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CN112739359A - Apmv及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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CN112739359A
CN112739359A CN201980060371.XA CN201980060371A CN112739359A CN 112739359 A CN112739359 A CN 112739359A CN 201980060371 A CN201980060371 A CN 201980060371A CN 112739359 A CN112739359 A CN 112739359A
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cancer
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阿道夫·加西亚-塞斯特
彼得·帕雷斯
萨拉·夸德拉多卡斯塔尼奥
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Icahn School of Medicine at Mount Sinai
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Abstract

在一个方面，本文提供了天然存在的和重组产生的禽副粘病毒(APMV)(例如，APMV‑2、APMV‑3、APMV‑4、APMV‑6、APMV‑7、APMV‑8和APMV‑9株)和这些APMV用于癌症治疗的用途。具体地，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用天然存在的或重组产生的APMV‑4株。在另一个方面，本文提供了包含包装的基因组的重组APMV，其中所述包装的基因组包含转基因。具体地，本文描述了重组APMV(例如，APMV‑2、APMV‑3、APMV‑4、APMV‑6、APMV‑7、APMV‑8和APMV‑9)。在另一个方面，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用重组APMV(例如，APMV‑2、APMV‑3、APMV‑4、APMV‑6、APMV‑7、APMV‑8和APMV‑9)，其中所述重组APMV包含包装的基因组，所述包装的基因组包含转基因。具体地，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用重组APMV‑4，其中所述重组APMV‑4包含包装的基因组，所述包装的基因组包含转基因。在具体的方面，当与溶瘤NDV La Sota‑L289A株相比时，除APMV‑1以外的APMV血清型(如本文所述的，具体地，AMPV‑4)治疗癌症的使用部分基于类似或提高的体内抗‑肿瘤活性。

Description

APMV及其用于治疗癌症的用途
本发明申请主张2018年7月13日提交的美国临时专利申请No.62/697,944的优先权益，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
本发明申请包含以ASCII格式，以电子形式提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2019年7月9日所创建的所述ASCII拷贝的名称为6923-282-888_SL.txt并且大小为322,198字节。
1.简介
在一个方面，本文提供了天然存在的和重组产生的禽副粘病毒(APMV)(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)和这些APMV用于癌症治疗的使用。具体地，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用天然存在的或重组产生的APMV-4株。在另一个方面，本文提供了包含包装的基因组的重组APMV，其中所述包装的基因组包含转基因。具体地，本文描述了重组APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9)。在另一个方面，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用重组APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9)，其中所述重组APMV包含包装的基因组，所述包装的基因组包含转基因。具体地，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用重组APMV-4，其中所述重组APMV-4包含包装的基因组，所述包装的基因组包含转基因。在具体的方面，当与溶瘤NDV LaSota-L289A株相比时，除APMV-1以外的APMV血清型(如本文所述的，具体地，AMPV-4)治疗癌症的使用部分基于类似或提高的体内抗-肿瘤活性。
2.背景技术
副粘病毒科(Paramyxoviridae)包括人(腮腺炎病毒、麻疹病毒、人副流感病毒)和动物(仙台病毒、犬瘟热病毒、新城疫病毒)的重要呼吸性和全身性病原体，包括几种人畜共患病毒(亨得拉病毒和尼帕病毒)。副粘病毒是包膜多形性病毒，其含有编码6-10个病毒基因并且在宿主细胞的细胞质中复制的非节段、负义单链RNA基因组。除了禽偏肺病毒这一唯一例外以外，分离自禽类物种的所有副粘病毒被划分到禽副粘病毒属(Avulavirus)(1)。在14900-17000个核苷酸的尺寸范围内，所有禽副粘病毒属的基因组均编码6个参与病毒复制循环的结构性蛋白质：与病毒RNA结合，核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)是核糖核苷酸蛋白质复合物(RNP)的组分。RNP发挥作为核衣壳蛋白(i)和病毒复制机器(ii)的双重作用。在病毒组装和出芽过程期间，基质蛋白(M)在病毒包膜和核衣壳蛋白之间组装并主动参与(2)。血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)和融合(F)糖蛋白，结合宿主-来源的脂质双分子层构成了病毒的外部包膜。
基于血细胞凝集抑制(HI)和神经氨酸酶抑制作用(NI)测定，将禽副粘病毒属(Avulavirus)进一步划分为不同的血清型(3，4)。最近对该组的分类学修正识别了禽副粘病毒属的13种血清型(表1)，其被表示为APMV(来自禽副粘病毒)。
表1：包括在禽副粘病毒属(Avulavirus)基因内的接受的血清型的综述
Figure BDA0002976913420000021
已从广泛的家养禽类和野生禽类分离了APMV。感染的临床病征根据株-特异性和宿主-依赖性从无症状至高发病率和死亡率各不相同(5)。由于致病株在养禽业中所造成的高死亡率和经济损失，禽副粘病毒属1(APMV-1)，通常被称为新城疫病毒(NDV)，是唯一被明确鉴定的血清型(6，7)。不考虑高致病株的破坏性影响，可以通过活减毒疫苗和/或灭活病毒疫苗的预防性施用来控制新城疫(8，9)。根据感染的鸡所显示出的临床病征的严重程度，已将APMV-1株划分成3种不同的致病型：强毒性(高毒力)、中毒性(中等毒力)和弱毒性(低毒力或无毒力)(10)。尽管APMV-1病毒是流行的并在全世界分布，其对人无威胁。偶发的人感染仅限于与病禽的直接接触并且以轻微流感-样症状和结膜炎消除。哺乳动物中报道的APMV-1感染已表明这些禽病毒既不能建立持续感染，也不能抵抗哺乳动物细胞中的抗病毒天然应答(12-14)。此外，不同的NDV株已显示在局部和全身水平起到了体液和细胞免疫应答的强刺激剂的作用(15-19)。已发展了反向遗传学系统，其使得能够遗传操纵NDV基因组(20-22)。基于APMV-1株在哺乳动物中所显示出的安全性和免疫刺激性，几种重组NDV疫苗株已在禽类和哺乳动物中用作疫苗载体以表达不同病原体的抗原(22-28)。
在过去30年，对于使用AMPV-1作为抗肿瘤剂的兴趣逐渐提高(29)。APMV-1株的固有抗-肿瘤能力结合限定溶瘤病毒(OV)的两种性质：诱导特异性肿瘤细胞死亡(30)以及引起抗肿瘤免疫性和长期肿瘤症状缓解(31-34)。从60年代有关NDV的抗-肿瘤潜力的首次报道(35，36)至今，已通过不同途径(肿瘤内、局部或全身)直接将不同的APMV-1株在动物模型和/或癌症患者中用作抗-癌疗法(37-39)或者用作病毒肿瘤裂解物(40，41)、活细胞肿瘤疫苗(NDV-ATV)(34，42-46)或者通过病毒肿瘤裂解物引起的DC疫苗来治疗肿瘤。尽管已在临床研究中检验了AMPV-1的抗-癌症效果，但是其尚未被批准用于治疗任何人癌症。
现今，多个研究小组开展研究以开发可以克服肿瘤-相关的耐受性机制的更有效的AMPV-1-基抗-肿瘤策略(50-59)。例如，近期研究已显示AMPV-1最终在肿瘤细胞和肿瘤-浸润的免疫细胞中引起PD-L1表达上调(Zamarin等人,2018,J.Clin.Invest.128:1413-1428)，从而提供了对免疫调节抗体组合的临床研究的坚实原理。
与对于APMV-1株已知的相反，有关其它禽副粘病毒属血清型的生物学的信息有限。尽管已测试了NDV的抗-肿瘤潜力，但是尚无NDV-基抗-肿瘤治疗被批准用于癌症治疗。因此，存在对用于癌症治疗的疗法的需求。
3.发明内容
在一个方面，本文提供了天然存在的和重组产生的禽副粘病毒(APMV)(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)和这些APMV用于癌症治疗的使用。在具体的实施方式中，将APMV(例如，APMV-4)瘤内或静脉内施用于人对象。在另一个具体的实施方式中，以106至1012空斑形成单位(pfu)的剂量施用APMV(例如，APMV-4)。
当与溶瘤NDV La Sota-L289A株相比时，除APMV-1以外的APMV血清型治疗癌症的使用部分基于类似或提高的体内抗-肿瘤活性。具体地，APMV-4治疗癌症的使用将部分基于在多种肿瘤的不同动物模型中所观察到的统计学显著的抗-肿瘤活性。参见下文第6节。
在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)，其中所述APMV在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在另一个具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用重组APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)，其中所述重组APMV在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，将APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)瘤内或静脉内施用于人对象。在另一个具体的实施方式中，以106至1012pfu的剂量施用所述APMV。在一些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用检查点抑制剂。在某些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用特异性结合至PD-1并且阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合的单克隆抗体。
在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的APMV-4，其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在另一个具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用重组APMV-4，其中所述重组APMV-4在原鸡(Gallusgallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，将APMV-4瘤内或静脉内施用于人对象。在另一个具体的实施方式中，以106至1012pfu的剂量施用所述APMV-4。在一些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用检查点抑制剂。在某些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用特异性结合至PD-1并且阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合的单克隆抗体。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，当施用于B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型时降低B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型的肿瘤生长并提高其存活的APMV-4。在一些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，当施用于B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型时导致B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型更大的肿瘤生长降低和更长的存活期的APMV-4，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在某些实施方式的，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用PBS的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型的肿瘤生长和存活相比，当施用于BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型时降低BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型的肿瘤生长并提高其存活的APMV-4。在一些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，当施用于BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型时导致BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型更大的肿瘤生长降低和更长的存活期的APMV-4，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在某些实施方式的，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型的肿瘤生长和存活相比，当施用于C57BL/6同基因肺癌肿瘤模型时降低C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型的肿瘤生长并提高其存活的APMV-4。在一些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-4是与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，当施用于C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型时导致C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型更大的肿瘤生长降低和更长的存活期的APMV-4，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDVLaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的APMV-8，其中所述APMV-8在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用重组APMV-8，其中所述重组APMV-8在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，所述APMV-8是APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)。在某些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-8是与施用PBS的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高其存活的APMV-8。在一些实施方式中，根据本文所述的方法向对象施用的APMV-8是与施用基因修饰的NDV的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期的APMV-8，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDVLaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在另一个方面，本文提供了重组APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)，其包含包装的基因组，所述包装的基因组包含编码异源序列的转基因。在具体的实施方式中，本文提供了重组APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)，其包含包装的基因组，所述包装的基因组包含编码细胞因子、白介素-15(IL-15)受体alpha(IL-15Ra)-IL-15、人乳头状瘤病毒(HPV)-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的转基因。在某些实施方式中，所述APMV(例如，APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8和APMV-9株)在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中具有小于0.7的脑内接种致病指数。在具体的实施方式中，本文所述的重组APMV包含APMV-7或APMV-8主链。在另一个具体的实施方式中，本文所述的重组APMV包含APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)主链。在另一个具体的实施方式中，本文所述的重组APMV包含APMV-7鸽/田纳西州/4/1975(Dove/Tennessee/4/1975)主链。在另一个具体的实施方式中，所述重组APMV包含APMV-4主链。在具体的实施方式中，本文所述的重组APMV包括APMV-4鸭/香港/D3/1975株(Duck/Hong Kong/D3/1975strain)主链，APMV-4鸭/中国/G302/2012株(Duck/China/G302/2012strain)主链，APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)主链；APMV4海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4Uriah-aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)主链，APMV4/埃及鹅/南非/NJ468/2010株(APMV4/Egyptian goose/south Africa/NJ468/2010strain)主链或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010strain)主链。在具体的实施方式中，所述转基因插入在APMV包装基因组的两个转录单元(例如，APMV M和P转录单元)之间。在一个实施方式中，所述细胞因子是白介素-12(IL-12)。在具体的实施方式中，所述IL-12由包含SEQ ID NO：16或17所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在另一个实施方式中，所述细胞因子是白介素-2(IL-2)。在具体的实施方式中，通过包含SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码IL-2。在另一个实施方式中，所述细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在具体的实施方式中，通过包含SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码GM-CSF。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，本文提供了包含含有编码细胞因子、IL-15Ra-IL-15、HPV-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的转基因的包装的基因组的重组APMV-4，并且其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，所述转基因插入在APMV-4包装基因组的两个转录单元(例如，APMV-4M和P转录单元)之间。在一个实施方式中，所述细胞因子是IL-12。在具体的实施方式中，通过包含SEQ IDNO：16或17所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码IL-12。在另一个实施方式中，所述细胞因子是IL-2。在具体的实施方式中，通过包含SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码IL-2。在另一个实施方式中，所述细胞因子是GM-CSF。在具体的实施方式中，通过包含SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码GM-CSF。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。在另一个实施方式中，所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了重组APMV-4，其包含包装的基因组，所述包装的基因组包含编码IL-12的转基因。在具体的实施方式中，APMV-4在原鸡(Gallusgallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在另一个具体的实施方式中，APMV-4的包装的基因组包含从SEQ ID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，本文所述的重组APMV-4包含APMV-4鸭/香港/D3/1975株(Duck/Hong Kong/D3/1975strain)主链。在另一个实施方式中，本文所述的重组APMV-4包含APMV-4鸭/中国/G302/2012株(Duck/China/G302/2012strain)主链，APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)主链；APMV4海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4Uriah-aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)主链，APMV4/埃及鹅/南非/NJ468/2010株(APMV4/Egyptian goose/south Africa/NJ468/2010strain)主链或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010 strain)主链。
在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用本文所述的重组APMV。在某些实施方式中，将本文所述的重组APMV瘤内或静脉内施用于人对象。在一些实施方式中，以106至1012pfu的剂量施用本文所述的重组APMV。在具体的实施方式中，本文所述的重组APMV包含APMV-4或APMV-8主链。在一些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用检查点抑制剂。在某些实施方式中，治疗癌症的方法还包括向对象施用特异性结合至PD-1并且阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合的单克隆抗体。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是黑素瘤、肺癌、结肠癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或乳腺癌。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是转移性的。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是不可切除的。
3.1术语
如本文所使用的，当结合数值使用时，术语“约”或“大约”是指所提及的数值的1、5或10％以内的任何数值。
如本文所使用的，术语“抗体”是指含有抗原结合位点的分子，例如，免疫球蛋白。抗体包括(但不限于)单克隆抗体、双重特异性抗体、多重特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单域抗体、骆驼化抗体、单-链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫化物-连接的双重特异性Fv(sdFv)、胞内抗体和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括(例如)抗-Id和抗抗体的抗-抗-Id抗体)和任何上述抗体的表位-结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。在具体的实施方式中，抗体是人或人源化抗体。在另一个具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体或scFv。在某些实施方式中，抗体是人或人源化单克隆抗体或scFv。在其它具体的实施方式中，所述抗体是双重特异性抗体。
在蛋白或多肽的背景中，如本文所使用的，术语“衍生物”包括：(a)与天然多肽至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％、80％至90％、80％至95％、90％至95％、85％至99％或者95％至99％同一的多肽；(b)通过与编码天然多肽的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％、80％至90％、80％至95％、90％至95％、85％至99％或者95％至99％同一的核酸序列所编码的多肽；(c)相对于天然多肽，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或以上或者2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失或替换中的任何一种或多种或全部)的多肽；(d)可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然多肽的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽；(e)可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸的天然多肽片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽；或者(f)天然多肽片段。衍生物还包括包含哺乳动物多肽的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在一个实施方式中，衍生物是被分离的。在具体的实施方式中，衍生物保留了它所来源的天然多肽的一种或多种功能。
如本文所使用的，术语“老人”是指65岁或以上的人。
在核苷酸序列的背景中，如本文所使用的，术语“片段”是指包含所关心的基因的核苷酸序列的至少5个邻接核酸碱基，至少10个邻接核酸碱基，至少15个邻接核酸碱基，至少20个邻接核酸碱基，至少25个邻接核酸碱基，至少40个邻接核酸碱基，至少50个邻接核酸碱基，至少60个邻接核酸碱基，至少70个邻接核酸碱基，至少80个邻接核酸碱基，至少90个邻接核酸碱基，至少100个邻接核酸碱基，至少125个邻接核酸碱基，至少150个邻接核酸碱基，至少175个邻接核酸碱基，至少200个邻接核酸碱基或至少250个邻接核酸碱基的核酸序列的核苷酸序列。所述核酸可以是RNA、DNA或其化学修饰变体。
在蛋白试剂(例如，蛋白或多肽)片段的背景中，如本文所使用的，术语“片段”是指由蛋白试剂的8个或更多个邻接氨基酸，10个或更多个邻接氨基酸，15个或更多个邻接氨基酸，20个或更多个邻接氨基酸，25个或更多个邻接氨基酸，50个或更多个邻接氨基酸，75个或更多个邻接氨基酸，100个或更多个邻接氨基酸，150个或更多个邻接氨基酸，200个或更多个邻接氨基酸，10至150个邻接氨基酸，10至200个邻接氨基酸，10至250个邻接氨基酸，10至300个邻接氨基酸，50至100个邻接氨基酸，50至150个邻接氨基酸，50至200个邻接氨基酸，50至250个邻接氨基酸或者50至300个邻接氨基酸所组成的片段。
如本文所使用的，术语“异源的”是在自然界中不与天然存在的APMV关联(例如，通过其编码，通过其基因组表达或两者)的实体。在具体的实施方式中，异源序列编码在自然界中未被发现与APMV关联的蛋白。
如本文所使用的，术语“成人”是指18岁或以上的人。
如本文所使用的，术语“儿童”是指1年至18岁的人。
如本文所使用的，术语“婴儿”是指新生儿至1-岁的人。
如本文所使用的，术语“学步幼儿”是指1岁至3岁的人。
在向对象施用疗法的背景中，如本文所使用的，术语“组合”是指不止一种疗法的使用。术语“组合”的使用不限制其中向对象施用疗法的顺序。可以在向对象施用第二疗法之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一疗法。例如，可以在另一种疗法施用之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)，同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用本文所述的重组APMV。
如本文所使用的，短语“干扰素-缺陷系统”、“干扰素-缺陷基底”、“IFN-缺陷系统”或者“IFN-缺陷基底”是指不产生一种、两种或更多种类型的IFN或者不产生任何类型的IFN或者产生低水平的一种、两种或更多种类型的IFN或者产生低水平的任何IFN(即当与相同条件下的IFN-活性系统相比时，任何IFN的表达降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或以上)，对一种、两种或更多种类型的IFN不应答或应答有效性更低，对一种、两种或更多种类型的IFN的应答延迟和/或通过一种、两种或更多种类型的IFN诱导的或者通过任何类型的IFN诱导的抗病毒基因的活性不足的系统，例如，细胞、细胞系和动物，如小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠、马等。
如本文所使用的，短语“感染复数”或“MOI”具有其常规含义。通常，MOI是每个感染细胞的平均病毒数。通过所添加的病毒数(所添加的ml×Pfu)除以所添加的细胞数(所添加的ml×个细胞/mL)确定MOI。
在蛋白或多肽的背景中，如本文所使用的，术语“天然的”是指任何天然存在的氨基酸序列，包括蛋白的未成熟或前体和成熟形式。在具体的实施方式中，天然多肽是人蛋白或多肽。
在APMV的背景中，如本文所使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中存在的，未经人修饰的APMV。换言之，天然存在的APMV不是基因工程的或另外通过人改变的。
如本文所使用的，术语“对象”或“患者”是可互换使用的。如本文所使用的，术语“对象”是指动物。在一些实施方式中，对象是哺乳动物，其包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、马、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。在一些实施方式中，所述对象是非人哺乳动物。在某些实施方式中，所述对象是宠物(例如，狗或猫)或农畜(例如，马、猪或牛)。在具体的实施方式中，对象是人。在某些实施方式中，所述哺乳动物(例如，人)为4至6个月、6至12个月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁。在具体的实施方式中，所述对象是非禽类动物。
如本文所使用的，术语“疗法”可以表示可以用于治疗癌症的任何规程、方法、试剂或其组合。在某些实施方式中，术语“疗法”是指本文所述的APMV。在其它实施方式中，术语“疗法”是指非本文所述的APMV的试剂。
4.附图说明
图1A-1B。APMV在B16-F10鼠科黑素瘤癌细胞系中的感染性和细胞毒性。图1A显示了通过APMV感染的B16-F10鼠科黑素瘤细胞的显微镜图像。以1FFU/细胞的MOI感染细胞，感染后固定20小时，用多克隆抗-APMV种特异性血清(红色)、多克隆抗-NDV血清(绿色)和用于核对比的Hoechst染色。图1B显示了体外细胞毒性。以1FFU/个细胞的MOI感染B16-F10细胞，并在感染后24小时，通过CellTiter-FluorTM活力测定确定它们的存活力。柱代表平均值±标准偏差(SD)(n＝3；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001)。
图2A-2C。APMV在同基因鼠科黑素瘤肿瘤模型中的溶瘤能力。图2A显示了各个肿瘤的生长曲线。每个点代表指定时间点的每只小鼠的肿瘤体积。图2B显示了肿瘤生长速率分析。点代表指定时间点的每个实验组的肿瘤体积的平均值。误差线对应于每个组的SD。图2C显示了所治疗的具有-B16-F10肿瘤的小鼠的整体存活期(*，P<0.03)。
图3A-3D。APMV在同基因鼠科结肠癌模型中的溶瘤能力。图3A显示了各个肿瘤的生长曲线。每个点代表指定时间点的每只小鼠的肿瘤体积。图3B显示了肿瘤生长速率分析。每个点代表指定时间点的每个处理组的肿瘤体积。图3C显示了所治疗的具有CT26肿瘤的小鼠的整体存活期。图3D显示了所治疗的具有CT26肿瘤的小鼠的整体存活期，其中通过在左后腿侧面(对侧)皮内注射CT26细胞来再激发无肿瘤存活者。
图4A-4C。APMV-4在同基因鼠科肺癌模型中的溶瘤能力。图4A显示了各个肿瘤的生长曲线。每个点代表指定时间点的每只小鼠的肿瘤体积。图4B代表肿瘤生长速率的分析。点代表指定时间点的每个实验组的平均肿瘤体积；右侧：第三次注射后肿瘤生长控制的统计分析。误差线对应于每个组的SD。图4C显示了所治疗的具有TC-1肿瘤的小鼠的整体存活期(**，p<0.03)。
5.详细说明
5.1禽副粘病毒
5.1.1 APMV
可以使用任何APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株，包括(但不限于)可以在本文所述的治疗癌症的方法中使用天然-存在的株、变体或突变体、突变病毒、基因工程病毒或它们的组合。在某些实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是溶胞株。在其它实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是非溶胞株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是天然存在的。在具体的实施方式中，通过本文所述的或本领域技术人员已知的方法，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株在禽类中是无毒力的。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是重组产生的。在某些实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株通过基因工程以减弱所述病毒在鸟类中的病原性的方式减毒。
在另一个具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在某些具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是非病原性的，如通过用所述病毒颅内注射1天-大的小鸡并对8天内的发病和死亡打分所评价的。在一些实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。在一些实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数在0.7至0.1，0.6至0.1，0.5至0.1或者0.4至0.1之间。在某些实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数为0。对于可以用于评价APMV在鸟类中的病原性的测定的描述，参见，例如，以下中的一种或多种参考文献：Hines,N.L.and C.L.Miller,Avian paramyxovirus serotype-1:a reviewof disease distribution,clinical symptoms,and laboratory diagnostics.Vet MedInt,2012.2012:p.708216；Kim S-H,Xiao S,Shive H,Collins PL,Samal SK.,2012:Replication,Neurotropism,and Pathogenicity of Avian Paramyxovirus Serotypes1–9 in Chickens and Ducks.PLoS ONE.；7(4):e34927；Subbiah,M.,Xiao,S.,Khattar,S.K.,Dias,F.M.,Collins,P.L.,&Samal,S.K.,2010:Pathogenesis of two strains ofAvian Paramyxovirus serotype 2,Yucaipa and Bangor,in chickens andturkeys.Avian Diseases,54(3),1050–1057；Kumar S,Militino Dias F,Nayak B,Collins PL,Samal S.K.,2010:Experimental avian paramyxovirus serotype-3infection in chickens and turkeys.Veterinary Research.；41(5):72；RyotaTsunekuni,Hirokazu Hikono,Takehiko Saito.,2014:Evaluation of avianparamyxovirus serotypes 2 to 10 as vaccine vectors in chickens previouslyimmunized against Newcastle disease virus.Veterinary Immunology andImmunopathology；160(3-4):184-191；和www.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。在具体的实施方式中，所述APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株分别是重组APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株。
在另一个具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是天然存在的并且在原鸡(Gallusgallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株分别是重组APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株并且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在另一个具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A(有关L289A突变的描述，参见，例如，Sergel等人(2000)A Single Amino Acid Change in the Newcastle DiseaseVirus Fusion Protein Alters the Requirement for HN Protein in Fusion.Journalof Virology 74(11):5101-5107，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。在另一个具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV株是下文第6节中所述的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9。在一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-2株，其中所述APMV-2株是APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)。有关APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU338414.1或者SEQ ID NO：1。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-3株，其中所述APMV-3株是APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)。有关APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU782025.1或者SEQ ID NO：2。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-6株，其中所述APMV-6株是APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)。有关APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU622637.2或者SEQ ID NO：9。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-7株，其中所述APMV-7株是APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)。有关APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)的完整基因组cDNA，参见，例如，GenBank No.FJ231524.1或者SEQ ID NO：10。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-8株，其中所述APMV-8株是APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)。有关APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.FJ619036.1或者SEQID NO：11。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-9，其中所述APMV-9株是APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)。有关APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.NC_025390.1或者SEQ ID NO：12。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-4株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-4株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-4株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/Hong Kong/D3/1975strain)。有关APMV-4/鸭/香港/D3/75(APMV-4/duck/Hong Kong/D3/75)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.FJ177514.1或者SEQ ID NO：4。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012 strain)、APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)、APMV4/海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 strain)、APMV-4/埃及鹅/南非/N1468/2010株(APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010strain)或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010strain)。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是基因组与APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/Hong Kong/D3/1975strain)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-4。
在一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012strain)。有关APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012 strain)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.KC439346.1或者SEQ ID NO：7。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV-4/海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV-4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 strain)。有关APMV-4/海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV-4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 strain)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.KU601399.1或者SEQ ID NO：5。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010 strain)。有关APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010 strain)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.JX987283.1或者SEQ ID NO：8。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07 strain)。有关APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07 strain)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.JN571485或者SEQ IDNO：3。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4是APMV-4/埃及鹅/南非/N1468/2010株(APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 strain)。有关APMV-4/埃及鹅/南非/N1468/2010株(APMV-4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010 strain)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.JX133079.1或者SEQ IDNO：6。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在另一个具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-4在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-8株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-8株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-8株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-8是APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)。有关APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.FJ619036.1或者SEQ ID NO：11。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-8是基因组与APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-8。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-7株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-7株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-7株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-7是APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)。有关APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)的完整基因组cDNA，参见，例如，GenBank No.FJ231524.1或者SEQ ID NO：10。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-7是基因组与APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-7。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-2株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-2株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-2株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2是APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)。有关APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBankNo.EU338414.1或者SEQ ID NO：1。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-2是基因组与APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-2。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-3株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-3株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-3株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-3是APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)。有关APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU782025.1或者SEQ ID NO：2。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-3是基因组与APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-3。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-6株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-6株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-6株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-6是APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)。有关APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU622637.2或者SEQ ID NO：9。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-6是基因组与APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-6。
在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了APMV-9株。在另一个实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的APMV-9株。在优选的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用了天然存在的且在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-9株。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-9是APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/NewYork/22/1978)。有关APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.NC_025390.1或者SEQ ID NO：12。在具体的实施方式中，在本文所述的治疗癌症的方法中使用的APMV-9是基因组与APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)的基因组具有80％、85％、90％、95％或更高百分比同一性的APMV-9。
5.1.2重组APMV
在一个方面，本文提供了重组APMV，其包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含转基因。有关可以引入本文所述的APMV基因组的转基因的实例，参见，例如，5.1.2.2节和7节。有关其基因组可以引入转基因的APMV的实例，参见，例如，5.1.2.1节和6节。在具体的实施方式中，引入了转基因的APMV的基因组是APMV-4(例如，本文所述的APMV-4株)、APMV-7株(例如，本文所述的APMV-7株)或者APMV-8株(例如，本文所述的APMV-8株)的基因组。在另一个实施方式中，其中引入了转基因的APMV的基因组是APMV-6(例如，本文所述的APMV-6株)或者APMV-9株(例如，本文所述的APMV-9株)的基因组。在具体的实施方式中，本文提供了重组APMV-4，其包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含转基因。在优选的实施方式中，本文提供了包含包装的基因组的重组APMV-4，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA(由其组成)。在具体的实施方式中，通过重组APMV感染的细胞表达由所述转基因编码的蛋白。
在某些实施方式中，重组APMV的基因组不包括编码由所述转基因所编码的蛋白以外的异源蛋白质的异源序列。在某些实施方式中，本文所述的重组APMV包含包装的基因组，其中所述基因组包含APMV和转基因中存在的基因(或由其组成)。在某些实施方式中，本文所述的重组APMV包含包装的基因组，其中所述基因组包含APMV中存在的转录单元(例如，APMV核蛋白壳、蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血球凝集素-神经氨糖酸苷酶蛋白和大聚合酶蛋白的转录单元)和转基因(例如，5.1.2.2节中)(或由其组成)，但是不包括另一种其它转基因。
5.1.2.1重组APMV的主链
任何APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株可以用作工程化“主链”以编码本文所述的转基因，其包括(但不限于)天然-存在的株、变体或突变体、突变病毒或者基因工程病毒或它们的任意组合。在某些实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是溶胞株。在其它实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是非溶胞株。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入至通过本文所述的或本领域技术人员已知的方法在鸟类中无毒力的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的基因组中。在某些实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株通过基因工程的以减弱所述病毒在鸟类中的病原性的方式减毒。
在另一个具体的实施方式中，将转基因引入在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的基因组。在某些具体的实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株是非病原性的，如通过用所述病毒颅内注射1天-大的小鸡并对8天内的发病和死亡打分所评价的。在一些实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。在一些实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数在0.7至0.1，0.6至0.1，0.5至0.1或者0.4至0.1之间。在某些实施方式中，工程化以编码本文所述的转基因的APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9株的颅内接种致病指数为0。对于可以用于评价APMV在鸟类中的病原性的测定的描述，参见，例如，以下中的一种或多种参考文献：Hines,N.L.andC.L.Miller,Avian paramyxovirus serotype-1:a review of disease distribution,clinical symptoms,and laboratory diagnostics.Vet Med Int,2012.2012:p.708216；Kim S-H,Xiao S,Shive H,Collins PL,Samal SK.,2012:Replication,Neurotropism,andPathogenicity of Avian Paramyxovirus Serotypes 1–9in Chickens and Ducks.PLoSONE.；7(4):e34927；Subbiah,M.,Xiao,S.,Khattar,S.K.,Dias,F.M.,Collins,P.L.,&Samal,S.K.,2010:Pathogenesis of two strains of Avian Paramyxovirus serotype2,Yucaipa and Bangor,in chickens and turkeys.Avian Diseases,54(3),1050–1057；Kumar S,Militino Dias F,Nayak B,Collins PL,Samal S.K.,2010:Experimental avianparamyxovirus serotype-3infection in chickens and turkeys.VeterinaryResearch.；41(5):72；Ryota Tsunekuni,Hirokazu Hikono,Takehiko Saito.,2014:Evaluation of avian paramyxovirus serotypes 2 to 10 as vaccine vectors inchickens previously immunized against Newcastle disease virus.VeterinaryImmunology and Immunopathology；160(3-4):184-191；和www.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdf，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和高存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了相当的肿瘤生长降低和存活期升高，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4株的基因组。在优选的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/HongKong/D3/1975strain)的基因组。APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/Hong Kong/D3/1975strain)的基因组的cDNA序列的一个实例可见于SEQ ID NO：4。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因的核苷酸序列引入APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012strain)、APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)、APMV4/海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)、APMV4/埃及鹅/南非/N1468/2010株(APMV4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010strain)或者APMV-4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV-4/duck/Delaware/549227/2010strain)的基因组中。APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012strain)的基因组的cDNA序列的一个实例可见于SEQ ID NO：7。APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)的基因组的cDNA序列的实例可见于SEQ ID NO：3。APMV4/海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4/Uriah_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)的基因组的cDNA序列的实例可见于SEQ ID NO：5。APMV4/埃及鹅/南非/N1468/2010株(APMV4/Egyptian goose/South Africa/N1468/2010strain)的基因组的cDNA序列的实例可见于SEQ ID NO：6。APMV-4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV-4/duck/Delaware/549227/2010strain)的基因组的cDNA序列的实例可见于SEQ ID NO：8。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组中，所述APMV-4与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组，其与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组中，所述APMV-4与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组，所述APMV-4与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSotaF蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组中，所述APMV-4与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-4的基因组，所述APMV-4与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSotaF蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。在具体的实施方式中，修饰的NDV包含包装的基因组，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-7株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)的基因组。有关APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)的完整基因组cDNA，参见，例如，GenBank No.FJ231524.1或者SEQ ID NO：10。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-8株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)的基因组。有关APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.FJ619036.1或者SEQID NO：11。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-9株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9 duck/New York/22/1978)的基因组。有关APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9 duck/New York/22/1978)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.NC_025390.1或者SEQ ID NO：12。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)的基因组。有关APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBankNo.EU338414.1或者SEQ ID NO：1。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-3株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)的基因组。有关APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU782025.1或者SEQ ID NO：2。
在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-6株的基因组。在具体的实施方式中，将本文所述的转基因引入APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/HongKong/18/199/77)的基因组。有关APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)的完整基因组cDNA序列，参见，例如，GenBank No.EU622637.2或者SEQ ID NO：9。
本领域技术人员将理解APMV基因组RNA序列是编码APMV基因组的cDNA序列的反向互补序列。因此，可以使用将核苷酸序列转化为其反向互补序列的任何程序来将编码APMV基因组的cDNA序列转化为基因组RNA序列(参见，例如，www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html，www.fr33.net/seqedit.php和DNAStar)。因此，本领域技术人员可以容易地将下文表2和3中所提供的核苷酸序列转化为APMV基因组的负义RNA序列。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-4株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-4感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-4株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-4株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-4核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-4磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-4基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-4融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-4血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-4大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-4的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-4基因组中。在某些实施方式中，APMV-4的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-4株是APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/Hong Kong/D3/1975 strain)、APMV-4/鸭/中国/G302/2012株(APMV-4/Duck/China/G302/2012 strain)、APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07 strain)、APMV4海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4Uriah-aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 strain)APMV4/埃及鹅/南非/NJ468/2010株(APMV4/Egyptian goose/south Africa/NJ468/2010 strain)或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010 strain)。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-8株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-8感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-8株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-8株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-8核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-8磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-8基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-8融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-8血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-8大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-8的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-8基因组中。在某些实施方式中，APMV-8的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-8株是APMV-8/鹅/特拉华州/1053/76(APMV-8/Goose/Delaware/1053/76)株。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-9株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-9感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-9株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-9株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-9核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-9磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-9基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-9融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-9血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-9大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-9的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-9基因组中。在某些实施方式中，APMV-9的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-9株是APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)株。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-7株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-7感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-7株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-7株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-7核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-7磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-7基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-7融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-7血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-7大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-7的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-7基因组中。在某些实施方式中，APMV-7的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-7株是APMV-7/鸽/田纳西州/4/75(APMV-7/dove/Tennessee/4/75)株。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-2株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-2感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-2株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-2株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-2核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-2磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-2基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-2融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-2血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-2大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-2的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-2基因组中。在某些实施方式中，APMV-2的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-2株是APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)株。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-3株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-3感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-3株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-3株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-3核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-3磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-3基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-3融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-3血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-3大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-3的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-3基因组中。在某些实施方式中，APMV-3的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-3株是APMV-3火鸡/威斯康星州/68(turkey/Wisconsin/68)株。
在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-6株的基因组，其中所述基因组包含病毒在基底(例如，对APMV-6感染敏感的细胞系)、对象(例如，人对象)或两者中的感染和复制所必需的APMV-6株的转录单元。在具体的实施方式中，将转基因引入APMV-6株的基因组，其中所述基因组包含编码APMV-6核蛋白壳(N)蛋白的转录单元、编码APMV-6磷蛋白(P)的转录单元、编码APMV-6基质(M)蛋白的转录单元、编码APMV-6融合(F)蛋白的转录单元、编码APMV-6血球凝集素-神经氨糖酸苷酶(HN)蛋白的转录单元和编码APMV-6大聚合酶(L)蛋白的转录单元。所述转基因可以引入到本文所述的APMV-6的两个转录单元(例如，M和P转录单元之间或者HN和L转录单元之间)的APMV-6基因组中。在某些实施方式中，APMV-6的基因组不编码本文所述的转基因以外的异源蛋白质。在具体的实施方式中，所述APMV-6株是APMV-6/鸭/香港/18/199/77(APMV-6/duck/Hong Kong/18/199/77)株。
5.1.2.2转基因
在具体的实施方式中，将编码细胞因子的转基因引入本文所述的APMV的基因组。例如，所述转基因可以编码IL-2、IL-15Ra-IL-15或GM-CSF。在另一个具体的实施方式中，将编码肿瘤抗原的转基因引入本文所述的APMV的基因组。例如，所述转基因可以编码人乳头状瘤病毒(HPV)抗原，如E6或E7(例如，HPV-16E6或E7蛋白)或者可以将其它肿瘤抗原引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。
在某些实施方式中，编码本文所述的蛋白(例如，人IL-2、人IL-12、人GM-CSF或人IL-15Ra-IL-15蛋白或者肿瘤抗原)的转基因包含APMV调控信号(例如，基因末端、基因间和基因起始序列)和Kozak序列。在一些实施方式中，编码本文所述的蛋白(例如，人IL-2、人IL-12、人GM-CSF、人IL-15Ra-IL15蛋白或肿瘤抗原)的转基因包含APMV调控信号(例如，基因末端、基因间和基因起始序列)、Kozak序列和限制性位点以有利于克隆。在某些实施方式中，编码本文所述的蛋白(例如，人IL-2、人IL-12、人GM-CSF、人IL-15Ra-IL15蛋白或肿瘤抗原)的转基因包含APMV调控信号(例如，基因末端、基因间和基因起始序列)、Kozak序列、限制性位点以有利于克隆，并且在非编码区包含其它核苷酸以确保符合六位规则(rule ofsix)。在优选的实施方式中，转基因符合六位规则。
IL-2
在具体的实施方式中，将编码IL-2的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人IL-2。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含GenBank No.NO_000577.2中所示的氨基酸序列的人IL-2的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，该转基因包含SEQ ID NO：15中所示的序列。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同IL-2蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码IL-2(例如，人IL-2)的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在一些实施方式中，编码人IL-2蛋白的转基因包含由包含SEQ ID NO：15中所示序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMV P和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码IL-2(例如，人IL-2)的转基因。
“白介素-2”和“IL-2”表示本领域技术人员已知的任何IL-2。在某些实施方式中，IL-2可以是人、狗、猫、马、猪或牛IL-2。在具体的实施方式中，IL-2是人IL-2。GenBankTM登录号NG_016779.1(GI号291219938)提供了示例性的人IL-2核酸序列。GenBankTM登录号NP_000577.2(GI号28178861)提供了示例性的人IL-2氨基酸序列。如本文所使用的，术语“白介素-2”和“IL-2”涵盖了通过翻译后处理，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的白介素-2多肽。在一些实施方式中，IL-2由包含信号序列的单个多肽链组成。在其它实施方式中，IL-2由不包含信号序列的单个多肽链组成。所述信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。在一些实施方式中，所述信号肽是IL-2信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽对IL-2信号肽是异源的。
在具体的实施方式中，将编码IL-2衍生物的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人IL-2衍生物。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。在具体的实施方式中，IL-2衍生物与本领域技术人员已知的IL-2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本领域中已知的方法/技术可以用于确定序列同一性(参见，例如，10版的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)的“最佳匹配(Best Fit)”或“空位(Gap)”程序；Genetics Computer Group,Inc.)。在具体的实施方式中，IL-2衍生物包含已知的IL-2(例如，人IL-2)的缺失形式，其中从已知的IL-2(例如，人IL-2)上缺失多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-2的缺失形式的IL-2衍生物，其中从已知的IL-2(例如，人IL-2)上缺失约1-3，3-5，5-7，7-10，10-15或15-20个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-2(例如，人IL-2)的改变形式的IL-2衍生物，其中用其它氨基酸替换(例如，保守替换)多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个已知IL-2的氨基酸残基。在具体的实施方式中，已知的IL-2是人IL-2，如(例如)GenBankTM登录号NP_000577.2(GI号28178861)中所提供的。在一些实施方式中，IL-2衍生物包含多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守替换的氨基酸。保守氨基酸替换的实例包括(例如)用相同类的另一种氨基酸替换一类氨基酸。在具体的实施方式中，保守替换不改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸的类别可以包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏性(conformation disruptor)(Gly、Pro)和芳族(Trp、Tyr、Phe)。
在具体的实施方式中，IL-2衍生物与天然IL-2(例如，人IL-2)是至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在另一个具体的实施方式中，IL-2衍生物是与编码天然IL-2的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)核酸序列所编码的多肽。在具体的实施方式中，天然IL-2是人IL-2，如(例如)GenBankTM登录号NP_000577.2(GI号28178861)或者GenBankTM登录号NG_016779.1(GI号291219938)中所提供的人IL-2。在另一个具体的实施方式中，IL-2衍生物相对于天然IL-2(例如，人IL-2)含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个或者2至5，2至10，5至10，5至15，5至20，10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失、替换或它们的任意组合)。在另一个具体的实施方式中，IL-2衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然IL-2(例如，人IL-2)的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利申请No.2005/0048549，例如，第72和73段)。在另一个具体的实施方式中，IL-2衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸的天然IL-2(例如，人IL-2)的片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，IL-2衍生物是天然IL-2(例如，人IL-2)的片段。IL-2衍生物还包括包含IL-2的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，IL-2衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，IL-2衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，IL-2衍生物保留了它所来源的天然IL-2(例如，人IL-2)的1、2或更多种或全部功能。IL-2的功能的实例包括对T细胞、B细胞和NK细胞的信号调控、调节性T细胞发展的促进和自体耐受性的维持。确定IL-2衍生物是否保留它所来源的天然IL-2(例如，人IL-2)的一种或多种功能的测试是本领域技术人员已知的并且本文提供了实例。
在具体的实施方式中，在本文所述的重组APMV的包装的基因组中编码IL-2或其衍生物的转基因是密码子优化的。
IL-12
在具体的实施方式中，将编码IL-12的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人IL-12。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列的人IL-12的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，这种转基因包含从SEQ ID NO：16中所示的核苷酸序列转录的负义RNA。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同IL-12蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码IL-12(例如，人IL-12)的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在具体的实施方式中，转基因包含从SEQ ID NO：17中所示的密码子优化的序列转录的负义RNA。在一些实施方式中，编码人IL-12蛋白的转基因包含由包含SEQ ID NO：16或17中所示的核苷酸序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMV P和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码IL-12(例如，人IL-12)的转基因。
“白介素-12”和“IL-12”表示本领域技术人员已知的任何IL-12。在某些实施方式中，所述IL-12可以是人、狗、猫、马、猪或牛IL-12。在具体的实施方式中，IL-12是人IL-12。典型的IL-12由通过本领域技术人员已知的两个不同的基因IL-12A(p35亚基)和IL-12B(p40亚基)编码的杂二聚体组成。GenBankTM登录号NM_000882.3(GI号325974478)或者SEQID NO：49提供了示例性的人IL-12A核酸序列。GenBankTM登录号NM_002187.2(GI号24497437)或者SEQ ID NO：47提供了示例性的人IL-12B核酸序列。GenBankTM登录号NP_000873.2(GI号24430219)或者SEQ ID NO：48提供了示例性的人IL-12A(p35亚基)氨基酸序列。GenBankTM登录号NP_002178.2(GI号24497438)或者SEQ ID NO：46提供了示例性的人IL-12B(p40亚基)氨基酸序列。在某些实施方式中，IL-12由任选地通过接头序列(如(例如)SEQID NO：35(其由SEQ ID NO：45中所示的核苷酸序列所编码))分开的单个多肽链，包括p35亚基和p40亚基组成。在某些实施方式中，IL-12由在四级结构上结合的不止一条多肽链，例如，p35和p40组成。如本文所使用的，术语“白介素-12”和“IL-12”涵盖了通过翻译后处理，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的白介素-12多肽。在一些实施方式中，IL-12的亚基之一或两者或者由单个多肽链组成的IL-12包括信号序列。在其它实施方式中，IL-12的亚基之一或两者或者由单个多肽链组成的IL-12不包括信号序列。所述信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。在一些实施方式中，所述信号肽是IL-12信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽对IL-12信号肽是异源的。
在具体的实施方式中，包含直接彼此融合的IL-12p35亚基和IL-12p40亚基的多肽是功能性的(例如，能够特异性结合至IL-12受体并且引起IL-12-介导的信号转导和/或IL-12-介导的免疫功能)。在具体的实施方式中，IL-12p35亚基和IL-12p40亚基或其衍生物是使用一个或多个接头彼此间接融合的。适合于制备IL-12p35亚基/p40亚基融合蛋白的接头可以包括一个或多个氨基酸(例如，肽)。在具体的实施方式中，包含使用氨基酸接头(例如，肽接头)间接彼此融合的IL-12p35亚基和IL-12p40亚基的多肽是功能性的(例如，能够特异性结合至IL-12受体并且引起IL-12-介导的信号转导和/或IL-12-介导的免疫功能)。在具体的实施方式中，所述接头足够长以保持IL-12p35亚基和IL-12p40亚基形成功能性IL-12杂二聚体复合物的能力，其能够结合至IL-12受体并且引起IL-12-介导的信号转导。在一些实施方式中，所述接头是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸长的氨基酸序列(例如，肽)。在一些实施方式中，所述接头是长度为5至20或5至15个氨基酸之间的氨基酸序列(例如，肽)。在某些实施方式中，在本文所述的重组APMV的包装的基因组中由转基因所编码的IL-12由在四级结构中结合的不止一条多肽链组成，例如，在四级结构中与包含IL-12p40亚基的多肽链或其衍生物结合的包含IL-12p35亚基的多肽链或其衍生物。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，弹性蛋白-样多肽序列包含氨基酸序列VPGXG(SEQ ID NO：22)，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在某些实施方式中，弹性蛋白-样多肽序列包含氨基酸序列VPGXGVPGXG(SEQ ID NO：23)，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在某些实施方式中，所述接头可以是美国专利No.5,891,680中所述的接头，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，将编码IL-12衍生物的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人IL-12衍生物。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。在具体的实施方式中，IL-12衍生物与本领域技术人员已知的IL-12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本领域中已知的方法/技术可以用于确定序列同一性(参见，例如，10版的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)的“最佳匹配(Best Fit)”或“空位(Gap)”程序；Genetics Computer Group,Inc.)。在具体的实施方式中，IL-12衍生物包含已知的IL-12的缺失形式，其中从已知的IL-12上缺失了多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-12的缺失形式的IL-12衍生物，其中从已知的IL-12上缺失约1-3，3-5，5-7，7-10，10-15或15-20个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-12的改变形式的IL-12衍生物，其中用其它氨基酸替换(例如，保守替换)多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个已知IL-12的氨基酸残基。在一些实施方式中，所述IL-12衍生物包含多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守替换的氨基酸(参见，例如，Huang等人,2016,Preclinical validation:LV/IL-12transduction of patient leukemia cells forimmunotherapy of AML,Molecular Therapy–Methods&Clinical Development,3,16074；doi:10.1038/mtm.2016.74，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。在一些实施方式中，保守取代的氨基酸不计划在细胞因子/受体的界面(参见，例如，Huang等人,2016,Preclinical validation:LV/IL-12 transduction of patient leukemia cells forimmunotherapy of AML,Molecular Therapy–Methods&Clinical Development,3,16074；doi:10.1038/mtm.2016.74；Jones&Vignali,2011,Molecular Interactions within theIL-6/IL-12cytokine/receptor superfamily,Immunol Res.,51(1):5-14,doi:10.1007/s12026-011-8209-y；以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文)。在一些实施方式中，IL-12衍生物包含具有氨基酸替换L165S的IL-12p35亚基(即IL-12衍生物中的IL-12p35亚基的位置165处的亮氨酸被丝氨酸取代)。在一些实施方式中，IL-12衍生物包含具有氨基酸替换C2G的IL-12p40亚基(即IL-12衍生物中未成熟的IL-12p40亚基(即含有信号肽的IL-12p40亚基)的位置2处的半胱氨酸被甘氨酸取代)。
在具体的实施方式中，IL-12衍生物包含与天然IL-12p35亚基(例如，人IL-12p35亚基)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)IL-12p35亚基。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物是由核酸序列所编码的多肽，其中核酸序列部分编码IL-12p35亚基，其中所述部分的所述核酸序列是与编码天然IL-12p35亚基(例如，人IL-12p35亚基)的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在具体的实施方式中，IL-12衍生物包含与天然IL-12p40亚基(例如，人IL-12p40亚基)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)IL-12p40亚基。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物是由核酸序列所编码的多肽，其中核酸序列部分编码IL-12p40亚基，其中所述部分的所述核酸序列是与编码天然IL-12p40亚基(例如，人IL-12p40亚基)的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物包含相对于天然IL-12p35亚基、天然IL-12p40亚基或两者，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个或者2至5，2至10，5至10，5至15，5至20，10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失、替换或它们的任意组合)的IL-12p35亚基、IL-12p40亚基或两者。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然IL-12p35亚基、天然IL-12p40亚基或两者的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利申请No.2005/0048549，例如，第72和73段)。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然IL-12p35亚基片段、天然IL-12p40亚基片段或者天然IL-12p35亚基和天然IL-12p40亚基两者的片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽，其中所述片段为至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物包含天然IL-12p35亚基、天然IL-12p40亚基或两者的片段。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物包含天然IL-12p35亚基的片段、天然IL-12p40亚基的片段或两者。在另一个具体的实施方式中，IL-12衍生物包含由在其全长上与编码天然亚基(例如，天然p40亚基或天然p35亚基)的核苷酸杂交的核苷酸序列所编码的亚基(例如，p35或者p40)。在具体的实施方式中，IL-12衍生物包括天然IL-12p40亚基和IL-12p35亚基的衍生物。在具体的实施方式中，IL-12衍生物包括天然IL-12p35亚基和IL-12p40亚基的衍生物。IL-12衍生物还包括包含IL-12的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，IL-12衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，IL-12衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，IL-12衍生物保留了它所来源的天然IL-12的1、2或更多种或全部功能。IL-12的功能的实例包括辅助T1细胞(T helper 1cells)的发展的促进和促炎免疫应答途径的激活。确定IL-12衍生物是否保留它所来源的天然IL-12(例如，人IL-12)的一种或多种功能的测试是本领域技术人员已知的并且本文提供了实例。
在具体的实施方式中，在本文所述的重组APMV的包装的基因组中编码IL-12或其衍生物的转基因是密码子优化的。在具体的实施方式中，编码天然IL-12的亚基之一或两者的核苷酸序列可以是密码子优化的。编码IL-12的密码子-优化的序列的非限制性实例包括SEQ ID NO：17。
IL-15Ra-IL-15
在具体的实施方式中，将编码IL-15Ra-IL-15的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人IL-15Ra-IL-15。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列的人IL-15Ra-IL-15的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，这种转基因包含从SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列转录的负义RNA。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同IL-15Ra-IL-15蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在一些实施方式中，编码人IL-15Ra-IL-15蛋白的转基因包含由包含SEQ ID NO：18中所示序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMV P和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)的转基因。
如本文所使用的，术语“IL-15Ra-IL-15”是指包含彼此共价或非共价结合的IL-15或其衍生物和IL-15ra或其衍生物的复合物。在具体的实施方式中，IL-15Ra或其衍生物对于IL-15或其衍生物具有相对高的亲合力，例如，10至50pM的Kd，如通过本领域中已知的技术所测量的，例如，KinEx A测定、等离子表面共振(例如，BIAcore测定)。在优选的实施方式中，IL-15Ra-IL-15诱导IL-15-介导的信号转导，如通过本领域熟知的测定所测量的，例如，电动性迁移测定(electromobility shift assay)、ELISA及其它免疫测定。在一些实施方式中，IL-15Ra-IL-15复合物保留了特异性结合至βγ链的能力。在优选的实施方式中，IL-15Ra-IL-15复合物保留了特异性结合至βγ链和诱导/介导IL-15信号转导的能力。
在具体的实施方式中，可以通过使用非共价键或共价键(例如，通过经由肽键的氨基酸序列合并)直接将IL-15Ra或其衍生物(例如，人IL-15Ra或其衍生物)融合至IL-15或其衍生物(例如，人IL-15或其衍生物)来形成IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)。在具体的实施方式中，可以通过使用一个或多个接头将IL-15Ra或其衍生物(例如，人IL-15Ra或其衍生物)间接融合至IL-15或其衍生物(例如，人IL-15或其衍生物)来形成IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)。适合于制备IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)的接头包括肽、烷基、化学取代的烷基、聚合物或任何其它能够将两个或更多个组分结合在一起的共价键键合或非共价键键合的化学物质。聚合物接头包括本领域中已知的任何聚合物，包括聚乙二醇(“PEG”)。在一些实施方式中，所述接头是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸长的肽。在具体的实施方式中，所述接头足够长以保持IL-15或其衍生物(例如，人IL-15或其衍生物)结合至IL-15Ra或其衍生物(例如，人IL-15Ra或其衍生物)的能力。在其它实施方式中，所述接头足够长以保持IL-15Ra-IL-15复合物结合至βγ受体复合物和作为介导IL-15信号转导的激动剂起作用的能力。在某些实施方式中，所述接头具有SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列(编码这种接头序列的核苷酸序列是SEQ ID NO：42中所示的)。
在某些实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)包含IL-15(例如，人IL-15)的信号序列。在其它实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)包含IL-15Ra(例如，人IL-15Ra)的信号序列。在其它实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)包含对IL-15(例如，人IL-15)和IL-15Ra(例如，人IL-15Ra)异源的信号序列。在具体的实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)包含SEQ ID NO：41中所示的信号序列(编码这种信号序列的核苷酸序列是在SEQ ID NO：43中所示的)。
在具体的实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)包含信号序列、标签(例如，flag标签)，IL-15Ra(例如，IL-15Ra sushi域)的可溶性形式、接头和IL-15。在另一个具体的实施方式中，人IL-15Ra-IL-15包含含有下列的氨基酸序列：(1)包含SEQ IDNO：41中所示的氨基酸序列(由其组成)的信号序列；(2)包含SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列(由其组成)的flag-标签；(3)包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列(由其组成)的人IL-15Ra的可溶性形式；(4)包含SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列(由其组成)的接头；和(5)包含SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列(由其组成)的人IL-15。由于核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同人IL-15Ra-IL-15蛋白的不同的核酸序列。在另一个具体的实施方式中，人IL-15Ra-IL-15包括：(1)通过包含SEQ ID NO：43中所示的核苷酸序列(由其组成)的核苷酸序列所编码的信号序列；(2)通过包含SEQ ID NO：44中所示的核苷酸序列(由其组成)的核苷酸序列所编码的flag-标签；(3)通过包含SEQ ID NO：50中所示的核苷酸序列(由其组成)的核苷酸序列所编码的人IL-15Ra的可溶性形式；(4)通过包含SEQ ID NO：42中所示的核苷酸序列(由其组成)的核苷酸序列所编码的接头；和(5)通过包含SEQ ID NO：51中所示的核苷酸序列(由其组成)的核苷酸序列所编码的人IL-15。
如本文所使用的，术语“白介素-15”和“IL-15”是指本领域技术人员已知的任何IL-15。在某些实施方式中，所述IL-15可以是人、狗、猫、马、猪或牛IL-15。多种物种的IL-15的氨基酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NP_000576(人，未成熟形式)、CAA62616(人，未成熟形式)、NP_001009207(猫(Felis catus)，未成熟形式)、AAB94536(家鼠属，未成熟形式)、AAB41697(家鼠属，未成熟形式)、NP_032383(小家鼠(Mus musculus)，未成熟形式)、AAR19080(狗)、AAB60398(恒河猴(Macaca mulatta)，未成熟形式)、AAI00964(人，未成熟形式)、AAH23698(小家鼠(Mus musculus)，未成熟形式)和AAH18149(人)。多种物种的IL-15的核苷酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NM_000585(人)、NM_008357(小家鼠(Musmusculus))和RNU69272(褐家鼠(Rattus norvegicus))。如本文所使用的，术语“白介素-15”和“IL-15”涵盖了通过翻译后处理，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的白介素-15多肽。在一些实施方式中，IL-15由包含信号序列的单个多肽链组成。在其它实施方式中，IL-15由不包含信号序列的单个多肽链组成。
在具体的实施方式中，人IL-15Ra-IL-15序列的人IL-15组分包含SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，人IL-15Ra-IL-15序列的人IL-15组分包含SEQ IDNO：51中所示的核苷酸序列。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同IL-15蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，编码人IL-15Ra-IL15转基因的人IL-15组分的核苷酸序列是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。
在具体的实施方式中，IL-15Ra-IL-15(例如，人IL-15Ra-IL-15)序列的IL-15(例如，人IL-15)组分是IL-15衍生物。在具体的实施方式中，IL-15衍生物与本领域技术人员已知的IL-15具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本领域中已知的方法/技术可以用于确定序列同一性(参见，例如，10版的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)的“最佳匹配(Best Fit)”或“空位(Gap)”程序；Genetics Computer Group,Inc.)。在具体的实施方式中，IL-15衍生物包含已知的IL-15(例如，人IL-15)的缺失形式，其中从已知的IL-15上缺失了多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-15(例如，人IL-15)的缺失形式的IL-15衍生物，其中从已知的IL-15上缺失约1-3，3-5，5-7，7-10，10-15或15-20个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-15(例如，人IL-15)的改变形式的IL-15衍生物，其中用其它氨基酸替换(例如，保守替换)多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个已知IL-15的氨基酸残基。在一些实施方式中，IL-15衍生物包含多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守替换的氨基酸。保守氨基酸替换的实例包括(例如)用相同类的另一种氨基酸替换一类氨基酸。在具体的实施方式中，保守替换不改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸的类别可以包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏性(conformation disruptor)(Gly、Pro)和芳族(Trp、Tyr、Phe)。
在具体的实施方式中，IL-15衍生物与天然IL-15(例如，人IL-15)是至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在另一个具体的实施方式中，IL-15衍生物是与编码天然IL-15(例如，人IL-15)的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，IL-15衍生物相对于天然IL-15(例如，人IL-15)含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个或者2至5，2至10，5至10，5至15，5至20，10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失、替换或它们的任意组合)。在另一个具体的实施方式中，IL-15衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然IL-15(例如，人IL-15)的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利申请No.2005/0048549，例如，第72和73段)。在另一个具体的实施方式中，IL-15衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸的天然IL-15(例如，人IL-15)的片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，IL-15衍生物是天然IL-15(例如，人IL-15)的片段。IL-15衍生物还包括包含IL-15的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，IL-15衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，IL-15衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，IL-15衍生物保留了它所来源的天然IL-15(例如，人IL-15)的1、2或更多种或全部功能。IL-15的功能的实例包括NK细胞的发育和分化以及记忆性CD8+T细胞的存活或扩增的促进。确定IL-15衍生物是否保留它所来源的天然IL-15(例如，人IL-15)的一种或多种功能的测试是本领域技术人员已知的并且本文提供了实例。
如本文所使用的，术语“IL-15Ra”和“白介素-15受体α”是指本领域技术人员已知的任何IL-15Ra。在某些实施方式中，所述IL-15可以是人、狗、猫、马、猪或牛IL-15Ra。多种天然哺乳动物IL-15Ra的氨基酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NP_002180(人)、ABK41438(恒河猴(Macaca mulatta))、NP_032384(小家鼠(Mus musculus))、Q60819(小家鼠(Mus musculus))、CAI41082(人)。多种物种的天然哺乳动物IL-15Ra的核苷酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NM_002189(人)、EF033114(恒河猴(Macaca mulatta))和NM_008358(小家鼠(Mus musculus))。在具体的实施方式中，所述IL-15Ra是可溶性的。
如本文所使用的，术语“白介素-15受体α和“IL-15Ra”涵盖了通过翻译后处理，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的IL-15Ra多肽。在一些实施方式中，IL-15Ra由包含信号序列的单个多肽链组成。在其它实施方式中，IL-15Ra由不包含信号序列的单个多肽链组成。所述信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。在一些实施方式中，所述信号肽是IL-15Ra信号肽。
在具体的实施方式中，IL-15Ra-IL-15序列的IL-15Ra组分包含人IL-15Ra衍生物。在具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物与本领域技术人员已知的IL-15Ra(例如，人IL-15Ra)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本领域中已知的方法/技术可以用于确定序列同一性(参见，例如，10版的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)的“最佳匹配(Best Fit)”或“空位(Gap)”程序；Genetics Computer Group,Inc.)。在具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物包含已知的IL-15Ra的缺失形式，其中从已知的IL-15Ra(例如，人IL-15Ra)上缺失多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-15Ra(例如，人IL-15Ra)的缺失形式的IL-15Ra衍生物，其中从已知的IL-15Ra上缺失约1-3，3-5，5-7，7-10，10-15或15-20个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的IL-15Ra的改变形式的IL-15Ra衍生物，其中用其它氨基酸替换(例如，保守替换)多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个已知IL-15Ra的氨基酸残基。在一些实施方式中，IL-15Ra衍生物包含多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守替换的氨基酸。保守氨基酸替换的实例包括(例如)用相同类的另一种氨基酸替换一类氨基酸。在具体的实施方式中，保守替换不改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸的类别可以包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏性(conformation disruptor)(Gly、Pro)和芳族(Trp、Tyr、Phe)。
在具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物与天然IL-15Ra是至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在另一个具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物是与编码天然IL-15Ra的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物相对于天然IL-15Ra含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个或者2至5，2至10，5至10，5至15，5至20，10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失和/或替换)。在另一个具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然IL-15Ra的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利申请No.2005/0048549，例如，第72和73段)。在另一个具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸的天然IL-15Ra片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。
在优选的实施方式中，IL-15Ra的衍生物是缺少IL-15Ra的跨膜域和任选地缺少天然IL-15Ra的胞内域的IL-15Ra的可溶性形式。在具体的实施方式中，IL-15Ra的衍生物由IL-15Ra的胞外域组成并且缺少IL-15Ra的跨膜和胞内域。在另一个实施方式中，IL-15Ra的衍生物是包含IL-15Ra的胞外域或其片段(由其组成)的IL-15Ra的可溶性形式。在某些实施方式中，IL-15Ra的衍生物是包含含有天然IL-15Ra的sushi域或外显子2的胞外域的片段(由其组成)的IL-15Ra的可溶性形式。在某些实施方式中，IL-15Ra的衍生物是包含天然IL-15Ra的sushi域或外显子2(由其组成)的IL-15Ra的可溶性形式。在一些实施方式中，IL-15Ra的衍生物是包含含有IL-15Ra的sushi域或外显子2的胞外域片段和外显子3所编码的至少一种氨基酸(由其组成)的IL-15Ra的可溶性形式。在某些实施方式中，IL-15Ra的衍生物是包含含有IL-15Ra的sushi域或外显子2的胞外域片段和IL-15Ra铰链区或其片段(由其组成)的IL-15Ra的可溶性形式。
在另一个具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物是天然IL-15Ra的片段。IL-15Ra衍生物还包括包含IL-15RaRa的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，IL-15Ra衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，IL-15Ra衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，IL-15Ra衍生物保留了它所来源的天然IL-15Ra的1、2或更多种或全部功能。IL-15Ra的功能的实例包括提高细胞增殖和细胞凋亡抑制剂的表达。确定IL-15Ra衍生物是否保留它所来源的天然IL-15Ra的一种或多种功能的测试是本领域技术人员已知的并且本文提供了实例。
在具体的实施方式中，人IL-15Ra-IL-15序列的人IL-15Ra组分包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列(由其组成)。在一些实施方式中，人IL-15Ra-IL-15的人IL-15Ra组分包含SEQ ID NO：50中所示的核苷酸序列(由其组成)。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同人IL-15Ra蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，编码人IL-15Ra的核苷酸序列是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。
肿瘤抗原
在具体的实施方式中，将编码肿瘤抗原(例如，HPV-16E6或E7蛋白)的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。在具体的实施方式中，可以将编码HPV-16E6蛋白的转基因引入本文所述的APMV的基因组。HPV-16E6蛋白的示例性氨基酸序列包括GenBank登录号No.AKN79013.1。编码HPV-16E6蛋白的示例性核酸序列包括GenBank登录号No.KP677555.1。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含GenBank登录号No.AKN79013.1中所示的氨基酸序列的HPV16 E-6蛋白的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，这种转基因包含从SEQ IDNO：19中所示的核苷酸序列转录的负义RNA。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同HPV-E6蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在一些实施方式中，编码HPV-16E6蛋白的转基因包含由包含SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMVP和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码HPV-16E6蛋白的转基因。
在具体的实施方式中，可以将编码HPV-16E7蛋白的转基因引入本文所述的APMV的基因组。HPV-16E7蛋白的示例性氨基酸序列包括GenBank登录号No.AIQ82815.1。编码HPV-16E7蛋白的示例性核酸序列包括GenBank登录号No.KM058635.1。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含GenBank登录号No.AIQ82815.1中所示的氨基酸序列的HPV16 E-7蛋白的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，这种转基因包含从SEQ ID NO：20中所示的核苷酸序列转录的负义RNA。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同HPV-16E7蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在一些实施方式中，编码HPV-16E7蛋白的转基因包含由包含SEQ ID NO：20中所示的序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMV P和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码HPV-16E7蛋白的转基因。
GM-CSF
在具体的实施方式中，将编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；例如，人GM-CSF)的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.1节和5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人GM-CSF。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。例如，可以将编码包含GenBank登录号No.X03021.1中所示的氨基酸序列的人GM-CSF的转基因引入本文所述的任何APMV类型或株的基因组。在具体的实施方式中，这种转基因包含从SEQID NO：21中所示的核苷酸序列转录的负义RNA。然而，考虑到核酸编码的简并度，存在一些可以编码相同GM-CSF蛋白的不同的核酸序列。在具体的实施方式中，包含编码GM-CSF(例如，人GM-CSF)的核苷酸序列的转基因是密码子优化的。有关密码子优化的讨论，参见，例如，下文5.1.2.3节。在一些实施方式中，编码人GM-CSF蛋白的转基因包含由包含SEQ IDNO：21中所示序列的核酸序列所编码的氨基酸序列。可以在任何两个APMV转录单元之间(例如，APMV P和M转录单元之间或者HN和L转录单元之间)引入编码GM-CSF(例如，人GM-CSF)的转基因。
如本文所使用的，术语“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”和“GM-CSF”是指本领域技术人员已知的任何GM-CSF。在某些实施方式中，所述GM-CSF可以是人、狗、猫、马、猪或牛GM-CSF。多种物种的GM-CSF的氨基酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NP_000749.2(人，前体)、AAA52578.1(人)、AAC06041.1(猫(Felis catus))、NP_446304.1(褐家鼠(Rattus norvegicus)，前体)、NP_034099.2(小家鼠(Mus musculus)，前体)、CAA26820.1(小家鼠(Mus musculus))、AAB19466.1(狗)、AAG16626.1(恒河猴(Macaca mulatta)，未成熟形式)和AAH18149(人)。多种物种的GM-CSF的核苷酸序列的GeneBank登录号No.的实例包括NM_000758.3(人)、NM_009969.4(小家鼠(Mus musculus))和NM_053852.1(褐家鼠(Rattus norvegicus))。在具体的实施方式中，所述GM-CSF是人GM-CSF。如本文所使用的，术语“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”和“GM-CSF”涵盖了通过翻译后处理，如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶切割和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)修饰的GM-CSF多肽。在一些实施方式中，GM-CSF由包含信号序列的单个多肽链组成。在其它实施方式中，GM-CSF由不包含信号序列的单个多肽链组成。所述信号序列可以是天然存在的信号肽序列或其变体。在一些实施方式中，所述信号肽是GM-CSF信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽对GM-CSF信号肽是异源的。
在具体的实施方式中，可以将编码GM-CSF衍生物的转基因引入本文所述的APMV的基因组。有关可以使用的APMV的类型和株，参见，例如，以上5.1.2.1节。在具体的实施方式中，所述转基因编码人GM-CSF衍生物。本领域技术人员将能够使用这些序列信息产生用于向本文所述的APMV基因组引入的转基因。在具体的实施方式中，GM-CSF衍生物与本领域技术人员已知的GM-CSF具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。本领域中已知的方法/技术可以用于确定序列同一性(参见，例如，10版的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)的“最佳匹配(Best Fit)”或“空位(Gap)”程序；Genetics Computer Group,Inc.)。在具体的实施方式中，GM-CSF衍生物包含已知的GM-CSF的缺失形式，其中从已知的GM-CSF(例如，人GM-CSF)上缺失多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的GM-CSF的缺失形式的GM-CSF衍生物，其中从已知的GM-CSF(例如，人GM-CSF)上缺失约1-3，3-5，5-7，7-10，10-15或15-20个氨基酸残基。本文还提供了包含已知的GM-CSF(例如，人GM-CSF)的改变形式的GM-CSF衍生物，其中用其它氨基酸替换(例如，保守替换)多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个已知GM-CSF的氨基酸残基。在一些实施方式中，GM-CSF衍生物包含多至约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守替换的氨基酸。保守氨基酸替换的实例包括(例如)用相同类的另一种氨基酸替换一类氨基酸。在具体的实施方式中，保守替换不改变多肽的结构或功能或两者。氨基酸的类别可以包括疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性亲水性(Cys、Ser、Thr)、酸性(Asp、Glu)、碱性(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、构象破坏性(conformation disruptor)(Gly、Pro)和芳族(Trp、Tyr、Phe)。
在具体的实施方式中，GM-CSF衍生物与天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)是至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)。在另一个具体的实施方式中，GM-CSF衍生物是与编码天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)的核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或者80％至85％，80％至90％，80％至95％，90％至95％，85％至99％或95％至99％同一的(例如，序列同一性)核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，相对于天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)，GM-CSF衍生物含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或以上或者2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15或15至20个氨基酸突变(即添加、缺失和/或替换)。在另一个具体的实施方式中，GM-CSF衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。杂交条件是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利申请No.2005/0048549，例如，第72和73段)。在另一个具体的实施方式中，GM-CSF衍生物是可以在高、中或典型严格杂交条件下与编码至少10个邻接氨基酸，至少12个邻接氨基酸，至少15个邻接氨基酸，至少20个邻接氨基酸，至少30个邻接氨基酸，至少40个邻接氨基酸，至少50个邻接氨基酸，至少75个邻接氨基酸，至少100个邻接氨基酸，至少125个邻接氨基酸，至少150个邻接氨基酸，或者10至20，20至50，25至75，25至100，25至150，50至75，50至100，75至100，50至150，75至150，100至150或100至200个邻接氨基酸的天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)片段的核酸序列杂交的核酸序列所编码的多肽。在另一个具体的实施方式中，GM-CSF衍生物是天然GM-CSF(例如，人GM-CSF)的片段。GM-CSF衍生物还包括包含GM-CSF的天然存在的成熟形式的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，GM-CSF衍生物包括已通过(例如)糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白部分连接等化学修饰的多肽。此外，GM-CSF衍生物包括包含一个或多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，GM-CSF衍生物保留了它所来源的天然GM-CSF的1、2或更多种或全部功能。GM-CSF的功能的实例包括来自骨髓前体细胞的粒性白细胞和巨噬细胞的增殖刺激和循环嗜中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞的招募。确定GM-CSF衍生物是否保留它所来源的天然GM-CSF的一种或多种功能的测试是本领域技术人员已知的并且本文提供了实例。
在具体的实施方式中，在本文所述的重组APMV的包装的基因组中编码GM-CSF或其衍生物的转基因是密码子优化的。在具体的实施方式中，编码天然GM-CSF的亚基之一或两者的核苷酸序列可以是密码子优化的。
5.1.2.3密码子优化
本领域技术人员已知的任何密码子优化技术可以用于编码所关心的蛋白(例如，IL-2、IL-15Ra-IL-15、GM-CSF、HPV-16E6或HPV-16E7)的核酸序列的密码子优化。密码子优化的方法在本领域中是已知的，例如，OptimumGeneTM
Figure BDA0002976913420000361
规程和
Figure BDA0002976913420000362
规程，其以其全部内容作为参考并入本文。对于密码子优化的方法，还参见美国专利No.8,326,547，其以其全部内容作为参考并入本文。
作为密码子优化的示例性方法，在编码所关心的蛋白或其域(例如，IL-2、IL-15Ra-IL-15、GM-CSF、HPV-16E6或HPV-16)的核酸序列的开放框中的每个密码子被哺乳动物蛋白中最常使用的密码子替换。这可以使用利用通过植物基因研究部门(Department ofPlant Gene Research,Kazusa,Japan)所维持的密码子使用数据库(Codon UsageDatabase)的基于网络的程序(www.encorbio.com/protocols/codon.htm)完成。对于对哺乳动物表达所优化的这种核酸序列，可以检查：(1)可以起转录终止子作用的5×A或以上的延伸的存在；(2)可以妨碍亚克隆的限制性位点的存在；和(3)符合六位规则。检查后，(1)可以通过同义突变取代可以起转录终止子作用的5×A或以上的延伸；(2)可以通过同义突变取代可以防碍亚克隆的限制性位点；(3)可以添加用于最优蛋白表达的APMV调控信号(基因末端、基因间和基因起始序列)和Kozak序列；和(4)可以将核苷酸加入非编码区以确保符合六位规则。同义突变通常是不改变所编码的氨基酸的核苷酸变化。例如，就其序列编码Lys-Lys的6A(AAAAAA)延伸来说，同义序列将是AAGAAG，该序列也编码Lys-Lys。
5.2 APMV的构建
可以使用反向遗传学技术产生本文所述的APMV(参见，例如，5.1、6和7节)。反向遗传学技术包括制备含有负链病毒RNA的非编码区的合成重组病毒RNA，该非编码区对于病毒聚合酶的识别和对于产生成熟病毒粒子所需的包装信号均是必不可少的。重组RNA从重组DNA模板合成并通过纯化的病毒聚合酶复合物体外重构以形成重组核糖核蛋白(RNP)，其可以用于转染细胞。如果在合成RNA体外或体内转录期间存在病毒聚合酶蛋白，则将实现更有效的转染。合成的重组RNP可以被拯救成为感染性病毒颗粒。以上技术描述于美国专利No.5,166,057(1992年11月24日公告)；美国专利No.5,854,037(1998年12月29日公告)；美国专利No.6,146,642(2000年11月14日公告)；欧洲专利公布EP 0702085A1(1996年2月20日公布)；美国专利申请序列号No.09/152,845；国际专利公布PCT WO97/12032(1997年4月3日公布)；WO96/34625(1996年11月7日公布)；欧洲专利公布EP A780475；WO 99/02657(1999年1月21日公布)；WO 98/53078(1998年11月26日公布)；WO 98/02530(1998年1月22日公布)；WO 99/15672(1999年4月1日公布)；WO 98/13501(1998年4月2日公布)；WO 97/06270(1997年2月20日公布)；和EPO 780 475A1(1997年6月25日公布)，以上每篇专利公开以其全部内容作为参考并入本文。
还可以使用无辅助质粒技术来工程改造本文所述的APMV。具体地，无辅助质粒技术可以用于工程改造本文所述的重组APMV。简要地，构建APMV(例如，APMV-4株)的完整cDNA，将其插入到质粒载体中并经工程改造以在两个转录单元(例如，APMV P和M转录单元；或APMV HN和L转录单元)之间包含独特的限制性位点。可以将编码异源氨基酸序列(例如，转基因或其它序列)的核苷酸序列在所述独特的限制性位点插入病毒基因组。作为另外一种选择，可以将编码异源氨基酸序列(例如，转基因或其它序列)的核苷酸序列工程改造成APMV转录单元，只要所述插入不影响病毒感染和复制的能力。将单个节段置于T7启动子和丁型肝炎病毒核糖酶之间以从所述T7聚合酶产生精确的负义和正义转录本。将包含必需病毒蛋白的质粒载体和表达载体转染到细胞中，从而导致产生重组病毒颗粒(参见，例如，国际专利公开No.WO 01/04333；美国专利No.7,442,379、6,146,642、6,649,372、6,544,785和7,384,774；Swayne等人(2003).Avian Dis.47:1047-1050；和Swayne等人(2001).J.Virol.11868-11873，以上每篇文献以其全部作为参考并入)。还参见，例如，Nolden等人,Scientific Reports 6:23887(2016)有关产生负义链RNA病毒的反向遗传学技术，以上文献作为参考并入本文。
从单一mRNA产生多种蛋白质的双顺反子技术是本领域技术人员已知的。双顺反子技术允许通过使用IRES序列将多种蛋白质的编码序列工程改造成单一mRNA。IRES序列指导核糖体向RNA分子的内部招募并且允许以不依赖于帽(cap)的方式进行下游翻译。简要地，将一个蛋白的编码区插入第二蛋白的ORF的下游。通过正确表达和/或功能所必需的IRES和任何未翻译的信号序列侧接所述插入。所述插入不可破坏第二蛋白的开放阅读框、多腺苷酸化或转录启动子(参见，例如García-Sastre等人,1994,J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人,1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文)。
克隆重组APMV以编码转基因和表达所述转基因所编码的异源蛋白质的方法是本领域技术人员已知的，如(例如)所述转基因向已工程改造至APMV基因组的限制性位点的插入，适当信号在所述转基因中的包含以用于APMV RNA-依赖性-RNA聚合酶(例如，所述转基因的开放阅读框的上游序列，其允许APMV聚合酶识别前一个基因的末端和所述转基因的开始，例如，两者可以通过单核苷酸基因间序列隔开)的识别、有效的Kozak序列的包含(例如，以改善真核核糖体翻译)；用于APMV克隆的满足“六位规则”的转基因的引入；和沉默突变的包含以除去所述转基因内的外源基因端和/或基因起始序列。对于六位规则，本领域技术人员将理解APMV的有效复制(并且更一般地，副粘病毒科(paramyxoviridae)的大部分成员)取决于基因组长度是6的倍数，其被称为“六位规则”(参见，例如，Calain,P.&Roux,L.Therule of six,a basic feature of efficient replication of Sendai virusdefective interfering RNA.J.Virol.67,4822-4830(1993))。因此，当构建本文所述的重组APMV时，应小心以满足APMV克隆的“六位规则”。可以使用本领域技术人员已知的满足APMV克隆的六位规则的方法，如(例如)所述转基因下游核苷酸的添加。有关APMV(例如，重组APMV)的克隆和挽救的方法的讨论，参见，例如，Ayllon等人,Rescue of RecombinantNewcastle Disease Virus from cDNA.J.Vis.Exp.(80),e50830,doi:10.3791/50830(2013)，该文献以其全部内容作为参考并入本文
5.3 APMV的增殖
本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在允许病毒生长至允许本文所述的病毒使用的滴度的任何基底中增殖。在一个实施方式中，所述基底允许本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)。在具体的实施方式中，所述基底允许本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)生长至与对于相应野生型病毒所确定的那些相当的滴度。
本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在对病毒感染敏感的细胞(例如，禽类细胞、鸡细胞等)、含胚卵(例如，鸡蛋或鹌鹑蛋)或动物(例如，鸟)中生长。这些方法是本领域技术人员熟知的。在具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在癌细胞，例如，癌瘤细胞(例如，乳腺癌细胞和前列腺癌细胞)、肉瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和生殖细胞瘤细胞(例如，睾丸癌细胞和卵巢癌细胞)中增殖。在另一个具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在细胞系，例如，癌细胞系，如HeLa细胞、MCF7细胞、B16-F10细胞、CT26细胞、TC-1细胞、THP-1细胞、U87细胞、DU145细胞、Lncap细胞和T47D细胞中增殖。在某些实施方式中，细胞或细胞系(例如，癌细胞或癌细胞系)得自和/或来源于人。在另一个实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在鸡细胞或含胚卵中增殖。代表性的鸡细胞包括(但不限于)鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾细胞。在具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在IFN-缺陷型细胞(例如，IFN-缺陷型细胞系)中增殖。在具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在Vero细胞中增殖。在另一个具体的实施方式中，根据下文6节中所述的方法，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在癌细胞中增殖。在另一个具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在鸡蛋或鹌鹑蛋中增殖。在某些实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)首先在含胚卵中增殖，然后在细胞(例如，细胞系)中增殖。
本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在含胚卵中增殖，例如，6至14日龄，6至12日龄，6至10日龄，6至9日龄，6至8日龄，8日龄，9日龄，10日龄，8至10日龄，12日龄或者10至12日龄。初期或未成熟的含胚卵可以用于增殖本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)。未成熟的含胚卵涵盖了小于10日龄的卵，例如，IFN-缺陷型6至9日龄或6至8日龄的卵。未成熟的含胚卵还涵盖了人工模拟未成熟卵多至但小于10日龄的卵，这是由于生长条件改变所致，例如，孵化温度变化；用药物处理；或任何其它导致卵延迟发育的改变，从而使得与10-12日龄的卵相比，IFN系统未完全发育。在具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在8或9日龄的鸡含胚卵中增殖。在另一个具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在10日龄的鸡含胚卵中增殖。本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)可以在含胚卵的不同位置，例如，在尿囊腔中增殖。有关病毒生长和增殖的详细讨论，参见，例如，美国专利No.6,852,522和美国专利No.7,494,808，两者均以其全部内容作为参考并入本文。
在具体的实施方式中，本文提供了包含本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)的细胞(例如，细胞系)或含胚卵(例如，鸡含胚卵)。可以包含本文所述的APMV的细胞以及含胚卵的实例可见于上文。在具体的实施方式中，本文提供了用于增殖本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)的方法，所述方法包括培养APMV感染的基底(例如，细胞系或含胚卵)。在另一个具体的实施方式中，本文提供了用于增殖本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)的方法，所述方法包括：(a)培养APMV感染的基底(例如，细胞系或含胚卵)；和(b)从所述基底分离或纯化APMV。在某些实施方式中，这些方法包括在培养所述基底之前用APMV感染所述基底。有关可以用于增殖本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或本文所述的重组APMV)的方法，参见，例如，下文第6节。
对于病毒分离，通常可以通过熟知的净化方法，例如，如离心、深层过滤和微滤从含胚卵或细胞培养物除去并且从细胞组分分离本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)，并且可以根据需要，使用本领域技术人员熟知的程序，例如，切向流过滤(TFF)、密度梯度离心、微分萃取或色谱法进一步纯化。
在具体的实施方式中，本文提供了用于产生包含本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1和6节)的药物组合物(例如，免疫原性组合物)的方法，所述方法包括(a)使本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)在细胞(例如，细胞系)或含胚卵中增殖；和(b)从所述细胞或含胚卵分离APMV。所述方法还可以包括将APMV与药物可用的载体一起添加至容器。
在具体的实施方式中，根据第6节中所述的方法增殖、分离和/或纯化本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)。在具体的实施方式中，使用第6节中所述的方法，使本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者重组APMV；还参见，例如，5.1、6和7节)增殖、分离或纯化或者进行上述中的任意两个或全部。
5.4组合物和施用途径
本文涵盖了本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)在组合物中的使用。在具体的实施方式中，所述组合物是药物组合物。可以在治疗癌症的方法中使用所述组合物。
在一个实施方式中，药物组合物包含与药物可用的载体混合的本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)。在具体的实施方式中，APMV是本文所述的APMV-4。在其它实施方式中，APMV是本文所述的APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9。在具体的实施方式中，APMV是本文所述的重组APMV。在具体的实施方式中，APMV是包含包装的基因组的重组APMV-4，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种其它预防或治疗剂，如下文5.5.2节中所述。在具体的实施方式中，药物组合物在药物可用的载体中包含有效量的本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)和任选地一种或多种其它预防或治疗剂。在一些实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或本文所述的重组APMV)是包含在所述药物组合物中的唯一活性成分。
在另一个实施方式中，药物组合物(例如，肿瘤裂解物疫苗)包含与药物可用的载体混合的来自APMV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜片段制剂。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种其它预防或治疗剂，如下文5.5.2节中所述。在另一个实施方式中，药物组合物(例如，全细胞疫苗)包含与药物可用的载体混合的APMV感染的癌细胞。在一些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种其它预防或治疗剂，如下文5.5.2节中所述。
本文所提供的药物组合物可以处于允许所述组合物向对象施用的任何形式。在具体的实施方式中，所述药物组合物适合于兽医施用、人施用或两者。如本文所使用的，术语“药物可用的”表示联邦或州政府管理机构批准的或者美国药典或其它通常承认的药典中所列的在动物，并且更具体地在人中使用的。术语“载体”是指药物组合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，具体地用于可注射溶液。适合的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。适合的药物载体的实例描述于E.W.Martin主编的“Remington's PharmaceuticalSciences”。制剂应适合施用形式。
在具体的实施方式中，将药物组合物配制以适合于对象的预定施用途径。所述药物组合物可以配制用于向对象全身或局部施用。例如，所述药物组合物可以配制以适合于肠胃外、静脉内、动脉内、胸膜内、吸入、腹膜内、口服、皮内、结肠直肠、腹膜内、颅内和肿瘤内施用。在具体的实施方式中，可以将所述药物组合物配制用于静脉内、动脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、胸膜内、颅内、皮下、肌内、局部、肺部或肿瘤内施用。
在具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)的药物组合物配制以适合于向对象(例如，人对象)的肿瘤内施用。在具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV-4的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的肿瘤内施用。在其它具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的肿瘤内施用。在另一个具体的实施方式中，将包含本文所述的重组APMV的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的肿瘤内施用。
在具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)的药物组合物配制以适合于向对象(例如，人对象)的静脉内施用。在具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV-4的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的静脉内施用。在其它具体的实施方式中，将包含本文所述的APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的静脉内施用。在另一个具体的实施方式中，将包含本文所述的重组APMV的药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的静脉内施用。
在本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或本文所述的重组APMV)与另一种疗法组合施用的范畴中，可以将另一种疗法(例如，预防或治疗剂)在单独的药物组合物中施用。换言之，可以向对象施用两种不同的药物组合物以治疗癌症——一种药物组合物包含与药物可用的载体混合的本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或者本文所述的重组APMV)并且第二种药物组合物包含与药物可用的载体混合的另一种疗法(如，例如，下文5.5.2节中所述的)。可以将两种药物组合物配制用于向对象(例如，人对象)的相同施用途径或者向对象(例如，人对象)的不同施用途径。例如，可以将包含本文所述的APMV的药物组合物配制用于对象(例如，人对象)肿瘤的局部施用，而将包含另一种疗法(如，例如，下文5.5.2节中所述的)的药物组合物配制用于对象(例如，人对象)的全身施用。在一个具体实例中，包含本文所述的APMV的药物组合物可以配制用于对象(例如，人对象)的肿瘤内施用，而包含另一种疗法(如，例如，下文5.5.2节中所述的)的药物组合物配制用于对象(例如，人对象)的静脉内施用、皮下施用或另一种施用途径。在另一个实例中，包含本文所述的APMV的药物组合物和包含另一种疗法(如，例如，下文5.5.2节中所述的)的药物组合物可以均配制用于对象(例如，人对象)的静脉内施用。在某些实施方式中，将包含与本文所述的APMV或其组合物组合使用的疗法(如，例如，下文5.5.2节中所述的)的药物组合物配制用于通过批准的途径施用，如Physicans'Desk Reference,第71版(2017)中所述的。
5.5 APMV的使用
在一个方面，可以在癌症治疗中使用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物、本文所述的肿瘤裂解物或其组合物或者全细胞疫苗。在一个实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用有效量的本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。在另一个实施方式中，本文所述的肿瘤裂解物或全细胞疫苗可以用于治疗如本文所述的癌症。对于可以根据本文所述的方法治疗的癌症类型，参见5.5.4节，对于可以根据本文所述的方法治疗的患者类型，参见5.5.3节，并且对于根据本文所述的方法用于治疗癌症的示例性剂量和方案，参见5.5.1节。
在某些实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物是治疗癌症所施用的唯一活性成分。在具体的实施方式中，本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)是治疗癌症所施用的组合物中的唯一活性成分。
可以向对象局部或全身施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。例如，可以将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物肠胃外(例如，腹膜内、静脉内、动脉内、皮内、肌内或皮下)、瘤内、结节内、胸膜内、鼻内、腔内、颅内、口服、直肠、通过吸入或局部施用于对象。在具体的实施方式中，瘤内施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。图像-指导可以用于将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物施用于对象。在具体的实施方式中，静脉内施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。
在某些实施方式中，本文所述的方法包括对无治疗可用的癌症的治疗。在一些实施方式中，向对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物以作为其它常规疗法的替代治疗癌症。
在一个实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物和一种或多种其它疗法，如下文5.5.2节中所述的。在具体的实施方式中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的对象施用有效量的本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物和有效量的一种或多种其它疗法，如下文5.5.2节中所述的。在具体的实施方式中，将一种或多种疗法与本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物组合施用于对象以治疗癌症。在具体的实施方式中，目前使用、已使用其它疗法或者其它疗法已知在治疗癌症中是有用的。在另一个实施方式中，将本文所述的重组APMV(例如，以上5.1节和7节中所述的重组APMV)或其组合物与支持疗法、疼痛缓解疗法或对癌症不具有治疗效果的其它疗法组合施用于对象。在某些实施方式中，在相同组合物中施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)和一种或多种其它疗法。在其它实施方式中，在不同组合物中施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)和一种或多种其它疗法。可以将与一种或多种其它疗法(如本文在下文5.5.2节中所述的)组合的本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物用作根据本文所述的方法治疗癌症的任何线疗法(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)。
在某些实施方式中，向对象施用两种、三种或多种APMV(包括本文所述的一种、两种或更多种重组APMV)以治疗癌症。
在具体的实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法可以对对象产生有益效果，如癌症或其症状的发展或进展的减小、降低、减弱、减轻、稳定、缓解、遏止、抑制或终止。在某些实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法导致了以下效果中的至少一种、两种或更多种：(i)减轻或缓解癌症和/或与之相关的症状的严重程度；(ii)缩短与癌症相关的症状的持续时间；(iii)防止与癌症相关的症状的复发；(iv)癌症和/或与之相关的症状的消退；(v)减少对象住院；(vi)缩短住院时间；(vii)增加对象的存活期；(viii)抑制癌症和/或与之相关的症状的发展；(ix)增强或改善另一种疗法的治疗效果；(x)减少或消除癌细胞群体；(xi)使肿瘤或赘生物的生长降低；(xii)使肿瘤尺寸减小；(xiii)使肿瘤形成降低；(xiv)根除、去除或控制原发性、局限性和/或转移性癌症；(xv)使转移的数目或尺寸减小；(xvi)使死亡率降低；(xvii)使患者无癌症存活率增加；(xviii)使无复发存活期增加；(xix)处于缓解期的患者数增加；(xx)住院率降低；(xxi)在施用疗法后，肿瘤尺寸维持且尺寸不增加，或者肿瘤尺寸增加小于5％或10％，如通过本领域技术人员可获得的常规方法(如MRI、X-射线、CT扫描和PET扫描)所测量；(xxii)预防癌症和/或与之相关的症状的发展或发作；(xxiii)患者的缓解时间增加；(xxiv)使与癌症相关的症状数量减少；(xxv)癌症患者的无症状存活期增加；(xxvi)转移受限或缩小；(xxvii)整体存活期；(xxviii)无恶化存活期(如(例如)通过RECIST v1.1.所评价的)；(xxix)整体反应率；和/或(xxx)反应持续时间延长。在一些实施方式中，对象所接受的治疗/疗法不治愈癌症，但是预防疾病的发展或恶化。在某些实施方式中，本文所述的治疗癌症的方法不预防癌症的发病/发展，但是可以预防癌症症状的发生。技术人员已知的任何方法可以用于评价对象所接受的治疗/疗法。在具体的实施方式中，根据实体瘤反应评价标准(“RECIST”)公开规定评价治疗/疗法的效力。在具体的实施方式中，根据2000年2月所公开的RECIST规定(也称为“RECIST 1”)评价治疗/疗法的效力(参见，例如，Therasse等人,2000,Journal of National Cancer Institute,92(3):205-216，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。在具体的实施方式中，根据2009年1月所公开的RECIST规定(也称为“RECIST 1.1”)评价治疗/疗法的效力(参见，例如，Eisenhauer等人,2009,European Journal of Cancer,45:228-247，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。在具体的实施方式中，根据技术人员在评价时所使用的RECIST规定评价治疗/疗法的效力。在具体的实施方式中，根据免疫相关RECIST(“irRECIST”)公开规定评价效力(参见，例如，Bohnsack等人,2014,ESMO Abstract 4958，该文献以其全部内容作为参考并入本文)。在具体的实施方式中，根据技术人员在评价时所使用的irRECIST规定评价治疗/疗法的效力。在具体的实施方式中，通过肿瘤-相关血清标志物的降低来评价效力。
5.5.1剂量和频率
在癌症治疗中有效的本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物的量将取决于癌症性质、施用途径、对象的一般健康状况等，并且应根据开业医生的判断来决定。可以任选地使用标准临床技术，如体外测定来帮助鉴别剂量范围。然而，用于施用的本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组)的适合剂量范围一般为约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu并且最优选地为约104至约1012、106至1012、108至1012、109至1012或109至1011pfu，并且可以向对象施用一次、两次、三次、四次或更多次，间隔时间随需要而定。用于施用的肿瘤裂解物疫苗的剂量范围可以包括0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg至10.0mg、0.01mg至1.0mg、0.1mg至1mg和0.1mg至5.0mg，并且可以向对象施用一次、两次、三次或更多次，间隔时间随需要而定。用于施用的全细胞疫苗的剂量范围可以包括102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012个细胞，并且可以向对象施用一次、两次、三次或更多次，间隔时间随需要而定。在某些实施方式中，向对象施用与目前正在NDV的临床试验中使用的剂量类似的本文所述的APMV的剂量。
在某些实施方式中，作为单一剂量向对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组)或其组合物，然后在1至6周，1至5周，1至4周，1至3周，1至2周后施用第二剂量。根据这些实施方式，可以在第二接种后以3至6个月或6至12个月的间隔向所述对象施用加强接种。
在某些实施方式中，与一种或多种其它疗法，如下文5.5.2节中所述的疗法结合向对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组)或其组合物。另外一种或多种其它疗法的剂量将取决于多种因素，包括(例如)疗法、癌症性质、施用途径、对象的一般健康状况等，并且应根据医疗从业者的判断来决定。在具体的实施方式中，其它疗法的剂量是对于作为根据本文所公开的方法使用的单一试剂使用时，对所述疗法所推荐的疗法的施用剂量和/或频率。在其它实施方式中，其它疗法的剂量是对于作为根据本文所公开的方法使用的单一试剂使用时，比对所述疗法所推荐的低的剂量和/或包括较低的疗法施用频率。批准疗法的推荐剂量可见于Physicians'Desk Reference(例如，第71版，Physicians’Desk Reference(2017))。
在某些实施方式中，与一种或多种其它疗法的施用同时向对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物。在其它实施方式中，每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、2至4周、1至3周或1至2周向对象施用所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物，并且每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、1至3周或1至2周施用一种或多种其它疗法(如在下文第5.5.2节中所述的)。
5.5.2其它疗法
可以与本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物组合使用以治疗癌症的其它疗法包括(但不限于)小分子、合成药物、肽(包括环肽)、多肽、蛋白质、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸，包括(但不限于)反义核苷酸序列、三重螺旋、RNAi和编码生物学活性蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成或天然无机分子、模拟剂和合成或天然有机分子。在具体的实施方式中，其它疗法是化疗剂。在具体的实施方式中，可以与本文所述的肿瘤裂解物或全细胞疫苗组合使用本文所述的其它疗法。
在一些实施方式中，与放射疗法组合使用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物，所述放射疗法包括X射线、γ射线和其它辐射源破坏癌细胞的使用。在具体的实施方式中，作为外放射或远距疗法施用所述放射疗法，其中所述辐射是从远端源导入的。在其它实施方式中，作为内部疗法或其中放射源至于接近于癌细胞和/或肿瘤块的身体内部的短距离放射治疗施用所述放射疗法。
可以与本文所述的APMV或其组合物组合使用的抗癌剂的具体实例包括：激素类药剂(例如，芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)和雌激素受体拮抗剂)、化疗剂(例如，微管拆散阻滞剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂)、抗血管生成剂(例如，VEGF拮抗剂、受体拮抗剂、整合素拮抗剂、血管靶向剂(VTA)/血管破坏剂(VDA))、放射疗法和常规外科手术。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与免疫调节剂组合使用。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的APMV或本文所述的重组APMV)或其组合物与免疫细胞上存在的共刺激性受体的激动剂组合使用，如(例如)T-淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T-淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原-递呈细胞(例如，树突状细胞或巨噬细胞)或其组合物。共刺激性受体的具体实例包括糖皮质激素-诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、淋巴细胞毒素α(LTα)、LIGHT(淋巴细胞毒素样，显示出诱导型表达并且与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM，T淋巴细胞表达受体)、CD226、细胞毒和调控T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DR3)、淋巴细胞毒素-β受体(LTBR)、跨膜激活因子和CAML相互作用因子(TACI)、B细胞-激活因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。在具体的实施方式中，共刺激性分子的激动剂结合至细胞上的受体(例如，GITR、ICOS、OX40、CD70、4-1BB、CD40、LIGHT等)并触发或提高一个或多个信号转导通路。在具体的实施方式中，共刺激性受体的激动剂是结合至共刺激性受体并且引起或提高一个或多个信号转导通路的抗体或配体。在某些实施方式中，所述激动剂有利于共刺激性受体及其配体之间的相互作用。在某些实施方式中，共刺激性受体的激动剂是结合至糖皮质激素-诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、淋巴细胞毒素α(LTα)、LIGHT(淋巴细胞毒素样，显示出诱导型表达并且与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM，T淋巴细胞表达受体)、CD226、细胞毒和调控T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DR3)、淋巴细胞毒素-β受体(LTBR)、跨膜激活因子和CAML相互作用因子(TACI)、B细胞-激活因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)的抗体(例如，单克隆抗体)。在具体的实施方式中，共刺激性受体的激动剂是结合至4-1BB或OX40的抗体(例如，单克隆抗体)。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与免疫细胞上存在的抑制性受体的拮抗剂组合使用，如(例如)T-淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T-淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原-递呈细胞(例如，树突状细胞或巨噬细胞)或其组合物。抑制性受体的具体实例包括细胞毒T-淋巴细胞-相关抗原4(CTLA-4或CD52)、细胞程序死亡蛋白1(PD-1或CD279)、B和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白-样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、CD160、腺苷酸A2a受体(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞-相关免疫球蛋白-样受体1(LAIR1)和CD160。在具体的实施方式中，所述拮抗剂抑制所述抑制性受体的作用但不引起自身生物反应。在具体的实施方式中，所述拮抗剂是结合至免疫细胞上的抑制剂受体的抗体或配体，并且阻断或减弱受体与一个或多个其配体的结合。在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是特异性结合至抑制性受体的配体并且阻断所述配体与抑制性受体的结合并转导抑制信号的抗体或可溶性受体。抑制性受体的配体的具体实例包括PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9和腺苷酸。抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。
在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是特异性结合至抑制性受体的配体并且阻断所述配体与抑制性受体的结合并转导抑制信号的可溶性受体。在某些实施方式中，所述可溶性受体是抑制性受体的片段(例如，抑制性受体的胞外域)。在一些实施方式中，可溶性受体是包含抑制性受体的至少一部分(例如，天然抑制性受体的胞外域)和异源氨基酸序列的融合蛋白。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含抑制性受体的至少一部分和免疫球蛋白的Fc部分或其片段。在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是LAG3-Ig融合蛋白(例如，IMP321)。
在另一个实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是特异性结合至抑制性受体的配体并且阻断所述配体与抑制性受体的结合并转导抑制信号的抗体。抑制性受体的配体的具体实例包括PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9和腺苷酸。抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。在具体的实施方式中，所述拮抗剂是结合至PD-L1或PD-L2的抗体。
在另一个实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是结合至抑制性受体并且阻断抑制性受体与一个、两个或更多个其配体的结合的抗体。在具体的实施方式中，抗体与抑制性受体的结合不转导抑制信号或阻断抑制信号。抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。抑制性受体的抗体的具体实例是抗-CTLA-4抗体(Leach DR等人Science 1996；271:1734-1736)。在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是CTLA-4的拮抗剂，如(例如)普利木单抗或者曲美木单抗(Tremelimumab)。
在某些实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是PD-1的拮抗剂，如(例如)纳武单抗(MDX-1106或者BMS-936558)、派姆单抗(MK3475)、匹利珠单抗(pidlizumab)(CT-011)、AMP-224(PD-L2融合蛋白)、阿替利珠单抗(Atezoliuzumab)(MPDL3280A；抗-PD-L1单克隆抗体)、阿维鲁单抗(Avelumab)(抗-PD-L1单克隆抗体)或者MDX-1105(抗-PD-L1单克隆抗体)。在某些实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是LAG3的拮抗剂，如(例如)IMP321。
在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是阻断PD-1及其配体(PD-L1和PD-L2)之间的相互作用的抗-PD-1抗体。结合至PD-1的抗体的非限制性实例包括派姆单抗(
Figure BDA0002976913420000461
参见，例如，Hamid等人,N Engl J Med.2013；369:134-44和FullPrescribing Information for KEYTRUDA,参考文献ID：3862712)、纳武单抗(
Figure BDA0002976913420000462
Figure BDA0002976913420000463
参见，例如，Topalian等人,N Engl J Med.2012；366:2443-54和Full PrescribingInformation for OPDIVO(nivolumab),参考文献ID:3677021)和MEDI0680(也称为“AMP-514”；参见，例如，Hamid等人,Ann Oncol.2016；27(suppl_6):1050PD)。在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是抗-PD1抗体(例如，派姆单抗)。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与检查点抑制剂组合使用。在具体的实施方式中，检查点抑制剂可以是结合至T细胞上存在的抑制性受体的抗体，如PD-1、CTLA-4、LAG-3或TIM-3。在另一个具体的实施方式中，检查点抑制剂可以是结合至T细胞上存在的抑制性受体，如PD-1、CTLA-4、LAG-3或TIM-3并且阻断抑制性受体与其配体的结合的抗体。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与如本文所述的或本领域技术人员已知的阻断PD1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或两者)的结合的抗-PD1抗体或其组合物组合使用。在具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与抗-PD-L1抗体(例如，本文所述的或者本领域技术人员已知的抗-PD-L1抗体)或其组合物组合使用。在具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与抗-PD-L2抗体(例如，本文所述的或者本领域技术人员已知的抗-PD-L2抗体)或其组合物组合使用。在具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与RIG-1激动剂(例如，聚-dA-dT(或者称为聚(脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸)钠盐))或其组合物组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与MDA-5激动剂或其组合物组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与NOD1/NOD2激动剂(例如，MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-mDAP)或其组合物组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与化疗剂或其组合物组合使用。在一些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与抗-肿瘤剂、烷化剂、抗代谢物、植物-来源的抗-肿瘤试剂、激素疗法剂、局部异构酶抑制剂、喜树碱衍生物、激酶抑制剂、靶向药物、抗体、干扰素或生物反应调节物或者上述一种或多种的组合组合使用。烷化剂包括(例如)氮芥N-氧化物、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、六甲蜜胺、阿帕兹醌(apaziquone)、brostallicin、苯达莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡磷酰胺(glufosfamide)、异环磷酰胺、马磷酰胺、苯达莫司汀和二溴卫矛醇；和铂-配位烷化化合物，如(例如)顺铂、卡铂、依铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂或赛特铂。抗代谢物包括(例如)甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤核糖核苷、巯嘌呤、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、替加氟、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐、依诺他滨、吉西他滨、氟达拉滨、5-阿扎胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、地西他滨、依氟鸟氨酸、乙炔基胞苷、阿糖胞苷、羟基脲、美法仑、奈拉滨、诺拉曲特、十八烷基磷酸盐(ocfosfite)、培美曲塞二钠、喷司他丁、吡利曲索、雷替曲塞、triapine、三甲曲沙、阿糖腺苷、长春新碱和长春瑞滨。激素疗法剂包括(例如)依西美坦、亮丙瑞林(Lupron)、阿那曲唑、度骨化醇、法倔唑、福美坦、11β-羟甾醇脱氢酶1抑制剂、17-α羟化酶/17,20裂解酶抑制剂，如阿比特龙乙酸盐、5-α还原酶抑制剂，如非那雄胺(Bearfina)和依立雄胺、抗-雌激素，如枸橼酸它莫西芬和氟维司群、曲普瑞林(Trelstar)、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、来曲唑或抗-雄激素，如比卡鲁胺、氟他胺、米非司酮、尼鲁米特、康士得(Casodex)或抗-黄体酮及其组合。
植物-来源的抗-肿瘤物质包括(例如)选自有丝分裂抑制剂，例如埃博霉素，如沙戈匹隆、伊沙匹隆或埃博霉素B、长春碱、长春氟宁、多西他赛和紫杉醇的那些。细胞毒性拓扑异构酶抑制剂包括(例如)阿柔比星、氨萘非特、贝洛替康、喜树碱、10-羟喜树碱、9-氨基喜树碱、二氟替康、伊立替康(Camptosar)、edotecahn、表柔比星(Ellence)、依托泊苷、依喜替康、吉马替康、勒托替康、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生琼、卢比替康、索布佐生、他氟泊苷和拓扑替康及其组合。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与干扰素或其组合物组合使用。干扰素包括(例如)干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-la和干扰素γ-1b。在一些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与L19-IL2或其它L19衍生物、非格司亭、蘑菇多糖、西佐喃、TheraCys、乌苯美司、阿地白介素、阿仑珠单抗、BAM-002、达卡巴嗪、达昔单抗(daclizumab)、地尼白介素-2、吉妥珠单抗奥唑米星、替伊莫单抗、咪喹莫特、来格司亭、蘑菇多糖、黑素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭、沙格司亭、他索纳明、替西白介素、胸腺素、托西莫单抗、维如利金、依帕珠单抗、米妥莫单抗、奥戈伏单抗、培妥莫单抗或普列威(Provenge)组合使用。
在一些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与生物反应调节剂组合使用，所述生物反应调节剂是改变生物机体的防御机制或生物反应，如组织细胞的存活、生长或分化以指导它们具有抗-肿瘤活性的试剂。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组)或其组合物与生物反应调节剂，如云芝多糖、蘑菇多糖、西佐喃、溶链菌、ProMune或乌苯美司组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与促凋亡试剂，如YM155、AMG 655、APO2L/TRAIL或CHR-2797组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与抗血管生成化合物，如(例如)阿维A、阿柏西普、血管阻断素、aplidine、爱善达(asentar)、阿西替尼、西地尼布(Recentin)、贝伐单抗、丙氨酸布立尼布、西仑吉肽、考布他丁、DAST、内皮抑素、芬维A胺、卤夫酮、帕唑帕尼、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞马司他(rebimastat)、卡妥索单抗(removab)、雷利米得(Revlimid)、索拉非尼、瓦他拉尼、角鲨胺、舒尼替尼、替拉替尼、沙利度胺、乌克雷恩(ukrain)或Vitaxin组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与铂-配位化合物，如(例如)顺铂、卡铂、奈达铂、沙铂或奥沙利铂组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与喜树碱衍生物，如(例如)喜树碱、10-羟喜树碱、9-氨基喜树碱、伊立替康、依地卡林(edotecarin)或拓扑替康组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、替西木单抗、普利木单抗、鲁昔单抗、卡妥索单抗、阿塞西普；奥戈伏单抗或阿仑珠单抗组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与VEGF抑制剂，如(例如)索拉非尼、DAST、贝伐单抗、舒尼替尼、西地尼布(Recentin)、阿西替尼、阿柏西普、替拉替尼、丙氨酸布立尼布、瓦他拉尼、帕唑帕尼或兰尼单抗(ranibizumab)组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与EGFR(HER1)抑制剂，如(例如)西妥昔单抗、帕尼单抗、维克替比、吉非替尼、厄洛替尼或凡德他尼(Zactima)组合使用。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与HER2抑制剂，如(例如)拉帕替尼、曲妥珠单抗或帕妥珠单抗组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与mTOR抑制剂，如(例如)替西罗莫司、西罗莫司/雷帕霉素或依维莫司组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与cMet抑制剂组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与PI3K-和AKT抑制剂组合使用。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与CDK抑制剂，如罗斯维汀(Roscovitine)或黄酮吡醇(flavopiridol)组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与纺锤体组装检查点抑制剂、靶向抗-有丝分裂药或两者组合使用。靶向抗-有丝分裂药的实例是PLK抑制剂和极光激酶(Aurora)抑制剂，如橙皮苷(Hesperadin)、检查点激酶抑制剂和KSP抑制剂。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与HDAC抑制剂，如(例如)帕比司他、伏立诺他、MS275、贝利司他或LBH589组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与HSP90抑制剂、HSP70抑制剂或两者组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与蛋白酶体抑制剂，如(例如)硼替佐米或卡非佐米组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如(例如)MEK抑制剂或Raf抑制剂，如索拉非尼组合使用。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与法呢基转移酶抑制剂，例如，替吡法尼组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与酪氨酸激酶抑制剂，如(例如)达沙替尼、尼罗替尼、DAST、博舒替尼、索拉非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、AZD2171、阿西替尼、阿柏西普、替拉替尼、伊马替尼甲磺酸盐、丙氨酸布立尼布、帕唑帕尼、兰尼单抗(ranibizumab)、瓦他拉尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、维克替比、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或c-Kit抑制剂组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与维生素D受体激动剂或Bcl-2蛋白抑制剂，如(例如)奥巴克拉(obatoclax)、奥利默森钠和棉酚组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与分化簇20受体拮抗剂，如(例如)利妥昔单抗组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与核糖核苷酸还原酶抑制剂，如(例如)吉西他滨组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与拓扑异构酶I和II抑制剂，如(例如)Camptosar(伊立替康)或多柔比星组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与肿瘤坏死细胞凋亡诱导配体受体1激动剂，如(例如)马帕木单抗组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与5-羟色胺受体拮抗剂，如(例如)rEV598、扎利罗登(Xaliprode)、帕洛诺司琼盐酸盐、格拉司琼、Zindol、帕洛诺司琼盐酸盐或AB-1001组合使用。
在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与整合素抑制剂，如(例如)α-5β-1整合素抑制剂，如E7820、JSM6425、伏洛昔单抗(volociximab)或内皮抑素组合使用。在具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与雄激素受体拮抗剂，如(例如)癸酸诺龙、氟甲睾酮、氟甲睾酮、Android、Prost-aid、安卓姆斯汀(Andromustine)、比卡鲁胺、氟他胺、阿普环丙孕酮、阿普氟他胺、氯地孕酮、比卡鲁胺、环丙氯地孕酮、Tabi、醋酸赛普罗特博、环丙孕酮片剂或尼鲁米特组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与芳香酶抑制剂，如(例如)阿那曲唑、来曲唑、睾内酪、依西美坦、氨鲁米特或福美坦组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与基质金属蛋白酶抑制剂组合使用。在另一个具体的实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物与阿利维A酸、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦、贝沙罗汀、硼替佐米、波生坦、骨化三醇、依昔舒林(exisulind)、非那雄胺、福莫司汀、伊班膦酸、米替福新、米托蒽醌、L-天冬酰胺酶、丙卡巴肼、达卡巴嗪、羟基脲、羟基脲、培门冬酶、喷司他丁、他扎罗汀(tazarotne)、万珂(velcade)、硝酸镓、坎磷酰胺(Canfosfamide)、达雷那新(darinaparsin)或者维甲酸组合使用。
现用的癌症疗法及它们的剂量、施用途径和推荐用法在本领域中是已知的并且描述于文献中，如Physicians'Desk Reference(第71版,2017)。
5.5.3患者群体
在一些实施方式中，向患有癌症的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在其它实施方式中，向易患癌症或对癌症敏感的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在一些实施方式中，向诊断患有癌症的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。本文描述了癌症类型的具体实例(参见，例如，第5.5.4节和第6节)。在一个实施方式中，对象患有转移性癌症。在另一个实施方式中，所述对象患有1期、2期、3期或4期癌症。在另一个实施方式中，所述对象处于症状缓解中。在另一个实施方式中，所述对象具有癌症复发。
在某些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于0至6个月、6至12个月、6至18个月、18至36个月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁的人。在一些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于人婴儿。在其它实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于人学步幼儿。在其它实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于人儿童。在其它实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于成年人。在其它实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于老年人。
在某些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法施用于处于免疫缺失状态或免疫抑制状态或者处于变成免疫缺失或免疫抑制的风险中的对象。在某些实施方式中，向接受免疫抑制疗法或由于免疫抑制疗法恢复的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在某些实施方式中，向患有癌症或具有患癌风险的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在某些实施方式中，所述对象进行、将进行或已进行了手术、化疗和/或放射疗法。在某些实施方式中，所述患者已进行手术以除去肿瘤或赘生物。在具体的实施方式中，在手术除去肿瘤或赘生物后，向患者施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在其它实施方式中，在进行手术除去肿瘤或赘生物之前，向患者施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。在某些实施方式中，向患有、将患有或已患有组织移植、器官移植或输血的对象施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。
在一些实施方式中，将本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或本文所述的组合疗法施用于已证明对除APMV或其组合物或者组合疗法以外的疗法难治疗，但是不再进行这些疗法的患者。在具体的实施方式中，向已证明对化疗难治疗的患者施用本文所述的APMV(例如，天然存在的或本文所述的重组APMV)或其组合物或者本文所述的组合疗法。可以通过本领域中已知的任何方法做出癌症是否难治疗的确定。在某些实施方式中，难治疗的患者是对标准疗法难治疗的患者。在一些实施方式中，癌症患者一开始对疗法起反应，但随后变得难治疗。
5.5.4癌症类型
根据本文所述的方法可以治疗的癌症的具体实例包括(但不限于)黑素瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤和癌瘤。在一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是白血病，如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，如髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病和脊髓发育不良综合征。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是慢性白血病，如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是淋巴瘤，如霍奇金病和非霍奇金病。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是多发性骨髓瘤，如冒烟型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是华氏巨球蛋白血症、意义未明的单克隆丙种球蛋白病、良性单克隆丙种球蛋白病、威尔姆氏瘤或重链病。
在一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是骨癌、脑癌、乳腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、垂体癌、眼癌、阴道癌、外阴癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、肺癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、口腔癌、基底细胞癌、唾液腺癌、咽癌、皮肤癌、肾癌或膀胱癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是脑癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肝癌、肾癌或皮肤癌。
在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是骨和结缔组织肉瘤，如骨肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软-组织肉瘤、血管肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤或滑膜肉瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是脑肿瘤，如神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、非神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤或原发性脑淋巴瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是乳腺癌，如三阴乳腺癌、ER+/HER2-乳腺癌、导管癌、腺癌、小叶(癌细胞)癌、管内癌、髓样乳腺癌、乳腺粘液腺癌、乳腺小管癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病或炎性乳腺癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肾上腺癌，如嗜铬细胞瘤或肾上腺皮质癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是甲状腺癌，如乳头状或滤泡性甲状腺癌、髓样甲状腺癌或者未分化甲状腺癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是胰腺癌，如胰岛瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素-分泌肿瘤或者类癌瘤或胰岛细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是垂体癌，如库兴氏病、促乳激素-分泌肿瘤、肢端肥大症或尿崩症。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是眼癌，如眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤、睫状体黑素瘤或成视网膜细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌或黑素瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是外阴癌，如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤或佩吉特病。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是宫颈癌，如鳞状细胞癌或腺癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是子宫癌，如子宫内膜癌或子宫肉瘤。
在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是卵巢癌，如卵巢上皮癌、交界瘤、生殖细胞瘤或间质瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是食道癌，如鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌或燕麦细胞(癌细胞)癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是胃癌，如腺癌、蕈状(息肉状)、溃疡形成、浅表面扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤或癌肉瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肝癌，如肝细胞癌或肝胚细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是胆囊癌，如腺癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肝胆管型肝癌，如乳头状、结节性和弥散性。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肺癌，如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大-细胞癌或癌-细胞肺癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是睾丸癌，如生殖细胞肿瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精子细胞、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌或绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是前列腺癌，如前列腺上皮内瘤样病变、腺癌、平滑肌肉瘤或横纹肌肉瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是阴茎癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是口腔癌，如鳞状细胞癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是唾液腺癌，如腺癌、粘液表皮样癌或腺样囊性癌。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是咽癌，如鳞状细胞癌或疣状。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是皮肤癌，如基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、雀斑痣样恶性黑素瘤或肢端雀斑痣样黑素瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肾癌，如肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤或移行细胞癌(肾盂和/或子宫)。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是膀胱癌，如移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌或癌肉瘤。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是黑素瘤。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是肺癌。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是结肠直肠癌。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、尿路上皮癌、高微卫星不稳定性癌、胃癌或宫颈癌。
在具体的实施方式中，本文所述的APMV或其组合物或者本文所述的组合疗法在多种癌症和异常增殖性疾病的治疗中是有用的，其包括(但不限于)下列：癌瘤，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝脏、肺、卵巢、胰脏、胃、宫颈、甲状腺和皮肤；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤；髓系谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性粒性白血病和早幼粒细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和许旺氏细胞瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarama)和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。
在一些实施方式中，根据本文所述的方法治疗了与细胞凋亡中的畸变有关的癌症。这些癌症可以包括(但不限于)滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌症、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤和癌前病变，如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合征。在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗恶性肿瘤或增殖异常变化(如组织变形和发育异常)或者皮肤、肺、肝脏、骨、脑、胃、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰腺、卵巢、子宫的过度增殖病症或者上述病症的任意组合。在其它具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗肉瘤或黑素瘤。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。根据本文所述的方法可以治疗的白血病和其它血源性癌症的具体实例包括(但不限于)急性淋巴母细胞性白血病“ALL”、急性淋巴母细胞B-细胞白血病、急性淋巴母细胞T-细胞白血病、急性髓母细胞性白血病“AML”、急性早幼粒细胞白血病“APL”、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性未分化白血病、慢性粒细胞性白血病“CML”、慢性淋巴细胞性白血病“CLL”和毛细胞白血病。
根据本文所述的方法可以治疗的淋巴瘤的具体实例包括(但不限于)霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤，如弥漫性大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病和脾大性红细胞增多。
在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是实体瘤。根据本文所述的方法可以治疗的实体瘤的实例包括(但不限于)纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、咽喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、癌细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是转移性的。在另一个实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是恶性的。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是具有不良预后和/或对常规疗法，如化疗和放疗反应不良的癌症。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是恶性黑色素瘤、恶性神经胶质瘤、肾细胞癌、胰腺腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌、肺小细胞癌、肺鳞状细胞癌、未分化甲状腺癌或头颈鳞状细胞癌。在另一个具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是在下文第6节中描述的癌症类型。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是转移性癌症。在具体的实施方式中，所述癌症包括皮肤、皮下或结节转移。在具体的实施方式中，所述癌症包括腹膜或胸膜转移。在具体的实施方式中，所述癌症包括内脏器官转移，如肝脏、肾、脾脏或肺转移。
在具体的实施方式中，根据本文所述的方法治疗的癌症是不可切除的癌症。可以使用技术人员已知的任何方法来确定癌症是否不可切除。
5.6生物测定
在具体的实施方式中，第6节中所述的一种、两种或更多种测定可以用于鉴别本文所述的APMV。
5.6.1体外测定
病毒测定包括使用在本领域中熟知的方法在体外间接测量培养细胞中的病毒复制(如(例如)通过蚀斑形成所确定的)或病毒蛋白质生产(如(例如)通过免疫印迹分析所确定的)或病毒RNA(如(例如)通过RT-PCR或RNA印迹分析所确定的)的那些。
本文所述的APMV的生长可以通过本领域中已知的或者本文所述的任何方法来评价(例如，在细胞培养物中(例如，鸡胚肾细胞的培养物或鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的培养物)(参见，例如，第6节)。通过将本文所述的重组APMV的连续稀释物接种到细胞培养物(例如，CEF、MDCK、EFK-2细胞、Vero细胞、原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞系或HeLa细胞)、鸡胚或活的动物(例如，禽类)中，可以确定病毒滴度。在将病毒培育指定的时间之后，使用标准方法分离病毒。病毒滴度的物理定量可以使用应用于病毒上清液的PCR(Quinn&Trevor，1997；Morgan等人，1990)、血细胞凝集测定、组织培养感染剂量(TCID50)或蛋感染剂量(EID50)来进行。在下文第6节中描述了评价病毒滴度的示例性方法。
可以通过本领域中已知的或者本文所述的任何方法(例如，在细胞培养物、动物模型或含胚卵中的病毒培养物中)评价编码异源肽或蛋白质的核苷酸序列的引入(例如，进入本文所述的APMV的基因组的转基因)。例如，使用本领域中熟知的方法，来自含胚卵的尿囊液的细胞培养物的病毒颗粒可以通过蔗糖夹层离心进行纯化，并随后通过免疫印迹分析蛋白表达。
基于免疫荧光的方法也可以用于检测病毒和评价病毒生长。这些方法是本领域技术人员熟知的，例如，荧光显微镜术和流式细胞术(参见，例如，下文第6节)。用于流式细胞术的方法是可用的，包括荧光激活细胞分选术(FACS)(参见，例如，Owens等人,(1994)FlowCytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。用作(例如)诊断试剂的适合于修饰核酸的荧光试剂，包括核酸引物和探针、多肽和抗体是可用的(Molecular Probesy(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。参见，例如，下文第6节中所述的测定。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(主编)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人,(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。对于可以使用的组织学和免疫组织化学测定，还参见下文第6节。
5.6.2干扰素测定
可以使用本领域技术人员已知的技术确定本文所述的APMV的IFN诱导和释放。例如，在感染本文所述的重组APMV之后，可以使用免疫分析(例如，ELISA或免疫印迹测定)来确定细胞中诱导的IFN的量，以测量IFN表达或测量由IFN诱导其表达的蛋白质的表达。作为另外一种选择，可以通过本领域技术人员已知的测定，如RNA印迹和定量RT-PCR在RNA水平测量诱导的IFN的量。在具体的实施方式中，可以使用ELISPOT测定测量释放的IFN的量。此外，可以通过(例如)免疫测定或ELISPOT测定在蛋白水平上确定和/或定量RT-PCR或RNA印迹在RNA水平上确定细胞因子和/或干扰素-刺激的基因的诱导和释放。
5.6.3激活标志物测定和免疫细胞浸润测定
可以评价通过APMV诱导的免疫细胞的T细胞标志物、B细胞标志物、激活标志物、共刺激分子、配体或抑制性分子的表达。评价免疫细胞的T细胞标志物、B细胞标志物、激活标志物、共刺激分子、配体或抑制性分子的表达的技术是本领域技术人员已知的。例如，可以通过流式细胞术评价免疫细胞的T细胞标志物、B细胞标志物、激活标志物、共刺激分子、配体或抑制性分子的表达。
5.6.4毒性研究
在一些实施方式中，在哺乳动物，优选地人细胞系中测试了本文所述的APMV或其组合物或者本文所述的组合疗法的细胞毒性。在某些实施方式中，在一种或多种以下细胞系的非限制性实例中评价了细胞毒性：U937，人单核细胞细胞系；原代周围血单核细胞(PBMC)；Huh7，人肝胚细胞瘤细胞系；HL60细胞、HT1080、HEK 293T和293H、MLPC细胞、人胚肾细胞系；人黑素瘤细胞系，如SkMel2、SkMel-119和SkMel-197；THP-1，单核细胞；HeLa细胞系；和成神经细胞瘤细胞系，如MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y和BE(2)-C。在一些实施方式中，将ToxLite测定用于评价细胞毒性。
本领域熟知的多种测定可以用于评价本文所述的APMV或其组合物感染后细胞或细胞系的存活力，并因此确定APMV或其组合物的细胞毒性。例如，可以通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入、(3H)胸腺嘧啶核苷掺入，通过直接细胞计数或通过检测已知基因，如原癌基因(例如，fos，myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、细胞周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)在转录、翻译或活性方面的变化来测定细胞增殖。可以通过本领域中熟知的任何方法确定这种蛋白和mRNA的水平和活性。例如，可以使用抗体，包括可商购的抗体，通过已知的免疫诊断方法，如ELISA、免疫印迹或免疫沉淀定量蛋白。可以使用本领域熟知的和常规的方法定量mRNA，例如，使用northern分析、RNA酶保护或与反转录结合的聚合酶链反应。可以通过使用台盼蓝染色或本领域已知的其它细胞死亡或生存力标志物来评价细胞生存力。在具体的实施方式中，测量细胞ATP水平来确定细胞生存力。在优选的实施方式中，本文所述的APMV或其组合物不杀死健康(即非癌性)细胞。
在具体的实施方式中，可以使用本领域中的标准测定，如测量胞内ATP水平的CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)，在三天和七天的时间段内测量细胞生存力。细胞ATP的降低是细胞毒性作用的指示。在另一个具体的实施方式中，可以在中性红吸收测定中测量细胞存活力。在其它实施方式中，形态变化的目视观察可以包括膨大、粒度、具有粗糙边缘的细胞、薄膜外观、圆化、从孔表面脱离或其它改变。
可以在动物模型中测试本文所述的APMV或其组合物或组合疗法的体内毒性。例如，本领域中已知的测试化合物对癌症的影响的动物模型也可以用于确定本文所述的APMV或其组合物或组合疗法的体内毒性。例如，向动物施用一定范围的pfu的本文所述的APMV，并且随后，随时间监测动物的多种参数，如以下中的一种、两种或更多种：致死率、体重减轻或体重增加不足和可以指示组织损伤的血清标志物水平(例如，作为一般组织损伤的指标的肌酸磷酸激酶水平，作为可能的肝损伤的指标的谷草转氨酶或丙酮酸转氨酶水平)。这些体内测定也可以适合于测试除了剂量之外的多种施用方式和方案的毒性。
可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序确定本文所述的APMV或其组合物或本文所述的组合疗法的毒性、效力或两者。在具体的实施方式中，通过下文第6节中所述的方法确定APMV的细胞毒性。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制在对象中使用的一定范围的剂量的疗法。
5.6.5生物活性测定
可以使用用于治疗癌症的动物模型测试本文所述的APMV或其组合物或者本文所述的组合疗法的生物活性。(参见，例如，第6节)。这些动物模型系统包括(但不限于)大鼠、小鼠、仓鼠、棉鼠、鸡、牛、猴(例如，非洲绿猴)、猪、狗、兔等。在具体的实施方式中，将如下文第6节中所述的动物模型用于测试APMV或其组合物治疗癌症的用途。
5.6.6转基因的表达
可以使用本领域中已知的任何测定实施蛋白在本文所述的重组APMV感染的细胞中的表达(其中所述重组APMV包括包装的基因组，其包含编码异源蛋白质的转基因)，如(例如)免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术和ELISA或者本文所述的任何测定(参见，例如，第6节)。
在具体的方面，使用ELISA检测包含含有所述转基因的包装的基因组的重组APMV感染的细胞中的转基因所编码的异源蛋白质的表达。
还可以通过本领域技术人员已知的测定，如RNA印迹和定量RT-PCR在RNA水平测量转基因的表达。
除转基因的表达之外，可以通过本领域技术人员已知的技术评价转基因编码的蛋白的功能。例如，可以使用本领域技术人员已知的技术评价本文所述的或本领域技术人员已知的蛋白的一种或多种功能。
5.7试剂盒
在一个方面，本文提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的组合物(例如，药物组合物)的一种或多种成分。在具体的实施方式中，本文提供了包含容器的药物包装或试剂盒，其中所述容器包含本文所述的APMV(例如，AMP-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9)，或者包含本文所述的APMV(例如，AMP-2、APMV-3、APMV-4、APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9)的药物组合物。在具体的实施方式中，本文提供了包含容器的药物包装或试剂盒，其中所述容器包含本文所述的APMV-4或者包含本文所述的APMV-4的药物组合物。在某些实施方式中，所述药物包装或试剂盒包含第二容器，其中所述第二容器包含其它预防或治疗剂，如(例如)第5.5.2节中所述。任选的，与这种容器相关的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，所述注意事项反映了所述制造、使用或销售机构批准用于人施用。在具体的实施方式中，所述药物包装或试剂盒包括APMV或其组合物用于癌症治疗的使用说明书。
5.8序列
表2.APMV序列
Figure BDA0002976913420000571
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表3：异源序列
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表6：其它序列
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6.实施例：禽副粘病毒的抗-肿瘤性质
本实施例证实了使用APMV株(特别是，APMV-4株)治疗癌症的效力。具体地，本实施例证实APMV-4鸭/香港/D3/1975(Duck/Hong Kong/D3/1975)的使用导致在多种肿瘤的不同动物模型中产生了统计学显著的抗-肿瘤活性。
6.1材料&方法
6.1.1细胞系、抗体及其它试剂。
将B16-F10(小鼠皮肤黑素瘤细胞；ATCC Cat#CRL-6475，2016)、TC-1(肺癌；JohnsHopkins University,Baltimore,MD)和CT26(鼠科结肠癌；ATCC Cat#CRL-2639，2016)维持在补充有10％FBS(胎牛血清)和2％青霉素和链霉素的DMEM或RPMI培养基中。在购买后制成B16-F10、CT26和TC-1种源细胞库，并在每个实验步骤中融化早期传代细胞。一旦培养，则将细胞维持不超过8周以确保基因型的稳定性并通过显微镜监测。通过位于西奈山(MtSinai,Mount Sinai Hospital,New York,NY)的伊坎医学院(Icahn School of Medicine)的比较医学和手术中心实施对种源细胞库的体内实验所要求的IMPACT测试。将减血清培养基Opti-MEMTM(gibcotm)用作体外病毒感染培养基。先前描述了抗NDV的兔多克隆血清[14]。禽副粘病毒血清型-特异的抗血清(类型-2471-ADV、类型-3 473-ADV、类型-4 475-ADV、类型-6 479-ADV、类型-7 481-ADV、类型-8 483-ADV和类型-9 485-ADV，2017)购自美国农业部(USDA,Ames,IA)国家兽医服务实验室。山羊抗-鸡，Alexa-缀合的第二抗体(Alexa-568,A-11041)来自Thermo Fisher。Hoechst 33258核染色剂购自Invitrogen(Molecular Probes,Eugene,OR)。CellTiter-FluorTM细胞存活力测定(G608)购自Promega。
6.1.2病毒。
内部生产了修饰的新城疫病毒LaSota-L289A并已将其作为治疗载体进行了测试[43]。APMV原型APMV-2鸡/加利福尼亚州/尤卡帕/1956(Chicken/California/Yucaipa/1956)(171ADV9701)、APMV-3火鸡/威斯康星州/1968(turkey/wisconsin/1968)(173ADV9701)、APMV-4鸭/香港/D3/1975(Duck/Hong Kong/D3/1975)(175ADV0601)、APMV-6鸭/香港/199/1977(Duck/Hong Kong/199/1977)(176ADV8101)APMV-7鸽/田纳西州/4/1975(Dove/Tennessee/4/1975)(181ADV8101)、APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)(无；10/27/1986)和APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/NewYork/22/1978)(185ADV 0301)得自美国农业部(USDA,Ames,IA)国家兽医服务实验室。病毒原液在鸡含胚卵中增殖8或9天，并从尿囊液中完全纯化。使用鸡血(Lampirelaboratories)进行血细胞凝集测定(HA)以计算病毒滴度。
6.1.3体外细胞存活力测定。
将B16-F10细胞在96孔皿中以80％汇合培养并以指明的病毒的1PFU/个细胞的MOI感染。感染后1h除去病毒混悬液并将细胞在100ml补充DMEM中培育。感染后24小时，将相等体积的CellTiter-FluorTM试剂(100m1)加入至每个孔中并随后在37℃，在限制光条件下培育细胞1小时。使用Synergy H1酶标仪(BioTek)记录每个样品所产生的荧光(400nmEx/505nmEm波长)。参考空-感染细胞(阴性对照)的存活力计算存活率。存活率(％)＝[Fluor505nm感染-样品/Fluor505nm空-感染样品]×100。
6.1.4荧光显微术。
对于间接免疫荧光染色，将在96-孔标准板中接种的细胞以1PFU/细胞的MOI在Opti-MEMTM中感染1h，然后除去接种物并用100ml DMEM-FBS-P/S更换。感染后20小时，将细胞在2.5％多聚甲醛中固定15分钟。使用0.2％Triton-PBS进行细胞-膜透性化，并在PBS1％BSA中封闭1h。将一抗与样品在室温下培育1h。在使用EVOS FL细胞成像系统(ThermoFisher)成象前，将第二抗体(山羊抗-鸡Alexa Fluor 568、山羊抗-兔Alexa Fluor 488；购自Invitrogen，USA)以1:1000稀释使用45分钟。
6.1.5同基因肿瘤模型。
在所有体内研究中所使用的BALBc和C57/BL6J雌性小鼠4-6周购自JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME)。将2.5×105个细胞的B16-F10、TC-1和CT26细胞悬液(在100μl PBS中)皮内植入每只C57BL/6(黑素瘤和肺癌)或BALBc(结肠癌)小鼠右后腿的侧面。7-10天后，通过肿瘤内注射5×106PFU的所指明的病毒或PBS治疗小鼠。每24小时施用肿瘤内注射，总计施用4个治疗剂量。当上次体积估计接近1000mm3的实验终点时，每48小时或每24小时监测肿瘤体积。在体积超过预定终点时，将小鼠人道地安乐死。使用数字卡尺确定肿瘤测量并且使用公式：肿瘤体积(V)＝L×W2计算总体积，其中L或肿瘤长度是较大直径，并且W或肿瘤宽度是较小直径。
6.1.6统计分析。
通过单因素方差分析(Dunnett多重比较检验)确定三个样品的结果之间的统计显著性。将结果表示为平均值和标准偏差(SD)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验对同基因肿瘤模型进行存活曲线比较。
6.2结果
6.2.1 APMV在B16-F10鼠科黑素瘤癌细胞系中的感染性和细胞毒性
评价了所选择的代表性APMV株(表4)感染B16-F10鼠科黑素瘤癌细胞的能力。将B16-F10单层对含有2×105ffu/ml的每种所选病毒的病毒混悬液(相当于MOI或感染复数为1)暴露超过20小时。将先前鉴定的弱毒LaSota病毒(APMV-1血清型)用作感染性的阳性参考，并且将空-感染细胞用作阴性对照。培育20小时后，处理样品以通过免疫染色检测病毒抗原在感染细胞中的存在。在用所选APMV处理的所有样品中检测阳性荧光信号(图1A)，从而表明除NDV以外，鼠科B16-F10癌细胞系对禽副粘病毒属(avian avulavirus)的感染的敏感性。
为了评价通过不同血清型所获得的细胞毒性作用，以1的MOI感染B16-F10单层并培育24小时。如上所述定量存活力的损失。样品的荧光分析显示仅APMV-9和-4原型能够将细胞存活力降低至与LaSota病毒类似的程度，然而其余所测试的株未在感染后24小时在细胞存活力中显示出相关影响(图1B)。
表4：研究中所包括的APMV血清型和原型病毒
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表5中详细显示了研究中所包括的所选的APMV在鸡中的病原性。
表5：与研究中所包括的所选的APMV有关的病原性
Figure BDA0002976913420001752
Figure BDA0002976913420001761
6.2.2 APMV在同基因鼠科黑素瘤模型中的体内抗-肿瘤活性
将B16-F10鼠科黑素瘤细胞皮内植入C57BL/6雌性小鼠右后腿侧面。使肿瘤生长10天，然后用总计4剂量的5×106PFU的La Sota-L289A或APMV原型，或者对于对照小鼠用PBS每隔一天(第0、2、4和6天；每个处理组n＝5)瘤内治疗动物。将先前鉴定的LaSota-L289A病毒(APMV-1血清型)用作抗-肿瘤活性的阳性参考，并且将PBS空-治疗组用作肿瘤生长的对照。每48小时或每24小时监测肿瘤体积，直至接近1,000mm3的实验终点，然后使小鼠安乐死。图2A显示了在指定时间点各个小鼠的肿瘤体积。图2B显示了在指定时间点每个实验组的平均肿瘤体积。除APMV-9以外，当与PBS治疗组相比，在治疗早期，将禽副粘病毒属原型的施用控制在一定程度的肿瘤生长。仅3个禽副粘病毒属血清型发挥出长抗-肿瘤活性：APMV-7、APMV-8和APMV-4。与对照相比，APMV-7和-8治疗组显示出与参考LaSota-L289A病毒类似的速度的肿瘤生长延迟和存活延长。当与参考LaSota-L289A病毒相比时，APMV-4治疗小鼠显示出严重的肿瘤生长抑制和统计学显著的存活期增加(图2C)。误差线对应于每个组的标准偏差。(*，p<0.03)。
6.2.3 APMV在同基因鼠科结肠癌模型中的溶瘤能力。
将CT26细胞植入BALBc小鼠右后腿侧面。从肿瘤细胞系注射后7天开始，用总计4剂量的5×106PFU的La Sota-L289A或APMV原型，或者对于对照小鼠用PBS每隔一天(第0、2、4和6天；每个处理组n＝5)瘤内治疗动物。每48小时并且然后每24小时监测肿瘤体积，直至接近1,000mm3的实验终点，然后使小鼠安乐死。图3A显示了在指定时间点各个小鼠的肿瘤生长。图3B显示了在指定时间点每个处理组的平均肿瘤体积。鼠科结肠癌对APMV引起的-疗法比以上所讨论的黑素瘤模型更敏感。当与空治疗PBS组相比时，如通过肿瘤生长控制和存活延长所证明的，所有APMV-治疗组显示出有益的临床反应(图3A和3B)。此外，除APMV-3和APMV-7以外，用所选的APMV病毒株的治疗在每个处理组中的至少一只动物中引起了完全的肿瘤症状缓解(CR)。APMV-4和APMV-8组显示出所测试株的最佳治疗反应，其中施用APMV-4的5只小鼠中有4只小鼠显示出完全肿瘤症状缓解，而施用APMV-8的5只小鼠中有3只小鼠显示出完全肿瘤症状缓解(图3C)。
在实验第130天，通过在左后腿侧面(对侧)皮内注射5×105个CT26细胞来再激发无肿瘤存活者。如图3D所示，APMV-4再激发的小鼠(4只中的4只)以及LS-L289A'单一存活者显示出对结肠癌发展的完全保护，其持续长期存活研究的程度(300天)。在APMV-6、APMV-8和APMV-9实验组内，在3只再激发小鼠中的1只中观察到对侧肿瘤发展。在APMV-2治疗组中未观察到对再激发的保护。
6.2.4 APMV-4在同基因鼠科肺癌模型中的溶瘤能力。
将TC-1细胞植入C57BL/6小鼠右后腿侧面。从肿瘤细胞系注射后10天开始，用总计4剂量的5×106PFU的La Sota-L289A或鸭/香港/D3/1975(Duck/Hong Kong/D3/1975)，或者对于对照小鼠用PBS每隔一天(第0、2、4和6天；每个处理组n＝5)瘤内治疗动物。每48小时并且然后每24小时监测肿瘤体积，直至接近1,000mm3的实验终点，此时使小鼠安乐死。图4A显示了在指定时间点各个小鼠的肿瘤生长。图4B显示了在指定时间点每个处理组的平均肿瘤体积。图4C中显示了所治疗的具有TC-1肿瘤的小鼠的整体存活期(**，p<0.03)。这些数据表明当与LaSota-L289A APMV-1株和空PBS治疗组相比时，使用APMV-4鸭/香港/D3/1975株(Duck/Hong Kong/D3/1975strain)的治疗导致抗肿瘤反应提高。在这种难治性肿瘤模型中，对APMV-4溶瘤疗法的反应的特征在于统计学显著的肿瘤生长控制和存活延长。
6.2.5背景技术(第2节)和第6节中所引用的参考文献
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7.编码人IL-12的重组APMV-4的发展
改变APMV-4/鸭/香港/D3/1975株(APMV-4/Duck/Hong Kong/D3/1975 strain)P-M基因间区(APMV-4基因组的cDNA序列的残基2932-2938)中的核苷酸序列CATCGA(SEQ IDNO：52)以形成Mlu I限制性位点(ACGCGT(SEQ ID NO：32))。将包含Mlu I限制性位点、Kozak序列(CCGCCACC(SEQ ID NO：33))、编码人IL-12蛋白的核苷酸序列(例如，包含SEQ ID NO：16或17所示的核苷酸序列的转基因)和核苷酸CCC的转基因插入APMV-4株的P和M基因(P-M基因间区；2979至3013的34nt)之间。对于编码IL-12蛋白的核苷酸序列使用SEQ ID NO：16实施该方法导致了包含包装的基因组的重组APMV-4的产生。具体地，产生了包含包装的基因组的重组APMV-4-hIL-12，其中所述包装的基因组包含从SEQ ID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA(或者由其组成)。
8.实施方式
本文提供了以下示例性实施方式：
1.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的禽副粘病毒血清型4(APMV-4)，其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
2.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用重组APMV-4，其中所述重组APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
3.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，APMV-4的施用降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
4.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
5.根据实施方式4所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
6.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，APMV-4的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
7.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDVLaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
8.根据实施方式7所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
9.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，APMV-4的施用降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
10.根据实施方式1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDVLaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
11.根据实施方式10所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
12.根据实施方式1至11中任一项所述的方法，其中将APMV-4瘤内施用于人对象。
13.根据实施方式1至12中任一项所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述APMV-4。
14.包含包装的基因组的重组APMV-4，其中所述包装的基因组包括转基因，所述转基因包括编码白介素-12(IL-12)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-15(IL-15)受体alpha(IL-15Ra)-IL-15、人乳头状瘤病毒(HPV)-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的核苷酸序列，并且其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
15.根据实施方式14所述的重组APMV-4，其中所述转基因插入在所述包装的基因组的AMPV-4M和P转录单元之间。
16.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-12的核苷酸序列。
17.根据实施方式16所述的重组APMV-4，其中编码IL-12的核苷酸序列包含从SEQID NO：16或17所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
18.根据实施方式16所述的重组APMV-4，其中所述APMV-4的包装的基因组包含从SEQ ID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA。
19.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-2的核苷酸序列。
20.根据实施方式19所述的重组APMV-4，其中编码IL-2的核苷酸序列包含从SEQID NO：15所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
21.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。
22.根据实施方式21所述的重组APMV-4，其中编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
23.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码GM-CSF的核苷酸序列。
24.根据实施方式23所述的重组APMV-4，其中编码GM-CSF的核苷酸序列包含从SEQID NO：21所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
25.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。
26.根据实施方式25所述的重组APMV-4，其中所述编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
27.根据实施方式14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。
28.根据实施方式27所述的重组APMV-4，其中所述编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
29.根据实施方式14至17或者19至28中任一项所述的重组APMV-4，其中所述重组APMV-4包含APMV-4鸭/香港/D3/1975株(Duck/Hong Kong/D3/1975strain)主链。
30.根据实施方式14至17或者19至28中任一项所述的重组APMV-4，其中所述重组APMV-4包含APMV-4鸭/中国/G302/2012株(Duck/China/G302/2012strain)主链、APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)主链；APMV4海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4Uriah-aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)主链、APMV4/埃及鹅/南非/NJ468/2010株(APMV4/Egyptian goose/southAfrica/NJ468/2010strain)主链或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010strain)主链。
31.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的禽副粘病毒血清型8(APMV-8)，其中所述APMV-8在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
32.根据实施方式31所述的方法，其中所述APMV-8是APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)。
33.根据实施方式31或32所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，所述APMV-8的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
34.根据实施方式31或32所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，所述APMV-8的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDVLaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
35.根据实施方式34所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
36.包含包装的基因组的重组APMV，其中所述包装的基因组包括转基因，所述转基因包括编码白介素-12(IL-12)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-15(IL-15)受体alpha(IL-15Ra)-IL-15、人乳头状瘤病毒(HPV)-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的核苷酸序列，并且其中所述重组APMV在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7，并且所述重组APMV包括APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9主链。
37.根据实施方式36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-8主链。
38.根据实施方式37所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)主链。
39.根据实施方式36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-7主链。
40.根据实施方式39所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-7鸽/田纳西州/4/1975(Dove/Tennessee/4/1975)主链。
41.根据实施方式36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-6主链。
42.根据实施方式41所述的重组APMV，其中所述APMV包含所述APMV-6鸭/香港/199/1977(Duck/Hong Kong/199/1977)主链。
43.根据实施方式36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-9主链。
44.根据实施方式43所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)主链。
45.根据实施方式36至44中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因插入在所述APMV包装的基因组的AMPV M和P转录单元之间。
46.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-12的核苷酸序列。
47.根据实施方式46所述的重组APMV，其中编码IL-12的核苷酸序列包含从SEQ IDNO：16或17所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
48.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-2的核苷酸序列。
49.根据实施方式48所述的重组APMV，其中编码IL-2的核苷酸序列包含从SEQ IDNO：15所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
50.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。
51.根据实施方式50所述的重组APMV，其中编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
52.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码GM-CSF的核苷酸序列。
53.根据实施方式52所述的重组APMV，其中编码GM-CSF的核苷酸序列包含从SEQID NO：21所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
54.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。
55.根据实施方式54所述的重组APMV，其中所述编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
56.根据实施方式36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。
57.根据实施方式56所述的重组APMV，其中所述编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
58.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用根据实施方式14至30中任一项所述的重组APMV-4。
59.根据实施方式58所述的方法，其中将所述重组APMV-4瘤内施用于人对象。
60.根据实施方式58或59所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述重组APMV-4。
61.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用根据实施方式36至57中任一项所述的重组APMV。
62.根据实施方式61所述的方法，其中将所述重组APMV瘤内施用于人对象。
63.根据实施方式61或62所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述重组APMV。
64.根据实施方式31至35中任一项所述的方法，其中将所述APMV-8瘤内施用于人对象。
65.根据实施方式31至35或64中任一项所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述APMV-8。
66.治疗癌症的方法，其包括施用天然存在的禽副粘病毒血清型6(APMV-6)或9(APMV-9)，其中所述APMV-6或APMV-9在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
67.根据实施方式66所述的方法，其中所述APMV-6是APMV-6鸭/香港/199/1977(Duck/Hong Kong/199/1977)。
68.根据实施方式66所述的方法，其中所述APMV-9是APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)。
69.根据实施方式66、67或68所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，所述APMV-6或APMV-9的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
70.根据实施方式66、67或68所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，所述APMV-6或者APMV-9的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
71.根据实施方式70所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
72.根据实施方式1至13，31至35或58至71中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、结肠癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或乳腺癌。
73.根据实施方式1至13，31至35或58至72中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
74.根据实施方式1至13，31至35或58至73中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的。
75.根据实施方式1至13，31至35或58至74中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用检查点抑制剂。
76.根据实施方式1至13，31至35或58至75中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用特异性结合至PD-1并且阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合的单克隆抗体。
本文所述的具体实施方式不限制本发明的范围。的确，除了所述那些之外，根据上述描述和附图，本发明的多种修改将对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文所引用的所有参考文献以与每个单个专利公开或专利或专利申请具体且单独表明出于所有目的以其全部作为参考并入的相同程度以其全部内容并且出于所有目的作为参考并入本文。
序列表
<110> 西奈山伊坎医学院 （ICAHN SCHOOL OF MEDICINE AT MOUNT SINAI）
<120> APMV及其用于治疗癌症的用途
<130> 6923-282-888
<140>
<141>
<150> 62/697,944
<151> 2018-07-13
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14904
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 2
<400> 1
accaaacaag gaataggtaa gcaacgtaaa tcttagataa aaccatagaa tccgtggggg 60
cgacatcgcc tgaagccgat ctcgagatcg ataactccgg ttaattggtc tcagcgtgag 120
gagcttatct gtctgtggca atgtcttctg tgttttcaga ataccaggct cttcaggacc 180
aactggtcaa gcctgccact cgaagggctg atgtggcatc gactggattg ttgagagcgg 240
agataccagt ttgtgtaacc ttgtctcagg acccaactga tagatggaac ctcgcatgtc 300
tcaatctgcg atggctgata agtgagtcct ctactactcc catgagacaa ggggcgatcc 360
tgtcactgct gagcttgcac tctgacaaca tgcgagctca cgcaaccctt gcagcgagat 420
ccgctgatgc tgccatcact gtgcttgagg ttgacgccat agacatggcg gatggcacaa 480
tcacttttaa tgccagaagt ggagtatccg agaggcgcag cacacagctc atggcaatcg 540
caaaagatct gccccgctct tgttccaatg actcaccatt caaagatgac actatcgagg 600
atcgcgaccc ccttgacctg tccgagacta tcgatagact gcaggggatt gctgcccaaa 660
tctggatagc ggccatcaag agcatgactg ccccggatac tgctgcggag tcagaaggca 720
agaggcttgc aaagtaccaa caacaaggcc gcttggtgcg acaggtgtta gtgcatgatg 780
cggtgcgtgc ggaattccta cgtgtcatca gaggcagcct ggtcttacgg caattcatgg 840
tatcagaatg taagagggca gcatccatgg gtagcgagac atctaggtac tatgccatgg 900
tgggtgacat cagcctctac atcaagaatg caggacttac cgccttcttc ttgacactca 960
gatttggtat tgggacacac taccccactc ttgccatgag tgtgttctct ggagaactga 1020
agaagatgtc gtccttgatc aggctgtata agtcaaaagg ggaaaatgct gcatacatgg 1080
cattcctgga ggatgcggac atgggaaact ttgcgcctgc taactttagt actctctact 1140
cctatgcaat gggggtaggt acagtgctgg aagcatcagt tgcgaaatac cagttcgctc 1200
gagagttcac cagtgagaca tacttcaggc ttggggttga gaccgcacag aaccaacagt 1260
gcgctctaga tgaaaagacc gccaaggaga tggggcttac tgatgaagcc agaaagcagg 1320
tgcaagcatt ggctagcaac atcgagcagg ggcaacattc aatgcccatg caacaacagc 1380
ccacattcat gagtcagccc taccaggatg acgatcgtga ccagccaagc accagcagac 1440
cagagccaag accatcgcaa ttgacaagcc aatcagcagc acaggacaat gatgcggcct 1500
cattagattg gtgaccgcaa tcagctcagc caagccattg ttggacgcag gacattcaaa 1560
tcatacattg ccctaagagt attaaagtga tttaagaaaa aaggaccctg ggggcgaagt 1620
tgtcccaatc caggcaggcg ctgaaaccga atccctccaa cctccgagcc ccaggcgacc 1680
atggagttca ccgatgatgc cgaaattgct gagctgttgg acctcgggac ctcagtgatc 1740
caagagctgc agcgagccga agtcaagggc ccgcaaacaa ccggaaagcc caaagttccc 1800
ccggggaaca ctaagagcct ggctactctc tgggagcatg agactagcac ccaagggagt 1860
gcattgggca cacccgagaa caacacccag gcacccgatg acaacaacgc aggtgcagat 1920
acgccagcga ctaccgacgt ccatcgcact ctggatacca tagacaccga cacaccaccg 1980
gaagggagca agcccagctc cactaactcc caacccggtg atgaccttga caaggctctt 2040
tcgaagctag aggcgcgcgc caagctcgga ccagataggg ccagacaggt taaaaagggg 2100
aaggagatcg ggtcgagcac agggacgagg gaggcagcca gtcaccacat ggaagggagc 2160
cgacagtcgg agccaggagc gggcagccga gcacagccac aaggccatgg cgaccgggac 2220
acaggaggga gtactcattc atctctcgag atgggagact ggaagtcaca agctggtgca 2280
acccagtctg ctctcccatt agaagcgagc ccaggagaga aaagtgcaca tgtggaactt 2340
gcccagaatc ctgcatttta tgcaggcaac ccaactgatg caattatggg gttgacaaag 2400
aaagtcaatg atctagagac aaaattggct gaggtattgc gtctgttagg aatactcccc 2460
ggaataaaga atgagattag tcagctgaaa gcaaccgtgg ctctgatgtc aaatcagatt 2520
gcctccattc agattcttga tcctgggaat gccggagtca aatcccttaa tgagatgaaa 2580
gccctgtcaa aagcagccag catagttgtg gcaggtccag gagtccttcc tcctgaggtc 2640
acagaaggag gactgatcgc gaaagatgag ctagcaaggc ccatccccat ccaaccgcaa 2700
cgagactcca aacccaaaga cgacccgcac acatcaccaa atgatgtcct tgctgtacgc 2760
gctatgatcg acacccttgt ggatgatgag aagaagagaa agagattaaa ccaggccctt 2820
gacaaggcaa agaccaagga tgacgtctta agggtcaagc ggcagatata caatgcctag 2880
gagtccattt gtctaaagaa cctccaatca tatcaccagt ttcgtgccac atgcttccct 2940
gccgagaatc tagccgacac aaaaactaaa tcatagttta acaaaaaaga agtttggggg 3000
cgaagtctca catcatagag cacccttgca ttctaaaatg gctcaaacaa ccgtcaggct 3060
gtatatcgat gaagctagtc ccgacattga actgttgtct tacccactga taatgaaaga 3120
cacaggacat gggaccaaag agttgcagca gcaaatcaga gttgcagaga tcggtgcatt 3180
gcagggaggg aagaatgaat cagttttcat caatgcatat ggctttgttc agcaatgcaa 3240
agttaaaccg ggggcaaccc aattcttcca ggtagatgca gctacaaagc cagaagtggt 3300
cactgcaggg atgattataa tcggtgcagt caagggggtg gcaggcatca ctaagctggc 3360
agaagaggtg ttcgagctgg acatctccat caagaagtcc gcatcattcc atgagaaggt 3420
tgcggtgtcc tttaatactg tgccactatc actcatgaat tcgaccgcat gcagaaatct 3480
gggttatgtc acaaacgctg aggaggcgat caaatgcccg agcaaaatac aagcgggtgt 3540
gacgtacaaa tttaagataa tgtttgtctc cttgacacga ctgcataacg ggaaattgta 3600
ccgtgtcccc aaggcagtgt atgctgtaga ggcatcagct ctatataaag tgcaactgga 3660
agtcgggttc aagcttgacg tggccaagga tcacccacac gttaagatgt tgaagaaagt 3720
ggaacggaat ggtgagactc tgtatcttgg ttatgcatgg ttccacctgt gcaacttcaa 3780
gaagacaaat gccaagggtg agtcccggac aatctccaac ctagaaggga aagtcagagc 3840
tatggggatc aaggtttcct tgtacgactt atgggggcct actttggtgg tgcaaatcac 3900
aggtaagacc agcaagtatg cacaaggttt cttttcaacc acaggtacct gctgcctccc 3960
agtgtcgaag gctgcccctg agctggccaa acttatgtgg tcctgcaatg caacaatcgt 4020
tgaagctgca gtgattatcc aagggagtga taggagggca gtcgtgacct cagaggactt 4080
ggaagtatac ggggcagttg caaaagagaa gcaggctgca aaaggatttc acccgttccg 4140
caagtgacac gtggggccgc acacctcatt accccagaag cccgggcaac tgcaaattca 4200
cgcttatata atccaattac catgatctag aactgcaatc gatactaatc gctcattgat 4260
cgtattaaga aaaaacttaa ctacataact tcaacattgg gggcgacagc tccagactaa 4320
gtgggtggct aagctctgac tgataaggaa tcatgaatca agcactcgtg attttgttgg 4380
tatctttcca gctcggcgtt gccttagata actcagtgtt ggctccaata ggagtagcta 4440
gcgcacagga gtggcaactg gcggcatata caacgaccct cacagggacc atcgcagtga 4500
gatttatccc ggtcctgcct gggaacctat caacatgtgc acaggagacg ctgcaggaat 4560
ataatagaac tgtgactaat atcttaggcc cgttgagaga gaacttggat gctctcctat 4620
ctgacttcga taaacctgca tcgaggttcg tgggcgccat cattgggtcg gtggccttgg 4680
gggtagcaac agctgcacaa atcacagccg ccgtggctct caatcaagca caagagaatg 4740
cccggaatat atggcgtctc aaggaatcga taaagaaaac caatgcggct gtgttggaat 4800
tgaaggatgg acttgcaacg actgctatag ctttggacaa agtgcaaaag tttatcaatg 4860
atgatattat accacagatt aaggacattg actgccaggt agttgcaaat aaattaggcg 4920
tctacctctc cttatactta acagagctta caactgtatt tggttctcag atcactaatc 4980
ctgcattatc aacgctctct taccaggcgc tgtacagctt atgtggaggg gatatgggaa 5040
agctaactga gctgatcggt gtcaatgcaa aggatgtggg atccctctac gaggctaacc 5100
tcataaccgg ccaaatcgtt ggatatgacc ctgaactaca gataatcctc atacaagtat 5160
cttacccaag tgtgtctgaa gtgacaggag tccgggctac tgagttagtc actgtcagtg 5220
tcactacacc aaaaggagaa gggcaggcaa ttgttccgag atatgtggca cagagtagag 5280
tgctgacaga ggagttggat gtctcgactt gtaggtttag caaaacaact ctttattgta 5340
ggtcgattct cacacggccc ctaccaactt tgatcgccag ctgcctgtca gggaagtacg 5400
acgattgtca gtacacaaca gagataggag cgctatcttc gagattcatc acagtcaatg 5460
gtggagtcct tgcaaactgc agagcaattg tgtgtaagtg tgtctcaccc ccgcatataa 5520
taccacaaaa cgacattggc tccgtaacag ttattgactc aagtatatgc aaggaagttg 5580
tcttagagag tgtgcagctt aggttagaag gaaagctgtc atcccaatac ttctccaacg 5640
tgacaattga cctttcccaa atcacaacgt cagggtcgct ggatataagc agtgaaattg 5700
gtagcattaa caacacagtt aatcgggtcg acgagttaat caaggaatcc aacgagtggc 5760
tgaacgctgt gaacccccgc cttgtgaaca atacgagcat catagtcctc tgtgtccttg 5820
ccgccctgat tattgtctgg ctaatagcgc tgacagtatg cttctgttac tccgcaagat 5880
actcagctaa gtcaaaacag atgaggggcg ctatgacagg gatcgataat ccatatgtaa 5940
tacagagtgc aactaagatg tagagaggtt gaataagcct aaacatgata tgatttaaga 6000
aaaaattgga aggtgggggc gacagcccat tcaatgaagg gtgtacactc caacttgatc 6060
ttgtgacttg atcatcatac tcgaggcacc atggatttcc catctaggga gaacctggca 6120
gcaggtgaca tatcggggcg gaagacttgg agattactgt tccggatcct cacattgagc 6180
ataggtgtgg tctgtcttgc catcaatatt gccacaattg caaaattgga tcacctggat 6240
aacatggctt cgaacacatg gacaacaact gaggctgacc gtgtgatatc tagcatcacg 6300
actccgctca aagtccctgt caaccagatt aatgacatgt ttcggattgt agcgcttgac 6360
ctacctctgc agatgacatc attacagaaa gaaataacat cccaagtcgg gttcttggct 6420
gaaagtatca acaatgtttt atccaagaat ggatctgcag gcctggttct tgttaatgac 6480
cctgaatatg caggggggat cgctgtcagc ttgtaccaag gagatgcatc tgcaggccta 6540
aatttccagc ccatttcttt aatagaacat ccaagttttg tccctggtcc tactactgct 6600
aagggctgta taaggatccc gaccttccat atgggccctt cacattggtg ttactcacat 6660
aacatcattg catcaggttg ccaggatgcg agccactcca gtatgtatat ctctctgggg 6720
gtgctgaaag catcgcagac cgggtcgcct atcttcttga caacggccag ccatctcgtg 6780
gatgacaaca tcaaccggaa gtcatgcagc atcgtagcct caaaatacgg ttgtgatatc 6840
ctatgcagta ttgtgattga aacagagaat gaggattata ggtctgatcc ggctactagc 6900
atgattatag gtaggctgtt cttcaacggg tcatacacag agagcaagat taacacaggg 6960
tccatcttca gtctattctc tgctaactac cctgcggtgg ggtcgggtat tgtagtcggg 7020
gatgaagccg cattcccaat atatggtggg gtcaagcaga acacatggtt gttcaaccag 7080
ctcaaggatt ttggttactt cacccataat gatgtgtaca agtgcaatcg gactgatata 7140
cagcaaacta tcctggatgc atacaggcca cctaaaatct caggaaggtt atgggtacaa 7200
ggcatcctat tgtgcccagt ttcactgaga cctgatcctg gctgtcgctt aaaggtgttc 7260
aataccagca atgtgatgat gggggcagaa gcgaggttga tccaagtagg ctcaaccgtg 7320
tatctatacc aacgctcatc ctcatggtgg gtggtaggac tgacttacaa attagatgtg 7380
tcagaaataa cttcacagac aggtaacaca ctcaaccatg tagaccccat tgcccataca 7440
aagttcccaa gaccatcttt caggcgagat gcgtgtgcga ggccaaacat atgccctgct 7500
gtctgtgtct ccggagttta tcaggacatt tggccgatca gtacagccac caataacagc 7560
aacattgtgt gggttggaca gtacttagaa gcattctatt ccaggaaaga cccaagaata 7620
gggatagcaa cccagtatga gtggaaagtc accaaccagc tgttcaattc gaatactgag 7680
ggagggtact caaccacaac atgcttccgg aacaccaaac gggacaaggc atattgtgta 7740
gtgatatcag agtacgctga tggggtgttc ggatcataca ggatcgttcc tcagcttata 7800
gagattagaa caaccaccgg taaatctgag tgatgcatca atcctaaatt ggaatgacca 7860
atcaaaagct acgtagtgtc taacagcatt gcgaagcctg gtttaagaaa aaacttgggg 7920
gcgaatgccc atcaaccatg gatcaaactc aagctgacac tataatacaa cctgaagtcc 7980
atctgaattc accacttgtt cgcgcaaaat tggttcttct atggaaattg actgggttac 8040
ctttgccgtc tgatttgaga tcatttgtac taactacaca tgcagctgat gaccaaatcg 8100
caaaaaatga gactaggatc aaggccaaaa ttaattccct aatcgataac ttaatcaaac 8160
actgcaaggc aaggcaagtg gcactttcag ggttgacacc tgtcgtacat ccaacaactc 8220
tacagtggtt gctatccatc acatgtgaac gagcagacca ccttgcaaaa gtacgcgaga 8280
aatcagttaa gcaagcaatg tcagagaagc aacacgggtt tagacatctc ttttcggcag 8340
taagtcatca gttagttgga aacgccacac tgttctgtgc acaagactct agcaccgtga 8400
atgtcgactc tccttgctca tcaggttgtg agaggctgat aatagactct attggagcct 8460
tacaaacacg atggacaaga tgtaggtggg cttggcttca cattaaacag gtaatgagat 8520
accaggtgct tcagagtcgc ctacacgctc atgccaattc tgttagcaca tggtctgagg 8580
cgtgggggtt cattgggatc acaccagata tagtccttat tgtagactat aagagcaaaa 8640
tgtttactat cctgaccttc gaaatgatgc tgatgtattc agatgtcata gagggtcgtg 8700
ataatgtggt agctgtagga agtatgtcac caaacctaca gcctgtggtg gagaggattg 8760
aggtgctgtt tgatgtagtg gacaccttgg cgaggaggat tcatgatcct atttatgatc 8820
tggttgctgc cttagaaagc atggcatacg ctgccgtcca attgcacgat gctagtgaga 8880
cacacgcagg ggaattcttt tcgttcaatt tgacagaaat agagtccact cttgccccct 8940
tgctggatcc tggccaagtc ctatcggtga tgaggactat cagttattgt tacagtgggc 9000
tatcgcctga ccaagctgca gagttgctct gtgtgatgcg cttatttgga caccctctgc 9060
tctccgcaca acaagcagcc aaaaaagtcc gggagtctat gtgtgcccct aaactgttag 9120
agcatgatgc aatactgcaa actctatctt tcttcaaggg aatcataatc aatggctaca 9180
ggaaaagtca ttctggagta tggcctgcaa ttgacccaga ttctatagtg gacgatgacc 9240
ttagacagct gtattacgag tcggcagaaa tttcacatgc tttcatgctt aagaaatatc 9300
ggtaccttag tatgattgag ttccgcaaga gcatagagtt tgacttaaat gatgacctga 9360
gcacattcct taaagacaaa gcaatctgca ggccaaaaga tcaatgggca cgcatcttcc 9420
ggaaatcatt gttcccttgc aaaacgaacc ttggcactag tatagatgtt aaaagtaatc 9480
gactgttgat agattttttg gagtcacatg acttcaatcc tgaggaagaa atgaagtatg 9540
tgactacgct agcatacctg gcagataatc aattctcagc atcatattca ctgaaggaga 9600
aagagatcaa gactactggc cggatcttcg ccaaaatgac caggaaaatg aggagctgtc 9660
aagtaatatt ggaatcacta ttgtccagtc acgtctgcaa attctttaag gagaacggtg 9720
tgtcaatgga acaactgtct ttgacaaaga gcttgcttgc aatgtcacag ttagcaccca 9780
ggatatcttc agttcgccag gcgacagcac gtagacagga cccaggactc agccactcta 9840
atggttgtaa tcacattgta ggagacttag gcccacacca gcaggacaga ccggcccgga 9900
agagtgtagt cgcaaccttc cttacaacag atcttcaaaa atattgcttg aattggcgat 9960
atgggagtat caagcttttc gcccaagcct taaaccagct attcggaatc gagcatgggt 10020
ttgaatggat acacctgaga ctgatgaata gcaccctgtt tgtcggggac ccattctcgc 10080
ctcctgaaag caaagtgctg agtgatcttg atgatgcgcc caattcagac atatttatcg 10140
tgtccgccag aggggggatt gaagggttat gccagaagct gtggaccatg atttcaataa 10200
gcataatcca ttgcgtggct gagaagatag gagcaagggt tgcggcgatg gttcagggag 10260
ataatcaggt aattgcaatc acgagagagc tgtataaggg agagacttac acgcagattc 10320
agccggagtt agatcgatta ggcaatgcat tttttgctga attcaaaaga cacaactatg 10380
caatgggaca taatctgaag cccaaagaga caatccaaag tcaatcattc tttgtgtatt 10440
cgaaacggat tttctgggaa gggagaattc ttagtcaagc actgaagaat gctaccaaac 10500
tatgcttcat tgcagatcac ctcggggata atactgtctc atcatgcagc aatctagcct 10560
ctacgataac ccgcttggtt gagaatgggt atgaaaagga cacagcattc attctgaata 10620
tcatctcagc aatgactcag ttgctgattg atgagcaata ttccctacaa ggagactact 10680
cagctgtgag aaaactgatt gggtcatcaa attaccgtaa tctcttagtg gcgtcgctca 10740
tgcctggtca ggttggcggc tataatttct tgaatatcag tcgcctattc acacgcaata 10800
ttggtgatcc agtaacatgc gccatagcag atctgaagtg gttcattagg agcgggttaa 10860
tcccagagtt catcctgaag aatatattac tacgagatcc cggagacgat atgtggagta 10920
ctctatgtgc tgacccttac gcattaaata tcccctacac tcagctaccc acaacatacc 10980
tgaagaagca tactcagagg gcattactat ccgattctaa taatccgctt cttgcagggg 11040
tgcaattgga caatcaatac attgaagagg aggagtttgc acgattcctt ttggatcggg 11100
aatccgtgat gcctcgagtg gcacacacaa tcatggagtc aagtatacta gggaagagaa 11160
agaacatcca gggtttaatc gacactaccc ctacaatcat taagactgca ctcatgaggc 11220
agcccatatc tcgtagaaag tgtgataaaa tagttaatta ctcgattaac tacctgactg 11280
agtgccacga ttcattattg tcctgtagga cattcgagcc aaggaaggaa ataatatggg 11340
agtcagctat gatctcagta gaaacttgca gtgtcacaat tgcggagttc ctgcgcgcca 11400
ccagctggtc caacatcctg aacggtagga ctatttcggg tgtaacatct ccagacacta 11460
tagagctgct caaggggtca ttaattggag agaatgccca ttgtattctt tgtgagcagg 11520
gagacgagac attcacgtgg atgcacttag ccgggcccat ctatatacca gacccggggg 11580
tgaccgcatc caagatgaga gtgccgtatc ttgggtcaaa gacagaggaa aggcgtacgg 11640
catccatggc caccattaag ggcatgtctc accacctaaa ggccgctttg cgaggagcct 11700
ctgtgatggt gtgggccttt ggtgatactg aagaaagttg ggaacatgcc tgccttgtgg 11760
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<210> 2
<211> 16182
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 3
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<210> 3
<211> 15054
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
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cccagaagcc aacttcatga gaggataagt acaatattag cccttggaga ccaactgggg 9180
agaaaagcac cccaagtcct gtatgatttt gtagcaaccc ttgagtcatt tgcatacgca 9240
gctgttcaac ttcatgacaa caatcctacc tacggtgggg ccttctttga attcaatatc 9300
caagagttag aatctattct gtcccctgca cttagtaagg atcaggtcaa cttctacata 9360
ggtcaagttt gctcagcgta cagtaacctt cctccatctg aatcggcaga attgctgtgc 9420
ctgctacgcc tgtggggtca tcccttgcta aacagccttg atgcagcaaa gaaagtcagg 9480
gaatctatgt gtgccgggaa ggttctcgat tacaacgcca ttcgactcgt cttgtctttt 9540
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ttcaatgtct cttactcact caaagagaag gaagtaaaga aagaagggcg cattttcgca 10020
aaaatgtcac aaaagatgag agcatgccag gttatttgtg aagaattgct agcacatcat 10080
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attatccgaa aacacaccca aaaagtcttg ttgcaagatt gcccaaatcc cctattagca 11340
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cgcatatcgt gggccaatct actgaactgg agagctatag atggtttaga aaccccggat 11760
gtgatagaga gtattgatgg ccgccttgta caatcatcca atcaatgtgg cctatgtaat 11820
caagggttgg gatcctactc ctggttcttc ttgccctctg ggtgtgtgtt cgaccgtcca 11880
caagattctc gggtagttcc aaagatgcca tacgtggggt ccaaaacaga tgagagacag 11940
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aggttgttga ttattatgaa taatcggagt cggaatcgta aataggaagt cacaaagttg 15000
tgaataaaca atgattgcat tagtatttaa taaaaaatat gtcttttatt tcgt 15054
<210> 4
<211> 15054
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 4
acgaaaaaga agaataaaag gcagaagcct tttaaaagga accctgggct gtcgtaggtg 60
tgggaaggtt gtattccgag tgcgcctccg aggcatctac tctacaccta tcacaatggc 120
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cttctcaaca gtcgtgagta agtatctgac cgatgggttg aatagaaaaa gctgttccgt 7020
agctgcggga tccgggcatt gttacctcct ttgtagccta gtgtcagagc ccgaacctga 7080
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ctttgttcct tgactcgcac ccacgtacac ccaatcccat tcctgtcaag aaggaaccct 8280
tcccaaactc accttgcaat gtccaatcag gcagctgaga ttatactacc caccttccat 8340
cttttatcac ccttgatcga gaataagtgc ttctactaca tgcaattact tggtctcgtg 8400
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caaataagca atgatcgtat taatatttaa taaaaaatat gtcttttatt tcgt 15054
<210> 5
<211> 15054
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 5
acgaaaaaga agaataaaag gcagaagcct tttaaaagga accctgggct gtcgtaggtg 60
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tgaataaaca atgattgcat tagtatttaa taaaaaatat gtcttttatt tcgt 15054
<210> 6
<211> 15054
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 6
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tgatgaatta aagacaacgt ggaggttagc ttatagagtt gtgtcccttc tattgatggt 6420
gagcgctttg ataatctcta tagtaatcct gacgagagat aacagccaaa gcgtaatcac 6480
ggcgatcaac cagtcatctg aagctgactc caagtggcaa acgggaatag aagggaaaat 6540
cacctccatt atgactgata cgctcgatac caggaatgca gcccttctcc acattccact 6600
ccagctcaac tcgcttgagg cgaacctatt gtccgccctt gggggcaaca caggaattgg 6660
ccccggagat atagagcact gccgttaccc tgttcatgac accgcttacc tgcatggagt 6720
taatcgatta ctcatcaacc agacagctga ttatacagca gaaggccccc tagatcatgt 6780
gaacttcatt ccagccccgg ttacgaccac tggatgcaca aggataccat ccttttccgt 6840
gtcatcgtcc atttggtgct atacacacaa cgtgattgaa accggttgca atgaccactc 6900
aggtagtaac caatatatca gcatgggagt cattaagaga gcgggcaacg gcctacctta 6960
cttctcaaca gttgtaagta agtatctgac tgatgggttg aataggaaaa gctgttctgt 7020
agctgccgga tctgggcatt gctacctcct ttgcagcttg gtgtcggagc ccgaatctga 7080
tgactatgtg tcacctgatc ctacaccgat gaggttaggg gtgctaacgt gggatgggtc 7140
ttacactgag caggtggtac ccgaaagaat attcaagaac atatggagtg caaactaccc 7200
aggagtaggg tcaggtgcta tagtaggaaa taaggtgtta ttcccatttt acggcggagt 7260
gagtaatgga tcgaccccgg aggtgatgaa taggggaaga tattactaca tccaggatcc 7320
aaatgactat tgccctgacc cgctgcaaga tcagatctta agggcggaac aatcgtatta 7380
cccaactcga ttcggtagga ggatggtgat gcaaggggtc ctagcatgtc cagtatccaa 7440
caattcaaca atagcaagcc aatgtcaatc ttactatttt aataactcat tagggttcat 7500
tggggcagaa tctaggatct attacctcaa tgataacatt tatctttacc agagaagctc 7560
gagctggtgg cctcaccccc agatttacct gcttgattct aggattgcaa gtccgggtac 7620
tcagaacatt gactcaggtg tcaatctcaa gatgttaaat gtcactgtaa ttacacgacc 7680
atcatctggt ttttgtaata gtcagtcacg atgccctaat gactgcttat tcggggtcta 7740
ctcggatatc tggcctctta gccttacctc agatagcata ttcgcattca caatgtattt 7800
acaggggaag acaacacgta ttgacccggc ttgggcgcta ttctccaatc atgcgattgg 7860
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ttcggacacc gtccaaaatc aggtgtattg cctgagtata cttgaggtca ggagtgagct 7980
cttgggagca ttcaaaatag taccattcct ctatcgcgtc ttgtaggcat ccattcagcc 8040
agaaaacttg agtgaccatg atattaacac ctgatccccc tcaaagacac ctatctaaat 8100
tactgttcta gactcatgat taggtacctt cttaatcaat catttggttt ttaattaaaa 8160
atgaaaaaat aggcctagtt ccaagagagg gctggaaccc attagggtgg ggaaggattg 8220
ctttgctcct tgactcacac acacgtacac tcgatcagac tcctgtttaa aaggaatcct 8280
tctcaaactc gccccacgat gtccaatcag gcggctgaga ttatactacc caccttccat 8340
ctagaatcac ccttaatcga aaataagtgc ttctattata tgcaattact tggtctcgtg 8400
ttgccacatg atcactggag atggagggca ttcgttaact ttacagtgga tcaggtgcac 8460
cttaaaaatc gtaatccccg cttgatggcc cacatcgact acactaagga tagattaagg 8520
actcatggtg tcttaggttt ccaccagact cagacaagtt tgagccgtta tcgtgttttg 8580
ctccatcctg aaaccttatc ttggctatca gccatggggg gatgcatcaa tcaggttcct 8640
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ctaaagctac tcatggagag aacctcatta aaattaactg gagtacctta cttgttctct 8760
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gaactcttgt cgaatcctat ctcccaattc caatcaacat gggggtgtgc tgcttcgggg 8880
tggcaccatg tagtcagtat catgaggctc caacaatacc aaagaaggac aggtaaagaa 8940
gagaaagcga tcactgaagt tcagtatggc acagacacct gtctcattaa tgcagactac 9000
actgttgtgt tttccacaca gaaccgtatc ataacagtct tgccttttga tgttgtcctc 9060
atgatgcaag acctgctcga atcccgacgg aatgtcctgt tctgtgcccg ctttatgtat 9120
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gagtctatgt gcgccgggaa ggttctcgat tacaacgcca ttcgacttgt cttgtctttt 9540
tatcatacgt tgctaatcaa cggataccgg aagaaacaca agggtcgctg gccaaatgtg 9600
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ccacactctg ttgctcttga gcactatttg gacgtctcaa tggtagaatt tgaaaaaact 9720
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gataagcaag agtggtacag tggttttgtc tcagaagtga ctccgaagca cctgcgaatg 9840
tcccgtcatg atcgcaagtc taccaatagg ctcctgttag ccttcattaa ctcccctgaa 9900
ttcgatgtta aggaagagct taaatacttg actacgggtg agtacgccac tgacccaaat 9960
ttcaatgtct catactcact taaagagaag gaagtaaaga aagaggggcg cattttcgca 10020
aaaatgtcac aaaagatgag agcatgccag gttatttgtg aagaattgct agcacatcat 10080
gtggctcctt tgtttaaaga gaatggtgtt actcaatcag agctatccct gacaaaaaat 10140
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aattggcggc accagtcagt caaactgttc gccagaagcc tggatcgact gtttgggtta 10320
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ttcagtaaac tcactactaa tgccactacc cttgctgaga atactgtggc cggctgcagt 10860
gacatctctt catgcattgc ccgttgtgtg gaaaacgggt tgcctaagga tgccgcatat 10920
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attatccgaa aacacaccca aaaagtcttg ttgcaagatt gcccaaaccc cctattagca 11340
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aaaaaacata tacaaggatt ggtggacact acaaaaacaa ttattcagtg ctcattggaa 11520
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caagggttgg ggtcctactc ttggttcttc ttgccctctg ggtgtgtgtt cgaccgtcca 11880
caagattccc gggtagttcc aaagatgcca tacgtggggt ccaaaacaga tgagagacag 11940
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tcttcggcga atttacacca cagattaaat gacggggtaa cacaggttaa attcatgccc 12180
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agcccaatac ctggtgattt ggatcagagg ctcattcaga ccaaattttt catgggttct 12540
gacaatttgg ataatcttga tatctaccaa cagcgagctt tactgagcag gtgtgtggct 12600
tatgatgtta tccaatcgat ctttgcctgt gatgcaccag tctctcagaa gaatgacgca 12660
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attatccaag taacggcagg ctacgagtta attctgttcc ttgcatacca gctttattat 12780
ctcagagtga ggggtgaccg tgcaatcctg tgttatattg acaggatact caataggatg 12840
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gcaggaattg agcctgagat ctcccgaggt ggctgtactc aggatgagct gagctttact 13080
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aacttggtta aagtcagaaa ccttcctgta gaggagaaaa ccgccttact gtaccaaatg 13200
ttggtcactg aggccaatgc taggaagtca ggatctgcta gcattatcat aaacctagtc 13260
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tccgcacctg cagagctgac tgatgttcct ggtcacatgg cagaagagtt tccctgtttg 13440
tttagtagtt ataacgccac atatgaagac acaattactt acaatccaac gactgaaaaa 13500
ctcgccttgc acttggacaa cagttccacc ccatccagag cacttggccg tcactacatc 13560
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gtacggacac tactatctgg ctattctcat tgtgcactat tagcctactg gctattgcaa 14040
cctggagggc gatttgcagt tagggttttc ttaagtgacc atatcatagt aaacttagtc 14100
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ttaggaatca ttaaatgggc cgagggtgag gtgtcccaac ttaccagaaa ggcggatgat 14340
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gaaataaggg ttgagcaaga tcagttggaa gataattcga ggagacaaat ccaagtagtc 14580
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cagattatag atgttatttg tgtaaacata gaccacctct ttcctaaaca ccgacatgtt 14700
cttgtcacgc aacttaccta ccagtcggtg tgccttgggg acctgattga aggcccccaa 14760
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aaccatatca tcactggaca agtgtcacgg aataaagcaa gggatttttt caagaggcgc 14880
ttgaagttgg ttgggttttc actctgcggt ggttggagct acctctcact ttagctgttc 14940
aggttgtcga ttattatgaa taatcggagt cggaatcgca aataggaagc cacaaagttg 15000
tggagaaaca atgattgcat tagtatttaa taaaaaatat gtcttttatt tcgt 15054
<210> 7
<211> 15054
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 7
acgaaaaaga agaataaaag gcagaagcct tttaaaagga accctgggct gtcgtaggtg 60
tgggaaggtt gtattccgag tgcgccttcg aggcatctac tctacaccta tcacaatggc 120
tggtgtcttc tcccagtatg agaggtttgt ggacaatcaa tcccaagtgt caaggaagga 180
tcatcgttcc ctggcagggg gatgcctaaa agtcaacatc cctatgcttg tcactgcatc 240
tgaagatccc accactcgtt ggcaactagc atgtttatcc ttaaggctct tggtctccaa 300
ctcatcaacc agtgctatcc gccagggggc gatactgact ctcatgtcac taccatcaca 360
aaatatgaga gcaacggcag ctattgctgg ttccacaaat gcggctgtta tcaacactat 420
ggaagtcttg agtgtcaacg actggacccc atccttcgac cccaggagcg gtctctctga 480
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gtcacccttt acatcggcat tggcggaggg gtttaccccg gaggacaccc acgacctaat 600
ggaggccctg accagtgtgc tgatacagat ctggatcctg gtggctaagg ccatgaccaa 660
cattgatggc tctggggaag ccaatgagag acgtcttgca aagtacatcc agaagggaca 720
gcttaatcgc cagtttgcaa ttggtaatcc tgctcgtctg ataatccaac agacgatcaa 780
aagctcctta actgtccgca ggttcttggt ctctgagctt cgtgcatcac gaggtgcggt 840
gaaagaagga tccccttact atgcggctgt tggggatatc cacgcttaca tctttaacgc 900
aggactgaca ccattcttga ctaccttaag atacgggata ggcaccaaat atgctgctgt 960
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tgcgcctgga aacttcccac acatgtactc ctacgcgatg ggggtggctt cttaccatga 1140
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caagacccaa tccaacaccc cagcatcccc ctcatttaat taaaaactga ccaatagggt 1620
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ggctgcaacc atcaggcact gtcggcctat cacaaatccc aaaggggata accagcgcct 1800
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ccaaagccag actcaagagg cccaagacag ggagggacac ccacgacaat ccctctgcgc 2040
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cactaaacag ttggttcaaa ccacgccaag atcacgcggt tgttgtgtcc ggaccaggga 2580
atccattggc catgccaacc ccgatccaag acaacaccat attcctagat gaactggcaa 2640
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atcgatccga tcttctcggc ttaatccaga gttagttaga tgtctcagtg gggcacttga 5520
ttcatgcaca tttgagaggg aaagtgcatt attgtcaacc cctttctttg tatacaacaa 5580
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aattgagggt tatcgcttca acatacagac tgaatccaac tcatgggttg caccaaactt 5760
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caaaatcaac agttccatcg aggctgcaag agagcagctg gaactaagca accagatcct 5880
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tcttaggaaa gtccaacgag ctcaagctgc catgatgatg cagcaaatga gctcatcaca 6060
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tgatgagcaa gacgtaccaa tcatcaatga ttgtgtcaca aggccggttg ggaatgcatc 6180
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tggataaaca atgattgcat tagtatttaa taaaaaatat gtcttttatt tcgt 15054
<210> 8
<211> 15048
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 8
acgaaaaaga agaataaaag gcagaagcct tttaaaagga accctgggct gtcgtaggtg 60
tgggaaggtt gtattccgag tgcgcctccg aggcatctac tctacaccta tcacaatggc 120
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ctatcagcag tcagggtacc acgaccttgt cataagatta ttaccccttt taccaacgga 4620
actcaatgat tgccaaaaag aagtagtcac agaatacaat aatacagtat cacaattgtt 4680
gcagcctatc aaaaccaact tggataccct attagcagat ggtaatacga gggaagcgga 4740
tatacagccg cggtttattg gagcaataat agccacaggt gccttggcgg tagcaacagt 4800
ggcagaagta actgcagctc aggcactctc ccagtccaaa acaaatgctc aaaatattct 4860
caagctaaga gatagtatcc aggccaccaa ccaagcggtc tttgaaattt cacaagggct 4920
tgaggcaact gcaactgtgc tatcgaaact acagacagag ctcaatgaga atattatccc 4980
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tctcaagaag gtccaacgag ctcaggctgc tatgatgatg cagcaaatga gttcatcgca 6060
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tgatgagcga gatgtcttaa tcattgataa ttatgccgta aggctggtag ggaatgtgct 6180
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ggaatctagg atttattacc taaatgggaa cctctacctt taccaaagaa gctcgagctg 7560
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caccatccaa aaccaggtgt attgcctgag tatacttgaa gttagaagtg agcttttggg 7980
gccattcaag atagtaccat tcctctaccg tgtcctatag gtgcctgctc gatcgagaac 8040
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cctaggtctc tggattagcg ccctttaaac cagttttttg atttttaatt aaaaatagaa 8160
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tttaatacga gatccggggg gaggatccgt acattgattg agtgtgccca gctgcaggtt 14640
atagatgtca tatgtgtaaa catagatcac ctcttcccca aacatcgaca tgttcttgtt 14700
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ttgatcattg tgaaaaatcg gagtcggaat cgcaaataaa aacatacaaa attgcaaatt 15000
tacaataatc gcattaatat ttaataaaaa atatgtcttt tatttcgt 15048
<210> 9
<211> 16236
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 6
<400> 9
accaaacaag gaaaccatat gcttggggac tttacgagag cgcttgtaaa accgtgaggg 60
ggaagctggt ggactccggg tccggagtcg gtggacctga gtctagtagc ttccctgctg 120
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actcagaagg tagtttacac aatcaatgcc aaacctgcac tgttgttctc ctcccgtgtt 3660
gtcagggctg ggggttgtgt ggttgcagca gaaggtgcaa tcaagtgccc cgagaaaatg 3720
acatctgatc gcctctacaa attccgcgta atgtttgtgt cattgacctt cctacatcgc 3780
agcagccttt ttaaagttag ccgtacagtg ctgtcaatga ggaattctgc tctaatagca 3840
gtacaggccg aagtgaagct ggggttcgat ctgccactgg accatccgat ggcaaaatat 3900
ttgagcaaag aggatggaca gctatttgca actgtgtggg tacacttgtg caactttaag 3960
cgcacagaca gacgcggagt agaccgatcg gtggagaaca tcaggaacaa agtacgagcc 4020
atggggctga agctcacctt gtgtgatcta tggggtccca cacttgtttg tgaagccacg 4080
gggaagatga gcaagtacgc gctaggtttc ttctcggaga ctaaggttgg ctgtcaccca 4140
atctggaaat gcaactcgac tgtcgcaaag atcatgtggt catgcacaac ttggatcgca 4200
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accttccttg ataatcacta aatcaataca cagagtgcca tttgattaag atattgattg 4440
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tcaagaagtg cttaaatgtt ctgctgggca gatcaaatca tacaatgaca cccttaatcg 4860
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aatcctgata gatggggtta ctctgcagat agaagctcaa gttagcggat cgtattccag 5940
gaatataacg gtcgggaaca gccaaattgc cccatctgga ccccttgaca tctcaagcga 6000
actcggaaag gtcaaccaga gtctatctaa tgtcgaggat cttattgacc agagcaatca 6060
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attgctagtt atcctggtat tatggtgttt ggccctaacg attagtatct tgtatgtatc 6180
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atgcagaata atctaacagc ccaaccaaac cacccaggag agaacgcctg aggggggaag 6480
gaggttgact acaacctcta ctgatcagag gttgtagtat caattcttaa caacccccaa 6540
gatgagacca caagtggcaa tttggggctt gcgcttattg gctaccggcc tagctatggt 6600
ctccttagtg ttctgcctaa accaggtaat catgcaggtg ctaattaggg acattagagg 6660
cttgttgaca tcctcggaca tcaagactac acatgaggcg ctgcgtgagc atctctcatc 6720
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tcccccaccg tattatgttg caatacagct cagcgctgag atgcaacctg ggtaccattc 6960
aagtgattga tccccttgac gcactggcag agtctacccc accaagatcc gttcttgtcc 7020
tacttgtttg atttaagaaa aaattgtaat ttatacagaa agataatagc tgagggggaa 7080
gcctggtgtc accgctggtg accattcccc agccggtggc aatggcttcc tcaggcgata 7140
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caatagttag gatgtcaacc attacaacaa aagatattga taacagtatc tcatcatcta 7320
ttacatccct gagtgccgat taccagccaa tatggtcaga tacccatcag aaagttaaca 7380
gtattttcaa ggaagttgga atcactatcc ctgtcacact cgacaagatg caagtagaaa 7440
tgggaacagc ggttaacata atcactgatg ctgtaagaca actacaagga gtcaatgggt 7500
cagcaggatt tagcattacc aattccccag agtatagtgg agggatagac acactgatat 7560
accctcttaa ttcacttaat ggaaaggctc tagctgtatc agacttacta gaacacccga 7620
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ttacgacaag tgcagcgaca atcctagatg atggaaggaa caggaaaagt tgtagcatca 7860
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acactgagtc tgaacttgac cctggcctat ttaataacca ttgggtcgct caatatccag 8040
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tcaactaggc catctacctg gatgcccacc taattccaga tttgaagaac aggtaggaga 9780
ctgcagtttg tggtcaccca taagcgatcc agctctagtc acaggtggtg aatacgctaa 9840
ctgtgtgtat gcgtggtact taatacgtca gaccatgcgg tacatggccc tccagagaaa 9900
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ctttagggtg ttcagagaga tcaacagggg tataggacac aacttaaaag tccaagaaac 11760
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<210> 10
<211> 15480
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 7
<400> 10
accaaacaag gactgcataa gcagtgtaaa acttttaata aaaaataact ttcgtgaggg 60
tgaatcgatc atcgctcgaa gccgatatcg actcacccaa attagctgct tgtataagga 120
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cagtctttgc aggagatcaa gcagccccac aggcaaatcc tccagcccaa ccaagacaga 1440
atgacacacc acagcagcct gctcctcttc agcagccaat tcgaattgcc atgcctcaaa 1500
attatgatga tatgccagac ttagagatgt agacagaacc ccaatcaagc aacaattggc 1560
attaagatct aagctgaatg tatgagcaca cgagtaccca agtatatttg ttagcagttg 1620
catgaaatca ttatccatat tattgatttg caatatagaa aattactgat aaacaattaa 1680
gaatcattta ataaaaaaat tccacaaaaa ttaaaaaaat tgtgaggggg aacacctttc 1740
agtcggtcaa ctgctgctaa taacctgcaa ttatcacgtg gattgaatat ggaattcagt 1800
aatgatgccg aggttgccgc gctcctggat cttggagata gcatcattca gggcattcag 1860
catgcaacaa tggctgatcc gggaacacta gggaagtcag ctattcctgc aggtaatacc 1920
aaacgcttag agaaattatg ggagaaagaa tctgttccta atcatgataa tatgattcac 1980
tcttccatga gtgcagaacc tataagcggg gaactacctg aggaaaacgc taaaactgaa 2040
ccaacaggga ctcaagaaat gccagaacaa attcaaaaga atgacaatct ccaacctgca 2100
tccatcgata acatattgag cagcattaat gcattagagt caaaacaggt taaaaaaggg 2160
ttagtgctat cgccccaatc actgaaaggt gtgtccccct taatcaagaa ccaggatctg 2220
aagaacacca tgcaggacct ggaaaccaaa cccaaggctg taacgactgt aaatccatta 2280
gcaaaccgac aagtgtcacc tggaagcctg gtcatagacg agagtattcc tttgcttgga 2340
gtgcaggaac aaacaaattt attgtctcct cgtggtgtaa cccaacttgc gccccaatca 2400
gaccctatcc tacagtcgaa cgatgcaggt gcgggaattg cccaaaattc tgccctggat 2460
gtcaatcagc tctgggatgt aatcaatcag caacacaaga tgctgataaa cctacaaaat 2520
caagtaacaa agatcactga gctggttgct ttaattccaa ttcttcgaag tgatattcag 2580
gctgtaaagg gaagttgcgc attattagaa gcacagctag catctataag aatactagat 2640
cctgggaaca tcggggtatc ttcattagat gatcttaaaa cagcagggaa acaaagtgta 2700
gttattaatc aagggagcta tactgatgca aaggatctga tggttggggg aggattgatt 2760
cttgatgaac ttgctagacc tactaaatta gtcaatccaa agccacaaca atcttccaaa 2820
atattggatc aggcagaaat tgaaagtgtc aaggccctaa tccataccta cactcacgat 2880
gataagaagc ggaacaaatt cttaactgca cttgacaagg tgacaaccca ggatcagcta 2940
actcgcatca agcagcaagt attaaatcaa tagatagaca attagcattc attcaagcta 3000
tactcattta agtgctttga ttgtgttgcg gaaactatat tgagataatt tagtcttaca 3060
tgcaaaataa cattaaaaat taattatgag caatcttgat ttttctaact cataatcaac 3120
ctccttctct ataaaggcat acttagtatt gcaaaaagag aaaattaaga aaaaaagaaa 3180
aagaaaattg agggagaccg cttgatagat ctgtgatcgg tctcataacc tcaaattaaa 3240
atggaatcta tatctctggg gttatatgtt gatgaaagtg atccagcatg ctcattactt 3300
gcattcccca taatcatgca gactacaagt gaaggaaaga aggtcttaca accgcaagtc 3360
agaataaacc gtctagggag tatatcgata gaaggagttc gggcaatgtt cataaataca 3420
tatggcttca ttgaggagag gcctacggaa aggacaggtt tctttcagcc aggcgaaaaa 3480
aatcagcagc aagttgtgac agctggtatg ctgacattgg gccaaataag gaccaatata 3540
gacccggacg aaattggaga ggcatgcttg agactcaaag tgaatgctaa aaaatcagca 3600
gcaagtgagg agaagatagt atttagcatt cttgaaaagc ctcccgccct gatgactgca 3660
cctgtagtac aagatggggg cttaattgct aaagcagaag gatcaatcaa atgcccaggt 3720
aagatgatga gtgaaattca ctactcattt agagtaatgt ttgtgagtat cacaatgctg 3780
gataatcaga gcctatacag agtaccaaca gccatcagct cgttcaaaaa taaagctcta 3840
tattctattc agttagaggt attgctggaa gttgatgtga agcctgagag cccccagtgt 3900
aaatttctag cagaccagaa agggaagaaa gttgcttctg tatggttcca tctctgcaat 3960
tctaaaaaga cgaatgccag cgggaaaccg agatcattag aggatatgag aaagaaggtc 4020
cgagatatgg gaatcaaagt gtctctggcc gacctttggg gccctacgat catcgtcagg 4080
gccacaggga agatgagtaa atatatgcta ggatttttct ctacctcagg gacttcatgt 4140
catccagtaa caaagagttc accagatttg gcaaaaatat tatggtcatg ctcaagcaca 4200
atcatcaaag caaatgccat tgttcaaggg tcagtcaaag tcgatgtcct gaccctcgaa 4260
gatatccaag tttccagtgc tgcaaaaatc aacaaatcag gaatagggaa gtttaatcca 4320
tttaagaaat aaagtcatat gcagattaaa atttgatcaa gattggtctt agcaaattaa 4380
ctgaatgtaa ttataaaata cctcagtaaa atgctaatga atcagtggat gatattgaat 4440
tagcagattg aaaattaaag aaaaccttat gagggcgaat gagcttagat gatttaataa 4500
aggagactaa tccaacattt ccctcaaatt aacaaaatca gaaagtaaaa agaaagggag 4560
caatgagagt acgaccttta ataataatcc tggtgctttt agtgttgctg tggttaaata 4620
ttctacccgt aattggctta gacaattcaa agattgcaca agcaggtatt atcagtgcac 4680
aagaatatgc agttaatgtg tattcacaga gtaatgaggc ttacattgca ctgcgcactg 4740
tgccatatat acctccacac aatctctctt gtttccagga tttaatcaac acatacaata 4800
caacgattca aaacatattc tcaccaattc aggatcaaat cacatctata acatcggcgt 4860
caacgctccc ctcatcaaga tttgcaggat tagtagtcgg tgcaatcgct ctcggagtag 4920
cgacatctgc acaaataact gcagccgtgg cactcacaaa ggcacagcag aacgctcaag 4980
aaataatacg attacgtgat tctatccaaa atactatcaa tgctgtgaat gacataacag 5040
tagggttaag ttcaatagga gtagcactaa gcaaggtcca aaactacttg aatgatgtga 5100
taaaccctgc tctgcagaac ctgagctgcc aggtttctgc attaaactta gggatccaat 5160
taaatcttta tttaaccgaa attacaacta tctttggacc gcaaattaca aatccatcat 5220
tgaccccatt gtcaattcag gcattataca ccctagcagg agataacctg atgcaatttc 5280
ttaccaggta tggctatgga gagacaagtg ttagcagtat tctcgagtca ggactaatat 5340
cagcacaaat tgtatctttt gataaacaga caggcattgc aatattgtat gtcacattac 5400
catcaattgc gactctttcc ggttctagag ttaccaaatt gatgtcagtt agtgtccaaa 5460
ctggagttgg agagggttct gctattgtac catcatacgt tattcagcag ggaacagtaa 5520
tagaagaatt tattcctgac agttgcatct tcacaagatc agatgtttat tgtactcaat 5580
tgtacagtaa attattgcct gatagcatat tgcaatgcct ccagggatca atggcagatt 5640
gccaatttac tcgctcattg ggttcatttg caaacagatt catgaccgtt gcaggtgggg 5700
tgatagcaaa ttgtcagaca gtcctgtgcc gatgctataa tccagttatg attattcccc 5760
agaacaatgg aattgctgtc actctgatag atggtagttt atgtaaagaa cttgaattgg 5820
aggggataag actaacaatg gcagacccag tatttgcttc atactctcgt gatctgatta 5880
taaatgggaa tcaatttgct ccgtctgatg ctttagacat tagtagcgaa ttaggtcaac 5940
tgaataactc aattagctca gcaactgata atttacagaa ggcacaggaa tcattgaata 6000
agagtatcat tccagctgcg acttccagct ggttaattat attactattt gtattagtat 6060
caatctcatt agtgatagga tgtatctcca tttattttat atataaacat tcaaccacaa 6120
atagatcacg aaatctctca agtgacatca tcagtaatcc ttatatacag aaagctaatt 6180
gatgaattaa tttctaaaaa ataatttgat gttctaatag gagaatgcaa tatcaatatg 6240
tccattataa tatacttgat tgattgaaag atctgataat aatagtttat aagacactaa 6300
gtaagagtta aatgctaaag caagttgatt cctaaatttc tgcacaatag gaccatacta 6360
tatcatatta gataattaat aaaaaacgcc ctatcctgag ggcgaaaggc cgatcattag 6420
tgactttaac cgttgctctc ccaatttaaa atatatttca catggagtca atcgggaaag 6480
gaacctggag aactgtgtat agagtcctta cgattctatt agatgtagtg atcattattc 6540
tctctgtgat tgctctgatt tcattgggtc tgaagccagg tgagaggatc atcaatgaag 6600
tcaatggatc tatccataat caacttgttc ccttatcggg gattacttcc gatattcagg 6660
caaaagtcag cagcatatat cggagcaact tgctaagtat cccactacaa cttgatcaaa 6720
tcaaccaggc aatatcatca tctgctaggc aaattgctga tacaatcaac tcgtttctcg 6780
ctctgaatgg cagtggaact tttatttata caaattcacc tgagtttgca aatggtttca 6840
atagagcaat gttcccaacc ctaaatcaaa gcttaaatat gctaacacct ggtaatctaa 6900
ttgaatttac taattttatt ccaactccaa caacaaaatc aggatgtatc agaataccat 6960
cattttcaat gtcatcaagt cactggtgtt atacccataa tatcattgct agtggatgtc 7020
aggatcattc aaccagtagt gaatacatat cgatgggggt tgttgaagtg actgatcagg 7080
cttacccgaa ctttcggaca actctttcta ttacattagc tgataatcta aacagaaagt 7140
catgtagcat tgcagcaact gggttcgggt gtgatatatt atgtagtgtt gtcactgaga 7200
cagaaaatga tgattatcaa tcaccagaac cgactcagat gatctatgga agattatttt 7260
ttaatggcac atattcagag atgtcattga atgtgaacca aatgttcgca gattgggttg 7320
caaattatcc agcagttgga tcaggagtag agttagcaga ttttgtcatt ttcccactct 7380
atggaggtgt taaaatcact tcaaccctag gagcatcttt aagccagtat tactatattc 7440
ccaaggtgcc cacagtcaat tgctctgaga cagatgcaca acaaatagag aaggcaaaag 7500
catcctattc accacctaaa gtggctccaa atatctgggc tcaggcagtc gttaggtgca 7560
ataaatctgt taatcttgca aattcatgtg aaattctgac atttaacact agcactatga 7620
tgatgggtgc tgagggaaga ctcttgatga taggaaagaa tgtatacttt tatcaacgat 7680
ctagttcgta ttggccagtg ggaattatat ataaattaga tctacaagaa ttgacaacat 7740
tttcatcaaa tcaattgctg tcaacaatac caattccatt tgagaaattc cctagacctg 7800
catctactgc tggtgtatgt tcaaaaccaa atgtgtgtcc tgcagtatgc cagactggtg 7860
tttatcaaga tctctgggta ctatatgatc ttggcaaatt agaaaatacc acagcagtag 7920
gattgtatct aaactcagca gtaggccgaa tgaacccttt tattgggatt gcaaatacgc 7980
tatcttggta taatacaact agattattcg cacagggtac tccagcatca tattcaacaa 8040
cgacctgctt caaaaatact aagattgaca cggcatactg cttatcaata ttagaattaa 8100
gtgattcttt gttaggatca tggagaatta caccattatt gtacaatatc actttaagta 8160
ttatgagcta gatcctgttt taacattgaa tcgtatgaac ttataagact gaaggatgtc 8220
tgttggtatt aagcatcata aaacacggtt gtttttgatt tgacacctaa tcgtactcaa 8280
tactctccat agatttaatc taacagattt agatactatt gatcatatag gcatagatgg 8340
tatatgggca attagattga actgagttaa atccgattga tacttatcaa attaagatct 8400
agattattta ataaaaaatc taagttagaa aatgaggggg acctcattat ggagttcaga 8460
caatctgatc aaataataca tcctgaagtg catctagatt cacctattat tgggaataaa 8520
atactctatt tatggcgaat tacaggctta cctactccgc ctgttcttga gcttaactct 8580
actatatcgc ctgaagtctg gacaaacttg aaagccaatg atcctagagt agcctttaaa 8640
tgggacaaac taagaccacg gttgctaaca tgggcagcac atcaagggat atcactatcg 8700
gatctgatcc ctattacaca tcctgagtca ttgcagtggt taacaacaat atcctgtcct 8760
aaaattgatg aaaattttgc gttaattaag aagtgccttc ttagaacaag ggactataca 8820
gcatcaggat ttaagaattt attccaaatg atctcacaga aattgacgtc gacgaatatt 8880
ctattttgcg cagaaaatcc gacaactccc cccatctccg acgaagcatc ctgggcatta 8940
aagaatcctg agcactggtt taatacacct tggtcatctt gttgtatgtt ttggttacat 9000
gtgaaacaga ctatgaggaa cttaattaga atacaacgat ctcaaccaga atcacaaagc 9060
atatacagta tcacggttga taacttgttt gttggattga ctcctgactt gtgtgtcata 9120
gctgattctc aaagacaatc aattacagta ctgtcatttg agtgtgtatt gatgtattgt 9180
gacttaattg aaggtcgtaa caatgtttat gacctctgtc aattgtctcc tgtgctaagt 9240
cctcttcaag atagaatttt acttttactg agattaattg attctttagc atatgacatc 9300
ggagcgccaa tttttgatgt aattgcttct cttgaatctt tagcatatgg agctattcag 9360
ctatatgatt acgacacaga ggcagccggt gattttttct catttaattt aagagaaatt 9420
tcccaggtca tagaagagag caaatgtagg aatcaaaccc atactataat cagtgcaatt 9480
agtaagattt acacagggat caatcctgat caagcagctg aaatgctgtg tatcatgaga 9540
ctgtggggtc acccattgct ttatgcatcc aaggctgcat ctaaggttcg cgagtcaatg 9600
tgtgcaccta aagttatcca atttgatgca atgctgcttg tattagcatt ctttaagaga 9660
agcatcataa atggatatag acgaaagcat ggtgggctat ggccgaacat catagttgag 9720
tcacttcttt ctgcagaact tgtcgcggca catcatgatg cagttgaatt gacagacact 9780
tttgttatta aacactatag agaagtagcc atgattgact tcaaaaaatc attcgactac 9840
gatatagggg atgacttaag tttatacctc aaggataaag caatttgtcg acagaaatca 9900
gagtggctta atatcttcaa gggtcaattg cttgagcccg ctgtacgatc gaagcgaatt 9960
cgtggaatag gtgaaaaccg attactgtta catttcttga attcagtcga ttttgatcct 10020
gaacaagaat tcaaatacgt cactgatatg gagtacctct acgatgaaac attctgtgca 10080
tcctattcac tgaaggaaaa agaagtgaaa agagatggaa gaatattcgc aaaaatgaca 10140
ccaaaaatga gaagctgtca agttttatta gaggcattgt tagcaaaaca tgtaagcgaa 10200
cttttcaagg agaatggagt ctcaatggag cagatatccc tcacaaagtc attggtagcc 10260
atgtcacaat tagctccccg agtgaatatg agaggtggga gagcagctag atcaacagac 10320
gttaaaatca atcaacgaag ggtcaagtca atcaaagagc atgttaaatc gagaaatgat 10380
tcgaatcaag agaaaattgt aattgcaggt tatctgacta ctgatttaca aaaatactgc 10440
ctcaattgga gatatgaatc aataaaatta tttgcaagag cacttaacca attatttgga 10500
ataccccatg gatttgaatg gatacactta aggctcataa gaagtacaat gtttgttggg 10560
gatccttaca atcctcctgc atcaatccaa tctttggatc tcgatgaaca gcctaatgat 10620
gatattttta ttgtctcgcc acgtggtggg attgaaggat tatgtcagaa gatgtggaca 10680
ctcatctcaa ttgcattaat tcaagctgca gctgcaaaaa taggatgtcg ggttacaagt 10740
atggtacagg gagataatca ggttattgct atcaccagag aagtgcgagt gggggaacct 10800
gtgagggagg cgtcacgaga actcagatta ttgtgtgatg agttcttcac tgaattcaaa 10860
caattaaact acggaatagg gcacaatctt aaagcaaaag aaactatcaa gagtcaatcg 10920
ttttttgtat atagcaagag agttttcttt gagggaagag tgttaagtca gatattgaag 10980
aatgcctcaa aattgaatct aatttctgac tgtctggctg aaaatacagt tgcttcatgt 11040
agcaatattt cttctactgt agcaaggcta atagagaatg gccttgggaa agacgtagcc 11100
ttcattttaa actttcagac tattataagg caactgattt ttgatgaagt atatacgatt 11160
tcattgaact atagtacagc aagacggcag gtgggaagcg agaatcctca cgcattggct 11220
atagccgctt tgattcctgg tcaacttggg ggattcaatt tcctaaacgt tgctaggtta 11280
tttacacgga atatcgggga tccaatcact tgctcattga gtgatatcaa atggtttgca 11340
aaagttggat tgatgcctga gtacatcctt aaaaacattg ttttgagggc accaggttca 11400
ggaacatgga caactttagt cgctgatccc tactccttaa acattacgta cacaaaattg 11460
cctacgtcgt acctaaagaa acatacacag aggacattag ttgctgattc ccctaatccg 11520
ttgcttcagg gggtgtttct attaaatcag cagcaggagg atgaagcatt atgtaaattt 11580
cttcttgacc gagaacaagt gatgccacga gctgcccatg taatctatga tcagtcagtt 11640
ctcggccgga ggaaatattt acaagggctt gttgatacta cacagacaat cataaggtat 11700
gcactccaaa aaatgccggt atcatacaaa aagagtgaaa aaatccaaaa ttacaatctc 11760
ctctacatac aatcactttt tgatgaggtc ttgacacaga atgtcattca tagtggattg 11820
gatactatat ggaaaagaga tctaattagc attgagacct gttctgtcac acttgccaat 11880
tttacgagga cttgctcgtg gtctaatatt ctacagggca ggcaaattgt tggagttaca 11940
actccagaca cgatagaatt gtgtaccggt tctttgattt cttgcaacag tgcatgtgag 12000
ttttgtagaa ttggagataa aagctactct tggtttcata caccaggggg tatctcattt 12060
gatacaatga gccctggcaa tctgattcaa agagtgccgt acctaggatc aaagactgat 12120
gaacagcgag ctgcctctct aacaaccatc aaggggatgg attaccatct gagacaagct 12180
cttcgaggag catcattgta tgtgtgggca tatggagaga ctgatcagaa ttggttagat 12240
gcgctgaagt tagcaaacac ccggtgcaat gtaacattac aagctttgac tgcactctgc 12300
ccaataccga gtaccgcaaa tctacaacac cggcttgcgg atggaataag tacagttaaa 12360
ttcacacctg caagtttgtc acgaatagca gcttatattc acatttgtaa tgaccaacaa 12420
aagcatgata acctagggaa tagttttgaa tcaaatctga tttaccagca aataatgctt 12480
cttggaacag gaatatttga aacaattttc ccactatcag ttcaatatat ccacgaggaa 12540
caaacacttc acttgcacac tggattttcc tgttgtgtca gggaagctga cacaatgatt 12600
atagatgaga gcagaactgg attcccagga ttgacagtga ctaagagtaa taagttttta 12660
ttcaaccctg accctattcc tgcagtgtgg gcagataaaa tattcacgac tgaatttaga 12720
ttcttcgagt acaatataga gaatcaagga acttatgaac taataaaatt tctttcttct 12780
tgctgcgcga aagttgttac agaatcgcta gttcaggata ctttccatag ttctgtcaaa 12840
aatgatgcaa taattgcgta tgacaattca attaattaca tcagtgagct acaacaatgt 12900
gacattgttc tgtttagcag tgaacttgga aaggaattac ttctagattt agcttaccag 12960
ctgtactacc ttcgaattag atcgaaacga ggtataatta gttacttgaa ggtactgctg 13020
actcggcttc caattattca gtttgcaccg cttgcgttga caatatcaca tcctgtaatc 13080
tacgagcgat tacgccaacg gaggttggtt atggaaccgt tgcaacctta tttggcttcg 13140
atagattatg tcaaagccgc aagagagctt gttttgattg gtgcttcttc ttacctctca 13200
atgcttgaga caggtttaga taccacttac aacatataca gtcatttaga cggggattca 13260
gagggcaaga ttgatcaggc gatggcaagg agactgtgcc taatcacatt attagtgaat 13320
cctggatatg cattacctgt gatcaaagga ctaactgcaa ttgagaaatg tagactatta 13380
acagattttt tacaatcaga tatcatttct gtttctttat ctgagcagat tgcaacactt 13440
attctaacac caaagattga agtgcacccg acaaatttat actatatgat gcggaagacc 13500
ttgaatctaa tccggtcacg agatgataca gttgtgatca tggcagaatt gtataatata 13560
gatcaagagt ctgcgataat gagggttgaa tcagaagagg acggccctgt agacaaaatg 13620
aatcttgcac ccatactaag gcttgtgcca atcacattca aatcaatgga cttgcatgcc 13680
ttaactgggc taggtagaaa agaggtggaa ctgatgggta gcccagtttg caaaatcact 13740
cagagattag ataagtacat ctatcgcaca attggcacca tatctactgc atggtataaa 13800
gcaagtagtt taatcgccag tgacatactt aaggggggcc cattggggga cagcttatat 13860
ttatgtgagg gaagtggtag tagtatgaca tgtttggaat attgtttccc ttcgaaaaca 13920
atctggtata attcattctt ctcaaatgag ctaaatccac ctcaacggaa catcggccca 13980
ttaccaacac aattttgttc aagcattgtc tatcacaatt tgaatgctga agtcccgtgc 14040
tctgcagggt ttatccaaga tttcaaagta ctctgggccg acaaatcagt ggagactgat 14100
atttctacaa ctgaatgtgt gaatttcatc ctaagcaaag ttgaacttga aacatgcaaa 14160
ttgatacatg cagaccttga tctacctatt gagaccccaa gatctgtctg gatggcttgt 14220
gtcacaaata cattcatttt gggaaatgcc ttattgaagt caggagggaa attggtcatg 14280
aaattatatg cagtagatga gctcctcttt tcatcttgct taggattcgc atggtgcctt 14340
atggacgata taaatatcct ccgaaatggc tacttcaatg acaaatcaaa ggaatgctac 14400
ctcattggga caaaaaaggt gacaatcccg caccagaaaa tccaggatat ccagcagcaa 14460
ataaataaga ttgctagtca agggttaagt gtcatacctg aagctgtaat tcatgacatt 14520
tacaaccagc ttgaggacag tattagatgt gagaaaaaat tcaaaaatga taatgcaccg 14580
acttggtcca atgggatcct caattcgaca gatctattac taataagact tggagggaaa 14640
ccaattgggg aatcactatt agagttaaca tccatacaag gcatggatta tgatgattta 14700
acaggggata taattcaagt aatagacaca gcgctaaatg agattattca cctcaagtct 14760
gatacttcga gcttagatct tgtactgcta atgtctcctt acaatctggc acttggaggg 14820
aaaataagca caattctgaa atctgttgtt caccagactc taatactcag gattatccaa 14880
tctaggcaga ataaggatat accattaaaa ggatggttgt ctctgttgaa tcaaggagtc 14940
atctcactat cttcattgat cccgttgcat gattatctga ggaagagtaa gttgagaaaa 15000
tttatagttc aaaaattagg ccaacaggaa ttacaagcat tttggcagag caggtctcaa 15060
caaatgctga gtagaagtga gaccaagttg ctaataaaag tgctgagtgc tgcttggaag 15120
ggattgttgt aaaattgtaa atatacactg catgtatata aattggttgc tacccttatc 15180
agctaaccac aggtgtaaat tttcatatgg aatgcatatc aataaagata ggcatttaaa 15240
ttatacaatg ataacatatt ttaggttgac aacaatcatt gatataatca ccaatagtag 15300
ctctattact tatttgttaa taataaatgg tacactttga atttaagaaa aaattagaat 15360
tgctatattt tatcgctata gtgggcctgt cggctgcgtt agcggtaaga caaagaggac 15420
ttgtctttta aaaatttatt aaaaaatcat taattgatca tattgctttc cttgtttggt 15480
<210> 11
<211> 15342
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 8
<400> 11
accaaacaag gaatgcaaga ccaacgggaa ctttaaataa aacaatcgaa tcattggggg 60
cgaagcaagt ggatctcggg ctcgaggccg aaacactgga tttcgctgga ggttttgaat 120
aggtcgctat aagactcaat atgtcatctg tattcaatga atatcaggca cttcaagaac 180
aacttgtaaa gccggctgtc aggagacctg atgttgcctc aacaggttta ctcagggcgg 240
aaatacctgt ctgtgttaca ttgtctcaag accccggtga gagatggagc cttgcttgcc 300
ttaatatccg atggcttgtg agtgattcat caaccacacc aatgaagcag ggagcaatat 360
tgtcactgct gagtctacat tcagacaata tgcgagctca cgcaacatta gcagcaaggt 420
ctgcagatgc ttcactcacc atacttgagg tagatgaagt agatattggc aactccctaa 480
tcaaattcaa cgctagaagt ggtgtatctg ataaacgatc aaatcaattg cttgcaattg 540
cggatgacat ccccaaaagt tgcagtaatg ggcatccatt tcttgacaca gacattgaga 600
ccagagaccc gctcgatcta tcagagacca tagaccgcct gcagggtatt gcagctcaga 660
tatgggtgtc agccataaag agcatgacag cgcctgacac cgcatcagag tcagaaagta 720
agaggctggc caaataccaa caacaaggcc gactggttaa gcaagtactt ttgcattctg 780
tagtcaggac agaatttatg agagttattc ggggcagctt ggtactgcgc cagtttatgg 840
ttagcgagtg caagagggct tcagccatgg gcggagacac atctaggtac tatgctatgg 900
tgggtgacat cagtctgtac atcaagaatg caggattgac tgcatttttc ctcaccctga 960
agttcggggt tggtacccag tatccaacct tagcaatgag tgttttctcc agtgacctta 1020
aaagacttgc tgcactcatc aggctgtaca aaaccaaggg agacaatgca ccatacatgg 1080
cattcctgga ggactccgat atgggaaatt ttgctccagc aaattatagc acaatgtact 1140
cttatgccat gggcattggg acgattctgg aagcatctgt atctcgatac cagtatgcta 1200
gagactttac cagtgagaat tatttccgtc ttggagttga gacagcccaa agccagcagg 1260
gagcgtttga cgagagaaca gcccgagaga tgggcttgac tgaggaatcc aaacagcagg 1320
ttagatcact gctaatgtca gtagacatgg gtcccagttc agttcgcgag ccatcccgcc 1380
ctgcattcat cagtcaagaa gaaaataggc agcctgccca gaattcttca gatactcagg 1440
gtcagaccaa gccagtcccg aatcaacccg caccaagggc cgacccagat gacattgatc 1500
catacgagaa cgggctagaa tggtaattca atcacctcga cacatccacc tatacaccaa 1560
ttctgtgaca tattaaccta atcaaacatt tcataaacta tagtagtcat tgatttaaga 1620
aaaaattggg ggcgacctca actgtgaaac acgccagatc tgtccacaac accactcaac 1680
aacccacaca agatggactt cgccaatgat gaagaaattg cagaacttct gaacctcagc 1740
accactgtaa tcaaggagat tcagaaatct gaactcaagc ctccccaaac cactgggcga 1800
ccacctgtca gtcaagggaa cacaagaaat ctaactgatc tatgggaaaa ggagactgca 1860
agtcagaaca agacatcggc tcaatctcca caaaccacac aagttcagtc tgatggaaat 1920
gaggaggaag aaatcaaatc agagtcaatt gatggccaca tcagtggaac tgttaatcaa 1980
ttagagcaag tcccagaaca aaaccagagc agatcttcac caggtgatga tctcgacaga 2040
gctctcaaca agcttgaagg gagaatcaac tcaatcagct caatggataa agaaattaaa 2100
aagggccctc gcatccagaa tctccctggg tcccaagcag caactcaaca ggcgacccac 2160
ccattggcag gggacacccc gaacatgcag gcacggacaa aacccctgac caagccacat 2220
caagaggcaa tcaatcctgg caaccaggac acaggagaga atattcattt accaccttcc 2280
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caatctatga cgaatgtaga tgcggggagt gtccaactac atgcatcatg tgcagagatg 2400
ataagtagaa tgcttgtaga agttatatct aagcttgata aactcgagtc gagactgaat 2460
gatatagcaa aagttgtaaa caccaccccc cttatcagga atgatattaa ccaacttaag 2520
gccacaactg cactgatgtc caaccaaatt gcttccatac aaattcttga cccagggaat 2580
gcaggggtga ggtccctctc tgaaatgaga tctgtgacga agaaagctgc tgttgtaatt 2640
gcaggatttg gagacgaccc aactcaaatt attgaagaag gtatcatggc caaagatgct 2700
cttggaaaac ctgtgcctcc aacatctgtt atcgcagcca aagctcagac ttcttccggt 2760
gtgagtaagg gtgaaataga aggattgatt gcattggtgg aaacattagt tgacaatgac 2820
aagaaggcag cgaaactgat taaaatgatt gatcaagtta aatcccacgc cgattacgcc 2880
cgagtcaagc aggcaatata taatgcataa tattgtaatt atacaaacaa tcaatactgc 2940
tgtcggttgc acccacctta gcaaatcaat aatcttttaa aattgattga ttaagaaaaa 3000
attgactaca ataaggaaag aacaccaagt tgggggcgaa gtcacgattg accacagtcg 3060
ctatctgtaa ggctcctcac caaaaatggc atatacaaca ctaaaactgt gggtggatga 3120
gggtgacatg tcgtcttcgc ttctatcatt cccgttggta ctaaaagaga cagacagagg 3180
cacaaagaag cttcaaccac aggtaagggt agattcaatt ggcgatgtgc agaatgccaa 3240
agagtcctcg atattcgtga ctctatatgg tttcatccaa gcaattaagg agaattcaga 3300
tcgatcgaaa ttcttccatc caaaagatga cttcaaacct gagacagtca ctgcaggact 3360
ggtagtagtg ggtgcaatcc gaatgatggc tgatgtcaat accatctcta atgatgcact 3420
agcgctggag atcactgtta agaaatctgc aacttctcaa gagaaaatga cggtgatgtt 3480
ccacaatagc cccccttcat tgagaactgc aataactatc cgagcaggag gtttcatctc 3540
gaatgcagac gaaaatataa aatgtgccag caagttgact gcaggagtgc agtacatatt 3600
ccgtccaatg tttgtttcaa tcactaaatt acacaatggc aaactatata gggtgcccaa 3660
aagtatccac agcatctcgt ctaccctact gtatagtgtg atgttggagg taggattcaa 3720
agtggacatc gggaaggatc atccccaggc aaaaatgctg aagagggtca caattggcga 3780
tgcagacaca tactggggat ttgcatggtt ccacctgtgc aatttcaaaa agacatcctc 3840
taagggaaag ccgagaacgc tagacgaact gaggacaaaa gtcaaaaata tggggttgaa 3900
attggagtta catgacctat ggggtccgac tattgtggtc caaatcactg gcaagagcag 3960
caaatatgct caaggatttt tttcttccaa tggtacttgt tgcctcccaa tcagcagatc 4020
tgcaccagag cttgggaagc ttctgtggtc ctgctcagca actattggtg acgcaacagt 4080
tgttatccaa tcaagcgaga agggggaact cctaaggtct gatgatctcg agatacgagg 4140
tgctgtggcc tccaagaaag gtagactgag ctcatttcac cccttcaaaa aatgatgcag 4200
gacatagtac agagaatgaa agggccatca gacgtgcgaa aaaaactaaa tctgaaaaaa 4260
actgcccaga ctccacatta atctaggttg cagggaaata atacccgaca tgcacaatac 4320
tatcacggtc accagcaatc agcaaagttg atcaatcact atataaggaa tcaagtggga 4380
taacaattat taatccaatt tcataattat aaaaaattgc tttaaaggtt actgacgagt 4440
cgggggcgaa accttgccac ttaagctgca gtcaatttta gaatctacat attgaattat 4500
gggtaaaata tcaatatatc taattaatag cgtgctatta ttgctggtat atcctgtgaa 4560
ttcgattgac aatacactcg ttgccccaat cggagtcgcc agcgcaaatg aatggcagct 4620
tgctgcatat acaacatcac tttcagggac aattgccgtg cgattcctac ctgtgctccc 4680
ggataatatg actacctgtc ttagagaaac aataactaca tataataata ctgtcaacaa 4740
catcttaggc ccactcaaat ccaatctgga tgcactgctc tcatctgaga cttatcccca 4800
gacaagatta attggggcag ttataggttc aattgctctt ggtgttgcaa catcggctca 4860
aatcactgct gcagtcgctc tcaagcaagc acaagataat gcaagaaaca tactggcact 4920
caaagaggca ctgtccaaaa ctaatgaggc ggtcaaggag cttagcagtg gattgcaaca 4980
aacagctatt gcacttggta agatacagag ctttgtgaat gaggaaattc tgccatctat 5040
caaccaactg agctgcgagg tgacagccaa taaacttggg gtgtatttat ctctgtatct 5100
cacagaactg accactatat tcggtgcaca gttgactaac cctgcattga cttcattatc 5160
atatcaagcg ctgtacaacc tgtgtggtgg caacatggca atgcttactc agaagattgg 5220
aattaaacag caagacgtta attcgctata tgaagccgga ctaatcacag gacaagtcat 5280
tggttatgac tctcagtacc agctgctggt catccaggtc aattatccaa gcatttctga 5340
ggtaactggt gtgcgtgcga cagaattagt cactgttagt gtaacaacag acaagggtga 5400
agggaaagca attgtacccc aatttgtagc tgaaagtcgg gtgactattg aggagcttga 5460
tgtagcatct tgtaaattca gcagcacaac cctatactgc aggcaggtca acacaagggc 5520
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agagattgga gcattatcat cccggtatat aacactagat ggaggggtct tagtcaattg 5640
taagtcaatt gtttgtaggt gccttaatcc aagtaagatc atctctcaaa atacaaatgc 5700
tgcagtaaca tatgttgatg ctacaatatg caaaacaatt caattggatg acatacaact 5760
ccagttggaa gggtcactat catcagttta tgcaaggaac atctcaattg agatcagtca 5820
ggtgactacc tccggttctt tggatatcag cagtgagata gggaacatca ataatacggt 5880
gaatcgtgtg gaggatttaa tccaccaatc ggaggaatgg ctggcaaaag ttaacccaca 5940
cattgttaat aatactacac taattgtact ctgtgtgtta agtgcgcttg ctgtgatctg 6000
gctggcagta ttaacggcta ttataatata cttgagaaca aagttgaaga ctatatcggc 6060
attggctgta accaatacaa tacagtctaa tccctatgtt aaccaaacga aacgtgaatc 6120
taagttttga tcattcaggc caaaacagag ggtctaggct cgggttaata aaagttcaat 6180
caatgtttga tttattaggc tttccctact aattattaat gtatttgtga ttatatgata 6240
acgttaaaag tcttaaatat ttaataaaaa atgtaacctg ggggcgacct atttacaggc 6300
tagtatatat taggaagtcc tcatattgca ctataatctc aaacaattat attacctcgt 6360
atccaccttg tctaaagaca tcatgagtaa cattgcatcc agtttagaaa atattgtgga 6420
gcaggatagt cgaaaaacaa cttggagggc catctttaga tggtccgttc ttcttattac 6480
aacaggatgc ttagccttat ccattgttag catagttcaa attgggaatt tgaaaattcc 6540
ttctgtaggg gatctggcgg acgaggtggt aacacctttg aaaaccactc tgtctgatac 6600
actcaggaat ccaattaacc agataaatga catattcagg attgttgccc ttgatattcc 6660
attgcaagta actagtatcc aaaaagacct cgcaagtcaa tttagcatgt tgatagatag 6720
tttaaatgct atcaaattgg gcaacgggac caaccttatc atacctacat cagataagga 6780
gtatgcagga ggaattggaa accctgtctt tactgtcgat gctggaggtt ctataggatt 6840
caagcaattt agcttaatag aacatccgag ctttattgct ggacctacaa cgacccgagg 6900
ctgtacaaga atacccactt ttcacatgtc agaaagtcat tggtgctact cacacaacat 6960
catcgctgct ggctgtcaag atgccagtgc atctagtatg tatatctcaa tgggggttct 7020
ccatgtgtct tcatctggca ctcctatctt tcttactact gcaagtgaac tgatagacga 7080
tggagttaat cgtaagtcat gcagtattgt agcaacccaa ttcggctgtg acattttgtg 7140
cagtattgtc atagagaagg agggagatga ttattggtct gatactccga ctccaatgcg 7200
ccacggccgt ttttcattca atgggagttt tgtagaaacc gaactacccg tgtccagtat 7260
gttctcgtca ttctctgcca actaccctgc tgtgggatca ggcgaaattg taaaagatag 7320
aatattattc ccaatttacg gaggtataaa gcagacttca ccagagttta ccgaattagt 7380
gaaatatgga ctctttgtgt caacacctac aactgtatgt cagagtagct ggacttatga 7440
ccaggtaaaa gcagcgtata ggccagatta catatcaggc cggttctggg cacaagtgat 7500
actcagctgc gctcttgatg cagtcgactt atcaagttgt attgtaaaga ttatgaatag 7560
cagcacagtg atgatggcag cagaaggaag gataataaag atagggattg attactttta 7620
ctatcagcgg tcatcttctt ggtggccatt ggcatttgtt acaaaactag acccgcaaga 7680
gttagcagac acaaactcga tatggctgac caattccata ccaatcccac aatcaaagtt 7740
ccctcggcct tcatattcag aaaattattg cacaaagcca gcagtttgcc ctgctacttg 7800
tgtcactggt gtatactctg atatttggcc cttgacctca tcttcatcac tcccgagcat 7860
aatttggatc ggccagtacc ttgatgcccc tgttggaagg acttatccca gatttggaat 7920
tgcaaatcaa tcacactggt accttcaaga agatattcta cccacctcca ctgcaagtgc 7980
gtattcaacc actacatgtt ttaagaatac tgccaggaat agagtgttct gcgtcaccat 8040
tgctgaattt gcagatgggt tgtttggaga gtacaggata acacctcagt tgtatgaatt 8100
agtgagaaat aattgaatca cgataatttt gggactcatt taattgcaga gtgaaattgt 8160
catcttagga aataatcaat tccatgattt ttattgaaca tgatcaagca atcatgtggg 8220
aaatttatta tcacataact tctaatagtt ttaaatgacg aattaagaaa aaatggaggg 8280
cgacctctac acaaacatgg atgtaaaaca agttgaccta ataatacaac ccgaggttca 8340
tctcgattca cccatcatat tgaataaact ggcactatta tggcgcttga gtggtttacc 8400
catgcctgca gacttacgac aaaaatccgt agtgatgcac atcccagacc acatcttaga 8460
aaaatcagaa tatcggatca agcaccgtct agggaaaatc aagagtgaca tagcacatta 8520
ctgtcagtat tttaatatta atttggcaaa tcttgatccg ataacccacc ccaaaagttt 8580
gtattggtta tccagactaa caatagctag tgctggaacc tttagacata tgaaagatag 8640
aatcttatgt acagttggct ccgaattcgg acacaaaatt caagatttat tttcactgct 8700
gagccataaa ttagtaggta acggtgattt atttaatcaa agtctctcag gtacacgttt 8760
gactgcgagt ccgttatccc ctttatgcaa tcaatttgtc tctgacatca agtctgcagt 8820
cacgacaccc tggtcagaag ctcgttggtc ttggcttcat atcaaacaaa caatgagata 8880
cctgataaaa caatcacgca ctacaaattc agctcattta acagaaatta taaaagagga 8940
atggggttta gtaggtatta ctccagatct tgtcattctt tttgacagag tcaataatag 9000
tctaactgca ttaacatttg agatggttct aatgtattca gatgtattag aatcccgtga 9060
caatattgtg ctagtggggc gattatctac ttttctgcag ccagtagtta gtagactgga 9120
ggtgttgttt gatctagtag attcattggc aaaaacctta ggtgacacaa tatacgaaat 9180
tattgcggtg ttagagagct tgtcttatgg gtccgttcaa ctacatgatg caagtcactc 9240
tcatgcaggg tctttctttt catttaacat gaatgaactt gataacacac tatcaaagag 9300
ggtggatccg aaacacaaga acaccataat gagcattata agacaatgct tttctaatct 9360
agatgttgat caagctgcag agatgctatg cctgatgaga ttatttggac acccaatgtt 9420
aactgcaccg gatgcagcag ccaaagtaag gaaagcaatg tgtgctccaa aacttgttga 9480
acatgacacc atcttgcaga cattatcctt cttcaaggga ataattataa atgggtacag 9540
aagatcacac tctggcctgt ggcccaatgt agagccgtct tcaatctatg atgatgatct 9600
cagacagctg tacttagagt cagcagagat ttcccatcat ttcatgctta aaaactacaa 9660
gagtttgagc atgatagaat tcaagaagag catagactac gatcttcacg acgacttaag 9720
tactttctta aaggatagag caatttgccg gccaaaatcc cagtgggatg ttatattccg 9780
taagtcttta cgcagatccc acacgcggtc ccagtatatg gacgaaatta agagcaaccg 9840
attgctaatt gattttcttg attctgctga ttttgaccct gaaaaggaat ttgcatatgt 9900
aaccacaatg gattatttgc acgataatga attttgtgct tcatattctc taaaggaaaa 9960
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agtgatactt gaatctctgt tatcaaaaca tatatgcaag ttcttcaaag agaacggcgt 10080
ttcgatggag caattgtcat tgaccaagag tctacttgca atgtctcaac tctcaccaaa 10140
agtctcgact ctgcaggaca ctgcatcacg tcatgtaggc aactcaaaat ctcagatcgc 10200
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tgaatggata catttaagac tcatgaacag caccttattt gtcggtgatc cttactcgcc 10440
tcctgaagat ccaacactag aggatataga taaagcacca aatgacgata tcttcatagt 10500
ttctccaagg ggaggcatag agggtttatg tcagaagatg tggaccatga tatcaattag 10560
tgcgatacac tgtgtagcag agaaaattgg tgcacgagtg gcagcaatgg tgcagggtga 10620
taatcaagta atagctatca ccaaagaact attcagagga gagaaagcct gtgatgtcag 10680
agatgagtta gacgagctcg gtcaggtgtt ttttgatgag ttcaagaggc acaattatgc 10740
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caaacgaata ttctttgaag ggcgattgct tagtcaagtc ctcaaaaatg ctgccaagtt 10860
atgtatggtt gctgaccatc taggtgaaaa cacagtatct tcctgtagca acctgagctc 10920
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tagtgtcaaa agcttgatcg gatcaaaaaa ctatcggaat ctattgtact catctctaat 11100
accaggtcag ctcggtggtt tcaacttcct caatataagt cggttgttca ctaggaatat 11160
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tccaccctat gtacttaaaa atgtggttct gcgtgagcct ggtcctggga catggttgac 11280
gttgtgctct gatccttaca cccttaacat accatacaca cagctaccaa ccacatatct 11340
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cacctcctta atatcagttg agacctgtag tgtgacaatt gcggactatt tgagagctgt 11760
cagctggtct aatatattag ggggaagaag catatccggg gtgactacac ctgatactat 11820
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tactaactct aaaatgcgtg tgccatatct gggttcaaaa acagaggagc gtaaaacagc 12000
ttcaatggca gcaataaaag gaatgtcaca tcacctgcgt gcagtcttaa gaggtacatc 12060
cgtatttatt tgggcatctg gggacacaga tattaattgg gataatgcat tgcagattgc 12120
ccaatcacgg tgtaacatca cattggatca aatgagatta cttacaccaa ttcctagcag 12180
ttcaaatatc caacgtagac tcgatgacgg aatcagcacg cagaaattta ctcctgcaag 12240
ccttgctcga atcacatcct ctgttcacat ctgtaatgac agccaaaggt tagagaagga 12300
tggctcctct gtcgactcaa acttgattta ccagcaaatt atgttacttg gactcagcat 12360
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caattttgat aattcagtca attggatttc agagtgccta atgtgtgata ttcgctcact 12780
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aatcaggggt agaagggcca ttcttaatta cttggacaca actttgcaaa ggatccctgt 12900
gatacagtta gccaacattg cactcaccat ttcacaccct gagatatttc gcagaattgt 12960
caacaccggg atccataacc agattaaggg cccatatgtg gcaacaacag atttcatagc 13020
tgcaagtaga gatatcatat tatcaggtgc aagggagtat ctatcttatc taagcagtgg 13080
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ccccattatc cgatcactga caccaataga gaagtgcaag gtgctcacag aatacaatca 13260
acaaattgag tatgcagatc aagagtttag ctctgtattg aaagtggtca atgcactact 13320
acaaaatcct aatatagatg cattggtttc aaatctctac ttcaccacca gacgtgtttt 13380
atcaaacctc agatcatgtg ataaggctat atcatatatt gaatatttgt acactgagga 13440
cttcggagaa aaagaagata cagtacaata tgacatcatg acaacaaacg atatcatact 13500
tactcatggt ctattcacac agatcgaaat atcttaccaa gggagtagtc tccataaatt 13560
cctaactccg gataacgcgc ctggatcatt gatcccattc tctatttcac caaattcgct 13620
tgcatgtgat cctcttcacc acttactcaa gtcggtcggt acatcaagca caagctggta 13680
caagtatgca atcgcctatg cagtgtctga aaagaggtcg gctcgattag gagggagctt 13740
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tgacatattt tacaattcac tcttctcaaa tggtatgaac ccaccacaac gaaattatgg 13860
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ggtgaaagta tataggacat ctgaaaaagt atttcagttc ttactgagtg ccatgatcat 14220
gatctttggt tatgtcaaaa tccacaggaa tggttatatg tcggcaaagg atgaggagta 14280
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ctcagagagt gctgatcttg acctcgcttt aatgttaggc ccattcaact tgaataagct 14700
taagaaaatt gacacaatcc ttaagtcaag cacctatcag ctaatcccgt attggttgcg 14760
ctatgagtac tctattaatc cgagatcttt gtcatttcta atcactaaat tacaacaatg 14820
ccgaatttca tggtcagata tgataacaat ctctgaattt tgcaagaaat ccaagcggcc 14880
tatatttatt aaacgagtaa tagggaatca acggctgaaa tcattcttta atgaaagctc 14940
aagtattgtt ttgacccggg ctgaagtcaa agtctgtata aagttcctcg gtgcgatcat 15000
caagttgaaa taatttctgt gttttttaag gggtatagta ttctaagttg cacttgaagt 15060
aatatagctt gtaatcattc gctaggggat agaataattc ctataatctc tgaatatata 15120
tctctaggtt ataacaaata tatacataat aaaattgatt ttaagaaaaa atccgacttt 15180
caaagaagat tggtgcctgt aatattcttc ttgccagatg attatggagg gtctagccta 15240
acttaaaaca atcgtattcg atagggaaga atgacatata aagtaactaa taaaaaattg 15300
tattagtgaa aattaccgta tttcctgtat tccatttctg gt 15342
<210> 12
<211> 15438
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 9
<400> 12
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tagaaggatt gaatctcgag tgcgaacacg acgctgtgat tcgaaggtcc gtactaccat 120
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ctcgaacgtc ttaggagaga aaggtgacac tccaaaagtc gagatccctg tatttgtgct 240
caacagtgac aaccctgaag atcgctggaa ctttactacc ttctgtctca gagtcgctgt 300
gagcgaggat gctaataggc ctttgcgtca gggggcactc atctctctac tttgcgctca 360
ttctcaggtg atgaagaatc atgtggccat agcaggaaag caggatgagg ctctgattgt 420
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aaatattagg ggcctgactg ccgaagataa gtgccggatg ctcacaaatc atctcatgaa 13560
ccttccatct gaatttcggc tgaccgaaaa tcaggtacga aatgtactgc aaccagcact 13620
gacaactttc ccagcaaacc tctattatat gtcaagaaag agtcttaata tcatcagaga 13680
gagggagata aagatgctat tattcaaatg ttgttccctg ccggggatga agctacaagc 13740
acggtggcag ttaatttggg atacgaaagt aaatgacccc attgttaagt ggcgacgcat 13800
tgaattctta tgcgagctcg atctctctgg tcaggcaagg tttggagtca tactggatga 13860
atgcatctct gatgttgata aaaacggaca gggcatcctc gactttgtcc caatgactcg 13920
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cggtgcaata atgagtctgt tagagctcca cgtaccacat gagaagattt actacaatac 14100
tctcttttat aacgagatga accccccgca aagacatttc ggcccaacgc caactcaatt 14160
ccttgcatcg gtcgtttaca agaaccttca ggcaggtata gtctgcaaag atgggtatgt 14220
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gtgtgtctca ttcattacat cagaggtgcc tggaggcact gtatctctac tccattgtga 14340
catagaaaca accctggaac caagctgggc ttacttggag caattagcca ctaatatctc 14400
tctaatcggg atgcacgtcc tgcgagagaa tggagtgttc atcatcaaag tactatacac 14460
ccagagtttc ttttttcatc tattgctggc aatcttagct ccttgtagta aaaggatacg 14520
gatcatatcc aatggatact cagtacgggg agattttgag tgctacctag tcgcgacaat 14580
cagttataca ggggggcatg tcttcatgca agaggtgatc cgctctgcca aggcgttagt 14640
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gaggcagctc aacaggattc gtgggatact gggacagagg atatcgataa tgatacgcta 14760
cttgcagcat actattgata tggcattgat tgaagcggga ggccaacctg taagaccgag 14820
caatgttgga atcaacaagg cactcgactt aggagatgag acatatgagg aaatcatgat 14880
acagcatatt gacacaacac ttaagacagc aatcttccta gaacaagaag aagaactggc 14940
agacacagtc tttgtgttaa caccttataa cctaacggca agaggaaaat gtaatacagt 15000
acttattgca tgcactaaac atctatttga aacaactata ttacagacta cacgagacga 15060
catggataag atagagaaat tgttgtccct tatcttacaa ggtcatatct cgcttcagga 15120
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ggatgcatct cattgcaatt gaatcatgac gcaatctctt ttatacatca tactcgtaat 15360
caatcatagt taccatcatt tttaagaaaa acagtaacga tttatggtgt cacgtatgtt 15420
gccaaatctt tgtttggt 15438
<210> 13
<211> 15185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 13
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tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120
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tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca 360
ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 420
cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaataata ggagtggagt 480
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gtctaagtct gacagcggat actatgctaa cctcttcttg catattggac ttatgaccac 4020
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ggatagcata tccttgacca agagtatgct agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa 10200
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taatgtaaac ttagagtatc ttcggttact gtccccttta cccacggctg ggaatcttca 12180
acatagacta gatgatggta taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt 12240
gtcaccttac attcacatat ccaatgattc tcaaaggctg ttcactgaag aaggagtcaa 12300
agaggggaat gtggtttacc aacagatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat 12360
ctttccaatg acaacaacca ggacatatga tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt 12420
tagttgctgt atcagagaag cacctgttgc ggttcctttc gagctacttg gggtggtacc 12480
ggaactgagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagccctg tatcggaggg 12540
agactttgcg agacttgact tagctatctt caagagttat gagctcaatc tggagtcata 12600
tcccacgata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttga ttggccagtc 12660
tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa 12720
tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc 12780
agcacttgaa gtgctcctcg actgttctta ccaactctat tacctgagag taagaggcct 12840
agacaatatt gtcttatata tgggtgattt atacaagaat atgccaggaa ttctactttc 12900
caacattgca gctacaatat ctcatcccgt cattcattca aggttacatg cagtgggcct 12960
ggtcaaccat gacggatcac accaacttgc agatacggat tttatcgaaa tgtctgcaaa 13020
actattagta tcttgcaccc gacgtgtgat ctccggctta tattcaggaa ataagtatga 13080
tctgctgttc ccatctgtct tagatgataa cctgaatgag aagatgcttc agctgatatc 13140
ccggttatgc tgtctgtaca cggtactctt tgctacaaca agagaaatcc cgaaaataag 13200
aggcttaact gcagaagaga aatgttcaat actcactgag tatttactgt cggatgctgt 13260
gaaaccatta cttagccccg atcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca taattacatt 13320
cccagctaat ctgtactaca tgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga 13380
cagggatact atcctggcgt tgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt 13440
gcaagatatt ggtgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca 13500
agagttagat ttgagtgctc cagcaaggta tgacgcattc acacttagtc agattcatcc 13560
tgaactcaca tctccaaatc cggaggaaga ccacttagta cgatacttgt tcagagggat 13620
agggactgca tcttcctctt ggtataaggc atctcatctc ctttctgtac ccgaggtaag 13680
atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct 13740
tctcgaactg catgtaccac atgaaactat ctattacaat acgctctttt caaatgagat 13800
gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta 13860
taggaatcta caggcggagg taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt 13920
atggagagaa aatacagagg aaagtgacct gacctcagat aaagcagtgg ggtatattac 13980
atctgcagtg ccctacagat ctgtatcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg 14040
gtccaatcaa agcttactag atcaactagc tatcaattta tctctgattg ccatgcattc 14100
tgtaagggag ggcggggtag taatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca 14160
tctactcatg aacttgtttg ctccgtgttc cacaaaagga tatattctct ctaatggtta 14220
tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc 14280
tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc aaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct 14340
tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt 14400
gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaaattgac 14460
actgcgctga ttgaagccgg gggacagccc gtccgtccat tctgtgcgga gagtctggtg 14520
agcacgctag cgaacataac tcagataacc cagatcatcg ctagccacat tgacacagtt 14580
atccggtctg tgatatatat ggaagctgag ggtgatctcg ctgacacagt atttctattt 14640
accccttaca atctctctac tgacgggaaa aagaggacat cacttaaaca gtgcacgaga 14700
cagatcctag aggttacaat actaggtctt agagtcgaaa atctcaataa aataggcgat 14760
ataatcagcc tagtgcttaa aggcatgatc tccatggagg accttatccc actaaggaca 14820
tacttgaagc atagtacctg ccctaaatat ttgaaggctg tcctaggtat taccaaactc 14880
aaagaaatgt ttacagacac ttctgtactg tacttgactc gtgctcaaca aaaattctac 14940
atgaaaacta taggcaatgc agtcaaagga tattacagta actgtgactc ttaacgaaaa 15000
tcacatatta ataggctcct tttttggcca attgtattct tgttgattta atcatattat 15060
gttagaaaaa agttgaaccc tgactcctta ggactcgaat tcgaactcaa ataaatgtct 15120
taaaaaaagg ttgcgcacaa ttattcttga gtgtagtctc gtcattcacc aaatctttgt 15180
ttggt 15185
<210> 14
<211> 16696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多核苷酸
<400> 14
acgaaaaaga agaataaaag gcagaagcct tttaaaagga accctgggct gtcgtaggtg 60
tgggaaggtt gtattccgag tgcgcctccg aggcatctac tctacaccta tcacaatggc 120
tggtgtcttc tcccagtatg agaggtttgt ggacaatcaa tcccaagtgt caaggaagga 180
tcatcggtcc ttagcaggag gatgccttaa agttaacatc cctatgcttg tcactgcatc 240
tgaagacccc accactcgtt ggcaactagc atgcttatct ctaaggctcc tgatctccaa 300
ctcatcaacc agtgctatcc gtcagggggc aatactgact ctcatgtcat taccatcaca 360
aaacatgaga gcaacagcag ctattgctgg ttccacaaat gcagctgtta tcaacaccat 420
ggaagtctta agtgtcaacg actggacccc atccttcgac cctaggagcg gtctttctga 480
ggaagatgct caagttttca gagacatggc aagagatctg ccccctcagt tcacctctgg 540
atcacccttc acatcagcat tggcggaggg gttcactcct gaagatactc atgacctgat 600
ggaggccttg accagtgtgc tgatacagat ctggatcctg gtggctaagg ccatgaccaa 660
cattgacggc tctggggagg ccaatgaaag acgtcttgca aagtacatcc aaaaaggaca 720
gcttaatcgt cagtttgcaa ttggtaatcc tgcccgtctg ataatccaac agacaatcaa 780
aagctcctta actgtccgta ggttcttggt ctctgagctt cgtgcgtcac gaggtgcagt 840
aaaagaagga tccccttact atgcagctgt tggggatatc cacgcttaca tctttaatgc 900
gggattgaca ccattcttga ccaccttaag atacgggata ggcaccaagt acgccgctgt 960
tgcactcagt gtgttcgctg cagatattgc aaagttgaag agcctactta ccctgtacca 1020
ggacaagggt gtagaagctg gatacatggc actccttgag gatccagact ccatgcactt 1080
tgcacctgga aacttcccac acatgtactc ctatgcaatg ggggtagctt cttaccatga 1140
tcctagcatg cgccaatacc aatacgccag gaggttcctc agccgtcctt tctacttact 1200
aggaagggac atggccgcca agaacacagg cacgctggat gagcaactgg cgaaggaact 1260
gcaagtatca gagagagatc gcgccgcatt atccgctgcg attcaatcag cgatggaggg 1320
gggagagtcc gacgacttcc cactgtcggg atccatgccg gctctctctg agaatgcgca 1380
accagttacc cccagacctc aacagtccca gctctctccc ccccaatcat caaacatgcc 1440
ccaatcagca cccaggaccc cagactatca acccgacttt gaactgtagg cttcatcacc 1500
gcaccaacaa cagcccaaga agaccacccc tccccccaca catctcaccc agccacccat 1560
aaagactcag tcccacgccc cagcatctcc ttcatttaat taaaaaccga ccaacagggt 1620
ggggaaggag agtcattggc tactgccaat tgtgtgcagc aatggatttt actgacattg 1680
atgctgtcaa ctcattgatc gaatcatcat cggcaatcat agactccata cagcatggag 1740
ggctgcaacc agcgggcacc gtcggcctat cgcagatccc aaaagggata accagcgcat 1800
taaccaaggc ctgggaggct gaggcggcaa ctgccggtaa tggggacacc caacacaaat 1860
ctgacagtcc ggaggatcat caggccaacg acacagattc ccctgaagac acaggtactg 1920
accagaccac ccaggaggcc aacatcgttg agacacccca ccccgaggtg ctgtcagcag 1980
ccaaagccag actcaagagg cccaaagcag ggagggacac ccgcgacaac tcccctgcgc 2040
aacccgatca tcttttaaag gggggcctcc tgagcccaca accagcagca tcatgggtgc 2100
aaaatccacc cagtcatgga ggtcccggca ccgccgatcc ccgcccatca caaactcagg 2160
atcattcccc caccggagag aaatggcgat tgtcaccgac aaagcaaccg gagacattga 2220
actggtggag tggtgcaacc cggggtgcac agcagtccga attgaaccca ccagactcga 2280
ctgtgtatgc ggacactgcc ccaccatctg tagcctctgc atgtatgacg actgatcagg 2340
tacaactact aatgaaggag gttgctgaca taaaatcact ccttcaggcg ttagtgagga 2400
acctcgctgt cttgccccaa ttgaggaatg aggttgcagc aatcagaaca tcacaggcca 2460
tgatagaggg gacactcaat tcgatcaaga ttcttgaccc tgggaattat caggaatcat 2520
cactaaacag ttggttcaaa cctcgccaag atcacactgt tgttgtgtct ggaccaggga 2580
atccattggc catgccaacc ccagtccaag acaacaccat attcctggac gagctagcca 2640
gacctcatcc tagtgtggtc aatccttccc cacccatcac caacaccaat gttgaccttg 2700
gcccacagaa gcaggctgca atagcctata tctccgctaa atgcaaggat ccggggaaac 2760
gagatcagct atcaaggctc attgagcgag caaccacccc aagtgagatc aacaaagtta 2820
aaagacaagc ccttgggctc tagatcactc gatcacccct catggtgatc acaacaataa 2880
tcagaaccct tccgaaccac atgaccaacc cagcccaccg cccacaccgt ccatcacgcg 2940
tgtagctgat ttattcaaaa ccgccaccat gtgccatcag cagctggtca tctcatggtt 3000
ctccctggtg tttctggcct cacctctggt cgcaatctgg gaactgaaaa aggatgtgta 3060
cgtggtggag ctggactggt atcccgatgc ccctggcgag atggtggtgc tgacctgcga 3120
cacacccgag gaggatggca tcacctggac actggatcag agctccgagg tgctgggaag 3180
cggcaagacc ctgacaatcc aggtgaagga gttcggcgac gccggccagt acacctgtca 3240
caagggagga gaggtgctga gccactccct gctgctgctg cacaagaagg aggatggcat 3300
ctggtccaca gacatcctga aggatcagaa ggagccaaag aacaagacct tcctgcggtg 3360
cgaggccaag aattatagcg gccggttcac ctgttggtgg ctgaccacaa tctccaccga 3420
tctgacattt tctgtgaagt ctagcagggg atcctctgac ccacagggag tgacatgcgg 3480
agcagccacc ctgagcgccg agagggtgcg cggcgataac aaggagtacg agtattccgt 3540
ggagtgccag gaggactctg cctgtccagc agcagaggag tccctgccta tcgaagtgat 3600
ggtggatgcc gtgcacaagc tgaagtacga gaattatacc agctccttct ttatccggga 3660
catcatcaag cccgatcccc ctaagaacct gcagctgaag cctctgaaga atagcagaca 3720
ggtggaggtg tcctgggagt accctgacac ctggagcaca ccacactcct atttctctct 3780
gaccttttgc gtgcaggtgc agggcaagtc caagcgggag aagaaggaca gagtgttcac 3840
cgataagaca tctgccaccg tgatctgtag aaagaacgcc tctatcagcg tgagggccca 3900
ggaccgctac tattctagct cctggtccga gtgggcctct gtgccttgca gcggcggagg 3960
aggaggagga tctaggaatc tgccagtggc aacccctgac ccaggcatgt tcccctgcct 4020
gcaccacagc cagaacctgc tgagggccgt gtccaatatg ctgcagaagg cccgccagac 4080
actggagttt tacccttgta ccagcgagga gatcgaccac gaggacatca caaaggataa 4140
gacctccaca gtggaggcct gcctgccact ggagctgacc aagaacgagt cctgtctgaa 4200
cagccgggag acaagcttca tcaccaacgg ctcctgcctg gcctctagaa agacaagctt 4260
tatgatggcc ctgtgcctgt ctagcatcta cgaggacctg aagatgtatc aggtggagtt 4320
caagaccatg aacgccaagc tgctgatgga ccccaagagg cagatctttc tggatcagaa 4380
tatgctggcc gtgatcgacg agctgatgca ggccctgaac ttcaatagcg agacagtgcc 4440
tcagaagtcc tctctggagg agccagattt ctacaagacc aagatcaagc tgtgcatcct 4500
gctgcacgcc tttcggatca gagccgtgac aatcgaccgc gtgatgtcct atctgaatgc 4560
ttcctaatga cccacgcgtc atcccttgcc aaacatcctg ccgtagctga tttattcaaa 4620
agagctcatt tgatatgacc tggtaatcat aaaatagggt ggggaaggtg ctttgcctgt 4680
aagggggctc cctcatcttc agacacgtgc ccgccatctc accaacagtg caatggcaga 4740
catggacacg gtgtatatca atctgatggc agatgaccca acccaccaaa aagaactgct 4800
gtcctttcct ctcatccctg tgaccggtcc tgacgggaag aaggaactcc aacaccagat 4860
ccggacccaa tccttgctcg cctcagacaa acaaactgaa cggttcatct tcctcaacac 4920
ttacggattc atctatgaca ccacaccgga caagacaact ttttccaccc cagagcatat 4980
taatcagcct aagaggacga cggtgagtgc cgcgatgatg accattggcc tggttcccgc 5040
caatataccc ctgaacgaac taacggctac tgtgttcagc cttaaagtaa gagtgaggaa 5100
aagtgcgagg tatcgggaag tggtctggta tcaatgcaat ccagtaccgg ccctgcttgc 5160
agccaccagg tttggtcgcc aaggaggtct cgagtcgagc actggagtca gtgtaaaggc 5220
tcccgagaag atagattgtg agaaggatta tacctactac ccttatttct tatctgtgtg 5280
ctacatcgcc acctccaacc tgttcaaggt accgaggatg gttgctaatg caaccaacag 5340
tcaattatac caccttacca tgcaggtcac atttgccttt ccaaaaaaca tccctccagc 5400
caaccagaaa ctcctgacac aggtggatga gggattcgag ggcactgtgg attgccattt 5460
tgggaacatg ctgaaaaagg atcggaaagg gaacatgagg acactgtccc aggcggcaga 5520
taaggtcaga cgaatgaata ttcttgttgg tatctttgac ttgcatgggc caacgctctt 5580
cctggagtat accgggaaac tgacaaaggc tctgctaggg ttcatgtcca ccagccgaac 5640
agcaatcatc cccatatctc agctcaatcc catgctgagt caactcatgt ggagcagtga 5700
tgcccagata gtaaagttaa gggttgtcat aactacatcc aaacgcggcc cgtgcggggg 5760
tgagcaggag tatgtgctgg atcccaaatt cacagttaag aaagaaaagg ctcgactcaa 5820
ccctttcgag aaggcagcct aatgatttaa tccgcaagat cccagaaatc agaccactct 5880
atactatcca ctgatcactg gaaatgtaat tgtacagttg atgaatctgt gaagaatcaa 5940
ttaaaaaacc ggatccttat tagggtgggg aagtagttga ttgggtgtct aaacaaaagc 6000
atttcttcac acctccccgc cacgaaacaa ccacaatgag gctatcaaac acaatcttga 6060
ccttgattct catcatactt accggctatt tgataggtgt ccactccacc gatgtgaatg 6120
agaaaccaaa gtccgaaggg attaggggtg atcttacacc aggtgcgggt attttcgtaa 6180
ctcaagtccg acagctccag atctaccaac agtctgggta ccatgatctt gtcatcagat 6240
tgttacctct tctaccaaca gagcttaatg attgtcaaag ggaagttgtc acagagtaca 6300
ataacactgt atcacagctg ttgcagccta tcaaaaccaa cctggatact ttgttggcag 6360
atggtagcac aagggatgtt gatatacagc cgcgattcat tggggcaata atagccacag 6420
gtgccctggc tgtagcaacg gtagctgagg taactgcagc tcaagcacta tctcagtcaa 6480
aaacgaatgc tcaaaatatt ctcaagttga gagatagtat tcaggccacc aaccaagcag 6540
tttttgaaat ttcacaggga ctcgaagcaa ctgcaaccgt gctatcaaaa ctgcaaactg 6600
agctcaatga gaatatcatc ccaagtctga acaacttgtc ctgtgctgcc atggggaatc 6660
gccttggtgt atcactctca ctctatttga ccttaatgac cactctattt ggggaccaga 6720
tcacaaaccc agtgctgacg ccaatctctt acagcaccct atcggcaatg gcgggtggtc 6780
acattggtcc agtgatgagt aagatattag ccggatctgt cacaagtcag ttgggggcag 6840
aacaactgat tgctagtggc ttaatacagt cacaggtagt aggttatgat tcccagtatc 6900
agctgttggt tatcagggtc aaccttgtac ggattcagga agtccagaat actagggttg 6960
tatcactaag aacactagca gtcaataggg atggtggact ttacagagcc caggtgccac 7020
ccgaggtagt tgagcgatct ggcattgcag agcggtttta tgcagatgat tgtgttctaa 7080
ctacaactga ttacatctgc tcatcgatcc gatcttctcg gcttaatcca gagttagtca 7140
agtgtctcag tggggcactt gattcatgca catttgagag ggaaagtgca ttactgtcaa 7200
ctcccttctt tgtatacaac aaggcagtcg tcgcaaattg taaagcagcg acatgtagat 7260
gtaataaacc gccatctatc attgcccaat actctgcatc agctctagta accatcacca 7320
ccgacacttg tgctgacctt gaaattgagg gttatcgttt caacatacag actgaatcca 7380
actcatgggt tgcaccaaac ttcacggtct caacctcaca aatagtatcg gttgatccaa 7440
tagacatatc ctctgacatt gccaaaatta acaattctat cgaggctgcg cgagagcagc 7500
tggaactgag caaccagatc ctttcccgaa tcaacccacg gattgtgaac gacgaatcac 7560
taatagctat tatcgtgaca attgttgtgc ttagtctcct tgtaattggt cttattattg 7620
ttctcggtgt gatgtacaag aatcttaaga aagtccaacg agctcaagct gctatgatga 7680
tgcagcaaat gagctcatca cagcctgtga ccaccaaatt ggggacaccc ttctaggtga 7740
ataatcatat caatccattc aataatgagc gggacatacc aatcaccaac gactgtgtca 7800
caaggccggt taggaatgca ccggatctct ctccttcctt tttaattaaa aacggttgaa 7860
ctgagggtga gggggggggt gtgcatggta gggtggggaa ggtagccaat tcctgcccat 7920
tgggccgacc gtaccaagag aagtcaacag aagtatagat gcagggcgac atggagggta 7980
gccgtgataa cctcacagta gatgatgaat taaagacaac atggaggtta gcttatagag 8040
ttgtatccct cctattgatg gtgagtgcct tgataatctc tatagtaatc ctgacgagag 8100
ataacagcca aagcataatc acggcgatca accagtcgta tgacgcagac tcaaagtggc 8160
aaacagggat agaagggaaa atcacctcaa tcatgactga tacgctcgat accaggaatg 8220
cagctcttct ccacattcca ctccagctca atacacttga ggcaaacctg ttgtccgccc 8280
tcggaggtta cacgggaatt ggccccggag atctagagca ctgtcgttat ccggttcatg 8340
actccgctta cctgcatgga gtcaatcgat tactcatcaa tcaaacagct gactacacag 8400
cagaaggccc cctggatcat gtgaacttca ttccggcacc agttacgact actggatgca 8460
caaggatccc atccttttct gtatcatcat ccatttggtg ctatacacac aatgtgattg 8520
aaacaggttg caatgaccac tcaggtagta atcaatatat cagtatgggg gtgattaaga 8580
gggctggcaa cggcttacct tacttctcaa cagtcgtgag taagtatctg accgatgggt 8640
tgaatagaaa aagctgttcc gtagctgcgg gatccgggca ttgttacctc ctttgtagcc 8700
tagtgtcaga gcccgaacct gatgactatg tgtcaccaga tcccacaccg atgaggttag 8760
gggtgctaac aagggatggg tcttacactg aacaggtggt acccgaaaga atatttaaga 8820
acatatggag cgcaaactac cctggggtag ggtcaggtgc tatagcagga aataaggtgt 8880
tattcccatt ttacggcgga gtgaagaatg gatcaacccc tgaggtgatg aataggggaa 8940
gatattacta catccaggat ccaaatgact attgccctga cccgctgcaa gatcagatct 9000
taagggcaga acaatcgtat tatcctactc gatttggtag gaggatggta atgcagggag 9060
tcctaacatg tccagtatcc aacaattcaa caatagccag ccaatgccaa tcttactatt 9120
tcaacaactc attaggattc atcggggcgg aatctaggat ctattacctc aatggtaaca 9180
tttaccttta tcaaagaagc tcgagctggt ggcctcaccc ccaaatttac ctacttgatt 9240
ccaggattgc aagtccgggt acgcagaaca ttgactcagg cgttaacctc aagatgttaa 9300
atgttactgt cattacacga ccatcatctg gcttttgtaa tagtcagtca agatgcccta 9360
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tatttgcatt tacaatgtac ttacaaggga agacgacacg tattgaccca gcttgggcgc 9480
tattctccaa tcatgtaatt gggcatgagg ctcgtttgtt caacaaggag gttagtgctg 9540
cttattctac caccacttgt ttttcggaca ccatccaaaa ccaggtgtat tgtctgagta 9600
tacttgaagt cagaagtgag ctcttggggg cattcaagat agtgccattc ctctatcgtg 9660
tcttataggc acctgcttgg tcaagaaccc tgagcagcca taaaattaac acttgatctt 9720
ccttaaaaac acctatctaa attactgtct gagatccctg attagttacc ctttcaatca 9780
atcaattaat ttttaattaa aaacggaaaa atgggcctag ttccaaggaa aggatgggac 9840
ccattagggt ggggaaggat tactttgttc cttgactcgc acccacgtac acccaatccc 9900
attcctgtca agaaggaacc cttcccaaac tcaccttgca atgtccaatc aggcagctga 9960
gattatacta cccaccttcc atcttttatc acccttgatc gagaataagt gcttctacta 10020
catgcaatta cttggtctcg tgttaccaca tgatcactgg agatggaggg cattcgtcaa 10080
ttttacagtg gatcaagcac accttaaaaa tcgtaatccc cgcttaatgg cccacatcga 10140
tcacactaag gatagactaa gggctcatgg tgtcttgggt ttccaccaga ctcagacaag 10200
tgagagccgt ttccgtgtct tgctccatcc tgaaacttta ccttggctat cagcaatggg 10260
aggatgcatc aaccaggttc ccaaggcatg gcggaacact ctgaaatcta tcgagcacag 10320
tgtgaagcag gaggcgactc aactgaagtt actcatggaa aaaacctcac taaagctaac 10380
aggagtatct tacttattct ccaattgcaa tcccgggaaa actgcagcgg gaactatgcc 10440
cgtactaagt gagatggcat cagaactctt gtcaaatccc atctcccaat tccaatcaac 10500
atgggggtgt gctgcttcag ggtggcacca tgtagtcagc atcatgaggc tccaacagta 10560
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ctgtctcatt aatgcagact acaccgtcgt tttttccgca caggaccgtg tcatagcagt 10680
cttgcctttc gatgttgtcc tcatgatgca agacctgctt gaatcccgac ggaatgtctt 10740
gttctgtgcc cgctttatgt atcccagaag ccaactacat gagaggataa gtacaatact 10800
ggcccttgga gaccaactcg ggagaaaagc accccaagtc ctgtatgatt tcgtagctac 10860
cctcgaatca tttgcatacg ctgctgtcca acttcatgac aacaacccta tctacggtgg 10920
ggctttcttt gagttcaata tccaagaact ggaagctatt ttgtcccctg cacttaataa 10980
ggatcaagtc aacttctaca taagtcaagt tgtctcagca tacagtaacc ttcccccatc 11040
tgaatcagca gaattgctat gcttactacg cctgtggggt catcccttgc taaacagtct 11100
tgatgcagca aagaaagtca gagaatctat gtgtgctggg aaggttcttg attataatgc 11160
tattcgacta gttttgtctt tttatcatac gttattaatc aatgggtatc ggaagaaaca 11220
taagggtcgc tggccaaatg tgaatcaaca ttcactactc aacccgatag tgaagcagct 11280
ttactttgat caggaggaga tcccacactc tgttgccctt gagcactatt tagatatctc 11340
gatgatagaa tttgagaaga cttttgaagt ggaactatct gatagtctaa gcatctttct 11400
gaaggataag tcgatagctt tggataaaca agaatggcac agtggttttg tctcagaagt 11460
gactccaaag cacctacgaa tgtctcgtca tgatcgcaag tctaccaata ggctattgtt 11520
agcctttatt aactcccctg aattcgatgt taaggaagag cttaaatatt tgactacagg 11580
tgagtatgcc actgacccaa atttcaatgt ctcttactca ctgaaagaga aggaagttaa 11640
gaaagaaggg cgcattttcg caaagatgtc acagaaaatg agagcatgcc aggttatttg 11700
tgaagagtta ctagcacatc atgtggctcc tttgtttaaa gagaatggtg ttacacaatc 11760
ggagctatcc ctgacaaaga atttgttggc tattagccaa ctgagttaca actcgatggc 11820
cgctaaggtg cgattgctga ggccagggga caagttcacc gctgcacact atatgaccac 11880
agacctaaaa aagtactgcc ttaactggcg gcaccagtca gtcaaattgt tcgccagaag 11940
cctggatcga ctatttgggt tagaccatgc tttttcttgg atacacgtcc gtctcaccaa 12000
tagcactatg tacgttgctg acccattcaa tccaccagac tcagatgcat gcacaaattt 12060
agacgacaat aagaacactg ggatttttat tataagtgct cgaggtggta tagaaggcct 12120
tcaacagaaa ctatggactg gcatatcaat tgcaatcgcc caggcggcag cagccctcga 12180
gggcttacga attgctgcca ctttgcaggg ggataaccag gttttagcga ttacgaaaga 12240
attcatgacc ccagtctcgg aggatgtaat ccacgagcag ctatctgaag cgatgtcgcg 12300
atacaagagg actttcacat accttaatta tttaatgggg caccaattga aggataaaga 12360
aaccatccaa tccagtgact tcttcgttta ctccaaaagg atcttcttca atgggtcaat 12420
cctaagtcaa tgcctcaaga acttcagtaa actcactacc aatgccacta cccttgctga 12480
gaacactgta gccggctgca gtgacatctc ctcatgcata gcccgttgtg tggaaaacgg 12540
gttgcctaag gatgctgcat atgttcagaa tataatcatg actcggcttc aactgttgct 12600
agatcactac tattctatgc atggtggcat aaactcagag ttagagcagc caactctaag 12660
tatccctgtc cgaaacgcaa cctatttacc atctcaatta ggcggttaca atcatttgaa 12720
tatgacccga ctattctgtc gcaatatcgg tgacccgctt actagttctt gggcagagtc 12780
aaaaagacta atggatgttg gccttctcag tcgtaagttc ttagagggga tattatggag 12840
acccccggga agtgggacat tttcaacact catgcttgat ccgttcgcac ttaacattga 12900
ttacttaagg ccaccagaga caataatccg aaaacacacc caaaaagtct tgttgcagga 12960
ttgtcctaat cctctattag caggtgtagt tgacccgaac tacaaccagg aattagaatt 13020
attagctcag ttcctgcttg atcgggaaac cgttattccc agggctgccc atgccatctt 13080
tgaactgtct gtcttgggaa ggaaaaaaca tatacaagga ttggttgata ctacaaaaac 13140
aattattcag tgctcattag aaagacagcc actgtcctgg aggaaagttg agaacattgt 13200
aacctacaat gcgcagtatt tcctcggggc cacccagcag gttgacacca atatctcaga 13260
aaggcagtgg gtgatgccag gtaatttcaa gaagcttgta tctcttgacg attgctcagt 13320
cacgttgtcc actgtgtcac ggcgcatttc ttgggccaat ctacttaact ggagggctat 13380
agatggtttg gaaactccag atgtgataga gagtattgat ggccgccttg tgcaatcatc 13440
caatcaatgc ggcctatgta atcaaggatt gggctcctac tcctggttct tcttgccctc 13500
cgggtgtgtg ttcgaccgtc cacaagattc tcgagtggtt ccaaagatgc catacgtggg 13560
atccaaaacg gatgagagac agactgcgtc agtgcaggct atacagggat ccacatgtca 13620
ccttagagca gcattgagac ttgtatcact ctacctttgg gcctatggag attctgacat 13680
atcatggcta gaagccgcga cattggctca aacacggtgc aatatttctc ttgatgacct 13740
gcggatcctg agccctcttc cttcctcggc aaatttacac cacagattga atgacggggt 13800
aacacaagtg aaattcatgc ccgccacatc gagccgggtg tcaaagttcg tccaaatttg 13860
caatgacaac cagaatctta tccgtgatga tgggagtgtt gattccaata tgatttatca 13920
gcaggttatg atattagggc ttggagagat tgaatgtttg ttagctgacc caatcgatac 13980
aaacccagaa caactgattc ttcacctaca ctctgataat tcttgctgtc tccgggagat 14040
gccaacgacc ggttttgtac ctgctttagg attgacccca tgcttaactg tcccaaagca 14100
caatccgtat atttatgatg atagcccaat acccggtgat ttggatcaga ggctcattca 14160
aaccaaattc tttatgggtt ctgacaatct agataatctt gatatctacc agcagcgagc 14220
tttactgagt cggtgtgtgg cttatgacat tatccaatca gtattcgctt gcgatgcacc 14280
agtatctcag aagaatgatg caatccttca cactgactac catgaaaatt ggatctcaga 14340
gttccgatgg ggtgaccctc gcataatcca agtaacagca ggttacgagt taattctgtt 14400
ccttgcatac cagctttatt atctcagagt gaggggtgac cgtgcaatcc tgtgttatat 14460
tgataggata ctcaacagga tggtatcttc caatctaggc agtctcatcc agacgctctc 14520
tcatccggag attaggagga gattttcatt gagtgatcaa gggttccttg tcgaaaggga 14580
gctagagcca ggtaagccac tggtaaaaca agcggttatg ttcctaaggg actcagtccg 14640
ctgcgcttta gcaactatca aggcaggaat tgagcctgag atctcccgag gtggctgtac 14700
ccaggatgag ctgagcttta cccttaagca cttactatgt cggcgtctct gtataattgc 14760
tctcatgcat tcggaagcaa agaacttggt caaagttaga aaccttccag tagaggaaaa 14820
aaccgcctta ctataccaga tgttgatcac tgaggccaat gccaggagat cagggtctgc 14880
tagtatcatc ataagcttag tttcagcacc ccagtgggac attcatacac cagcgttgta 14940
ttttgtatca aagaaaatgc tggggatgct caaaaggtca accacaccct tggatataag 15000
tgacctttct gagagccaga acctcacacc aacagaattg aatgatgttc ctggtcacat 15060
ggcagaggaa tttccctgtt tgtttagcag ttataacgct acatatgaag acacaattac 15120
ttacaatcca atgactgaaa aactcgcagt gcacttggac aatggttcca ccccttccag 15180
agcgcttggt cgtcactaca tcctgcgacc ccttgggctt tactcgtctg catggtaccg 15240
gtctgcagca ctattagcgt caggggccct cagtgggttg cctgaggggt caagcctgta 15300
cttgggagag gggtatggga ccaccatgac tctacttgag cccgttgtca agtcctcaac 15360
tgtttactac catacattgt ttgacccaac ccggaatcct tcacagcgga actacaaacc 15420
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tggcattgta aatctatggg gtgaagacgt acgtcagagt gatattacac agaaagacac 15540
ggttaatttc atattatctc gggtcccgcc aaaatcactc aaattgatac acgttgatat 15600
tgagttctcc ccagactctg atgtacggac gctactatct ggctattccc attgtgcact 15660
attggcctac tggctactgc aacctggagg gcgatttgcg gttagagttt tcttaagtga 15720
ccatatcata gtcaacttgg tcactgccat tctgtccgct tttgactcta atctggtgtg 15780
cattgcgtca ggattgacac acaaggatga tggggcaggt tatatttgtg caaagaagct 15840
tgcaaatgtt gaggcttcaa gaattgagta ttacttgagg atggtccacg gctgtgttga 15900
ctcattaaaa attcctcatc aattaggaat cattaaatgg gctgagggtg aagtgtcccg 15960
acttaccaaa aaggcggatg atgaaataaa ctggcggtta ggtgatccag ttaccagatc 16020
atttgatccg gtttctgagc taataattgc gcgaacaggg ggatcagtat taatggaata 16080
cgggactttt actaacctca ggtgtgcgaa cttggcagat acatataaac ttttggcttc 16140
aattgtagag accaccttaa tggaaataag ggttgagcaa gatcagttgg aagatgattc 16200
gaggagacaa atccaggtag tccctgcttt taatacaaga tccgggggaa ggatccgtac 16260
attgattgag tgtgctcagc tgcaggtcat agatgttatc tgtgtgaaca tagatcacct 16320
ctttcccaaa caccgacatg ctcttgtcac acaacttact taccagtcag tgtgccttgg 16380
ggacttgatt gaaggccccc aaattaagac atatctaagg gccaggaagt ggatccaacg 16440
taggggactc aatgagacaa ttaaccatat catcactgga caagtgtcgc ggaataaggc 16500
aagggatttt ttcaagaggc gcctgaagtt ggttggcttt tcgctctgtg gcggttgggg 16560
ctacctctca ctttagctgc ttagattgtt gattattatg aataatcgga gtcgaaatcg 16620
taaatagaaa gacataaaat tgcaaataag caatgatcgt attaatattt aataaaaaat 16680
atgtctttta tttcgt 16696
<210> 15
<211> 5026
<212> DNA
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 15
agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta 60
caggatgcaa ctcctgtctt gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc 120
tacttcaagt tctacaaaga aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca 180
gatgattttg aatggaatta atgtaagtat atttcctttc ttactaaaat tattacattt 240
agtaatctag ctggagatca tttcttaata acaatgcatt atactttctt agaattacaa 300
gaatcccaaa ctcaccagga tgctcacatt taagttttac atgcccaaga aggtaagtac 360
aatattttat gttcaatttc tgttttaata aaattcaaag taatatgaaa atttgcacag 420
atgggactaa tagcagctca tctgaggtaa agagtaactt taatttgttt ttttgaaaac 480
ccaagtttga taatgaagcc tctattaaaa cagttttacc tatattttta atatatattt 540
gtgtgttggt gggggtggga agaaaacata aaaataatat tctcacttta tcgataagac 600
aattctaaac aaaaatgttc atttatggtt tcatttaaaa atgtaaaact ctaaaatatt 660
tgattatgtc attttagtat gtaaaatacc aaaatctatt tccaaggagc ccacttttaa 720
aaatcttttc ttgttttagg aaaggtttct aagtgagagg cagcataaca ctaatagcac 780
agagtctggg gccagatatc tgaagtgaaa tctcagctct gccatgtcct agctttcatg 840
atctttggca aattacctac tctgtttgtg attcagtttc atgtctactt aaatgaataa 900
ctgtatatac ttaatatggc tttgtgagaa ttagtaagta aatgtaaagc actcagaacc 960
gtgtctggca taaggtaaat accatacaag cattagctat tattagtagt attaaagata 1020
aaattttcac tgagaaatac aaagtaaaat tttggacttt atctttttac caatagaact 1080
tgagatttat aatgctatat gacttatttt ccaagattaa aagcttcatt aggttgtttt 1140
tggattcaga tagagcataa gcataatcat ccaagctcct aggctacatt aggtgtgtaa 1200
agctacctag tagctgtgcc agttaagaga gaatgaacaa aatctggtgc cagaaagagc 1260
ttgtgccagg gtgaatccaa gcccagaaaa taataggatt taaggggaca cagatgcaat 1320
cccattgact caaattctat taattcaaga gaaatctgct tctaactacc cttctgaaag 1380
atgtaaagga gacagcttac agatgttact ctagtttaat cagagccaca taatgcaact 1440
ccagcaacat aaagatacta gatgctgttt tctgaagaaa atttctccac attgttcatg 1500
ccaaaaactt aaacccgaat ttgtagaatt tgtagtggtg aattgaaagc gcaatagatg 1560
gacatatcag gggattggta ttgtcttgac ctacctttcc cactaaagag tgttagaaag 1620
atgagattat gtgcataatt tagggggtgg tagaattcat ggaaatctaa gtttgaaacc 1680
aaaagtaatg ataaactcta ttcatttgtt catttaaccc tcattgcaca tttacaaaag 1740
attttagaaa ctaataaaaa tatttgattc caaggatgct atgttaatgc tataatgaga 1800
aagaaatgaa atctaattct ggctctacct acttatgtgg tcaaattctg agatttagtg 1860
tgcttattta taaagtggag atgatacttc actgcctact tcaaaagatg actgtgagaa 1920
gtaaatgggc ctattttgga gaaaattctt ttaaattgta atataccata gaaatatgaa 1980
atattatata taatatagaa tcaagaggcc tgtccaaaag tcctcccaaa gtattataat 2040
tttttatttc actgggacaa acatttttaa aatgcatctt aatgtagtga ttgtagaaaa 2100
gtaaaaattt aagacatatt taaaaatgtg tcttgctcaa ggctatattg agagccacta 2160
ctacatgatt attgttacct agtgtaaaat gttgggattg tgatagatgg catccaagag 2220
ttccttctct ctcaacattc tgtgattctt aactcttaga ctatcaaata ttataatcat 2280
agaatgtgat ttttatgctt ccacattcta actcatctgg ttctaatgat tttctatgca 2340
gattggaaaa gtaatcagcc tacatctgta ataggcattt agatgcagaa agtctaacat 2400
tttgcaaagc caaattaagc taaaaccagt gagtcaacta tcacttaacg ctagtcatag 2460
gtacttgagc cctagttttt ccagttttat aatgtaaact ctactggtcc atctttacag 2520
tgacattgag aacagagaga atggtaaaaa ctacatactg ctactccaaa taaaataaat 2580
tggaaattaa tttctgattc tgacctctat gtaaactgag ctgatgataa ttattattct 2640
aggccacaga actgaaacat cttcagtgtc tagaagaaga actcaaacct ctggaggaag 2700
tgctaaattt agctcaaagc aaaaactttc acttaagacc cagggactta atcagcaata 2760
tcaacgtaat agttctggaa ctaaaggtaa ggcattactt tatttgctct cctggaaata 2820
aaaaaaaaaa agtaggggga aaagtaccac attttaaagt gacataacat ttttggtatt 2880
tgtaaagtac ccatgcatgt aattagccta cattttaagt acactgtgaa catgaatcat 2940
ttctaatgtt aaatgattaa ctggggagta taagctactg agtttgcacc taccatctac 3000
taatggacaa gcctcatccc aaactccatc acctttcata ttaacacaaa actgggagtg 3060
agagaaggta ctgagttgag tttcacagaa agcaggcaga ttttactata tatttttcaa 3120
ttccttcaga tcatttactg gaatagccaa tactgattac ctgaaaggct tttcaaatgg 3180
tgtttcctta tcatttgatg gaaggactac ccataagaga tttgtcttaa aaaaaaaaac 3240
tggagccatt aaaatggcca gtggactaaa caaacaacaa tctttttaga ggcaatcccc 3300
actttcagaa tcttaagtat ttttaaatgc acaggaagca taaaatatgc aagggactca 3360
ggtgatgtaa aagagattca cttttgtctt tttatatccc gtctcctaag gtataaaatt 3420
catgagttaa taggtatcct aaataagcag cataagtata gtagtaaaag acattcctaa 3480
aagtaactcc agttgtgtcc aaatgaatca cttattagtg gactgtttca gttgaattaa 3540
aaaaatacat tgagatcaat gtcatctaga cattgacaga ttcagttcct tatctatggc 3600
aagagtttta ctctaaaata attaacatca gaaaactcat tcttaactct tgatacaaat 3660
ttaagacaaa accatgcaaa aatctgaaaa ctgtgtttca aaagccaaac actttttaaa 3720
ataaaaaaat cccaagatat gacaatattt aaacaattat gcttaagagg atacagaaca 3780
ctgcaacagt tttttaaaag agaatactta tttaaaggga acactctatc tcacctgctt 3840
ttgttcccag ggtaggaatc acttcaaatt tgaaaagctc tcttttaaat ctcactatat 3900
atcaaaatat ttcctcctta gcttatcaac tagaggaagc gtttaaatag ctcctttcag 3960
cagagaagcc taatttctaa aaagccagtc cacagaacaa aatttctaat gtttaaactt 4020
ttaaaagttg gcaaattcac ctgcattgat actatgatgg ggtagggata ggtgtaagta 4080
tttatgaaga tgttcttcac acaaatttat cccaaacaga agcatgtcct agcttactct 4140
agtgtagttc tgttctgctt tggggaaaat ataaggagat tcacttaagt agaaaaatag 4200
gagactctaa tcaagattta gaaaagaaga aagtataatg tgcatatcaa ttcatacatt 4260
taacttacac aaatataggt gtacattcag aggaaaagcg atcaagttta tttcacatcc 4320
agcatttaat atttgtctag atctattttt atttaaatct ttatttgcac ccaatttagg 4380
gaaaaaattt ttgtgttcat tgactgaatt aacaaatgag gaaaatctca gcttctgtgt 4440
tactatcatt tggtatcata acaaaatatg taattttggc attcattttg atcatttcaa 4500
gaaaatgtga ataattaata tgtttggtaa gcttgaaaat aaaggcaaca ggcctataag 4560
acttcaattg ggaataactg tatataaggt aaactactct gtactttaaa aaattaacat 4620
ttttctttta tagggatctg aaacaacatt catgtgtgaa tatgctgatg agacagcaac 4680
cattgtagaa tttctgaaca gatggattac cttttgtcaa agcatcatct caacactgac 4740
ttgataatta agtgcttccc acttaaaaca tatcaggcct tctatttatt taaatattta 4800
aattttatat ttattgttga atgtatggtt tgctacctat tgtaactatt attcttaatc 4860
ttaaaactat aaatatggat cttttatgat tctttttgta agccctaggg gctctaaaat 4920
ggtttcactt atttatccca aaatatttat tattatgttg aatgttaaat atagtatcta 4980
tgtagattgg ttagtaaaac tatttaataa atttgataaa tataaa 5026
<210> 16
<211> 1600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多核苷酸
<400> 16
atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggcggcg gatctagaaa cctccccgtg 1020
gccactccag acccaggaat gttcccatgc cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc 1080
gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa actctagaat tttacccttg cacttctgaa 1140
gagattgatc atgaagatat cacaaaagat aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca 1200
ttggaattaa ccaagaatga gagttgccta aattccagag agacctcttt cataactaat 1260
gggagttgcc tggcctccag aaagacctct tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt 1320
tatgaagact cgaagatgta ccaggtggag ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg 1380
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caggccctga atttcaacag tgagactgtg ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat 1500
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<210> 17
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多核苷酸
<400> 17
atgtgccatc agcagctggt catctcatgg ttctccctgg tgtttctggc ctcacctctg 60
gtcgcaatct gggaactgaa aaaggatgtg tacgtggtgg agctggactg gtatcccgat 120
gcccctggcg agatggtggt gctgacctgc gacacacccg aggaggatgg catcacctgg 180
acactggatc agagctccga ggtgctggga agcggcaaga ccctgacaat ccaggtgaag 240
gagttcggcg acgccggcca gtacacctgt cacaagggag gagaggtgct gagccactcc 300
ctgctgctgc tgcacaagaa ggaggatggc atctggtcca cagacatcct gaaggatcag 360
aaggagccaa agaacaagac cttcctgcgg tgcgaggcca agaattatag cggccggttc 420
acctgttggt ggctgaccac aatctccacc gatctgacat tttctgtgaa gtctagcagg 480
ggatcctctg acccacaggg agtgacatgc ggagcagcca ccctgagcgc cgagagggtg 540
cgcggcgata acaaggagta cgagtattcc gtggagtgcc aggaggactc tgcctgtcca 600
gcagcagagg agtccctgcc tatcgaagtg atggtggatg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaattata ccagctcctt ctttatccgg gacatcatca agcccgatcc ccctaagaac 720
ctgcagctga agcctctgaa gaatagcaga caggtggagg tgtcctggga gtaccctgac 780
acctggagca caccacactc ctatttctct ctgacctttt gcgtgcaggt gcagggcaag 840
tccaagcggg agaagaagga cagagtgttc accgataaga catctgccac cgtgatctgt 900
agaaagaacg cctctatcag cgtgagggcc caggaccgct actattctag ctcctggtcc 960
gagtgggcct ctgtgccttg cagcggcgga ggaggaggag gatctaggaa tctgccagtg 1020
gcaacccctg acccaggcat gttcccctgc ctgcaccaca gccagaacct gctgagggcc 1080
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gagatcgacc acgaggacat cacaaaggat aagacctcca cagtggaggc ctgcctgcca 1200
ctggagctga ccaagaacga gtcctgtctg aacagccggg agacaagctt catcaccaac 1260
ggctcctgcc tggcctctag aaagacaagc tttatgatgg ccctgtgcct gtctagcatc 1320
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gaccccaaga ggcagatctt tctggatcag aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg 1440
caggccctga acttcaatag cgagacagtg cctcagaagt cctctctgga ggagccagat 1500
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<210> 18
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多核苷酸
<400> 18
atggcgccgc gccgcgcgcg cggctgccgc accctgggcc tgccggcgct gctgctgctg 60
ctgctgctgc gcccgccggc gacccgcggc gattataaag atgatgatga taaaattgaa 120
ggccgcatta cctgcccgcc gccgatgagc gtggaacatg cggatatttg ggtgaaaagc 180
tatagcctgt atagccgcga acgctatatt tgcaacagcg gctttaaacg caaagcgggc 240
accagcagcc tgaccgaatg cgtgctgaac aaagcgacca acgtggcgca ttggaccacc 300
ccgagcctga aatgcattcg cgatccggcg ctggtgcatc agcgcccggc gccgccgagc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cctgcagatg 420
cgcattagca aaccgcatct gcgcagcatt agcattcagt gctatctgtg cctgctgctg 480
aacagccatt ttctgaccga agcgggcatt catgtgttta ttctgggctg ctttagcgcg 540
ggcctgccga aaaccgaagc gaactgggtg aacgtgatta gcgatctgaa aaaaattgaa 600
gatctgattc agagcatgca tattgatgcg accctgtata ccgaaagcga tgtgcatccg 660
agctgcaaag tgaccgcgat gaaatgcttt ctgctggaac tgcaggtgat tagcctggaa 720
agcggcgatg cgagcattca tgataccgtg gaaaacctga ttattctggc gaacaacagc 780
ctgagcagca acggcaacgt gaccgaaagc ggctgcaaag aatgcgaaga actggaagaa 840
aaaaacatta aagaatttct gcagagcttt gtgcatattg tgcagatgtt tattaacacc 900
agc 903
<210> 19
<211> 477
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒16型 (Human papillomavirus type 16)
<400> 19
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477
<210> 20
<211> 297
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒16型 (Human papillomavirus type 16)
<400> 20
atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297
<210> 21
<211> 3043
<212> DNA
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 21
ttctcagagt ggctgcagtc tcgctgctgg atgtgcacat ggtggtcatt ccctctgctc 60
acaggggcag gggtcccccc ttactggact gaggttgccc cctgctccag gtcctgggtg 120
ggagcccatg tgaactgtca gtggggcagg tctgtgagag ctcccctcac actcaagtct 180
ctctcacagt ggccagagaa gaggaaggct ggagtcagaa tgaggcacca gggcgggcat 240
agcctgccca aaggcccctg ggattacagg caggatgggg agccctatct aagtgtctcc 300
cacgccccac cccagccatt ccaggccagg aagtccaaac tgtgcccctc agagggaggg 360
ggcagcctca ggcccattca gactgcccag ggagggctgg agagccctca ggaaggcggg 420
tgggtgggct gtcggttctt ggaaaggttc attaatgaaa acccccaagc ctgaccacct 480
agggaaaagg ctcaccgttc ccatgtgtgg ctgataaggg ccaggagatt ccacagttca 540
ggtagttccc ccgcctccct ggcattttgt ggtcaccatt aatcatttcc tctgtgtatt 600
taagagctct tttgccagtg agcccagcta cacagagaga aaggctaaag ttctctggag 660
gatgtggctg cagagcctgc tgctcttggg cactgtggcc tgcagcatct ctgcacccgc 720
ccgctcgccc agccccagca cgcagccctg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg 780
gcgtctcctg aacctgagta gagacactgc tgctgagatg gtaagtgaga gaatgtgggc 840
ctgtgctagg caccagtggc cctgactggc cacgcctgtc agcttgataa catgacattt 900
tccttttcta cagaatgaaa cagtagaagt catctcagaa atgtttgacc tccaggtaag 960
atgcttctct ctgacatagc tttccagaag cccctgccct ggggtggagg tggggactcc 1020
attttagatg gcaccacaca gggttgtcca ctttctctcc agtcagctgg ctgcaggagg 1080
agggggtagc aactgggtgc tcaagaggct gctggccgtg cccctatggc agtcacatga 1140
gctcctttat cagctgagcg gccatgggca gacctagcat tcaatggcca ggagtcacca 1200
ggggacaggt ggtaaagtgg gggtcacttc atgagacagg agctgtgggt ttggggcgct 1260
cactgtgccc cgagaccaag tcctgttgag acagtgctga ctacagagag gcacagaggg 1320
gtttcaggaa caacccttgc ccacccagca ggtccaggtg aggccccacc cccctctccc 1380
tgaatgatgg ggtgagagtc acctccttcc ctaaggctgg gctcctctcc aggtgccgct 1440
gagggtggcc tgggcggggc agtgagaagg gcaggttcgt gcctgccatg gacagggcag 1500
ggtctatgac tggacccagc ctgtgcccct cccaagccct actcctgggg gctgggggca 1560
gcagcaaaaa ggagtggtgg agagttcttg taccactgtg ggcacttggc cactgctcac 1620
cgacgaacga cattttccac aggagccgac ctgcctacag acccgcctgg agctgtacaa 1680
gcagggcctg cggggcagcc tcaccaagct caagggcccc ttgaccatga tggccagcca 1740
ctacaagcag cactgccctc caaccccggt gagtgcctac ggcagggcct ccagcaggaa 1800
tgtcttaatc tagggggtgg ggtcgacatg gggagagatc tatggctgtg gctgttcagg 1860
accccagggg gtttctgtgc caacagttat gtaatgatta gccctccaga gaggaggcag 1920
acagcccatt tcatcccaag gagtcagagc cacagagcgc tgaagcccac agtgctcccc 1980
agcaggagct gctcctatcc tggtcattat tgtcattacg gttaatgagg tcagaggtga 2040
gggcaaaccc aaggaaactt ggggcctgcc caaggcccag aggaagtgcc caggcccaag 2100
tgccaccttc tggcaggact ttcctctggc cccacatggg gtgcttgaat tgcagaggat 2160
caaggaaggg aggctacttg gaatggacaa ggacctcagg cactccttcc tgcgggaagg 2220
gagcaaagtt tgtggccttg actccactcc ttctgggtgc ccagagacga cctcagccca 2280
gctgccctgc tctgccctgg gaccaaaaag gcaggcgttt gactgcccag aaggccaacc 2340
tcaggctggc acttaagtca ggcccttgac tctggctgcc actggcagag ctatgcactc 2400
cttggggaac acgtgggtgg cagcagcgtc acctgaccca ggtcagtggg tgtgtcctgg 2460
agtgggcctc ctggcctctg agttctaaga ggcagtagag aaacatgctg gtgcttcctt 2520
cccccacgtt acccacttgc ctggactcaa gtgtttttta tttttctttt tttaaaggaa 2580
acttcctgtg caacccagat tatcaccttt gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt 2640
ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag ccagtccagg agtgagaccg gccagatgag 2700
gctggccaag ccggggagct gctctctcat gaaacaagag ctagaaactc aggatggtca 2760
tcttggaggg accaaggggt gggccacagc catggtggga gtggcctgga cctgccctgg 2820
gcacactgac cctgatacag gcatggcaga agaatgggaa tattttatac tgacagaaat 2880
cagtaatatt tatatattta tatttttaaa atatttattt atttatttat ttaagttcat 2940
attccatatt tattcaagat gttttaccgt aataattatt attaaaaata tgcttctact 3000
tgtccagtgt tctagtttgt ttttaaccat gagcaaatgc cat 3043
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 除Pro外任何氨基酸
<400> 22
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 除Pro外任何氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 除Pro外任何氨基酸
<400> 23
Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 1
<400> 24
Gly Arg Gln Gly Arg Leu
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 2
<400> 25
Lys Pro Ala Ser Arg Phe
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 3
<400> 26
Arg Pro Ser Gly Arg Leu
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 27
Asp Ile Gln Pro Arg Phe
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 6
<400> 28
Lys Arg Lys Lys Arg Phe
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 7
<400> 29
Leu Pro Ser Ser Arg Phe
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 8
<400> 30
Tyr Pro Gln Thr Arg Leu
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 9
<400> 31
Ile Arg Glu Gly Arg Ile
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 32
acgcgt 6
<210> 33
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 33
ccgccacc 8
<210> 34
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多肽
<400> 34
Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg
325 330 335
Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His
340 345 350
His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala
355 360 365
Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro
385 390 395 400
Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser
405 410 415
Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
420 425 430
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Met Tyr Gln
435 440 445
Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg
450 455 460
Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu
485 490 495
Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
500 505 510
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr
515 520 525
Leu Asn Ala Ser
530
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
肽
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
肽
<400> 36
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gln
20
<210> 37
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多肽
<400> 37
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Asp Tyr
20 25 30
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Glu Gly Arg Ile Thr Cys Pro Pro Pro
35 40 45
Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr
50 55 60
Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly
65 70 75 80
Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala
85 90 95
His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val
100 105 110
His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Met Arg Ile Ser Lys
130 135 140
Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu
145 150 155 160
Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly
165 170 175
Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val
180 185 190
Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile
195 200 205
Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val
210 215 220
Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu
245 250 255
Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys
260 265 270
Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln
275 280 285
Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
290 295 300
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
肽
<400> 38
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Glu Gly Arg
1 5 10
<210> 39
<211> 77
<212> PRT
<213> 人
<400> 39
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro
65 70 75
<210> 40
<211> 162
<212> PRT
<213> 人
<400> 40
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
多肽
<400> 41
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly
20 25 30
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 42
agcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcctgcag 60
<210> 43
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 43
atggcgccgc gccgcgcgcg cggctgccgc accctgggcc tgccggcgct gctgctgctg 60
ctgctgctgc gcccgccggc gacccgcggc 90
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 44
gattataaag atgatgatga taaaattgaa ggccgc 36
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成
寡核苷酸
<400> 45
ggtggcggtg gcggcggatc t 21
<210> 46
<211> 328
<212> PRT
<213> 人
<400> 46
Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 47
<211> 984
<212> DNA
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 47
atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagt 984
<210> 48
<211> 197
<212> PRT
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 48
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 49
<211> 594
<212> DNA
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 49
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300
tgccttagta gtatttatga agactcgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaa 594
<210> 50
<211> 231
<212> DNA
<213> 人
<400> 50
attacctgcc cgccgccgat gagcgtggaa catgcggata tttgggtgaa aagctatagc 60
ctgtatagcc gcgaacgcta tatttgcaac agcggcttta aacgcaaagc gggcaccagc 120
agcctgaccg aatgcgtgct gaacaaagcg accaacgtgg cgcattggac caccccgagc 180
ctgaaatgca ttcgcgatcc ggcgctggtg catcagcgcc cggcgccgcc g 231
<210> 51
<211> 486
<212> DNA
<213> 人 (Homo sapiens)
<400> 51
atgcgcatta gcaaaccgca tctgcgcagc attagcattc agtgctatct gtgcctgctg 60
ctgaacagcc attttctgac cgaagcgggc attcatgtgt ttattctggg ctgctttagc 120
gcgggcctgc cgaaaaccga agcgaactgg gtgaacgtga ttagcgatct gaaaaaaatt 180
gaagatctga ttcagagcat gcatattgat gcgaccctgt ataccgaaag cgatgtgcat 240
ccgagctgca aagtgaccgc gatgaaatgc tttctgctgg aactgcaggt gattagcctg 300
gaaagcggcg atgcgagcat tcatgatacc gtggaaaacc tgattattct ggcgaacaac 360
agcctgagca gcaacggcaa cgtgaccgaa agcggctgca aagaatgcga agaactggaa 420
gaaaaaaaca ttaaagaatt tctgcagagc tttgtgcata ttgtgcagat gtttattaac 480
accagc 486
<210> 52
<211> 6
<212> DNA
<213> 禽副粘病毒 (Avian paramyxovirus) 4
<400> 52
catcga 6

Claims (76)

1.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的禽副粘病毒血清型4(APMV-4)，其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
2.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用重组APMV-4，其中所述重组APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，所述APMV-4的施用降低了B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在B16-F10同基因鼠科黑素瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，APMV-4的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，APMV-4的施用降低了C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，APMV-4的施用在C57BL/6同基因鼠科肺癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中将所述APMV-4瘤内施用于所述人对象。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述APMV-4。
14.包含包装的基因组的重组APMV-4，其中所述包装的基因组包括转基因，所述转基因包括编码白介素-12(IL-12)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-15(IL-15)受体alpha(IL-15Ra)-IL-15、人乳头状瘤病毒(HPV)-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的核苷酸序列，并且其中所述APMV-4在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
15.根据权利要求14所述的重组APMV-4，其中所述转基因插入在所述包装的基因组的AMPV-4M和P转录单元之间。
16.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-12的核苷酸序列。
17.根据权利要求16所述的重组APMV-4，其中编码IL-12的核苷酸序列包含从SEQ IDNO：16或17所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
18.根据权利要求16所述的重组APMV-4，其中所述APMV-4的包装的基因组包含从SEQID NO：14所示的cDNA序列转录的负义RNA。
19.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-2的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的重组APMV-4，其中编码IL-2的核苷酸序列包含从SEQ IDNO：15所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
21.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。
22.根据权利要求21所述的重组APMV-4，其中所述编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
23.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码GM-CSF的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的重组APMV-4，其中所述编码GM-CSF的核苷酸序列包含从SEQID NO：21所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
25.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的重组APMV-4，其中所述编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
27.根据权利要求14或15所述的重组APMV-4，其中所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的重组APMV-4，其中所述编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
29.根据权利要求14至17或19至28中任一项所述的重组APMV-4，其中所述重组APMV-4包含APMV-4鸭/香港/D3/1975株(Duck/Hong Kong/D3/1975strain)主链。
30.根据权利要求14至17或19至28中任一项所述的重组APMV-4，其中所述重组APMV-4包含APMV-4鸭/中国/G302/2012株(Duck/China/G302/2012strain)主链、APMV4/野鸭/比利时/15129/07株(APMV4/mallard/Belgium/15129/07strain)主链；APMV4海鸦/俄罗斯/丘列尼岛/115/2015株(APMV4Uriah-aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015strain)主链、APMV4/埃及鹅/南非/NJ468/2010株(APMV4/Egyptian goose/south Africa/NJ468/2010strain)主链或者APMV4/鸭/特拉华州/549227/2010株(APMV4/duck/Delaware/549227/2010strain)主链。
31.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用天然存在的禽副粘病毒血清型8(APMV-8)，其中所述APMV-8在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述APMV-8是APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，所述APMV-8的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，所述APMV-8的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDVLaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
36.包含包装的基因组的重组APMV，其中所述包装的基因组包括转基因，所述转基因包括编码白介素-12(IL-12)、白介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-15(IL-15)受体alpha(IL-15Ra)-IL-15、人乳头状瘤病毒(HPV)-16E6蛋白或HPV-16E7蛋白的核苷酸序列，并且其中所述重组APMV在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7，并且所述重组APMV包括APMV-6、APMV-7、APMV-8或APMV-9主链。
37.根据权利要求36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-8主链。
38.根据权利要求37所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-8鹅/特拉华州/1053/1976(Goose/Delaware/1053/1976)主链。
39.根据权利要求36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-7主链。
40.根据权利要求39所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-7鸽/田纳西州/4/1975(Dove/Tennessee/4/1975)主链。
41.根据权利要求36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-6主链。
42.根据权利要求41所述的重组APMV，其中所述APMV包含所述APMV-6鸭/香港/199/1977(Duck/Hong Kong/199/1977)主链。
43.根据权利要求36所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-9主链。
44.根据权利要求43所述的重组APMV，其中所述重组APMV包含所述APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)主链。
45.根据权利要求36至44中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因插入在所述APMV包装的基因组的AMPV M和P转录单元之间。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-12的核苷酸序列。
47.根据权利要求46所述的重组APMV，其中编码IL-12的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：16或17所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
48.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-2的核苷酸序列。
49.根据权利要求48所述的重组APMV，其中编码IL-2的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
50.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码IL-15Ra-IL15的核苷酸序列。
51.根据权利要求50所述的重组APMV，其中编码IL-15Ra-IL-15的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
52.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码GM-CSF的核苷酸序列。
53.根据权利要求52所述的重组APMV，其中编码GM-CSF的核苷酸序列包含从SEQ IDNO：21所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
54.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列。
55.根据权利要求54所述的重组APMV，其中所述编码HPV-16E6蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
56.根据权利要求36至45中任一项所述的重组APMV，其中所述转基因包含编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列。
57.根据权利要求56所述的重组APMV，其中所述编码HPV-16E7蛋白的核苷酸序列包含从SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列转录的负义RNA。
58.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用根据权利要求14至30中任一项所述的重组APMV-4。
59.根据权利要求58所述的方法，其中将所述重组APMV-4瘤内施用于人对象。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述重组APMV-4。
61.治疗癌症的方法，其包括向对其有需要的人对象施用根据权利要求36至57中任一项所述的重组APMV。
62.根据权利要求61所述的方法，其中将所述重组APMV瘤内施用于人对象。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述重组APMV。
64.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中将所述APMV-8瘤内施用于人对象。
65.根据权利要求31至35或64中任一项所述的方法，其中以106至1012pfu的剂量施用所述APMV-8。
66.治疗癌症的方法，其包括施用天然存在的禽副粘病毒血清型6(APMV-6)或9(APMV-9)，其中所述APMV-6或APMV-9在原鸡(Gallus gallus)种的1天-大的小鸡中的脑内接种致病指数小于0.7。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述APMV-6是APMV-6鸭/香港/199/1977(Duck/Hong Kong/199/1977)。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述APMV-9是APMV-9鸭/纽约州/22/1978(APMV-9duck/New York/22/1978)。
69.根据权利要求66、67或68所述的方法，其中与施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活相比，所述APMV-6或APMV-9的施用降低了BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长并提高了存活。
70.根据权利要求66、67或68所述的方法，其中与施用基因修饰的新城疫病毒(NDV)的BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长和存活期相比，所述APMV-6或者APMV-9的施用在BALBc同基因鼠科结肠癌肿瘤模型中导致了更大的肿瘤生长降低和更长的存活期，其中基因修饰的NDV是包含包装的基因组的NDV LaSota株，其中所述包装的基因组包含编码突变的NDV LaSota F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变的LaSota F蛋白具有突变L289A。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述修饰的NDV LaSota的包装的基因组包含从SEQ ID NO：13中所示的cDNA序列转录的负义RNA。
72.根据权利要求1至13，31至35或58至71中任一项所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、结肠癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或乳腺癌。
73.根据权利要求1至13，31至35或58至72中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性的。
74.根据权利要求1至13，31至35或58至73中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的。
75.根据权利要求1至13，31至35或58至74中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用检查点抑制剂。
76.根据权利要求1至13，31至35或58至75中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用特异性结合至PD-1并且阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合的单克隆抗体。
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