以及表1。

表1

实施例2：通过水动力质粒转染对所识别的肝细胞特异性顺式调节元件(CRE)进行体内验证

材料及方法

AAV质粒构建体的产生(pAAV-HS-CRE-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA)

通过传统的寡核苷酸合成来合成实施例1中所识别的肝细胞特异性(HS)顺式调节元件(CRE)HS-CRE1、HS-CRE2、HS-CRE3、HS-CRE4、HS-CRE5、HS-CRE6、HS-CRE7、HS-CRE8、HS-CRE9、HS-CRE10、HS-CRE11、HS-CRE12、HS-CRE13、HS-CRE14、HS-CRE15、HS-CRE16、HS-CRE17、HS-CRE18、HS-CRE19、HS-CRE20、HS-CRE21并将它们克隆到AAVsc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA构建体中(分别为SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52以及53)。该构建体是基于自互补腺相关病毒载体(scAAV)设计并包含偶联至TTR增强子(TTRe或TTRenh)(SEQ ID NO:24)的最小甲状腺素运载蛋白启动子(TTRm)(SEQ ID NO:27)，其驱动密码子优化的活性过度的人类因子IX Padua(R338L)(SEQ ID NO:25)cDNA的表达。在TTRm/TTRe启动子/增强子的上游克隆不同的HS-CRE。构建体还包含来自小鼠微小病毒(MVM)的内含子(SEQ ID NO:29)以及牛生长激素多腺苷酸化位点(bghpolyA)(SEQ ID NO:30)。

包含先前识别的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERP)顺式调节元件的三重重复(SEQ IDNO:22)的附加质粒构建体(等效于如Nair等人，Blood，2014以及Chuah等人，Mol Ther，2014中所述的HS-CRM8)(被命名为pAAVsc-3xSERP-TTRe-TTRm-MVM-FIXcoPadua-bghpA(SEQ IDNO:32))被包括在内以用于比较(WO 2009/130208以及WO 2016/146757，其以引用的方式具体地并入本文中)。图1示意性地表示了不同的构建体。

水动力基因传递

在2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的总体积中以每只小鼠750ng的剂量在成年C57BL/6小鼠(18至19g)中通过尾静脉以水动力方式注射AAV质粒构建体AAVsc-HS-CRE-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(包含实施例1中所识别的以下HS-CRE：HS-CRE1、HS-CRE2、HS-CRE3、HS-CRE4、HS-CRE5、HS-CRE6、HS-CRE7、HS-CRE8、HS-CRE9、HS-CRE10、HS-CRE11、HS-CRE12、HS-CRE13、HS-CRE14、HS-CRE15、HS-CRE16、HS-CRE17、HS-CRE18、HS-CRE19、HS-CRE20或HS-CRE21)。使用在TTRenh-TTRm的上游不具有任何HS-CRE元件的AAVsc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA质粒(SEQ ID NO:31)作为参考构建体以评估不同顺式调节元件对FIX表达水平的影响。在水动力注射之后的两天，通过眶后丛神经的放血来针对所有小鼠将血液收集到柠檬酸盐缓冲液中。基于制造商的方案(DiagnosticaStago，法国)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量柠檬酸盐血浆中的hFIX抗原的浓度。每一队列均包括3只小鼠/载体。

结果

通过测量小鼠中的FIX蛋白质水平来评估实施例1中所识别的顺式调节元件对体内表达的影响，这些小鼠被注射了由嵌合启动子表达人类凝血因子IX(hFIX)的质粒构建体，该嵌合启动子由有效肝特异性最小甲状腺素运载蛋白启动子联合甲状腺素运载蛋白增强子(TTRenh/TTRmin)构成，其中在TTRenh/TTRmin的上游克隆不同的CRE。在转染后1或2天评估FIX表达，证明了通过新HS-CRE中的一些显著提高了FIX。具体而言，与没有任何顺式调节元件的对照质粒构建体(即，AAVsc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA(SEQ IDNO:31))相比，所识别的顺式调节元件的约52％(21个HS-CRE中的11个)在转染后第2天诱导了hFIX表达的显著提高(图2)。进一步将新识别的调节元件与被命名为丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(WO 2009/130208，其以引用的方式具体地并入本文中)的先前所识别的肝特异性调节元件进行比较，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子在载体中以三重重复序列的形式存在(即，pAAVsc-3xSERP-TTRe-TTRm-MVM-FIXcoPadua-bghpA(SEQ ID NO:32))。我们先前已经证明了重复SERP元件3次会提高所关注的基因(例如FIX)的表达。出人意料地，我们发现新CRE中的3个(即，HS-CRE4、HS-CRE6以及HS-CRE12)优于所有其他CRE(包括SERP3X)。具体而言，HS-CRE4、HS-CRE6以及HS-CRE12表达的FIX水平比得上或甚至高于通过将三重SERP重复序列掺入AAV载体中所能达到的FIX水平。将倍增SERP元件对转基因表达水平的已知影响考虑在内，这表明，出人意料地，HS-CRE4(ApoA2；SEQ ID NO:4)、HS-CRE6(ApoC1；SEQ ID NO:6)以及HS-CRE12(RBP4；SEQ ID NO:12)因此在提高转基因表达水平方面显著优于单个SERP元件。与所有CRE(包括SERP)相比，HS-CRE6是最有效的HS-CRE。

实施例3：通过AAV病毒载体转导对所识别的肝细胞特异性顺式调节元件(CRE)进行体内验证

为了确认通过水动力(即，非病毒)质粒转染所获得的体内结果并将本发明的范围拓宽到也包括病毒载体，基于非病毒、半高通量体内筛选及验证而产生AAV血清型9(被命名为AAV9)载体颗粒，其包含实施例2中所识别的最有效的CRE(即，HS-CRE4以及HS-CRE6)。对应的AAV9载体是基于自互补(sc)结构并被命名为AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA以及AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA。作为对照，产生不包含任何CRE的AAV9载体(被命名为AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA)或包含SERP元件的三重重复序列作为参考的AAV9载体(被命名为AAV9sc-3XSERP-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA)。

载体产生以及纯化及滴定：

如先前所述，通过使用磷酸钙(Thermo Fisher Scientific,美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)使AAV-293细胞共转染AAV质粒、嵌合包装构建体以及腺病毒辅助性质粒来产生上述AAV血清型9载体(即，AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA及AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-3XSERP-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA)。(VandenDriessche T、Thorrez L、Acosta-Sanchez A等人，基于血清型8及9的腺相关病毒载体与用于血友病B基因疗法的慢病毒载体的功效及安全性，J Thromb Haemost.2007；5(1):16-24)。转染后两天，收获细胞并通过连续冻融循环以及声波处理来裂解这些细胞，随后使用benzonase(Novagen，美国威斯康辛州麦迪逊市)以及脱氧胆酸(Sigma Aldrich(MERCK，检查)，美国密苏里州圣路易斯)以及3轮氯化铯(Thermo Fisher Scientific，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)密度梯度超离心进行处理。收集包含AAV颗粒的级分并在包含1mMMgCl₂的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)(Gibco，IRL)中进行透析。

为了确定载体滴定量，使用

Green(Thermo Fisher Scientific，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)以及FIX基因的引物进行定量实时PCR(ABI Prism 7900HT，AppliedBiosystems，美国加利福尼亚州福斯特城)。正向引物序列为5’-CACGAGAACGCCAACAAGAT-3’(SEQ ID NO:55)，反向引物序列为5’-CACTTCTCCTCCATGCACTC-3’(SEQ ID NO:56)。使用对应载体质粒的已知拷贝数量产生标准曲线。

AAV9载体注射

以1x10⁹ vg/小鼠的剂量(图3A)以及5x10⁹ vg/小鼠的剂量(图3B)将AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA、AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA以及AAV9sc-3XSERP-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpoly载体注射到C57BL/6小鼠(4-5周龄)的尾静脉中。每一队列由3只小鼠组成。在注射之后的多个时间点收集血液，并通过ELISA来分析血浆的FIX蛋白质水平。

与注射了没有任何HS-CRE的AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA载体的对照小鼠相比，注射了5x10⁹ vg AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA或AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA的小鼠产生显著更高的FIX水平。这表明了HS-CRE4以及HS-CRE6元件导致FIX水平显著提高5至6倍，该水平在至少3个月内相对稳定。类似地，与注射了没有任何HS-CRE的AAV9sc-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA的对照小鼠相比，注射了较低剂量(即，10⁹vg)AAV9sc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA或AAV9sc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA载体的小鼠产生显著更高的FIX水平。对于测试的所有载体，与10⁹vg相比，在注射5x10⁹ vg之后，剂量应答是明显的，符合更高的稳定FIX水平。

进一步将新识别的调节元件与被命名为丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(WO 2009/130208，其以引用的方式具体地并入本文中)的先前所识别的肝特异性调节元件进行比较，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子在载体中以三重重复序列的形式存在(即，AAV9sc-3xSERP-TTRe-TTRm-MVM-FIXcoPadua-bghpA)。我们先前已经证明了重复SERP元件3次会提高所关注的基因(例如FIX)的表达。与实施例2中所示的水动力转染数据一致，我们发现HS-CRE4以及HS-CRE6表达的FIX水平比得上或甚至高于通过将三重SERP重复序列掺入AAV载体中所能达到的FIX水平。将倍增SERP元件对转基因表达水平的已知影响考虑在内，这再次确认了，HS-CRE4(ApoA2；SEQID NO:4)以及HS-CRE6(ApoC1；SEQ ID NO:6)在提高转基因表达水平方面优于单个SERP元件。与所有CRE(包括SERP)相比，在基于AAV9的肝转导的情况下，HS-CRE6同样是最有效的HS-CRE。

本发明人通过实验研究测试哪些转录因子结合在HS-CRE 1-21上。

通过实验研究发现，(1)HS-CRE6、HS-CRE4以及HS-CRE12(它们是导致肝特异性蛋白质水平最大提高的HS-CRE)全部具有SP1、EP300、HNF4G、CEBPB、P300、HDAC2、JUND、FOSL2、ZBTB7A、CEBPD以及RXRA的转录因子结合位点；(2)HS-CRE1、HS-CRE5以及HS-CRE13(它们是显示肝特异性蛋白质水平中等提高的HS-CRE)全部具有SP1、EP300、POLR2A、MYBL2、FOXA1、FOXA2、ARID3A、POLR2A以及HEY1的转录因子结合位点；以及(3)HS-CRE9、HS-CRE11、HS-CRE14、HS-CRE16以及HS-CRE20(它们是显示肝特异性蛋白质水平最低提高的HS-CRE)全部具有SP1、EP300、HNF 4G、CEBPB、P300以及HNF 4A的转录因子结合位点。因此，HS-CRE6、HS-CRE4、HS-CRE12、HS-CRE1、HS-CRE5、HS-CRE13、HS-CRE9、HS-CRE11、HS-CRE14、HS-CRE16以及HS-CRE20全部具有SP1以及EP300的转录因子结合位点。

参考文献

Budker V,Zhang G,Knechtle S,Wolff JA.Naked DNA deliveredintraportally expresses efficiently in hepatocytes.(1996)Gene Ther.Jul；3(7):593-8.

BRUNETTI-PIERRI N,GROVE NC,ZUO Y,EDWARDS R,PALMER D,CERULLO V,TERUYAJ,NG P.Bioengineered factor IX molecules with increased catalytic activityimprove the therapeutic index of gene therapy vectors for hemophilia B.HumGene Ther.2009May；20(5):479-85.

Chang,J.,Jin,J.,Lollar,P.,Bode,W.,Brandstetter,H.,Hamaguchi,N.,Straight,D.L.&Stafford,D.W.(1998).Changing residue 338in human factor IX fromarginine to alanine causes an increase in catalytic activity.J Biol Chem273(20):12089-12094.

CRISTIANO RJ,Smith LC,Kay MA,Brinkley BR,Woo SL.(1993a)

Hepatic gene therapy:efficient gene delivery and expression in primary hepatocytes utilizing a conjugated adenovirus-DNA complex. Proc Natl Acad Sci USA.90(24):11548-11552.

CRISTIANO RJ,Smith LC,Woo SL.(1993b)Hepatic gene therapy:adenovirusenhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primaryhepatocytes.90(6):2122-2126.

GRIMM D,LEE JS,WANG L,DESAI T,AKACHE B,STORM TA,KAY MA (2008).JVirol.82(12):5887-5991.

IVICS Z,HACKETT PB,PLASTERK RH,

Z.(1997)Molecularreconstruction of Sleeping Beauty,a Tc1-like transposon from fish,and itstransposition in human cells.Cell.91(4):501-510.

Kay MA,Baley P,Rothenberg S,Leland F,Fleming L,Ponder KP,Liu T,Finegold M,Darlington G,Pokorny W,Woo SLC.(1992)Expression of human alpha 1-antitrypsin in dogs after autologous transplantation of retroviral transducedhepatocytes.Proc Natl Acad Sci U S A.Jan 1；89(1):89-93.

Kao,C.Y.,Lin,C.N.,Yu,I.S.,Tao,M.H.,Wu,H.L.,Shi,G.Y.,Yang,Y.L.,Kao,J.T.&Lin,S.W.(2010).FIX-Triple,a gain-of-function factor IX variant,improveshaemostasis in mouse models without increased risk of thrombosis.ThrombHaemost 104(2):355-365.

Kistner A,Gossen M,Zimmermann F,Jerecic J,Ullmer C,Lybbert H,BujardH.(1996)Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific controlof geneexpression in transgenic mice.Proc Natl Acad Sci U S A.Oct 1；93(20):10933-8.

Lin,C.N.,Kao,C.Y.,Miao,C.H.,Hamaguchi,N.,Wu,H.L.,Shi,G.Y.,Liu,Y.L.,High,K.A.&Lin,S.W.(2010).Generation of a novel factor IX with augmentedclotting activities in vitro and in vivo.J Thromb Haemost 8(8):1773-1783.

LISOWSKI L,DANE AP,CHU K,ZHANG Y,CUNNINGHAM SC,WILSON EM,NYGAARD S,GROMPE M,ALEXANDER IE,KAY MA.(2014)Nature.506(7488):382-386.

Liu F,Song Y,Liu D.(1999)Hydrodynamics-based transfection in animalsby systemic administration of plasmid DNA.Gene Ther.Jul；6(7):1258-66.

McCARTY DM,MONAHAN PE,and SAMULSKI RJ.(2001).Self-complementaryrecombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficienttransduction independently of DNA synthesis.Gene Ther.8,1248-54.

McCARTY DM,FU H,MONAHAN PE,TOULSON CE,NAIK P,and SAMULSKI RJ.(2003).Adeno-associated virus terminal repeat(TR)mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction invivo.Gene Ther.10,2112-8.

L,CHUAH MK,BELAY E,JERCHOW B,MANOJ N,ACOSTA-SANCHEZ A,GRZELADP,SCHMITT A,BECKER K,MATRAI J,MA L,SAMARA-KUKO E,GYSEMANS C,PRYPUTNIEWICZ D,MISKEYC,FLETCHER B,VANDENDRIESSCHE T,,IVICS Z,and IZSVAK Z.(2009).Molecularevolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robuststable gene transfer in vertebrates.Nat Genet.41,753-61.

Milanov,et al.,2012 Engineered factor IX variants bypass FVIII andcorrect hemophilia A phenotype in mice Blood 119:602-611.

Nair N,Rincon MY,Evens H,Sarcar S,Dastidar S,Samara-Kuko E,Ghandeharian O,Man Viecelli H,

B,De Bleser P,VandenDriessche T,Chuah MK.(2014).Computationally designed liver-specific transcriptional modules andhyperactive factor IX improve hepatic gene therapy.Blood123,3195-9.

NATHWANI AC,DAVIDOFF AM,HANAWA H,YUNYU HU,HOFFERFA,NIKANOROV A,SLAUGHTER C,NG CYC,ZHOU J,LOZIER J,MANDRELL TD,VANIN EF,and NIENHUIS AW.(2002).Sustained high-level expression of human factor IX(hFIX)after liver-targeted delivery of recombinant adeno-associated virus encoding the hFIXgene in rhesus macaques.Blood 100,1662–1669.

NATHWANI AC,GRAY JT,NG CY,ZHOU J,SPENCE Y,WADDINGTON SN,TUDDENHAM EG,KEMBALL COOK G,McINTOSH J,BOON-SPIJKER M,MERTENS K,DAVIDOFF AM.(2006).Self-complementary adeno-associated virus vectors containing a novel liver-specific human factor IX expression cassette enable highly efficienttransduction of murine and nonhuman primate liver.Blood 107,2653-61.

NATHWANI AC,TUDDENHAM EG,RANGARAJAN S,ROSALES C,MCINTOSH J,LINCH DC,CHOWDARY P,RIDDELL A,PIE AJ,HARRINGTON C,O'BEIRNE J,SMITH K,PASI J,GLADER B,RUSTAGI P,NG CY,KAY MA,ZHOU J,SPENCE Y,MORTON CL,ALLAY J,COLEMANJ,SLEEP S,CUNNINGHAM JM,SRIVASTAVA D,BASNER-TSCHAKARJAN E,MINGOZZI F,HIGH KA,GRAY JT,REISS UM,NIENHUIS AW,and DAVIDOFF AM.(2011).Adenovirus-associated virusvector-mediated gene transfer in hemophilia B.N Engl J Med.365,2357-2365.

WU Z,SUN J,ZHANG T,YIN C,YIN F,VAN DYKE T,SAMULSKI RJ,and MONAHAN PE.(2008).Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directedexpression results in sustained correction of hemophilia B at low vectordose.Mol Ther.16,280-9.

Schuettrumpf,J.,Herzog,R.W.,Schlachterman,A.,Kaufhold,A.,Stafford,D.W.&Arruda,V.R.(2005).Factor IX variants improve gene therapy efficacy forhemophilia B.Blood 105(6):2316-2323.

Simioni,P.,Tormene,D.,Tognin,G.,Gavasso,S.,Bulato,C.,Iacobelli,N.P.,Finn,J.D.,Spiezia,L.,Radu,C.&Arruda,V.R.(2009).X-linked thrombophilia with amutant factor IX(factor IX Padua).N Engl J Med 361(17):1671-1675.

SNYDER RO,MIAO C,MEUSE L,TUBB J,DONAHUE BA,HUI-FENG LIN,STAFFORD DW,PATEL S,THOMPSON AR,NICHOLS T,READ MS,BELLINGER DA,BRINKHOUS KM,and KAY MA.(1999).Correction of hemophilia B in canine and murine models usingrecombinant adeno-associated viral vectors.Nat Med.5,64–70.

WARD,N.J.ET AL.Codon optimization of human factor VIII cDNAs leads tohigh-level expression.Blood 117,798-807(2011).

Yamada T,Iwasaki Y,Tada H,Iwabuki H,Chuah MK,VandenDriessche T,FukudaH,Kondo A,Ueda M,Seno M,Tanizawa K,Kuroda S.(2003)Nanoparticles for thedelivery of genes and drugs to human hepatocytes.Nat Biotechnol.Aug；21(8):885-90.

YUSA ET AL.A hyperactive piggyBac transposase for mammalianapplications.Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(4):1531-6.

Zhang G,Budker V,Wolff JA.(1999)High levels of foreign geneexpression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.HumGene Ther.JuI 1；10(10):1735-7.

DE BLESER P,HOOGHE B,VLIEGHE D,VAN ROY F.(2007)A distance differencematrix approach to identifying transcription factors that regulatedifferential gene expression.Genome Biol.8(5):R83.

CHUAH,M.K.,PETRUS,I.,DE BLESER,P.,LE GUINER,C.,GERNOUX,G.,ADJALI,O.,NAIR,N.,WILLEMS,J.,EVENS,H.,

M.Y.,MATRAI,J.,DI MATTEO,M.,SAMARA-KUKO,E.,YAN,B.,ACOSTA-SANCHEZ,A.,MELIANI,A.,CHEREL,G.,BLOUIN,V.,CHRISTOPHE,O.,MOULLIER,P.,MINGOZZI,F.,VANDENDRIESSCHE,T.(2014)Liver-specifictranscriptional modules identified by genome-wide in silico analysis enableefficient gene therapy in mice and non-humans primates.Mol.Ther.22(9):1605-13

GARMORY HS1,BROWN KA,TITBALL RW.(2003)DNA vaccines:improvingexpression of antigens.Genet Vaccines Ther.1(1):2Wu C,Macleod I,Su AI.(2013)BioGPS and MyGene.info:organizing online,gene-centric information.NucleicAcids Res.41(Database issue):D561-5.

MCINTOSH J,LENTING PJ,ROSALES C,LEE D,RABBANIAN S,RAJD,PATEL N,TUDDENHAM EG,CHRISTOPHE OD,MCVEY JH,WADDINGTON S,NIENHUIS AW,GRAY JT,FAGONEP,MINGOZZI F,ZHOU SZ,HIGH KA,CANCIO M,NG CY,ZHOU J,MORTON CL,DAVIDOFF AM,NATHWANI AC.(2003)Therapeutic levels of FVIII followinga single peripheral vein administration of rAAV vector encoding a novel human factor VIII variant.Blood.121(17):3335-44XIAO SJ,ZHANG C,ZOU Q,JI ZL.(2010)TiSGeD:database for tissue-specific genes.Bioinformatics 26(9):1273-5.

序列表

<110> VRIJE布鲁塞尔大学

<120> 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途

<130> VUB-076-PCT

<150> 18202986.8

<151> 2018-10-26

<160> 58

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

tgggaaatta cagttaaata ccatggtaat gaataaaagg tacaaatcgt ttaaactctt 60

atgtaaaatt tgataagatg ttttacacaa ctttaataca ttgacaaggt cttgtggaga 120

aaacagttcc agatggtaaa tatacacaag ggatttagtc aaacaatttt ttggcaagaa 180

tattatgaat tttgtaatcg gttggcagcc aatgaaatac aaagatgagt ctagttaata 240

atctacaatt attggttaaa gaagtatatt agtgctaatt tccctccgtt tgtcctagct 300

tttctcttct gtcaacccca cacgcctttg gcacaa 336

<210> 2

<211> 347

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ttttttcttt tctaaatgat cagtacactt attctttcta aagaaaatac ttttcttaac 60

tactctctat ttttaaactt ctcccacaaa gatgagaaaa catttaaaaa tcattggggc 120

tatttttctg tttaccgagt aaagagaatc tctaaaccat atttataact cttactctaa 180

atatttgcat ttaccctcat gccagagccc gttgatgact gactaaacag agtttcaaag 240

tttgaagaac aggaaattta gaaatgacta acaattatgt aggtttattt ctctcagtat 300

agaatgttca tatagaatta atgccagagg ttttcagaga aaaatgc 347

<210> 3

<211> 386

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

gggacactga agccaaatgg gcttcagctc ctccccaggg atctccctac ctgctgccca 60

ttccaacctg gctctctccc tctccacaac tgaagcccag gcctctttgg atgctgctca 120

cacatcttgc ctccttatct tacctagcca gcgtctctgt ccttggtgtc tgtgcctgcc 180

ctggctggag aggaaggggc tatatacctg tctgtttacc caccccctgt caggtgacag 240

ggactatgga tgggcccagt ggggcaggga ttatgtgagg ataaacaagt tggagaaatg 300

ggggaggaga ggacaagcac atggaagact catggtgatg gggtgagagg cagggggtac 360

agctcttagt ggaggctaag ggggta 386

<210> 4

<211> 426

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gagttaatgt gtaatgagac ggggagaaaa caggagagcc cagaatgacc tggatgctga 60

tcactgaaca taccctaccc ccagtaaaac aaattcagaa aacagcttcc gcccgtcccc 120

tcccaatgga gggctctggc aggaaaagag gtgaataaga ggcttctacc agggtaaagg 180

ttgaaggcac ctggtcattt gatcacctta tcagttctag gcagtgatta gccaatattg 240

agtcagcagg ggcaatagcc ctggcccttg tctcactcct gttgggggtg ggggaggggg 300

agaggtacat tcccaggttc aaagcatttg ggtgaaatca gttaaataga tatcagaagc 360

ttttgtatct ttcacccttt tgccccccaa gcatactcgc tgagtatgtg gaacattcct 420

gagggt 426

<210> 5

<211> 260

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

tgttttgttt tggtgaccta actggtcaaa tgacctatta agaatatttc atagaacgaa 60

tgttccgatg ctctaatctc tctagacaag gttcatattt gtatgggtta cttattctct 120

ctttgttgac taagtcaata atcagaatca gcaggtttgc agtcagattg gcagggataa 180

gcagcctagc tcaggagaag tgagtataaa agccccaggc tgggagcagc catcacagaa 240

gtccactcat tcttggcagg 260

<210> 6

<211> 267

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

aggggggccc ctggggctga cagggactgg aagctctgag ctggccagag ggatgttgca 60

atcctgccag ggtcttgtct atgctgtcct tttcacaacc atccccctac tgccaggctg 120

acacgtggtt gcgggggcac aaggccagcc aacctagagt ctgaggctag gcggaggaca 180

ccctccccac cagctgccag ggtcactggc ggtcaaaggc agctggtggg gaaggcattg 240

gactccagcc ttgggggacg gatgtag 267

<210> 7

<211> 313

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tacaggcctg gggtcccggc ttagaggacc tctgagagct ccggggcccc ttctgggtcg 60

tggttgcctc atcgtggtcg ggtgggtctc caggttctcc caggctcagt cccgcaggcg 120

ccaaatctgc gcaggagagc actagcaacc gatgacgtat tgaggcccac acctctggga 180

ttggctgtcc tgcttcgaca gccttgaaag tgggtaagct gggtgggggg ctctgggaga 240

ggtcagtgct gagtaaggca attcccagca gcttgagccc caccaggtca ctccagtatt 300

cctccccatt ctt 313

<210> 8

<211> 513

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

cccgaacgaa taaacccctt ccttaactca gcgtctgagg aattttgtct gcggctcctc 60

ctgctacatt ctgagtgggg aaagggacta aggtggtctg aggaccccac agagtcagga 120

agattgagag gtgagagtgc tgaacgggga ggggctttgg ggctaaggga agtgcccggg 180

accccacctg accccaacgc tcacgggaca ggggcagagg agaaaaacgt gggtggacag 240

agggaggcag gcggtcaggg gaaggctcag gaggagggag atcaacatca acctgccccg 300

ccccctcccc agcctgataa aggtcctgcg ggcaggacag gacctcccaa ccaagccctc 360

cagcaaggat tcaggttggt gctgagtgcc tgggagggac acccgcctac actctgcaag 420

aaactcaaaa agggagatga ggggatcgtg ggagggaggt agggagggag gagggtgcca 480

ctgatcccct gaacccctgc ctctgcctcc aga 513

<210> 9

<211> 306

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

gatgagtgca gggaaccccg accccacccg ggagacctgc aagcctgcag acactcccct 60

cccgccccca ctgaaccctt gacccctgcc ctgcagcccc cgcagcttgc tgtttgccca 120

ctctatttgc ccagccccag ggacagagct gatccttgaa ctcttaagtt ccacattgcc 180

aggaccagtg agcagcaaca gggccggggc tgggcttatc agcctcccag cccagaccct 240

ggctgcagac ataaataggc cctgcaagag ctggctgctt agagactgcg agaaggaggt 300

gcgtcc 306

<210> 10

<211> 406

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

ttctatcatt atcttcaatc agaaactgat gtgtggggag gtgatgtatc ataactcatc 60

cagggtcagg cagctggatt tgaacctgcc tgacccttag atttgaggtt ttctggctcc 120

agaatcttct ctgaagtgaa aggcatgagg ccgaccactc cctgatctgg taaacagaga 180

tgtcagcctg gtttctagtg ttagggagtt tcctggagtg atggtacagg gtacatttct 240

gccctgcatc ccaagtccag agactgggtt ctaggtccag cctttcttct aactccctga 300

gagatgacag cctctgggca aagtccctct gtgctcttca gtctcttcat ctgtgagatg 360

gtggcatggg gagaggctgg agtgatgtca cagttcctct cagcct 406

<210> 11

<211> 504

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

acaaaagctg cagcaaaatt gccaaaagta ggaactactg ggggtggggg tcctgtctcc 60

cctgctcagt caccacctcc cctccctaac tctcattctg gctcatacca cgtgctccca 120

gaagaaacgt tctgagcagg ggctggtatg agactgcctc ccctcccagg acccactcct 180

ccctatgacc aggctggtga ccctccctct agggtgccag tgccattcac tgagcagatg 240

tttggcaggt gtctgttatg tgccagacct agcaggggac agagtcctcc cgatacagat 300

ggaccagtat gtttggacat aaattgtgaa aggagttgct aatctttctg tgcaaaatcc 360

actcttgcgg tcaccgccaa cactcctaca catgtcaggg catccagggc caggacttgg 420

taaccctgtt caggagcagt cgctctggag actcccaaga cgagggaaag aaatgggtgg 480

aaacaggggc ctacactgtg ggcc 504

<210> 12

<211> 431

<212> DNA

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gtgaggccac ggtcttcccg ccaggttgac tcgagcctcc tgccagagcc actggccccg 60

gaggccaccc tagaccgcag ctggcggccg ctggcacgag tgcagggtaa ctgagccagg 120

gccgctggcg catttggcct ggccgaggcc accccgcgcg gccgctccac tgtgcccgag 180

gctgtcctgg aggtgaggcc ggcccacagg gaccctgccc gtgcccgggc tccggtgagt 240

cagggcgcgt tatgcaagtg cccccggcgc ctccccttcg gtctttcacc ccgcgcggtt 300

acgaaagcgc gaccccctcc ccccggcgct ataaagcagc ggggcggccg cggcgcgctc 360

gcctccctcg ctccacgcgc gcccggactc ggcggccagg cttgcgcgcg gttcccctcc 420

cggtggtgag t 431

<210> 13

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<212> DNA

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aaatacctaa actagtcaca ctgttttgat tcaattggct actgaagtta tagaatgttg 60

tttactcttc tctcctttgt ctactcccca gccaacaaaa caaccgacct tagctgtttt 120

gaaaataaat gaaaattcca acatgggttt gaaataaaat tgcatcataa acaatcggta 180

ggtgtttttc aaagtggttt cagggaagtg ccacggagta agcaggcgac caccgaggct 240

gctaaaatat ttcctgtcct gaccagggtt gcgtttctgg agaatattta acagggaggg 300

ttttaacgct tttaaagatg ttgaaactaa agaacaaata ttgaccagag ggcaccacaa 360

cgctcctgaa agagagtaaa atacatcctt tataaaatga aaaactactt ggatgaatta 420

ttccaaaatt cctgcacaag tggacctc 448

<210> 14

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ctgagctcat ctgggctgca gggctggcgg gacagcagcg tggactcagt ctcctaggga 60

tttcccaact ctcccgcccg cttgctgcat ctggacaccc tgcctcaggc cctcatctcc 120

actggtcagc aggtgacctt tgcccagcgc cctgggtcct cagtgcctgc tgccctggag 180

atgatataaa acaggtcaga accctcctgc ctgtctgctc agttcatccc tagaggcagc 240

tgctccaggt aatgccctct ggggagggga aagaggaggg gaggaggatg aagaggggca 300

agaggagctc cctgcccagc ccagccagca agcct 335

<210> 15

<211> 431

<212> DNA

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<400> 15

agaagggtca gcggcccctc ctggaccacc gactccccgc agaactcctc tgtgccctct 60

cctcaccaga ccttgttcct cccagttgct cccacagcca gggggcagtg agggctgctc 120

ttcccccagc cccactgagg aacccaggaa ggtgaacgag agaatcagtc ctggtggggg 180

ctggggaggg ccccagacat gagaccagct cctcccccag gggatgttat cagtgggtcc 240

agagggcaaa atagggagcc tggtggaggg aggggcaaag gcctcgggct ctgagcggcc 300

ttggcccttc tccaccaacc cctgccctac actaaggggg aggcagcggg gggcacacag 360

ggtgggggcg ggtggggggc tgctgggtga gcagcactcg cctgcctgga ttgaaaccca 420

gagatggagg t 431

<210> 16

<211> 559

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

gtagctgatg ggaagagcag actgccttcc agccaggcct ggtcctgtga gtcagggacg 60

tccatcttag tgggcatgaa aggcctgtgt gatctcgagg gagacatcgc ctctccaagc 120

ctctccttat ctgtgcaaca ggcagactta atgattggtg aggcaatgag gctgatagct 180

cagcattagc tacagccacc cctcctggcc aaccacacag ggatcaaacc aggggtcagt 240

ccagaggtca gagtcaggag cagacaactc agatccagcc agggacaggc aggtcacacg 300

gacatgtgcc tcacgtatgc ttcaaggggc cctcccccgg gcagaactga aggacagctc 360

ctgttgccat aggagggagc tgggtgagat actaggagga acttccggca tgatgatgtg 420

tgatgaacaa gggcctctgg ccaacaggtc tgaatcaggg ctgcccagcc cagcctggtg 480

ggaagggcat ggagcatggg ggctcatgta ctaaacctca cctggacaca aggtgaaaca 540

gcccaacccc agaggacca 559

<210> 17

<211> 370

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

gcttgcaaca atgtctggca cataggaaaa gtgatcacta aatgttagcc acgtcttact 60

cctgcaaggc tcacctccct ggaacccatc ggtcccaacc ctgctcctga atcaggcaca 120

gtccagcttg cagcgggagc aaaggtcagt actcagtgcc cctgtccctt ccccaggcca 180

gaggggagga ggagactgag tcacgaatga cacctcagcc gcagtttgac ctccaggact 240

tacagtccta gcagccggtg ccactagcat gtgagaggtc cagaggcgct tctgtctcac 300

ccgcccgcct gggtgcaccc atgctgggag cgcctgcacc atttgagcat gtccgagagc 360

atccaccaga 370

<210> 18

<211> 431

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

ctgggcagga gcagctggct tgagcagaat cttgggacct gaggctctca ggggacctcc 60

cattggggga tggagggcaa tggtggtggt gcccaggagg tcttctactt agatgtctat 120

tggatctcta aatgaggctg catgcataat cacacacaaa catccactga gaaggtgaca 180

caccacgtca gcatgggtcc ctctgccgga ccacaccact cctagtgact atgaggtgac 240

atccaggcac gttgcactat tggctcctgt cggtgagtgc agtgcctgac aacagtgagc 300

tacatttatt tgtaaaaatg aacgccatca gagtagacca caattgtact aactctaatt 360

tgctttgtgt tcattttttc agtttccaga agtggcttaa tgtttcctag ggtcaaaggc 420

agtcaaatga c 431

<210> 19

<211> 481

<212> DNA

<213> 智人

<400> 19

gaagggggaa gagacccact gaaatcctat ctcccagcct cacctctgct gtctcctcca 60

cgcttcctgt ctccagagcc ccgagttcag cataagcaga aagcggcctg ttccctctct 120

agggagagga gggttgcggt ctggaggtct ggctcgtctt tatctgcgca ttctcccagc 180

ctcctggctt cagacctcag cgaggcggcg gctgccggcc ggctctcctc ttcctgcctg 240

cagacctggc ctgctgcttc tttctccttc ctccctccct gcctgccctg cggtttcaaa 300

gtagattaga aataacagtg tcccacatgg aagcctctac ttcttcctgg gtcaactttg 360

atgacgaggc tccagaaaac ctttgcaatg ctgtgtggaa tttttaaatc ggtgagctcg 420

tgctcttgcc ctatttattt gtccagcgta catttctgaa cattgtgaac gtcgaatggg 480

c 481

<210> 20

<211> 345

<212> DNA

<213> 智人

<400> 20

ggaaaacagg gagacagttt cctgtttgag atgttgggag atgcttcgag tagtatattt 60

actggaaata gacattcaac ttggatgtcc ctttttggaa atgtgcctgc gtccagggct 120

gggttggggc cccaatgaac tttggctctg acacagctgt tgccacactc agtggaactg 180

aatctatgtt tgtcttcccc ggcatccttc accccaactc tccccgccac aacatacatc 240

ccatgccagc ctggggaccc tcaaaggtgg cttcatcatt aggtttgtgg ctgggtccca 300

ctgaagtaag tcttggcact cagagggata ggaattgaat gaaga 345

<210> 21

<211> 386

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

ggaggttgca gtaagccaag attgtgccac tgcactccaa cctgggtgac agagccagac 60

tctgtctcaa gaaaataaag agaaaaagaa ctagattcag gctgtatgtg ggcaccatct 120

acagacatca gacacacaca tttaggagta ataatgatgc aatattgcca aatgtttctc 180

agcaaccatg tgcaactgtt gcatgtactg tttatttcta actcaggagg atctctctaa 240

ccacacattg caagaaaata gactttcagt gtttctggca aaacaaagag tttttttgtt 300

ggcatttatg ctgaaaggga agagttaaaa tgttaatttg tcttttttct tacctccaag 360

ttcactcaaa tcctctcttg aagcag 386

<210> 22

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SerpEnh

<400> 22

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc ac 72

<210> 23

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3xSerpEnh

<400> 23

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc accgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg 120

aggagcaaac aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca 180

ccccagttat cggaggagca aacaggggct aagtccac 218

<210> 24

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TTRe

<400> 24

cactgggagg atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat 60

taggacatgt ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag 100

<210> 25

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> co-FIX-R338L

<400> 25

atgcagcgcg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60

ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120

ctgaaccgcc ccaagcgcta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180

gagcgcgagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg cccgcgaggt gttcgagaac 240

accgagcgca ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300

ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360

ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc 420

tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480

taccgcctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggccgc 540

gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc cgcgccgagg ccgtgttccc cgacgtggac 600

tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660

ttcaacgact tcacccgcgt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720

caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780

tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggag accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840

gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaagc gcaacgtgat ccgcatcatc 900

ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960

ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020

tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg ccgcgtgttc 1080

cacaagggcc gcagcgccct ggtgctgcag tacctgcgcg tgcccctggt ggaccgcgcc 1140

acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200

gagggcggcc gcgacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260

ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320

tacggcatct acaccaaggt gagccgctac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380

acctaatga 1389

<210> 26

<211> 4377

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> co-FVIIIdeltaB

<400> 26

atgcagatcg agctgtccac ctgctttttt ctgtgcctgc tgcggttctg cttcagcgcc 60

acccggcggt actacctggg cgccgtggag ctgtcctggg actacatgca gagcgacctg 120

ggcgagctgc ccgtggacgc ccggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

accagcgtgg tgtacaagaa aaccctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240

gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300

gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360

ggcgtgagct actggaaggc cagcgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagcgg 420

gagaaagaag atgacaaggt gttccctggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480

aaagaaaacg gccccatggc ctccgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540

gtggacctgg tgaaggacct gaacagcggc ctgatcggcg ctctgctcgt ctgccgggag 600

ggcagcctgg ccaaagagaa aacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660

ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag acaaagaaca gcctgatgca ggaccgggac 720

gccgcctctg ccagagcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacagaagc 780

ctgcccggcc tgattggctg ccaccggaag agcgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840

accacacccg aggtgcacag catctttctg gaagggcaca cctttctggt ccggaaccac 900

cggcaggcca gcctggaaat cagccctatc accttcctga ccgcccagac actgctgatg 960

gacctgggcc agttcctgct gttttgccac atcagctctc accagcacga cggcatggaa 1020

gcctacgtga aggtggactc ttgccccgag gaaccccagc tgcggatgaa gaacaacgag 1080

gaagccgagg actacgacga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt gcggttcgac 1140

gacgacaaca gccccagctt catccagatc agaagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200

tgggtgcact atatcgccgc cgaggaagag gactgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260

cccgacgaca gaagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagcg gatcggccgg 1320

aagtacaaga aagtgcggtt catggcctac accgacgaga cattcaagac ccgggaggcc 1380

atccagcacg agagcggcat cctgggcccc ctgctgtacg gcgaagtggg cgacacactg 1440

ctgatcatct tcaagaacca ggctagccgg ccctacaaca tctaccccca cggcatcacc 1500

gacgtgcggc ccctgtacag caggcggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560

cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggacggcccc 1620

accaagagcg accccagatg cctgacccgg tactacagca gcttcgtgaa catggaacgg 1680

gacctggcct ccgggctgat cggacctctg ctgatctgct acaaagaaag cgtggaccag 1740

cggggcaacc agatcatgag cgacaagcgg aacgtgatcc tgttcagcgt gttcgatgag 1800

aaccggtcct ggtatctgac cgagaacatc cagcggtttc tgcccaaccc tgccggcgtg 1860

cagctggaag atcccgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctacgtg 1920

ttcgactctc tgcagctctc cgtgtgtctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980

atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttcagcg gctacacctt caagcacaag 2040

atggtgtacg aggacaccct gaccctgttc cctttcagcg gcgagacagt gttcatgagc 2100

atggaaaacc ccggcctgtg gattctgggc tgccacaaca gcgacttccg gaaccggggc 2160

atgaccgccc tgctgaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220

agctacgagg atatcagcgc ctacctgctg tccaagaaca acgccatcga accccggagc 2280

ttcagccaga acccccccgt gctgacgcgt caccagcggg agatcacccg gacaaccctg 2340

cagtccgacc aggaagagat cgattacgac gacaccatca gcgtggagat gaagaaagag 2400

gatttcgata tctacgacga ggacgagaac cagagcccca gaagcttcca gaagaaaacc 2460

cggcactact tcattgccgc cgtggagagg ctgtgggact acggcatgag ttctagcccc 2520

cacgtgctgc ggaaccgggc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa agtggtgttc 2580

caggaattca cagacggcag cttcacccag cctctgtata gaggcgagct gaacgagcac 2640

ctggggctgc tggggcccta catcagggcc gaagtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

cggaatcagg ccagcagacc ctactccttc tacagcagcc tgatcagcta cgaagaggac 2760

cagcggcagg gcgccgaacc ccggaagaac ttcgtgaagc ccaacgaaac caagacctac 2820

ttctggaaag tgcagcacca catggccccc accaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880

gcctacttca gcgacgtgga tctggaaaag gacgtgcact ctggactgat tggcccactc 2940

ctggtctgcc acactaacac cctcaacccc gcccacggcc gccaggtgac cgtgcaggaa 3000

ttcgccctgt tcttcaccat cttcgacgag acaaagtcct ggtacttcac cgagaatatg 3060

gaacggaact gcagagcccc ctgcaacatc cagatggaag atcctacctt caaagagaac 3120

taccggttcc acgccatcaa cggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc 3180

caggaccaga gaatccggtg gtatctgctg tccatgggca gcaacgagaa tatccacagc 3240

atccacttca gcggccacgt gttcaccgtg cggaagaaag aagagtacaa gatggccctg 3300

tacaacctgt accccggcgt gttcgagaca gtggagatgc tgcccagcaa ggccggcatc 3360

tggcgggtgg agtgtctgat cggcgagcac ctgcacgctg gcatgagcac cctgtttctg 3420

gtgtacagca acaagtgcca gaccccactg ggcatggcct ctggccacat ccgggacttc 3480

cagatcaccg cctccggcca gtacggccag tgggccccca agctggccag actgcactac 3540

agcggcagca tcaacgcctg gtccaccaaa gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600

ctggccccta tgatcatcca cggcattaag acccagggcg ccaggcagaa gttcagcagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720

cggggcaaca gcaccggcac cctgatggtg ttcttcggca atgtggacag cagcggcatc 3780

aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatt gcccggtaca tccggctgca ccccacccac 3840

tacagcatta gatccacact gagaatggaa ctgatgggct gcgacctgaa ctcctgcagc 3900

atgcctctgg gcatggaaag caaggccatc agcgacgccc agatcacagc cagcagctac 3960

ttcaccaaca tgttcgccac ctggtccccc tccaaggcca ggctgcacct gcagggccgg 4020

tccaacgcct ggcggcctca ggtcaacaac cccaaagaat ggctgcaggt ggactttcag 4080

aaaaccatga aggtgaccgg cgtgaccacc cagggcgtga aaagcctgct gaccagcatg 4140

tacgtgaaag agtttctgat cagcagctct caggatggcc accagtggac cctgttcttt 4200

cagaacggca aggtgaaagt gttccagggc aaccaggact ccttcacccc cgtggtgaac 4260

tccctggacc cccccctgct gacccgctac ctgagaatcc acccccagtc ttgggtgcac 4320

cagatcgccc tcaggatgga agtcctggga tgtgaggccc aggatctgta ctgatga 4377

<210> 27

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TTRm

<400> 27

gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60

catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120

ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180

cccttcacca ggagaagccg tc 202

<210> 28

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TTRe-TTRm

<400> 28

cactgggagg atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat 60

taggacatgt ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag ctctagagga tccccgtctg 120

tctgcacatt tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat 180

ttgtgtaggt tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt 240

ggagtcagct tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt 300

caccaggaga agccgtc 317

<210> 29

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MVM内含子

<400> 29

aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag 60

cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt gg 92

<210> 30

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BGHpolyA

<400> 30

gatctgagcc gaattcctgc agcccggggg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 60

gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 120

tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 180

tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 240

tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct gggga 295

<210> 31

<211> 6228

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAAVsc-TTRe-TTRm-MVM-co-FIX-R338L-BGHpA

<400> 31

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

aatggcgaat ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag 120

caaggccgat agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag 180

tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga 240

ttataaaaac acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg 300

cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa 360

agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 420

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 480

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 540

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 600

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 660

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 720

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 780

aacaaaaatt taacgcgaac tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt 840

atacaatctt cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca 900

tgctagtttt acgattaccg ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc 960

gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc 1020

gcagagaggg agtggaattc acgcgtggat ctgaattcaa ttcacgcgtg gtacggccgc 1080

ggtacccact gggaggatgt tgagtaagat ggaaaactac tgatgaccct tgcagagaca 1140

gagtattagg acatgtttga acaggggccg ggcgatcagc aggtagctct agaggatccc 1200

cgtctgtctg cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc taggcaaggt 1260

tcatatttgt gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc 1320

aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag 1380

ccccttcacc aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cctggctaga aagaggtaag 1440

ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag cacctgcctg 1500

aaatcacttt ttttcaggtt gggctagccc accatgcagc gcgtgaacat gatcatggcc 1560

gagagccccg gcctgatcac catctgcctg ctgggctacc tgctgagcgc cgagtgcacc 1620

gtgttcctgg accacgagaa cgccaacaag atcctgaacc gccccaagcg ctacaacagc 1680

ggcaagctgg aggagttcgt gcagggcaac ctggagcgcg agtgcatgga ggagaagtgc 1740

agcttcgagg aggcccgcga ggtgttcgag aacaccgagc gcaccaccga gttctggaag 1800

cagtacgtgg acggcgacca gtgcgagagc aacccctgcc tgaacggcgg cagctgcaag 1860

gacgacatca acagctacga gtgctggtgc cccttcggct tcgagggcaa gaactgcgag 1920

ctggacgtga cctgcaacat caagaacggc cgctgcgagc agttctgcaa gaacagcgcc 1980

gacaacaagg tggtgtgcag ctgcaccgag ggctaccgcc tggccgagaa ccagaagagc 2040

tgcgagcccg ccgtgccctt cccctgcggc cgcgtgagcg tgagccagac cagcaagctg 2100

acccgcgccg aggccgtgtt ccccgacgtg gactacgtga acagcaccga ggccgagacc 2160

atcctggaca acatcaccca gagcacccag agcttcaacg acttcacccg cgtggtgggc 2220

ggcgaggacg ccaagcccgg ccagttcccc tggcaggtgg tgctgaacgg caaggtggac 2280

gccttctgcg gcggcagcat cgtgaacgag aagtggatcg tgaccgccgc ccactgcgtg 2340

gagaccggcg tgaagatcac cgtggtggcc ggcgagcaca acatcgagga gaccgagcac 2400

accgagcaga agcgcaacgt gatccgcatc atcccccacc acaactacaa cgccgccatc 2460

aacaagtaca accacgacat cgccctgctg gagctggacg agcccctggt gctgaacagc 2520

tacgtgaccc ccatctgcat cgccgacaag gagtacacca acatcttcct gaagttcggc 2580

agcggctacg tgagcggctg gggccgcgtg ttccacaagg gccgcagcgc cctggtgctg 2640

cagtacctgc gcgtgcccct ggtggaccgc gccacctgcc tgctgagcac caagttcacc 2700

atctacaaca acatgttctg cgccggcttc cacgagggcg gccgcgacag ctgccagggc 2760

gacagcggcg gcccccacgt gaccgaggtg gagggcacca gcttcctgac cggcatcatc 2820

agctggggcg aggagtgcgc catgaagggc aagtacggca tctacaccaa ggtgagccgc 2880

tacgtgaact ggatcaagga gaagaccaag ctgacctaat gaaagatgga tttccaaggt 2940

taattcattg gaattgaaaa ttaacagccc cccccccccc ccccctgcag atctgagccg 3000

aattcctgca gcccggggga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3060

tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3120

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3180

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3240

cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggaccggtg gatctcgata 3300

gcaggcatgc tggggagaga tcgatctgag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 3360

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 3420

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caaccccccc 3480

cccccccccc cccggcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc 3540

ctttgtagag acctctcaaa aatagctacc ctctccggca tgaatttatc agctagaacg 3600

gttgaatatc atattgatgg tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc gtttgaatct 3660

ttacctacac attactcagg cattgcattt aaaatatatg agggttctaa aaatttttat 3720

ccttgcgttg aaataaaggc ttctcccgca aaagtattac agggtcataa tgtttttggt 3780

acaaccgatt tagctttatg ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ttctttgcct 3840

tgcctgtatg atttattgga tgttggaatc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 3900

tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 3960

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<223> AAVsc-HS-CRE1-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

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<210> 34

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE2-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 34

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<213> 人工序列

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<223> AAVsc-HS-CRE4-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

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agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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<211> 6497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE6-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 38

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<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE7-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 39

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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<210> 41

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE9-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 41

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gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc 1020

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ctgccctgca tcccaagtcc agagactggg ttctaggtcc agcctttctt ctaactccct 1380

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gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat 4260

ttattggatg ttggaatcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 4320

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<210> 43

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE11-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 43

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 6240

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 6300

gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 6360

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 6420

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<223> AAVsc-HS-CRE12-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 44

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 5940

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g 6661

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE13-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 45

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<220>

<223> AAVsc-HS-CRE14-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

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agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 720

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 780

aacaaaaatt taacgcgaac tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt 840

atacaatctt cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca 900

tgctagtttt acgattaccg ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc 960

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tgcatttaaa atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc 4080

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tgaggcttta ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt 4200

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<210> 47

<211> 6661

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE15-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 47

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cggcagctgc aaggacgaca tcaacagcta cgagtgctgg tgccccttcg gcttcgaggg 2340

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caccaagttc accatctaca acaacatgtt ctgcgccggc ttccacgagg gcggccgcga 3180

cagctgccag ggcgacagcg gcggccccca cgtgaccgag gtggagggca ccagcttcct 3240

gaccggcatc atcagctggg gcgaggagtg cgccatgaag ggcaagtacg gcatctacac 3300

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actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 3600

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 3660

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggaccg 3720

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tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgctcaataa tattgaaaaa 4800

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ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 6000

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gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 6180

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 6240

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 6300

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 6360

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 6420

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 6480

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 6540

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<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE16-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 48

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

aatggcgaat ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag 120

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aacaaaaatt taacgcgaac tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt 840

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ctcagcatta gctacagcca cccctcctgg ccaaccacac agggatcaaa ccaggggtca 1320

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cggacatgtg cctcacgtat gcttcaaggg gccctccccc gggcagaact gaaggacagc 1440

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ctgatgaccc ttgcagagac agagtattag gacatgtttg aacaggggcc gggcgatcag 1740

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tctaatctcc ctaggcaagg ttcatatttg tgtaggttac ttattctcct tttgttgact 1860

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tcctggctag aaagaggtaa gggtttaagg gatggttggt tggtggggta ttaatgttta 2040

attacctgga gcacctgcct gaaatcactt tttttcaggt tgggctagcc caccatgcag 2100

cgcgtgaaca tgatcatggc cgagagcccc ggcctgatca ccatctgcct gctgggctac 2160

ctgctgagcg ccgagtgcac cgtgttcctg gaccacgaga acgccaacaa gatcctgaac 2220

cgccccaagc gctacaacag cggcaagctg gaggagttcg tgcagggcaa cctggagcgc 2280

gagtgcatgg aggagaagtg cagcttcgag gaggcccgcg aggtgttcga gaacaccgag 2340

cgcaccaccg agttctggaa gcagtacgtg gacggcgacc agtgcgagag caacccctgc 2400

ctgaacggcg gcagctgcaa ggacgacatc aacagctacg agtgctggtg ccccttcggc 2460

ttcgagggca agaactgcga gctggacgtg acctgcaaca tcaagaacgg ccgctgcgag 2520

cagttctgca agaacagcgc cgacaacaag gtggtgtgca gctgcaccga gggctaccgc 2580

ctggccgaga accagaagag ctgcgagccc gccgtgccct tcccctgcgg ccgcgtgagc 2640

gtgagccaga ccagcaagct gacccgcgcc gaggccgtgt tccccgacgt ggactacgtg 2700

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<223> AAVsc-HS-CRE18-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

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agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

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<213> 人工序列

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<223> AAVsc-HS-CRE19-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

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accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 6240

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caaggccgat agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag 180

tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga 240

ttataaaaac acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg 300

cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa 360

agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 420

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ggagagatcg atctgaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 3720

gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 3780

cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa cccccccccc cccccccccc 3840

ggcgattctc ttgtttgctc cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc 3900

tctcaaaaat agctaccctc tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcata 3960

ttgatggtga tttgactgtc tccggccttt ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt 4020

actcaggcat tgcatttaaa atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa 4080

taaaggcttc tcccgcaaaa gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag 4140

ctttatgctc tgaggcttta ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt 4200

tattggatgt tggaatcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 4260

acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt tatatggtgc 4320

actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 4380

cagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 4440

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 4500

accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt 4560

taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 4620

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 4680

ataaccctga taaatgctca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 4740

cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 4800

acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 4860

ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 4920

atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa 4980

gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc 5040

acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc 5100

atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 5160

accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag 5220

ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca 5280

acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata 5340

gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc 5400

tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 5460

ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca 5520

actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg 5580

taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 5640

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 5700

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 5760

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 5820

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 5880

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 5940

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 6000

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 6060

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 6120

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 6180

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 6240

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 6300

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 6360

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 6420

cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc 6480

cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa 6540

ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatg 6575

<210> 53

<211> 6616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAVsc-HS-CRE21-TTRenh-TTRm-MVM-hFIXcoPadua-bghpolyA

<400> 53

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 60

aatggcgaat ggcgattccg ttgcaatggc tggcggtaat attgttctgg atattaccag 120

caaggccgat agtttgagtt cttctactca ggcaagtgat gttattacta atcaaagaag 180

tattgcgaca acggttaatt tgcgtgatgg acagactctt ttactcggtg gcctcactga 240

ttataaaaac acttctcagg attctggcgt accgttcctg tctaaaatcc ctttaatcgg 300

cctcctgttt agctcccgct ctgattctaa cgaggaaagc acgttatacg tgctcgtcaa 360

agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 420

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 480

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 540

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 600

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 660

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 720

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 780

aacaaaaatt taacgcgaac tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt 840

atacaatctt cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca 900

tgctagtttt acgattaccg ttcatcgccc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc 960

gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc 1020

gcagagaggg agtggaattc acgcgtggat ctgaattctg tacaggcgtg gtacggccgc 1080

ggggaggttg cagtaagcca agattgtgcc actgcactcc aacctgggtg acagagccag 1140

actctgtctc aagaaaataa agagaaaaag aactagattc aggctgtatg tgggcaccat 1200

ctacagacat cagacacaca catttaggag taataatgat gcaatattgc caaatgtttc 1260

tcagcaacca tgtgcaactg ttgcatgtac tgtttatttc taactcagga ggatctctct 1320

aaccacacat tgcaagaaaa tagactttca gtgtttctgg caaaacaaag agtttttttg 1380

ttggcattta tgctgaaagg gaagagttaa aatgttaatt tgtctttttt cttacctcca 1440

agttcactca aatcctctct tgaagcaggg tacccactgg gaggatgttg agtaagatgg 1500

aaaactactg atgacccttg cagagacaga gtattaggac atgtttgaac aggggccggg 1560

cgatcagcag gtagctctag aggatccccg tctgtctgca catttcgtag agcgagtgtt 1620

ccgatactct aatctcccta ggcaaggttc atatttgtgt aggttactta ttctcctttt 1680

gttgactaag tcaataatca gaatcagcag gtttggagtc agcttggcag ggatcagcag 1740

cctgggttgg aaggaggggg tataaaagcc ccttcaccag gagaagccgt cacacagatc 1800

cacaagctcc tggctagaaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta 1860

atgtttaatt acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg gctagcccac 1920

catgcagcgc gtgaacatga tcatggccga gagccccggc ctgatcacca tctgcctgct 1980

gggctacctg ctgagcgccg agtgcaccgt gttcctggac cacgagaacg ccaacaagat 2040

cctgaaccgc cccaagcgct acaacagcgg caagctggag gagttcgtgc agggcaacct 2100

ggagcgcgag tgcatggagg agaagtgcag cttcgaggag gcccgcgagg tgttcgagaa 2160

caccgagcgc accaccgagt tctggaagca gtacgtggac ggcgaccagt gcgagagcaa 2220

cccctgcctg aacggcggca gctgcaagga cgacatcaac agctacgagt gctggtgccc 2280

cttcggcttc gagggcaaga actgcgagct ggacgtgacc tgcaacatca agaacggccg 2340

ctgcgagcag ttctgcaaga acagcgccga caacaaggtg gtgtgcagct gcaccgaggg 2400

ctaccgcctg gccgagaacc agaagagctg cgagcccgcc gtgcccttcc cctgcggccg 2460

cgtgagcgtg agccagacca gcaagctgac ccgcgccgag gccgtgttcc ccgacgtgga 2520

ctacgtgaac agcaccgagg ccgagaccat cctggacaac atcacccaga gcacccagag 2580

cttcaacgac ttcacccgcg tggtgggcgg cgaggacgcc aagcccggcc agttcccctg 2640

gcaggtggtg ctgaacggca aggtggacgc cttctgcggc ggcagcatcg tgaacgagaa 2700

gtggatcgtg accgccgccc actgcgtgga gaccggcgtg aagatcaccg tggtggccgg 2760

cgagcacaac atcgaggaga ccgagcacac cgagcagaag cgcaacgtga tccgcatcat 2820

cccccaccac aactacaacg ccgccatcaa caagtacaac cacgacatcg ccctgctgga 2880

gctggacgag cccctggtgc tgaacagcta cgtgaccccc atctgcatcg ccgacaagga 2940

gtacaccaac atcttcctga agttcggcag cggctacgtg agcggctggg gccgcgtgtt 3000

ccacaagggc cgcagcgccc tggtgctgca gtacctgcgc gtgcccctgg tggaccgcgc 3060

cacctgcctg ctgagcacca agttcaccat ctacaacaac atgttctgcg ccggcttcca 3120

cgagggcggc cgcgacagct gccagggcga cagcggcggc ccccacgtga ccgaggtgga 3180

gggcaccagc ttcctgaccg gcatcatcag ctggggcgag gagtgcgcca tgaagggcaa 3240

gtacggcatc tacaccaagg tgagccgcta cgtgaactgg atcaaggaga agaccaagct 3300

gacctaatga aagatggatt tccaaggtta attcattgga attgaaaatt aacagccccc 3360

cccccccccc ccctgcagat ctgagccgaa ttcctgcagc ccgggggatc agcctcgact 3420

gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 3480

gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 3540

agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 3600

gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga 3660

accagctggg gaccggtgga tctcgatagc aggcatgctg gggagagatc gatctgagga 3720

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 3780

ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 3840

gcgcagagag ggagtggcca accccccccc cccccccccc cggcgattct cttgtttgct 3900

ccagactctc aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct 3960

ctccggcatg aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt 4020

ctccggcctt tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa 4080

aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa 4140

agtattacag ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt 4200

attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg cctgtatgat ttattggatg ttggaatcgc 4260

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 4320

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttatatggtg cactctcagt acaatctgct 4380

ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acagccagcc ccgacacccg 4440

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 4500

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 4560

gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 4620

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 4680

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctc 4740

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 4800

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 4860

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 4920

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 4980

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 5040

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 5100

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 5160

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 5220

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 5280

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 5340

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 5400

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 5460

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 5520

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 5580

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 5640

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 5700

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 5760

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 5820

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 5880

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 5940

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 6000

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 6060

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 6120

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 6180

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 6240

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 6300

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 6360

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 6420

tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 6480

gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 6540

agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 6600

ggccgattca ttaatg 6616

<210> 54

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 54

Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Thr Arg His Gln Arg

1 5 10

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

cacgagaacg ccaacaagat 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

cacttctcct ccatgcactc 20

<210> 57

<211> 771

<212> DNA

<213> 智人

<400> 57

caggctcaga ggcacacagg agtttctggg ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt 60

cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc 120

ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct 180

ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac 240

ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg 300

tggtttaggt agtgtgagag ggtccgggtt caaaaccact tgctgggtgg ggagtcgtca 360

gtaagtggct atgccccgac cccgaagcct gtttccccat ctgtacaatg gaaatgataa 420

agacgcccat ctgatagggt ttttgtggca aataaacatt tggttttttt gttttgtttt 480

gttttgtttt ttgagatgga ggtttgctct gtcgcccagg ctggagtgca gtgacacaat 540

ctcatctcac cacaaccttc ccctgcctca gcctcccaag tagctgggat tacaagcatg 600

tgccaccaca cctggctaat tttctatttt tagtagagac gggtttctcc atgttggtca 660

gcctcagcct cccaagtaac tgggattaca ggcctgtgcc accacacccg gctaattttt 720

tctatttttg acagggacgg ggtttcacca tgttggtcag gctcctctag a 771

<210> 58

<211> 328

<212> DNA

<213> 智人

<400> 58

caggctcaga ggcacacagg agtttctggg ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt 60

cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc 120

ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct 180

ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac 240

ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg 300

tggtttaggt agtgtgagag ggtccggg 328

Claims

1.一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段；其中所述核酸调节元件包括至少SP1以及EP300的转录因子结合位点(TFBS)。

2.根据权利要求1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4以及SEQ ID NO:12组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段，其中所述核酸调节元件还包括HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS、HDAC2的TFBS、JUND的TFBS、FOSL2的TFBS、ZBTB7A的TFBS、CEBPD的TFBS以及RXRA的TFBS。

3.根据权利要求1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:13组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段，其中所述核酸调节元件还包括POLR2A的TFBS、MYBL2的TFBS、FOXA1的TFBS、FOXA2的TFBS、ARID3A的TFBS、POLR2A的TFBS以及HEY1的TFBS。

4.根据权利要求1所述的核酸调节元件，包括选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16以及SEQ ID NO:20组成的组的序列、与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列、或其功能片段，其中所述核酸调节元件还包括HNF 4G的TFBS、CEBPB的TFBS、P300的TFBS以及HNF 4A的TFBS。

5.一种用于增强肝特异性基因表达的核酸调节元件，其在严格条件下与根据权利要求1至4中任一项所述的核酸调节元件或其互补物杂交。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸调节元件，具有600个核苷酸、优选500个核苷酸、更优选400个核苷酸、甚至更优选300个核苷酸的最大长度。

7.一种核酸表达盒，包括至少一个根据权利要求1至6中任一项所述的核酸调节元件，所述至少一个核酸调节元件可操作地连接至启动子以及转基因。

8.根据权利要求7所述的核酸表达盒，还包括至少一个、优选三个不同于根据权利要求1至4中任一项所述的核酸调节元件的肝特异性调节元件，优选地其中所述至少一个、优选三个肝特异性调节元件包括SEQ ID NO:22或与所述序列具有至少95％同一性的序列。

9.根据权利要求8所述的核酸表达盒，包括：核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:6、SEQID NO:4、SEQ ID NO:12或与所述序列中的任一者具有至少95％同一性的序列；以及至少一个、优选三个核酸调节元件，其包括SEQ ID NO:22或与所述序列具有至少95％同一性的序列。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的核酸表达盒，其中所述转基因编码治疗性蛋白质或免疫原性蛋白质，优选地其中所述转基因编码

—凝血因子IX(FIX)，优选地其中所述转基因是密码子优化凝血因子FIX，或其中所述凝血因子FIX包含超激活突变，优选地其中所述超激活突变对应于R338L氨基酸取代，更优选地其中编码凝血因子FIX的所述转基因具有如SEQ ID NO:25所定义的核酸序列；或

—凝血因子VIII(FVIII)，优选地其中所述转基因是密码子优化凝血因子FVIII，或其中所述凝血因子VIII具有B结构域的缺失，优选地其中所述FVIII的所述B结构域由SEQ IDNO:54所定义的接头替换，更优选地其中编码凝血因子VIII的所述转基因具有SEQ ID NO:26所定义的核酸序列。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的核酸表达盒，其中所述启动子为肝特异性启动子、优选为衍生自甲状腺素运载蛋白(TTR)启动子的启动子、更优选为SEQ ID NO:27所定义的甲状腺素运载蛋白基因的最小启动子(TTRmin)。

12.根据权利要求11所述的核酸表达盒，还包括肝特异性调节元件，其包括SEQ ID NO:24，由此包括如SEQ ID NO:28所定义的TTRe以及TTRm核酸的组合。

13.根据权利要求7至12中任一项所述的核酸表达盒，还包括小鼠微小病毒(MVM)内含子，优选SEQ ID NO:29所定义的MVM内含子。

14.根据权利要求7至13中任一项所述的核酸表达盒，还包括转录终止信号，其衍生自牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpA)、优选SEQ ID NO:30所定义的BGHpA。

15.一种载体，包括根据权利要求1至6中任一项所述的核酸调节元件或根据权利要求7至14中任一项所述的核酸表达盒，所述载体优选为病毒载体，更优选为衍生自腺相关病毒(AAV)的载体，甚至更优选为自互补AAV载体。

16.根据权利要求15所述的载体，具有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:44，优选SEQ ID NO:38。

17.一种药物组合物，包括根据权利要求7至14中任一项所述的核酸表达盒或根据权利要求15或16所述的载体、以及药学上可接受的载体。

18.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸调节元件、根据权利要求7至14中任一项所述的核酸表达盒、根据权利要求15或16所述的载体或根据权利要求17所述的药物组合物，其用于基因疗法、优选肝导向基因疗法，或用于接种疗法、优选预防接种。

19.根据权利要求18所述的使用的核酸调节元件、核酸表达盒、载体或药物组合物，其中所述基因疗法用于治疗血友病A或血友病B。

20.一种用于在肝细胞中表达转基因产物的体外或离体方法，包括：

—将根据权利要求7至14中任一项所述的核酸表达盒或根据权利要求15或16所述的载体引入所述肝细胞中；

—在所述肝细胞中表达所述转基因产物。