CN112334484A - 抗-CD3ε抗体及其应用方法 - Google Patents

Abstract

这里公开的内容涉及能够特异性结合CD3 epsilon(CD3ε)单克隆抗体及其抗原结合片段、变体、嵌合形式或者双特异性形式，以及制备这些抗‑CD3ε抗体及其抗原结合片段的方法和在多种治疗、诊断和预防适应性方面的应用。

Description

抗-CD3ε抗体及其应用方法

相关申请

本申请要求2018年3月14日递交的美国临时申请第62/643,095号的优先权，该申请的全部内容在此通过印证并入本文。

序列表

2019年3月14日产生的，大小为25.5KB的以“NOVI-046_001WO_SEQUENCELISTING_ST25.TXT”为名的文件的全部内容通过印证在此并入本文。

技术领域

本申请涉及能够特异性结合CD3ε的单克隆抗体及其抗原结合片段、变体、多聚体形式及其双特异性形式，以及制造这些抗CD3ε抗体及其抗原结合片段的方法，以及他们在治疗、诊断和预防中的应用。

背景技术

CD3是一种与T细胞受体相关的、在T细胞上表达的细胞表面复合物。CD3复合物是激活CD8+和CD4+T淋巴细胞所必需的。它由三种不同但高度相关的链组成：一个CD3γ链、一个CD3δ链和两个CD3ε链，它们相互结合形成CD3ε/γ异二聚体和CD3ε/δ异二聚体。两种CD3异二聚体与T细胞受体(TCR)和信号转导ζ链同二聚体一起形成T细胞受体复合物。

T细胞重定位(或T细胞重定向)双特异性抗体(biAbs)是一种新型的治疗方法，能够向肿瘤细胞募集T细胞，并诱导T细胞毒性的肿瘤特异性(但不依赖于MHC)活性。通常，T细胞重定位双特异性抗体(biAbs)包括一个用于T细胞募集的CD3结合臂和一个对肿瘤相关抗原(TAA)有特异性的肿瘤靶向臂。这种双特异性设计使T细胞与靶向肿瘤细胞紧密接触，形成免疫突触，局部激活T细胞，随后由T细胞毒性颗粒释放的穿孔素和颗粒酶破坏靶细胞。在过去的几年里，T细胞重定位双特异性抗体(biAbs)在临床试验中显示出了相当大的前景，两种分子已经通过监管批准：catumaxobab(商标名Removab)用于治疗恶性腹水和blinatumomab(Blincyto)用于B-ALL(B细胞急性淋巴细胞白血病)。如Blincyto所示，双特异性抗体(biAbs)介导的T细胞毒性反应的重定向能够诱导肿瘤细胞从骨髓中完全清除，并在相当大比例的B-ALL患者中产生持久的分子缓解，从而证明了这种治疗方法的威力。

因此，对使用全人类单克隆抗体及其抗原结合序列进行T细胞重定位存在需要。

发明内容

本发明提供了能够结合CD3 ε的抗体或其抗原结合片段。CD3是人类CD3或食蟹猴CD3。这些抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或多聚抗体。抗体或其抗原结合片段为食蟹猴抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人类抗体。其抗体或抗原结合片段为IgG同型体，例如，IgG1同型体。

单克隆抗体或其抗原结合片段例如为单链抗体(scAb)、Fab片段、F(ab')2片段、单链可变片段(scFv)、scFv-Fc片段、多聚抗体或双特异性抗体。

在各个方面，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括一种可变重链区域包括：互补性决定区域1(CDRH1)，所述互补性决定区域1包括GFTFNTYA(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列；互补性决定区2(CDRH2)，所述互补性决定区2(CDRH2)包括IRSKYNNYAT(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRH3)，所述互补性决定区域3(CDRH3)包括VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列；所述单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包括可变轻链区域，其包括：互补性决定区域1(CDRL1)，所述互补性决定区域1包括TGAVTTSNY(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列；互补性决定区域2(CDRL2)，所述互补性决定区域2(CDRL2)包括GTN(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRL3)，所述互补性决定区域3(CDRL3)包括从以下组中选择的氨基酸序列：ALWYANRWV(SEQ ID NO:13)、ALWYKGYWV(SEQ ID NO:14)、ALWYDGTWV(SEQ ID NO:15)、ALWYDGKWV(SEQ ID NO:16)、ALWYDGWWV(SEQ ID NO:17)、ALWYKQRWV(SEQ ID NO:18)和ALWYNQHWV(SEQ ID NO:19)。

在其他方面，本发明提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体具有第一臂和第二臂，所述第一臂结合CD3ε，其包括一种可变重链区域包括：互补性决定区域1(CDRH1)，所述互补性决定区域1包括GFTFNTYA(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，互补性决定区2(CDRH2)，所述互补性决定区2(CDRH2)包括IRSKYNNYAT(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRH3)，所述互补性决定区域3(CDRH3)包括VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列；所述第一臂进一步包括可变轻链区域，其包括：互补性决定区域1(CDRL1)，所述互补性决定区域1包括TGAVTTSNY(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列；互补性决定区域2(CDRL2)，所述互补性决定区域2(CDRL2)包括GTN(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRL3)，所述互补性决定区域3(CDRL3)包括从以下组中选择的氨基酸序列：ALWYANRWV(SEQ ID NO:13)、ALWYKGYWV(SEQ ID NO:14)、ALWYDGTWV(SEQ ID NO:15)、ALWYDGKWV(SEQID NO:16)、ALWYDGWWV(SEQ ID NO:17)、ALWYKQRWV(SEQ ID NO:18)和ALWYNQHWV(SEQ IDNO:19)；所述第二臂不结合CD3ε。

在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有可变重链区域和可变轻链区域，该可变重链区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，以及所述可变轻链区域包括SEQ IDNO:29、31、33、35、37、39或41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体具有可变重链区域和可变轻链区域，该可变重链区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，以及所述可变轻链区域包括SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39或41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包括hIGHV3-73框架区域的重链区域。例如，可变重链区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有包括hIGLV7-46框架区域的轻链区域。例如，可变轻链区域包括SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39或者41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体的第二臂结合肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，合适的肿瘤相关抗原(TAA)包括，不起到任何限制作用的包括CD20、HER2、HER3、EGFR、IGF1R、c-Met、PDGFR1、CD40、CD40L、CD30、CS1、CD70、格列替康、间皮素、PSMA、PSCA、MUC1、CA125、CEA、FRA、EpCAM、DR5、HGFR1和/或5T4。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括两个拷贝的单链重链多肽以及第一轻链和第二轻链，其中第一和第二轻链是不同的。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括第一轻链的至少一部分为Kappa类型，并且第二轻链的至少一部分为Lambda类型。在一些实施方案中，第一轻链包括至少一个Kappa恒定区域。在一些实施方案中，第一轻链还包括Kappa可变区。在一些实施方案中，第一轻链还包括Lambda可变区。在一些实施方案中，第二轻链还包括至少一个Lambda恒定区域。在一些实施方案中，第二轻链还包括Lambda可变区域。在一些实施方案中，第二轻链还包括Kappa可变区。在一些实施例中，第一轻链包括Kappa恒定区域和Kappa可变区域，其中第二轻链包括Lambda恒定区域和Lambda可变区域。

本发明还包括一种药物组合物，其包括根据本发明的抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体。

本发明进一步提供了一种通过对需要的患者给药包括本发明所述抗体的药物组合物来缓解症状或者疾病的方法，或者进行T细胞再定位方法。所述疾病例如癌症。

附图说明

图1显示了使用酶联免疫吸附法(ELISA)获得的对照以及针对重组人CD3ε、食蟹猴CD3ε和人PD-1重组蛋白的候选抗CD3ε抗体的结合信号图。NI-0701是一种抗人CCL5单克隆抗体，用作阴性对照。

图2显示了使用流式细胞仪和对照组和候选抗CD3ε抗体进行Jurkat T细胞染色获得的结合信号。以NI-0701为阴性对照。

图3显示了使用流式细胞仪(FAC)获得的结合信号，该结合信号是通过使用对照和候选抗CD3ε抗体对来自健康人类供体中的分离的CD4+T细胞群进行染色获得的。

图4显示了使用流式细胞仪(FAC)获得的结合信号，该结合信号是通过使用对照和候选抗CD3ε抗体对来自健康人类供体中的分离的CD8+T细胞群进行染色获得的。

图5显示了使用流式细胞仪(FAC)获得的结合信号，该结合信号是通过使用对照和候选抗CD3ε抗体对来自健康人类供体中的分离的CD20+T细胞群进行染色获得的。

具体实施方案

本发明涉及与人类CD3 epsilon(CD3ε)结合并与食蟹猴CD3ε交叉反应的一组抗体的产生。所有这些抗体都有共同的VH链，因此与使用kappa-lambda体技术产生的双特异性抗体兼容(WO2014087248)。与食蟹猴CD3ε的交叉反应性是一个重要特征，这能够促进已经整合了本文所述的抗CD3ε抗体的T细胞重定向双特异性抗体的临床前开发。此外，这些抗CD3ε抗体显示出不同的结合亲和力。双特异性抗体的CD3臂的亲和力可以显著改变双特异性抗体的功能活性，因此需要具有不同亲和力的抗CD3ε抗体。本文所述抗体在最终的双特异性kappa-lambda结构中可以容易地相互交换，因为它们共享相同的重链。其他基于工程设计的T细胞再定位双特异性抗体或者包括突变或者包括连接体，从而实现双特异性，与这种基于工程设计的T细胞在定位双特异性抗体不同，本发明描述的Kappa、lambda体包括天然人IgG结构。从发展的角度来看，这一特性具有相当大的优势，因为这些T细胞重定位剂具有人类单克隆抗体的药物样特性。可以预计，它们未经修饰的人类序列和天然结构，再加上良好的物理化学性质，当给病人服用时，可以最小化免疫原性的可能性。

本发明提供了结合CD3ε的单克隆抗体。这些抗体在此统称为抗-CD3ε单克隆抗体或抗CD3εmAbs。优选地，所述单克隆抗体至少对人CD3ε具有特异性。在一些实施方案中，识别人类CD3ε的单克隆抗体也对至少一种其他非人类CD3ε蛋白质具有交叉反应性，例如但不局限于，非人类灵长类动物CD3ε，例如食蟹猴CD3ε和/或啮齿动物CD3ε。

本发明还提供了单价抗体和/或双特异性抗体，其包括至少一个对CD3ε有特异性的第一结合位点。优选地，所述单价抗体和/或双特异性抗体至少对人CD3ε具有特异性。在示例性实施方案中，能够识别人类CD3ε的单价抗体和/或双特异性抗体也对至少一种其他非人类CD3ε蛋白质具有交叉反应性，例如，非限制性的，非人类灵长类动物CD3ε，例如食蟹猴CDε3和/或啮齿动物CD3ε。本发明还提供与本文公开的抗CD3ε单价和/或抗CD3ε双特异性抗体结合相同表位的抗体。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括能够结合CD3ε的第一臂和能够结合除了CD3ε之外的第二靶点的第二臂。在一些实施方案中，双特异性抗体包括能够结合CD3ε的第一臂和能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二臂，所述肿瘤相关抗原包括，非限制性地包括：EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1和/或5T4。在一些实施方案中，双特异性抗体包括能够结合CD3ε的第一臂和能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二臂，其中第一臂以低亲和力与CD3ε结合，而第二臂以高亲和力与TAA结合。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原(TAA)是在癌细胞的细胞表面上表达的抗原。在一些实施方案中，癌细胞选自肺癌细胞、支气管癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤癌细胞、食管癌细胞、肝癌细胞、尿路癌和/或膀胱癌细胞，肾癌细胞、口腔癌细胞、咽癌细胞、子宫癌细胞和/或黑色素瘤癌细胞。在一些实施方案中，合适的肿瘤相关抗原(TAA)包括但不局限于EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1和/或5T4。

在一些实施方案中，所述双特异性抗体是全人双特异性IgG型式，例如，PCT申请WO2012/023053中公开的κλ-体型式，该申请的全部内容通过引证在此全部并入本文。

这里公开的示例性的抗-CD3ε单克隆抗体或其抗原结合片段包括，例如，1B6抗体、1A10抗体、1D8抗体、1F8抗体、1A11抗体和1A4抗体或者他们的抗原结合片段。

这里公开的抗-CD3ε双特异性抗体中至少一个结合位点对CD3ε有特异性，这些示例性的抗-CD3ε双特异性抗体包括，例如，1B6抗体、1A10抗体、1D8抗体、1F8抗体、1A11抗体和1A4抗体或者他们的抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明的示例性抗CD3ε单克隆抗体及其抗原结合片段包括表2所示的重链互补性决定区(CDR)和从表3所示轻链互补性决定区(CDR)中选择的轻链CDR，其中表2和表3中所示的CDR是根据IMGT术语定义的(参见实施例)。

在一些实施方案中，本发明的示例性抗CD3ε单克隆抗体及其抗原结合片段包括表2所示的重链互补性决定区(CDR)和从表3所示轻链互补性决定区(CDR)中选择的轻链CDR，其中表2和表3中所示的CDR是根据IMGT术语定义的(参见实施例)。

抗-CD3ε抗体

示例性抗CD3ε抗体包括本文中称为1B6、1A10、1D8、1F8、1A11或1A4的抗体，或其任何片段、变体、多聚体版本或其双特异性抗体。这些抗体或其任何片段、变体、多聚体版本或其双特异性抗体在本文中分别称为“huCD3ε”抗体。本发明的huCD3ε抗体包括全人类单克隆抗体，以及人源化单克隆抗体和嵌合抗体，或其任何片段、变体、多聚体或双特异性形式。这些抗体对人CD3ε表现出特异性，并且已被证明能够调节，例如，阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD3ε的至少一种生物功能或活性。

CD3ε的生物功能或活性包括但不局限于T细胞受体信号传导。当与不存在或者不引入本发明所述抗体时CD3ε的功能活性水平相比，在抗体存在下CD3ε的功能活性水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，抗体被认为完全调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD3ε的至少一种功能活性。当与不存在或者不引入本发明所述抗体时CD3ε的功能活性水平相比，在抗体存在下CD3ε的功能活性水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，抗体被认为部分调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD3ε的至少一种功能活性。

这里描述的每个huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括重链可变区(VH)和轻链可变区。

这里描述的每个huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有一种氨基酸序列为GFTFNTYA(SEQID NO：3)的CDRH1、一种氨基酸序列为IRSKYNNYAT(SEQ ID NO：4)的CDRH2和一种氨基酸序列为VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：5)的CDRH3。

在一些实施方案中，所述重链可变框架序列衍生自hIGHV3-73。

示例性的人源化重链可变区包括以下氨基酸序列。其中CDR是根据IMGT术语定义的：

huSP34_VH

这里描述的1B6 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO：11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO：12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYANRWV(SEQ ID NO：13)的CDRL3。

这里描述的1A10 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO：11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO：12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYKGYWV(SEQ ID NO:14)的CDRL3。

这里描述的1D8 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO:11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO:12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYDGTWV(SEQ ID NO:15)的CDRL3。

这里描述的1F8 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO:11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO:12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYDGKWV(SEQ ID NO:16)的CDRL3。

这里描述的1A11 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO:11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO:12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYDGWWV(SEQ ID NO:17)的CDRL3。

这里描述的1A4 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO:11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO:12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYKQRWV(SEQ ID NO:18)的CDRL3。

这里描述的1H4 huCD3ε单克隆抗体或其任意片段、变体、多聚体形式或者双特异性形式包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有一种氨基酸序列为TGAVTTSNY(SEQID NO:11)的CDRL1、一种氨基酸序列为GTN(SEQ ID NO:12)的CDRL2和一种氨基酸序列为ALWYNQHWV(SEQ ID NO:19)的CDRL3。

在一些实施方案中，本发明的抗-CD3ε抗体序列或其抗原结合片段与一种第二抗体或者其抗原结合片段(所述第二抗体或者其抗原结合片段结合除了CD3ε之外的靶点)一起使用，从而产生一种双特异性抗体，在这里叫做“抗-CD3ε双特异性抗体”。

尽管这里提供了作为实施例的抗体序列，但是本领域普通技术人员应该理解，可以使用任何现有技术已知的各种技术，利用这里描述的序列来产生双特异性抗体。双特异性形式的实施例包括但是不局限于全人类双特异性抗体，所述全人类双特异性抗体包括一种共有的重链、κ-型轻链、和λ-型轻链(PCT申请第WO 2012/023053)、基于Fab臂交换获得的双特异性IgG(Gramer et al.,2013 MAbs.5(6))；CrossMab形式(Klein C et al.,2012MAbs 4(6))；基于强力异构化方法(例如SEED技术(Davis JH et al.,2010ProteinEng Des Sel.23(4):195-202)、静电转向(Gunasekaran K et al.,J Biol Chem.2010 285(25):19637-46)或者旋入孔中(Ridgway JB et al.,Protein Eng.1996 9(7):617-21)或者其他防止同源二聚体形成的突变组(Von Kreudenstein TS et al.,2013MAbs.5(5):646-54.))的多体形式；基于双特异性形式的片段，例如截断的scFv(例如BiTEs)(Wolf Eet al.,2005Drug Discov.Today 10(18):1237-44.)；双特异性四价抗体(

LM etal.,2012Cancer Immunol Immunother.61(10):1869-75.)；双亲和力再靶向分子(MoorePA et al.,2011Blood.117(17):4542-51)、双抗体(Kontermann RE et al.,NatBiotechnol.1997 15(7):629-31)。

定义：

除非另外定义，结合本发明使用的科学技术术语应该具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。另外，除非前后文必需，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常，与这里描述的细胞核组织培养、分子生物学、和蛋白质和寡核苷酸或多聚核苷酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域中众所周知的和普遍采用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体)。酶反应和提纯技术按照厂商说明书或按照本领域中普遍采用的或按照这里描述的进行实施。现有技术和方法通常按照本领域中众所周知的常规方法和在被引用的和在本详述中讨论的多种通常和更特异性参考文献中描述的进行实施。参见，例如Sambrook et al.Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。这里描述的与分析化学、有机合成化学、和药物和制药化学相关的术语和实验室工作程序和技术是本领域中众所周知的并普遍采用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和输送、和患者治疗。

如依照本申请采用的下列术语，除非另外指出，应理解为具有下列含义：

如这里使用的，术语“抗体”统指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(Ig)的免疫活性部分，例如该免疫球蛋白分子含有特异性结合(与发生免疫反应)一种抗原的分子。“特异性结合”或“与发生免疫反应”意指该抗体与预期抗原的一种或一种以上抗原决定簇并不与其它多肽反应(例如，结合)或按照更低亲和力(K_d>10^－6)结合其它多肽。所述抗体包括，但是不局限于其各种片段、变体、多聚形式或者双特异性形式，例如，多克隆、单克隆、嵌合、dAb(区域抗体)单链、F_ab,F_ab’和F_(ab')2片段、scFvs和F_ab表达文库。

众所周知，基本抗体结构单元包括一种四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一种“轻”链(约25kDa)和一种“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括约100到110个或更多个主要负责抗原识别的氨基酸可变区。每个链的羧基末端部分确定主要负责效应因子功能的恒定区。通常，来源于人的抗体分子涉及多种IgG,IgM,IgA,IgE和IgD，这些分子之间的天然区别在于分子中存在的重链是不同的。某些种类还包括亚种类，例如IgG₁、IgG₂及其他。而且，在人类中，轻链分为κ和λ轻链。

如这里采用的，术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”，统指一种抗体分子，所述抗体分子只包括由一组独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的一种抗体分子的分子种类。特别地，单克隆抗体的互补性决定区(CDRs)在所有该组分子中是相同的。MAb包括能与抗原的特殊表位进行免疫反应的抗原结合位，该抗原其特征在于具有独特结合亲和性。

术语“抗原结合位”、或“结合部分”统指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合位由重("H")链和轻("L")链N-末端可变("V")区的氨基酸残基组成。重链和轻链V区内的三个高度分支，统称为“高变区”，插入到被称为“骨架区”或“FRs”的更保守侧枝之间。因此，术语“FR”统指在免疫球蛋白内高变区之间和邻接高变区天然发现的氨基酸序列。在抗体分子内，一种轻链的三个高变区和一种重链的三个高变区相对于三维空间内彼此倾向于形成一种抗原结合面。抗原结合面互补于被结合抗原的三维抗原结合面，并且重链和轻链的每一种的三个高变区统称为“互补性决定区”或“CDRs”。分配给每个结构域的氨基酸与具有免疫学重要性的蛋白质的Kabat序列的定义一致(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991)),或者Chothia&Lesk J.MoI.Biol.196:901-917(1987),Chotliia et al.Nature 342:878-883(1989)。

如这里采用的，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv、T-细胞受体的任何蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、或T-细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，所述化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链，并通常具有特殊的三维结构特征，以及荷质比特征。例如，可以根据多肽的N-末端或者C-末端肽产生抗体。当离解常数<1μM；例如，≤100nM，优选<10nM，最优选<1nM时，抗体被认为特异性结合一种抗原。

如这里采用的，术语“免疫球蛋白结合”，和“免疫球蛋白结合性质”统指发生在免疫球蛋白分子和对免疫球蛋白具有特异性的抗原之间的非共价相互作用。免疫球蛋白结合作用的强度、或亲和性可采用相互作用的离解常数(K_d)表示，其中较小K_d表示较大亲和性。采用本领域中众所周知的方法对被筛选多肽的免疫球蛋白结合性质进行量化。该种方法中的一个需要测量抗原-结合位/抗原复合体形成和离解的速度，其中该速度取决于复合体配对的浓度、相互作用的亲和力、和同等影响两种反应方向速度的几何参数。因此，“结合速率”(K_on)和“离解速率”(K_off)可通过浓度计算和离解的和实际速率进行确定。(参见Nature361:186-87(1993))。K_off/K_0n比值取消与亲和力不相关的所有参数，等于离解常数K_d。(通常参见，Davies et al.(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。依据经测试如本领域的技术人员周知的放射配基结合法或类似方法进行测量，当平衡结合常数(K_d)<1μM；例如，≤100nM，优选<10nM，最优选<1nM时，本发明抗体被认为特异性结合其靶点。

如这里所使用的，术语“分离的多聚核苷酸”应意指基因组、cDNA或人造起源的多聚核苷酸或其组合，由于其起源“分离的多聚核苷酸”(1)与所有或部分的多聚核苷酸不相关，其中“分离的多聚核苷酸”在自然界中存在，(2)可与一种在自然界中不链接的多聚核苷酸链接，或(3)作为较大序列的一部分在自然界中不存在。本发明公开的多核苷酸包括编码重链免疫球蛋白分子的核酸分子和编码这里所述轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。

这里提到的术语“分离的蛋白”意指cDNA、重组RNA、或人造起源的蛋白质或其中一些的组合物，根据其来源或者衍生的起源，“分离的蛋白质”(1)与自然界发现的蛋白质不相关，(2)无相同来源的其他蛋白质，例如，无海洋蛋白质，(3)由来自不同种类的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。

这里使用的术语“多肽”被用作专业术语统指天然蛋白质、多肽序列的片段、或类似物。因此，天然蛋白质片段、和类似物为多肽类的种类。依照本发明的多肽包括这里描述的重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，以及包括重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子例如κ轻链免疫球蛋白分子结合形成的抗体分子，反之亦然，以及其片段和类似物。

如这里所使用的，术语“天然生成”统指能在自然界中自然发现对象的事实。例如，存在于有机体中(包括病毒)的多肽或多聚核苷酸序列，所述多肽或者多聚核苷酸序列可从自然界内的一种来源中分离出不经过人在实验室中人为修饰，则是天然生成。

这里采用的术语“可操作链接”统指被描述的组分位置处于使其能够按照目的方式发挥作用的关联中。与编码序列可操作链接的对照序列以在与对照序列兼容的条件下获得编码序列表达的方式被结合。

这里采用的术语“对照序列”统指对影响其结合的编码序列的表达和处理所必需的多聚核苷酸序列。依据原核生物中宿主有机体，这种对照序列的性质不同，这种对照序列通常包括启动子、核糖体结合位、和真核细胞中转录终止序列，通常，这种对照序列包括启动子和转录终止序列。术语“对照序列”目的最小化包括对表达和处理必要的所有组分，并且也可包括对如前导序列和融合部分序列有利的其他组分。如这里提到的术语“多聚核苷酸”意指一种聚合的长度至少10个碱基的核苷酸、或核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链或双链的DNA。

如这里使用的，20个常规氨基酸和其缩写按照常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第二版,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,SunderlandMass.(1991))。20个常规氨基酸、非天然氨基酸如α-,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可为本发明所述多聚核苷酸的适宜组分。非常规氨基酸的实施例包括：4羟(基)脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟(基)赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸，和其他类似氨基酸和亚氨酸(例如，4-羟(基)脯氨酸)。在这里被采用的多肽表示法中，依据标准用法和常规，左箭头为氨基末端方向，右箭头为羧基末端方向。

如对多肽使用的，术语“基本上同源”是指两个肽序列，当进行优化比对时，如通过程序GAP或BESTFIT采用缺省gap weight，具有至少80％序列同源，优选至少90％序列同源，更优选至少95％序列同源，最优选至少99％序列同源。

优选地，不相同的残基部分经保守氨基酸取代进行区分。

保守氨基酸取代统指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为氨基乙酸、丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺的侧链的一组氨基酸为天冬酰胺酸和谷氨酸盐；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯基丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；和具有含有硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯基丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙胺酸缬氨酸、谷氨酸-天(门)冬氨酸、和天冬酰胺酸-谷氨酸盐。

如这里讨论的，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中最小变化包括在本发明内，但是氨基酸序列中的变化保持至少75％，更优选至少80％、90％、95％，最优选99％。特殊地，保守氨基酸取代被考虑。保守氨基酸取代多发生在侧脸相互关联的氨基酸家族内。遗传编码氨基酸通常分为如下家族：(1)酸性氨基酸为天(门)冬氨酸酯、谷氨酸酯；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和(4)不带电的极性氨基酸为氨基乙酸、天冬酰胺酸、谷氨酸盐、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺酸、天(门)冬氨酸酯、谷氨酸盐、谷氨酸酯、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸。憎水性氨基酸包括丙胺酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他家族氨基酸包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其脂肪族-羟基家族；(ii)天冬酰胺酸和谷氨酸盐，其为含酰胺的家族；(iii)丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族家族；和(iv)苯基丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸，其为芳香族家族。例如，可合理预期的是，用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸酯单独取代天(门)冬氨酸酯，用丝氨酸单独取代苏氨酸，或用具有结构相关氨基酸相似取代一种氨基酸，不会对生成的分子的结合或性质产生主要影响，尤其如果取代不涉及顾家位点内氨基酸。是否氨基酸改变产生功能肽能通过评估多肽衍生物的特殊活性而确定出。评估在这里进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可通过本领域普通技术人员制备得到。片段或类似物的优选氨基-和羧基-端存在于功能结构域边界附近。结构和功能结构域可通过核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比对而被鉴别出。优选地，计算机比对方法被用于鉴别序列基序或已知结构和/或功能的其他蛋白中存在的预期蛋白构形结构域。鉴别出折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是周知的。Bowie et al.Science 253:164(1991)。因此，现有实施例证实本领域技术人员能识别序列基序和结构构形，依据本发明，该结构构形可用于确定结构和功能结构域。

优选的氨基酸取代为那些：(1)减少蛋白质水解的敏感性，(2)减少氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合体的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，和(4)赋予或修改这种类似物的其他物理化学或功能性质。类似物能包括除了天然生成肽序列之外的一种序列的多种突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)可能在天然生成序列(优选在形成分子内接触的结构域外部分多肽内)中进行。保守氨基酸取代不应该大体上改变母序列的结构特征(例如，取代氨基酸不应该趋向折断母体序列中的螺旋，或破坏其他类型的表征母序列的二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的实施例在《蛋白质、结构和分子原理》(Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freemanand Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden andJ.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton et at.Nature354:105(1991)中进行了描述。

如这里采用的，术语“标记”或“标记的”统指加入可探测的标记物，例如通过加入放射性标记氨基酸或附着上可被标记抗生物素蛋白(例如，含荧光标记物或可通过光学或量热方法被探测的酶活性的链霉亲和素)检测出的生物素基团的多肽。在某一情况中，标记或标记物也可具有治疗性的。标记多肽和糖蛋白的多种方法在本领域中是周知的并可被采用。多肽标记的实施例包括，但不限于，下列：放射性同位素或放射性核(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、荧光标记物(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光的、生物素基团、二级受体(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位、金属结合结构域、表位附加标记)识别的预先确定多肽表位。在一些实施方案中，标记被附着在不同长度的间隔臂减少潜在空间位阻。如这里采用的术语“制药试剂或药物”统指当正确对一种患者进行给药时，能够引发预期治疗功效的一种化学化合物或组合物。

依据本领域中常规用法，这里的也可以使用其他的化学术语，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.,Ed.,McGraw-Hill,San Francisco(1985))中所例举的。

如这里采用的，“基本上纯净的”是指目标种类为存在的主要种类(例如，以摩尔计，它比组合物中任何其他单个种类更多)，优选地，基本纯化组分为一种组合物，其中目标种类包括至少约所有存在的大分子种类的50％(以摩尔计)。

一般地，大体上纯化组合物将包括组合物中存在的大于80％，更优选地大于约85％、90％、95％和99％的大分子种类。最优选地，目标种类被纯化成基本均一性(经传统检测方法不能检测出组合物中的污染物种类)，其中组合物基本由单一大分子种类组成。

术语患者包括人和兽医医学对象。

抗体

多种本领域已知的方法可以被用做生产针对给定靶点(例如，比方说，CD3ε、肿瘤相关抗原或者其他靶点)或者其衍生物、片段、类似物或其同系物的多克隆或者单克隆抗体(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；其通过引证在此全部并入本文)。

使用本领域众所周知的技术对抗体进行纯化，例如，采用蛋白A或蛋白G的亲和层析法，该亲和层析法主要提供免疫血清的IgG片断。随后或者作为选择，针对某种免疫球蛋白组或其表位的特异性抗体可以被固定在层析柱上，通过免疫亲和层析法纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化已经被公开，例如，在D.Wilkinson的文献中(The Scientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia PA,Vol.14,No.8(April 17,2000),pp.25-28)。

在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。例如，通过使用本文提供的实施例中所述的方法来生成单克隆抗体。还可以通过用在其表面表达高水平给定靶点的细胞转染剂组合物对BALB/c小鼠进行免疫来产生抗体。然后用骨髓瘤/B细胞融合物产生的杂交瘤来筛选针对选定靶点的反应性。

可以使用，例如杂交瘤的方法制备单克隆抗体，例如，在以下文献中描述的：Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975).在杂交瘤方法中，用常用的免疫试剂对小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物进行免疫，以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将与免疫剂特异结合。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。

免疫剂通常包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。一般来说，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞；如果需要非人类哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与固定化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103)。固定化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是来自啮齿动物、牛和人类的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合、固定化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。

优选的固定化细胞系是那些能够有效融合、支持抗体在所选择的生产抗体的细胞中稳定的高水平表达的细胞系，并且优选的固定化细胞系对培养基，例如对HAT培养基之类的培养基敏感。更优选的固定化细胞系是小鼠骨髓瘤系，例如，可从加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分布中心和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物收集中心获得。人类骨髓瘤和小鼠-人类异基因骨髓瘤细胞系已经被记载用于生产单克隆抗体(参见Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)pp.51-63))。

然后可以检测培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对该抗原的单克隆抗体。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或体外结合试验(例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。此类技术和分析方法在本领域内是已知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力可以通过Munson和Pollard的Scatchard分析来确定Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，识别对靶向抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体是非常重要的。

在识别出理想的杂交瘤细胞之后，通过限制稀释过程将克隆体进行亚克隆并使用标准方法生长(参见Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)pp.59-103)。适用于此目的的合适的培养基包括，例如，Dulbecco's修饰的鹰式培养基和RPMI-1640培养基。作为选择，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为腹水生长。

可以使用常用的免疫球蛋白分离方法将亚克隆体分泌的单克隆抗体从培养基或者腹水液体中分离或者纯化出来，所述免疫球蛋白分离方法例如，比方说，蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和层析法。

还可以使用重组DNA技术制备单克隆抗体，例如，美国专利第4,816,567中所公开的。可以使用常用的方法(例如，通过使用寡聚核苷酸探针，所述寡聚核苷酸探针能够特异性结合编码鼠抗体轻链和重链的基因)容易的分离并测序这里公开的DNA编码的单克隆抗体。这里公开的杂交瘤细胞可以用作这种DNA的优选来源。一旦被分离，所述DNA可以被放置在表达载体中，随后被转染到宿主细胞，例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。所述DNA也可以被修饰，例如，用同源的鼠序列取代人类重链和轻链恒定区编码序列(参见美国专利第4816567号；Morrison，Nature 368，812-13(1994))或通过共价结合免疫球蛋白编码序列的全部或者部分非球蛋白多肽的编码序列来修饰。这种非免疫球蛋白多肽可以被这里公开的抗体恒定区所取代，或者可以被这里所公开的抗体的抗原结合位点的一个可变区所取代，从而产生嵌合二价抗体。

本发明的单克隆抗体包括人源化抗体或人抗体。这些抗体适合用于施用给人而不产生针对所施用的免疫球蛋白的人的免疫应答。抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、F_ab、F_ab’、F_(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其主要由人免疫球蛋白的序列构成，并包括源自非人免疫球蛋白的最少序列。例如通过按照Winter和同事的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过用人抗体的相应序列取代啮齿动物CDR或CDR序列来进行人源化。(还参见美国专利号5,225,539)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还包括，例如既不见于受体抗体也不见于导入的CDR或框架序列的残基。通常，人源化抗体包括基本上至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。人源化抗体任选地还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.,1986；Riechmann et al.,1988；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。

全人抗体是其中轻链和重链的整个序列(包括各个互补决定区CDR)均源自人基因的抗体分子。这些抗体在本文又称为“人抗体”或“全人抗体”。可以通过使用三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,et al.,1983Immunol Today 4:72)，以及产生单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole,et al.,1985In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)制备单克隆抗体。可以利用单克隆抗体并可以通过使用人杂交瘤(参见Cote,等,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)产生单克隆抗体，或通过用埃巴二氏病毒体外转化人B细胞来生产单克隆抗体(参见，Cole,et al.,1985In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。

此外，还可以使用其他的技术，包括噬菌体展示文库产生人抗体。(参见Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如，小鼠)来制造人抗体。在受到攻击时，观察到人抗体产生，其在各方面非常类似于在人中所见，包括基因重排，装配和抗体库。此方法描述于，例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，和Markset al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368,812-13(1994)；Fishwild et al,Nature Biotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；以及Lonberg andHuszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)中。

另外，还可以使用转基因非人动物产生人抗体，所述转基因非人动物被修饰以便在对抗原的攻击应答时产生全人抗体而非动物的内源抗体。(参见PCT申请W094/02602)。编码非人宿主重和轻免疫球蛋白链的内源基因已丧失能力，并且编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入到宿主的基因组中。例如，使用包括所需人DNA区段的酵母人工染色体掺入人基因。然后通过杂交包括比修饰的全互补物少的中间转基因动物获得作为后代的提供所有所需修饰的动物。这种非人动物的实例是称为Xenomouse^TM的小鼠，如公开于PCT公布WO 96/33735和WO 96/34096。此动物产生B细胞，其分泌全人免疫球蛋白。抗体可直接从目标免疫原免疫后的动物获得，作为，例如多克隆抗体的制备物，或者可选地从动物来源的永生化B细胞例如产生单克隆抗体的杂交瘤获得。此外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可以回收和表达以直接获得抗体，或者可进一步修饰以获得抗体类似物，诸如，例如，单链Fv(scFv)分子。

产生缺少内源免疫球蛋白重链表达的非人宿主(示例为小鼠)的方法的实例公开于美国专利第5,939,598号中。其可以通过一种方法获得，所述方法包括：从胚胎干细胞中至少一个内源重链基因座缺失J区段的基因，以防止基因座重排，并防止重排的免疫球蛋白重链基因座转录物的形成，所述缺失通过包括编码可选择标记基因的靶向载体实现；并从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包括编码可选择标记的基因。

用于产生目标抗体诸如人抗体的一个方法公开于美国专利第5,916,771号中。该方法包括将包括编码重链的核苷酸序列的表达载体导入一种培养的哺乳动物宿主细胞，将包括编码轻链的核苷酸序列的表达载体导入另一种哺乳动物宿主细胞，并融合两种细胞以形成杂交细胞。所述杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体

在此方法的一个进一步的改进中，用于鉴定免疫原上临床相关表位的方法和用于选择以高亲和力特异性结合相关表位的抗体的相关方法公开于PCT申请WO99/53049中。

所述抗体可以通过含有编码上述单链抗体的DNA区段的载体来表达。

这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物，诸如国际申请第WO93/64701号中的描述，其具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如，聚赖氨酸)；病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)；融合蛋白，诸如描述于PCT/US95/02140(WO95/22618)中的描述，其是包括靶部分(例如，特异针对靶细胞的抗体)和核酸结合部分(例如，鱼精蛋白)的融合蛋白；质粒；噬菌体等。载体可以是染色体载体，非染色体载体或合成载体。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。反转录载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘载体诸如正痘或禽痘载体，疱疹病毒载体诸如单纯疱疹I病毒(HSV)载体(参见Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,et al.,in DNA Cloning:Mammalian Systems；D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.et al.,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.,et al.,Proc Natl.Acad.Sci USA 87:1149(1990)，腺病毒载体(参见LeGal LaSalle et al.,Science,259:988(1993)；Davidson,et al.,Nat.Genet 3:219(1993)；Yang,et al.,J.Virol.69:2004(1995)，以及腺病毒相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.et al.,Nat.Genet.8:148(1994))。

痘病毒载体将基因导入细胞胞浆。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒载体，腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体优选用于将核酸导入神经细胞。腺病毒载体导致比腺相关病毒(约4个月)(其转而短于HSV载体)更短期的表达(约2个月)。所选具体载体将取决于靶细胞和处理条件。导入可以通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞显微注射和病毒载体。

可以利用所述载体针对基本上任何期望的靶细胞。例如，立体定位注射可以用来引导载体(例如，腺病毒，HSV)至期望的位置。此外，该粒子可以通过使用微泵输注系统，如SynchroMed输注系统进行脑室内(icv)输注来递送。基于本体流动的方法，称为对流，也被证明在递送大分子到大脑的延伸区域是有效的并可用于将载体递送至靶细胞。(参见Boboet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994)；Morrison et al.,Am.J.Physiol.266:292-305(1994))。可以使用的其它方法包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，以及口服或其它已知的施用途径。

双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本发明情况下，结合特异性之一是对诸如CD3ε或其任何片段的靶点具有结合特异性。所述第二结合靶点是任何其它抗原，并且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链/轻链的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milsteinand Cuello,Nature,305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。类似方法公开于1993年5月13日发表的WO 93/08829和Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。

可以使用任何一种本领域内公知的技术制备双特异性和/或单价抗体，包括2011年8月16日递交的处于在审状态的WO 2012/023053，该专利的全部内容通过引证在此并入本文。WO 2012/023053中描述的方法可以产生在结构上与人免疫球蛋白一致的双特异性抗体。这种分子由两个拷贝的特有重链多肽、一个与恒定的κ区融合的第一轻链可变区和与恒定λ区融合的第二轻链可变区组成。由于重链和轻链的贡献，每个结合位点显示不同的抗原特异性。所述轻链可变区可以是λ族或者κ族，并且优选分别与λ和κ恒定区融合。优选的是，为了避免产生非天然多肽链接物。但是，还有可能通过将κ轻链可变区与具有第一特异性的恒定的λ区域相融合并且将λ轻链可变区与具有第二特异性的恒定κ区相融合来获得这里公开的双特异性抗体。WO 2012/023053中公开的双特异性抗体被称为IgGκλ抗体或者“κλ抗体”，是一种新全人双特异性IgG形式。这种κλ-体形式能够使该双特异性抗体与标准IgG分子相区别，并且与标准单克隆抗体分子相区别，从而允许对双特异性抗体进行亲和纯化，并因此与之前的形式相比是更为优选的。

本发明的一个基本步骤是识别两种抗体的Fv区域(每种都由一个可变轻链区域和可变重链区域组成)，其具有不同的抗原特异性但是具有相同的重链可变区。以及公开了多种方法来产生单克隆抗体及其片段(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,该文献通过引证在此全部并入本文)。全人抗体是一种特定的抗体分子，在此抗体分子中，轻链和重链的序列，包括CDR1和CDR2均来自于人类基因。CDR3区域可以是人类来源的或者是通过合成方法被设计的。这种抗体在这里被叫做“人抗体”，或者“全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,et al.,1983Immunol Today 4:72)，以及产生单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole,et al.,1985In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)制备单克隆抗体。可以利用单克隆抗体并可以通过使用人杂交瘤(参见Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)产生单克隆抗体，或通过用埃巴二氏病毒体外转化人B细胞来生产单克隆抗体(参见，Cole,et al.,1985In:MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。

例如通过用靶点抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫接种动物生成单克隆抗体。可替代地，动物用细胞进行免疫，所述细胞用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染，从而使得靶点抗原被表达且与转染细胞的表面结合。用于生产异种非人动物的多种技术是本领域众所周知的。例如，参见在此整体通过引用并入的美国专利号6,075,181和6,150,584。

可替代地，通过筛选含有抗体或抗原结合结构域序列的文库与靶抗原的结合获得抗体。该文库例如在细菌噬菌体中被制备为与细菌噬菌体衣壳蛋白的蛋白或肽融合物和包括在噬菌体颗粒内的编码DNA序列(即，“噬菌体展示的文库”)，所述蛋白或肽融合物在装配的噬菌体颗粒的表面上表达。

随后筛选获得自骨髓瘤/B细胞融合物的杂交瘤的与靶抗原的反应性。单克隆抗体例如使用杂交瘤方法例如由Kohler和Milstein，Nature，256:495(1975)描述的那些进行制备。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其他合适宿主动物一般用免疫试剂进行免疫，以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将与免疫试剂特异性结合。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。

尽管并非严格不可能，但具有相同重链可变结构域但针对不同抗原的不同抗体的偶然鉴定是高度不可能的。事实上，在大多数情况下，重链在很大程度上促成抗原结合表面，并且在序列中也是最可变的。特别地，在重链上的CDR3是序列、长度和结构中最多样的CDR。因此，对于不同抗原特异性的两种抗体将几乎总是具有不同重链可变结构域。

目前在审的专利申请WO 2012/023053中描述的方法克服了这一缺陷并且极大的促进了具有相同重链可变区的分离，所述分离是通过使用抗体文库进行的，在此抗体文库中，重链可变区与所有文库成员的相同，并且因此其多样性取决于其轻链可变区。这些文库被描述在，例如，目前在审的专利申请WO 2010/135558和WO 2011/084255中，这些专利的每一篇通过引证在此全部并入本文。但是，因为轻链可变结构域与重链可变区结合表达，所以两个结构域可以促成抗原结合。为了进一步促进该过程，含有相同重链可变结构域和λ可变轻链或κ可变轻链的多样性的抗体文库可以平行用于针对不同抗原的抗体的体外选择。这种方法使两种抗体的鉴定成为可能，所述两种抗体具有共同重链但一个具有λ轻链可变结构域并且另一个具有κ轻链可变结构域，其可以用作用于生成本发明的完全免疫球蛋白形式中的双特异性抗体的构建嵌段。本发明的双特异性抗体可以是不同同种型的，并且其Fc部分可以是修饰的，以便改变与不同Fc受体的结合性质，并且以这种方式修饰抗体的效应子功能以及其药物代谢动力学性质。用于修饰Fc部分的众多方法已得到描述且可应用于本发明的抗体。(参见例如WR Curr Opin Biotechnol 2009(6):685-91；美国专利号6,528,624；于2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可以用于生成双特异性抗体和以缺乏Fc部分的F(ab’)2形式的抗体混合物。

常见的重链和两种不同的轻链在单一细胞中共表达，从而组装成这里所公开的双特异性抗体。如果所有多肽都在相同水平表达并且变得同样良好装配，以形成免疫球蛋白分子，那么单特异性(相同轻链)和双特异性(两条不同轻链)的比例应当是50％。然而，可能不同轻链以不同水平表达和/或不以相同效率装配。因此，本发明的方法还提供了调节不同多肽的相对表达的方法，以补偿其固有表达特征或与共同重链装配的不同倾向。这种调节可以经由启动子强度，特征在于不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或其他类型的调节元件的使用以及对mRNA稳定性起作用而达到，所述调节元件可以在转录或翻译水平起作用。不同强度的不同启动子可以包括CMV(立即早期巨细胞病毒病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α-亚单位启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。来自哺乳动物和病毒来源的不同IRES也已得到描述。(参见例如，Hellen CU和Sarnow P.Genes Dev 200115：1593–612)。这些IRES在其长度和核糖体招募效率方面极大不同。此外，可能通过引入多拷贝的IRES进一步微调活性(Stephen等人2000Proc Natl Acad Sci USA 97：1536-1541)。表达的调节还可以通过细胞的多次相继转染达到，以增加表达一条或另一条轻链的个别基因的拷贝数，并且因此修饰其相对表达。本文提供的实施例证实控制不同链的相对表达对于使双特异性抗体的装配和总体得率达到最大是关键的。

重链和两条轻链的共表达生成在细胞培养上清液内的三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化，以获得目的分子。本文描述的方法通过使用亲和层析介质极大促进这个纯化程序，所述亲和层析介质与κ或λ轻链恒定结构域特异性相互作用，例如Capture Select Fabκ和Capture Select Fabλ亲和介质(BAC BV，荷兰)。这个多步亲和层析纯化方法是有效的且一般可应用于本发明的抗体。这与特异性纯化方法形成鲜明对比，所述特异性纯化方法必须对于衍生自四源杂交瘤的每种双特异性抗体或表达抗体混合物的其他细胞系开发且最佳化。事实上，如果混合物中的不同抗体的生物化学特征是相似的，那么其使用标准层析技术例如离子交换层析的分离可以是挑战性的或完全不可能的。

其他合适的纯化方法包括公开在2012年10月19日递交的在审国际申请PCT/IB2012/003028和WO2013/088259的方法，这些专利的每个通过引证在此全部并入本文。

再另一个产生双特异性抗体的实施方案中，具有理想结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选发生在免疫球蛋白重链恒定区，包括铰链区的一部分、CH2和CH3结构域。优选具有一种重链恒定区(CH1)，所述重链恒定区包括在至少一种融合中存在的轻链结合所需位点。编码免疫球蛋白重链融合的DNA和必要时，免疫球蛋白轻链，被插入到分离的表达载体，并共转染到适宜的宿主有机体内。对于生成双特异性抗体的进一步详情参见，Suresh et al.,Methods inEnzymology,121:210(1986)。

依据WO 96/27011中描述的另一种方法，一对抗体分子间的界面可被遗传工程学方法最大化二聚体的百分率，该二聚体由重组细胞培养物中得到。优选界面包括至少抗体恒定结构域CH3区域的一部分。在该方法中，第一种抗体分子的界面的一种或一种以上小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过采用较小氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)取代较大氨基酸侧链，等同于或类似于较大侧链尺寸的代偿性空腔建立在第二个抗体分子界面上。这提供了提高异型二聚体产量超过其他不必要的最后产物如同型二聚体的机理。

文献中已经报道了使用抗体片段制备双特异性抗体的技术。例如，使用化学连接法可以制备双特异性抗体。制得的双特异性抗体可以用作酶选择性固定化作用的试剂。

制备和从重组细胞培养物中直接分离双特异性抗体的多种技术已经进行了描述。例如，采用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两个不同抗体的Fab'部分。抗体同型二聚体在铰链区被还原形成单体，然后再氧化形成抗体异型二聚体。这种方法也可被用于制备抗体同型二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双链抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的可供选择机理。该片段包括与通过一种接头与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)，该接头太短以至于在同一链上的两个结构域之间不能配对。因此，一种片段的VH和VL结构域不强行与另一种片段的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略已经进行了报道。参见Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994)。

具有大于2个价态的抗体也被包括在本发明范围内，例如，三特异性抗体也可以被制的Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。

示范性双特异性抗体可结合两个不同的表位，至少其中一种存在于本发明的蛋白质抗原中。或者，一种免疫球蛋白分子的抗-抗原臂可与一种结合白细胞如T-细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28、或B7)、或IgG的Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)上的诱导分子的一种臂结合使细胞防御机理焦点引入到细胞表达特殊抗原上。双特异性抗体也可用于表达一种特殊抗原的细胞的直接细胞毒类药物。这些抗体具有一种抗原结合臂和结合一种细胞毒类药物或一种放射性核素螯合剂如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的结合臂。另一种重要的双特异性抗体结合这里描述的蛋白抗原并进一步结合组织因子(TF)。

异偶联物抗体也被包括在本发明界定的范围内。异偶联物抗体由两个共价键连接的抗体组成。这种抗体，例如被提出使免疫系统细胞靶向不必要细胞(参见例如，美国专利第4,676,980号)，并治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。可期望的是，该抗体可采用合成蛋白化学中周知的方法在体外制得，包括涉及交联剂的那些。例如，免疫毒素可采用二硫化物交换反应或通过形成一种硫醚键而构成。用于本目的的适宜试剂的实施例包括亚氨基硫醇和甲基-4-氢硫基丁基亚胺酸酯和如在美国专利第4,676,980号中公开的那些。

理想的情况是修改本发明中关于效应子功能的抗体，以提高(例如)抗体在治疗与异常CD3ε表达和/或活性相关的癌症和/或其他疾病和异常中的有效性。例如，静止突变可以被引入Fc区域，从而破坏Fc受体的结合并降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。本领域已经描述了Fc区域中的静止突变：例如LALA和N297A突变(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.vol.20(6):685-691)；和D265A(Baudino et al.,2008,J.Immunol.181:6664-69；Strohl,W.,supra)。静止Fc lgG1抗体的实例包括所谓的LALA突变体，其在lgG1 Fc氨基酸序列中包括L234A和L235A突变。静止的lgG1抗体的另一个例子包括D265A突变。另一种沉默的lgG1抗体包括N297A突变，其可以产生糖基化/非糖基化抗体。抗体Fc区的糖基化可以调节与Fc受体的结合，而去糖基化可能导致结合减少。由此产生的抗体可降低内在化能力和/或减少补体介导的细胞杀伤力和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

本文所公开的抗体也可被配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体由本领域已知的方法制备，如Epstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；和美国专利第4,485,045和4,544,545号中所描述的。具有增强循环时间的脂质体在美国专利号5013556中公开。

特别有用的脂质体可使用一种包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，由反相蒸发法产生。脂质体通过规定孔径的过滤器挤出，得到所需直径的脂质体。如Martin et al.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述，本发明抗体的Fab'片段可与脂质体结合。

抗-CD3ε抗体的应用

应了解，依据本发明，本发明的治疗剂将与适宜载体、赋形剂及其他制剂一起给药，其中所述适宜的载体、赋形剂和其他制剂被添加到制剂中来提供改善的转移、输送、耐受性和类似性质。许多适宜的配方可在所有制药药剂师周知的药典中找到：Remington'sPharmaceutical Sciences(15th ed,Mack Publishing Company,Easton,PA(1975))，尤其在Blaug,Seymour编写的第87章。这些配方包括，例如，粉末、贴剂、药膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含小泡的脂质(例如，Lipofectin^TM)、DNA偶联物、无水吸收贴剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固态凝胶、和含有碳蜡的半固态混合物。假如制剂中的活性组分经配制不失活并且所得制剂是生理学上相容的，并且对给药路线具有耐受性，则本发明前述混合物中的任何一种可能适用于在本发明的处理和治疗中。也参见，Baldrick P."Pharmaceutical excipient development:the need for preclinicalguidance."Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W."Lyophilizationand development of solid protein pharmaceuticals."Int.J.Pharni.203(1-2):1-60(2000),Charman WN"Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-someemerging concepts."J Phartn Sci.89(8):967-78(2000),Powell et al."Compendiumof excipients for parenteral formulations"PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311(1998)和与制药药剂师周知的制剂、赋形剂和载体相关的引用的附加信息。

本包括这里所公开的抗体的本发明治疗制剂被用于治疗或减轻与癌症相关的症状，例如，但不局限于，白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胶质瘤、肺癌和支气管癌、结肠直肠癌癌症、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾盂癌、口腔和咽部癌、子宫体癌和/或黑色素瘤。本发明还提供了治疗或减轻与癌症相关症状的方法。治疗方案是通过使用标准方法确定受试者，例如患有癌症(或有发展风险)的人类患者来实施的。

可以通过与任何已知的诊断或治疗特定免疫相关疾病的方法相关联来确定治疗的有效性。免疫相关疾病的一种或多种症状的缓解表明抗体具有临床益处。

筛选具有所需特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)和本领域已知的其他免疫介导技术。

在与靶点定位和/或定量有关的本领域内已知的方法中，可以使用直接针对某一靶点，比如CD3，肿瘤相关抗原或者其他抗原(或其片段)的抗体，例如，用于测定合适的生物学样品中这些靶点的水平，用于诊断方法中，用于对蛋白成像等等。在一个给定的实施方案中，对这些靶点中的任意一个具有特异性的抗体或其衍生物、片段、类似物或者同系物包括衍生自抗原结合区域的抗体，这些抗体被用作药理学活性成分(以下称为“治疗剂”)。

本发明的抗体可用于使用标准技术(如免疫亲和技术、色谱法或免疫沉淀法)分离特定靶点。本发明的抗体(或其片段)可诊断性地用于监测组织中的蛋白质水平，作为临床试验程序的一部分，例如，确定给定治疗方案的疗效。可通过将抗体与可检测物质耦合(即物理连接)来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、修复基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的修复基团复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形花序酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明，二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和阿曲林，并且合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或者³H。

本发明的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和全人源性抗体，可用作治疗剂。这类治疗剂通常用于治疗或预防与受试者中特定靶点的异常表达或激活相关的疾病或病理学。向受试者施用抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制剂，并且通常由于其与靶抗原结合而产生作用。给药抗体可以消除、抑制或干扰靶的信号功能。给药抗体可能会取消、抑制或干扰靶向与它自然结合的内源性配体的结合。

本发明抗体的治疗有效量通常与实现治疗目标所需的量有关。如上所述，这可能是抗体与其靶抗原之间的结合作用，在某些情况下，会干扰靶点的功能。所需给药量还将取决于抗体对其特定抗原的结合亲和力，也将取决于被给药的抗体从其他受试者的游离体积中耗尽的速率。通过非限制性实例，本发明抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常用范围可为约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率可能从每天两次到一周一次不等。

可以以药物组合物的形式施用本发明的抗体或其片段，用于多种疾病和病症的治疗。例如在Remington:The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(AlfonsoR.Gennaro,等编辑)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995；Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery(Advances InParenteral Sciences,Vol.4),1991,M.Dekker,New York中提供了在制备此类组合物中涉及的原则和考虑，以及组分选择中的指导。

其中，使用抗体片段时，优选能够特异性结合到靶蛋白的结合结构域上的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计肽分子保留结合靶蛋白序列的能力。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见，例如Marasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993))。制剂还可以包括一个以上的对于被治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性彼此没有不利地影响那些。可选地，或另外地，所述组合物可包括增强其功能的试剂，诸如，比方说，细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。这类分子以对于预定目的有效的量适合地存在于组合中。

所述活性成分也可以被包埋在微胶囊中，所述微胶囊通过如下制备：例如，通过凝聚技术或通过界面聚合，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或在粗乳液中。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可以制备可持续释放的制剂(缓释制剂)。缓释制剂的合适实例包括包括抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，其中所述基质以定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白持续较短的时间段。

根据本发明的抗体可用作用于检测样品中给定靶点(或其蛋白片段)是否存在的试剂。在一些实施方案中，所述抗体包括可检测标记。所述抗体是多克隆抗体，或更优选地，是单克隆抗体。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”，旨在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质至探针或抗体的探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性的探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测初级抗体，和用生物素末端标记的DNA探针，使得它可以用荧光标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”旨在包括从对象分离的组织、细胞和生物流体，以及对象内存在的组织、细胞和流体。因此包括在术语“生物样品”的使用内的是血液和血液的级分或组成部分，包括血清、血浆或淋巴。即，本发明的检测方法可用于在体外和体内检测生物样品中分析物mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。用于进行免疫测定的方法描述于，例如“ELISA:Theory and Practice:Methods in Molecular Biology”,Vol.42,J.R.Crowther(Ed.)Human Press,Totowa,NJ,1995；“Immunoassay”,E.Diamandis and T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,SanDiego,CA,1996；和“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括引入对象标记的抗分析物蛋白抗体。例如，所述抗体可标记有放射性标记物，其在对象中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。

药物组合物

这里公开的抗体(本文也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可以被整合到适合于施用的药物组合物中。此类组合物典型地包括抗体和药学上可接受的载体。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，与药物的给药方式相兼容。合适的载体描述于该领域中的标准参考文献最近版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences中，该文献在此通过引用并入本文。这些载体或稀释剂的优选实例包括，但不限于，水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性载体，如固定油。这些介质和试剂在药学活性基质中的使用是本领域熟知的。除非不兼容，在任何常规介质或试剂与活性化合物其在组合物中的使用是预期的。补充的活性化合物也可以被包括在组合物中。

本发明的药物组合物被配制成与其预期施用途径相兼容的剂型。施用途径的实例包括肠胃外给药，例如，静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服给药(例如，吸入给药)、经皮给药(即，局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。用于肠胃外给药、皮内给药或皮下给药应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外给药的制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶)或分散体和用于随时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是达到存在易注射性程度的流体。它必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用下保存。载体可以是包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，在组合物中将优选包括等渗剂，例如糖类，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。

可通过在适当的溶剂中以所需量掺入活性化合物以及上面列举的成分之一或组合，根据需要，然后过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质的和来自上述列举的那些所需其它成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液获得活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压成片剂。对于口服治疗施用目的，活性化合物可以与赋形剂掺合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备用作漱口水，其中在该流体载体中的化合物经口应用并涮洗及吐出或吞下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以包括作为组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸、羟基乙酸淀粉钠或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。

对于通过吸入式给药，所述化合物从加压容器或者分配器中以气溶胶喷雾的形式传递，所述加压容器或者分配器包括合适的推进剂(例如气体，例如，二氧化碳)或者喷雾器。

全身施用也可是通过经粘膜或经皮手段。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用对待渗透的障碍合适的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括，例如，用于经粘膜施用，去垢剂，胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。

所述化合物也可以被制备成栓剂形式(例如，与常规的栓剂基质一起，例如，可可脂和其他甘油酯一起制备)或者用于直肠传递的滞留型灌肠剂。

在一个实施方案中，与载体一起制备活性化合物，所述载体将保护化合物免于快速从体内消除，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法对于那些本领域技术人员将是显而易见的。该材料也可以从Alza公司和诺华制药有限公司商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以根据本领域技术人员已知的方法制备这些，例如在美国专利第4,522,811号中描述的方法。

以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物以易于施用和剂量的均匀性是特别有利的。如本文所用剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的经计算与所需的药物载体联合以产生的期望的治疗效果的活性化合物。对于本发明的剂量单位形式的说明是由活性化合物的独特性质和要实现的特定治疗效果以及配制这种活性化合物用于个体的治疗的所属领域中固有的限制来决定，并直接取决于活性化合物的独特性质和要实现的特定治疗效果以及配制这种活性化合物用于个体的治疗的所述领域中固有的限制。

这里所述的药物组合物可以与使用说明书一起被包括在容器、包装或者分配器中。

本发明将在下面的实施例中被进一步的描述，但下面实施例不限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由权利要求书描述。

实施例

实施例1.抗-CD3单克隆抗体SP34的蛋白质序列的确定

可商业获得的鼠单克隆抗体SP34(Pessano et al.1985,EMBO J；4-2)与人类和食蟹猴CD3ε特异性结合。用质谱法重新测定了SP34的可变重链和轻链的氨基酸序列。蛋白质样品在8M尿素、50mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)缓冲液中溶解，然后添加三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)至最终浓度5mM，并在室温下孵育20分钟。随后添加最终浓度为10mM的碘代乙酰胺，并在室温下培养样品再在黑暗中保持20分钟。烷基化后，抗体样品通过添加PNGase F酶缓冲液(新英格兰生物实验室)稀释1:10。将0.5μl PNGase样品加入25μg抗体中，以使糖基化。将样品在37℃下进一步培养1小时。为了分离两种抗体亚基(LC，HC)，将烷基化和脱糖基化的抗体样品溶解在样品装载缓冲液中。将5μg的等分试样加载到SDS-PAGE凝胶上。凝胶运行(150V，最大400mA，75分钟)后，在考马斯亮蓝(CBB G250)染色前，将凝胶在50％乙醇、10％乙酸中孵育30分钟，将SDS-PAGE凝胶切片分别在100mM ABC或50mM ABC、60％ACN中膨胀/收缩3次，制备酶切。每个步骤在室温下进行30分钟。最后一步收缩后，凝胶切片在打开的eppendorf杯中干燥15分钟。通过添加3体积(约为凝胶体积)的酶溶液(酶/蛋白质比为1:50)开始蛋白质水解。表1列出了用于蛋白质水解的酶溶液。每一次蛋白质水解都在夜间进行。所得肽在质谱前用0.5％(最终)甲酸酸化。

表1:蛋白水解酶及其适当的缓冲溶液和培养温度列表

Tr/TL/PK/弹性蛋白酶:50mM碳酸氢铵,10％乙腈(v/v)@37℃
	CT:100mMTris-HCl,10mM CaCl2,5％ACN(v/v),pH 8.0@37℃
LysC:50mM Tris-HCl,1mM EDTA,10％ACN(v/v),pH 8.5@37℃
	GluC:50mM Tris-HCl,0.5mMGlu-Glu,pH 8.0@25℃
LysN:100mM Bis-Tris丙烷,pH 10@37℃
	AspN:50mMTris-HCl,2.5mM ZnSO4,pH 8.0@37℃

安捷伦1100纳米液晶系统与Orbitrap XL质谱仪(购自德国不来梅市ThermoFisher公司)耦合。从蛋白质水解液中提取样品，经酸化后用于纳米级ESIMS/MS。在使用1％乙腈/0.5％甲酸溶液在富集柱(Zorbax SB C18，0.3毫米x 5毫米，安捷伦)上捕获和脱盐后，在Zorbax 300SB C18，75μm x 150mm柱(安捷伦，Waldbronn)上用乙腈/0.1％甲酸梯度从5％到40％乙腈分离肽。根据制造商的仪器设置，在FT模式下自动获取MS概述光谱，以进行纳米LC ESI MSMS分析、肽碎片(CID和HCD)以及在FT模式下操作的检测。

迭代序列组装(未显示数据)显示了单克隆抗体可变轻链的一个候选序列和可变重链的一个候选序列。

被确定的氨基酸序列和核酸序列如下所示：

mSP34VH

mSP34VL

实施例2:鼠SP34人源化变体的选择

在实施例1中确定的可变重链的氨基酸序列被用作抗体人源化的模板，所述方法使用互补性确定区域(CDR)嫁接法(Jones P et al,1980,Nature)，并使用hIGHV3-73框架作为受体(IMGT命名法)。hIGHV3-73框架的氨基酸和核酸序列如下所示。IMGT术语定义的CDR序列加下划线。

hIGHV3-73框架区

hIGHV3-73框架区

人源化SP34的可变重链中各个CDR的氨基酸序列和核酸序列如表2所示。

表2：人源化SP34的CDR序列

人源化SP34可变重链的氨基酸序列和核酸序列如下所示。IMGT术语定义的CDR序列加下划线。

huSP34VH

huSP34VH

鼠和人源化SP34序列的序列比对如下所示(mSP34VH(SEQ ID NO：1)和hSP34VH(SEQ ID NO：6)).IMGT术语定义的各个CDR序列加下划线。hSP34VH氨基酸中未与mSP34VH对齐的氨基酸用斜体表示。hSP34VH氨基酸序列中与mSP34VH对齐的氨基酸用“.”表示。

mSP34VH

同样，mSP34的轻链CDR1和2被嫁接到人类hIGLV7-46框架区上。hIGLV7-46框架区的氨基酸和核酸序列如下所示。IMGT术语定义的CDR序列加下划线。

hIGLV7-46框架区

hIGLV7-46框架区

在DNA合成过程中，将mSP34的CDR3区域替换为含有IIs型限制酶的非编码填充DNA片段，以产生一个受体框架，允许插入编码CDR3区域的多种序列并按照欧洲专利EP2432878中所述的方法有效地生成噬菌体展示抗体库。人源化重链可变区和受体轻链可变区首先作为单链抗体克隆到pNDS噬菌体中间载体中(Ravn et al.，2009，NAR)。采用简并NNS密码子策略，合成了3种部分随机化mSP34基因CDRL3的DNA片段。每个片段(Fgt a，b，c)使CDR的3个连续密码子多样化，如下所示。

CDRL3

X＝NNS密码子

表3：实施例2中分离的人源化CD3ε scFv结合体CDR序列

人源化SP34可变轻链区域的氨基酸序列和核酸序列如下所示。IMGT术语定义的CDR序列加下划线。

L3sp34-G1-1-R2-P1_B6可变轻链

L3sp34-G1-2-R2-P1_A10可变轻链

L3sp34-G1-1-R2-P1_D8可变轻链

L3sp34-G1-2-R2-P1_F8可变轻链

L3sp34-G1-1-R2-P1_A11可变轻链

L3sp34-G1-2-R2-P1_A4可变轻链

L3sp34-G1-2.4-R2-P1_H4可变轻链

实施例3:鼠SP34人源化变体的表征

选择的候选单链抗体被重新格式化为人IgG1格式，以进一步表征。

检测纯化的IgG与人和食蟹猴重组CD3ε蛋白以及无关蛋白的结合。作为对照，使用SP34以及使用专利申请WO2011121110中描述的序列生成的I2C抗CD3ε抗体。剂量-反应实验表明，如图1所示，所有这些抗体都显示出与食蟹猴和人类CD3ε蛋白具有相当的特异性结合。

通过流式细胞仪对不同细胞群(包括T细胞系和来自健康献血者的自然细胞群)的结合进行评估。首先，在人T细胞系Jurkat上检测不同浓度的对照和抗CD3ε候选物。图3所示的结果表明，不同的候选体以剂量依赖的方式与Jurkat结合。对CD3ε缺陷T细胞系也进行了同样的实验，没有观察到结合。通过从健康献血者中分离PBMCs并评估与CD4+、CD8+T细胞以及B细胞的结合来实现与天然细胞群体的结合。在CD4+和CD8+群体中观察到荧光染色的剂量依赖性增加(图4和图5)，而在最高浓度为10μg/ml的B细胞上未观察到染色。在不同浓度下获得的荧光强度在候选者之间有所不同，表明结合亲和力不同。表4列出了不同候选物在非饱和抗体浓度下的平均荧光值。

表4.使用0.1μg/ml抗体浓度测量的平均荧光强度

这些值表明，IgG 1D8、1F8和1A4具有最高的结合能力，而IgG 1B6和1A11具有中等的结合能力，而IgG 1A10显示最低的结合能力。有一组显示不同表观亲和力的抗CD3ε抗体是重要的，因为它可以在构建T细胞重定向双特异性抗体时产生功能性后果。

其他实施方案

尽管本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，但是前述描述只是为了起到解释说明的作用，不应被认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书的范围来定义。其他方面、优势和修饰也被包括在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 诺维莫尼公司

N·费希尔

F·格内尤

U·拉文

G·马吉斯特雷利

<120> 抗-CD3ε抗体及其应用方法

<130> NOVI-046/001WO 322145-2734

<150> US 62/643,095

<151> 2018-03-14

<160> 52

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mSP34VH 氨基酸序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Leu

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mSP34VL 氨基酸序列

<400> 2

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 6

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huSP34_VH 氨基酸序列

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mSP34 CDRL3 氨基酸序列

<400> 7

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fgta CDRL3 氨基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(5)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 8

Ala Leu Xaa Xaa Xaa Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fgt b CDRL3 氨基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(7)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 9

Ala Leu Trp Tyr Xaa Xaa Xaa Trp Val

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fgt c CDRL3 氨基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(8)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 10

Ala Leu Trp Tyr Ser Xaa Xaa Xaa Val

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-1-R2-P1_B6 CDRL1 氨基酸序列

<400> 11

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-1-R2-P1_B6 CDRL2 氨基酸序列

<400> 12

Gly Thr Asn

1

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-1-R2-P1_B6 CDRL3 氨基酸序列

<400> 13

Ala Leu Trp Tyr Ala Asn Arg Trp Val

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-2-R2-P1_A10 CDRL3 氨基酸序列

<400> 14

Ala Leu Trp Tyr Lys Gly Tyr Trp Val

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-1-R2-P1_D8 CDRL3 氨基酸序列

<400> 15

Ala Leu Trp Tyr Asp Gly Thr Trp Val

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-2-R2-P1_F8 - CDRL3 氨基酸序列

<400> 16

Ala Leu Trp Tyr Asp Gly Lys Trp Val

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-1-R2-P1_A11 CDRL3 氨基酸序列

<400> 17

Ala Leu Trp Tyr Asp Gly Trp Trp Val

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆L3sp34-G1-2-R2-P1_A4 CDRL3 氨基酸序列

<400> 18

Ala Leu Trp Tyr Lys Gln Arg Trp Val

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 19

Ala Leu Trp Tyr Asn Gln His Trp Val

1 5

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 20

actggagctg tcaccactag caattat 27

<210> 21

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 21

ggtacaaac 9

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 22

gcactgtggt atgccaaccg ctgggtg 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 23

gcactgtggt ataaggggta ctgggtg 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 24

gcactgtggt atgacgggac ctgggtg 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 25

gcactgtggt atgacggcaa gtgggtg 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 26

gcactgtggt atgacggctg gtgggtg 27

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 27

gcactgtggt ataagcagag gtgggtg 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 28

gcactgtggt ataaccagca ctgggtg 27

<210> 29

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 29

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ala Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 30

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 30

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt atgccaaccg ctgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 31

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 31

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Lys Gly

85 90 95

Tyr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 32

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 32

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt ataaggggta ctgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 33

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 33

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asp Gly

85 90 95

Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 34

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 34

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt atgacgggac ctgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 35

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 35

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asp Gly

85 90 95

Lys Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 36

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 36

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt atgacggcaa gtgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 37

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 37

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asp Gly

85 90 95

Trp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 38

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 38

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt atgacggctg gtgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 39

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 39

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Lys Gln

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 40

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 40

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt ataagcagag gtgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 41

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 41

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Gln

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 42

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 42

cagactgtgg tgacccagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctg 60

acctgtcgct ccagcactgg agctgtcacc actagcaatt atgccaactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagccccccg gggactgatt ggtggtacaa acaaaagagc ccccgggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctgcttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc gcactgtggt ataaccagca ctgggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 43

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mSP34VH - 多核苷酸序列

<400> 43

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctaagggcag cctgaagctg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcca tgaactgggt gcgccaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtggcccgg atcagaagca agtacaacaa ttacgccacc 180

tactacgccg acagcgtgaa ggaccggttc accatcagcc gggacgacag ccagagcctg 240

ctgtacctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccatgtacta ctgcgtgcgg 300

cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcaccctc 360

gtgacagtct cgagc 375

<210> 44

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mSP34VL 合成核苷

<400> 44

caggccgtcg tgacacagga aagcgccctg acaaccagcc ctggcgagac agtgaccctg 60

acctgcagat ctagcacagg cgccgtgacc accagcaact acgccaactg ggtgcaggaa 120

aagcccgacc acctgttcac cggcctgatc ggcggcacca acaaaagggc tccaggcgtg 180

ccagccagat tcagcggcag cctgattggc gataaggccg ccctgaccat cactggcgcc 240

cagacagagg acgaggccat ctacttttgc gccctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300

ggcggaggca ccaagctgac agtccta 327

<210> 45

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGHV3-73 框架

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys

<210> 46

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGHV3-73 框架 - 多核苷酸序列

<400> 46

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt ggctctgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

tccgggaaag ggctggagtg ggttggccgt attagaagca aagctaacag ttacgcgaca 180

gcatatgctg cgtcggtgaa aggcaggttc accatctcca gagatgattc aaagaacacg 240

gcgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgt 294

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 47

gggttcacct tcaacaccta tgct 24

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 48

attagaagca aatataacaa ttacgcgaca 30

<210> 49

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成核苷

<400> 49

gtgagacacg ggaatttcgg caattcttat gtctcgtggt tcgcttac 48

<210> 50

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> huSP34VH - 多核苷酸序列

<400> 50

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctgggtt caccttcaac acctatgcta tgaactgggt ccgccaggct 120

cccgggaaag ggctggagtg ggttggccgt attagaagca aatataacaa ttacgcgaca 180

tactatgctg actcggtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc aaagaacacg 240

gcgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga 300

cacgggaatt tcggcaattc ttatgtctcg tggttcgctt actggggcca agggactctg 360

gtcacagtct cgagc 375

<210> 51

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGLV7-46 框架 - 多肽序列

<400> 51

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

His Tyr Pro Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

85 90

<210> 52

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIGLV7-46 框架 - 多核苷酸序列

<400> 52

caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60

acctgtggct ccagcactgg agctgtcacc agtggtcatt atccctactg gttccagcag 120

aagcctggcc aagcccccag gacactgatt tatgatacaa gcaacaaaca ctcctggaca 180

cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgaccct ttcgggtgcg 240

cagcctgagg atgaggctga gtattactgc 270

26

Claims (24)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：

a.一种可变重链区域，包括：互补性决定区域1(CDRH1)，所述互补性决定区域1包括GFTFNTYA(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，互补性决定区2(CDRH2)，所述互补性决定区2(CDRH2)包括IRSKYNNYAT(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRH3)，所述互补性决定区域3(CDRH3)包括VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列；以及

b.一种可变轻链区域，其包括：互补性决定区域1(CDRL1)，所述互补性决定区域1包括TGAVTTSNY(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列，互补性决定区域2(CDRL2)，所述互补性决定区域2(CDRL2)包括GTN(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRL3)，所述互补性决定区域3(CDRL3)包括从以下组中选择的氨基酸序列：ALWYANRWV(SEQ ID NO:13)、ALWYKGYWV(SEQ ID NO:14)、ALWYDGTWV(SEQ ID NO:15)、ALWYDGKWV(SEQ ID NO:16)、ALWYDGWWV(SEQ ID NO:17)、ALWYKQRWV(SEQ ID NO:18)和ALWYNQHWV(SEQ ID NO:19)；

其中，所述分离的单克隆抗体或其片段结合CD3ε。

2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述可变重链区域包括hIGHV3-73框架区。

3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述可变轻链区域包括hIGLV7-46框架区。

4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括可变重链区域和可变轻链区域，该可变重链区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，以及该可变轻链区域包括SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39或41的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述CD3ε是人CD3ε或者食蟹猴CD3ε。

6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、单链抗体(scAb)、Fab片段、F(ab')2片段、单链可变片段(scFv)、scFv-Fc片段、多聚抗体或双特异性抗体。

7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或者抗原结合片段是食蟹猴抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者全人抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG同型体。

9.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是IgG1同型体。

10.一种双特异性抗体，包括:

a.能够结合CD3ε的第一臂，包括：

i.一种可变重链区域，包括：互补性决定区域1(CDRH1)，所述互补性决定区域1包括GFTFNTYA(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列、互补性决定区2(CDRH2)，所述互补性决定区2(CDRH2)包括IRSKYNNYAT(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRH3)，所述互补性决定区域3(CDRH3)包括VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列；以及

ii.一种可变轻链区域，其包括：互补性决定区域1(CDRL1)，所述互补性决定区域1包括TGAVTTSNY(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列，互补性决定区域2(CDRL2)，所述互补性决定区域2(CDRL2)包括GTN(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列和互补性决定区域3(CDRL3)，所述互补性决定区域3(CDRL3)包括从以下组中选择的氨基酸序列：ALWYANRWV(SEQ ID NO:13)、ALWYKGYWV(SEQ ID NO:14)、ALWYDGTWV(SEQ ID NO:15)、ALWYDGKWV(SEQ ID NO:16)、ALWYDGWWV(SEQ ID NO:17)、ALWYKQRWV(SEQ ID NO:18)和ALWYNQHWV(SEQ ID NO:19)；以及

b.不结合CD3ε的第二臂。

11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包括可变重链区域和可变轻链区域，该可变重链区域包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，以及该可变轻链区域包括SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39或41的氨基酸序列。

12.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中，所述第二臂结合肿瘤相关抗原(TAA)。

13.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中，所述肿瘤相关抗原(TAA)是EGFR、Her2、Her3、FOLR-1、MSLN、BSMA、CD20、CD19、CEA、PSMA、EpCAM、FSHR、CD123、CD38、CD33、gpA33、B7-H3、CDH3、SSTR2、TROP-2、GPC3、SLAMF7、ROR1或者5T4。

14.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体包括两个拷贝的单重链多肽和一种第一轻链和一种第二轻链，其中，所述第一和第二轻链是不同的。

15.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述第一轻链的至少一部分是κ型并且所述第二轻链的至少一部分是λ型。

16.根据权利要求15所述的双特异性抗体，其中，所述第一轻链包括至少一种κ恒定区。

17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中，所述第二轻链包括至少一种λ恒定区。

18.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中，所述第二轻链进一步包括至少一种λ可变区。

19.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中，所述第二轻链进一步包括至少一种κ可变区。

20.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述第一轻链包括一种κ恒定区和一种κ可变区，并且其中所述第二轻链包括一种λ恒定区和一种λ可变区。

21.一种药物组合物，包括前述权利要求中任意一项所述的抗体。

22.一种缓解症状或者疾病的方法，包括对需要的患者给药权利要求21所述的药物组合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述疾病是癌症。

24.一种T细胞重靶向方法，包括对需要的患者给药权利要求21所述的药物组合物。

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