CN112646044B - TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TFF2‑Fc融合蛋白及其高效表达生产方法。所述TFF2‑Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述高效表达生产方法包括：人工合成编码TFF2‑Fc融合蛋白的DNA序列、构建能够在真核细胞中表达的核酸构建体、转染真核细胞、进而纯化和测定。本发明的高效表达TFF2‑Fc融合蛋白的生产方法所生产的TFF2‑Fc融合蛋白原液质量高，实现了TFF2蛋白的规模化生产。

Description

TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法。

背景技术

三叶因子(Trefoil factor，TFF)主要由胃肠道黏液细胞分泌的一类富含半胱氨酸的小分子多肽，由于分子构象中存在一个或多个三叶状结构，又称作“三叶肽”。TFF在哺乳动物中主要包括以下三种：乳腺癌相关肽(PS2，即TFF1)、解痉多肽(SP，即TFF2)和肠三叶因子(ITF，即TFF3)。TFF2于1982年由Jorgensen及其同事从猪胰腺中分离出来，且在不同物种中具有高度的保守性。其中，人三叶因子2(hTFF2)和鼠三叶因子2(mTFF2)含有同样的氨基酸数目，氨基酸序列的同源性达到82％。成熟的TFF2蛋白由106个氨基酸组成，分子量约为7-12kD，内含4个外显子及两个对称的三叶结构域，因此其结构极其稳定，耐酸、耐热且抗蛋白酶水解，主要表达在胃粘膜颈部杯状细胞中。

已有研究表明，TFF2主要在胃肠道中发挥作用，其拥有胃肠道黏膜保护和上皮修复的功能，参与胃癌的调节，减少细菌对肠道的损伤，并且保护小鼠免受因DSS肠炎而导致的致死。另外，TFF2在过敏反应中也发挥重要作用，TFF2能减轻过敏反应，如缓解哮喘症状。然而其主要的作用机制目前不完全清晰，大体包括与黏蛋白相互作用、促进细胞迁移、抗凋亡、抑制炎症反应等；近期研究中，TFF2是H9N2感染后高表达、H7N9感染高度抑制的蛋白，表明其在呼吸道急性炎症性疾病中有抗炎症与组织损伤的修复功能。然而，目前hTFF2的研究主要集中在前期的病理阶段，体外大规模生产重组hTFF2的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种TFF2-Fc融合蛋白，其编码基因可在真核生物细胞中进行高效表达。

本发明的另一目的在于提供了一种高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法，其包括三级种子扩增、两级纯化分离和四次过滤阶段，实现了所生产的TFF2-Fc融合蛋原液高，方法简单易行，适于大批量生产。

本发明的目的还在于提供一种基因工程菌株，该菌株可以表达hTFF2-Fc融合蛋白，表达量大且稳定，易于工业化生产，且成本低，安全性好。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种TFF2-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

MKWVTFISLLFLFSSSSRAEKPSPCQCSRLSPHNRTNCGFPGITSDQCFDNGCCFDSSVTGVPWCFHPLPKQESDQCVMEVSDRRNCGYPGISPEECASRKCCFSNFIFEVPWCFFPKSVEDCHYGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:1)

其中，所述融合是Fc片段融合于TFF2的N-端或融合于TFF2的C-末端。

其中，所述Fc片段是源自免疫球蛋白IgG的Fc片段。优选地，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的任一种。更优选地，所述IgG为IgG4。

其中，所述Fc片段包括铰链区、CH2区和CH3区，所述TFF2与Fc片段之间的融合为直接融合或通过接头序列融合。

其中，GGGGS是接头部分的序列，GGGGS之前的序列是TFF2的氨基酸序列，GGGGS之后的序列是IgG4的Fc片段的氨基酸序列。

一种在真核生物细胞中进行高效表达的TFF2-Fc蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码TFF2-Fc融合蛋白。

在一个具体的实施例中，所述融合是Fc片段融合于TFF2的N-端；在另外一个具体的实施例中，所述的融合是Fc片段融合于TFF2的C-末端。在一个优选的实施例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在一个具体的实施例中，TFF2-Fc融合蛋白的编码基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或是与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列。在另外的一个具体的实施例中，TFF2-Fc融合蛋白的编码基因具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:2序列插入、缺失或添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

GAGAAGCCTTCTCCTTGTCAGTGTTCTAGGCTGTCCCCTCACAACAGAACCAATTGCGGATTCCCAGGCATCACATCCGATCAGTGTTTCGATAACGGCTGTTGCTTCGATTCTAGCGTGACAGGAGTCCCTTGGTGTTTTCACCCTCTGCCTAAGCAGGAATCAGATCAGTGCGTGATGGAGGTGTCCGATAGAAGAAATTGCGGCTACCCAGGAATTTCTCCAGAGGAGTGCGCTTCCAGAAAGTGTTGCTTCTCCAACTTCATCTTCGAGGTCCCTTGGTGTTTCTTTCCTAAGAGCGTGGAAGATTGTCATTACGGAGGAGGAGGCTCCGAGTCTAAGTACGGACCTCCTTGTCCTCCTTGTCCAGCTCCAGAATTTCTGGGAGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTAGAACCCCAGAAGTGACTTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGAGTGGAAGTGCATAACGCTAAAACCAAGCCTAGAGAGGAGCAGTTTAACTCCACCTATAGAGTGGTGTCAGTGCTGACAGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGAAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGACAGCCTAGAGAACCTCAGGTGTATACACTGCCTCCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTCTCTCTGACTTGCCTGGTGAAGGGATTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAATCTAACGGACAGCCAGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCAGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTAGGCTGACAGTGGATAAGTCTCGTTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCTCTGGGAAAA(SEQ ID NO:2)

一种核酸构建体，所述的核酸构建体包含上述本发明先前所述的核苷酸序列。在一个具体的实施例中，所述的核酸构建体为能够在真核宿主细胞中介导基因表达的载体，所述的载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和质粒载体中的一种或多种；在另外一个具体的实施例中，所述的质粒载体选自pcDNA3.1、pCMV、pTRE、pSL和pBudCE4.1中的一种或多种，最优选地所述质粒载体为pcDNA3.1。

一种基因工程修饰的宿主细胞，其含有如本发明先前所述的核酸序列或含有先前所述的核酸构建体，所述的宿主细胞可以高效表达产生TFF2-Fc融合蛋白。在一个具体的实施例中，所述的宿主细胞为真核生物细胞，选自酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中任一种的真核生物细胞；优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地选自BHK细胞、VERO细胞和CHO细胞中一种或多种的细胞，更优选为CHO细胞，最优选地为CHO-K1细胞。

一种高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法，所述方法通过培养上述基因工程修饰的宿主细胞来生产TFF2-Fc融合蛋白。在一个具体的实施中，所述方法包括以下步骤：a)上游细胞培养工艺，其包括种子复苏、摇瓶扩增、Wave系统扩增、反应器种子扩增、反应器流加培养和澄清过滤；b)下游蛋白纯化工序，其包括亲和层析、低pH病毒灭活、阴离子交换层析、除病毒过滤、超滤或洗滤工艺和原液制备。

其中，所述Wave系统的体积为10-25L。优选地，Wave系统为“ReadyToProcess WAVE25波浪生物反应系统”。Wave系统的工作方式为摇摆式，液体在反应系统的培养袋子里以一定的角度上下摇摆，达到混合和传质的效果，气体从表面通入，常用于细胞扩增。

优选地，所述方法中的反应器为XDR200或XDR500反应器，其与Wave系统的区别主要在于通气和搅拌方式。XDR200和XDR 500反应器，搅拌桨在反应器下方，由磁力搅拌器驱动，达到液体混合效果，气体一般在液体底部通入。

具体地，一种高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：

a.种子复苏：将含有TFF2-Fc融合蛋白的表达载体的宿主细胞的冻存管水浴融化，复苏；

b.细胞扩增：将复苏后的宿主细胞依次逐级进行摇瓶扩增、Wave系统扩增和反应器扩增；

c.反应器流加式培养：将扩增结束的种子细胞以流加式培养12-18天，得到培养液；

d.澄清过滤：将培养液进行过滤；

e.亲和层析：采用pH 3-4的45-55mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液；

f.低pH病毒灭活：将收集到的洗脱液稀释至≤15g/L，调节pH至2.50-4.50，灭活，深层过滤，收集滤液；

g.阴离子交换层析：以pH7.5的包含20mmol/L Tris-HCl、50mmol/L盐酸精氨酸和1mol/L氯化钠的洗脱液洗脱滤液，收集紫外280nm吸收值150mAu/mm-150mAu/mm间的洗脱液；

h.除病毒过滤和浓缩：将洗脱液再次过滤除去病毒，浓缩；

i.原液制备：将浓缩后的蛋白溶液稀释至蛋白浓度45-55mg/ml，过滤，分装，冷冻保存。

其中，“收集紫外280nm吸收值150mAu/mm-150mAu/mm间的洗脱液”意思是指在280nm处，从紫外吸收值升高达到150mAu/mm时开始收集洗脱液，待到紫外吸收值再次降低至达到150mAu/mm时停止收集洗脱液。

在一个具体的实施方式中，所述种子复苏包括：将含有TFF2-Fc融合蛋白的表达载体的宿主细胞的冻存管36.5-38.5℃水浴融化，复苏。

在一个具体的实施方式中，所述摇瓶扩增包括：以0.3×10⁶-0.6×10⁶个细胞/ml的接种密度接种复苏后的细胞，在36.5±0.5℃，6.0±1.0％CO₂，130±10rpm条件下培养2～4天进行传代培养，直至达到Wave系统种子扩增所需的细胞量。

在一个具体的实施方式中，所述Wave系统扩增包括：以0.5×10⁶-0.8×10⁶个细胞/ml的接种密度接种摇瓶细胞扩增后的细胞，在温度35.5℃-37.5℃，摇速16-20r/min，角度6-10°，CO₂流量30-50ml/min，空气流量340-400ml/min条件下扩增。

在一个具体的实施方式中，所述反应器种子扩增包括：初始接种密度以0.6×10⁶-1.0×10⁶个细胞/ml的接种密度接种Wave系统扩增后的细胞，在pH6.5～7.2，DO40％，温度35.5-37.5℃，搅拌转速60～150r/min条件下扩增，其中底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制。

在一个具体的实施方式中，所述反应器流加式培养包括：以0.8×10⁶-1.2×10⁶个细胞/ml的接种密度接种反应器种子扩增后的细胞，在pH6.5～7.2，DO 40％，D0～D5培养温度35.5-37.5℃，D5以后温度控制为32℃-34.0℃；搅拌转速60～150r/min条件下培养，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制，持续培养12-18天，得到培养液。

在一个具体的实施方式中，所述澄清过滤包括：采用两级澄清过滤膜包以及囊式滤器(优选0.22μm囊式滤器)对收获液进行澄清过滤，其中过滤压力≤1.5bar，一级膜包载量≤71.3L/m²，二级膜包载量≤142.6L/m²，调整通量为≤100L/m²/h过滤培养液。

在一个具体的实施方式中，所述亲和层析包括：层析柱柱高10～27cm，保留时间3-8min，载量≤25.1g/L，洗脱时收集紫外280nm处50mAu/mm-50mAu/mm的洗脱液。

在一个具体的实施方式中，所述低pH病毒灭活包括：将洗脱液稀释至≤15g/L，调节pH至2.50-4.50，于18-26℃静置60-90min，然后调节pH至5-7；用深层过滤膜包(优选，最大载量85-110L/m²)，对病毒灭活收集液进行深层过滤，所得滤液2～8℃暂存。

在一个具体的实施方式中，所述阴离子交换层析包括：调节样品pH7.50±0.10，调节电导率≤6mS/cm，保留时间3-8min，上样载量≤30g/L，梯度洗脱收集紫外280nm吸收值150mAu/mm-150mAu/mm的洗脱液，调节pH7.00±0.10，囊式滤器过滤。

在一个具体的实施方式中，所述除病毒过滤包括：采用预过滤过滤器和除病毒过滤器，载量≤2.4kg/m2，过滤完毕润洗滤器10L/m2，整个过程中压力不超过29psi，合并两次滤过液，囊式滤器过滤得到滤液。

在一个具体的实施方式中，所述步骤h中的浓缩包括：将滤液浓缩至20.0～30.0g/L时开始洗滤，连续换液浓缩至50g/L以上，润洗超滤系统及管道，收集洗膜液，合并浓缩液和洗膜液得到混合液。

在一个具体的实施方式中，所述原液制备包括：将混合液稀释至蛋白浓度45-55mg/ml，混匀后用囊式滤器过滤，分装于无菌储液袋中，-30℃以下保存。

优选地，在反应器流加式培养中，培养至第5天(D5)时，调整温度为32-34℃；在发酵培养过程中，葡萄糖浓度<5g/L时，补糖至5-10g/L；在第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)、第9天(D9)和第11天(D11)分别流加占初始培养基体积的3.0-8.0％的补料培养基A和占初始培养基体积的0.15-0.8％的补料培养基B。

优选地，在反应器流加式培养中，反应器为500L一次性生物反应器；流加培养基为ActiPro，补料培养基A为Cell Boost 7a，补料培养基B为Cell Boost 7b(三种培养基皆由思拓凡生物工程科技(广州)有限公司生产)。任选地，所述流加培养基可以是Dynamis(Gibco)。

优选地，在亲和层析中，亲和洗脱缓冲液为pH 3.5的40-60mmol/L醋酸-醋酸钠。

优选地，在阴离子交换层析中，阴离子洗脱缓冲液为10-30mmol/L Tris-HCl、40-60mmol/L盐酸精氨酸和0.5-2mol/L氯化钠的混合液，pH7.5。

优选地，在浓缩步骤中，超滤平衡缓冲液为15-35mmol/L PB和50-200mmol/L氯化钠的混合液，pH7.0。

优选地，在原液制备步骤中，原液稀释缓冲液为15-35mmol/L PB和50-200mmol/L氯化钠的混合液，pH7.0。

本发明的有益效果是：本发明首先合成了一种TFF2与Fc的融合蛋白，其实现了在真核生物细胞中的高效表达。在本发明的高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法中，通过逐渐递增式的种子扩增过程，使转染TFF2-Fc融合基因的宿主细胞菌株处于一种自适应状态的稳步生长阶段，待扩增到稳定的目标密度时，进行流加式培养，随着菌株的不断增长而相应地补充培养基，从而避免一次添加全部所需营养元素的富集或浪费；另外，通过亲和层析初步洗脱和低pH病毒灭活，以及阴离子交换层析进一步洗脱和病毒滤除，实现逐级纯化和浓缩的效果。因此，根据本发明的生产方法的TFF2-Fc融合蛋白原液可应用于500L反应器大规模生产，且生产出的TFF2-Fc融合蛋白原液质量高、重复批次一致性好。

附图说明

图1为本发明的高效表达TFF2-Fc融合蛋白原液的生产方法的示意性流程图。

具体实施方式

实施例1：表达TFF2-Fc融合蛋白的细胞系制备

1、编码基因的获得

选取将Fc的多肽融合于TFF2的C-末端，并用连接肽相连，获得TFF2-Fc的融合多肽，根据所述结构构建其编码基因序列：

1)根据专利申请CN201610104936.8公开的方法克隆的TFF2蛋白的编码基因为出发序列；

2)以蛋白质数据库UniProt公开的IgG4的Fc多肽序列的编码序列，对其进行CHO偏好密码子的修改，获得编码序列；

3)选取GGGGS作为接头，获得其编码序列；

4)按照TFF2-接头-Fc的结构将1)-3)的核酸序列连接，并按照CHO-K1的密码子偏好进行优化，获得SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2、载体构建

1)将上述获得的核苷酸序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成片段；

2)通过PCR在序列两端添加限制性酶切位点；

3)将pcDNA3.1和步骤2)获得的序列利用相同的内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收编码片段和线性质粒片段；

4)将步骤3)获得大小两个片段通过T4连接酶16℃过夜；

5)将连接产物转染DH5接，挑选阳性克隆，PCR验证后提取质粒，测序；

6)将阳性克隆菌株扩大培养，利用中抽试剂盒提取质粒；

7)将质粒通过电转转染进细胞CHO-K1，利用MSX筛选，并通过单细胞铺板获得单克隆，保藏于液氮。

实施例2：高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法

1.种子复苏：实施例1中制备的转染细胞CHO-K1的冻存管在37.5℃温度下水浴融化，复苏；

2.摇瓶扩增：以0.5×10⁶细胞/ml的接种密度接种复苏后的细胞，摇床培养条件为36.5±0.5℃，6.0±1.0％CO₂，130±10rpm，培养3天进行传代，达到Wave种子扩增所需细胞量后转接至Wave系统中；

3.Wave系统扩增：以0.7×10⁶细胞/ml的接种密度接种摇瓶细胞扩增后的细胞，在温度36.5℃，摇速18r/min，角度8°，CO₂流量40ml/min，空气流量360ml/min条件下扩增；

4.反应器种子扩增：以0.8×10⁶细胞/ml的接种密度接种Wave系统扩增后的细胞，在pH7，DO40％，温度36.5℃，搅拌转速100r/min条件下扩增，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制；

5.500L一次性生物反应器流加培养：以1.0×10⁶细胞/ml的接种密度接种反应器种子扩增后的细胞，在pH 7，DO 40％，温度36.5℃，搅拌转速100r/min条件下培养，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制；培养至D5时，调整温度为33℃；在发酵培养过程中，当葡萄糖浓度<5g/L时，补糖至7g/L；在D3、D5、D7、D9、D11分别流加5.0％补料培养基A和0.3％的补料培养基B，其中流加培养基为ActiPro，补料培养基A为Cell Boost7a，补料培养基B为CellBoost 7b；

6.澄清过滤阶段：采用两级澄清过滤膜包以及0.22μm囊式滤器对收获液进行澄清过滤，过滤压力≤1.5bar，一级膜包载量≤71.3L/m²，二级膜包载量≤142.6L/m²，调整通量为≤100L/m²/h过滤收获液；

7.亲和层析：层析柱柱高20cm，保留时间5min，载量≤25.1g/L，用pH 3.5的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱时收集紫外280nm处50mAu/mm-50mAu/mm洗脱液，收集洗脱液；

8.低pH病毒灭活：样品稀释至≤15g/L，调节pH至3.50，于22℃静置70min，然后调节pH至6.00，用深层过滤膜包，对病毒灭活收集液进行吸附深层过滤，最大载量97.3L/m²，收集液0.22μm囊式滤器过滤后，4℃暂存；

9.阴离子交换层析：调节样品pH7.50±0.10，调节电导≤6mS/cm，保留时间5min，上样载量≤30g/L，用pH7.5的包含20mmol/L Tris-HCl、50mmol/L盐酸精氨酸和1mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，梯度洗脱收集紫外280nm吸收值150mAu/mm-150mAu/mm洗脱液，调节pH7.00±0.10，洗脱液0.22um囊式滤器过滤；

10.除病毒过滤：采用预过滤过滤器+除病毒过滤器，载量≤2.4kg/m²，过滤完毕润洗滤器10L/m²，整个过程中压力不超过29psi，合并滤过液，0.22um囊式滤器过滤，收集滤液；

11.超滤浓缩换液：将步骤10的滤液浓缩至25g/L时，用pH7.0的包含25mmol/L PB和100mmol/L氯化钠的缓冲液洗滤，连续换液浓缩至50g/L以上，用相同缓冲液润洗超滤系统及管道，收集洗膜液，合并浓缩液和洗膜液得到混合液；

12.原液制备：采用pH7.0的包含25mmol/L PB和100mmol/L氯化钠的稀释缓冲液，将混合液稀释至蛋白浓度50mg/ml，混匀后用0.22μm囊式滤器过滤，分装于无菌储液袋中，-30℃以下保存，整个制备流程如图1所示。

其中通过以上步骤制备出的TFF2-Fc融合蛋白原液的质量检测结果见下表1：

表1

实施例3

在该实施例中，将实施例2的步骤5中“培养至D5时，调整温度为33℃”替换为“培养至D5时，调整温度为34℃”，其余的步骤和操作条件与实施例2相同。

其中，所制备出的TFF2-Fc融合蛋白原液的质量检测结果见下表2：

表2

实施例4

在该实施例中，将实施例2的步骤5中“培养至D5时，调整温度为33℃”替换为“培养至D5时，调整温度为32℃”，其余的步骤和操作条件与实施例2相同。

其中，所制备出的TFF2-Fc融合蛋白原液的质量检测结果见下表3：

表3

实施例5

在该实施例中，根据实施例2的步骤5，如下调整发酵培养步骤：500L一次性生物反应器流加培养：以1.0×10⁶细胞/ml的接种密度接种反应器种子扩增后的细胞，在pH 7，DO40％，温度36.5℃，搅拌转速100r/min条件下培养，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制；培养至D5时，调整温度为33℃；在发酵培养过程中，当葡萄糖浓度<5g/L时，补糖至5g/L；在D3、D5、D7、D9、D11分别流加8.0％补料培养基A和0.8％的补料培养基B，其中补料培养基A为Cell Boost 7a，补料培养基B为Cell Boost 7b。

其余的步骤和操作条件与实施例2相同。

其中，所制备出的TFF2-Fc融合蛋白原液的质量检测结果见下表4：

表4

实施例6

在该实施例中，根据实施例2的步骤5，如下调整发酵培养步骤：500L一次性生物反应器流加培养：以1.0×10⁶细胞/ml的接种密度接种反应器种子扩增后的细胞，在pH 7，DO40％，温度36.5℃，搅拌转速100r/min条件下培养，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制；培养至D5时，调整温度为33℃；在发酵培养过程中，当葡萄糖浓度<5g/L时，补糖至10g/L；在D3、D5、D7、D9、D11分别流加3.0％补料培养基A和0.15％的补料培养基B，其中补料培养基A为Cell Boost 7a，补料培养基B为Cell Boost 7b。

其余的步骤和操作条件与实施例2相同。

其中，所制备出的TFF2-Fc融合蛋白原液的质量检测结果见下表5：

表5

上述实施例证实，本发明的逐级递增式种子扩增模式和流加式培养方法有利于宿主细胞菌株的稳定生长，使得最终制备的TFF2-Fc融合蛋白原液中的蛋白经过三种纯度测定方法测定的纯度达93％以上，且由于采用双重层析分离和四次过滤步骤，极好地减少了蛋白原液中残留的毒素，且外源性DNA残留和蛋白A残留含量也极少。由此可见，本发明的方法是通过特定的扩增、培养、过滤和纯化步骤的组合，实现了500L或更大规模生产，且重复批次一致性高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 山东晶辉生物技术有限公司

<120> TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Lys Pro Ser Pro Cys Gln Cys Ser Arg Leu Ser Pro His Asn Arg

1 5 10 15

Thr Asn Cys Gly Phe Pro Gly Ile Thr Ser Asp Gln Cys Phe Asp Asn

20 25 30

Gly Cys Cys Phe Asp Ser Ser Val Thr Gly Val Pro Trp Cys Phe His

35 40 45

Pro Leu Pro Lys Gln Glu Ser Asp Gln Cys Val Met Glu Val Ser Asp

50 55 60

Arg Arg Asn Cys Gly Tyr Pro Gly Ile Ser Pro Glu Glu Cys Ala Ser

65 70 75 80

Arg Lys Cys Cys Phe Ser Asn Phe Ile Phe Glu Val Pro Trp Cys Phe

85 90 95

Phe Pro Lys Ser Val Glu Asp Cys His Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Glu

100 105 110

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

115 120 125

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

130 135 140

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

145 150 155 160

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

165 170 175

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

180 185 190

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

195 200 205

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

210 215 220

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

225 230 235 240

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

245 250 255

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

260 265 270

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

275 280 285

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

290 295 300

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

305 310 315 320

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

325 330 335

Ser Leu Gly Lys

340

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagaagcctt ctccttgtca gtgttctagg ctgtcccctc acaacagaac caattgcgga 60

ttcccaggca tcacatccga tcagtgtttc gataacggct gttgcttcga ttctagcgtg 120

acaggagtcc cttggtgttt tcaccctctg cctaagcagg aatcagatca gtgcgtgatg 180

gaggtgtccg atagaagaaa ttgcggctac ccaggaattt ctccagagga gtgcgcttcc 240

agaaagtgtt gcttctccaa cttcatcttc gaggtccctt ggtgtttctt tcctaagagc 300

gtggaagatt gtcattacgg aggaggaggc tccgagtcta agtacggacc tccttgtcct 360

ccttgtccag ctccagaatt tctgggagga ccttccgtgt tcctgtttcc tcctaagcct 420

aaggacaccc tgatgatctc tagaacccca gaagtgactt gcgtggtggt ggacgtgtct 480

caggaagatc ccgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gagtggaagt gcataacgct 540

aaaaccaagc ctagagagga gcagtttaac tccacctata gagtggtgtc agtgctgaca 600

gtgctgcatc aggattggct gaacggaaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggga 660

ctgccttctt ccatcgagaa gaccatctcc aaggctaagg gacagcctag agaacctcag 720

gtgtatacac tgcctccttc tcaggaggag atgacaaaga accaggtctc tctgacttgc 780

ctggtgaagg gattttaccc ttccgatatc gccgtggaat gggaatctaa cggacagcca 840

gagaacaact acaagaccac acctccagtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 900

tctaggctga cagtggataa gtctcgttgg caggaaggca acgtgttctc ttgttccgtg 960

atgcacgagg ctctgcataa tcactacaca cagaagtccc tgtctctgtc tctgggaaaa 1020

Claims (9)

1.一种高效表达TFF2-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于：

1)将SEQ ID NO:2所示的TFF2-Fc融合蛋白的编码基因连接入表达载体pcDNA3.1；

2)将步骤1)制备的表达载体转染入宿主细胞CHO-K1获得基因工程宿主细胞；

3)培养步骤2)制备的基因工程宿细胞制备TFF2-Fc融合蛋白；

其中，步骤3)的步骤包括：

a)上游细胞培养工艺，其包括种子复苏、摇瓶扩增、Wave系统扩增、反应器种子扩增、反应器流加式培养和澄清过滤；

b)下游蛋白纯化工序，其包括亲和层析、低pH病毒灭活、阴离子交换层析、除病毒过滤、超滤或洗滤工艺和原液制备；

其中，Wave系统扩增为：以0.5×10⁶-0.8×10⁶个细胞/ml的接种密度接种摇瓶细胞扩增后的细胞，在温度35.5℃-37.5℃，摇速16-20r/min，角度6-10°，CO₂流量30-50ml/min，空气流量340-400ml/min条件下扩增；其中Wave系统扩增中Wave系统体积为10-25L；

其中反应器流加式培养步骤为：以0.8×10⁶-1.2×10⁶个细胞/ml的接种密度接种反应器种子扩增后的细胞，在pH6.5-7.2，DO 40％，D0-D5培养温度35.5-37.5℃，D5以后温度控制为32℃-34.0℃；搅拌转速60-150r/min条件下培养，底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制，持续培养12-18天，得到培养液；葡萄糖浓度<5g/L时，补糖至5-10g/L；在第3天、第5天、第7天、第9天和第11天分别流加占初始培养基体积的3.0-8.0％的补料培养基A和占初始培养基体积的0.15-0.8％的补料培养基B，其中流加培养基为ActiPro，补料培养基A为CellBoost 7a，补料培养基B为Cell Boost 7b；反应器流加式扩增培养的反应器体积为500L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中摇瓶扩增为：以0.3×10⁶-0.6×10⁶个细胞/ml的接种密度接种复苏后的细胞，在36.5±0.5℃，6.0±1.0％CO₂，130±10rpm条件下培养2-4天进行传代培养，直至达到Wave系统种子扩增所需的细胞量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中反应器种子扩增：初始接种密度以0.6×10⁶-1.0×10⁶个细胞/ml的接种密度接种Wave系统扩增后的细胞，在pH6.5-7.2，DO40％，温度35.5-37.5℃，搅拌转速60-150r/min条件下扩增，其中底部关联DO控制，二氧化碳关联pH控制。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述澄清过滤包括：采用两级澄清过滤膜包以及囊式滤器对收获液进行澄清过滤，其中过滤压力≤1.5bar，一级膜包载量≤71.3L/m²，二级膜包载量≤142.6L/m²，调整通量为≤100L/m²/h过滤培养液。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和层析包括：层析柱柱高10-27cm，保留时间3-8min，载量≤25.1g/L，洗脱时收集紫外280nm处50mAu/mm-50mAu/mm的洗脱液。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述低pH病毒灭活包括：将洗脱液稀释至≤15g/L，调节pH至2.50-4.50，于18-26℃静置60-90min，然后调节pH至5-7；用深层过滤膜包，对病毒灭活收集液进行深层过滤，所得滤液2-8℃暂存。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子交换层析包括：调节样品pH7.50±0.10，调节电导率≤6mS/cm，保留时间3-8min，上样载量≤30g/L，梯度洗脱收集紫外280nm吸收值150mAu/mm-150mAu/mm的洗脱液，调节pH7.00±0.10，囊式滤器过滤。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述除病毒过滤包括：采用预过滤过滤器和除病毒过滤器，载量≤2.4kg/m²，过滤完毕润洗滤器10L/m²，整个过程中压力不超过29psi，合并两次滤过液，囊式滤器过滤得到滤液。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述原液制备包括：将混合液稀释至蛋白浓度45-55mg/ml，混匀后用囊式滤器过滤，分装于无菌储液袋中，-30℃以下保存。

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